HUT53153A - Process for producing bispecific monoclonal antibody - Google Patents

Process for producing bispecific monoclonal antibody Download PDF

Info

Publication number
HUT53153A
HUT53153A HU896763A HU676389A HUT53153A HU T53153 A HUT53153 A HU T53153A HU 896763 A HU896763 A HU 896763A HU 676389 A HU676389 A HU 676389A HU T53153 A HUT53153 A HU T53153A
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
antibody
binding
producing
alkyl
tumor
Prior art date
Application number
HU896763A
Other languages
English (en)
Other versions
HU896763D0 (en
Inventor
Susumu Iwasa
Kaori Harada
Yukio Toyoda
Original Assignee
Takeda Chemical Industries Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Takeda Chemical Industries Ltd filed Critical Takeda Chemical Industries Ltd
Publication of HU896763D0 publication Critical patent/HU896763D0/hu
Publication of HUT53153A publication Critical patent/HUT53153A/hu

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6861—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from kidney or bladder cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6875—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody being a hybrid immunoglobulin
    • A61K47/6879—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody being a hybrid immunoglobulin the immunoglobulin having two or more different antigen-binding sites, e.g. bispecific or multispecific immunoglobulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/14—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from fungi, algea or lichens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3038—Kidney, bladder
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/972—Modified antibody, e.g. hybrid, bifunctional

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Description

(018560-1989)
68606-5372-GI ···· • · » · · • ···· • · «
*«·
A jelen találmány tárgya eljárás bispecifikus hibrid monoklonális antitest előállítására. Pontosabban, a jelen találmány tárgya egy olyan hibrid monoklonális antitest (a továbbiakban mint hibrid MoAb-ra hivatkozunk rá), amely bispecifikus egy ansamitocin származékra és egy cél-antigénre, azaz egy rákos sejt felületi membránján levő, tumorhoz kapcsolódó antigénre nézve, valamint az ezt előállító polidóma.
A jelen találmány továbbá egy olyan rák-kezelésre vonatkozik, amely során az említett MoAb-ot használjuk arra a célra, hogy specifikusan kapcsoljon egy ansamitocin származékot egy rákos sejthez, hogy a rákos sejtet ezáltal elpusztítsuk.
Az ábrák rövid leírása
Az 1. ábrán az antitest higítási görbét látjuk, amelyet úgy kapunk, hogy az 1. példa szerint előállított AS6-44.9 anti-ANS antitestet az 1. referencia példában leírt ELISA módszernek vetjük alá. A 2. ábrán ugyanennek az AS6-44.9 antitestnek ANS-sel (1 ng/ml) szembeni neutralizáló aktivitását látjuk. A 3. ábrán a 2. példában előállított ATF1-170 hibrid antitest bispecifikus antitest aktivitását látjuk. A 4. ábrán a 3. példában előállított ATF1-170 tetraóma által termelt immunoglobulin hidroxilapatit oszlop elúciós görbéjét látjuk a 280 nm-en mért elnyelés alapján. Az 5. ábrán a 3. példában előállított anti-ANS-anti-hTfR bispecifikus antitest citotoxicitási vizsgálatának eredményeit látjuk. A 6. ábrán az RCAS1-488 tenyészet felülúszójának antitest higítási görbéjét látjuk.
«·«· ·
-3<
Az ansamitocint, amely egy jelentős antitumor aktivitással rendelkező hatóanyag, egy aktinomyces (Nocardia nemzetség) fermentációs termékei között fedezték fel [E.Higashide et al.: Natúré, 270 721 (1977)]. Jóllehet egy ansamitocin analógot, a maytansint (a továbbiakban a rövidítése MAY) már korábban felfedezték mint egy növényi eredetű antitumor anyagot [S.M.Kupchan et al.: Journal of the American Chemical Society, 94, 1354 (1972)], mégis' több figyelmet fordítottak az ANS-ra, amely bakteriális eredetű, mivel a MAY-ból előállítható mennyiség kevés. Mindkét anyagnak a hatásmechanizmusa hasonlít a vinka alkaloidokéra [például a vinkrisztinére (a továbbiakban VCR-nek rövidítjük)], azaz gátolja a mikrotubulusok képződését a tumorsejtekben, ezáltal fejtve ki citocid hatást. Az ansamitocin citotoxicitása 10-100-szor nagyobb mint az ismert rákellenes kemoterápiás hatóanyagoké (például a metotrexáté, daunomiciné); mint egy új típusú antitumor anyagot, az ansamitocint és származékait kémiai módosításokkal és mikrobiális átalakításokkal szintetizálták [A.Kawai et al.: Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 32. 2194 (1984); H.Akimoto et al.: Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 32, 2565 (1984); A.Kawai et al.: Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 32, 3441 (1984)]. Ezeknek az ansamitocin származékoknak in vitro és in vivő antitumor hatását tanulmányozva, MAY-t és VCR-t használva kontroll hatóanyagként, valamint a szubakut toxicitási vizsgálatok során, beleértve az emésztőrendszeri rendellenessége- két és a neurotoxicitási vizsgálatokat is, számos ansamitocin származékról találták azt, hogy a hatékonyság és biztonság szempontjából jobbak mint a MAY és a VCR. Pontosabban, a I képletű 9-tio-maytansin jobb kemoterápiás koefficiens értéket mutatott (toxikus mennyiség/ hatékony mennyiség) mint a MAY és a VCR.
Azonban az ANS erős citotoxicitása erős mellékhatásokat okoz; az ANS most ugyanabban a helyzetben van mint amilyenben a MAY volt, amelynek a fejlesztését leállították, mivel emésztőrendszeri rendellenességeket okozott és neurotoxikus hatása volt.
Másrészről azonban kifejlesztették a célzott terápiás gyógyszereket, azaz olyan tumorellenes immunokomplexeket, amelyekben egy antitumor antitestet egy kemoterápiás hatóanyaghoz vagy egy biotoxinhoz kapcsolnak, azzal a céllal, hogy szelektíven pusztítsák a tumor-sejteket. Jellemzőjük az, hogy felismerik és kötődnek a tumor-sejteken levő tumor-specifikus antigénekhez illetve a tumorral kapcsolatos antigénekhez, gátolják a DNS szintézist, fehérje szintézist vagy mikrotubulus képződést ezekben a tumor-sejtekben és megölik őket. Ennélfogva a tumoros szervekre, szövetekre és sejtekre specifikusak és csekély káros hatással rendelkeznek a normál sejtekre. Néhány antitest-hatóanyag vagy antitest-toxin komplexet már bevezettek a klinikai gyakorlatba, néhány biztató eredménnyel. Azonban az antitest aktivitása vagy a hatóanyag illetve a toxin farmakológiai aktivitása gyakran lecsökken, mivel kémiai kötési reakció van az antitest és a hatóanyag illetve a toxin-fehérje között; várható hogy hatékonyabb szelektív antitumor anyagokat fognak kifejleszteni.
Részletesebben, az alacsony molekulatömegü antitumor anyagoknál számos probléma van, például:
(1) egy megfelelő funkcionális csoportot kell használni egy antitesthez való kötésre (2) egy antitesthez való kémiai kötődés nagyobb hatással van az aktivitásra mint egy toxikus fehérjénél, és a farmakológiai aktivitás rendszerint egy tizedére-egy századára vagy még kisebbre csökken, és így (3) különleges körülményeket kell biztosítani, amelyek között az antitest-hatóanyag komplex kapcsoló része lehasitható a tumorsejtekben.
Ezzel a technikai háttérrel vizsgálatokat folytattunk új típusú antitest-hatóanyag komplex kifejlesztésére, olymódon, hogy az ANS-t, amely jelentős citotoxikus aktivitással rendelkezik, egy antitumor antitesthez kötik, hogy tumor-specifikussá tegyék. Az ilyen antitest-hatóanyag komplex előállítása során várható volt a fenti problémák előfordulása. A szokványos módszerekből, azaz a kémiai kapcsolási reakciók használatából származó problémák közé tartozik:
(1) a hatóanyag antitumor aktivitásának lényeges csökkenése, valamint az antitest-antigén kapcsolódás aktivitásának csökkenése, (2) homopolimer melléktermékek keletkezése az antitestek között, amelyek szelektív antitumor anyagként semlegesek, vagy nagy molekulájú polimerek képződése, amelyek in vivő nem hasznosak,mivel könnyen metabolizálnak, (3) nehézségek az antitesthez kapcsolódó hatóanyag molekulák számának szabályozásában, lehetetlenné téve ezáltal hogy állandó minőségű antitest-hatóanyag komplexet állítsunk elő, és (4) nehézségek a legjobb terápiás koefficienssel rendelkező hatóanyag használatában, mivel az antitesthez kapcsolásra felhasználható hatóanyagok szelekcióját azokra korlátozza, amelyek megfelelő' funkciós csoporttal rendelkeznek.
Az újabban kifejlesztett hibridóma előállítási technikák lehetővé tették újtípusú triómák, tetraómák és más poliómák előállítását [C. Milstein et al.: Natúré.305. 357 (1983); M.R.Suresh et al.: Proceedings of the National Academy of Science, USA., 83, 67989 (1986)], ezzel lehetővé téve új funkciókkal rendelkező bispecifikus antitestek előállítását [Japanese Unexamined Patent Publication No. 12276/1988 (Hybritech); US Patent No. 4,714,681 (University of Texas System Cancer Center)].
A problémák megoldásának módjai
Vizsgálatokat folytattunk a fentiekben leírt új technológia alkalmazásáról és kiterjesztéséről ezeknek a problémáknak a megoldására. Ennek eredményeképpen sikerült olyan hibrid MoAb-ot kifejleszteni, amely nem teszi szükségessé a kémiai kapcsolási eljárásokat az antitest és a hatóanyag molekula között, amely lényeges volt a szokásos antitest-hatóanyag komplexek előállításához, és amely lehetővé teszi olyan antitest-hatóanyag immunokomplex előállítását, amely megtartja mind az antitest, mind a hatóanyag teljes bioaktivitását; ezután a hibrid MoAb felhasználásával előállítottunk egy anti-humán-tumor fehérje komplexet. Ennek megfelelően a jelen találmány olyan polidóma előállítási eljárására vonatkozik, amely olyan bispecifikus hibrid MoAb-ot termel, amely specifikus mind az ansamitocin származékokra mind a cél antigénekre, azaz a tumorsejt-membránon levő antigénekre.
A jelen találmány tárgya továbbá egy olyan tetraóma által előállított bispecifikus hibrid MoAb előállítási eljárása amelyet úgy kapunk, hogy fúzionáltatunk egy ansamitocin származékok elleni antitestet (a továbbiakban anti-ANS antitestnek rövidítjük) termelő hibridőmát, és egy másik hibridómát, amely a cél antigének elleni antitestet termeli,valamint az ezt a hibrid MoAb-ot felhasználva előállított szelektív anti-humán-tumor fehérje komplex előállítási eljárása. A cél antigén lehet például humán transzferrin receptor (a továbbiakban csak hTfR-nek rövidítjük), amely gyakran expresszálódik a tumorsejtek membránján.
A jelen találmány szerinti bispecifikus hibrid MoAb-ot termelő polidóma előállítására egy anti-ANS-antitestet termelő hibridómát használunk, amelyet például az alább ismertetett módszerrel állíthatunk elő.
Egy ansamitocin származékkal először beoltunk egy állatot, hogy beindítsuk az anti-ANS antitest termelését. Ebben az esetben az ANS önmagában immunogénként való felhasználása rendszerint nem indukálja az antitest nagymennyiségben való termelését; ennélfogva egy megfelelő funkcionális csoporttal rendelkező ansamitocin származékot hordozó fehérjével, például szarvasmarha szérum albuminnal (a továbbiakban BSA-nak rövidítjük), vagy tiroglobulinnal konjugálva használjuk immunogénként, egy megfelelő funkciós csoporton keresztül, úgymint a PDM-3-C2o-karboximetil éter karboxil csoportján keresztül, vagy a II általános képlettel leírható maytansinol 3-a-aminofenil-acetát vagy PDM-3-C2o-p-aminobenzil éter aminocsoportján keresztül.
Vegyület
PDM-3-Cso-karboximetil éter
Maytansinol 3-aaminofenil-acetát
PDM-3-C20-Paminobenzil éter
-COCH(CH3)2
-COCH(NH2)C6H5
-COCH(CH3)2
9-t io-maytansin
-COCHCH3
N(CH3)COCH3
MAY
ANS
-CH2COOH -OH
-CH3 -OH
-CH2(CeH4)NH2 -OH
-CH3
-SH
-COCHCH3 I -ch3 -OH
1 N(CH3)COCH3
-COCH(CH3)2 -CHs -OH
Megjegyzés: PDM-3 jelentése 20-demetoxi-20-hidroxi-maytansinol
3-izobutirát
A használt állat lehet például nyúl, patkány, egér és tengeri malac; a MoAb előállításához különösen előnyős az egér használata.
A beoltást szokásos módszerrel végezhetjük. Például az immunogén anyagot 1-100 ug mennyiségben, előnyösen 10-25 ug-ot oltásonként, 0.1 ml fiziológiás sóoldattal és 0.1 ml komplett Freund adjuvánssal emulgeáljuk, majd ezután az állat hátába adjuk szubkután módon, vagy intraperitonálisan a hasüregébe, 3-6-szor 2-3 hetes intervallumokban.
Az immunizált állatok csoportjából, például egerekből, azokat választjuk ki amelyek magas antitest titerrel rendelkeznek. Az utolsó immunizálás után 3-5 nappal összegyűjtjük a lépeket vagy nyirokmirigyeket; a bennük levő antitest-termelő sejteket mielóma sejtekkel fúzionáltatjuk. A sejtfúziót ismert módszerekkel végezzük. A fuzogén anyagok közé tartozik például a polietilénglikol (a továbbiakban PEG-nek rövidítjük) és a Sendai vírus; a PEG használata előnyös. A mielóma sejtvonalak közé tartozik például az NS-1, P3U1 és SP2/0; előnyös a P3U1 használata. Előnyös, ha az arány a splenociták és a mielóma sejtek között 1:1 és 1:10 között van. Ajánlott, hogy 1000-9000 molekulatömegü PEG-et adjunk hozzá 10-80% koncentrációban, az inkubálást 20-37°C-on végezzük, előnyösen 30-370C-on, 3-10 percig.
Különböző módszerek használhatók az anti-ANS-antitestet termelő hibridómák szelektálására, beleértve az ELISA módszert, amely során a hibridóma tenyészetek felülúszóját olyan mikrotiter lemezekhez adjuk, amelyekre (maytansinol-3-a-aminofenil-acetát)humán szérum albumin (a továbbiakban HSA-nak rövidítjük) komplexet adszorbeáItattunk; ezután torma-peroxidázzal (HRP) jelzett anti-egér immunoglobulin antitestet adunk a mikrotiter • ·
-10• ··· · · · · · • ·· ·· ····· • · · ·· · · ·· · lemezekhez, és a lemez szilárd fázisához kötődött anti-ANS monoklonális antitestet detektáljuk. Azokat a pozitív antitest aktivitást mutató hibridómákat amelyeket HAT-tal (hipoxantinaminopterin-timidin) kiegészített táptalajon szelektáltunk és növesztettünk, azonnal tovább klónozzuk; a klónozást általában könnyen végrehajthatjuk határhigitási módszerrel vagy más módszerekkel. A klónozott hibridómák tenyészete felülúszójának antitest titerét a fenti módszerekkel meghatározzuk hogy kiválasszuk azokat a hibridómákat, amelyek stabilan, magas titerrel termelnek egy antitestet, igy állíthatjuk elő a keresett anti-ANS antitestet termelő hibridómát.
A fenti módszer szerint előállított és anti-ANS antitestet (IgGi, lambda lánc) termelő hibridómák közé tartozik az AS6-44.9 egér hibridoma.
A tumorral kapcsolatos antigének mint cél antigének közé tartozik a hTfR, amely viszonylag gazdagon expresszálódik a különböző tumor sejtvonalakban. A hTfR-t humán placenta szövetből tisztíthatjuk ismert módszerekkel [P.A.Seligman et al.: Journal of Biological Chemistry.254.9943 (1979)]; a nagytisztaságú mintát az alábbi módszerekkel állíthatjuk elő.
(1) Humán placenta szövetet foszfáttal puffereit sóoldatban (20 mmól dinátrium-foszfát, 0.15 mól NaCl; a továbbiakban PBS-nek rövidítjük), pH=7.5, 4% Triton-X-100-at tartalmaz, homogenizáljuk, majd szonikáljuk és centrifugáljuk.
(2) A kapott felülúszót, miután ammónium-szulfáttal kisóztuk, olyan oszlopra visszük, amelyre humán transzferrin elleni antitestet kapcsoltunk és • · •
• · · · · • · alaposan mossuk foszfát pufferrel (20 mmól dinátrium-foszfát, a továbbiakban PB-nek rövidítjük), pH=7.5, 0.5 mól NaCl-t tartalmaz, majd a hTfR frakciót 0.5 mól NaCl-t és 0.5% Triton-X-100-at tartalmazó 0.02 mólos glicin pufferrel (pH=10.0) eluáljuk.
(3) A kapott hTfR frakciót hTf-fel kapcsolt oszlopra visszük. Miután az oszlopot 1 mólos NaCl-t tartalmazó PB-vel (pH=7.5) mostuk, az eluálást 1 mól NaCl-t és 1% Triton-X-100-at tartalmazó 0.5 mólos glicin pufferrel (pH=10.0) eluáljuk, így kapjuk a tisztított hTfR mintát.
Más módszer szerint egylépéses eluálás és izolálás is lehetséges anti-hTfR antitesttel kapcsolt oszlopot használva.
Az állatok immunizálását hTfR-rel és az anti-hTfR-antitestet termelő sejtek mielóma sejtekkel való fúzióját ugyanolyan módszerrel végezhetjük, mint amit az ansamitocin származékokra leírtunk. Különböző módszerek használhatók anti-hTfR-antitestet termelő hibridómák screenelésére. Az ilyen módszerek közé tartozik például az ELISA módszer, amely során a hibridómák tenyészetének felülúszóját olyan mikrotiter lemezre visszük, amelyre anti-egér IgG antitest van adszorbeálva, majd a HRP-vel jelölt tisztított hTfR mintát hozzáadjuk és a lemez szilárd fázishoz kötött anti-hTfR monoklonális antitestet detektáljuk, valamint a sejt-ELISA módszer, amely során a K562 sejtvonalat, amely a sejfelszíni membránján nagymennyiségű TfR-t ezpresszál, egy mikrotiter lemezre immobilizáljuk, és a hibridómák tenyészetének felülúszóját adjuk a mikrotiter lemezhez, majd HRP-vel jelölt anti-egér IgG antitestet adunk hozzá.
• ·
-12A fenti módszer szerint előállított anti-hTfR antitestet termelő (IgGi, kappa lánc) hibridómák közé tartozik például a 22C6 egér hibridóma.
Számos módszer létezik a jelen találmány szerinti, bispecifikus hibrid MoAb-ot termelő polidóma előállítására [H.Aramoto et al.: Proteins, Nucleic Acids and Enzvmes.33. 217 (1988)]; ezek közül bármelyik használható. Az ilyen módszerek közé tartozik például (1) az a módszer, amely során az említett HAT rezisztens anti-ANS-antitestet termelő hibridómát lépésenként 5-bróm-dezoxiuridinnel (a továbbiakban BrdU-nak rövidítjük) kiegészített táptalajhoz szoktatjuk, ezt követően egy timidin-kináz deficiens törzset szelektálunk és HAT érzékennyé tesszük; hasonlóképpen, egy HAT-rezisztens anti-hTfRantitestet termelő hibridómát teszünk rezisztenssé 8-aza-guaninra (a továbbiakban AZG-nek rövidítjük), ezt követően egy hipoxantin-guanin-foszforibozil transzferáz deficiens törzset klónozunk és HAT érzékennyé tesszük; ezt a két törzset azután egy ismert módszerrel fúzionáltatjuk, így kapjuk a tetraómákat, amelyeket HAT-tal kiegészített táptalajon szelektálunk, majd azt a tetraómát klónozzuk, amely mind az ansamitocin származékhoz mind a hTfR-hez kapcsolódni képes hibrid antitestet szekretál; és · (2) az a módszer, amely szerint egy anti-ANS
-antitestet termelő hibridómát fluoreszcein-izotiocianáttal (a továbbiakban FITC-nek rövidítjük) jelölünk; egy anti-hTfR-antitestet termelő hibridómát tetrametil-rodamin-izotiocianáttal (a továbbiakban TRITC-nek rövidítjük) jelölünk; ezt a két jelzett hibridómát ismert módszerrel fúzionáltatjuk; a kapott sejt-szuszpenziót fluoreszcein-aktivált sejt- szelektálóra visszük (a továbbiakban FACS-nak rövidítjük), hogy szelektáljuk és klónozzuk azokat a tetraómákat, amelyek mind a FITC zöld fluoreszcenciáját, mind a TRITC vörös fluoreszcenciáját mutatják. A szülő törzsek genetikai markereit fordítva használhatjuk a kívánt tetraóma szelektálására és klónozására.
Ezekben az eljárásokban a sejtek fúziójára fuzogén anyagot, például Sendai vírust vagy PEG-et használunk, illetőleg elektromos stimulálást vagy más módszert. A sok közül a PEG az előnyős. Az alábbiakban a PEG felhasználására ismertetünk egy módszert, de a jelen találmány nem korlátozható erre a módszerre. A körülbelül 1000-9000 molekulatömegü PEG-et használjuk körülbelül 10-80% koncentrációban; a kezelés ideje 0.5-30 perc. Hatékony fúziót érhetünk el ha a sejteket 37°C-on 4-10 percig tartjuk kontaktusban 35-55%-os PEG 6000-rel; ezek az előnyős körülmények.
A polidómák szelekcióját az előzőkben említett HAT-tal kiegészített táptalajban illetve más táptalajokban végezhetjük; erre a célra 8-AZG, 6-tioguanin, 5-BrdU vagy más hatóanyagok felhasználásával a hatóanyag akklimatizációs módszert • · ·
-14• ·· t alkalmazhatjuk, hogy a hatóanyagra rezisztens törzseket állítsunk elő. Egy új marker bevezetése a fúzionált sejtekbe lehetővé teszi különböző szelekciós táptalajok alkalmazását. Az ilyen szeleciós táptalajra példa lehet a neomicinneí kiegészített táptalaj valamint a higromicin B-vel kiegészített táptalaj [B.Sugden et al.: Molecular and Cellular Biology, 5, 419 (1985)]. Hozzáférhető az a módszer is, amely során különböző fluoreszcens festékekkel jelölt hibridómákat fúzionáltatunk, majd a kettősen jelölt hibrid hibridómákat FACS-szal szétválasztjuk az előzőkben közölt leírás szerint [L.Karawajew et al.: Journal of Immunological Methods, SS, 265 (1987)].
A hibrid antitestet termelő polidómák szelektálására különböző módszerek alkalmasak. Az ilyen módszerek közé tartozik például:
(1) az előbb említett ELISA módszer az anti-ANS antitestet termelő hibridómák szelektálására;
(2) az az ELISA módszer, amelyben a polidoma tenyészet felülúszóját olyan mikrotiter lemezhez adjuk, amelynek a felszínére anti-egér immunoglobulin antitestet abszorbeáltunk és HRP-vel jelzett hTfR-t adunk hozzá, hogy kimutassuk a szilárd fázishoz kötött anti-hTfR antitestet;
(3) az az ELISA módszer, amelyben a polidóma tenyészet felülúszóját olyan mikrotiter lemezhez adjuk, amelyre (maytansinol 3-a-aminofenil-acetát)-HSA komplexet abszorbeáltunk, majd HRP-vel jelzett hTfR-t adunk hozzá a bispecifikus hibrid antitest detektálására;
···
-15ha olyan anti-hTfR antitestet használunk (kappa lánc), amelynek könnyű lánca eltér az anti-ANS antitestétől (lambda lánc), akkor (4) az az ELISA módszer, amelyben a tenyészet felülúszóját olyan mikrotiter lemezekhez adjuk, amelyre (maytansinol 3-a-aminofenil-acetát)HSA komplexet adszorbeáltunk, majd HRP-vel vagy biotinnal jelzett anti-egér IgG-kappa lánc specifikus antitestet adunk hozzá a bispecifikus antitest kimutatására, valamint ezeknek a módszereknek a módosításai;
ezeket a módszereket adott esetben kombinálva is alkalmazhatjuk.
A hibrid antitest aktivitás szempontjából pozitív polidómákat klónozzuk, ami általában egyszerűen kivitelezhető a határhigítási vagy egyéb módszerekkel. A klónozott polidőmák tenyészetének felülúszóját a fentemlített módszerrel antitest-titer meghatározásnak vetjük alá, hogy szelektáljuk azt a polidómát, amely egy antitestet stabilan, magas titerrel termel, így kapjuk a keresett hibrid monoklonális antitestet termelő polidómát.
Az említett, jelen találmány szerinti polidóma tenyésztését folyékony táptalajon, vagy állatok hasüregében (azaz emlősök, például egerek hasüregében) végezhetjük ismert módszerekkel. A tenyészfolyadékból vagy aszcitesz folydékból az antitestet ismert biokémiai technikák kombinálásával izoláljuk. Például a sejttenyészetet vagy aszcitesz folyadékot lecentrifugáljuk; a kapott felülüszót összegyűjtjük és kisózzuk (általában ammónium-szulfátot vagy nátrium-szulfátot alkalmazva). A kapott fehérje csapadékot megfelelő oldatban oldjuk majd dializáljuk és oszlopkromatografáljuk (például ioncserélő oszloppal, gélszürö oszloppal, Protein A oszloppal, hidroxilapatit oszloppal) a • · ·· ··· · · • · · · · · ··· · · · · · • · · · · ···· ·· ·· ·· ·
-le keresett antitest kinyerésére és tisztítására. Egylépéses kinyerést és tisztítást is végezhetünk olyan oszloppal, amelyre két különböze antigént kötöttünk.
A fentiekben ismertetett elválasztási és tisztítási eljárások körülbelül 1-5 mg hibrid MoAb-ot eredményeznek 1 liter tenyészet-felülúszóból, fehérjetömegre számítva 80%-osnál nagyobb tisztaságban. 20 ml aszcitesz folyadékból 3-10 mg ugyanilyen antitest állítható elő.'
Az így előállított hibrid MoAb egy egységes fehérje, és például proteináz kezeléssel olyan F(ab')2 fragmentek állíthatók elő, amelyek mind az ansamitocin származékokhoz mind a tumorral kapcsolatos antigénekhez, úgymint hTfR antigénekhez való kapcsolódási aktivitásukat megtartják; ezek a fragmentek ugyanazt a célt szolgálhatják mint a jelen találmány szerinti hibrid MoAb.
Az előzőkben említett eljárás szerint előállított, hibrid antitestet termelő polidómák közé tartozik például az ATF1-170 tetraóma, amelyet az alábbiakban következő 2. példában ismertetünk.
Mint olyan polidómát, amely a jelen találmány szerinti hibrid MoAb-ot termeli, az előzőkben az anti-ANS MoAb-ot termelő hibridóma és az anti-hTfR MoAb-ot termelő hibridóma fúziójával létrejött polidómát említettük. Megjegyezzük azonban, hogy az a trióma, amelyet úgy kapunk, hogy fúzionáltatjuk az egyik MoAb-ot termelő hibridómát, egy másik MoAb-ot termelő olyan sejttel vagy hibridomával, amelyet úgy kapunk, hogy Epstein-Barr vírussal vagy más eszközökkel végzett immortalizáció után két, megfelelő MoAb fajtát termelő sejt fúzionáltatjuk, ugyanazt a célt szolgálhatja mint az előbb említett tetraóma, amíg a jelen találmány szerinti hibrid MoAb-ot termeli.
·· ···· ·
Továbbá, azokban az esetekben, amikor ezek a polidómák egér IgG MoAb-ot termelnek, lehetséges egér-humán kiméra antitestet készíteni olymódon, hogy olyan DNS-t állítunk elő, amely a bispecifikus hibrid MoAb antigén felismerő helyének variábilis régióját kódolja, és ezt gén-manipulációs technika alkalmazásával humán IgG konstans régióját kódoló génhez ligáljuk [Z.Steplewski et al.: Proceedings of the National Academy of Science, USA, 35, 4852 (1988)]. Ezt a kiméra antitestet előnyösen használhatjuk emberek kezelésére, mivel kicsi az antigenicitása.
Számos módszer használható a rák terápiában a jelen találmány szerinti bispecifikus antitest vagy egy ansamitocin származékból és a bispecifikus antitestből előállított anti-humán-tumor fehérje komplex alkalmazásával. Az ilyen módszerek közé tartozik például:
(1) az a módszer, amelyben a jelen találmány szerinti hibrid MoAb-ot rákos betegeknek adjuk be, és megfelelő idő elteltével ansamitocin származékot adunk be a betegnek, ezzel biztosítjuk, hogy a rákos szövetekhez vagy sejtekhez kapcsolódjon a rákellenes szer; és (2) az a módszer, amelyben a hibrid MoAb-ot és egy ansamitocin származékot egyszerre adunk be a rákos betegnek, előnyös (3) az a módszer, amelyben a hibrid MoAb-ot és egy ansamitocin származékot reagáltatunk, a nem reagált ansamitocin származékot eltávolítjuk, majd a kapott anti-humán-tumor fehérje komplexet adjuk be a rákos betegnek.
Az utóbbi esetben bármely ansamitocin származék használható, ha • ·· ·· ······ · · • ··· · · · · · • · · · · ··*·· ··· ·· ·· ·· ·
-18• ·· · antitumor aktivitással rendelkezik és képes az anti-ANS antitesttel reagálni. Az ilyen ansamitocin származékok közé tartoznak például a III általános képletű vegyületek ahol R jelentése hidrogénatom vagy karbonsavból származó acilcsoport; Q jelentése hidroxilcsoport (OH) vagy merkaptocsoport (SH); X jelentése klóratom vagy hidrogénatom; Y jelentése hidrogénatom, rövid szénláncú alkilszulfonilcsoport, alkilcsoport vagy aralkil csoport, ezek közül bármelyik lehet helyettesített és ezeknek 4,5-dezoxi származékai.
A fenti III általános képletben R-rel jelzett, karbonsavból származó acilcsoport lehet például 300-nál nem nagyobb molekulatömegü karbonsavakból származó acilcsoport, vagy 1-20 szénatomot tartalmazó acilcsoport. Az ilyen acilcsoportok közé tartoznak például a telített vagy telítetlen alifás acilcsoportok, telített vagy telítetlen aliciklusos acilcsoportok és az N-acil-a-aminosav típusú acilcsoportok; ezeket például a kővetkező képlettel lehet leírni:
-COR1 (A) ahol R1 jelentése hidrogénatom, alkilcsoport, alkenilcsoport, cikloalkilcsoport vagy arilcsoport; ezeknek a csoportoknak lehetnek szubsztituenseik; a fenti ciklikus csoport alkilén láncon keresztül kapcsolódhat a karbonil csoporthoz. Olyan példaként, amikor szubsztituenst tartalmaz, a következő képlettel jellemzett N-acil-a-aminoacil csoportot említjük:
···· «
-19·····♦ · · • ··· · · · · · * · * · · · ···· ··· ·· ·« ·· ·
R2 R3
I /
-COCH-N (Β) \
COR4 ahol R2 jelentése hidrogénatom, alkilosoport, cikloalkilcsoport vagy arilcsoport; ezeknek a csoportoknak lehetnek szubsztituensei; a ciklikus csoport alkilén láncon keresztül kapcsolódhat a szénatomhoz az α-helyzetben.; R3 jelentése hidrogénatom, alkilosoport, cikloalkilcsoport vagy arilcsoport; ezeknek a csoportoknak lehetnek szubsztituensei, és a ciklikus csoport alkilén láncon keresztül kapcsolódhat az N atomhoz; R4 jelentése hidrogénatom, alkilosoport, alkenilcsoport, cikloalkil csoport vagy egy arilcsoport; ezeknek a csoportoknak lehet szubsztituense és a ciklikus csoport alkilén láncon keresztül kapcsolódhat a nitrogénatomon levő karbonilcsoporthoz; R4 jelentése lehet alkoxicsoport vagy benzil-oxi-csoport.
A fenti (A) képlettel jellemzett acilcsoportban R1 jelentését az alábbiakban adjuk meg.
Az Ri-gyel jelzett alkilcsoportba tartoznak az 1-13 szénatomot tartalmazó alkilcsoportok (például a metil-, etil-, propil-, izopropil-, butil-, izobutil-, szek-butil-, terc-butil-, pentil-, izopentil-, 1-metil-propil-, hexil-, heptil-, 3-heptil-, oktil-, nonil-, decil-, undecil-, dodecil-, tridecil-, pentadecil és heptadecilesöpört). Mások mellett a körülbelül 1-16 szénatomot tartalmazó, alacsony szénatomszámú alkilosoport előnyös.
Az Rx-gyel jelölt alkenil-csoportok közé tartoznak például a
2-10 szénatomot tartalmazó alkenilcsoportok (például a vinil-, allil-, 1-metil-vinil-, 1-oktenil- és 1-decenil-csoport). Mások ·· ···· · • · · · · · *4« · ♦ · » · • · · · · ···· ·· ·· ·· · mellett a 2-4 szénatomot tartalmazó alacsony szénatomszámú alkenilcsoportok előnyösek.
Az R1-gyel jelölt cikloalkilcsoportok közé tartoznak a 3-10 szénatomot tartalmazó cikloalkilcsoportok (például a ciklopropil-. ciklobutil-, ciklopentil-, ciklohexil-, cikloheptil-, ciklooktil-, nonybornil- és adamantilesöpört).
Az R1-gyel jelölt arilcsoportba tartozik a fenil- és a naftilcsoport. A fenilcsoport az előnyős.
Az Ri-ként szereplő alkilcsoport, alkenilcsoport, cikloalkilcsoport és acilcsoport helyettesítőt is tartalmazhat. A szubsztituensek közé tartoznak például az 1-4 szénatomot tartalmazó alacsony szénatomszámú alkoxiesoportok (például a metoxi-, etoxi-, propoxi-, izopropoxi-, butoxi-, izobutoxi-, szek-butoxi- és terc-butoxi- csoport), a 2-4 szénatomot tartalmazó alacsony szénatomszámú alkanoil csoportok (például az acetil-, propionil-, butiril- és izobutirilcsoport), a 2-4 szénatomot tartalmazó alacsony szénatomszámú alkanoil-oxi-csoportok (például az acetil-oxi-, propionil-oxi-, butiril-oxi és izobutiril-oxi-csoport), a 2-4 szénatomot tartalmazó alacsony szénatomszámú alkoxikarbonil csoportok (például a metoxi-karbonil, etoxi-karbonil, propoxi-karbonil és izopropoxi-karbonil-csoport), a halogénatomok (például a klór-, fluor-, bróm- és jódatom), hidroxilcsoport nitrocsoport, cianocsoport, trifluormetil-csoportok, amino- csoportok mono-(alacsony szénatomszámú (C1-4) alkil)-amino csoportok (például a metil-amino csoport), a di-(alacsony szénatomszámú (C1-4) alkil)-amino csoportok (például a dimetil-amino-, dietil-amino-, dipropil-amino-, diizopropil-amino és dibutil-amino csoport), 1-4 szénatomot tartalmazó alacsony
-21szénatomszámú alkil-tio csoportok (például a metil-tio-, etil-tio-, propil-tio-, izopropil-tio-, butil-tio-, izobutil-tio-, szek-butil-tio- és terc-butil-tio-csoport), alacsony szénatomszámú (C1-4) alkilszulfinilcsoportok, alacsony szénatomszámú alkánszulfonilcsoportok, oxocsoportok, tioxocsoportok és 1-4 szénatomot tartalmazó alacsony szénatomszámú alkanoil-amino csoportok (például a formil-amino-, acetil-amino-, propionil-amino-, bútiril-amino- és izobutiril-amino-csoport). Ha a fenti R1 csoport jelentése ciklikus csoport (cikloalkil vagy aril csoport), akkor a szubsztituensek közé tartoznak még az 1-4 szénatomot tartalmazó alacsony szénatomszámú alkilcsoportok (például a metil-, etil-, propil-, izopropil-, butil-, izobutil-, szek-butil- és terc-butil-csoport). A csoportok a szubsztituensek azonos vagy különböző csoportjába tartozó 1-3 taggal szubsztituálhatók.
Az Ri-gyel jelölt ciklikus csoport (cikloalkil- vagy arilcsoport, amely szubsztituenssel is rendelkezhet) a -COR1 képletben szereplő karbonil csoporthoz alkilén láncon keresztül kapcsolódhat. Az alkilén láncok közé tartoznak például az 1-4 szénatomszámos alkilén láncok (például a metilén, etilén, metil-metilén (etilidén), propilén, butilén, 1-, 2- vagy 3-metil-propilén, 1- vagy 2-etiletilén, propil-metilén, 1,1- vagy 1,2 dimetil-etilén, izopropil-metilén). Az alkilén láncok rendelkezhetnek a fentemlített szubsztituensek valamelyikével. Ennek megfelelően, ha a ciklikus csoport és az alkilén lánc összekapcsolódik, akkor R1 jelentése olyan cikloalkilcsoport vagy aralkilcsoport, amely szubsztituenssel rendelkezhet.
Az R1-gyel jelölt, 1-18 szénatomot tartalmazó és egy szubsztituenssel rendelkező alkilcsoportok közé tartozik például «
• · ····
.··. .··. ···: ·»· · · · • · · · · ·· ·· ·· a metoxi-metil-, butoxi-metil-, metil-tio-metil-, metil-tio-et.il-, etil-tio-etil-, izopropil-tio-etil-, butil-tio-etil-, izobutil-tio-etil-, acetil-oxi-metil-, acetil-oxi-etil-, etoxi-karbonil-metil-, butoxi-karbonil-etil-, fluor-metil-, klór-metil-, klór-etil-, 3-klőr- -propil,
4- klór-butil-, trifluor-metil-, bróm-metil-, 4-bróm-butil-,
5- bróm-pentil-, jód-metil-, 2-jód-etil-, ciano-metil-, metil-szulfinil-etil- és metil-szulfonil-metil-csoport.
Az R1-gyel jelölt, 2-10 szénatomot tartalmazó és egy szubsztituenssel rendelkező alkenil csoportok közé tartozik a 2-etoxi-karbonil-vinil-csoport.
Az Ri-gyel jelölt, 3-10 szénatomot tartalmazó és egy szubsztituenssel rendelkező cikloalkil csoportok közé tartozik például a 2,2-dimetil-ciklopropil-, 4-izobutil-ciklohexil-, 2-bróm-ciklopropil-, 2-klór-ciklobutil-, 4-klőr-ciklohexil-, 2,2-difluor-ciklobutil-, 3-metoxi-ciklohexil-, 4-acetil-ciklohexil-, 2-ciano-ciklobutil-, 4-ciano-ciklohexil- és 4-dimetil-amino-ciklohexil- csoport.
Az R1-gyel jelölt, egy szubsztituenssel rendelkező árucsoportok közé tartozik például a 2-, 3- vagy 4-metil-fenil-, 4-terc-butil-fenil-, 2-,3- vagy 4-klór-fenil-, 2-,3- vagy 4-bróm-fenil-, 2-, 3- vagy 4-jód-fenil-, 2-, 3- vagy 4-fluor-fenil-, 2- vagy 4-metoxi-fenil-, 4-butoxi-fenil-, 4-metoxi-karbonil-fenil-, 3-acetil-fenil-, 2-, 3- vagy 4-nitro-fenil-, 3- vagy 4-ciano-fenil, 4-dimetil-amino-fenil-, 4-dietil-amino-fenil-, 4-acetoxi-fenil-, 4-butiril-oxi-fenil-,
3.4- dimetoxi-fenil-, 3,4,5-trimetoxi-fenil-,
3.4- metilén-dioxi-fenil-, 3-trifluor-metil-fenil-, 4-metil-tio-fenil-, 4-metil-szulfonil-fenil- és • · ♦ · ·
4-acetamido-fenil-csoport.
Ha az R1-gyel jelölt, a fentiekben ismertetett ciklikus csoport [például oikloalkil és aril (főleg fenil) csoport] az (A) képletben levő acilcsoport karbonil szénatomjához alkilén láncon keresztül kapcsolódik, akkor R1 lényegében olyan csoportot jelent, amely ezeket a ciklikus csoportokat és a hozzá kapcsolódó alkilén láncokat tartalmazza, például egy cikloalkilcsoportot vagy egy aralkilcsoport'ot. Az ilyen cikloalkilcsoportok közé tartozik például az adamantil-metil-, ciklohexil-metil-,
3- ciklohexil-propil-, 2-ciklopentenil-metil- és 2-ciklopentil-etil- csoport. Az aralkil csoportok közé tartozik például a 4-bróm- -benzil-, 2-, 3- vagy 4-ciklobenzil-, 2,5- vagy
3,4-dimetoxi-benzil-, 4-etoxi-benzil-, 4-fluor-benzil-, 3- vagy
4- metoxi-benzil-, 4-metoxi-fenil-etil-, 1- vagy 2-naftil-metil-, 2-, 3- vagy 4-nitro-benzil-, 3-nitro-fenetil-, benzil, 2-,3- vagy 4-fenil-propil-, 2-, 3- vagy 4-metil-benzil-, 3,4,5-trimetoxi-benzil- és α-metil-fenetil-csoport.
A fenti (B) képlettel jellemzett N-acil-a-aminoacil csoportot az alábbiakban írjuk le.
Az R2, R3 vagy R4 csoportok részére meghatározott alkil, alkenil-, oikloalkil- és arilcsoportok ugyanazok mint amiket az előzőkben az R1 számára említettünk. Ezek a csoportok szubsztituenst tartalmazhatnak. Szubsztituensként ugyanazok a csoportok említhetők, mint amiket az előzőkben az R1 csoportnál példaként említettünk. Az R2, R3 vagy R4 ciklikus csoport (azaz cikloalkilvagy arilcsoport a (B) képletben alkilén láncon keresztül kapcsolódhat az α-helyzetben levő szénatomhoz, a nitrogénatomhoz vagy a nitrogénatomhoz kapcsolódó karbonil csoporthoz. Az alkilén lánc ugyanaz lehet mint amit az előzőkben az Rí-nél leírtunk.
Az R4-gyel jelzett alkoxi-csoport lehet 1-4 szénatomos alkoxicsoport (például metoxi-, etoxi-, propoxi-, izopropoxi-, butoxi-, izobutoxi-, szek-butoxi- és terc-butoxi-csoport).
A (B) képlettel leírt N-acil-a-amino-acil csoport lehet például N-acetil-N-metil-glicil-, N-benzoil-N-metil-glicil-, N-(4-klór-benzoil)-N-metil-glicil-, N-acetil-N-metil-alanil-, N-acetil-N-benzil-alanil-, N-acetil-N-metil-leucil-, N-izobutiril-N-metil-alanil-, N-izovaleril-N-metil-alanil-, N-propionil-N-metil-alanil-, N-acetil-N-metil-fenilalanil-, 2-(N-acetil-N-metil)-amino-3-metoxi-karbonil-propionil-, 2-(N-acetil-N-metil)-amino-3-metil-merkapto-propionil-,
2-(N-aceti1-N-metil)-amino-3-etil-merkapto-propionil-, N-acetil-N -metil-izoleucil-, N-acetil-N-metil-leucil-, N-acetil-N-metil-metionil-, Ν-acetil-N-metil-fenilalanil-, N-acetil-N-metil-4'-acetoxi-tirozinil-, N-benzil-N-metil-valil-,
N-aceti1-N-metil-fenilglicil, N-acetil-N-metil-3-ciano-alanil- és N-aceti1-N-metil- -(4'-dímeti1-amino)-fenilalanil-csöpört.
A fenti (I) általános képletben Y-nal jelzett alacsony szénatomszámú alkilszulfonilcsoport lehet 1-4 szénatomszámú alkilszulfonilcsoport (például metánszulfonil-, etánszulfonil-,
2- propánszulfonil-, 2-butánszulfonil-csoport).
Az Y-nal jelzett alacsony szénatomszámú, 1-8 szénatomos alkilcsoport lehet metil-, etil-, propil-, izopropil-, butil-, szek-butil-, pentil-, izopentil-, hexil-, heptil-, oktilcsoport. Az aralkilcsoport lehet fenil-[alacsony szénatomszámú (C1-4) alkilcsoport], például benzil-, 2-fenetil-,
3- fenil-propil-csoport. Az Y-ban szereplő alkil- és aralkilcsoport tartalmazhat szubsztituenst. A szubsztituens lehet • · például hidroxilcsoport, aminocsoport, oxocsoport, halogénatom (klór-, bróm-, jódatom), trifluor-metil-csoport, alacsony szénatomszámú (C2-5) alkoxi-karbonil- csoport, karboxilesöpört, metilén-dioxi-csoport és alacsony szénatomszámú (C1-4) alkil-tio csoport.
A megfelelő 4,5-didezoxi származékokat a III általános képlettel írhatjuk le, ahol a szimbólumok megfelelnek a fentieknek.
Az előzőkben említett ansamitocin származékokat szintetizálhatjuk például a Kupchan és munkatársai által leírt módszerrel [Journal of the American Chemical Society, SZ, 5294 (1975)1, a Higashide és munkatársai által leírt módszerrel [Natúré, 270. 271 (1977)], valamint a 4137230, 4151042, 4162940, 4228239, 4229533, 4248870, 4256746, 4260608, 4263294, 4264596, 4265814, 4294757, 4307016, 4308268, 4308269, 4309428, 4317821, 4322348, 4331598, 4356265, 4362663, 4371533 és 4424219 sorszámú Amerikai Egyesült Allamok-beli szabadalmi leírás alapján és hasonló módszerekkel.
A jelen találmány szerinti cél-antigén számos antigén lehet; a jellemző példák közé tartoznak a rákos sejtek membránjának felületi antigénjei, úgymint a tumorhoz kapcsolódó antigének, immunkompetens sejtfelszíni receptorok és a vírussal fertőzött sejtek felszíni antigénjei. Ezek közül az antigének közül gyakran használják a hTfR-t mint tumorral kapcsolt antigént, de karcinoembrionikus antigént (amelynek a rövidítése CEA), az α-fetoproteint és számos tumorhoz kapcsolódó cukorlánc antigént, beleértve a CA19-9-et [S.Hakomori: Cancer Research, AÜ, 2405 (1985)1, a B-sejt limfóma membrán immunoglobulin idiotipusokat [R.A.Miller et al.: New England Journal of Medicine, 306. 517
-26(1982)], T-sejt limfóma receptor idiotipusokat [L.L.Lanier et al.: Journal of Immunology, 137. 2286 (1986)], valamint a specifikusan a vesesejt karcinómán expresszálódó glikoproteint is használják.
Amint az előzőkben említettük, a jelen találmány szerinti hibrid MoAb képes nagyon specifikusan kötődni a cél antigénhez és hatékonyan elpusztítani a rákos sejteket a hozzákötődö ansamitocin származék citotoxikus hatása révén, ezzel lehetővé teszi a szelektív és hatékony rák kezelést.
A jelen találmány szerinti hibrid MoAb olymódon semlegesíti egy ansamitocin származék citotoxikus hatását, hogy hozzákötödik, majd az ansamitocin származékot a megcélzott helyen elengedi, hogy kifejtse citotoxikus hatását. így a jelen találmány szerinti hibrid MoAb az ansamitocin származékot képes stabil és inaktív formában a célhelytöl eltérő helyen szállítani, majd az ansamitocin aktív formáját a megcélzott helyen felszabadítja, ezzel kiváló stabilitású és szeletivitású, valamint nagyon csekély káros mellékhatással rendelkező rákellenes szer állítható elő.
A továbbiakban a jelen találmányt referencia és munkapéldákon keresztül részletesebben ismertetjük; ezek a példák nem jelenthetik a jelen találmány oltalmi körének korlátozását.
-27Az állati sejtek letétbe helyezése törzsgvüiteménvekben
Állati sejtvonal IFO (IFO szám) FRI (FERM szám)
Egér hibridóma AS6-44.9 50181 BP-2233
Egér-egér hibridóma 22C6 50172 BP-2054
Egér hibridóma ATF1-17Q· 50182 BP-2234
Egér hibridóma RCS-1 50184 BP-2333
Egér hibridóma RCAS1-488 50218 BP-2687
IFO: Institute of Fermentation, Osaka
FRI: Fermentation Research Institute, Agency of Industrial
Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry
1. Referencia példa (ELISA az anti-ANS antitest vizsgálathoz) (1) Szilárd fázisú antigén előállítása
N-(gamma-maleimido-butiriloxi)-szukcinimiddel maleimidezett maytansinol 3-a-amino-fenil-acetátot adunk olyan HSA-hoz, amelyet N-szukcinimidil-piridil-ditio-propionátos redukcióval módosítunk, így kapjuk tiolcserés reakcióval a (maytansinol-3-a-amino-fenil-acetát)-HSA komplexet.
(2) Vizsgáló módszer
A fenti, antigén-érzékenyített lemezhez 100 ul-t adunk a szóbanforgó hibridóma felülúszójából, majd 2 órán át
-28szobahömérsékleten hagyjuk a reakciót lejátszódni. Miután a lemezt alaposan mostuk 20 millimólos foszfáttal puffereit sóoldattal, amely 0.05 % Tween 20-at tartalmaz (pH=7.3, a továbbiakban csak PBS-Tw-nek rövidítjük), egy HRP-vel jelzett anti-egér IgG nyúl antitestet adunk hozzá, majd a reakciót szobahőmérsékleten hagyjuk lejátszódni 2 órán át.
Miután a lemezt ismét mostuk, orto-fenilén-diamint és Hz02-t mint enzim-szubsztrátot' tartalmazó 0.1 mólos citrát puffer oldatot adunk mindegyik lemezhez, és az enzimreakciót szobahőmérsékleten hagyjuk lejátszódni. Miután a reakciót 1 normál kénsav hozzáadásával leállítottuk, a színanyag mennyiségét 492 nm-en fotometrálva határozzuk meg, egy Multiscan alkalmazásával (készíti a Flow Co.).
2. Referencia példa (Az anti-hTfR-antitestet termelő hibridóma készítése) (1) A hTfR tisztítása kg humán placenta-szövetet kis darabokra vágunk, majd PBS-ben ípH=7.5) homogenizáljuk, majd lecentrifugáljuk. A kapott üledéket 4 % Triton Χ-100-at tartalmazó PBS-ben homogenizáljuk. Ezt a hcmogenizátumot ultrahangozzuk, majd lecentrifugáljuk. A kapott felülúszóhoz 100 ml-ként 32 g ammónium-szulfátot adunk. Kisózás után ezt az oldatot olyan oszlopra visszük, amelyre anti hTf antitestet kapcsoltunk, majd alaposan mossuk 0.5 mól NaCl-t tartalmazó PB-vel (pH=7.5). A 0.5 mól NaCl-t és 0.5% Triton-X 100-at tartalmazó 0.02 mólos glicin pufferrel (pH=10.0) eluálódó hTfR frakciót hTf-fel kapcsolt oszlopra visszük. Miután az oszlopot 1 mól NaCl-t tartalmazó PB-vel mostuk, az elúciót 1 mól NaCl-t és 1% Triton Χ-100-at tartalmazó 0.05 mólos glicin
« ·
-29pufferrel (pH=10.0) végezve körülbelül 1.5 mg tisztított hTfR mintát kapunk.
(2) Immunizálás
A fenti tisztított hTfR minta fiziológiás sóoldatban készült 200 pg/ml-es oldatához azonos térfogatú Freund komplett adjuvánst adunk, majd alaposan emulgeáljuk. A kapott emulziót ezután intraperitonálisan és szubkután adagoljuk BALB/c egereknek (nőstény, n=10. 20 ug/ml/egér). A további immunizálást 3 hetes intervallumokban végezzük. 4 egymást kővető immunizálás után két héttel maximális szérum antitest titerrel rendelkező állatnak intravénásán ugyanazt a hTfR antigén oldatot adjuk mint amit az előzőkben meghatároztunk (30 ug/0.1 ml fiziológiás sóoldat/egér).
(3) Sejtfúzió
A végső immunizálás után 3 nappal a lépet kivágjuk és splenocita szuszpenziót készítünk a szokványos módszerekkel (körülbelül 10® sejt). Ehhez a szuszpenzióhoz 2 x 10T egér mielóma sejtet adunk, majd PEG 6000-rel fúzionáltatjuk a sejteket Köhler és Milstein módszere szerint [Natúré, 256. 495 (1975)].
A sejtfúzió teljes lejátszódása után a sejtkeveréket HAT táptalajban szuszpendáljuk, amely hipoxantint, aminopterint és timidint tartalmaz, és 10 napig növesztjük őket. A szülösejtek szelektálása után a tenyésztést tovább folytatjuk HT táptalajon, amelynek ugyanilyen az összetétele mint a HAT táptalajnak, csak nem tartalmaz aminopterint.
(4) Hibridómák szelekciója és klónozása
Kereskedelmi forgalomban levő anti-egér IgG nyúl antitest oldatot (20 pg/ml) mérünk szét 100 ul/luk mennyiségben egy 96 lukas mikrotiter lemezen. A mikrotiter lemezt ezután éjszakán át 4°C-on hagyjuk állni, majd 2 % BSA-t tartalmazó PBS-t (pH=7.3)
-30• · • ·· adunk az érzékeny!tett lemezhez. Az (1) pontban kapott tisztított hTfR mintát, miután az ismert módszerrel HRP-vel jelöltük, használjuk ELISA-hoz [T.Kitagawa: Yuki Gosei Kagaku, 42, 283 (1984)]. Eszerint a hibridómák tenyészetének felülúszóját adjuk a fenti második antitest-érzékenyített lemezhez, majd a reakciót szobahőmérsékleten 2 órán át hagyjuk lejátszódni. Ennek megfelelően, a hibridóma tenyészetek felülúszóját az előzőkben említett második antite'st-érzékenyített lemezhez adjuk, majd a reakciót szobahőmérsékleten hagyjuk lejátszódni 2 óra alatt. Miután a lemezt PBS-sel mostuk, HRP-vel jelzett hTfR-t adunk hozzá, majd ezt kétórás, szobahőmérsékleten lejátszódó reakció követi. Az enzim-reakciót ezután az antitest-titer meghatározása céljából az 1-(2) referencia példa szerint hajtjuk végre.
A különösen magas kapcsolási aktivitást mutató hibridómákat határhigítási módszerrel klónozzuk, így kapjuk a 22C6 anti-hTfR antitestet termelő hibridómát. A jelen antitestet az IgGi (kappa lánc ) alosztályba tertozónak azonosítottuk, amely nagy affinitást mutat a K562 humán rákos sejtvonalhoz.
3... Referencia példa (Kevert hemagglutináciős vizsgálat, MHA)
A vizsgált sejtek közül a tapadó sejteket (500 sejt/luk) egy 60 lukas mikrotiter lemezen hígítjuk (Nunc), majd 24-48 óra hosszat tenyésztjük, míg a nem-tapadó sejteket szérumot nem tartalmazó táptalajban szuszpendáljuk, lukakba osztjuk szét (500 sejt/luk), majd 5 percig 400 x g-vel centrifugáljuk, hogy a sejtek a lemezhez tapadjanak.
···· · ·
Λ · · · • · ·«·· *
• ··
-31<·· ·
Az indikátor vért a kővetkezők szerint állítjuk elő: Birka vörös vérsejteket háromszor mossuk PBS-sel, majd PBS-ben szuszpendálva 2 %-os szuszpenziót állítunk elő. A szuszpenziót azonos térfogatú egér anti-birka-vörös vérsejt antitesttel (Ortho) reagáltatjuk, amelyet előzőleg 2.5-szörösre hígítottunk maximum agglutinációs titeren PBS-sel, 37°C-on 30 percig. A vérsejteket háromszor mossuk PBS-sel majd ismét PBS-ben szuszpendáljuk 2 %-os koncentrációban. A szuszpenziőt azonos térfogatú nyúl anti-egér IgG antitesttel (Cappel) reagáltatjuk, amelyet előzőleg 25-szörösre hígítottunk PBS-sel, 37°C-on 30 percig. A vérsejteket ezután háromszor mossuk PBS-sel, majd 2 %-os szuszpenzió formájában tároljuk.
A sejt-tapadási lemezt 0.1 mólos MgCla-0.03 mólos CaCls-0.1% glükóz tartalmú Veronái puffereit sóoldattal mossuk (pH=7.4, rövidítése a továbbiakban VBS), amely még 5% FCS-t tartalmaz. Egy tenyészet felülúszót vagy aszcitesz folyadékot a mikrotiter lemez lukaiba mérünk szét, majd egy órán át szobahőmérsékleten hagyjuk állni. A lemezt VBS-sel mossuk, majd az előzőleg 5%-os FCS-VBS-sel 0.2 %-osra hígított indikátor vérsejt szuszpenziót mérjük szét a lukakba és szobahőmérsékleten hagyjuk állni 40 percig. A lemezt VBS-sel mossuk hogy eltávolitsuk a nem reagált vérsejteket, majd mikroszkóppal vizsgáljuk. Azt az esetet minősítjük pozitívnak, amikor a kontroll tesztben (antitestet nem adtunk hozzá) nem keletkezik 1 %-nál több rozetta és ezzel egyidöben a vizsgált sejteknek több mint 25 %-nál keletkezik rozetta a fenti tesztben.
• ··· · · · · .
.....· ·.·* *·.· ····
4. Referencia példa (Anti humán vesesejt karcinóma monoklonális antitestet termelő hibridóma készítése) (1) Humán vese ráksejtek transzplantációja és immunizálás szérummal
Egy nu/nu-BALB/c egérnek szubkután beadunk egy tumorszövet darabot (graft, 2 mm-es négyzet), amely veserákban szenvedő betegtől származik, így kapjuk az AM-RC-3, stabil ráksejtet, amelyet ezután szubkután átültetünk szingenikus nu/nu-BALB/c egérnek. Három-négy hét elteltével a szérumot összegyűjtjük. Egy szingenikus BALB/c egérnek intraperitonálisan beadunk 0.5 ml-t a szérumból azonos térfogatú komplett Freund adjuvánssal, ezt hatszor megismételjük 7-10 napos intervallumokban, majd az egérnek intraperitonálisan 1.0 ml-t adunk a szérumból (végső immunizálás). A végső immunizálás után az antitest titert a 3. referencia példában leírt MHA módszerrel határozzuk meg.
(2) Hibridóma készítés
Az immunizált egérnek azokat a lépsejtjeit, amelyek magas antitest titert mutatnak, egér mielőma sejtekkel (NS-1) fúzionáltatjuk az ismert módszerrel (kezelés PEG6000-rel 37°C-on 1-10 percig), majd a hibridómákat HAT táptalajon szelektáljuk (1 x 10-4 mól hipoxantin, 4 x 10_T mól aminopterin és 1.6 xl0~s mól timidin). A növekedő hibridóma csoportokat a 3. referencia példában leírt MHA módszerrel vizsgáljuk át, majd a magas antitest titerű csoportokat tovább klónozzuk, így kapjuk az anti-humán vese karcinóma MoAb-ot termelő RCS-1 egér hibridómát. Az RCS-1 egér hibridóma által termelt RCS-1 antitestet az IgGi
• r·
-33alcsoportba tartozónak azonosítottuk.
(3) Egér MoAb előállítása
Egy MCH (AF)-nu egérnek 5 x 106 egér hibridóma RCS-1 sejtet adunk be intraperitonálisan. Körülbelül 4 hét elteltével 5-10 ml aszcitesz folyadékot gyűjtünk össze. Az összegyűjtött aszcitesz folyadékot kisózzuk ammőnium-szulfáttal, majd DEAE-cellulóz oszlopon tisztítjuk. Körülbelül 200 mg tisztított egér anti-humán vesesejt karcinóma MoAb RCS-l-et kapunk 50 ml aszcitesz folyadékból.
(4) Az egér anti-humán vese karcinóma MoAb jellemzői
Az egér MoAb RCS-1 reakcióképességét a különböző humán tumorsejtekkel és normál vesesejtekkel a 3. referencia példában leírt MHA módszerrel határozzuk meg. Az eredmények a kővetkező táblázatban láthatók.
A táblázatból tisztán látható, hogy az antitest erősen reagál mindenféle veseráksejttel, míg nem reagál a normál veseszövetekkel. Az antitest ezenkívül reagál a tüdőrák sejtek, hólyagrák sejtek és T-sejt leukémia sejtek egy részével.
·· *··' · · · · • · · · · ·_ · · · ·»·· ·· ·
-34♦ »·
Táblázat (Az egér RCS-1 monoklonális antitest reaktivitása)1
Pozitív sejtcsoportok
Veserák: (AM-RC-3, AM-RC-6, AM-RC-7, SK-RC-1, SK-RC-9, SK-RC-18)
Hólyagrák: (T-24)
Tüdőrák: (Luci-10, Calu-6, PC-1O)
T-sejt leukémia (HUT-78)
Negatív se/it csoportok:
Hólyagrák: (KK-47, MGH-U-1)
Prosztatarák: (DU-145)
Gyomorrák: (NUGC-2, NUGC-3, NUGC-4, MKN-28, KATO-III, MRK-1)
Bélrák (SW-403, SW-620, SW-1116, SW-1222, CaOV-4, HT-29)
Méhnyakrák: (ME-180)
Melanóma (SK-MEL-33, SK-MEL-37)
Mellrák (MCF-7)
Glioma (MG-178)
Tüdőrák (ADLC-DA, SBC-3, SCLC-SA, Luci-6, CAD0-LC3, OKADA, QG-56)
T-sejt leukémia: (CCRF-CEM, HPB-ALL, HSB-2, HUT-102, RPMI-8402, P12/Ichikawa, MT-1, MT-2)
B-sejt leukémia: (Raji, Daudi, Ball-1, RPMI-1788, Ly-16)
Null sejt leukémia: (Nall-1, Nalm-6, Nalm-18, KOPN-K, P30/0hkubo) Myelocita leukémia: (HL-60)
Negatív szővetcsoport:
Normál vese (5 különböző)
1): A 3. referencia példa szerinti MHA módszerrel meghatározva.
·· *· ···« · ··· • · · · . · · · ···· ·· ·· ·
L·.......pálda (Az anti-ANS-antitestet termelő hibridóma előállítása és immunizálás)
PDM-3-C2O-karboximetil étert aktív észterré alakítunk N-hidroxi-szukcinimiddel és diciklohexil-karbodiimiddel, majd a BSA hordozó-fehérjéhez kapcsoljuk, így kapunk egy immunogént.
Az igy kapott (PDM-3-C-2o-karboximetil éter)-BSA komplex 200 pg/ml fiziológiás sóoldatban készült oldatához azonos térfogatú Freund komplett adjuvánst adunk, majd alaposan emulgeáljuk. A kapott emulziót intraperitonálisan és szubkután adjuk be BALB/c egereknek (nőstény, 20 ug/ml/egér). A további immunizálást 2-3 hetes intervallumokban végezzük. Annak az állatnak, amely három további immunizálás után 10 nappal maximális szérum antitest titert mutat, a (PDM-3-C2o-karboximetil-éter)-BSA komplex oldatát adjuk be intravénásán (50 ug/0.1 ml fiziológiás sőoldat / egér).
(2) Sejtfúzió
A sejtfúziót a 2-(3) referencia példában leírt módon végezzük.
(3) Hibridőmák szelekciója és klónozása
A hibridómákat az 1. referencia példában szereplő ELISA módszerrel szelektáljuk, (maytansinol 3-a-aminofenil-acetát)-HSA-val kapcsolt mikrotiter lemezen, majd a 2-(4) referencia példában leírt eljárást követve kapjuk az anti-ANS MoAb-ot termelő hibridómákat. Ezek közül a hibridómák közül szelektáltuk az AS6-44.9 egér hibridómát, amely erősen kötődik a 9-tiomaytansin-hoz, a MAY-hoz és az ANS-hez, valamint a PDM-3-36«··
-C2o-karboximetil-éter immunogénhez. A jelen antitest immunoglobulin osztályát, alosztályát és könnyülánc típusát meghatározva az IgGi-lambda láncúnak bizonyult az Ouchterlony és ELISA módszerekkel. Az antitestről úgy találtuk, hogy képes semlegesíteni az ANS citotoxicitását.
Az 1. ábrán láthatjuk az AS6-44.9 hibridoma tenyészet felúlúszőjának ELISA-val mért antitest higítási görbéjét. A 2. ábrán láthatjuk az ANS citotoxicitásának semlegesítési görbéit (megcélzott sejtvonalak: P388D1 egér leukémia sejtvonal és a K562 humán leukémia sejtvonal).
2.-Példa (Az anti-ANS-anti-hTfR bispecifikus hibrid monoklonális antitest előállítása) (1) Sejtfúzió
Az 1. példában előállított anti-ANS antitestet termelő AS6-44.9 hibridómát, valamint a 2. példában előállított, az anti-hTfR antitestet termelő 22C6 hibridómát fluoreszcens festés céljára 37’C-on 30 percig Iskove-Ham kevert táptalajban inkubáljuk, amely az AS6-44.9 esetében 0.5 ug/ml FITC-t, illetve a 22C6 esetében 1.5 ug/ml TRITC-t tartalmaz. LSM oldat hozzáadása (megvásárolható a Wako Pure Chemical Industries Ltd-töl) és az elpusztult sejtek eltávolítása után ezeket a hibridómákat 1:1 arányban összekeverjük, majd PEG6000-rel fúzionáltatjuk a sej teket.
Miután két órán át 37°C-on inkubáltuk, a sejteket FACS-ra visszük, majd 25 000 fluoreszceinnel-rodaminnal duplán festett sejtet szelektálunk. Ezeket a duplán festett sejteket (10
-37sejt/luk) 96 lukas mikrotiter lemezen szaporítjuk,amely 5 x 105 sejt/luk mennyiségben egér timocitákat tartalmaz tápláló sejtekként.
(3) Hibrid hibridómák klónozása és szelekciója
Azokban a lukakban levő sejtek felülúszóját, amelyekben a sejtfúzió után 1-2 héttel sejtszaporodás történt, a kővetkező bispecifikus antitest ELISA eljárással vizsgáljuk, hogy meghatározzuk antitest 'titerüket. Az 1-(1) referencia példában előállított (maytansinol 3-a-aminofenil-acetát)-HSA érzékenyített lemezekhez adjuk a hibrid hibridómák tenyészetének felülúszóját, majd a reakciót 2 óráig hagyjuk lejátszódni szobahőmérsékleten. Miután a lemezt PBS-Tw-vel mostuk, biotinnal jelzett anti-egér IgG-kappa lánc specifikus antitestet adunk hozzá, majd a reakciót 2 óra hosszat hagyjuk szobahőmérsékleten lejátszódni. Ezután HRP-vel jelzett avidint adunk hozzá és a lemezt mossuk. A szilárd fázishoz kötődött enzim aktivitását az l-(2) referencia példában leírt módszerrel határozzuk meg.
A magas hibrid antitest aktivitást mutató lukakat határhigítási módszerrel klónozzuk, így kapjuk a keresett bispecifikus antitestet termelő ATF1-170 tetraómát.
A 3. ábrán látható az ATF1-170 felülúszója antitest higítási görbéje.
(3) A hibrid antitest tisztítása
Egerenként 5 x 106 tetraóma sejtet adunk be intraperitonálisan hat BALB/c egérnek, amelyeknek előzőleg intraperitonálisan 0.5 ml ásványolajat adtunk. Az aszcitesz folyadék visszatartása 14-18 nappal később jelentkezik. Az aszcitesz folyadékot összegyűjtjük és 45-50 % telített ammónium-szulfáttal kisózzuk, így kapjuk az IgG frakciót. 20 mmőlos • · • · · ·
-38PBS-sel (pH 7.5) szembeni dialízis után ezt a frakciót olyan Cellulofine oszlopra visszük, amelyet PDM-3-C20-p-aminobenzil éterrel kapcsoltunk, majd 0.2 mólos glicin-HCl pufferrel (pH=2.9) eluáljuk. A savasan eluált frakciót PBS-sel szemben dializáljuk, majd nagynyomású folyadékkromatográfra visszük, hidroxilapatit oszlopot használva kapjuk a jelen találmány szerinti anti-ANS-anti-hTfR bispecifikus hibrid antitestet.
ml aszcitesz folydékból körülbelül 7.3 mg bispecifikus antitestet kapunk.
X Példa (Anti-ANS-anti-hTfR bispecifikus monoklonális antitest izolálása)
Az ATF1-17O tetraómát BALB/c egerekbe oltjuk a 2-(3) példában leírt módszerrel aszcitesz folyadék előállítása céljából. A kapott aszcitesz folyadékot 40-50 % telített ammónium-szulfáttal kisózzuk, majd Protein A oszlopon tisztítva kapjuk az IgG frakciót. Ezt a savasan eluált frakciót 10 mmólos kálium-foszfát pufferrel (pH=6.2) szemben dializáljuk, majd olyan hidroxilapatit oszlopra visszük, amelyet azonos pufferrel hoztunk egyensúlyba. Az eluálást 10-300 mmólos kálium-foszfát (pH=6.2) oldat gradienssel végezzük a különböző immunoglobulin fajták elválasztása céljából. Az eredmények a 4. ábrán láthatók.
A 4. ábrán az 1. csúcs az AS6-44.9 anti-ANS antitest elúciós pozíciójának felel meg, a 3. csúcs a 22C6 anti-hTfR antitest elúciós pozíciójának. A megfelelő csúcsok antitest elúciós frakcióit a 2-(2) példában bispecifikus antitestekre leírt ELISA módszerrel vizsgáljuk. Ennek eredményeképpen, csak a 2-es csúcs mutatott erős antitest aktivitást; ez azt igazolja, hogy a keresett ATF1-170 bispecifikus antitest a 2-es csúcsban eluálódik.
A jelen találmány szerinti aszcitesz folyadék 5 ml-éböl körülbelül 2.2 mg bispecifikus antitest nyerhető ki.
4. Példa (Az anti-ANS-anti-hTfR bispecifikus monoklonális antitest szelektív citotoxicitása)
A 3. példában előállított tisztított anti-ANS-anti-hTfR bispecifikus antitestet 5 mól-ekvivalensnyi ansamitocinnel reagáltatjuk 1 óra hosszat 5°C-on, majd a reakcióelegyet olyan Sephadex G-25 oszlopra visszük amely PBS-sel van egyensúlyba hozva, így nyerjük ki az ANS-bispecifikus antitest komplexet.
Az ANS-antitest komplex oldatot (0.5 ml/luk) olyan lemezre visszük, amelyre humán leukémia sejteket (K562; 1.0 x 104 sej0.,/0.5 ml/luk) vagy egér leukémia sejteket (P388Di; 1.0 x 104 sejt/0.5 ml/luk) oltottunk, majd a tenyésztést 4 napig 37°C-on végezzük. A tenyésztés után a sejtszámot Coulter Counterrel meghatározzuk, és az ANS-antitest komplex citotoxicitását értékeljük. Az eredmények az 5. ábrán láthatók.
Az ANS-antitest komplex erős citotoxikus hatást mutat a K562 humán leukémia sejtvonallal szemben, amely rendelkezik hTfR-rel, és erősen kötődik a jelen találmány szerinti bispecifikus antitesthez, de csekély citotoxikus hatása van a P388D1 egér leukémia sejtvonalra, amelyen nincs hTfR.
5. Példa (Anti-ΑΝS-anti-humán vesesejt karcinóma bispecifikus hibrid monoklonális antitest előállítása) (1) Sejtfúzió
A 2. példában leírt módszer szerint az 1. példában előállított AS6-44.9 anti-ANS antitestet termelő hibridómát és a
4. referencia példában előállított RCS-1 anti-humán vesesejt karcinóma antitestet termelő hibridómát fluoreszcens festéshez 30 percig 37°C-on kúlön-kúlön Iskove-Ham F12 kevert táptalajban inkubáljuk, amely az AS6-44.9 esetében 0.3 pg/ml FITC-t és az RCS-1 esetében 1.5 pg/ml TRITC-t tartalmaz. LSM oldat hozzáadása (beszerezhető a Wako Pure Chemical Industries, Ltd.-töl) és az elpusztult sejtek eltávolítása után a két hibridómát 1:1 arányban összekeverjük és PEG6000-rel fúzionáltatjuk.
Miután két órán át inkubáltuk, a sejteket FACS-ra visszük és 25 000 fluoreszceinnel-rodaminnal duplán festett sejtet izolálunk. Ezeket a duplán festett sejteket (10 sejt/luk) olyan 96 lukas mikrotiter lemezen tenyésztjük, amelyet tápláló sejtekként 5 x 10s sejt/luk koncentrációban egér timocitákkal borítunk.
(2) Hibrid hibridómák szelekciója és klónozása
Azokban a lukakban levő sejteknek a felülúszóját, amelyekben a fúzió után 1-2 héttel sejtszaporodás volt, a következő bispecifikus antitest ELISA eljárásnak vetjük alá, hogy meghatározzuk antitest titerüket. Olyan mikrotiter lemezre, amelyre AM-RC-7 vese ráksejteket (104 sejt/luk) adszorbeáltunk, felvisszük a kiválasztott hibrid hibridómák felülúszóját, majd a reakciót szobahőmérsékleten 2 óra hosszat hagyjuk lejátszódni.
-41Miután a tenyészetet tápfolyadékkal mostuk, HRP-vel jelzett (maytansinol 3-a-aminofenil-acetát)-HSA-t adunk hozzá, majd a reakciót szobahőmérsékleten 2 óra hosszat hagyjuk lejátszódni. A lemezt ezután mossuk. A szilárd fázishoz kötődő enzim aktivitását az l-(2) referencia példában leírt módszerrel határozzuk meg.
Azokat a lukakat, amelyek magas hibrid antitest aktivitást mutatnak, határhigításos módszerrel klónozzuk, így kapjuk a keresett bispecifikus antitestet termelő RCAS1-488 tetraőmát. A
6. ábrán láthatjuk az RCAS1-488 tenyészet felülúszójának antitest higítási görbéjét.
(3) A hibrid antitest tisztítása
Egerenként 5 χ 106 tetraóma sejtet oltunk be intraperitonálisan hat olyan BALB/c egérnek, amelyek előzőleg intraperitonálisan 0.5 ml ásványolajat kaptak. Az aszcitesz folyadék felgyülemlése 14-18 nappal később kezdődik. Az aszcitesz folyadékot összegyűjtjük, és 40-50 %-ig telített ammónium-szulfáttal kisózzuk, így kapunk egy IgG frakciót. 20 mmólos PBS-sel (pH=7.5) szembeni dialízis után ezt a frakciót olyan Cellulofine oszlopra visszük, amelyre PDM-3-C2o-p-aminobenzil-étert kötöttünk, majd 0.2 mólos glicin-HCl pufferrel (pH=2.9) eluáljuk. A savasan eluált frakciót PBS-sel szemben dializáljuk, majd nagynyomású folyadékkromatográfiának vetjük alá hidroxilapatit oszlopot használva, így kapjuk a jelen találmány szerinti anti-ANS-anti-humán vesesejt karcinóma bispecifikus hibrid antitestet.
ml aszcitesz folyadékból körülbelül 5.8 mg bispecifikus antitestet kapunk.

Claims (20)

1. Eljárás olyan hibrid monoklonális antitest előállítására, amely mind egy ansamitocin származékhoz, mind egy megcélzott antigénhez képes kötődni, azzal jellemezve, hogy az említett hibrid monoklonális antitest előállítására képes polidómát tenyésztünk, és az említett monoklonális antitestet kinyerjük a tenyészetből.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás a megcélzott antigénként egy tumorhoz kapcsolódó antigénhez kötődni képes antitest előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő antitestet nyerjük ki.
3. A 2. igénypont szerinti eljárás a tumorhoz kapcsolódó antigénként humán transzferrin receptorhoz kötődni képes antitest előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő antitestet nyerjük ki.
4. A 2. igénypont szerinti eljárás a tumorhoz kapcsolódó antigénként humán vesesejt karcinómához kapcsolódó glikoproteinhez kötődni képes antitest előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő antitestet nyerjük ki.
5. Az 1. igénypont szerinti eljárás z ansamitocin származékként a III általános képletű vegyülethez, ahol R jelentése hidrogénatom vagy karbonsavból származó acil-csoport; Q jelentése hidroxilcsoport vagy merkaptocsoport X jelentése klóratom vagy hidrogénatom; Y jelentése hidrogénatom, rövidszénláncu alkilszulfonilcsoport, alkilcsoport vagy aralkilcsoport, ezek közül bármelyik lehet helyettesített vagy ezeknek 4,5-dezoxi származékaihoz kötődni képes antitest előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő antitestet nyerjük ki.
• ·
6. Az 5. igénypont szerinti eljárás R helyén
-CORi képletű csoportot tartalmazó, III általános képletű vegyűlethez kötődni képes antitest előállítására, amelyben R1 jelentése 1-18 szénatomot tartalmazó alkilcsoport, vagy a kővetkező képletű csoport:
R3
-COCH-N' ahol R2, R3 és R4 jelentése 1-18 szénatomos alkilcsoport, Q jelentése hidroxil- vagy merkaptocsoport; X jelentése klóratom;
Y jelentése 1-8 szénatomos alkilcsoport, azzal jellemezve, hogy a megfelelő antitestet nyerjük ki.
7. Eljárás egy ansamitocin származék és egy olyan hibrid monoklonális antitest közötti immunkomplex előállítására, amely mind az ansamitocin származékhoz, mind egy megcélzott antigénhez képes kapcsolódni, azzal jellemezve, hogy az említett ansamitocin származékot az említett hibrid monoklonális antitesttel reagáltatjuk.
8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy megcélzott antigénként egy tumorhoz kapcsolódó antigénhez kötődni képes antitestet alkalmazunk.
9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy tumorhoz kapcsolódó antigénként humán transzferrin receptorhoz kötődni képes antitestet alkalmazunk.
10. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy tumorhoz kapcsolódó antigénként humán vesesejt karcinómához kapcsolódó glikoproteinhezkötödni képes antitestet alkalmazunk.
11. Az 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy ansamitocin származékként
III általános képletű vegyületet alkalmazunk, ahol R jelentése hidrogénatom vagy karbonsavból származó acil-csoport; Q jelentése hidroxilcsoport vagy merkaptocsoport; X jelentése klóratom vagy hidrogénatom; Y jelentése hidrogénatom, rövidszénláncu alkilszulfonilcsoport, alkilcsoport vagy aralkilcsoport, ezek közül bármelyik lehet helyettesített vagy ezeknek 4,5-dezoxi származékai.
12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy R helyén
-C0R1 képletű csoportot tartalmazó vegyületet alkalmazunk, amelyben R1 jelentése 1-18 szénatomot tartalmazó alkilcsoport, vagy a következő képletű csoport:
R2 | R3
-COCH-N^
COR4 ahol R2, R3 és R4 jelentése 1-18 szénatomos alkilcsoport, Q jelentése hidroxil- vagy merkaptocsoport; X jelentése klóratom; Y jelentése 1-8 szénatomos alkilcsoport.
13. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az ansamitocin származékként ansamitocint használunk.
14. Eljárás olyan polidóma előállítására, amely képes egy ansamitocin származék és egy olyan hibrid monoklonális antitest közötti immunkomplex előállítására,.amely mind az ansamitocin származékhoz, mind egy megcélzott antigénhez képes kapcsolódni, azzal jellemezve, hogy egy ansamitocin származék előállítására képes állati sejtet olyan állati sejttel fúzionáltatunk, amely a megcélzott antigén elleni antitestet termel.
15. A 14. igénypont szerinti eljárás egy tetraóma előállítására, azzal jellemezve, hogy mindkét állati sejtként hibridómát használunk
16. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy megcélzott antigénként egy tumorhoz kapcsolódó antigént használunk.
17. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy tumorhoz kapcsolódó antigénként humán transzferrin receptort használunk.
18. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tumorhoz kapcsolódó antigénként humán vesesejt karcinómához kapcsolódó glikoproteint használunk.
19. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az ansamitocin származékként a III általános képletű vegyületet használunk, ahol R jelentése hidrogénatom vagy karbonsavból származó acilcsoport; Q jelentése hidroxilcsoport vagy merkapto csoport; X jelentése klóratom vagy hidrogénatom; Y jelentése hidrogénatom, rövidszénláncu alkilszulfonil csoport, alkilcsoport vagy aralkilcsoport, ezek közül bármelyik lehet helyettesített vagy ezeknek 4,5-dezoxi származékai.
20. A 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy R helyén
-CORi képletű csoportot tartalmazó III általános képletű vegyületet használunk, amelyben R1 jelentése 1-18 szénatomot tartalmazó alkilcsoport, vagy a kővetkező képletű csoport:
R2 | R3
-COCH-N^ ^COR4 ahol R2, R3 és R4 jelentése 1-18 szénatomos alkilcsoport, Q jelentése hidroxil- vagy merkaptocsoport; X jelentése klóratom; Y jelentése 1-8 szénatomos alkilcsoport.
A meghatalmazott:
danubia
SiabadaJml és Védjefly Iroda Kft 'v„.
J
6763/89
6/1
HU896763A 1988-12-27 1989-12-22 Process for producing bispecific monoclonal antibody HUT53153A (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP33219488 1988-12-27
JP1856089 1989-01-26

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HU896763D0 HU896763D0 (en) 1990-02-28
HUT53153A true HUT53153A (en) 1990-09-28

Family

ID=26355251

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU896763A HUT53153A (en) 1988-12-27 1989-12-22 Process for producing bispecific monoclonal antibody

Country Status (6)

Country Link
US (1) US5141736A (hu)
EP (1) EP0376176A3 (hu)
KR (1) KR900009096A (hu)
CA (1) CA2006408A1 (hu)
DK (1) DK666389A (hu)
HU (1) HUT53153A (hu)

Families Citing this family (45)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5977307A (en) * 1989-09-07 1999-11-02 Alkermes, Inc. Transferrin receptor specific ligand-neuropharmaceutical agent fusion proteins
US6329508B1 (en) 1989-09-07 2001-12-11 Alkermes, Inc. Transferrin receptor reactive chimeric antibodies
US5672683A (en) * 1989-09-07 1997-09-30 Alkermes, Inc. Transferrin neuropharmaceutical agent fusion protein
CA2026147C (en) * 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5208020A (en) * 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US6099842A (en) * 1990-12-03 2000-08-08 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant immunotoxin composed of a single chain antibody reacting with the human transferrin receptor and diptheria toxin
US5622835A (en) * 1994-04-28 1997-04-22 The Wistar Institute Of Anatomy & Biology WT1 monoclonal antibodies
US6991907B1 (en) * 1995-04-18 2006-01-31 Biosite, Inc. Methods for the assay of troponin I and T and complexes of troponin I and T and selection of antibodies for use in immunoassays
US6174686B1 (en) * 1995-04-18 2001-01-16 Biosite Diagnostics, Inc. Methods for the assay of troponin I and T and complexes of troponin I and T and selection of antibodies for use in immunoassays
US6627404B1 (en) * 1995-04-18 2003-09-30 Biosite, Inc. Methods for improving the recovery of troponin I and T in membranes, filters and vessels
US6015555A (en) * 1995-05-19 2000-01-18 Alkermes, Inc. Transferrin receptor specific antibody-neuropharmaceutical or diagnostic agent conjugates
US6805869B2 (en) 1996-06-12 2004-10-19 Shanghai Cp Guojian Pharmaceutical Co., Ltd. Cellular vaccines and immunotherapeutics and methods for their preparation
US20050136066A1 (en) * 1996-06-12 2005-06-23 Yajun Guo Cellular vaccines and immunotherapeutics and methods for their preparation
DK1068357T3 (da) * 1998-03-30 2011-12-12 Northwest Biotherapeutics Inc Terapeutiske og diagnostiske anvendelser baseret på CXCR-4-genets rolle i tumorgenese
US6312689B1 (en) 1998-07-23 2001-11-06 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Anti-CCR2 antibodies and methods of use therefor
US6333410B1 (en) 2000-08-18 2001-12-25 Immunogen, Inc. Process for the preparation and purification of thiol-containing maytansinoids
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US20020156274A1 (en) * 2001-03-16 2002-10-24 Terfloth Gerald J. Process for preparing maytansinol
DK2163256T3 (en) 2001-05-11 2015-12-07 Ludwig Inst For Cancer Res Ltd Specific binding proteins and use thereof
US20110313230A1 (en) 2001-05-11 2011-12-22 Terrance Grant Johns Specific binding proteins and uses thereof
US20100056762A1 (en) 2001-05-11 2010-03-04 Old Lloyd J Specific binding proteins and uses thereof
US6441163B1 (en) 2001-05-31 2002-08-27 Immunogen, Inc. Methods for preparation of cytotoxic conjugates of maytansinoids and cell binding agents
KR100497719B1 (ko) * 2002-06-17 2005-06-28 대동공업주식회사 트랙터용 전륜증속 절환용 클러치
US6808450B2 (en) * 2002-12-04 2004-10-26 Christopher E. Snow Solar powered heating and ventilation system for vehicle
CA2522700A1 (en) * 2003-04-18 2004-11-04 Cytovia, Inc. Methods of treating diseases responsive to induction of apoptosis and screening assays
US7432088B2 (en) 2003-05-08 2008-10-07 Immunogen Inc. Methods for the production of ansamitocins
MXPA06000176A (es) 2003-12-10 2006-06-27 Millennium Pharm Inc Anticuerpos anti-ccr2 humanizados y sus metodos de uso.
EP1899376A2 (en) 2005-06-16 2008-03-19 The Feinstein Institute for Medical Research Antibodies against hmgb1 and fragments thereof
EP2298815B1 (en) 2005-07-25 2015-03-11 Emergent Product Development Seattle, LLC B-cell reduction using CD37-specific and CD20-specific binding molecules
EA013327B1 (ru) 2005-08-24 2010-04-30 Иммуноджен, Инк. Способ приготовления очищенных конъюгатов лекарственных средств
WO2007146968A2 (en) 2006-06-12 2007-12-21 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Single-chain multivalent binding proteins with effector function
CN104043123B (zh) 2007-01-25 2019-08-13 达娜-法勃肿瘤研究所公司 抗egfr抗体在治疗egfr突变体介导的疾病中的用途
JP5618549B2 (ja) 2007-03-15 2014-11-05 ルードヴィッヒ インスティテュート フォー キャンサーリサーチ リミテッド Ｅｇｆｒ抗体及びｓｒｃ阻害剤を用いる治療方法及び関連製剤
EP2188311B1 (en) 2007-08-14 2016-10-05 Ludwig Institute for Cancer Research Ltd. Monoclonal antibody 175 targeting the egf receptor and derivatives and uses thereof
NZ603059A (en) 2008-04-11 2014-07-25 Emergent Product Dev Seattle Cd37 immunotherapeutic and combination with bifunctional chemotherapeutic thereof
EP3480202A1 (en) 2009-06-03 2019-05-08 ImmunoGen, Inc. Conjugation methods
US20110076232A1 (en) 2009-09-29 2011-03-31 Ludwig Institute For Cancer Research Specific binding proteins and uses thereof
AR084020A1 (es) 2010-11-30 2013-04-17 Genentech Inc Anticuerpos para el receptor de la barrera hematoencefalica de baja afinidad y sus usos
RS58367B1 (sr) 2011-03-29 2019-03-29 Immunogen Inc Priprema konjugata antitela i majtanzinoida jednostepenim postupkom
CN106432506A (zh) * 2011-05-24 2017-02-22 泽恩格尼亚股份有限公司 多价和单价多特异性复合物及其用途
MX359599B (es) 2012-10-04 2018-09-12 Immunogen Inc Uso de una membrana de pvdf para purificar conjugados de agentes de unión celular y agentes citotóxicos.
CA2907181C (en) 2013-03-15 2023-10-17 Viktor Roschke Multivalent and monovalent multispecific complexes and their uses
AR097306A1 (es) * 2013-08-20 2016-03-02 Merck Sharp & Dohme Modulación de la inmunidad tumoral
SG10202002577XA (en) 2015-09-21 2020-04-29 Aptevo Res & Development Llc Cd3 binding polypeptides
CN113811770A (zh) * 2019-05-13 2021-12-17 豪夫迈·罗氏有限公司 抑制干扰的药代动力学免疫测定

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4714681A (en) * 1981-07-01 1987-12-22 The Board Of Reagents, The University Of Texas System Cancer Center Quadroma cells and trioma cells and methods for the production of same
US4474893A (en) * 1981-07-01 1984-10-02 The University of Texas System Cancer Center Recombinant monoclonal antibodies
US4713352A (en) * 1981-08-31 1987-12-15 Sloan-Kettering Institute For Cancer Reseach Monoclonal antibody panel for early diagnosis and therapy of renal carcinoma
US4444878A (en) * 1981-12-21 1984-04-24 Boston Biomedical Research Institute, Inc. Bispecific antibody determinants
CA1213229A (en) * 1982-04-12 1986-10-28 Gary S. David Antibodies having dual specificities, their preparation and uses therefor
US4727021A (en) * 1984-06-01 1988-02-23 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Human monoclonal antibodies to cytokeratin
US4962188A (en) * 1985-12-06 1990-10-09 Cetus Corporation Recombinant ricin toxin A chain conjugates

Also Published As

Publication number Publication date
HU896763D0 (en) 1990-02-28
US5141736A (en) 1992-08-25
DK666389A (da) 1990-06-28
EP0376176A3 (en) 1990-09-05
CA2006408A1 (en) 1990-06-27
KR900009096A (ko) 1990-07-02
EP0376176A2 (en) 1990-07-04
DK666389D0 (da) 1989-12-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HUT53153A (en) Process for producing bispecific monoclonal antibody
US5217713A (en) Cytotoxic bispecific monoclonal antibody, its production and use
CA3093327C (en) Targeted cd73 antibody and antibody-drug conjugate, and preparation method therefor and uses thereof
EP0578774B1 (en) Monoclonal antibodies to stem cell factor receptors
US5028697A (en) Cytotoxic antibody conjugates of hydrazide derivatized methotrexate analogs via simple organic linkers
CA1341082C (en) Method of treating tumor cells by inhibiting growth factor receptor function
US5470571A (en) Method of treating human EGF receptor-expressing gliomas using radiolabeled EGF receptor-specific MAB 425
EP0635030B1 (en) IMMUNOTOXINS DIRECTED AGAINST c-erbB-2 (HER-2/neu) RELATED SURFACE ANTIGENS
EP0637593B1 (en) Bispecific trigger molecules recognizing lymphocyte antigen CD2 and tumor antigens
US4919927A (en) Process for the potentiation of immunotoxins
US5006652A (en) Intermediates for antibody-vinca drug conjugates
EP0505566A1 (en) Biospecific antibody to cancer cell and enzyme with prodrug-activating characteristics
US5144012A (en) Cytotoxic drug conjugates
Sato et al. [6] Derivation and assay of biological effects of monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptors
JPH0641423B2 (ja) 細胞毒性薬剤組成物及び細胞毒性薬剤キット
JPH0246297A (ja) モノクローナル抗体、抗体産生ハイブリドーマおよび抗体の製造法
EP0336405B1 (en) Anti-human cancer protein complexes, their production and use
CN115364238B (zh) 一种阿特珠单抗-mmad结合物及其制备方法与应用
JPH01502195A (ja) 細胞毒性結合物の増強法
IWASA et al. Selective cytotoxicity of drug-monoclonal antibody conjugates against murine bladder tumor cells
US5523085A (en) Monoclonal antibody in destruction of small cell lung carcinoma
JPH0347090A (ja) 二重特異性を有するハイブリッドモノクローナル抗体
JPH04187096A (ja) 二重特異性を有するハイブリッド・モノクローナル抗体
JPH07163392A (ja) ヒト型モノクローナル抗体、該抗体を産生するハイブリドーマ
KR20080113215A (ko) 단일클론 항체 및 이를 코딩하는 유전자, 하이브리도마, 의약 조성물 및 진단 시약

Legal Events

Date Code Title Description
DFC9 Refusal of application