HUT55446A

HUT55446A - Process for determining salicilates and reduced pyridin-nucleotides and diagnostical kit for the determining process

Info

Publication number: HUT55446A
Application number: HU89260A
Authority: HU
Inventors: Anthony Atkinson; Robert Stewart Campbell; Peter Michael Hammond; Helen Christine Morris; John Richard Ramsay; Christopher Philip Price
Original assignee: Health Lab Service Board
Priority date: 1987-12-03
Filing date: 1988-12-02
Publication date: 1991-05-28
Also published as: GB2213261B; EP0396584B1; HU890260D0; GB2213261A; JPH03502521A; GB8728296D0; EP0396584A1; US5460948A; AU2811789A; DK136590D0; DE3852889D1; DE3852889T2; KR900700619A; GB8828176D0; DK136590A; ATE117726T1; WO1989005356A1

Description

A találmány tárgya eljárás szalicilátok és redukált piridin-nukleotidok meghatározására, és a fenti eljárás rutinszerű kivitelezésére alkalmas diagnosztikai készlet.

Gyakran szükség van szalicilát vegyületek, különösen a gyógyszer-hatóanyag orto-acetil-szalicilsav /fezpirin/ és a rendszerint nátriumsója formájában használt szalicilsav koncentrációjának meghatározására biológiai folyadékokban. Ilyen esetekben, és különösen akkor, ha a beteg gyógyszer-túladagolásban szenved, nagyon fontos, hogy a hatóanyag koncentrációját a szervezetben gyorsan meg lehessen határozni, azért, hogy szükség esetén antidótumot vagy egyéb kezelést lehessen alkalmazni.

Számos eljárás ismeretes egy minta vagy oldat szalicilát-tartalmának meghatározására. Például a szalicilát-iont Folin-Ciocalteau reagenssel reagáltatják erősen lúgos oldatban, és az igy kialakult kék színt kolorimetriásan analizálják /Smith és Talbot, Brit. J. Exp. Path. 31, 65 /1950/7. Ezzel a módszerrel azonban igen nagy és változó vak-értékeket kapnak . szalicilátot nem tartalmazó mintákban.

A szalicilát-iont savas oldatban vas/III/-sókkal is reagáltathatják, és az igy keletkezett bibor színt analizálják kolorimetriásan /Trinder, Biochem. J. 57» 301 /1954/y. Ennek az eljárásnak is vannak hátrányai, és nem-specifikus interferencia léphet fel.

A szalicilát-tartalom úgy is meghatározható, hogy a szalicilátot először enzimatikusan pirokatechinné alakítják, majd ez utóbbi vegyületet hidrazonnal és molekuláris oxigénnel reagáltatják egy másik enzim - a tirozináz - jelenlétében,

- 3 így egy azin-szinezéket kapnak /Roder és munkatársai, 0 054 146 számú európai szabadalmi leírás?. A tirozináz enzim azonban nemcsak a pirokatechint,hanem más monofenolokat is oxidál, és a hidrazon bármely kapott kinonnal képes oxidativan kapcsolódni, és igy színes terméket képezni. Ezenkívül, az ismeretlen mennyiségben jelenlévő egyéb monofenolok, különösen tirozin a tirozináz enzim kötőhelyeiért versenghetnek is, ami csökkenti a rendszer hatékonyságát.

További eljárás ismert szalicilátok meghatározására a 84306810.7 számú európai szabadalmi leírásból. Eszerint a szalicilátot először enzimatikusan katechinné alakítják. A katechint ezután lúgos körülmények között amino-fenollal reagáltatják, a reakció termékeként indofenol keletkezik, amely kolorimetriásan kvantitativen meghatározható. Azonban az amino-fenol lúgos körülmények között instabil, igy a ketechinnel való reagáltatás előtt savas körülmények között kell tárolni. Ezenkívül abban az esetben, ha az amino-fenol nem reagál gyorsan a katechinnel, a lúgos reakciókörülmények miatt az amino-fenol elbomolhat, vagy mellékreakciókban vehet részt, amelynek következtében a mérési eredmények pontatlanok lesznek.

A fenti eljárás további hátránya, hogy azonnali alkalmazásra kész reagens-készletként nem lehet forgalmazni, mivel az amino-fenolt savas körülmények között kell tárolni a vizsgálat megkezdése előtt, és az indofenol termék kialakításához semleges, vagy előnyösen lúgos körülmények kellenek.

A szalicilát-meghatározási eljárás kompenensei ideálisan vízben oldhatók, szinkifejlődésük sebessége nagy, a szín hozama nagy, és a végső szín nagy stabilitású.

·· ···· ·«

Célunk olyan uj eljárás kidolgozása volt szalicilátok meghatározására, amellyel a fenti hátrányok kiküszöbölhetők, vagy legalábbis csökkenthetők, de amellyel a szalicilát-tartalom még megfelelően gyorsan meghatározható, igy az eljárás alkalmazható a feltehetőleg tuldozirozott betegek biológiai folyadékaiban a hatóanyag-koncentráció meghatározására.

A találmány szerinti eljárás értelmében a szaliciláttartalmat úgy határozzuk meg, hogy a szalicilátot szalicilát-mono-exigenáz emzimmel enzimatikusan katechinné alakítjuk, redukált piridin-nukleotid /különösen NADH vagy NADPH/ jelenlétében, majd a katechint egy /1/, /11/, /111/ vagy /IV/ általános képletü vegyülettel - a képletekben

Rp R^ és R^ jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, aminocsoport vagy 1-6 szénatomos alkilcsoport, ^R4 ~ ^R10 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, alkilcsoport, aminocsoport, -NHR^^R^2> ^idroxilcsoport, hidroxi-metil-csoport, formilcsoport, karboxilcsoport, -00/0^/^, -CONH/C^/flCOOH vagy -NH_o.H00CC00H.H_oNC,H_r, ahol

2 6 5 n értéke 1 és 5 közötti egész szám, és ^R11és ^Ri2 J^el^enté^se egymástól függetlenül 1-5 szén atomos alkilcsoport, azzal a megkötéssel, hogy ha a /11/ általános képletben R^ - Rg közül az egyik jelentése aminocsoport vagy -NR^^R^2> ^a^^^or“ az R^ - Rg csoportok közül legalább egyik jelentése 1-6 szénatomos alkilcsoport, aminocsoport, -NR₁-^R₁2> f^orrail^csoport, karboxilcsoport, -CO/CH₂/_nH, -CONH/CH^/_nCOOH vagy

-NH₂ . HOOCCOOH. , ahol a /11/ általános képletü vegyületek körébe nem tartoznak az amino-fenolok körébe tartozó vegyületek reagáltatjuk, és a kapott színezék mennyiségét kolorimetriásan meghatározzuk.

Az /1/ általános képletben előnyösen

jelentése metilcsoport, jelentése hidrogénatom és jelentése aminocsoport.

A /11/ általános képletben előnyösen ha jelentése karboxilcsoport, jelentése aminocsoport és jelentése hidrogénatom;

ha jelentése -CONH/CH₂/_nCOOH, akkor értéke előnyösen 1, jelentése aminocsoport és

ha R

R_o és R_n jelentése hidrogénatom, o y jelentése -C0/CH_o/ H, akkor értéke előnyösen 1, jelentése aminocsoport és ^R5’ ^R6’

Rg és Rg jelentése hidrogénatom.

A /111/ általános képletben előnyösen

jelentése aminocsoport és és Rg - R^q jelentése hidrogénatom.

A /IV/ általános képletben előnyösen

R^ és R₂ jelentése metilcsoport és Rg jelentése aminocsoport.

- 6 A leírásban színezék alatt olyan vegyületeket értünk, amelyek egy vagy több ultraiolya /UV/, látható vagy infravörös /IR/ spektrum-tartományban abszorbeálják az elektromágneses sugárzást .

A szinreakció akkor jön létre, ha az /1/ - /IV/ általános képletü amin— vagy fenol-komponenseket 0,5 - 50 mmól/1, előnyösen 1,3 - 2,9 mmól/1 koncentrációban alkalmazzuk.

A találmány szerinti eljárás alapját az 1. reakcióvázlat szerinti reakciók képezik, a reakcióvázlátban a redukált piridin-nukleotidra példaként a NADPH-t vagy NADH-t említjük.

Az 1. reakcióvázlat szerinti /i/ reakcióban a redukált piridin-nukleotid, vagyis redukált nikotinamid-adenin-dinukleotid /NADH/ vagy redukált nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát /NADPH/ a megfelelő oxidált formává, vagyis nikotinamid-adenin-dinukleotiddá /NAD/ vagy nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfáttá /NADP/ alakul.

A szalicilát fenti módon történő meghatározására a NADH-t vagy NADPH-t azt a legnagyobb szalicilát-koncentrációt meghaladó koncentrációban kell alkalmazni, amelyre nézve a vizsgálat lineáris. Ez a követelmény azt jelenti, hogy a találmány szerinti eljárást a NADH vagy NADPH meghatározására is lehet használni, ha a rendszerhez feleslegben szalicilátot adunk. A találmány szerinti eljárást ezért a NADH vagy NADPH kimutatására is használhatjuk, amelyek dehidrogenáz enzimek szubsztrátokra - például glükózra vagy laktátra - való hatásakor keletkeznek .

Az 1. reakcióvázlat szerinti /i/ és /ii/ reakciót célszerűen egyetlen lépésben lejátszathatjuk, amikoris a reak

- 7 ció összes komponense jelen van a rendszerben. Úgy is eljárhatunk, hogy az /i/ és /ii/ reakciót két egymást követő lépésben jáiszatjuk le, azaz az /i/ lépésben lejátszódik a katechin képződése, és a /ii/ lépésben az /i/ reakcióban keletkezett katechin egy fent megadott aminnal vagy fenoi-vegyülettel színes reakcióterméket képez. A találmány szerinti eljárás mind manuálisan, mind automatizált rendszer részeként kivitelezheto.

A szalicilát katechinné alakításának katalizálására bármely szalicilát-mono-oxigenáz enzim alkalmas, amelyet az International Unión of Biochemistry /Enzyme Nomenclature 1978, Academic Press, New York 1979/ szerint E.C.1.14.13.1 számon, szalicilát mono-oxigenáz /dekarboxilező és hidroxilező/ néven tartanak számon. A katalitikus reakcióban az enzimet és a redukált piridin-nukleotidot feleslegben alkalmazzuk.

A szalicilát-mono-oxigenáz enzim NADH-oxidáz aktivitással rendelkezik, amelynek hatására a NADH NAD⁺-dá oxidálódik. Ezért ha az enzimet NADH-val vizes rendszerben tárolhatóvá kívánjuk tenni, egy NADH regeneráló rendszert is tartalmaznia kell a rendszernek, amely péládul a 2. reakcióvázlat szerint működik.

A NADH tárolás közbeni stabilitását tovább javíthatjuk azáltal, hogy a rendszerhez klorid-sókat, például nátrium-kloridot adunk, 10 - 5000 mmól/1, előnyösen 100 mmól/1 koncentrációban. A NAD⁺ NADH-vá való visszaalakítására, illetve a NADH oxidálódásának meggátlására alkalmazható egyéb adalékanyagok a szakemberek számára jól ismertek.

Ha a vizsgálatra használt reakcióelegy nagy koncent >·· ·

- 8 rációban tartalmaz fémionokat, az enzim-aktivitás biztosítására fém-kelát-képző szert is kell adni a rendszerhez, előnyösen 0,1 - 1,0 mmól koncentrációban.

Az enzimreakciót azonban bizonyos fémionok jelenléte katalizálja és meggyorsítja. Az enzimreakció katalizálására előnyös fémek a mangán és kobalt.

A katechin aminnal vagy fenol-vegyülettel való szinreakciójának/1. reakcióvázlat, /ii/_/ katalizálására fém- és ammónium-ionokat is használhatunk. A szín kifejlesztésének katalizálására használható fémionok például mangán-, kobalt-, réz-, kalcium- és magnéziumionok lehetnek. Az egyéb alkalmazható fémionok szakemberek előtt jól ismertek. A fenti, szín-kifejlesztésre használt ionok koncentrációja rendszerint 0,01 - 50 mmól/1, előnyösen 0,1 - 0,25 mmól/1. Az ion-koncentráció azonban az adott vizsgálattól függően változik.

A fémionokat előnyösen olyan vegyületek formájában alkalmazzuk, amelyek a meghatározásra használt elegyben és a vizsgálandó mintában jól oldódnak. A fémionok például acetátokból, igy kobalt-acetátból származhatnak, vagy más, szakemberek által egyszerűen megválasztható vegyületekből, amelyekről feltételezhető, hogy az ellenion nem zavarja az enzimreakciót, vagy a meghatározás egyéb fázisát.

Ha a szalicilát acetilezett származék formájában van jelen, azt először az acetil-származék hidrolízisével nem acetilezett formává kell alakítani, például egy aril-észter-hidroláz enzimmel /EC: 3.1.1.2./ katalizált reakcióban.

A katechin színezékké alakítására a katechint egy fent megadott aminnal vagy fenol-vegyülettel reagáltatjuk. Amin ♦»·· ·9 *« ···· ·« ·»·»·*> · · » · · · » « • · · · · ·

- 9 vegyületként 4-amino-fenazolt /1/, 2-amino-benzoesavat /11/, 4-amino-hippursavat /11/, 4-amino-acetofenont /11/ vagy 6-amino-benzotiazolt /111/ használhatunk, a fenti vegyületeket előnyösségük sorrendjében említettük, elsőként említve a legelőnyösebb vegyületet.

A találmány szerinti eljárás egy különösen előnyös megvalósitásdcor a katechin a 4-amino-fenazonnal gyorsan, nagy specificitással reagál, és viszonylag stabil színű színezéket eredményez. A katechin színezékké alakítását lényegében vizes oldatban hajtjuk végre, semleges, vagy előnyösen lúgos pH-n. A szinreakciót előnyösebben 8 és 14 közötti pH-értéken játszatjuk le, és egy vagy több puffért is használhatunk, 0,025 - 1,0 mól/1, előnyösen 100 mmól/1 koncentrációban.

A találmány egyik előnyös megvalósítási módja szerint a színreakciót pH 10 értéken játszatjuk le. Pufferként karbonát-hidrogén-karbonát, borát, glicin, dietanolamin, glicil-glicin, nátrium-foszfát, kálium-foszfát, Tris-HCl, 2-/Nciklohexil-amino/-etánszulfonsav /CHES/, 2-amino-2-metil-l-propanol /AMP/, 2-amino-2-metil-l,3-propándiol /AMPD/, N-/trisz/hidroxi-metil/-metilT-3-amino-propánszulfonsav /TAPS/, 3-/ciklohexil-amino/-l-propánszulfonsav /CAPS/, N-/2-hidroxi-etil/—piperazin-N-2-etánszulfonsav /HEPES/, és N-/2-hidroxi-etil/-piperazin-N-2-propánszulfonsav /EPPS/ puffereket használhatunk.

A szalicilát-mono-oxigenáz enzim széles pH-tartománya /6,0 - 10,5/ lehetővé teszi, hogy az enzimreakciót különféle pH-értéken, előnyösen lúgos körülmények között játszassuk le, igy mind az enzimreakció /i/, mind a szinreakció /11/ ugyan··»· ·· ·· ··«* ·· ·*·»·· « ·

9» «··· « • · · · · · azon reakcióelegyben mehet végbe, egylépéses reakcióban, például az előnyös pH 10 értéken.

A találmány szerinti eljárást azonban két reakciólépésben is végezhetjük, amikor az enzimreakciót megfelelő pH-ju oldatban lejátszatjuk, majd a pH-t a szinreakciónak megfelelő, értékre állítjuk, például úgy, hogy az oldathoz nátrium-karbonát-oldatot vagy más megfelelő lúgot, például nátrium-hidroxid-oldatot keverünk, 25-500 mmól/1, előnyösen 120 - 250 mmól/1 koncentrációban.

Különösen előnyösen úgy járhatunk el, hogy a szinreakciót CHES puffer jelenlétében, és a legelőnyösebb pH-értéken, azaz pH 10-en játszatjuk le. Ezek a körülmények különösen előnyösek abban az esetben, ha a szalicilát meghatározását egyetlen reakciólépésben végezzük, és a színreakcióban a kifejlesztésre a katechint amino-fenazonnal, különösen előnyösen 4-amino-fenazonnal reagáltatjuk.

Másik előnyös megvalósítási mód szerint a szín kialakítására a szalicilát katechinné alakítására használt enzim-reagenshez - amely EPPS puffért tartalmaz, és pH-ja előnyösen 8,6 - nátrium-karbonát-puffért keverünk.

Az egylépéses szalicilát-meghatározási eljárásban a reagensek - különösen az enzim - előnyösen liofilizált formában vannak, igy megakadályozható, hogy a reagensek a vizsgálandó minta hozzáadása előtt maguk reagáljanak.

Egy előnyös megvalósítási mód szerint, a reagensek egy szilárd szubsztráton - célszerűen a tartóedény, például üvegcső falán - egymás utáni fagyott rétegként helyezkednek el, és a reagenseket ezután liofilizáljuk.

Ha a színezék kialakítását a szín kialakulásának maximális sebességét biztosító feltételek között végezzük, a reakció szérum-minta esetén mintegy 6 perc alatt teljesen végbemegy.

A szín kialakulása után általában legalább 1 órán keresztül stabil. Bizonyos esetekben azonban - különösen kétlépéses eljárás esetén - a reakciótermék stabilitását felületaktív anyagok hozzáadásával javíthatjuk. Felületaktív anyagként például 14 - 16 szénatomos alfa-olefin-szulfonát-sókat, igy Witconate AOS Li8-at, Witconate SES-t és Witconate 6OL-t használhatunk. Egyéb, szakemberek által ismert felületaktív anyagok is használhatók. A felületaktív anyagok koncentrációja előnyösen 0,005 - 5 %, még előnyösebben 0,05 %.

Az aril-amin tipusu reaktánsokkal, különösen a 4-amino-fenazonnal lejátszódó színreakció igen specifikus. A fenti aril-aminok szaliciláttal, acetil-szaliciláttal, acil-anilidekkel, igy hidroxi-acetaniliddel, vagy tirozinnal lejátszódó reakciójában nem figyeltük meg zavaró szín kialakulását. Ezért a találmány szerinti eljárás gyors és specifikus eljárást biztosit szalicilát meghatározására, ami különösen akkor hasznos, ha a szalicilátot biológiai folyadékban kell meghatározni.

A keletkezett színezék spektrofotometriás analízisét bármely hullámhosszon elvégezhetjük, amelyen a színezék abszorbeál, előnyösen a maximális abszorpciónak megfelelő hullámhoszszon végezzük a mérést. Ez a hullámhossz 520 nm, ha a katechin és 4-amino-fenazon reakciójában keletkező színezéket vizsgál12

A találmány szerinti szalicilát-meghatározási eljárásnak számos alkalmazása lehet, különösen akkor használható, ha gyors, és rutinszerű analitikai eljárásra van szükség, különösen akkor, ha a szalicilátot tartalmazó minta olyan komponenseket is tartalmaz, amelyek más analitikai eljárás alkalmazásakor ismert módon zavarják a szalicilát meghatározását. A találmány szerinti eljárás különösen orvosi területeken használható, szalicilát-alapu analgetikus készítmények detektálására. Ebben az esetben a szalicilát általában olyan más hatóanyagokkal van elegyítve, amelyekről ismert, hogy a hagyományos gyors analitikai eljárásokban zavarják a meghatározást.

Abból a tényből, hogy a szalicilát-mono-oxigenáz által katalizált enzimreakcióban a szalicilát katechinné alakításához kofaktorra, közelebbről NADPH-ra vagy NADH-ra is szükség van, az következik, hogy a találmány szerinti eljárás alapját képező reakció a redukált piridin-nukleotidok, különösen NADPH vagy NADH meghatározására is használható. NADPH vagy NADH keletkezik /és azután meghatározható/ például azokban a reakciókban, mikor a dehidrogenáz enzimek szubsztrátokra, igy glükózra vagy trigliceridekre, vagy laktátra hatnak.

A találmány további tárgya ennek megfelelően eljárás redukált piridin-nukleotidok - különösen NADH vagy NADPH - meghatározására valamely mintában, oly módon, hogy egy szalicilátot szalicilát-mono-oxigenáz enzimmel katechinné alakítunk, redukált piridin-nukleotid jelenlétében, a katechint egy fent megadott aminnal vagy fenol-vegyülettel reagáltatjuk, és a kialakult színezék mennyiségét kolorimeriásan meghatározzuk. A színezék meny13 nyisége a mintában lévő redukált piridin-nukleotid mennyiségével arányos. A színezéket előnyösen spektrofotometriásán mérjük.

A redukált piridin-nukleotidok meghatározására szolgáló eljárás alapját szintén a fenti 1. reakcióvázlat szerinti /i/ és /ii/ reakciók képezik. Azonban ebben az esetben - a szalicilét meghatározástól eltérően, amikor az enzim és a redukált piridin-nukleotid van jelen feleslegben - az enzimet és a szalicilátot alkalmazzuk feleslegben. Az előzőekhez hasonlóan, a katechint célszerűen egy fent megadott aminnal vagy fenol-vegyülettel reagáltatva alakítjuk színezékké, előnyösen a fenti előnyös aminok egyikét, különösen előnyösen 4-amino-fenazont használunk.

Ha a redukált piridin-nukleotid egy dehidrogenáz enzim szubsztrátra való hatásakor keletkezik, a keletkezett nukleotid mennyiségének meghatározását használhatjuk-a jelenlévő szubsztrát mennyiségének meghatározására. A redukált piridin-nukleotidok meghatározására szolgáló eljárásnak ilyen alkalmazása a találmány szerinti eljárás egy újabb alkalmazását jelenti .

A találmány szerinti analitikai eljárás rutin vizsgálatokban való alkalmazására, különösen a gyógyászat területén, összeállítottunk egy diagnosztikai készletet is, szalicilát vagy redukált piridin-nukleotid /különösen NADH vagy NADPH/ meghatározására a találmány szerinti eljárással, amely készlet /a/ redukált piridin-nukleotidok jelenlétében szalicilátot katechinné alakító szalicilát-mono-oxigenáz enzimet, és /b/ a katechin színezékké alakítására képes amint vagy fenol-vegyületet, előnyösen egy fent említett előnyös amint, különösen á-amino-fenazont tartalmaz.

Mint fent említettük, a szalicilát-mono-oxigenáz enzim egy, az IUB által az EC:1.14.1.13.1 enzim-osztályba sorolt enzim lehet. Az amin vagy fenol-vegyület előnyösen amino-fenazon, különösen előnyösen 4-amino-fenazon lehet.

Az enzim és az egyéb reagensek oldatban, előnyösen vizes oldatban lehetnek. Ebben az esetben a szalicilát-mono-oxigenáz enzim aktivitásának fenntartására a tárolás során, az enzimoldat előnyösen glicerint tartalmaz, vagy liofolizálhatjuk, előnyösen egy védőanyag jelenlétében.

A védőanyag egy cukor lehet, különösen glükóz, laktóz, raffinóz vagy egy poliszacharid.

A fenti készlet egyetlen oldatból állhat, amelyben az /i/ és /ii/ reakciólépés végrehajtásához szükséges összes reagens jelen van, például az enzim, NADH vagy NADPH, puffer, katalizátor, és az aril-amin, megfelelő pH-η. A készlet azonban két különálló oldatból is állhat, az egyik tartalmazhatja az /i/ és /ii/ lépéshez szükséges reagenseket, és a másik a pH beállításához szükséges lúgot.

Az enzim és a többi reagens immobilizált formában is lehetnek, például szilárd vagy félszilárd hordozóanyagba beitatva.- Ebben az esetben különösen előnyös egy pórusos anyag, például papír. A találmány szerinti készlet manuális meghatározásra éppúgy használható, mint automata analizátorokhoz. Az utóbbi előnye, hogy kis minta-térfogatokkal tud dolgozni.

Az enzim aktivitásának fenntartására további intézkedésként azt a készlet többi komponensével együtt, vagy külön, alacsony hőmérsékleten /5 - -20 °C-on/ tárolhatjuk.

Az amin és a fenci-vegyület szintén oldat formájában, előnyösen vizes oldat formájában is lehet a készletben. Az amin vagy fenol-komponens is lehet immobilizált formában, például egy szilárd vagy félszilárd hordozóanyagba beitatva. Erre a célra különösen előnyösen pórusos anyagot, például papirt használhatunk .

A találmány szerinti készlet egyik kiviteli alakjánál mind az enzim, mind az amin vagy fenol-vegyület pórusos anyagba, például papírba van beitatva, amelyet azután teszt-csík formájában haszálunk.

A készlet tartalmazhatja a reagenseket bemeritéses vizsgálatra alkalmas formában is, ekkor a reagensek például immo.bilizálva lehetnek, esetleg egy fent említett módon, vagy kapszulázva, vagy egy célszerű eszközben megkötve, amely azután alkalmas raktározásra, vagy a szalicilét, redukált piridin-nukleotid vagy a dehidrogenáz enzim által fogyasztott szubsztrát meghatározásának kivitelezésére.

A találmány szerinti készlet használatának megkönnyítésére, minden egyes készlethez mellékelhetünk egy használati útmutatót, amelyben feltüntetjük a vizsgálati eljárás egyes lépéseit .

A találmányt részleteiben az alábbi példákkal ismertetjük, hivatkozva a következő ábrákra, ahol az

1. ábra mutatja a szín-kifejlődés sebességét szalícilát-meghatáro- zásban, kombinált enzimet és szín-reagenst használva;

a

2. ábra mutatja a reakció végtermékének spektrumát szalicilát- —meghatározásban; a

3. ábra mutatja a szérum-kalibrációs anyagokkal felvett kalib- rációs görbét, szalicilát-meghatározásban, kombinált enzimet és szín-reagenst használva; a

4. ábra mutatja a szalicilát-meghatározásban a kalibrációs görbe változását az idővel; az

5. ábra mutatja az enzim-reagens tárolási stabilitását, a rend- szer rekonstituciója után, két reagensből összeállított rendszerben, a

6. ábra mutatja a találmány szerinti enzimatikus eljárással és a szokásos kolorimetriás eljárással kapott szalicilát-meghatározási eredmények összehasonlítását.

1. példa

Katechin reakcióinak pH-függése

A pH hatását a különféle színes reakciótermékek kialakulására úgy vizsgáljuk, hogy a reakciókat pH 8, 9, 10 és 14 értéken játszatjuk le.

Módszer

A lehetséges reaktánsokból 50 mmól/1 koncentrációjú oldatokat készítünk, a vízben oldhatatlan reaktánsokat etanolban oldjuk. A vizsgált vegyületeket az 1. táblázatban ismertetjük.

500 /U1 50 mmól/1 koncentrációjú vizes katechinoldatot 500 /U1 reaktáns-oldattal kombinálunk, és szobahőmérsékleten 10 percen keresztül inkubáljuk. Az észlelt színváltozásokat szintén az 1. táblázatban tüntetjük fel.

Ezután ez elegyekhez 2 ml 100 mmól/1 koncentrációjú borát-puffért /pH 8, 9 vagy 10/ vagy 250 mmól/1 koncentrációjú natrium-hidroxid-oldatot adunk, es 10 es 60 perc múlva megfigyeljük a színváltozásokat. Minden egyes reakcióelegy mellett egy ka·· · · techin nélküli vak-próbát is készítünk.

Eredmények

Nem találtunk olyan reaktánst, amely pH 8,0 értéken reagálna a katechinnel. A vegyületek közül több is reagál a katechinnel pH 9, 10 és 14 értéken, ezeket a 2. táblázatban foglaljuk össze.

- A 3. és 4. táblázatban ismertetjük a katechin reakcióit különféle pufferekben.

- Az 5. táblázatban közöljük a katechin reakciótermékeinek A max értékeit.

- A 6. táblázatban optimalizált katechin—reakciórendszereket ismer-

- tétünk.

- A 7. táblázatban ismertetjük a 4-amino-fenazon-koncentráció optimalizálását mangánt tartalmazó karbonát-pufferben /pH 10/.

- A 8. táblázatban a nátriu m-karbonát-koncentráció optimalizálását mutatjuk be, 4-amino-fenazonos reakcióban,

- A 9· táblázatban ismertetjüka találmány szerinti enzimatikus szalicilát—meghatározás egy napon belüli pontosságát.

- A 10. táblázat mutatja a mérhető szalicilát koncentrációkat lehetséges zavaró vegyületek jelenlétében, azok 10 mmól/1 koncentrációinak jelenlétében.

• ·

- 18 1. táblázat: Katechin lehetséges reaktánsai

Vizoldható vegyületek Alkoholban oldódó vegyületek antipirin amidol anilin-oxalát o-amino-benzoesav

4- amino-fenazon

5- amino-kinon

4-amino-acetof enon

2- amino-bifenil

3- amino-5,6-dimetil-triazin

2-amino-benzimidazol

4- nitro-fenol naftorezorcin floroglucin m-f enilén-diamin rezorcin |i-rezorcinsav

4,2-tiazolil-azo-rezorcin p-amino-hippursav

2-amino-pirazin

1- amino-antrakinon

2- amino-benzotiazol

6-amino-benzotiazol

6-amino-2-f enil-indenon

2-amino-4-metil-benzotiazol

2.6- diklór-p-benzokinon-4-klórimin

2.6- diklór-kinon-4-klór-imid

4-hexil-rezorcin

8-hidroxi-kinolin

4-/dimetil-amino/-benzaldehid

4-nitro-anilin o-fenilén-diamin • · ·· ·· ···· • · «

táblázat: Katechinnel reagáló vegyületek szinreakciói

C\J

OJ

g

G

C

1 c

C

I C

G

i a

G

1 G

G

Ω

<D

CD

1 CD

CD

1 CD

CD

1 CD

(D

Ό

1—1

ι—1

1 ι—1

ι—1

1 r-l

<—I

rH

ι—1

1 ι—1

ι—1

1 ι—1

r—|

G

<D

cd

CD

1 (D

(D

1 CD

CD

1 CD

CD

1 <D

CD

Q.

CD

P

1 P

P

1 P

P

1 P

P

1 P

P

1

c

G

c

1 G

G

1 G

a

G

1 G

G

1 G

C

Λί

•rl

Ή

1 *H

Ή

1 Ή

•rl

1 -r-l

•rl

1 -rl

•rl

1 -rl

•rl

cö

N

M

1 CO

M

1 N

ts)

N

1 N

N

1 tS)

N

>

CO

1 co 1

CO

1 CO 1

co

CO

1 CO 1

CO

1 co

CO

1 1

>

1

ι—1

1

G

1

G

s

G

1 c

C

1 c

1

•H

•rl

1 Ή

•rl

1 *rl

1

N

o

N

1 N

N

1 N

1

I

CO

G

CO

1 CO

CO

1 co

1

CD

OJ

co

cö

1 cö

cö

1 cö

cö

CÖ

cö

1 G

CÖ

•H

a

CO

o

G

1 CO

co

1 co

C

G

1 o

Ό

1 o

C

g

N

G

1 N

N

1 N

G

1 .o

ι—1

1 JO

G

'Cö

o

Ό

•H

cö

1 Ό

Ό

1'0

CÖ

(Ö

cö

1 -rl

:O

1 *H

CÖ

P

vO

G

Q.

X>

1 G

G

1 G

£>

jO

1 £>

N

1 X)

•ű

CO		G
G	+	•rl
Ό		.G
P	P	o	CD
	cö	(D	G
<Ö	Ό	P	•rl
(D	r-l	cö	N
CG	O		CO

P	4-5	CD
Λί	03	G
cö	T3	•rH
<D	rH	N
CG	O	co

C	q	1 c	G 1	a
CD	<D	1 CD	CD 1	•rí
>—1	ι—1	1 <—1	r-l 1	N
ID	a>	1 (D	CD 1	CO
P	4-5	1 -P	P 1	CÖ
G	q	1 G	G 1	CO
•rl	•H	1 -rl	•rl 1	N
N	N	1 N	N 1	Ό
CO	ω	1 CO 1	CO 1 1	G
G		1 1 G	1 1	C
<D		1 CD	1	CD
r—1		ι ι—ι	1	<—1
CD		1 <D	1	CD
P		1 P	1	-P
G		ι a	1	C
Ή		1 ·Η	1	rl
N		1 N	1	N
CO		1 CO	l	CO
		1 1	1
C		1 c	1 1	G
CD		1 CD	I	CD
1—1		I rH	1	(—1
CD		1 <D	1	CD
P		1 -P	1	P
G		1 C	1	C
•H		1 -H	1	•rl
N		1 N	1	N
CO		1 CO 1	1 1 1	CO
O		1 1 1 o	1 <r 1	O
1—1	«—1	1 ι—1 1 I	<-1 1 1 1	»—1
		1 1 1 r-l	1 1 1	ι—1
		1 o	I	O
		1 N	1	N
		1 CÖ	1	CÖ
		1 Ή	I	•rl
		1 -P	1	-P
		1 o	l	O
		1 N	1	to
		1 G	1	G
		1 CD	1	CD
c		1 x>	1	X)
•rl		1 1	1	1
G		1 o	1	o
•rl		1 c	1	G
CL		1 ·Η	1	•H
•rl		1 s	1	s
-P		ι a)	\|	aj
G		1 1	I	1
CÖ		1 C\J	1	<o

i' ·· · · · ► · »·· ·

táblázat /folytatás/ ej

0		α	0	1	0	0	! 0 1	0	0	0
JD		0	0	1	0	0	0 I	0	0	0	α>
Ό		<—ι	ι—ΐ	1	Γ—1	ι—1	γ—1 1	Γ~1	1—1	^4	ι—I
S—		ο	0	1	0	0	0 1	0	0	0	(D
Q. 0		•Ρ	-Ρ	1	-Ρ	-Ρ	1 ρ 1	Ρ	Ρ	Ρ	4->
1 c		C	0	\|	0	0	1 0 1	0	0	α	C
x ·η		•Η	•Η	I	•Η	Η	1 Η \|	•Η	1 ·γ4	•Η	•Η
05 N		Ν	Ν	1	Ν	Ν	1 Ν 1		Ν	Ν	Ν
> 0		ω	0	1 1	0	0	1 0 1 1	0	0	0	CQ
	0			1			1 1 1 1			1
	>			1			1 1
	ι—1			1					1	1
	3			1			1 1
α	S			1			1 1		1
•Η				1			1 1			1
Ν	Ο			1						1
0	L.			1			1 1		1	1
	ω	ί-	0	1	ί-	0	1 0 1	0	0	1 0	ω
•Η	ο.	Ο	0	1	ο	0	ι 0 ι	0	0	1 C	C
C		£>	0	1	α	0	1 0 1	0	0	0
'05	ο	•Η	05	I	•Η	03	1 03 1	0	0	0	cd
Ρ		Χ>	Χ>	I	Χ>	£>	1 .Ο 1	η	1 Χ>	£>	X)
□				1			1 1
05				1 1			1 1 1
0	05			1			1 1
'05	>			\|			1 1
Ό	<—1			1			1 1		1
05	3			\|			1 1
'05	S	C	0	1	α	0	1 1		1
Ν		•Η	Ή	1	•Η	•Η	1 1
Ν	υ	Ν	Ν	1	Ν	Ν	1 0 1	0	0
Ο	0	0	m	I	0	0	1 Ο 1	ο	Ο
X	0	0	05	1	0	0	ι α ι	0	0	0
	α	0	0	1	Ο	0	ι α) ι	0	0	Ο	Ό
tű		Ν	Ν	1	Ν	Ν	1 0 1	0	0	0	(-1
0	ο	Ό	Ό	1	Ό	Ό	1 05 1	0	0	•Η	:θ
J	ι^-1	L,	0	1 1	0	0	ι 0 ι 1 1	0	0 1	1 Q.	Ν
1		0		1 1	0		1 1 ι 0 1	0	1 0	1 C	α
ω	C	0		1	Ο		1 0 1	0	1 0	0	CD
c +	•Η	r—1		1	γΗ		1 r4 1	<—1	1 <—1	<~4	γ—1
'05	£!	0		1	0		1 0 1	0	1 0	0	0)
Ρ -Ρ	Ο 0)	Ρ		1	Ρ>		1 p 1	Ρ	Ρ	Ρ	-Ρ
.X 05	0 C	C		1	0		0 1	0	C.	0	α
0 Ί3	Ρ -Η	•Η		\|	•γΗ		1 ·Η 1	•Η	•Η	·γ4	Ή
0 r4	0 Ν	Ν		1	Ν		1 Ν 1	Ν	Ν	Ν	κι
κ Ο	X 0	0		1 1 I	0		0 1 1 1 t t	0	1 0	0	0
1		0		1 I	0		1 1 1 1 0 1	0	1 0	t 0	0
ω		0		1	Ο		1 Ο 1	0	0	0	0
α		<—1		1	ι—1		Μ 1	ι—1	1 ι—1	γ4	<—1
'05		0		1	ο		1 0 1	0	ο	0	0
-Ρ Ρ	0	Ρ		1	Ρ		Ρ 1	Ρ	Ρ	Ρ	Ρ
.X 05	α	0		1	α		1 0 1	0	0	α	α
οί ό	•Η	•Η		1	•Η		1 ·Η 1	•Η	1 ·γ4	1 Ή	•Η
Ο r-4	Ν	Ν		1	Ν		1 Ν 1	Ν	Ν	Ν	Κ3
CC 0	0	0		1 1	0		1 0 1 1 1 ι ι	0	0 1	0	0
X		Ο	<Γ	1	Ο		1 1 1 1 1 <Γ 1	<Γ	1 <Γ	1 <Γ	<Γ
ο.		—1	ι—1	1 1 I	<—1	<—1	I <—ι ι 1 1 \| \|	ι—1	1 >—1	1 ι—ι 1	<—1
				1 1			1 1 1 1				1 ι—1
				1	0		1 1				·γ4
				1	ο		1 > 1				Ρ
		1		1	0		1 05 1				0
		<—1		1	0		1 0 1				Ε
		•Η	ι—1	1	04		1 0 1				·γ4
		Ρ	ο	1	ο		1 Ο 1	Ρ	1	>	Ό
		0	Ν	1	Ρ		1 Ν \|	'0		0	1
		Ε		1	0		1 0 1	ι—1		0
		1	•Η	1	ο		1 0 1	0		0	-	0
		<Γ	Ρ	1	0		1 .Ο 1	X		•r4	L0>	·γ4
0		1	ο	1	1		1 1 1	ο	0	Ο	1	Κ)
0		ο	Ν	I	ο		1 Ο 1	1	! ·Η	0	0	0
'05		C	0	1	0		1 0 1	0	0	Ο	0	•Η
4->		•Η	0	1	•Η		1 ·Η 1	•Η	ί-	Ν	•Η	0
Λί		Β	Λ	1	Ε		ι ε ι	ι—1	ο	Ο	Ε	-Ρ
(ΰ		05	1	1	05		1 0 1	·γ4	Ν	0	0	1
α>		1		1	1		1 1 1	0	Ο	1	1
CC		0J		1	<Γ		1 Ο 1	0	0	<ϋ-	C9

·*·<

Cm	3
Cm	>
3 3	<—1
CX'H	3
1 tO	g
-P to
'3	υ
c	3
o	CD
fi	Q.
3
3	O
Xá	<—1

			to				3			co
co	3	CO	CO 3	3	co	3	>> 3	ω	Li >> q	o c
o	3	O	CO	3	O	3	^K3 >	ο	^soJ	3	0
3	3	K_	CO	3	3	3	r-H	3	>	3	rH
Ή	3	•H	'O	3	•rl	3	3	•Η	rH	3	:O
CX	fi	CX	3	fi	Q.	fi	x:	CX	aj x	a	tO

CO o 0 3 3 aj •rl tO

CO aj

CO	>>
0	3
3	'3	0
3	>	o
3	rH	3
3	CO	•H
3	X	CX

•rl tO CO aj

3	to
0 <—1	to Ό 3
0	>>
-P	3	co
3	'3	o
•rl N	> rH aj	3 •H
CO	X	CX

3 •rl 10	W tO Ό 3	3 •rH to
CO	>>	m
3	3	3
CO	'3	co
to Ό	> r-H 3	to Ό
3	X	3

3	:O
CD		to
1—1		>>
CD		3
-P		'3
3	fi	>
•rl	I—1	1—1
to	:O	3
co	tO	X

táblázat: Katechin reakciói különféle pufferekben aj > í—i

Ξ \ aj in 3

Ό cr>

r-H ü

Cl aj

03>

Cm Ή<-h

Cm tO3

COg

Q.

iυ •h0

OCX •H r-HO

CJ rH

I

CO a '3

-P P> 0 .X a) a aj 0 -rl 0 r—I tO KOM

CO c '3

U>

«

3	3	3	3	3	3	3	3
•rl	•rH		•rl	•rl		•rl	•rl	•rl	•H
10	to		to	to		N	to	to	N
co	CO		co	CO		CO	co	CO	W
3	3		3	3		3	3	3	aj
m	CO		CO	CO		co	co	CO	co
tO	to		to	to		N	to	tO	N		Ím
Ό	Ό		'0	Ό		Ό	Ό	Ό	^SO		CD
3	3		3	3	ω	3	3	3	p		rH
>>	>>		>>	>,	o	>>	>>	>>	>>		Ű)
3	3	aj	3	3	c	3	3	3	a	aj	-P
'3 >	'3 >	C r	'3 >	'3 >	aJ	'3 >	'3 . >	'3 >	*aj >	bű	c
rH	r“1	Π	rH	rH	£-i	rH	rH	r—1	r—1	P	•H
3	3	aj	3	3	aj	3	aj	3	aj	^K0j	NI
X	x	X	X	X	C	X	x	X	X	CO	CO

	3		3	3		3	3
	•rH		rH	•rl		•rl	•rl
	to		to	to		to	to
	CO		CO	co		CO	co
	3		3	3		3	3
	CO		CO	to		CO	CO
X	tO	3	10	N	3	to	to	3	3		C
a)	Ό	•rH	Ό	Ό	•rl	Ό	Ό	0	0		(D
i—1	3	to	3	3	to	3	3	rH	rH		r—\|
ω P>	>> 3 '3	CO 3	r*S 3 '3	>> 3 '3	CO 3	3 '3	>, 3 '3	0	CD P		(D P>
c	>	to	>	>	to	>	>	3	3	Ό	C
•rH	r—1	to	rű	rH	to	r—1	r—1	•rl	•rH	rH	•rH
N	3	Ό	3	3	Ό	3	3	to	N	:O	N
CO	X	3	X	x	3	X	.3	CO	co	N	CO

3	3	3	3	3	3	3	3	3	3	3	3
CD	CD	-3	e	0	0	0	Q	0	0	0	0
rH	rH	i—1	i—1	<—1	i—1	i—1	i—1	!----1	i—1	<—1
CD	CD	3	CD	0	0	0	0	0	0	0	0
-P	fi	'3	P	-P	JP	4J	-P	-P	-P	-P	-P
3	3	>	3	3	3	3	3	3	3	3	3
•rH	•rH	1—1	•rl	•rl	•rl	•rH	•rl	•rl	•rl	•rl	•rH
to	to	3	to	to	to	to	to	to	to	to	to
CO	CO	x	CO	CO	3	CO	co	3	w	3	3

I i—I —I

	to			O	o		3
>	5			N	to		o	>
3	0			3	3	1	3	3
3	fi	3		•rl	•rl	rH	0	co
X	1	O		X>	4J	•rl	Cm	O
3	o	to		o	O	P r-H	o	o	P		• >
CX	3	3		to	to	0 O	P	to	'3		3
CX	•rH	3		3	3	g to	0	3	i—1		CO
•rl	g	O		0	0	1 3	o	o	3		3
X	3	<M	3	fi	fi	Ό Ή	3	fi	X		•rH
1	1	•0 1	•rl	1	I	1 4->	1	1	o	3	0
o	<—1	•rl O	3	o	o	o o	o	o	1	•rl	3
3	•rl	.3 3	•rl	3	3	3 to	3	3	3	o	O
rl	-P	0 -rl	ex	•rl	•rl	•rl 3	•rH	•rH	•rl	3	to
g	CD	TD g	•rl	E	g	g 0	E	s	i—1	O	0
3	g	r-H 3	fi	3	3	3 fi	3	3	•rH	to	3
1	•rl	3 1	3	1	1	1 1	1	1	3	0	1
ex	Ό	<r	3	nj	LO	CO	<r	o	3	3	tíl_

-amino-5,6-dimetil- színtelen halványrózsaszin halványrózsaszin rózsaszín barna

-triazin » >·*.

> <—ι 3

E o ícd

Q.

o cö > ι—I

E

co	aj	co	ai	aj
o	C	o	C	C
í-	í-	í-	L,	ί-
Ή	aj	•rl	aj	α!
CL	X>	Q.	X>	x>

co	co	CO	co
cj		o		CJ	o
c	a!	c	co	a	a	cö
ai	C	aj	o	aj	aj	C
ί-	ί-	ί-	í-	ί-	ί-	ί-
α!	α!	α!	•H	α!	α!	α!
a	X>	c	Q.	C	c	X)

c a>

co	rd
o	a>
c	P	co
a!	c	o
ί-	♦rd	L.
α!	N	•H
C	co	CL

a	a
•rl	•rl
N	N	CO
CO	CO	CJ
a!	CÖ	a
co	co	cö
N	N	ί-
Ό	Ό	α!
í-	í-	c

a	C
•H			CD
N	CO	co	ι—1
CO	CJ	CJ	CD
a!	c	c	P
co	cö	cö	C	Ό	Ό
N	L	ί-	•rd	<—1	<—1
o	al	α!	N	:O	:O
í-	C	C	CO	N	N

aj C í-

	C		CÖ
	*H		X)
co	N		>>		co
CJ	co		c		o
C	a)	CO	'CÖ	a)	c
cö	co	O	>	a	a!
ί-	N	í-	rd	ί-	ί-
α!	Ό	•rd	d	α!	α!
C	L.	CL	x:	X)	C

c •rd

tsl	CO	co	co
CO	CJ		CJ	CJ
CÖ	C	CO	a	C	a!
CO	a!	O	cö	cö	c
N	ί-	í-	ί-	ί-	ί-
Ό	α!	•H	α!	α!	α!
í-	C	CL	C	C	X)

CO CO

	N		a			VJ N			c
	Ό		CD	C		Ό			<D
co	í-		«—1	•rl	co	1-	CO	co	1—1
CJ			CD	CO	CJ	<—ι	o	CJ	CD
C		co	•P	aí	a	E '•CÖ	c	C	P
a!	>	o	C	co	cö	>	a!	a!	C	TJ	Ό
ί-	Γ—1	í-	rl	N	ί-	r—1	ί-	ι-	•H	rd	ι—1
α!	d	•rd	N	Ό	α!	(ΰ	α!	οί	tsl	:O	:O
a	4Ξ	Q.	CO	í-	c:	e:	a	a	CO	N	N

táblázat /folytatás/

1

c

C

í-

c

C

a

c

a

c:

C

CO

CD

'CÖ

CD

Φ

CD

c

r—1

ι—1

&

ι—1

í—1

r—1

Γ—1

'0!

CD

c

CD

<D

CD

<D

-Ρ P CD

P

-P

'cö

P

-P

P

Js! a! c

c:

C

>

c

a

C

a

£!

a

a! Ό -H

•rl

1----1

Ή

•rl

rl

•rl

rl

•rl

<D rd M

tsl

tS3

cö

N

tsl

N

CS3

N

tsl

K O CO

CO

x:

CO

r>

co c: •cd P aJ cd κ

	1			rd	1—1
	b!			o	o		c
>	C			N	M		o	>
al	<D			a!	a!	1	c	a!
co	X>	a		rl	•rl	ι—1	CD	co
í-	1	o		P	P	•rl	Cm	CD
□	o	tO		o	o	P	i—1 o	o	-P		>
a	c	aj		tsl	N	CD	O -P	N	'OJ		aj
CL	•rl	a		ÍÖ	a	E	N CD	C	1—1		co
•rd	S	CD		CD	CD	1	cö cj	CD	a!		c
X!	aj	Cm	a	X!	x>	<r	•rl aj	X>	X		•rl
1	1	Ό 1	‘rl	1	I	1	P 1	1	o	c	o
o	rd	•rl O	L.	o	o	o	O O	o	1	•rl	ί-
s	•rd	x: a	Ή	c	a	Ö	N C	c	a	CJ	ο
•rd	P	CD -rl	CL	•rl	•rl	•rl	S -rl	•rl	•rl	ί-	N
E	<D	Ό E	•rl	E	E	E	<D Ξ	E	<—1	Ο	CD
a!	s	rd Π5	P	al	cö	a!	X> aj	a!	•rl	N	í-
1	•rí	Π3 1	c:	1	1	1	1 1	1	a	CD	1
a	Ό	<r	al	C\1	vű	C\J	<T	o	cö	í.	CL

-amino-5,6-dimetil- színtelen halványrózsaszin halványrózsaszin halványrózsaszin barna

-triazin

··*« ·· » · · • *·· φ

- 23 s ω χ χ φ

X φ Cm Cm

Q.

Φ ι—1 'Φ Cm

C :θ ι—1 :3 X

Ό •Η

Ο X <0 Φ ία •Η χ:

υ φ X φ ί±2

Ρ

Φ tO 'Φ <—I X 'Φ Ρ <Τ

	Φ > rd 3 s
	Φ X
ro	Ό
·.
cr>	<—1
X Q.
\	Φ
su 3	> rd
ΦΉ	3
Cm N	s
Cm t0
3	o
Q.	x
1	φ
CO	Q.

<	o
H	rd

o σ>	rd 3 E
X Q. \ X		Φ X Ό
Φ Cm Cm 3 Q.		rd
1		Φ
3	3	>
•H V4	ι—1
s	tSJ	3
Φ <—1	CO	S
o		<J
3		X
Φ		Φ
P Φ		Q.
•rd		O
Q		ι—1

I

C0 'φ

Ρ Ρ Φ

X Φ 3 Φ Ό ·Η ΦΗ Ν Κ Ο C0 co 'φ Ρ χ φ φ CG

	3			3
	•H			•rd
	N			tO
	CO			co
	Φ			Φ
3	n			co
’rd	tO			tO
N W	Ό X >>		CO U	Ό X >,
Φ		CO	3	3	CO
co	'Φ	o	Φ	'Φ	O
N	>	X	X	>	X
Ό X	Γ—1 Φ X	•rd Q.	Φ 3	rd Φ X	•H Q.

•Η tO

CO Φ

CO t \	3	3
3			•rd N		•rd N
Φ			CO		CO
X			Φ		Φ
Φ	3	3	CO		CO
c	•rd	•H	tO		N
>>	tO	N)	Ό	CO	'0 c
3	CO	CO	>,	υ	*-» >,
'Φ	Φ	Φ	3	3	3
>	CO	CO	'Φ	Φ	'Φ
r—(	tO	tO	>	X	>
Φ X	Ό X	Ό X	rd Φ X	Φ 3	rd Φ X

3	3	3	co	3	3	3	3	3	3		3
•rd	Φ	rd	N «·.<>	Φ	•rd	Φ	•rl	•rd	Φ		Φ
tO	1—1	tO	CJ	ι—i	to	r—{	tO	tO	r*H		ι—1
CO	Φ	CO	>3	Φ	CO	Φ	CO	CO	Φ		Φ
Φ	P	Φ	C	P	Φ	P	Φ	Φ	P		P
CO	3	CO	'03	3	co	3	CO	CO	3	X	3
N	•H	tO	>	•rd	tO	•rd	N	N	•H		•rd
•O	N	Ό	ι—1 (Ό	ts)	Ό	tO	Ό	Ό	N	:O	N
X	co	X	.C	CO	X	CO	X	X	CO	tO	CO

3	3	3	3	3	3
Φ	Φ	•H			•rd		Φ		Φ
rH	rH	N			N		ι—1		rH
Φ	Φ	CO			CO		Φ		(D
P	P	05	Φ	Φ	Φ	Φ	P	Φ	-P		Φ
3	3	co	hű	hű	CO	hű	3	W	C	X	hű
•rd	•rd	N	X	X	tO	X	•rd	X	•H	<—1	X
N	N	Ό	'Φ	'Φ	Ό	'Φ	to	'Φ	N	:O	-Φ
CO	CO	L,	co	CO	X	CO	CO	CO	CO	N	co

3	3	3	3	3	3	3	3	3	3	:O	3
Φ	Φ	•rd	•rd	•rd	Φ	•r-Η	Φ	rd	Φ	to	Φ
r-1	r—1	to	tO	to	r~H	tO	ι—1	to	ι—1	>>	ι—1
Φ	Φ	CO	CO	CO	Φ	CO	Φ	CO	Φ	3	Φ
P	P	Φ	Φ	Φ	P	Φ	P	Φ	P	'Φ	P
3	3	co	CO	co	3	CO	3	CO	3	>	3
•H	•H	co	N	to	•H	to	•rd	to	•rl	<—1	•rd
to	to	-o	Ό		to	Ό	to	Ό	tO	Φ	N
CO	co	X	X	X	co	X	CO	X	CO	X	CO

3	3	X	3	3	3	3	3	3	3	3	3
Φ	Φ	'Φ a	Φ	Φ	Φ	Φ	Φ	Φ	Φ	Φ	Φ
ι—1	<—1	1—1	ι—1	1—1	<—1	1—1	l—1	ι—1	I^-1	rd
Φ	Φ	3	Φ	Φ	Φ	Φ	Φ	Φ	Φ	Φ	Φ
P	P	'Φ	X	P	X	P	P	P	P	-P	P
3	3	>	3	3	3	3	3	3	3	3	5
•rd	•rd	1—1	•rd	•rd	•rd	•rd	•rd	•rd	•rd	•rd	•rd
to	to	Φ	N	to	to	to	to	to	to	to	to
CO	CO	X	CO	CO	CO	CO	CO	CO	CO	co	CO

I rd r~d

to

O

o

3

>

3

to

o

>

Φ

1

3

Φ

co

X

3

•rd

1—1

Φ

co

X

1

O

P

•rd

<M

Φ

3

o

to

o

P

rH

O

o

X

>

Q.

3

Φ

to

Φ

O X

to

'Φ

Φ

£X

•H

3 '

3

s

to

Φ

3

ι—1

co

•rd

s

Φ

1

Φ

O

Φ

3

X

Φ

<X

s

X

<r

•rd

Φ

X

•rd

J

1 X

1

•rd

1

X

1

o

3

o

ι—1 ·Η

o

X

o

1

•rd

X

3

•rd X

3

•rd

3

to

3

υ

o

•rd

Ρ Φ

•H

X.

•rd

•rl

•rd

3

•rd

X

to

s

Φ X

s

•rd

e

Ξ

E

Φ

E

s

r—1

o

Φ

Ξ rd

aj

P

Φ

Φ X

Φ

•rl

to

X

1

rd Φ

1

3

1

l

1

|

1

3

Φ

1

Q.

X

<r

Φ

C\J

X

CXJ

<r

o

Φ

X

<£L

-amino-5,6-dimetil- színtelen barna sárga színtelen narancs

-triazin »

táblázat /folytatás/

α) > rH g

\ 3

Ο Ό <—I <—I

X

Q.

\ al s- >

CD 3 rH 'm'H 3

N g □ W

Q.CJ

I3 —>O '3Q.

oo

LOi	r- I^-1
σ>	3 g

a 'x	a) 3
3	Ό
CD
3,	pH
3 Q. 1
1 c	OJ
•H C	>
<J VH	,—1
•pH tO	3
rH CO	g
bű
1	O
1--------1	3
•H	CD
ü	£X
•H
r—l	O
CD	1—1

I

W c '3

P P CD aj a aj ό ·η t> pH tsi cc o co co 'd

P je aJ <D CE

c

3

a

3

•pH

•rH

•pH

•rd

<D

N

CO

co

N

i—1

CO

O

cj

CO

<D

aj

CO

OJ

aJ

a

aJ

aj

P

aj

co

o

a

co

aj

ai

co

3

Ό

3

N

3

N

3

N

3

•rH

i—1

3

Ό

pH

aj

Ό

aj

Ό

aJ

N

:O

OJ

aJ

3

Q.

£>

3

£>

CO

N

X3

£>

c •pH N

3	3	3	3	3	3	a	3	3	3	3
CD	•H	CD	•rH	•rH	•rH	CD		CD	CD	•H	•pH
i—1	N	i—1	N	N	co	,—1	CO	r—1	r—1	N	N
CD	co	<D	CO	co	co	CD	o	CD	CD	<0	CO
P	OJ	-P	aJ	aJ	aj	P	3	P	P	ai	aj
3	co	3	co	co	co	3	aJ	3	3	co	co
•pH	N	•rH	N	N	N	•rH	3	•cH	•pH	N	N
N	Ό	N	Ό	Ό	Ό	N	aj	N	N	Ό	Ό
CO	3	CO	3	3	3	CO	3	CO	CO	3	3

OJN

3co

3ai

3

aJ

3

co N -O

3

CD

•H

CD

•pH

CD

r—1

<—1

>4

<—1

1—1

N

,—1

3

N

r—1

rH

r—1

CD

3

CD

CO

CD

>»

co

CD

-P

P

'al

P

0!

P

3

aj

P

3

>

3

CO

3

'Cű •4

co

3

•rH

•pH

i-H

•rd

•rH

N

•rH

K*

N

•H

i—1

•H

•r-1

N

cd

tO

N

Ό

tJ

cd

Ό

N

:O

N

CO

x

CO

3

CO

x:

3

CO

N

CO

a •pH

CS)

CO OJ

3

VJ N

3

CD

•H

CD

<D

Ό

CD

rH

<—1

N

1------1

i—1

3

rH

r-1

•—1

<—1

1—1

CD

CO

CD

f—«

CD

P

aj

P

*“Cd

P

3

co

3

>

3

Ό

3

•rH

N

•rH

rH

•rH

•H

i—1

•rH

N

Ό

ts)

N

cd

N

CO

:O

N

CO

3

CO

X

CO

co

CO

3

CD

^scd

CD

1—1

rH

£

rH

i—1

<—1

rH

i—1

r—l

rH

CD

3

CD

P

'01

P

3

>

a

3

•rl

•rH

rH

•rH

•rl

•rH

•rl

N

aJ

N

tJ

CO

.3

CO

1

rH

i—1

1 i—1

N

O

o

3

rH

>

3

N

o

>

P

aj

(D

aJ

aj

1

3

aj

CD

co

£>

3

•rH

•pH

,—1

CD

CO

g

3

1

O

P

•rH

3t

CD

•rH

3

o

ISJ

o

O

P rH

O

o

P

>

u

Q.

3

aj

N

tO

CD Ο P

tO

'01

aj

1

O.

•rH

c

3

g N

CD

S

<—1

co

•pH

g

CD

i aJ

CJ

CD

aJ

3

—

j3

aj

<4-1

a

x>

JO

pH

aj

P

X

•rH

in

3

1

1 Ό

1

•pH

1

1 P

1

o

3

CJ

1

•pH

o

Γ—1 ·γΗ

o

3

o

o o

o

1

•rl

3

o

N

3

•Η X

3

•rH

3

3 tSJ

3

CJ

O

3

aJ

•pH

4-> Q

•rH

Q.

•rH

•pH

•rl 3

•rH

•pH

3

N

•rH

g

Φ Ό

g

•rH

g

g <D

g

<—1

O

CD

g

3

aJ

S rH

aj

P

al

aJ

aj X)

aJ

•rH

N

3

aj p

1

•rH Π5

1

3

1

1 1

1

3

CD

1

a

Ό

<r

aj

OJ

O

OJ

'T

o

aj

3

cn

- 25 ··«· <

• · ·· ···· ·· • · · • ··· · táblázat: Katechin reakciótermékeinek λ értékei max ι

Ό

•H t»0

0'0 X

X CO '0)

3 X C

LT>

O

o

<O

o

O C 1

a-

cm

C0

a-

MJ

<r

C0

\0

ι—1

N :θ X

<—1

00

<T

Γ—I

co

in

<r

CO <—1 0)

—

•K

£> :3 S

r—1

o

I—1

o

Ό

•H

O

α

3

in

o

-4

o

O X

CM

ι—1

CO

<—1

1------1

CM

co

CM

N 01

o

O

o

O

co >

·.

·<

Λ

·»

•t

n

o

<

Ό

Ή <—1

CJ '01

Q. 3

o

ÍM 1

o

co

mj

00

t—

a-

00

CO

O £

<\l

co

<r

I—1

00

co

in

<r

N g

·*

·»

·*

·<

«s.

CO e

ι—1

o

1—1

o

$ <

\

E

CO

E

CO

E

CO

E

co

E

CO

E

CO

X

a

o

a

ι—1

3

o

3

o

3

o

3

o

3

ι—1

3

o

0!

3

rH

3

1

3

Ξ

in

co

o

O

co

in

CO

O

Ki

O

CO

O

in

CO

in

CO

re

a-

o

CM

>

co

o

a-

o

a-

O

CM

o

CM

>

a-

(J

a-

CJ

<r

in

<r

in

<r

\

<r

\

in

σ>

\

in

X

»

·>

Q.

in

σ>

\

cn

σ>

X

a

&

Q.

Ή

X

in

X

\

S

in

Q.

in

a

al

σ>

*%

-s

P

i—1

o>

-P

ca

σ>

-P

'di

'01

o

'0J

X

'01

3

X

3

£X

X

3

Φ

o

01

Q.

o

X

O

x

.o

x>

•P

£>

Q

£>

q_<

3

Φ

X

3

X

3

ol

•H

s

CO

s

S

al

X

x

X

<

X

<

X

1 o

Φ

N

ι—1

<—1

3

φ

o

3

Φ

-P

>

N

O

>

jQ

'Φ

01

3

ol

3

0)

1

P

to

3

Ή

•rl

Φ

co

ι—1

Φ

3

o

•P

P

X

Φ

•H

N

3

N

O

o

P

co

Q.

01

N

P

M

Φ

co

a

3

Φ

3

E

:o

•H

φ

Φ

o

Φ

1

X

n

£>

al

X>

<r

3 co

1

3

1

Φ 3

o

O

o

•H

o

rP

N '01

a

c

3

(J

CJ

3

O

CO P>

•H

3

•H

N

-α x

E

O

E

al

3 σ)

kJ

al

kJ

al

01

N

01

•H

Φ Φ

1

Φ

1

-P

ffi cc

£X

<r

CM

CO

<r

o

3

CM

• · • · · « · • ··♦ · A. · ·

- 26 táblázat: Optimalizált katechin-reakciórendszerek /végkoncentrációk az elegyben/

2Ü '(D

S\

GS <L>C

P\

Ό •ΗX

O<0 cüs <0 (D

CC \

• ι—I Ο Ό C B Ο E Cü \

X CX

<P Cm Cm

CL, g o •rl

E '<1> tX, w G '01 P> 2Ü <D cc

o	O	O	o	o	o	in	in	in	in
CM	CM	CM	CM	LA	LA			t—	L·—
LA	LA	LA	LA	in	LA	<r	<r	<r	<r

LA	LA	in	LA		σ>	m	LA	LA	in
t-		c—	t—	ι—1	1—1	Γ-	t-	ί-	>-
		m
o	O		o			Ο	O	Ο	o
r—\|	.—1		.—1			f“d	,—1	r-1	ι^-1

> 'Φ

G

O S o cü > 'CD

G

O G O cü

<—ι \ ι—I Ό

B

E

-P	4->	-P	-P	4->
CO	'(ΰ					'01	'01	'01
G	G					C	G	c
O	o					O	O	o
X	£>	Q			X	J3	x>	x>
G	G	CL,	CL,	o	O	G	G	G
ol	cfl	s	s	cö	0!	01	01	G	•P
Cü	Cü	<		2	2	cü	Cü	Cü	'01
									G
	LA	LA	LA						O
LA	CM	CM	CXJ	LA	LA	LA	LA	LA	n
AJ	O	O	o	CM	CM	o	CM	O	G

ol

o	O	O	O	O	O	O	O	o	Cü
-P	C	c	G	S 3 •H	G	c	-P	c	-P
t—1	'01	'01	'01	'Φ	'01	'01	ι—1	'01	<—1
oi	hű	hű	hű	C	hű	hű	01	hű	01
O	G	G	G	hű	C	G	JO	G	£
o	01	01	ol	0!	01	aj	o	01	O
Cü	8	S	S	E	S	S	CÜ	E	Cü

vű LA CM

O <r lO

O a o N Oj

C <D Cm,

O G

Ή E cű <r

co	co	co
CM	CM	CM
·*
ι—1		rH

o
	N	>	>
	ol	ol	01
	•H	w	m
	-P	CD	G
	O	O	5
	to	N	ex
	C	G	Q.
	Φ	Φ	•H
	£	£>	X
c	1	1	1
•H	o	o	o
Ο	c	G	c
G	•H	•H	•H
Ο	B	8	B
N	ol	01	ol
Φ	1	\|	1
G	Lű	O	ex

7. táblázat: 4-Amino-fenazon-koncentráció optimalizálása mangán + karbonát-puffér /pH 10/ rendszerben

4-amino-fenazon Abszorpció 520 nm-en koncentrációja Plató

Vak /mmól/1/

50	1,151	/3	perc/	0,011
30	1,159	/3	perc/	0,010
10	1,171	/3	perc/	0,006
5	1,170	/3	perc/	0,06

8. táblázat: Nátrium-karbonát-koncentráció optimalizálása

4-amino-fenazonos reakcióban

Nátrium-karbonát- -oldat koncentrációja /mmól/1/	Abszorpció 520 nm-en Plató eléréséig
/plató/	eltelt idő /perc/
600	0,768	2,0
400	0,774	2,5
200	0,753	2,5
100	0,750	3,5
50	0,746	5,0

9. táblázat:	Száliciiát-méghatározás	pontossága 1 napon belül
Átlagérték	S.D.^a/	c.v¹?/	n^c/
/mmól/1/
1,03	0,0488	4,6	15
4,14	0,0516	1,2	15
a/ standard	deviáció
b/ variációs	koefficiens
c/ vizsgált	minták száma
10. táblázat	: Mért szali	cilát-koncentrációk visszanyerése poten

ciálisan zavaró vegyületek jelenlétében /zavaró vegyületek koncentrációja 10 mmól/1/

Zavaró vegyület	Mért szalicilát- -koncentráció /mmól/1/	Szalicilát visszanyerés /%/
- /szérumos kontroll/	2,05	100
szálici1-uronsav	2,15	105
2,5-dihidroxi-benzoesav	2,30	112
benzoát	2,05	100
4-hidroxi-benzoát	2,00	98
L-tirozin	2,05	100
4-amino-szalicilát	2,05	100
aceto-acetát	2,10	102
3-hidroxi-butirát	2,08	101

9-

1/a/ példa

Szalicilát meghatározása egyetlen reagens-rendszerrel

Reagens

szalicilát-mono-oxigenáz	151	egység/1
NADH vagy NADPH	0,25	mmól/1
CHES-puffer /pH 10,0/	145	mmól/1
kobalt-acetát	0,25	mmól/1
4-amino-fenazon	1,29	mmól/1

Módszer /U1 szérum-mintát 1 ml reagenssel 6 percen keresztül inkubálunk. Meghatározzuk 520 nm-en az abszorpciót. A különböző koncentrációban szalicilátot tartalmazó szérum-mintákkal kapott eredményeket a 1L táblázatban ismertetjük.

11. táblázat

Szalicilát koncentrációja	Abszorpció 520 nm-en
a szérumban /mmól/1/
1	0,151
2	0,300
3	0,435
4	0,592
5	0,746

2. példa

Szalicilát meghatározása két reagens-rendszerrel

Enzim-reagens

szalicilát-mono-oxigenáz	304	egység/1
NADH vagy NADPH	1,52	mmól/1
Tris-HCl-puffer /pH 8,6/	30	mmól/1
mangán-klorid	0,15	mmól/1
4-amino-fenazon	3,94	mmól/1

Lúgos reagens nátrium-karbonát-oldat

Whitconate AOS Li8

Módszer /U1 szérum-mintát 330 yUl enzim-reagenssel inkubálunk 4 percen keresztül. Hozzáadunk 1 ml lúgos reagenst, és 4 perc múlva 520 nm-en mérjük az abszorpciót. A különböző koncentrációban szalicilátot tartalmazó szérum-mintákkal kapott eredményeket a 12.táblázatban ismertetjük.

12.táblázat

Szalicilát koncentrációja	Abszorpció 520 nm-en
a szérumban /mmól/1/
1	0,126
2	0,269
3	0,405
4	0,564
5	0,705

- 31 A következő példákban két reagens-rendszercel végezzük a meghatározásokat, de egyetlen reagens-rendszer is alkalmazható

2/a/ példa

Szalicilát meghatározása két reagens-rendszerrel

Enzim-reagens

nátrium-klorid	100	mmól/1
4-amino-fenazon	4	mmól/1
mangán-klorid	0,15	mmól/1
NADH	4,5	mmól/1
EPPS-puffer /pH 8,6/	150	mmól/1
dextrán /liofilezéshez töltőanyag/	2	°/o
marha-szérumalbumin	2	mg/ml
glükóz	4,5	%
glükóz-dehidrogenáz	0,1	egység/ml
szalicilát-mono-oxigenáz	2	egység/ml
Lúgos reagens
nátrium-karbonát	150	mmól/1
Witconate AOS	0,05	%
nátrium-azid /konzerválószer/	0,1	%

Módszer /U1 szérum-mintát 500 ^ul enzim-reagenssel szobahőmérsékleten A percen keresztül inkubálunk. Hozzáadunk 1 ml lugo reagenst, és szobahőmérsékleten 4 percen keresztül inkubáljuk, majd 520 nm-en mérjük az abszorpciót.

Automatizált eljáráshoz módszer

Az analizátort úgy állítjuk be, hogy 5 ^ul szérum-mintát, 70 /U1 enzim-reagenst és 10 ^ul vizet /mosáshoz/ pipettáz zon be az analitikai rotor egyik cellájába; a másik cellába 140 /U1 lúgos reagenst és 10 ^ul vizet /mosásra/.

A rotorok tartalmát 37 °C-on 4 percen keresztül tartó inkubálás után elegyítjük. Újabb 2 percen át tartó inkubálás után leolvassuk az 520 nm-en mért abszorpciót, 600 nm-en 5 másodperccel később felvett bikromátos vak leolvasással szemben.

A különböző koncentrációban szalicilátot tartalmazó szérum-mintákkal kapott eredményeket a 13. táblázatban foglaljuk össze.

13. táblázat

Szalicilát koncentrációja	Abszorpció /o20 nm - 600 nm/
a szérumban /mmól/1
1	0,0656
2	0,1516
3	0,2355
4	0,3214
5	0,4084

Redukált piridin-nukleotid	/NADH/ meghatározása
Enzim-reagens
szalicilát-mono-oxigenáz	304 egység/1
nátrium-szalicilát	5 mmól/1
Tris-HCl-puffér /pH 8,6/	30 mmól/1
mangán-klorid	0,15 mmól/1
4-amino-fenazon	3,94 mmól/1

• ·

4. példa

Redukált piridin-nukleotid /NADPH/ meghatározása

A 3. példában ismertetett reagnest és eljárást alkalmazva felvesszük a NADPH kalibrációs görbéjét. Az eredményeket a

14. táblázatban ismertetjük.

14. táblázat

NADPH koncentrációja szérumban /mmól/1	Abszorpció 520 nm-en
1	0,124
2	0,263
3	0,407
4	0,652
5	0,701

5. példa

Laktát meghatározása

A laktát koncentrációjának meghatározására a NAD⁺

NADH-vá redukálását használjuk által katalizált reakcióban. A példában ismertetett eljárássá

Enzim-reagens szalicilát-mono-oxigenáz nátrium-szalicilát Tris-HCl-puffér /pH 8,6/ laktát-dehidrogenáz /E.C.1.1.1 mangán-klorid fel, laktát-dehidrogenáz enzim keletkezett NADH-t ezután a 3.

határozzuk meg.

304	egység/1
	5	mmól/1
	30	mmól/1
27/	100	egység/1

0,15 mmól/1

4-amino-fenazon

Lúgos reagens nátrium-karbonát-oldat

Whitconate AoS Li8

Módszer

3,94 mmól/1

120 mmól/1

0,05 %

330 /U1 enzim-reagenst 25 ^ul, laktátot tartalmazó szérum-mintával 4 percen keresztül inkubálunk. Hozzáadunk 1 ml lúgos reagenst, és 4 perc elteltével 520 nm-en mérjük az abszorpciót. A különböző szérum-laktát-koncentrációk esetén kapott eredményeket a 15. táblázatban ismertetjük.

15. táblázat

Laktát koncentrációja szérumban /mmól/1/	Abszorpció 520 nm-en
1	0,124
2	0,264
3	0,406
4	0,562
5	0,711

6. példa

Glükóz meghatározása

A glükóz koncentrációjának meghatározására ATP-t és hexokináz enzimet használunk, amely az összes glükózt glükóz-6-foszfáttá alakítja. Ezután a NAD⁺ NADH-dá alakítására glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz enzimet használunk, majd a NADH mennyiségét a 3. példában leírtak szerint meghatározzuk.

Enzim-reagens

szalicilát-mono-oxigenáz	304	egység/1
nátrium-szalicilát	5	mmól/1
Tris-HCl-puffer /pH 8,6/	30	mmól/1
magnézium-klorid	2	mmól/1
NAD⁺	5	mmól/1
glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz	100	egység/1
/E.C.l..1.49/
mangán-klorid	0,15	mmól/1
4-amino-fenazon	3,94	mmól/1
Lúgos reagens
nátrium-karbonát-oldat	120	mmól/1
Whitconate AoS Li8	0,05	%

Módszer /U1 szérum-mintát feleslegben lévő ATP-vel és hexokináz enzimmel /E.C.2.7.1.1./ reagáltatunk. Hozzáadunk 330 ^ul enzim-reagenst, és az elegyet 4 percen keresztül inkubáljuk. 1 ml lúgos reagenst adunk hozzá, és 4 perc elteltével mérjük 520 nm-en az abszorpciót. Az eredményeket a 16. táblázatban ismertetjük.

16.táblázat

Glükóz koncentrációja szérumban /mmól/1	Abszorpció 520 nm-en
1	0,122
2	0,264
3	0,413
4	0,570
5	0,713

• ·

7. példa

Acetil-szalicilát meghatározása

A mintában lévő acetil-szalicilátot először aril-észter-

-hidroláz enzimmel szaliciláttá	és	acetáttá hi	drolizáljuk. A fel
szabadult szalicilátot ezután a	2.	példában ismertetett eljárás-
sál meghatározzuk.
Enzim-reagens
aril-észter-hidroláz /E.C.3.1.1.	2/	200	egység/1
szalicilát-mono-oxigenáz		304	egység/1
NADH vagy NADPH		1,52	mmól/1
Tris-HCl-puffér /pH 8,6/		30	mmól/1
mangán-klorid		0,15	mmól/1
4-amino-fenazon		3,94	mmól/1
Lúgos reagens
nátrium-karbonát-oldat		120	mmól/1
Whitconate AoS Li8		0,05	%

Módszer /Ul, acetil-szalicilátot tartalmazó szérum-mintát 330 /U1 enzim-reagenssel inkubálunk 4 percen keresztül. Hozzáadunk 1 ml lúgos reagenst, és 4 perc múlva 520 nm-en mérjük az abszorpciót. Az eredményeket a 17· táblázatban ismertetjük.

17. táblázat

Acetil-szalicilát koncentrációja szérumban /mmól/1	Abszorpció 520 nm-en
1	0,130
2	0,274
3	0,412
4	0,570
5	0,715

Claims

Szabadalmi igénypontok

1. Eljárás egy minta szalicilát-tartalmának meghatározására, azzal jellemezve, hogy a szalicilátot szalicilát-mono-oxigenáz enzimmel enzimatikusan katechinné alakítjuk, redukált piridin-nukleotid, különösen NADH vagy NADPH jelenlétében, a katechint egy /1/, /11/, /111/ vagy /IV/ általános képletü vegyülettel - a képletekben

Rp R^ és R^jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, aminocsoport vagy 1-6 szénatomos alkilcsoport,

R^ - R_1q jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, alkilcsoport, aminocsoport, -NR^jR-^2’ hidroxilcsoport, hidroxi-metil-csoport, formilcsoport, karboxilcsoport,

-CO/CH„/ H, -C0NH/CH_o/ COOH vagy -NH_.HOOCCOOH.H_ONC,H_C
2 n ’ 2n 2 265 képletü csoport, ahol értéke 1 és 5 közötti egész szám, és és R^2 jelentése egymástól függetlenül 1-5 szénatomos alkilcsoport, azzal a megkötéssel, hogy ha a /11/ általános képletben ^R4 ^R9 ^R4 ^R9 közül egyik jelentése aminocsoport vagy -NR-^-^R-^2, akkor a többi közül legalább egyik jelentése 1-6 szénatomos alkilcsoport, aminocsoport, ~formilcsoport, kar boxilcsoport, -C0/CH2/_nH, -C0NH/CH2/_nC00H vagy

-NH2.HOOCCOOH., és a /11/ általános képletü vegyület jelentése amino-fenol-vegyülettől eltérő reagáltatunk, és a kapott színezék mennyiségét kolorimetriásan meghatározzuk.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy reaktánsként egy /1/ általános képletü vegyületet használunk.
3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy olyan /1/ általános képletü vegyületet használunk, amelynek képletében R^ metilcsoportot, R^ hidrogénatomot vagy metilcsoportot és R^ aminocsoportot jelent.
4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy reaktánsként egy /11/ általános képletü vegyületet használunk.
5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy olyan /11/ általános képletü vegyületet használunk, amelynek képletében R^ hidroxi-metil-csoportot, R^ aminocsoportot és R^ - R^ hidrogénatomot jelent.
6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy reaktánsként egy /11/ általános képletü vegyületet használunk, amelynek képletében n értéke 1, R? jelentése aminocsoport, és R^, R^, Rg és jelentése hidrogénatom.
7. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy reaktánsként egy /11/ általános képletü vegyületet használunk, amelynek képletében R^ jelentése -CO/CH^/nH, ahol n értéke 1, R? jelentése aminocsoport és R^, Rg, Rg és Rg jelentése hidrogénatom.
8. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy reaktánsként egy /111/ általános képletü vegyületet használunk.
9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy olyan /111/ általános képletü vegyületet használunk, amelynek képletében R? jelentése aminocsoport, és R^ - Rg és Rg - R_1q jelentése hidrogénatom.
10. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy reaktánsként egy /IV/ általános képletü vegyületet használunk.
11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy olyan /IV/ általános képletü vegyületet használunk, amelynek képletében R^ és Rg jelentése metilcsoport és Rg jelentése aminocsoport.
12. Az 1 - 11. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az /1/ - /IV/ általános képletü reaktánsokat 0,5 - 50 mmól/1 koncentrációban használjuk.
13. Az 1 - 12. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy a szalicilát katechinné alakítását és a katechin színezékké alakítását egylépéses re akcióban végezzük, ahol az összes reagens együtt van jelen.
14. Az 1 - 12. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy a szalicilát katechinné alakítását és a katechin színezékké alakítását két egymást

- 40 követő lépésben vágezzük.
15. Az 1 - 14. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a piridin-nukleotidok redukálását litium-laktáttal és laktát-dehidrogenázzal végezzük.
16. Az 1 - 15. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az enzimreakció katalizálására fémionokat is adunk a reakcióelegyhez.
17· A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy fémionként mangán- vagy kobaltiont használunk.
18. Az 1 - 17· igénypontok bármelyike szerinti eljárás, . azzal jellemezve, hogy reaktánsként 4-amino-fenazont, 2-amino-benzoesavat, 4-amino-hippursavat, 4-amino-acetofenont vagy 6-amino-benzotiazolt használunk.
19. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy reaktánsként 4-amino-fenazont használunk .
20. Az 1 - 19. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a katechint pH 8 - 14 értéken reagáltatjuk az /1/ - /IV/ általános képletü vegyületek egyikével.
21. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy a reagáltatást pH 10 értéken végezzük .

;;.··. :«· .*·, • · · ·* .· ·» .... «... .,.
22. Az 1 - 21. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a pH beállítására karbonát—hidrogén-karbonát-, borát-, glicin-, dietanolamin-, glicil-glicin-, nátrium-foszfát-, kálium-foszfát-, Tris-HCl-,

2- /N-ciklohexil-amino/-etánszulfonsav~. /CHES/, 2-amino-2-metil-1-propanol- /AMP/, 2-amino-2-metil-l,3-propándiol- /AMPD/, N-/trisz/hidroxi-metil/-metil7-3-amino-propánszulfonsav- /TPAS/,

3- /ciklohexil-amino/-l-propánszulfonsav- /CAPS/, N-/2-hidroxi-etil/-piperazin-N-2-etánszulfonsav- /HEPES/ vagy N-/2-hidroxi-etil/-piperazin-N-3-propánszulfonsav- /EPPS/-puffért használunk.
23. Az 1 - 22. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a színezék kialakítását CHES-puffer jelenlétében pH 10 értéken végezzük.
24. A 23. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy a meghatározást egylépéses eljárással, ázinkifejlesztő reaktánsként 4-amino-fenazonnal végezzük.
25. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy a színezék kialakítását N-/2-hidroxi-etil/-piperazin-N-3-propánszulfonsavat tartalmazó enzim-

-reagens és nátrium-karbonát-puffér elegyítésével végezzük pH 8,6 értéken, amelyet a szalicilát katechinné alakítására is használtunk .
26. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy a reagensek liofolizált formában vannak.

·..”. :···.«.

► ·* .· ···. .· ·· .... .... ,,,» ,»_M
27. A 26. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy a reagenseket szilárd hordozóra visszük fel egymást követően, megfagyott rétegek formájában, majd liofilizáljuk.
28. Az 1 - 27· igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a színezék stabilitásának javítására felületaktiv anyagokat is adunk a reakcióelegyhez.
29. Eljárás egy minta redukált piridin-nukleotid-tartalmának meghatározására, azzal jellemezve, hogy egy szalicilátot szalicilát-mono-oxigenáz enzimmel katechinné alakítunk, redukált piridin-nukleotid jelenlétében, a katechint egy /1/, /11/, /111/ vagy /IV/ általános képletü vegyülettel - a képletekben ^Rl> ^R2θ^{Ξ R}3 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, aminocsoport vagy 1-6 szénatomos alkilcsoport,

R^ - R_lo jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, alkilcsoport, aminocsoport, -NR^^R^₂, hidroxilcsoport, hidroxi-metil-csoport, formilcsoport, karboxilcsoport, -CO/C:-I₂/_nH, -C0NH/CH₂/_nC00H vagy -NH₂ . HCOCCOCH. képletü csoport, ahol n értéke 1 és 5 közötti egész szám, és

Rp és R^₂ jelentése egymástól függetlenül 1-5 szénatomos alkilcsoport, azzal a megkötéssel, hogy ha a /11/ általános képletben R^ - Rg közül egyik jelentése aminocsoport vagy -NR₁₁R₁₂, akkor a többi közül legalább egyik jelentése 1-6 szénatomos alkil csopcrt, aminocsoport, -NR^-^R^2» formilcsoport, kar boxilcsoport, -C0/CH2/_nH, -CONH/Cl^/nCOOH vagy

-N^/FOOCCOOH.H^NCgH,-, és a /11/ általános képletü vegyület jelentése amino-fenol-vegyülettől eltérő reagáltatunk, és a kapott színezék mennyiségét - amely a minta redukált piridin-nukleotid-tartalmának mértéke - kolorimetriásan meghatározzuk.
30. Diagnosztikai készlet egy minta szalicilát vagy redukált piridin-nukleotid - különösen NADH vagy NADPH - tartalmának meghatározására, az 1 - 29. igénypontok bármelyike szerinti eljárással, azzal jellemezve, hogy /a/ redukált piridin-nukleotid jelenlétében szalicilátot katechinné alakitó szalicilát-mono-oxigenáz enzimet, és /b/ a katechin színezékké alakítására képes, 1. igénypontban meghatározott /1/, /11/, /111/ vagy /IV/ képletü vegyületet tartalmaz.
31. A 30. igénypont szerinti diagnosztikai készlet azzal jellemezve, hogy az /1/, /11/, /111/ vagy /IV/ általános képletü reaktánst szilárd vagy félszilárd hordozóban felitatva, immobilizált formában tartalmazza.
32. Az 1 - 29. igénypontok bármelyike szerinti eljárás,