HUT54308A

HUT54308A - Process for producing immunoglobulin conjugates and medicaments comprising same

Info

Publication number: HUT54308A
Application number: HU902047A
Authority: HU
Inventors: Michael Jon Pikal; Michael Larry Roy
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1989-04-04
Filing date: 1990-04-02
Publication date: 1991-02-28
Also published as: AU5252090A; EP0392717A1; ZA902519B; HU902047D0; CA2013600A1; IL93986A0; KR900015760A; JPH02290822A

Description

A találmány tárgya eljárás immunoglobulin-konjugatok és az ezeket tartalmazó gyógyszerkész Ítmény ek előállítására·

A Vinca rosea-ból nyerhető alkaloidok a daganatgátló szerekkel kapcsolatos kutatások kémiájának egyik leggyümölcsözőbb területét képezik· Kez> detben esak a növény leveleiből extrahálható néhány alkaloidot tartották hatásosnak· A vinca növény leveleiből közvetlenül kivonható hatásos daganatgátó alkaloidok közé tartozik a vinblastin /vincaleukoblastin vagy VLB/, vincristin /leurocristin/, leurosin /vinleurosin/, leurosidin /vinrosidin/, leuroformin /fonail-leurosin/ és dezoxi-VLB A” és ⁿB^H /4*-dezoxi-VLB és 4’-dezoxi-leurosidin/· Más, kevésbé bőségesen előforduló daganatellenes alkaloidokat is találtak· A természetes alkaloidok mellett a Vinca rosea-ból nyert indol-dihidroindol alkaloidok kémiai módosítása utján a származékok széles köréhez jutottak, amelyeknél a kémiai módosítás főként a molekula C-3, 6-4’ és 0-4 helyzetét érintette·

Kimutatták továbbá, hogy a daganathoz társuló antigéneket meghatározó monoklonális antitestek hatásos hordozóanyagok a célirányos daganatterápia megvalósításához, mivel ezek az iauaunoglo buli nők kovalensen kötődnek különböző daganatsejtoldó szerekhez. Tekintettel a vinca-alkaloidok és kémiai származékaik, valamint ··♦♦ • V · • · · • ·« ♦ · · • · · · · · •·* ·· ··«· · *«··

- 3 a hozzájuk köthető antitestek fontosságára az irányított daganatterápiában, a VLB-t, vincristint és más daganatgátló szereket immunoglobulinökkal és más fehérjékkel kapcsoltak össze. Például a 2,O9O,833A számú Egyesült Királyság-beli szabadalmi leírás immunoglobulin konjugánsokat ismertet, amelyek a vinca-részhez amidképzés utján kovalesen kötődnek. A 3,392,173 és 3,397,001 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás a VLB, vinoristin, leurosidin és hasonló vegyületek C-4 észtereit Írja le. Közéjük tartozik egy klór-acetil-észter származék, amelyet fehérjével konjugáltak /124,502 számú európai szabadalmi leírás/· Teale éa munkatársai /Brit. J. Clin. Phaim. 169 Ο31ΊΠ a vinca-alkaloid albuminhoz kötését Írják le; az alkalmazott Mannichreakció során a fehérje /BSA, borjúszórum albumin/ aminocsöpörtját formaldehiddel és vinblastinnal kapcsolják össze. Johnaon és munkatársai /Brit. J. Can. 44. 372 /1991// azid segítségével anti-CEA-hoz /karcinoembrionális antigén/ kötött vindesin előállítását Írják le.

A vinca-alkaloidok vagy kémiai származékaik immunoglobullnokhoz történő más hasonló konjugációját részletesen közlik a 4,301,683 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban.

E fenti szabadalmi leírásban immunoglobulin konjugatok sorát ismertetik, amelyeket úgy ··♦ ·· » · • 4 állítanak elő, hogy a 03 vagy 04 helyzetben hidrazidcsoportot tartalmazó daganatgátló indol-dihídroindol vinca-alkaloidot aldehidcsoportokat tartalmazó oxidált glikoproteinnel reagáltatnak· E konjugátokat a fenti szabadalmi leírás szerint előnyösen parenterálisan alkalmazzák· A parenterális gyógyszerkészítmények előállításakor azonban az a nehézség jelentkezik, hogy a liofilizált immunoglobulin-konjugát tennék a feldolgozás és tárolás során hajlamos az agregálódásra· Találmányunk célkitűzése e probléma megoldása olyan parenterális készítmények előállítása utján, amelyek stabilizálva vannak az immunoglobulin konjugát agregáoiója ellen.

Találmányunk tárgya eljárás oxidált glikoprotein és /1/ általános képlett! vinca-hidrazid konjugátot, valamint az agregáció ellen stabilizáló mennyiségi! glicint és mannitot tartalmazó parenterális gyógyszerkészítmények előállitására; az /1/ általános képle ti! vinoa-hidrazidban

R hidrogénatomot, -CH^ vagy -CHO csoportot jelent;

és r5 különállása esetén az R^ _SZUbsztituens hidrogénatomot, és az Έ? és szubsztituensek egyike etilcsoportot és másika

- 5 hidrogénatomot vagy -OH csoportot jelent; vagy és a hozzájuk kötődő szénatomokkal összetartva oxirángyűrüt alkot, amikor is R etilcsoportot jelent;

R jelentése -NHNH^ csoport, /1/ általános képletű csoport - ahol n = 2, 3 vagy 4 - ,

-0-/1-3 szénatomos alkil/-, -KHg, -lIH/1-3 szénatomos alkil/-csoport, -HH-CH₂CH₂-Y általános képletű csoport, amelyben

X jelentése klóratom, -OCH^ vagy -SCH3 csoport,

1-pirrolidinil- vagy 1-piperidinilcsoport;

R^ hidrogénatomot, /1-3 szénatomos alkil/-CŰ csoportot, klóratommal helyettesített /1-3 szénatomos alkil/ -CO csoportot vagy R általános képle tű csoportot jelent, ahol

R⁶ jelentése -COXCONHNHg általános képletű csoport, amelyben

X 1-4 szénatomos egyenes alkilén- 6 - • f ·· eeee *· ··*··· ··· • ·· · · · • · · · · « ··· ·· ··»· · ···· láncot, 2-8 szénatomos elágazó alkilénláncot, 2-4 szénatomos alkenilén-, 3-4 szénatomos alkintiéη-, 3-6 szénatomos cikloalkilén-, fentién-, hidroxi-szubsztituált 1-4 szénatomos alkilén-csöpörtot vagy egyszeres vegyértékkötést jelent, azzal a feltétellel, hogy R nem jelenthet -NHNHg csoportot, ha R¹ jelentése R^ általános képletű csoport, és R^ nem jelenthet R^ általános képletű csoportot, ha R jelentése -NHNHg csoport· A találmány szerint eljárást is kidolgoztunk a parenterális gyógyszerkészítményben levő oxidált glikoprotelnek és az /1/ általános képletű vincahidrazid immunoglobulin konjugátjeinek agregálódása ellen, mely szerint az Immunoglobulin konjugátot glicin és mannit agregációt gátló mennyiségével keverjük össze·

Mint említettük, a gyógyszerkészítményekben használt immunoglobulin konjugátokát és a találmány szerint alkalmazott eljárásokat az 1939· január 1-én nyilvánosságra hozott 4,801,683 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás ismerteti, amelyre itt

- 7 hivatkozásként utalunk· A konjugát előállításakor egy vagy több aldehidcsoportot tartalmazó oxidált glikoproteint vínca-hidraziddal reagáltatunk· A hidrazidcsoport C-3 karboxi-hidrazid, vagy szénhidrogénlánc utján kapcsolódó 0-4 hidrazidot tartalmazó ásztor lehet· A találmány szerint használt konjugátok képzésére alkalmazott hidrazidok különféleképpen állíthatók elő, függően attól· hogy a hídruzid a J-3 vagy O4 helyzetben kötődik-e· A C-3 hidrazidok a 4,2ü3,898 száma Amerikai Egyesült /llamok-beli szabadalmi leírás sierint állíthatók elő· Ha a hldrazidcsoport a C-4 lánc része» a 4-dezacetil kiindulóanyagokat a 3»392>173 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírási a J. Med· Chem. gg. 391 /1979//i a 30,560 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás; a 4»357»334 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi létrád $ a 4»203»893 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás és a 4*667»030 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás szerint állítjuk elő» amelyekre itt hivatkozásként utalunk.

A konjugátokban oxidált glikoproteint, előnyösen ismunoglobulint, és ezen osztályon belül előnyösen monoklonális antitestet» mint gamma-globulint, így IgG-t vagy IgM-et alkalmazunk. E konjugatok létrehozásához szénhidrátot tartalmazó immunoglobulin frag meritumok is használhatók, A glikoproteinek előnyben részesített osztályát képező immunoglobulinők azok, amelyek a kívánt célsejtek antigénjeivel reakcióba lépnek, vagy azokat legalább is felismerik. Különösen előnyösek azok a glikoproteinek, amelyek a kívánt célsejt felszíni antigénjeit ismerik fel· Antitestből származó, például fehérjebontó enzimes emésztéssel vagy redukáló alkilezéssel nyert Pab, rab·, F/ab^t/₂ néven is ismert immunoglobulin töredékek és IgM monomer is alkalmazható· A konjugátbán történő felhasználáshoz előnyben részesített immunoglobulin a KS1/4 monoklonális antitest·

A vinca-hidrazidot az oxidált glikoproteinnel ismert eljárások segítségével konjugáljuk. Általában a vincát vizzel elegyedő oldószerben, mint dimetil-formamidban oldjuk és hozzáadjuk az oxidált glikoprotein lehűtött, pufferezett oldatához. Előnyben részesítjük a mintegy 0-8°C hőmérsékletet és általában O,ln nátrium-acetát puffért használunk, A reakciót előnyösen sötétben, közömbös védőatmoszféra alatt hajtjuk végre· A reakció szokásosan mintegy 10-24 óra alatt végbemegy és a képződött konjugát standard módszerekkel, mint Sephadex gélen kromatografálva tisztítható. Különösen előnyös konjugát a 4-dezacetil-3-karboxi-hidrazid — KS1/4 monoklonális antitest. Az ilyen konjugátok előállítását részletesen ismerteti a fentebb idézett 4,801,688 számú

Amerikai Egyesült Államok-belí szabadalmi leírás·

A találmány szerinti perenterális készítmény az imiaunoglobulin konjugátot agregáció ellen stabilizáló mennyiségű gllcinnel és manníttal együtt tartalmazza· “Agregáció ellen stabilizáló mennyiség* alatt azt értjük, hogy az immunoglobulin konjugát kisebb mértékben agregálódik, ha a konjugátot glicin és mannit agregáció ellen statáLizáló mennyiségével formuláijuk, mint amikor a konjugátot glicin és mannit nélkül alakítjuk készítménnyé· Az ímmunoglobulin kon· jugát előnyben részesített, agregáció ellen stabil!· zált perenterálls kéadtraénye a konjugátot, a glioint és a mannítot ltltl tömegarányban tartalmazza· Bár az ilyen készítményt részesítjük előnyben, a szakember számára érthető módon a három komponens bármelyikének mennyisége eltérhet a fenti előnybe aránytól és így agregáció ellen stabilizálé mennyiségű glícint és mannítot tartalmazó további előnyös parenterális készítmények állíthatók elő· Egy készítmény összetételét adjuk meg az alábbiakban, amely hatásos mennyiségű imrauoglobulin konjugátot tartalmaz, mintegy 0,01·10 mg hatóanyagtartolómmal /vinca/.

A készítményekben hasz ált konjugátok előállításakor aldehidtartalmú glikoproteineket vinca· •hidraziddal reagáltatunk és így sej tmérgező hldrazon

- 10 konjugatok képződnek. Azonban a szakember számára érthető módon a találmány szerinti parenterális gyógyszerkészítmény szempontjából lényegtelen, hogy az indol-dihidroindol alkaloidot /á 4*301,688 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi bírásban a /11/ általános képlet7 milyen tipusu kémiai kötéssel kapcsoltuk össze a glikoproteinnel. Ez azt jelenti, hogy a találmány szerinti eljárással egy indol-dihidroindol alkaloid és egy glikoprotein konjugátját tartalmazó bármely készítmény stabilizálható agregáció ellen, függetlenül a két rész közötti kémiai kapcsolattól*

Az előnyben részesített kereskedelmi készítmény liofilizált /azaz gyorshütéssel szárított/ por, amelyet használat előtt újra feloldunk /rekonstituálunk/. Ez történhet gyógyszerészetileg elfogadható hordozóanyaggal, igy injekciókészítéshez használatos viz .el, baktériumok fejlődését és szaporodását gátló vízzel és hasonlókkal* A tényleges termékelőállitás szokványos módon történik, beleértve például a konténeres szelekciót, sterilizálást, kitöltést és lezárást, valamint egyéb adalékaqagok, mint mikróbaellenes szerek, pufferek, antioxidánsok és hasonlók hozzáadását* Parenterália készítmények előállításához további tájékoztatást nyújtanak standard munkák, például a Remington’s Pharmaceutical Sciences*, 17* ki- 11 adás /1985/, melyre itt hivatkozásként utalunk.

A következő példák a találmány bemutatására szolgálnak, anélkül, hogy a találmány hatókörét korlátoznák.

1, példa

4-Dezacötil-VLi—3-karooxi-hidrazid — K31/4 monoklonális antitest konjugát előállítása

A 4,801,638 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban megadott eljárást használva emberi adenokarcinóma-sejtek felszíni antigénjei felismerésére képes 200 mg KS1/4 monoklonális antitestet /MoAb, monoclonal antibody/ 20 ml O,1M nátrium-acetát pufferben /pH 5,6/ oldunk /29,3 g nátrium-acetát, 2,44 ml ecetsav és sterilizált viz 4 liter térfogatig/. Az oldatot éjszakán át mintegy 0°C-on tartjuk /körülbelül 10í3 fehérje oldatlan marad/. Egy részletben, gyors keverés közben 685 mg nátrium-metaperjodátot adunk az oldathoz.

Az elegyet sötétben 21 percen át keverjük mintegy 0°0-on, majd a reakciót ötszörös felesleg /az összes perjodátra vonatkoztatva/ hozzáadása utján 1,28 ml 12,5M etilénglikololdattal /steril vízzel készült oldat/ hirtelen leállítjuk. Az uj keveréket

- 12 0°C-on 5 percen át sötétben keverjük, majd centrifugáién után tiszta felülúszót és fehér pelletet kapunk· A felülúszót Sephadex G25 /közepes finomság/ géloszlopra visszük fel és a terméket a fenti nátrium-acetát pufferrel eluáljuk. Az eluátumot UV-fénnyel 280 nm-en detektáljuk· A perjodátot az oszlopról leöblítjük és elöntjük. Az oxidált termék koncentrációját minden eluált frakcióban 279 nm-en határozzuk meg; a kitermelés 176 mg oxidált MoAb 39»9 ml pufférben /88% kitermelés/.

274 mg 4-dezacetil-VLB-3-karboxhidrazidot dimetil-foxmamidban ml 53,7 mg/ml-es oldat7 oldunk a 4,801,688 számú Amerikai Egyesült Államokbeli szabadalmi leírás szerint és cseppenként hozzáadjuk a lehűtött pufferezett MoAb oldathoz· A reakcióedényt átöblitjük nitrogéngázzal, majd lezárjuk· A reakcióelegyet mágneses keveróvel hidegben és sötétben 24 órán át keverjük, azután az edényt kinyitjuk és az áttetsző halványsárga reakcióelegyet centrifugáljuk. A felüluszót Sephadex G25 géloszlopon kromatografáljuk, amelyet előzőleg 7»4 pH-ju foszfátpufferes sóoldattal egyensúlyba hoztunk. Eluensként is e pufferezett sóoldatot használjuk. Először a konjugátot /hidrazonképzés a 3-karboxhidrazidcsoport és a MoAb-on levő szénhidrát egy aldehidcsoportja között/ eluáljuk, majd a nem reagált 4-dezacetil-VLB-3-karboxhidrazidot. A kapott konjugát kitermelése 146 mg /83%/· A konjugát mintegy 7,5 mól 4-dezacetil-VLB-3-ksrboxhidr?.zont tartalmaz per mól KS1/4 monoklonális antitest.

Immunoglobulin konjugátokat tartalmazó parenterális készítmények agregációjának találmány szerinti gátlását /stabilizálását/ a következőképpen értékeljük.

2. példa

Az 1. példa szerinti konjugátot, továbbá glicint és mannitot tartalmazó készítményeket állítunk elő az I· táblázatban feltüntetett tömegarányokat alkalmazva, parenterális fiolákba töltjük és liofilizáljuk. A készítményeket 2 hónapon át 25°0-on tároljuk és a 30· napon és a 60· napon méret azeriit szelektáló exkluziós kromatográfiával határozzuk meg a konjugát oldható agregátjának képződését. Előzetes próbát végzünk liofilizálás után /0. nap az I· táblázatban/· Az értékelések eredményeit az I. táblázat mutatja·

I, táblázat

Készítmény®·**	Agregáció %-a a fel- .............
1:0:0	JL. 30 60 17 25,5 HV*
1:0:1	14,4 15,6 16,2
1:1:1	12,6 13,4 13,0

^aAz 1. példa szerinti konjugát, a glicin és a mannit tömegaránya ^Minden készítmény 10 mM foszfát-puffért tartalmaz °01dható agregátum %-os képződése, méret szerinti exkluziós kromatográfiával meghatározva ^dBem vizsgáltuk

Az I· táblázat adataiból világosan kltUnik, hogy az 1· példa konjugátját, glicint és mennitót 1:1:1 tömegarányban tartalmazó készítmény agregációja kisebb mértékű a 30· és 60. napon, mint a glicint nem tartalmazó készítményé és agregációja a 30· napon kisebb mértékű, mint a glicint és mannitit nem tartalmazó készítményé.

A találmány szerinti agregáció ellen stabilizáló hatást olyan készítményeken kutattuk ki, amelyeket az előállítás körülményeit szimuláló körülmények között tartottunk. A következő értékelést hajtottuk végre.

3, példa

A II. táblázatban feltüntetett tömegarányban 1. példa szerinti konjugátot, glicint és mannitott /valamint megadott mennyiségű foszfát-puffért és nátrium-kloridot/ tartalmazó készítményeket állítunk elő, 24 órán át 5°C-on tartjuk őket, majd liofilizáljuk. Rekonstitució után a készítményeket vizuális utón megvizsgáljuk és méret szerint szelektáló exkluziós kromatográfiával meghatározzuk az oldható agregátum képződését· Az értékelés eredményeit a II· táblázat tartalmazza·

II· táblázat
Készítmény®	Puffer^b Na Cl⁰	Megjelenés
1:0:0	10	0	Csapadék	12,9
1:0:0	50	0	Csapadék	11,8
1:0:0	10	3	Csapadék	10,9
1:1:1	10	0	Áttetsző	7,8
1:1:1	50	0	Áttetsző	3.2
1:1:1	10	3	Áttetsző	7,4

^aAz 1. példa szerinti konjugat, a glicin és a mannit tömegarányai

A készítményben levő foszfát-puffer koncentrációja /mM/ ^cKoncentráció mg/ml-ben megadva áldható agregátum képződésének %-a, méret-exkluziós kromatográfIával történő meghatározás alapján·

Claims

Szabadalmi igénypontok

1· Agregáció ellen stabilizált gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy valamely oxidált glikoprotein és egy /1/ általános képletű vinca-hidrazid - ahol

R² hidrogénatomot, -CH^ vagy -CHO csoportot jelent} az R^ és szubsztituensek különállása esetén P? hidrogénatomot, és az R^ és bP szubsztituensek egyike etilcsoportot és másika hidrogénatomot vagy -OH csoportot jelenti vagy

R^ és R^ a hozzájuk kötődő szénatomokkal összetartva oxirángyűrűt alkot, amikor is R^ etilcsoportot jelenti

R jelentése -UHHHg csoport, /1/ általános képletű csoport - ahol n * 2, 3 vagy 4 - , -O-/1-3 szénatomos alkil/-, -NHg, -NH/1-3 szénatomos alkil/-csöpört, -HH-CHgOHg-Y általános képletű csoport - amelyben ϊ jelentése klóratom, -OCH^ vagy -SCH^ csoport - , 1-pirrolidinil- vagy 1-piperidinilcsoport;

R^ hidrogénatomot, /1-3 szénatomos alkil/ -00 csoportot, klóratommal szubsztituált /1-3 széftatémos alkil/-CO csog portot vagy R általános képletű csoportot jelent, ahol

R⁶ jelentése -COXCONHNHg általános képletű csoport, amelyben X 1-4 szénatomos egyenes alkilénláncot, 2-8 szénatomos elágazó alkilénláncot, 2-4 szénatomos alkenilén-, 3-4 szénatomos alkinilén-, 3-6 szénatomos oikloalkilén-, feniléη-, hidroxiszubsztituált 1-4 szénatomos alkiléncsoportot vagy egyszeres vegyértékkötést jelent, azzal a feltétellel, hogy R nem jelenthet -NHHHg csoportot, ha R^ jelentése βθ általános képletű csoport, és R^ nem jelenthet Ηθ általános képletű csoportot, ha

- 19 R jelentése -NHNHg csoport immunoglobulin konjugátját tartalmazza, agregáció ellen stabilizáló mennyiségű glicinnel és mannittal összekeverve·
2. Az 1· igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy 4-dezacetil-VLB-3-karboxi-hidrazid — KS1/4 monoklonális antitest konjugátot tartalmaz.
3. A 2. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a konjugát, a glicin és a mannít tömegaránya 1:1:1.
4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy liofilizált por alakjában állítjuk elő.
5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy gyógyszerészetileg elfogadható hordozóanyagot is tartalmaz.
6. Eljárás valamely oxidált glikoprotein és egy /1/ általános képletű vinca-hidrazid - ahol

R hidrogénatomot, -CH^ vagy -CHO csoportot jelent;

az R^ és R^ szubsztituensek különállása esetén R hidrogénatomot, és az R^ és R^ szubsztituensek egyike etilcsoportot és másika hidrogénatomot vagy -OH csoportot jelent; vagy és R^ a hozzájuk kötődő szénatomokkal összetartva oxirángyűrűt alkot, amikor Is R etilcso portot jelent;

R jelentése -NHIJHg csoport, /1/ általános képletű csoport - ahol n = 2, 3 vagy 4 - ,

-0-/1-3 szénatomos alkil/-,

-NH/1-3 szénatomos alkil/-csöpört, -NH-OHgCHg-y általános képletű csoport, amelyben

Y jelentése klóratom, -OCH^ vagy

-SCH^ csoport, 1-pirrolidinil- vagy 1-piperidinilcsöpört;

R^ hidrogénatomot, /1-3 szénatomos alkil/-CO csoportot, klóratommal szubsztituált /1-3 szénatomos alkil/-CO csoportot vagy R^ általános képletű csoportot jelent, ahol

R⁶ jelentése -COXCONHNHg általános képletű csoport, amelyben

X 1-4 szénatomos egyenes alkilén21 láncot, 2-8 szénatomos elágazó alkilénláncot, 2-4 szénatomos alkenilén-, 3-4 szénatomos alkinilén-, 3-6 szénatomos cikloalkilén-, fenilén-, hidroxi-szubsztituált 1-4 szénatomos alkiléncsoportot vagy egyszeres vegyértékkötést jelent, azzal a feltétellel, hogy R nem jelenthet -NHKHg csoportot, ha R^ jelentése R általános képletű csoport, és R^ nem jelenthet Ηθ általános képletű csoportot, ha R jelentése -NHNHg csoport immunoglobulin konjugátját tartalmazó parenterális gyógyszerkészítmény agregációjának csökkentésére, azzal j elle mezve, hogy a konjugátot glicin és mannit agregáció ellen stabilizáló mennyiségével keverjük össze.
7. A 6· igénypont szerinti eljárás, azzal j ellemezve, hogy konjugátként 4-dezacetil-VLB-3-karboxi-hidrazid — KS1/4 monoklonális antitest konjugátot alkalmazunk·
8. A 7· igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a konjugátot, glicint és mannitot 1:1:1 tömegarányban alkalmazzuk.
9. A 6-8· igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy líofilizált porkészitményt állítunk elő·
10· A 6-9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal j ellemezve, hogy a készítményt gyógyszeré ezé tileg elfogadható hordozóanyaggal keverjük össze·
11. Eljárás parenterális gyógyszerkészítmény előállítására, azzal j ellemezve , hogy az 1« igénypontban meghatározott immunokonjugátot gliclnnel és mannittal keverjük össze·