HU227722B1 - Cell surface molecule mediating cell adhesion and signal transmission - Google Patents

Description

(57) Kivonat

A találmány tárgyát emlőseredetű sejtfelületi molekulák, a találmány szerinti molekulákat alkotó polipeptidek és fragmenseik, a találmány szerinti polipeptid-fragmenseket és immunglobulin-fragmenseket tartalmazó fúziós molekulák, a találmány szerinti polipeptideket és fragmenseket kódoló gének, a géneket tartalmazó vektorok, a vektorokat hordozó transzformánsok, a találmány szerinti polipeptidekkel, és a polipeptideket tartalmazó sejtfelületi molekulákkal reaktív antitestek, az antitesteket termelő hibridómák, a találmány szerinti polipeptid-fragmenseket, fúziós polipeptideket és antitesteket tartalmazó gyógyászati készítmények, továbbá transzgenikus egerek, valamint knockout egerek képezik.

A különböző találmány szerinti molekulák és fragmenseik alkalmasak különböző autoimmun betegségek, allergiás betegségek és gyulladásos betegségek kezelésére és/vagy megelőzésére.

A f A i as I'' U v s s eX.Av.<<sC<t.·

Képviselő:

D &ΪΧϋ.Ο X 3.

Szabadalmi és Védjegy Iroda Kft. 2 u. d a p e s t iót és szignál-átvitelt közvetítő sejtfelületi molekula í A találmány tárgya; enlőseredstö sejtfelüietí molekulák; a molekulákat alkotó polipeptídek és fragmenseik; < találmány szerinti polipeptid-fragmenseket és immunglobua gme n s e két t a.r t a 1 ma só iós molekulák; a találmány szerinti poiipeptideket és frsgmensekst kódoló gének; a géneket tartalmazó vektorok; a vektorokat hordozó transzformánsok; a találmány szerinti pciipeptidekfcel, illetve az ilyen poiipeptideket tartalmazó sejtfelületi molekulákkal reaktív antitestek; az antitesteket termelő hibridómák; a találmány szerinti polipeptid-fragmenseket és fúziós- poiipeptideket tartalmazó gyógyászati készítmények; a találmány szerinti antitesteket tartalmazó gyógyászati készítmények; transzgenikus egerek; valamint knockout egerek.

Ak t a sz ámunk; 90530-3661/PÁ

2.

A találmány szerinti sejtfelületi molekulákat alkotó poiipeptidek, ások fragmenseí, illetve a belőlük létrehozott fúziós molekulák, valamint a találmány szerinti antitestek rendkívül előnyösen alkalmazhatók különböző - iímfociták {pl. T-sejtek? aktiválása és az aktivált iimfodtaműködés szabályozásának rendellenességei okozta. - autoimmun betegségek, allergiás betegségek és gyulladásos betegségek (közelebbről, reumaszsrü izületi gyulladás, sclerosis multiplex, autoimmun pajzsmirigy-gyuiladás, allergiás kontaktus-típusú dermatítis, krónikus gyulladásos dermatosis, pl. 11 eben planus, szisztémás erythesxás lupus, inzulinfüggő diabetes mellitus és pikkelysömör) kezelésére vagy megelőzésére alkalmas gyógyszerek hatóanyagaiként.

Az emlősök szervezetében olyan immunreakció-rendsserek működnek, amelyek semlegesítik az élő szervezetet megtámadó kórokozó mikroorganizmusokat (vírusokat, baktériumokat, parazitákat, stb.), illetve idegen testeket (a következőkben mindkettőt antigénnek” nevezzük) . Az egyik íryen rendszer a természetes immunitás, a másik a szerzett immunitás. Az előbbi a rágódták (polimorf sejtmagvú leukocitak, monodták, makrofágok, stb.) által végzett fagedtőzíst, a antigén természetes ”kíliar^íJ“Sej tek (NK-sejtek) által végrehajtott megtámadását, illetve a nem specifikus antigén-felismerést (pl, az antigén komplementek általi opszonif ikálását.) foglalja magában. A szerzett immunítási rendszer az antigén ellen specififást szerzett iimfociták (vagyis aktivált Iimfociták, főleg T- és B-sejtek) által biztosított semlegesítési mechanizmus. Az antigén-soedfi« ♦♦ 1 íásfc szerzett B-sejtek. - antigénre specifikus antitestek termelése révén - megtámadják a sejtek felületén lévő antigént. Az antigén-spécifitást szerzett T-sejtek (aktivált Tsejtek) a heIper^M~7~seitek és a eitotoxikus T-sejtek (cite toxikus límfociták, CTD csoportjába sorolhatók., A halper-T-sejtek a B-sejtek differenciálódását és az antitestek termelődését vezérük, és- - a fagocitákka.l együttműködve elpusztítják az antigént, A eitotoxikus limfociták önmaguk támadják meg a vírussal és egyéb antigénekkel fertőzött sejteket (Experimental Medicina: SU'PPLEMENT, Bio Science

Te na Library, Immunity”, Yodosha, 14-1

ΟI d. · ( X is b !· >

A T-sejtek	antigén-speci fi tás	szerzési foly	amata
(vagyis a T-sejtek	aktiválása) azzal	kezdődik, hogy	X
sejtek felismerik a	z antigénpr.ezentál	ó sejtek (APÓ)	1* *
makrofágok, ©-sejtek vagy dendrit-sejt	ek. - által preze	ntált
antigént. Az antigénprezentáló sejtek	feldolgozzák az	anti -
gént, és azt a fő	dísztokompat ib í1i t	.ssi komplexhez	(MHC j
kötve prezentálják.	a T-aejzsfc az art	iváiás-ukat (azaz	spe-
cifitás-szerzésüket;	beί ndító ρrimer	szignált úgy ka	rn á k. x' ti >
hogy felismerik az	an t í g énpréz ént á1ó	sejtek által -	— rp
sejt-receptor (TőR)	és a CD3-antigén	sajtmembrán-felü	X ό ϋΓ1

képződött komplexe (TcR/CDS-kompiex) közvetítésével - prezentált, feldolgozott antigéneket.

Mindazonáltal, a 7cR/CD3-komplex által közvetített primer szignál önmagában nem elégséges a T-sejtek aktiválásához, és reagáióképtelenséghez. vagy klonális ahergíáho-z vezet, miáltal a sejtek nem. képesek a későbbiekben kapott stimulációkra reagálni. A T-sejtek. aktiválásához, antigénnéhány részlete nem teljesen tisztázott, az eddig végzett specifikus T-s-ejt kiónokká történő differenciálódásukhoz, illetve proliferáció-jukhoz ínterieuk.in-2-re. (IL-2) van szükség. Klónális anergia esetén a T-sejtek - az IL-2fermelődés és a sejtosztódás hiánya miatt ~ ínaktivált állapotban vannak.. A citokínek (pl. TL-2) termelődésével járó •T-sej t-aktíváláshcz a TcR/CD 3-kompi ex közvetítette primer szignált követé második szignálra van. szükség, melyet kost imulá tor szignálnak nevezünk.

E másodlagos szignál átvitele az antigénprezentáló sejteken lévő (MKC-től eltérő) molekulák es a T-sejt felületén lévő (Tc'8/CD3-komplaxtől eltérő) komplex közötti kölcsönhatással (azaz a molekulák kötődése révén bekövetkező sejtadbézióval) valósul meg. Ez a másodlagos szignál akadályozza meg a sejtanergiát (klónális energiát), és aktiválja a sejte re t.

... Bár a másodlagos szignál antigénprezentáló sejtek és limfociták (pl. T-sejtek) közötti átvitele mechanizmusának az edd.

izsgálatok eredményei azt mutatják, hogy a másodlagos

•1 átvitelének lényeges	faktora a CD2S	(más néven
T44 vagy 9,3 antigén;	amely főként T	-sejteken és
-sej teken exprasszálödó	sejtfelületi mól	ap>5 3í ά-ϊ- ssr J * d λ. Z \A'
npr a z a n t á .1 ő s ej t e ken	makro fá-go kon,	monocitákon,
.tes sejteken, stb. - e;	spresszálődé CDS*	3 (más· néven

37-1, 37, 381 vagy 87/8BI) és a szintén antigénprezentáló sejteken expre-sszálédő CD86 (más néven B7-2 vagy 8-70) közötti interakció, vagyis az e molekulák közötti kötődés révén megvalósuló sejtadhézió), Ezen túlmenően, kísérleti úton kiderítették, hogy a cítolitikus T-iímfocitávai asszociált. antigén-4 íCTLA-4) - amelynek expressziója feltételezhetően a másodlagos szignáltól függően fokozódik - CDSQnai (B7-1; és CD86~taI {37-2} bekövetkező kölcsönhatása (vagyis az e molekulák kötődése revén bekövetkező sejtadhéziói szintén fontos szerepet játszik a ϊ-sejtek másodlagos szignál általi aktiválásában. Más szavakkal; a T-sejtaktiválás másodlagos szignál átvitelével bekövetkező szabályozása legalább a CD23 és CDS0/CD8δ közötti kölcsönhatást; a CTLA-4 expressziójának fokozódását (amely vélhetően a kölcsönhatástól függ; ; és a CTLA-4 és a CD80./CDSS közötti kölcsönhatást foglalja magában,

Ismert., hogy a CD28 egy ko-stimuiátor molekula, amely a ϊ-sejtek aktiválásához és az energia elkerüléséhez szükséges másodlagos szignál átvitelére alkalmas. A CD 2 δ antigénprezentálö sejteken lévő kű-stimuiáior molekulákhoz - CSSö-hoz (B7-1) és CDS: 6-hoz (37-2) - történő kötődése (vagyis az e molekulák kötődése révén bekövetkező sejtadhéziös stabilizálja a Thl-típusú citokinek mRNS-ét., és ennek következtében elősegíti a Thl-típusú citokinek (pl. IL-2,

IFNv és TNFa} nagy mennyiségű sejtek a i z a 1 z ;erme.

dósét.	A CTLA-4	axpressziőját a TcR/CD3-	-komp	iex	á	.j. teli köz
vetite	tt primer	szignál indukálja, és a	CD28	és	a	CDSQ kő
tödése	ál t ál ko	zvetitett másodlagos sz	ctt*» £ · Uk c.	x,s		serkenti

Kimutatták, hogy a CTLA-4 ezeket a szignálokat abból a célból fogja fel, hogy kifejthesse T-sejt~funkcict gátló hatását, ami ellentétes a T-sejtek - CD28 által közvetített másodlagos szignál általi aktiválásával.

.... « ♦ * ' _χ φ *'» * ·

A humán C.D28 és CTLA-4 I. típusú glikoproteinak, amelyek molekulatömege 44 kD# illetve 41-43 kD. Kínákét molekula immunglobulln-sserö. domént tartalmas, az immunglobulin .szupercsaláába tartozik# és: sejtadhésiós molekulaként és szignál-átvivő molekulaként funkcionál.

A humán CD28 diszulfid-kötéssei homodimert képez# míg a CTLA-4: monomer alakban létezik. A CD28 és CTLA-4 génje emberben a 2q33-kromoszómakaron.# egérben az IC-karon helyezkedik. el# és négy exont tartalmaz. A formán CD28 és CTLA-4 220# illetve 223 aminosavbóí áll (beleértve a vezető-szekvenciákat) . A két aminosev-szekvencia közötti .homológra 20-30 %-os.

Emberekben és egerekben a CD2S és a CTLA-4 liganduma a CD80 !3?-l) és a CD86 (37-2), bár a CTLA-4 e iigandumokhoz kb. 20-szor akkora affinitással kötődik# mint a CD28. Kimutatták, hogy a különböző állatfajokban konzervált KYPPPY (Ket-Tyr-Pro-Pro-Prö-Tyr) aminosav-szekvencia motívum lényeges szerepet játszik a CD28 és CTLA-4 CD80-hoz történő kötődésében. Beszámoltak arról is, hogy a CD28 stimulálása esetén a FI3-kíná.z (foszfoinozitid-3 kináz; P13K) asszociálódik a CD28 YMNM (Tyr-Met-Asn-Met) szekvenciájával, és a CD2S fontos szerepet játszik az YxxM-struktúra révén megvalósuló intraoellulárís szignál-átvitelben. Leírták továbbá, hogy a CTLA-4 cítoplazmikus régiójában szintén tartalmaz Yxxd-struktúrát# nevezetesen az YVKK (Tyr-VálLys-det; szekvenciát# és - stimulálás után az SYP- ehhez a szekvenciához kapcsolódik.

A CD28 specifikusan a tiraocitikban és a perifériás vér T-sejtjeiben, mig a CTIA-4 specifikusan as aktivált Tsejtokban expresszálódik {Cell Engineering; SWPbSMEFT, nandbook of Adhesioa Möleenle”, Snujunsha, 35-Ia2. old.., 12Ö-13Ó. old. (1894); Experiraentad dedieine: SüPPbEMEMT, Bxo Science Terra Lifersry, Imramnity’-, fodosha, 94-98, old, (1995; 1 ; Experimentai Medicina; SUBPLEMEM? , ^!,Bic Science Terra Library, Intracellular Signal Transduction, Yodosha, 58-53. Old. {1997H Nikon Pinsho 55(8) 2X5 (199?)].

Felismerték, hogy a különféle molekulák, mint pl. a ko-sti.mulátor molekulák (CL28, őbPÖ, CD88, stb.), illetve a CTLA-4 közötti kölcsönbatások -azaz a molekulák egymásbcz: történd kötődése revén megvalösuié sejtadná?lók - jelentő® szerepet játszanak a T-sejt. működés szabályozásában (vagyis a T-sejtek működésének aktiválásában és gátlásában), és ez as ilyen molekulák és bizonyos betegségek közötti összefüggésekre, illetve a betegségek ilyen molekulák funksrőjának szabályozásán alapuló kezelésére irányította az érdeklődést.

Ahogy fentebb leirtűk, annak ellenére, hogy az élő szervezett immunitás! rendszerét a szervezet számára idegen antigének ellen aktiválja,, immunológiai toleranciát is mutat., vágyra,sajátellen nem. inokból megszűnők, az?:_:(:án.tőádkigéiék)'(\éiian:' is immunreakciő a la km 11 ki, és ·. a,_:: f ént .iyél:í)]áböűből:^: me chan i zmu s s z er int autó antzgén-reaktiv T-sejtek indukálódnak, ez immunitás abnormá 1 is stádiarabé kerül, (éb]i különböző sutoimmun betegségek

Más szavakkal; aível a normális szövetekben »»*♦ «·» φ*

alakulnak	ki.
Más	szav
nyiben az	immuí
prezentáló	sej
lekuiákát,	a

amenvhogy fenntartsák immunológiai toleranciájukat, stég akkor is, ha autoaniigén-reaktív T-sejtek vannak jelen. Felvetették annak lehetőségét, hogy az immunrendszer rendellenesége esetén - a ko-stimulátor molekulák abnormális, túlzott mértékű és folyamatos expresszáiődása következtében - több autoantigén-reaktív T-sejt aktiválódik, ami autoimmun béta g s é g e ke t o k o z.

Ebből	kiindulva,	a	ko-stimuiátor szignálok	átvÍtélé-
nek (pl. a	CD 2 8ZCTLA-	4	és δ CD80/CD86 közötti	st ignái-
átvitel) mőc	lös íthsával	sz	ámos kísérletet tettek a	különböző

autoimmun betegségek kezelésére.

Megfigyelték, hogy a. CDST ko-stimuiátor molekula (.a

CD28 és a CTLA-4 liganduma) az autoimmun betegségek (pl. reumaszerű izületi gyulladás, selerosis multiplex, autoimmun pajzsmlrigy-gyűliadás, allergiás kontaktus-típusú dermatitis és krónikus -gyulladásos dsrmatosis, pl. iichan pianus, és pikkelysömör) fészkében lévő antigénprezentálö sejtekben abnormálisán axpresszálődik. S megfigyelésből kiindulva számos kísérletet tettek a különböző autoimmun betegségek CDSO-funkció módosításával történő kezelésére.

A. CDsO-funkoió gátlására különböző megoldásokat javasoltak, például CD80 elleni antitest alkalmazásával végzett eljárásokat, szolubilízáit CT”⁵

52-8-protein alkalmazásával végzett eljárásokat:, illetve szölubílizáit CILA-4-pro te in alkalmazásával végzett eljárásokat. Annak alapján, hogy a CTLA-4 CDSÖ-ra vonatkozó kötési affinitása 20-szorosa vagy még többszöröse a CD28 kötési affinitásának, állatmodeliek alkalmazásával végzett tesztekben és klinikai tesztekben szolubilizált CTLA-4-gyel (közelebbről, a CTLA-4 extracelluláris doyenjéből és a humán IgGI Ec-régiöjából álló fúziós proteinnel ÍCTLA.~4/XgFCí ] végeztek terápiás kísérleteket íNíhon Rinsho 55(6), 215 11997)j.

A következőkben a CTLA-4/igFc autoimmun betegségek ál iatmodall jelben megfigyelt terápiás hatásait foglaljuk nssze.

CN2S/N2S;FI-egérben (amely a humán szisztémás eryfchsmás iupus (SLE) modellje] az autoantitsstek termelődését és a iupus nephritís kialakulását CTLA-4/XgFc - tünetek megjelenése előtti ~ adagolásával gátolták, és a patológiás állapotot a tünetek megjelenése után végzett adagolással enyhítették (Science 125, 1225 (1994)j.

A kísérleti allergiás agy-gerinevelőgyulladás (FAE; a selerosis multiplex állatmodelije) esetében a betegség kialakulását a CTuA~4/XgFc - közvetlenül immunizálás utáni rövid időtartamú adagolásával gátolták [J. Clin. invest 95, 2783 (.1995)1·.

Nem elhizásos cukorbeteg (’’ηοη-obese diabetes”; ITODj egérmodellben - amely az inzulinfüggő diabetes meliitus (IDDMí modellje - a betegség kitörését jelentős mértékben gátolta, ha a két-három hetes nőstény egereknek két héten át CTLA-4/XgFc-t adagoltak (J. Bxo, Med. 181, 1145 (1995;}.

ö

Patkányban a veseglomerulus-alapmembrán immunitás o~ kozta vesegyulladás esetében (Gocdpasture-féle vesegyulladás modelljei CTLA-4/IgFc adagolásával a tünetek javulását értek el [Sur. J. Immunoi. 2j(61, 1249 (1994)]<

DSA/l~egér alkalmazásával a II. típusú kollagén-indukálta izületi gyulladás (CXA) modellben (amely a humán reumaszerű izületi gyulladás áilatmodelljej a betegség kitörését a tesztelt hatóanyag - immunizálással egy időben történő - adagolásával sikerült szuppresszáini, és a kollagén elleni autoantitestek (IgGl és IgG2) termelődését is gátolták [Eur.. J. Immunoi. 26, 2120 (1996)).

A felsorolt kísérletek eredményei nem adtak magyarázatot a ko-stimulátor molekulák és a rokon molekulák közötti kölcsönhatások (vagyis az ilyen molekulák egymáshoz történő kötődése miatt bekövetkező sejtadhéziő) révén megvárósuiö T-sejt-aktiválás mechanizmusára. Ezekben a folyamatokban egyéb,, ismeretien molekulák is szerepet játszhatnak,

A különféle betegségek (pl, a fentebb említett autoimmun betegségek, allergiás betegségek és gyulladásos betegségek) kezelésére vagy megelőzésére akkor fejleszthetők ki hatásos gyógyszerek, ha a Iimfociták (p) tiválási mechanizmusa - amelynek alapja a iimfociták (pl. T-sejtek) aktiválását illetően kulcsfontosságú másodlagos .szignál átvitelében szerepet játszó molekulák közötti kötődés révén megvalósuló sejtadhéziő - ismert, és a mechanizmusban szerepet játszó - a sejtadhézió közvetítésére képes - ismert vagy ismeretlen molekulák azonosítva és karaktertzálva vannak.

II fc». ·. *

Xfc·, ««fc* fc

A találmány szerinti megoldás kidolgozása során célunk volt olyan új sejtfelületi molekulák azonosítása, amelyek funkciója a sejtadhézió és a szignál-átvitel közvetítése, és célul tűztük ki az ilyen molekulák szerkezeti és biológiai jellemzőinek karakter!tálasát ís·. További célunk veit a különböző autoimmun és gyulladásos betegségek újonnan azonosított molekulák (illetve az ilyen molekulák elleni antitestek; alkalmazásával történő - kezelésére vagy megelőzésére alkalmas gyógyszerek létrehozása.

Az ilyen molekulák azonosítása érdekében abból a tényből indultunk ki, hogy a limfociták (pl. T-sejtek; fontos szerepet játszanak az autoimmun és allergiás betegségekben, illetve, hogy a sejtadhézió nélkülözhetetlen a másodlagos (ko~stimuiátor} szignál antigénprezentáió sejtekről limzocltákra történő átvitelében, Olyan sajtfelületi molekulák izolálását és azonosítását terveztük, amelyek specifikusan, a limfocitákoh expresszálódnak, és sej hadháziét közvetitanek.

Állatok limfociták elleni immunizálásával (limfociták felületén expresszálódó sejtfelületi molekulák ellen irányuld) antitesteket termeltettünk, és a kapott monoklonális antitestek alkalmazásával izoláltuk és azonosítottuk a kívánt - sejtadhézíőt közvetítő - sejtfelületi molekulákat. Az alkalmazott eljárásokat a következőkben Írjuk le részletesen.

Egereket először patkányeredetű iimfocíta-sejtvonalakkal immunizáltunk, és különböző monoklonális antitesteket állítottunk elő. A kapott antitesteket ezután az anti12 « * * « « *«ν « Μ » * * * «« ♦ + * « puló áramlási ci törne tri ás vizsgálattal - a JTT génként alkalmazott patkányeredetű iimfooitákkal reagáltakfák, és teszteltük a monokionális antitestek sejtekre kifejtett hatását. Megállapítottuk, hogy az egyik monokionális antitest jelentős mértékben agglutinálta a patkányeredetű limfocita-sejteket (ezt az antitestet JTT-l-antitesfenek neveztük el) . Egy másik monokionális antitestről azt találtuk, hogy nagymértékben gátolta a patkányeredetű iimfocita-sejfcek - JTT-i-antitest által indukált - agglutinálódását (azt a monokionális antitestet JTT--antitestnek neveztük el.},

Mivel a JTT-1 által indukált patkánylimfooita-aggiutinációt az interceliuiárís adhéziós molekula-! {ICAM-1), illetve a limfocita-funkcióval asszociált antigén-1 (L.FA.-1) ~ melyek a legismertebb, sejteken expresszáiódó sejtadhéziós molekulák - elleni antitestek nem gátolják, arra a következtetésre jutottunk, hogy a megfigyelt agglutináoiót ismeretlen adhéziós molekulák segítségével bekövetkező sej tadhézíó okozta.

Ezt követően olyan, sejtfelüietí molekulákat azonosítottunk, izoláltunk és karakter!záltünk, melyeket az említett monokionális antitestek felismertek CJTT-l-antigén és JTT—antigén) ..

Elsőként különböző sejtekben - JTT-1- és JTT—antitest alkalmazásával végzett fluoreszcens antitest-technikán aia- es JTT antigén expressziós mintázatát vizsgáltuk. Mivel mind a

JTT-1-antigén, mind a JTT—antigén jelentős mértékben expresszáródott a - timocifcák. és lépsejtek concenavalin-A ♦ X (ConA) mitogénnel végzett stimulálásáva.l - aktivált limfoblaszt-sejtekbea (aktivált T-límfobiaszt-sejteken, aktivált B-limföblaszt-sejteken, stb,), as egyáltalán no stimulált lépsejtekben (melyeket a leírásban gyakran nyugvó limfocifáknak” nevesünk) expressziét alig figyeltünk meg,. Λ JTT1-, illetve a JTT—antitest által felismert molekulák expressziós mintázata csaknem azonos volt.

A fentebb említett patkányeredetű límfocita-sejfékből előállított, oldható sej.tfelQl.eti molekulák «legyéből - a JTT-l-antitest adszorbenshez történő kötésével előállított affinitás! oszlop alkalmazásává! - JTT-l-antitest által befogott molekulákat (vagyis JTT-1-antigéneket} tisztítottunk. S tisztított JT'T-l-antigének molekulatömegét JTT-Xés JTT—antitest alkalmazásával végzett immunprecipitációvai, illetve SDS-áAGü-analisissel határoztuk meg, Azt találtuk, hogy a JTT-1-, illetve JTT—antitest által precipitáit molekulák azonosak voltak, és mindkét molekula - különböző cukorláncokat tartalmazó - homodímer volt. Ha az 'Nkötött cukorláncok nem hasítódfak le, a molekulákat - nem redukáló feltételek mellett - egy, kb. 47 kD-os molekulaként, redukáló feltételek mellett pedig két, kb, 24 kD-os és kb, 28 kD-os molekulaként azonosítottuk. Ha az N-kötött cukorláncok lehasítödtak, a molekulákat - nem redukáló feltételek mellett - egy, kb. 36 kD-o-s molekulaként, illetve (redukáló feltételek melletti egy., kb, 20 kD-os molekulaként azonosítottuk.

Ezt követően a patkány-thymocifák tisztított JTT-Iantigénnel bevont tálcához történő tapadását vizsgáltuk.

Azt tapasztaltuk, hogy a timociták csak JTT-1-antitest jelenlétében tapadtak a tálcához (azaz a JTT-l-antígénhsz), és ezt az adhéziót a JTT—antitest jelenléte jelentős mértékben gátolta, ami arra utal, hogy a JTT-i-antigén volt a sejtadhézíöt közvetítő sejtfelületi molekula.

Következő lépésként patkányból, emberből és egérből származó JTT-1-antigént kódoló géneket kódoltunk, és vizsgáltuk ezek szerkezetét.

A. teljes hosszúságú patkány JTT-1-antigént kódoló cDNS-t ConA-val stimulált pa t kény 1 épből, származó limfoblasztokből előállított cDNS-könyvtárból - JT?-l-antítest~ tel végrehajtott, 'pann.ing”~el.járá.ssa.l végzett expressziós klónozással - izoláltuk. A cWS nukieotids szekvenciájának (didezoxi-éljárassal végzett) meghatározásával egy teljesen új patkánygént azonosítottunk. A. teljes hosszúságú humán JTT-l-antigént kódoló cDNS-t ConA-val stimulált humán perifériás vér iímfoblasttjaiból előállított cDNS-könyvtárból próbaként a patkány JTT-1-antigént kódoló cDNS alkalmazásával végzett - piakk-hibrldizáciőval izoláltuk. A cDNS nukleotidssekvenoiájának {didezoxi-eljárással végzett) meghatározásával egy teljesen új humán gént azonosítottunk. Hasonlóan, a teljes hosszúságú egér JTT-l-antigént kódoló

X XIXIXQXj a. <á;S S' nukleocDNS-t ConA-val stimulált egériépbol származó j.. tokból előállított 0DN8-könyvtárból izoláltuk, tidszefcveneiáIának didezoxi-eljárással végzett meghatározásával - teljesen új egérgént azonosítottunk. A fenti patkány JTT-i-antigén alternatív spllcing” eredményeként létrejött, teljes hosszúságú változatát kódoló cDNS-t patkány thymoma-sejtvonalból készített cDN5~könyvtárból izoláltuk, és - nukleotidssekvenciájának dídezoxi-aijárással végzett meghatározásával - egy másik, teljesen új patkánygént azonosítottunk..

A JTT-l-antigénről - a humán JTT-l-antlgén izolált cDNS-e által kódolt amínosav-szekvencia hidropátiás görbeanalízisével - megállapítottuk,, hogy olyan transzmembrán protein (sej tfelületi molekula)·, amely szignál szekvenciából, glikozilálási helyiekíet tartalmazó extraceliulárls régióbői, transzmembrán régióból és intraceiluláris régióból áll. Ismert molekulák bevonásával végzett homológra-

kereséssel kimutattuk,	hogy	a patkányból,	emberből	és egér-
bél származó JTT-l-anti	.géné	k egyik ismert	molekulával {ide-
értve a sejtadhéziős	mg le	kúrákat; sem.	mutat n a κ	jelentős
homológját, ami azt jel	.V ·{ . .A. f	hogy ú j onnan f	elismert -	- sejtad-

héziót közvetítő - sejtfeiületi molekulákról van szó.

A humán JTT-i-antigén aminosav-szekvenciáján alapuló motrvumkeresés eredményeként megállapítottuk, hogy a humán JTT-1-antigén strukturális hasonlóságot mutat a limfocitákon {T-se j te ken)· lévő CD28 sejtfelületi molekulával, amely a sejtadhézíőn keresztül megvalósuló T~sejt-aktiváiás szempontjából fontos ko-stimulátor szignál átviteléért felelős. A humán JTT-1-antigén ugyancsak strukturális hasonlóságot mutat - a szintén limfocitákon (T-sej teken) lévő - Cl LA-4 sejtfelületi molekulával, amely a szignállal együttműködve az aktivált limfociták (pl. aktíváit 7-sejteki funkcióit szaoaryoz za,

Ί 6

A strukturális hasonlóságok a következőkben nyilvánulnak meg;

Ι) 20 vagy több aminosav - köztük ciszternák - jelentős mértékben konzerválva van;

2) az extracelluiáris régióban a - ligandumkötő régiéként kulcsfontosságú - Pro-Pro-Pro (PP?) ismétlődő szekvencia konzerválva van;

3) a citoplazmíkus régióban a szignál-átvivő régióként kulcsfontosságú Tyr-Xaa-Xaa-Met (YxxM) szekvencia (Xaa és κ jelentése tetszőleges aminosav) konzerválva van.

As egérkromoszómán az egér JTT-1-antigént kódoló gén ló kusza, az IC 3, amel lokalizációjával (amit fiuoreszcen (FISH; eljárással állapítottunk meg].

Az autoimmun és allergiás betegségek JTT-1-antigén funkciójának szabályozásával történő kezelésének hatékonyságát olyan kísérletekkel vizsgáltuk, melyek során kísérleti allergiás agy-gerinevelőgyuiiadás (EAE) és giomerulusalapmembrán (GBM) vssegyulladás modelljeként szolgáló patkányoknak JTT—antitestet adagoltunk. Az találtuk, hogy mindkét állatmodellben jelentősen mérséklődtek a kóros tünetek, és az autoimmun, illetve allergiás betegségek a JTTl—antigén funkciójának szabályozásával kezelhető.

Megfigyeltük továbbá, hogy a humán JTT-1-antigén elleni mottoklonáiis antitest a hmáa perifériás ver limfocitáit jelentős mértékű prolit«rációra serkentette, és ez a _f azonos az agér-CD28 és egér-C/TLA-4 pontjából kulcsfontosságú primer szignált az antigénprezen♦ «·, táló sejtektől átvevő - Tc.R/CD3~komplexet képező CD3 elleni mono klónál is antitest jelenlétében tovább fokozódott# anl arra utal# hogy a JTT-1-antigén a iimíocitákba történő szignál-átvitelben szerepet játszó sejtfeiúletí molekula..

Ezen túlmenően# sikerült olyan fúziós polípeptidet előállítani, amely a huxaán JTT-l-antígén extracelluláris régióját és humán immunglobulin Fc-régióját tartalmazza. Az ilyen fúziós polipeptid autoimmun betegségek, allergiás betegségek és gyulladásos betegségek - JTT-1-antigén és/vagy Xiganduma funkcióinak szabályozásával történő - kezelésére alkalmas gyógyszerek előállítására alkalmazható.

Ezen túlmenően, előállítottunk elv ranszgenrkus egeret#· amelybe egy másik, állatfajból származó JTT-i-antigént kódoló gén van bejuttatva. A transzgenikus egér a JTT1-antigén részletes funkcióinak vizsgálatára, illetve autoimmun betegségek, allergiás betegségek és gyulladásos betegségek kezelésére szolgáló gyógyszerek kifejlesztésére alkalmazható. Létrehoztunk egy olyan knockout”-egeret is, amelyben az egér JTT-l-antígént kódoló endogén gént inaktiváltuk. Az ilyen knockout^fÍ-agér szintén alkalmas a fenti célokra.

A találmány tárgyát a fentiek szerint izolált és azonosított emlős JTT-l-antígénnel kapcsolatos polipeptidek# gének, antitestek, vektorok, transzformánsok# gyógyászati készítmények, transzgenikus egerek és knockout-egerek képezik. Közelebbről, a találmány megvalósítási módjait a következőkben ismertetjük részletesen, •j &

1. Sejtfeiületi molekulát alkotó polipeptid, melynek jellemzői a következők:

i) « sejtfelületi molekula legalább a thymocitákban és mi tógán-stímulálte limfofolaszt-sejtekben expresszáíódik;

ii) a sejtfeiületi molekulával reaktív .antitest mitogén-stímulálta iimfőbl.aszt-sejtek közötti adhéziöt inw kai / iií) a sejtfelúleti molekulára specifikus antitest CD3 elleni antitest jelenlétében. - a perifériás vér limfocítálnak prolíferációját indukálja;

iv) a sejtfelületi molekula extracellulárís régiójában tartalmaz egy Phe-ísp-Pro-Pro-Pro-Phe rész-szekvenciát;

és

v) a sejtíelüieti molekula citopiazmikus régiójában tartalmaz egy Tyr-Met-Phe-Mefc rész-szekvenciát.

2. Az 1. megvalósítási mód szerinti polipeptid, amely a 2. azonosítószámú amxnossv-székvenciát vagy a 2. azonosítószámú szekvenciában egy vagy több aminosavat érintő szubsztitúciót, deléciót vagy addíciót hordozó aminosav-szekvenci á t tarbaImaz.

3. Az 1. megvalósítási, mód szerinti polipeptid, amelyet ~ az 1. azonosítószámú nukleotidszekvsnciát tartalmazó

DNS-sei s-ztrlnoens feltételek mellett hibridizáiódó· - DNS

4, Az 1. megvalósítási mód szerinti polipeptid, amely a 2. azonositószámú aminosav-s2ekvenciával 6Ό %-os· vagy még nagyobb arányú homológiát mutató aminosav-szekvehciát tartalmaz .

S Φ Μ φ * Φ Φ Φ φ φ > φ φ

V ΦΦ* Φ «

5, Αζ 1-4. megvalósítási módok bármelyike szerinti polipeptid., amely emberből származó sejtfelületi molekulát alkot.

6, Gén, amely az 1-5, megvalósítási módok bármelyike szerinti polipeptídet kódolja,

7, A 6, megvalósítási mód szerinti gén, amely cDNS.

8, A 7. megvalósítási mód szerinti gén, amely az 1. azonosítószámú szekvenciát tartalmazó cDNS.

9, A '7. megvalósítási mód szerinti gén, amely a 3.

zonosi	tőszámú	szekvencia	2 6~625.	nukleotidjainak; a 4.
zonosi	tószámú	szekvencia	35-637,	nukleotidjainak; az 5.
zonosi	tószámú	szekvencia	1-603, n	okleotidjainak vagy a 6.
zonosi	tószámú	szekvencia	35-685, r	iu.kl.eo t i d j ai na k meg f e 1 e lő·

nukleotidszekvenciát tartalmaz.

Iö< Vektor, amely 6-9. megvalósítási módok bármelyike szerinti gént tartalmaz,

11. Transzformáns, amelybe a 10. megvalósítási mód szerinti vektor van bejuttatva.

12. Transzformáns, amely FERM BP-5725 deponálási számon van letétbe helyezve.

13. Polipeptid-fragmens, amely az 1-5. megvalósítási módok bármelyike szerinti polipeptid. extraceiíulárís régióját tartalmazza.

14. A 13, megvalósítási mód szerinti polipeptidfragmens, amely 2, azonosítószámú amínosav-szekveneiát tartalmazó, emberi eredetű polipeptid.

15. Gén, amely 13. vagy 14. megvalósítási mód szerinti polipeptid-fragmenst kódol.

« « φ « X **♦ * · φ«»« »·*·♦ φ * * * **f*

Φ y ΦΦ »» *

16, Homodimer molekula, amely két polipeptid-fragmenst tartalmaz, melyek az 1-5. megvaiösitási módok bármelyike szerinti polipeptid extraceiiuláris régióját tartalmazzák, és· a két fragmens dis sül fid- kötéssel kapcsolódik egymáshoz,

17, A 16. megvalósítási mód szerinti homodimer molekula, amelyben a polipeptid a 2. azonos!tószámü szekvenciát tartalmazd, emberi eredetű polipeptid.

18, Gyógyászati készítmény, amely - gyógyászati szem pontból elfogadható hordozóval együtt - « mód szerinti polípeptid-fragmenst vagy a mód szerinti homodimer molekulát (vagy mindkettőt; tartalmazza,

19, Fúziós polipeptid, amely az 1-5. megvalósítási módok bármelyike szerinti polipeptid extraceiiuláris régióját -és egy humán immunglobulin (lg) nehéz láncának konstans régióját - vagy annak egy részét - tartalmazza,

20, A 19, megvalósítási mód szerinti fúziós polipeptid, amely ímmunglobulin-G (IgG) nehéz láncának konstans régióját - vagy annak egy részét - tartalmazza.

21, A 19, megvalósítási mód szerinti fúziós polipeptid, amely a konstans régió részeként az IgG kapocs i^!fhínge'’; régióját, C2-domémjét és C3-doménjét tartalmazza.

22, A 19-21. megvalósítási módok bármelyike szerinti fúziós polipeptid, amely polípeptleként a 2, azonosítószámú szekvenciát tartalmazó, emberi eredetű polipeptidet tártál4. megvaiösitási ?, megvalósítási *

»»

23. homodimer molekula, amely a 19-22. megvalósítási módok bármelyike szerinti fúziós polipeptídek közül kettőt tartalmaz, melyek disznifíd-kötéssei kapcsolódnak egymáshoz <

24. Homodimer molekula, amely két, 22, megvalósítási mód szerinti fúziós polípeptidet tartalmaz., melyek díszülfid-kötéssel kapcsolódnak egymáshoz.

25. Gyógyászati készítmény, amely 22, megvalósítási mód szerinti poiipeptidat vagy 24. megvalósítási mód szerinti. homodimer molekulát (vagy mindkettőt) , valamint gyógyászati szempontból elfogadható hordozót tartalmaz.

26. A 2S. megvalósítási mód szerinti gyógyászati készítmény, amely autoimmun betegségek vag\ t dl ,-V η S.

ségek kezelésére, illetve az ilyen betegségek tünetei kialakulásának megelőzésére alkalmazható.

27. Antitest vagy fragmense, amely az 1-5. megvalósítási módok bármelyike szerinti polipeptiddel, a 13, vagy 14. megvalósítási mód szerinti pöiipeptid-fragmenssei, vagy az ilyen polípeptidet tartalmazó sejtieiületi molekulával

23. A 27. megvalósítási mőd szerinti (vagy fragmense; , amely monoklonális antitest (vagy annak fragmen.se, .

29. Monoklonális antitest vagy fragmense, amely a 2. azonos!tőszámé aminosav-szekvenciát tartalmazó polípeptiddél, a 14. megvalósítási mód szerinti polípeptid-.tragme.nssei vagy az ilyen polípeptidet tartalmazó, emberi eredetű seitfelületi molekulával reaktív.

··{

30. Monokionáíis antitest vagy fragmense, amely az 15. megvalósítási módok bármelyike szerinti polipeptiddel vagy az ilyen polipeptideket tartalmazó sejtfelhleti molekulával reaktív, és mi bogén-stimulálta limfoblaszt-sejtekre gyakorolt hatása lényegében azonos a EEHM BP-5707' deponálási számon letétbe helyezett hibridóma által termelt monoklonáiis antitest mitogén-stímulálta patkány limfoblasztsejtekre gyakorolt hatásával.

3.1. Monokionáíis antitest vagy fragmemse, amely az 1S. megvalósítási módok bármelyike szerinti polipeptiddel vagy az ilyen polipeptideket tartalmazó sejt.felőleti molekulával reaktív, és mitogén-stímulálta limfoblaszt-sejtekre gyakorolt hatása lényegében azonos a FERM BF-5708 deponálási számon letétbe helyezett hibridemé által termelt monoklonálís antitest mitogén-stímulálta patkány limfoblasztsejtekre gyakorolt hatásával.

32. Gyógyászati készítmény, amely a 23. megvalósítási mód szerinti monokionáíis antitestet vagy fragmensét és gyógyászati szempontból elfogadható hordozót tartalmaz.

33. A 32. megvalósítási mód szerinti gyógyászati készítmény, amely autoimmun betegségek vagy allergiás betegségek kezelésére, illetve az ilyen betegségek tünetei kialakulásának megelőzésére: alkalmazható.

34. Kibridóma, amely a 28-31. megvalósítási módok bármelyike- szerinti monokionáíis antitestet termeli.

35. Transzgenikus egér, amely az 1. megvalósítási mód szerinti polipeptidet kódoló gént hordoz, amely az 1. azonosítószámú szekvenciát tartalmazó emberi eredetű óén vacv

Μ » * a 4. azonosítószámú szekvencia 35-637. nukleotidjálból álló nukTeotidszekvenciát tartalmazó patkányeredetü gén#· amely az egér endogén génjébe vagy Integrálva,

36. Knockout-egér# amelyben az 5. azonosítószámú nukleotídszekvenciát. tartalmazó gén által kódolt aminosavszekvenciát tartalmazó# 1. megvalósítási mód szerinti egérpoiipeptidet kódoló endogén gén inaktíválva van, miáltal a szóban forgó egér-polípeptid nem termelődik.

Ahogy fentebb említettük, a találmány szerinti sejtfelületi molekula (GTT-l-antigén) a sejhadháziéban# a limfocitákra (pl. T-sejtekre) történő szignálátvitelfoen és az aktivált Iimfoeiták működésének szabályozásában játszik szerepet. A következőkben a limfoeita-sejlekről# ssjtaáhéziós molekulákról# valamint az ezek és bizonyos betegségek közötti összefüggésekről rendelkezésre álló általános ismereteket írjuk lé.# ami az e témába tartozó biológiai események megértését szolgálja, s nem jelenti a találmány tárgyának korlátozását.

A Iimfoeiták durván két fajtába sorolhatók; T-sejtek és E-sejtek. A csontvelőben a multípotsns őssejtek iimfoid őssejtekké történő differenciálódása után néhány közülük a véráramba kerülve eléri a csecsemőmirigyet (thymus). A csecsemőmirigyben. differenciálódott és megérett iimfoeiták# a T-sejtek (thymus-ersdstű T-sejtek) ismét a véráramba 'kerülnek# és a keringéssel az egész szervezetbe eljutnak. Az érett T-sejtek felületükön CD3~n.oieküiát hordoznak. A CE3molekula létezése olyan markér# amelynek segítségével meghatározható# hogy az adott sejtek érett T-sejtek-e vagy * « * ♦ » « * « * «·*♦·* * sem. A CS3 meggyőző T-sejt-marker. A T-sejtek ugyanakkor CD4-efc vagy CDS-at is expresssálnak, A T-sejtek közé négyféle változat tartozik; a S~ limfociták antitest-termelésében szerepet játszó segítő P'heiper”; T~sejtek (Th-se.jfek); a -célsejteket közvetlen kötődéssel elpusztító eítotoxikus T-sej tek (Tc-sejtek, CT.L) vagy ”killer''~T~sejtek; a 8limfociták antitest-termelését gátló szuppresszor-T-sejtsk; valamint az effektor-anyagokat (.pl, késleltetett allergiát okozó limfokineket) kiválasztó effektor-T-sejtek.

A 8-sejtek a csontvelőben differenciálódott és megérett limfoid őssejtekből származnak. A S-sejtek antitesttermelő prekurzor-sejtek, mivel megfelelő inger hatására antitesteket termeinek. A B-sejtek felületükön immunglobulinokat tartalmaznak, melyek a sejtekben termelődtek. Ezek az: immunglobulinok antigének receptoraiként szolgálnak. Az érett S-sejtek felületükön igM-et és IgD-t egyaránt tartalmaznak. Ha a 8-sejtek antigén-inger ás a T-sejtekrői jövő szignálok hatására differenciálodnak, fokozódik az IgMtermelődés, és C-termínáiis sejtmembrán-kötő régióik kiválasztást elősegítő módon változnak meg, Megfelelő, inger hatására nemcsak a felületi immunglobulinok változnak IgG-re, IgE-re és IgA-ra, hanem valamennyi, osztályba tartozó Immunglobulin szekretálődik. A 8-sejt felületén lévő immunglobulint gyakran slg-nek. (felületi lg) vagy mlg-nek (membránig) nevezzük. Az ugyanazon 8-sejten lévő immunglobulinok azonos antigénkőto helyet tartalmaznak.

Vannak olyan - nagy granuiáris limfociták' (1GL) vagy null-seítek elnevezésű - limfociták, amelyek nem sorolhatók

*.>· * ·» 1 Jt » 4 '* ♦ * * * I Φ> Α »·♦·.·» *:*♦** * * . Λ « * *·* .♦·* sem a T-sejtek, sem a B-sejtek közé. Ezek a sejtek - antigénes előstlmuláció nélkül ~ képesek elpusztítani a tumorsejteket és a vírussal fertőzött sejteket, ami hasonló a citotoxikus T-sejtek esetében megfigyelhető jelenséghez, így ezek természetes **kllier”-sejteknek (NX-sejbeknek) is nevezhetők.

A fenti T-sejtek közül a CD4--pozitiv T-sejbek - az antigénprezentáló sejtek által prezentált antigénekkel reagálva - különböző eitokineket választanak ki itoKinéz számára receptorokat expresszálnak, méretüket megnövelik, beindítják a sejtosztódást -és proiiferálódnak, Έ sejtszintü reakciókat megelőzően az antigénprezentálö sejteken lévő antigénpeptidek és az MHC XI. osztályú molekulák komplexe a megfelelő T-ssjt antigén-receptorhoz (TCR) kötődik. Ez a kötődés a sejtekben különféle biokémiai változásokat okoz, és a szignál a sejtmagba áttevődve beindítja a specifikus DXS-ek transzkripcióját, s ezáltal a megfelelő proteinek termelődését. Mindezek a folyamatok sejtszintü reakciókat idéznek elő. Például, a vírussal fertőzött sejtek vírusproteineket termelnek, melyeket a citoplármában lévő proteoszórnák peptídekké bontanak le, A peptidek egy része a TÁP-rí keresztül az endoplazma.tlkus retikulumba kerül, a frissen termelődött MHC 1. osztályú molekulákkal stabil komplexet képeznek, és a sejfcfelüietre szállítódnak. A sejtfelüietre került pepiidet specifikusan a CD8-specifikus T-sejtek ismerik fel, de ebben a stádiumban a T-sejtek még nem képesek elpusztítani a fertőzött sejteket.. Az antigénnel reagáló Tsejtek Ιΰ-2-receptort (IL-2X) expresszálnak, az XL-2 hatésára celluláris cítotoxicltásü CTL-limfocitákká differenciálódnak, és a legközelebbi alkalommal, amikor ugyanazzal a peptidantígén/MHC 1. komplexszel találkoznak, elpusztítják célsejtjeiket, A citotoxikus limfoeítákká történő differenciálódáshoz szükséges citokinek közé tartozik az IFlly ás egyéb citokinek, melyek vélhetően hasonló hatásúak. Ilyenformán, a T-sejtek által kiválasztott iimfokinek a citotoxikus llmfocitákká történő differenciálódáshoz szükségek iimfokinak termelődése azon alapul., hogy a CDIsek.

Thl-sejtek (IL-2-C va«v rívasaszto, CP4pozitív 7-sejtek) felismerik az MHC kát hordozó, ugyanazon vírusból származó peptidantigéneket. dohány esetben a CDS-pozitiv T-sejtek a Cb4-pozítív 7sejtek segítsége nélkül ~ reagálnak az antigénekkel (és termelnek Ih-2-t és egyéb citokineket) , Amennyiben a CD8pozítiv T-sejtek citotoxíkus limfoeítákká differenciálódnak, a citopiazmájukban granuiumok kezdenek növekedni. Ezek a granuiumok különféle nagy moiekulatömegű proteineket tartalmaznak, melyek jellemző képviselője a perfórin. A perfórén egy ^!!membrántámadási^!’ komplexre Pmembrans attack eompiex”; .MAC} hasonlít, amely az 5-9. komplement-komponensből áll, és a célsejtek sejtmembránján lyukakat hoz létre, A granuiumok szerin proteázokat, LT~t, proteoglíkánt, stb. is tartalmaznak. Ha a citotoxikus limfoeítákká differenciálódott CDS-pozitiv sejtek antigén-stimulációt kapnak, Iimrökinekat (pl. ΐΕΝγ-t, LT-t, TNE~et vagy lL-2-tí Is szekretálnak. Ezen túlmenően, a T-séjt-k hemagglutininnel (fítohemaggiutinin, PHA) vagy ConA-val reagálva biaszt- 27 φ y *« « Φ > X » ♦ X ♦ ♦ ' < φ * X * > * * * * φφφφ Φ*Χ* * X » * ·»♦»

Φ X- ** X ♦ * átalakulási jellemzőket mutatnak.

Az egyáltalán nem stimulált, érett T-sej:tekét nyugvó T-sejteknek nevezzük.; ezek kisebb méretűek és rövidebb élsttartamüak (néhány napig maradnak életben). Stimuláció felfogása eseten a sejtek metete megnövekszik (ahogy azt fsntebb említettük;, és különféle ah Imolád ókka i történő reakcióra válnak, alkalmassá.. Az ilyen T~sejt eket aktivált T-sejtoknek nevezzük. Az aktivált T~sejtek egy része mernéria-T-sejtekké válik, amelyek - ugyanazon antigén-stimuiussál találkozva - másodlagos írnmunrsskcióf váltanak ki. Úgy véljük, hogy a memória T-sejtek néhány évig vagy évtizedik maradnak fenn a keringésben.

Az egyáltalán nem stimulált 8-sejteket - a T~sej.lekhez hasonlóan - nyugvó B-sejteknek nevezzük,- mig a múl ti valans antigénekkel vagy CD401-antigénnel stimulált, proliferálódö 3-sejtehet aktivált 3-sejtöknek hívjuk. Mivel a nyugvó B-sejteknek nincsenek ko-stímulátor molekulái - amelyek a T-sejbeket a T~sejt-receptorokon (pl. B~-l -CDSO) vagy 37-2 CC.DS6)1 keresztül felfogott szignálok révén serkentik -, a nyugvó T-sejtek számára történő antigén-prezentáláshoz egyszerűen a T-sejt-receptorok stimulálására, valamint erre van szükség, hogy a T-sejtek ne legyenek képesek CD40~iigandvmokac : (CD40Ls szeresszáini vagy iimfokinégyéb7iáhtl:géhirétebtáiÓ'jiS:éj(tsk_:j;á:itá^:i7';prézéht'ál_:'t antigénnel Í(|íbÍlli(tÍl7|ÍllÍéiÍl;|llilllill^l||ékjóÍsÍ|l|ÍljBógiéj(ték7(ál:tái7<7.7i_: prezentált antigénnel reagálnak. Közelebbiül, ha egy antigén behatol, először a B~-molekulákat expresszáló dendrites ff φ

Φ * ♦ ♦ « ♦ X * * sejtek - vagy a mikroorganizmusokkal bekövetkezett reakcióval aktivált makrofágok - prezentálják az antigént és stimulálják a beiper-T-sejteket (ezáltal CD 401 expresszálására aktiválva azokat). Az aktivált helper-T-sejtek ezután az ugyanazon antigént prezentáló nyugvó B-sejtekhe.z kötődnek, és serkentik azok CD40—ét. A muitivalens antigénnel vagy CD4G~licanáumma'i bekövetkezett stimuláció révén aktivált Bsejtek szintén -e-xpres-szálnak BV-molekulákat h,-> 1 persejteket - a felületükön lévő CS2S TCR-rel történő szimulálásával - aktiválják, és lehetővé teszik, hogy a helper-Tsejtek -CD4öL~t expresszáijanak, illetve limfokineket termeljenek. A stimuláció hatására változásokat (p-I. a s-ejfméret növekedését) mutató, de antitestet nem szekretáló Bsejteket aktivált B-s-ejtöknek nevezzük.. Ha az ilyen módon érett B-sejtek antigénekkel találkoznak, a T-sejtektől érkező stimulációval együtt fokozódik az IgM-termelés, és a termelődött IgM-molekulák membránkötött típusúból szekréciós típussá történő átalakulás következtében kiválasztódnak. A B-sejtek a T-se-jfékből érkező humorális faktorok hatására igM-től eltérő izo-tipikus antitesteket, pl. IgG-t termeinek. Ezt a jelenséget ízotIpus-valiásnak vagy osztályváltásnak nevezzük. Az antitesteket kiválasztó B-sejteket anfite-st-szekretáló- sejteknek nevezzük. Ezek bizonyos hányada jellegzetes morfolőgiájű sejtekké alakul, melyeket plazmasejtekn-ek nevezünk (Khowledge of Immunology”, Ohmsha (1996) ].

Az immunrendszer különböző reakcióiban a. fehérvársejt-szubpopulációk (nevezetesen a T-limfociták, B-limfocil-Ctft.# íermészetss killer-sej fcek, neo trofil. gra.nulociták, stb,j gyakran egymástól eltérő dinamikáiúak# sőt# még' az ugyanazon limfocíták is egymástól eltérő dinaxaikájúak lehetnek# attól függően# hogy aktivált vagy nyugvó állapotban vannak-e* Ezek a tények arra engednek következtetni# hogy különféle felismerési mechanizmusok léteznek# amelyek a fehér vér sej t-szubpopul.áciőkra# a sejtek állapotára.# és a sejtadhéziós molekulákra (proteinekre) specifikusak,

A sejtadhéziós molekulák (vagy sejtadhéziós proteinek) általában olyan molekulák.# amelyek a fejlődés és differenciálódás során vagy a sejtek adott helyre történő vándorlása során az egyes sejteket egymáshoz kapcsolják. Az ilyen molekulák az élő szervezetben kialakuló szerves és funkcionális kontaktusok szempontjából kulcsfontosságú szerepet j át s zanak,

A sejtadhéziós molekulák - strukturális jellemzőik alapján - durván öt családba sorolhatók be: immunglobulin szupercsalád# integrín család# szeiektin család# kadherin család és CD44 család. Az immunglobulin szupercsaládba tartozó adhéziós molekulákra a díszuifid-kötésekkel létrejött ismétlődő# hurokszerű dóménak jellemzők. Az ilyen molekulák jellemző példái az interceilulárís adhéziós molekula-ΐ (1CAM-1:) és az érfalssjt adhéziós molekula-ΐ (ICÁM) . Az zsaiádba tartozó adhéziós molekulákra α/β héterőι η τ- λ .··*! r* ;

dimer szerkezet jellemző; az ilyen molekulák néIdái a nagyon késéi antigén-i

-o , .-Ό r*very xate antigén? m1# -2# a limíccítafunkciöval asszociált antigén-!

(LFA-1)₍ az Hac-1 és a plSO/SO, A szeiektin családba tartó-

zó molekulák - az N-terminúlistól számítva, sorrendben lektinszerű dóménfc, EGF-szerü domént és komplement-domént tartalmaznak. Szék példái az S-szelektin és a P-szelektín. A kadherin családba tartozó molekulák példáiként az Ekadherin, N-kadherin és P-kadherin említhető, míg a CD44 család jellemző tagja a CD44.

Ismeretes, hogy az ilyen adhéziós molekulák specifikus funkciója a fehérvérsejtek érfali belhámsejtekhez vagy a limfociták antigénprezentáló sejtekhez történő kapcsolása, Az utóbbi években végzett kísérletek eredményei arra utalnak, hogy as adhéziós molekulák nemcsak a sejtek adhésiójában, hanem különféle, betegségek kialakulásában is szerepet játszanak.

As adhéziós molekulákkal kapcsolatos betegségekről és azok expresszíós rendellenességeiről számos cikkben beszámoltak. Például, a reaumaszerű ízületi gyulladás (rheumatoid arthritis; HA) esetében a. Mac-ϊ és P150./90 expresszíó-ja az HA-synoviocitákbah fokozódott (Allén és mtsai.: Arthritis Rheum. 32, 247 (1939)1. Leírták továbbá, hogy HA ízületi hártyán különböző sejtek nagy mennyiségben és ektópiásan ICAM-l-et expresszóltak (Halé és mtsai,: Arthritis Rheum. 32, 22 (1989)J. Másutt azt írták, hogy az SLAM-1 is szerepet játszik a n.eufcrofil granulociták ér fali belhámsej tekhez történő tapadásában, és az ilyen molekulák túlzott mennyiségben történő expressziója elősegítette a neutrofíl. granulociták (elsősorban izületi folyadékba történő) beszűrődését, ami a reumászerü arthritíses ízületi folyadékban megfigyelhető- (Laffon és mtsai.: Arthritis

Rheum. 32, 336 (1989)) , leírták, hogy a CD44 nagy mennyiségben expresszálödik az érfali helhámsejtekben és az RA ízületi hártyán lévő A~tipusú synovíoeitákon [Heynes és mtsai.:; Arthritis Rheum, 34, 1434 (1991)1,

Az adhéziós molekulák expressziojának rendellenességei és a szisztémás erythemás lupus összefüggéséről is beszámoltak, Például, a T-limfociták tenyészetben lévő érfalí belhámsejbekhez történő adhéziósának képessege szisztémás erythemás lupusban szenvedő páciensekben - egészséges önkéntesekben megfigyelhetőhöz képest - csökkent [Haskard és mtsai.: Rheumatol. Int. 9, 33 (1989)1.

Leírták, hogy autoimmun pajzsmirigy-betegségek esetében az ICAM-l akkor expresszálódott, ha a pajzsmirígy tüszősejtjei v-inzerfáronnál, interleukin-I-gysi és tumornskrőzis-faktorral voltak stimulálva, továbbá, a tüszösejtek és az egymagvú sejtek kiasztérképzi gátolta (Wsetman és .mtsai,: Eur (1990)j.

Ögy véljük, hogy fertőző máj tociták és a gyulladásos sejtek összetapadásának esélye nő, mivel két adhéziós reakcióút áll rendelkezésre (ICÁM LEA-1, illetve LEA-l és CD2), melyek elősegítik az antigének prezentálását és a gyulladásos sejtek aktiválását. Hepatitis-S esetén az LFA-3-molekulák nagy mennyiségben expresszálódnak azokban a hepatocítá.kban, melyekben a vírusok aktívan osztódnak, és az ICAM-I mennyisége arányos a hepatitis súlyosságával, Ebből arra következtethetünk, hogy az LFA-3 szerepet játszik a vírusok semlegesítésében, az ICÁM-

;ét	anti-	... *i· X ü*	ciiiL
V	Immunoi,	π
yui	j. adás	esetén	a

*♦ * pedig serkenti a T-sejtek antigénprezentálását, és szabályozza a gyulladási reakciót. Az ICAM-1-negatív és HBcantigén-pozitív hepatocitákban a krónikus· vírusfertőzés {amely az immunérzéketlenség -egyik fajtája) a límfociták és a hepatociták kölcsönhatása revén alakulhat ki. Beszámoltak arról is, hogy krónikus májbefegség esetén a vérszérumICAM-1 mennyisége összefüggést mutat a hepatociták károsodásának mértékével, mivel akut májgyulladásban, krónikus aktív máj gyulladásban és májcírrhosisban szenvedő pácienseknél a vérszérum-ICÁM-I koncentrációja nagyobb volt, mint az egészséges önkéntesek, illetve a krónikus perzisztáló hepatitisben szenvedő páciensek esetében, és a koncentráció a szövettanilag előrehaladó, aktív hepatitíses páciensek esetében magas volt (Mód. Phys. 15(1), 73 (1995)) .

As ártérioscierosis állatmodelIgében a betegség kialakulásának nagyon korai stádiumában a monoéiták és limfociták érfali belhámsejtekhes történő vándorlását és tapadását figyeltük meg, amiből arra következtethetünk, hogy a monociták és iimfocíták belhámsejtekkel létrejött kölcsönhatása az arteríosclerosis kialakulásának első lépése. Az adhéziós molekulák valódi arteríosclerosísos gócokban megfigyelhető expressziéját több esetben is leírták, igy péiexpresszióját (Festőn és mtsaí.: Am. J. Pétből. 140, 665 {1992) 1 és a VCAM-l hiperkolesztaroismiás nyula.k arterioscierosisos gócában bekövetkező -éxpresszióját. (Cybuls-ky és Gimbrone: Science 251, 788 (1881)]. Az utóbbi években leírták, hogy humán arteriosclerosiso-s gócban - közelebbről, az érbe! hártyához {intim.} vándorló símai zoaassj lekben és a monocitákban és makrofagokfcan - a VCAM-i jelentős mértékű expressziéja volt megfigyelhető. Ezenfelül, nyulak és emberek arteriosclerosisos gócaiban az MCP-i expressziója is fokozott mértékű volt, ami arra utal, hogy az MCP-1 - a monociták/makrofágok migrációja révén. - serkenti az arteríosclerosísos gócképződést' [Current Therspy 12(8; , 1485

Beszámoltak a tumorok metasztázisa és az adhéziós molekulákkal kapcsolatos rendellenességek közötti összefüggésekről is. Például, a csökkent mennyiségű E-kaoherint tar-

taima	zó ráksejtek	átterjedő
V i <. ,	ezt azonban gá	í** rj 1Ηλ	&
do ló	cDMS-t juttatts	be, s	az

állt, ha a sejtekhez E-kadheriu antiszérumot adtak. Ez az E-kadherin expressziójának csökkenése és a tumorsejtek átterjedő képessége közötti szoros összefüggésre utal [Eríxen és mtsai.; 113, 1?3 (1991)}. Valódi klinikai esetekben as E-kadherín-expressziő csökkenése és a metssztázis közötti összefüggést különböző rákfajták (igy pi. hepatorna, nyalócsőrák, gyomorrák és emlőrák) esetében sikerült kimutatni. Leírták, hogy a VLA-4-moiekuiák (melyek a VCAM-i iigandumai) metasztásisos melanoma, gyomorrák és emlőrák esetében, nagy mennyiségben expresszálódtak, ami arra utal, hogy ez a molekula felhasználható a metasztázisokban lévő érfali belhámsejtekbe történő implantációra. A különféle tumotsejt-vonalakkai végzett kísérletek eredményei alapján megállapították, hogy a hámszövetes ráksejtek (pi. gyomorrák-, »» « » * A · X * « χ 44n 4 * * * ♦ * * * * ♦. * * vastagbélrák-, tüdőrák-, hepatoma- vagy hasnyáimirigyráksejtek), tapadnak beihámsejte-khez S-szelektinen keresztül (Takada és mtsai. Cancer Rés. 53, 354 (1993)·].

Az ilyen betegségek adhéziós molekulák megcélzásával történő kezelésére számos kísérletet végeztek. Például, leírták, hogy autoimmun arthritises patkánymodeliben. a patkány-lCAM-l elleni antitest jelentős mértékben gátolta a gyulladási reakciót. Beszámoltak arról is, hogy a reumaszerű ízületi gyulladás egyik állatmodellgében az I'CAM-1 elleni antitest adagolása az adjuváns synovitis esetében gátolta az ízületi gyulladás kialakulását [Nihcn Rínsho Meneki Gakkaí Kaíshi 14(6) , 571 {1391}j, Leírták továbbá, hogy beoltott tumor metasztázis-képzését jelentős mértékben gátolta, ha epehólyag-rákos egérnek nagy mennyiségben olyan pepiidet adagoltak, amely REG-szekvenciát (bizonyos integrinek által felismert és megkötött extracelluláris közeg proteinre jellemző aminosav-szekvencíái tartalmaz; és In vitro rendszerben az RGD-peptídek és a βί-alegység elleni antitestek gátolták a tumorsejtek migrációját és beszűrődését (Yamada és mtsai. ·: Cancer Rés . Sö, 4435 (1990) (.

A következőkben a találmány leírásában alkalmazott

kifej ezése)	t jelentését, valamint a	találmány szer	inti poli
peptídek, (	'úziós polipeptídek/ gén	ek, antitestek,	transzge
ni kas ege rí	ík és '’knookoutí,-egerek	előállításának	és létre

hozásának általános eljárásait írjuk le. Szükségtelen megjegyeznünk, hogy az egyes kifejezések általunk megadott definíciói semmilyen szempontból nem. jelentik e kifejezések jelentés éne k ko r 1 á tozását

Ο Λ ·£· λ. Τα X* ϊ'? · »* X *Φ * X ♦ *

Χφ *

a mitogén	{mito
dukáló anyagot jele.
límfociták	polikló
at indukáló	anyag.
. es PWM.! ,· a	concana
sztreptoiiz	és
tea, hogy a	concana'
. a lipopolíszacnari
mind a I-,	mint a

V *«« *««+ ♦ 4 4 » ··*»♦ « Φ «-* »« * ry a leírásban használjuk, a mitcgén .«Avw* , kifejezés sejtoaztódást Immunológiai szempontból a mitogé: lis blasztogenezísét és sejtosztódást ilyen anyagok példái a lektinek (PHA és PWM) lin-A (Cc-nAi, lipopolisza.ch.aridol limfociták elleni antitestek. Isme lin-A és a PHA csak a T-limfociták csak a B-límfocitákra, a P8M ped. limfo-citákra hat.

A találmány leírásában a limfoblaszt-sejt” (másképpen. nagy limfocita, iimfoblaszf vagy immunoblaszt} kifejezésen a nyirokézövetekben (nyirokcsomókban, lépben, csecsemőmirigyben, csontvelőben, nyirokvezetékekben, mandulában, stb.) és a vérben található, nagyméretű limfocitákat értünk.

Ahogy a leírásban használjuk, az aktivált limfocita” .kifejezésen, például,· egy fentebb említett - valamilyen stimulációval aktivált - limfocitát értünk, de e kifejezés jelentése nem korlátozódik csupán a fentebb felsoroltakra. Ahogy korábban említettük, a .límfociták T-sejtekre, Bsejlekre és természetes kilier-sejtekre oszthatók fel. A Tsejtsk lehetnek CE»4-pozitív sejtek és €D8~pozítiv sejtek. Ennek megfelelően, a találmány leíráséban az aktivált l.imfociták” köré főként aktivált T-sejtek, aktíváit B-sejtek és aktíváit természetes killer-sejtek, .míg az aktivált T~ sejtek közé aktivált CD 4-pozitív sejtek és aktivált CDSpo

Γ 1 V sejtek tartó znak.

•ί

Az antigénprezentáló sejtek által prezentált antigénnekfcel reagálva a CD4-pozit.lv T-sejtek különféle citokinekst választanak ki, e citokinek számára receptorokat expresszálnak, a sejtek mérete megnő, sejtosztódás indul be, proliferáló-dnak és aktiválódnak. Az ilyen állapotba került sejtek az aktivált CD4-pozitiv T-sejtek közé tartósriak v

A CDS-pozitív T-sejtek antigénekkel reagálva IL-2R-t expresszálnak. Ha az IL-2 kölcsönhatásba lép az IL-2R-rel, a sejtek citotoxikus· T-limfocitákká (GTL) differenciálódnak, melyek cellulá.ris citotoxicitásúak. Ha a citotoxikus T-limfociták azonos peptidantigén/MHG X. osztályú antigén komplexszel találkoznak, célsejtjeiket elpusztítják. Ha a CDS-pozitív T-sejtek citotoxikus T-iiisfocítákká differenciálódnak, citoplazmájukban granulumok nőnek, melyek különböző, . nagy molekula tömegű proteineket tartalmaznak, melyek jellemző példája a perforín. A perforin egy membrántámadási komplexre (MAC) hasonl.it, amely az 5-9. komplementkomponensből áll, és a célsejtek sejtmembránján lyukakat hoz létre. A granulumok. szerín proteázokst, LT-t és proteoglikánt Is tartalmaznak.. Ha a citotoxikus limfócitákká differenciálódott CDS-pozitív sejtek antigén-stimulációt kapnak, limfokineket (pl. ΧΗίγ-t, LT-t, TNF-et vagy IL-2-t) is szekrstálnak. Az ilyen állapotba került CD8-pozitív T~ sejtek az aktivált CD8-pozitiv T-sejtek közé tartoznak..

A T-sejtek hemagglutininnel (fitohemagglutinin, PHA): vagy coneanaval.in-A-va! (ConA; reagálva blaszt-képzcdési jellemzőket mutatnak. Az ilyen állaootban lévő T-seiteket . X 00 *»*<

‘·ί nevezzük aktivált T-sejteknek.

A B-sejfcek B-7 -molekulákat expresszainak, a he iper-Tsejteker a felületükön lévő CD28 T-sejb-receptorral í?CR) történő stimulálásávai aktiválják, miáltal azok CD40-ligandumot (CD40L) expresszálnak, illetve iimfokineket termelnek. Stimuláció hatására a sejtek mérete megnő és proliferálódni kezdenek. Az ilyen állapotban lévő sejtek az. aktíváit Β-sejtek közé tartoznak. A találmány szerinti megoldás értelmében az aktivált 3-sejtek közé tartoznak az antitesteket kiválasztó B-sejtek (antitest-szekretáló sejtek és plazmasejtek) is.

A leírásban az *aktivált limfoblaszt-sejt kifejezésen olyan aktivált limfoblasztot értünk, amely akkor képződik, ha egy fentebb említett límfoblasztot egy fentebb említett mítogénnel” (pl. ConA-val) stimulálunk.

Ahogy a leírásban használjuk, a nyugvó iímfocita kifejezésen, néhány esetben, olyan nem aktivált límfocitát értünk, amely nem kapott a sejtek aktiválásához szükséges stimulációt (szemben a fentebb említett, aktivált limfooifákkal) .

A találmány szerinti gén genomi DNS és cDNS egyaránt lehet.

A találmány szerinti emberi eredetű” anyag kifejezésen olyan természetes anyagot értünk, amely emberi szervezetből (szervből, szövetből, sejtből, testfolyadékbél, stb.} van izolálva, illetve, amely rekombináns DNS-tschnikával van előállítva. Amennyiben proteinről vagy polipeptidről van szó, a emberi eredetű anyag magában foglal :,” ϊ

99 0 0

Φ Φ * Φ * » * as olyan proteineket és polipeptideket is, amelyek amino·sav-szekvenciájában egy vagy több aminosavat érintő szubsztitúció, deiéció vagy addéció található.

A találmány szerinti sejtfeiületi molekula” emlős állatból (emberből, patkányból, egérből, tengerimalacból és nyűiből, előnyösen emberből, patkányból vagy egérből, még előnyösebben emberből) származó sejtfelületi molekula.

A találmány szerinti sejtfeiületi molekula legalább következő tulajdonságokkal bír:

a sejtfeiületi molekula legalább a thymociiákban és mitogén-stimulálta limfoblaszt-sejtekben expresszálódík;

ii) a sejtfeiületi molekulával reaktív antitest mitogén-stimulálta limfoblaszt-sajtek közötti adhéziót inouka1, iií) a sejtfeiületi. molekulára specifikus antitest CDS.elleni antitest jelenlétében - a perifériás vér iimfocltáínak pro!iterációját indukálja;

ív) a sejtfeiületi molekula extraceliuláris régiójában tartalmaz egy Phe-Asp-Pto-Pro-Prc-Phe rész-szekvenciát;

SS

v) a sejtfeiületi molekula citoplazmikus régiójában tartalmaz egy 'Tyr-Met-Dhe-Met rész-szekvenciát.

A sejtfeiületi molekula előnyösen a kővetkező, találmány szerinti polípeptidek valamelyikét tartalmazza,

A találmány szerinti polipeptid” olyan polipeptid, amely a találmány szerinti “sejtfeiületi molekulát” ja. Az ilyen polípeptidek példái a következők:

alkot39

Φ* X

Φ * ♦ ♦ φ > φ * *> * *** * (1) Polipeptid, amelyet - as 1, azonosítószámú nukleotidszekvenciát tartalmazd DNS-sei sztringens feltételek mellett hi.brídizálódó - DNS kódol.

(2) Polipeptid, amely a 2. azonosítószámú aminosavszekvenciával Sö %-os vagy még nagyobb arányú homológját mutató aminosav-szekvenoiát tartalmaz, (3) Polipeptid, amely 2. azonosítószámú aminosavszekvenciát vagy azzal lényegében azonos amiaosav-szekvenciát tartalmaz (közelebbről, a humán JTT-l-antigént alkotó .peptid vagy annak származéka}.

(4) Polipeptid, amely a 3. azonosítószámú szekvencia kódolt aminosav-szekvenciát vagy azzal lényegében azonos aminosav-szekvenciát tartalmaz (közelebbről, a humán JTT-lantigént alkotó polipeptid vagy származéka}.

(5} Polipeptid, amely a 4. azonosítószámú szekvencia 35-637. nukieotidjainak megfeleld nukleotidszekvencia által kódolt aminosav-szekvenciát vagy azzal lényegében azonos aminosav-szekvenciát tartalmaz (közelebbről, a patkány JTTl-antigént alkotó polipeptid vagy származéka.) , (6) Polipeptid, amely az 5. azónositószámú szekvencia 1-603. nukleotid fainak megfelelő: nuklsotidszekvencia által kódolt aminosav-szekvenciát vagy azzal lényegében azonos aminosav-szekvenciát tartalmaz (közelebbről, az egér JTT-lantigént alkotó polipeptid vagy származéka).

(7) Polipeptid, amely a 6. azonosítószámú szekvencia 35-6SS. nukieotidjainak megfelelő nuklectidszekvencia által kódolt aminosav-szekvenciát vagy azzal lényegében azonos κ* « '♦r aminosav-szekvenciát tartalmaz (közelebbről, a mutáns patkány JTT-l-antigént alkotó poiipeptid vagy származéka).

(8) Poiipeptid, amely a találmány szerinti sejtfelületi molekulát alkotó polípeptidet .kódoló DNS által kódolt aminosav-szekvenciát (vagy azzal lényegében azonos aminosav-szekvenciát) tartalmaz., mely DNS a FEFM 8/-5725 deponálási számon letétbe helyezett transzformánsba van bejuttatva (közelebbről, a humán JTT-l-antigént alkotó poiipeptid vagy származéka).

A ”sztringens feltételek” példáiként a következők említhetők. Amennyiben a hibridizációhoz SO vagy több nukieotídot tartalmazó próbát alkalmazunk, és a hibridizáltatást 0,9 %-os NaCl-oldatban végezzük, a standard hőmérsékletet (?m, amelynél 50 %-os disszociáció- következik be) a következő képlet alkalmazásával számítható ki, és a hibridizációs hőmérséklet a következő képlet szerint, határozható meg: To = 32,3: ^cC r 0,41 X. (GtC) % - 500/n - 0, (n - a utóba nukleotidiaínak száma;.

x (formamid) %

Hőmérséklet - Tm - 25 °C.

Amennyiben a próba löö vagy több nukleotid tartalmaz iSa-C - 40-50 %), a Tm a következő megfontolásokat kell figyelembe venni:

(1) A Tm érték 1 %-os mismatch”-aránv változásonként

kb. 1 ’C-kal	csökken.
{2.) A	lm érték 1 ί-	OS	formamid·
sónként kb.	Ο, 6-0/7 °c-kal	c	sokkén.
Ennek	megfelelően,	3.	teljesen

hibridizáltatása esetén a hibridizációs hőmérséklet a kő41 vetkezők szerint állítható· be;

(A) 65-75 °C (formamid. hozzáadása nélkül);

(Ss 35-45 °C <SQ % formamid jelenlétében).

A nem teljeses komplementer szálak hibrid!záltatása esetés a hibridizációs hőmérséklet a következők szerint választható meg:

(A) 45-55 °C (formamid hozzáadása nélküli;

(Sj 35-42 °C (30 % formamid jelenlétében).

Amer	íny íben 2 ~
próbát al	halmazunk,
állítható	be, vagy
kí :

let szerint számítható

Hibridizációs hőmérséklet - 2 °C χ. (A+T száma) e 4 ^cC x .(C+G száma) - 5 ^SC

A lényegében azonos aminosav-szekvencíát tartalmazó kifejezésen azt értjük, hogy a kérdéses polipeptid olyan aminosav-szekveneiát tartalmaz, amelyben - a szekvencialistában bemutatott aminosav-szekvencíához képest - több (előnyösen 1-10, különösen előnyösen 1-5} aminosav szubsztituálva, deietáiva és/vagy módosítva van, illetve, hogy a kérdéses polipeptid olyan, aminosav-szekveneiát tartalmaz, amelyhez - a szekvencialístában bemutatott aminosav-szekvenciához képest - több (előnyösen 1-10, különösen előnyösen 1-5) aminosav hozzá van adva, feltéve, hogy a kérdéses polipeptid lényegében azonos biológiai tulajdonságú, mint a s z e kvéne1 alístában b emut a t. o 1t -ami no s a v- sze k ve n c í á t tartalma zó po11pept id.

Az aminosavak szubsztitúciója, deléciója, illetve inszerelőja szokványos eljárással hajtható végre [id. pl. Experimental Medicina: SüPPLEMENT, Handbook of Genetic Engineering (1992)],

Az ilyen eljárások példái a szintetikus ollgonukieotid alkalmazásával végzett mutagenezís (hézagos duplex” eljárás); a pontmutagenezíses eljárás, amelynek során vei et rens zerú

'it- vagy s zul fit·	-reagens alkalmazásával	— vei
.mutációt hozunk	létre; Bai31~enzim vagy	haso:
isáv&l végzett	deiéciős mutagenesis;	xaz
:zís; ” I.inker~sea.	nníng” eljárás; hiba-b	«épít;

;ás; hibás bázispárosodású láncindító alkalmazásával végzett eljárás; DNS-szak&sz szintetizálást ns: sto.

A szintetikus olígonukleotid alkalmazásával végzett mntagenezis (^whézagos duplex^w eljárás?, például, a következők; szerint hajtható végre. A mutagenizální kívánt régiót amber”-mutációt hordozó M13-fágvektorba klónozzuk, miáltal egyszálú fág-DNS-t állítunk elő. Ezt követően az - axaber”mutáció nélküli - Ml3-vektor EF-I-DNS-ét restrikciós enzimes kezeléssel línearizáljuk, a kapott DNS-t az előző lépésben kapott egyszálú fág-DNS-sei elegyítjük, denaturáljuk és hibrídizáltatjuk, miáltal hézagos duplex DNS-t kapunk. A hézagos duplex DNS-sel olyan szintetikus oiigonukleotidot hibrid!zárhatunk, amelybe mutációkat juttattunk be, majd DNS-poIimerázzal és DNS-iigázzai végzett reakciókkal gyűrűvé zárt, kettős szálú DNS-t állítunk elő, s azzal olyan E. coli mutS-sejteket transzfaktáinak, amelyekben a hibás bazisnárcsodást kijavító (“’mismatch reoair) mechanizmus hibás.. A szuppresszor-aktivítás nélküli £. coli sejteket a kifejlődött fág-okkal. fertőzzük, és csak az ember-mutáció nélküli fégőket szkríneljük.

A nítrit-reagers alkalmazásával pontmntáciö bevitelére alkalmas eljárást, például, a következő aiapelv szerint hajthatjuk végre. Ha a DNS-t nitrittál kezeljük, a bázisok dezamináló-dnak, miáltal az adeninböl. hipoxanthin, a citoz ínból uracil, a gnaninből xéniáin lesz. Ha sejtekbe de zárainál t DNS-t juttatunk be, a A:T és G:C bázíspárokat G;C, illetve A:T báxíspárok helyettesítik, mivel a DNS-repiikáelő során a hipoxanthin, az uracíi és a xanthin - sorrendben - citozinnal, adeninnel, illetve tlrainnel párosodik. A nitrífteí kezelt, egyszáiú DNS-fragraenseket hézagos duplex” DNS-sel hibridízáitatjuk, majd a mutáns törzseket a szintetikus olígonukleotidon alapuló (hézagos duplex) mutagenezises eljárásnál Isirt módon végzett manipulációval különítjük el.

A leírásban és az ábrákon az aminosavakat a három-, illetve egy betűs kóddal jelöljük. Szék jelentése a következő: Giy/G - glicin; Ala/A. - alanin; Ve valin? Len/ leucin; Ile/l - izoleucín; Ser/S - szerin; Thr/? - trí nin; Asp/D - as.zparagin.sav;

g lutamx n sa v; Asnz h iszparagin; Gín/Q - gint amin; Lys/K - iizin; Arg/R nin; Cys/C ciszteín; Met/M - metionin; ?he/F - fe.ni.lslatirosin; Trp/W - tríptofán; His/H - hisztidin;

D.:Tol.

A fentebb említett, találmány szerinti sejtfelületi molekulát” alkotó “polipeptid” transzmembrán protein, amely « ♦ *·* átnyúlik a sejtmembránon, A. sejtf.elületí molekula egy vagy két ilyen fcranszmembrán polípeptidhől áll.

A ”fcranszmembrán protein” olyan protein, amely a membrán lipíd-kettősrétegén egy vagy több helyen átnyúló hidrofőb peptidrégiőval kapcsolódik a membránhoz, és amely egészében három fő régióból (extraceilulárls, transzmembrán és citopla.zmik.us .régióból) áll·, ahogy az számos receptor és sejtfelületi molekula esetében megfigyelhető. Az ilyen transz-membrán protein, a receptorokban vagy sejtfaluiét! molekulákban monomer, homodimer, heterodimer vagy - azonos vagy eltérő aminosav-s-sekvenciájű Iánco(ka)t tartalmazó oligomer - alakjában, van jelen,

A. találmány szerinti, polipeptid-fragmens” a fentebb említett, találmány szerinti polipeptid fragmense, előnyösen annak extraceilulárls régiója. Kívánt esetben e régió N- és/vagy C-terminálisához 1-5 aminosav kapcsolható.

Az 'extraceilulárls régió” kifejezésen a fentebb említett 'transzmembrán protein, teljes szerkezetéből származó részleges struktúra (részleges régió) egészét vagy részét értjük, amely részleges struktúra a sejtmembránon kívül helyezkedik el. Más szavakkal, az extraceilulárls régió a transzmembrán protein - membránba foglalt régió (transzmembrán régió) és az azt követő·, citoplazmába nyúló régió (eitopiazmikns régió) nélküli - régiójának egészét vagy részét jelenti.

Ahogy a leírásban használjuk., a “humán immunglobulin (lg) nehéz lánc konstans régiója vagy annak része” kifejezésen a emberi eredetű immunglobulin nehéz lánca íH-lánc) w* ♦

- két homológ könnyű lánc lánc (H-láncok) - kapcsoló konstans régióját vagy Fő-régióját (vagy azok egy részét; értjük. Az immunglobulin bármilyen osztályba és alosztályba tartozó immunglobulin lehet. Az immunglobulinok jellemző példái az IgG (IgGl, IgG2,· IgC3 és IgG4), IgM, IgA (IgAl és IgA2), IgS és Ig£. Az immunglobulin előnyösen IgG (IgGl, IgG2, lgG3 vagy IgG4) vagy IgM. A találmány szerinti, különösen előnyös immunglobulinok közé tartoznak a emberi eredetű IgG—t (igGÍ, !gG2,· IgG3 vagy IgG4) .

Az immunglobulin Y-aiakü szerkezeti egység, amelyben diszulfid-kötésekkel négy lánc (L-Iáncokt és két homológ nehéz dík egymáshoz. A könnyű lánc a könnyű lánc variábilis régióból (Vb) és a könnyű lánc konstans régióból (CL) áll., míg a nehéz lánc a nehéz lánc variábilis régióból (VH) és a nehéz lánc konstans régióból (CH) áll.

, A nehéz lánc konstans régiója néhány olyan doménból áll, amelyek az egyes osztályokra (IgG, IgK, IgA, IgD és loE) és egyes alosztályokra (IgSi, IgG2, igG3 és IgG4, illetve IgAl és IgA2) jellemző aminosav-szekvenciákat tartalmaznak ,

Az IgG (IgCL, IgG2, IgG3· és IgG4) nehéz lánca - az Nterminálistól számítva, sorrendben ~ VH-régióból, CH1doménból, kapocs- (^whínge~^!f) régióból, CE2-doménbői és CH3doménból áll.

Hasonlóan, az IgGl nehéz lánca - az N~terminálistói számítva, sorrendben - VH-régioból, ο^ΐ-doménból, kapocsrégióból, ογ_;:2-doménból és cy-.3-doménból; az I.gG'2 nehéz lánca - az M-terminálistől számítva, sorrendben - VB-régíoból, ”Í cysl-doménból, kapocsrégióból, cy₂2-doménból és cy₂ 3-dóménbői; az IgG 3 nehéz lánca - az N-termináiistól számítva, sorrendben - vH~régióból, cysl-doménbói, kapocsrégióból, cv₃2~doménböi és cysS'-döxaénból; az lgG4 nehéz lánca - az Nterminálistól számítva, sorrendben - VH-régióból, ογ₄1~ doménből, kapocsrégióból., cy4'2~doménból· és cyü-doménböí

As IGA nehéz lánca - az N-terminálistói számítva, sorrendben - VH-régiőból, cal-doménből, kapocs régióból, ca2-doméhbői és co3-doménból áll.

Hasonlóan, az IgAl nehéz lánca - az d-terminslistói .számítva, sorrendben. - YH-régióból, ca_xl-doménből, kapocsrégióból., ca_x2-doménbő-l és ca_x3-doménból; míg az IgA2 nehéz lánca - az N~terminálistói számítva, sorrendben - VHrégióből, cd₂l-domérsbő-I, kapocsrégióból, ca₂2”doménből és ca₂ 3~doménbó1 áll.

Az IgD nehéz lánca - az M-terminálistői számítva, sorrendben - VH-réglóból, cSl-doménből, kapocsrégióból, cS2~doménböl és cSő-doménből áll.

Az IgM nehéz lánca - az N~terminálistói számítva, sorrendben - VH-régióbóI, cpl-do-ménből, cp2~doménből, cu3doménból és cp4-doménbói áll, és nem tartalmaz - IgG-ben, IgA-ban és IgD-ben meglévő - kapocsrégiót.

Az XgE nehéz lánca - az N~ terminálistói számítva, sorrendben ~ VH-régiőból, csl-doménből, cs2-doménból, cs3doménbol és cs4~dománből áll, és nem tartalmas - IgG-ben, IgA-ban és IgD~'ben meglévő - kapocsrégiót.

láncot kapcsolják össze) mögötti

anal kezeljük	» ♦ * * * ♦ M * · * ♦ * * * * «>*« *·♦» * * · * *♦* 0 * W« ♦* * , az i gG ka-
sek (melyek	a két. nehéz
'övid N-termi#	ΐ á 1 i s ο 1 d a 1 o n
»b-fragmens (	amelyekben a
nehéz lánc	S ii **
fz kapcsolódik	cj és egy Fc-
üfid-kötéssei	. két homológ
CK3~doménhóI	álló - nehéz

lánc fragmens kapcsolódik egymáshoz (lö* Immunology lllustrated# 2. kiadás# szerk.: Nankodo, 65-75, old, (1992); és Focus of Hewest Medical Science# Reoognition Mechanism of Immuné .System*’# szerk*:. Nankodo# 4-7* old. (1391); stb.},

A találmány leírásában az immunglobulin nehéz lánca konstans régiójának egy része¹' kifejezésen egy immunglobulin. nehéz lánc konstans· régiójának olyan részét értjük# amely a fentebb említett strukturális sajátságokkal bir; előnyösen a €1-dómén nélküli konstans régió vagy az Fcrégíó, Az immunglobulin nehéz lánca konstans régiójának egy részének jellemző példái közé tartozik az IgG# IgA vagy IgD külön-külön - kapocsrégiójáboi, C2-dóménjébol és C3dóménjáből álló régió# valamint az IgM vagy TgS - különkülön - C2-dóménjébol# C3-doménj éboi és C4-dóménjebei álló régió# különösen előnyösen a emberi eredetű XgGl serégiója.

A találmány szerinti *fúziós protein olyan molekula# amely a fentebb leirt, találmány szerinti sejtfelületi molekulát alkotó polipeptid extraoelluláris régiójából és egy * » » * «»«* *♦»* x v * ♦ ♦♦*·’ • * ** ** ⁴ humán immunglobulin (lg) nehéz lánca konstans régiójából - vagy annak egy részéből ~ áll. A találmány szerinti fúziós protein előnyösen egy találmány szerinti polípeptid extracellulárís régiójából és a humán IgG nehéz lánca konstans régiójának agy részéből áll; különösen előnyösen olyan fúziós polípeptid, -amely egy találmány szerinti polípeptid extraoellaláris régiójából és a humán IgG nenéz lánca kapocsrégióját, CH2~doméüjét és Cü3~doménjét tartalmazó régióból (Fc-régiöi áll. Előnyös, ha az Fo-régió IgGl-fcől származik. Ezen túlmenően, előnyös, ha a találmány szerinti polípeptid emberből, egérből vagy patkányból (előnyösen emberből} származó polípeptid,

A. találmány szerinti fúziós polípeptid előnye, hogy fúziós polípeptid természetének köszönhetően - affinitás! osziopkromatográfiával rendkívül egyszerűen tisztítható, mégpedig a prptein-A. azon tulajdonságának kihasználásával, hogy specifikusan kötődik az immunglobulín-fragmenshez, amelyet a találmány szerinti fúziós protein fúziós partnerként tartalmaz (pl. az IgG Fc-fragmense}. Ezen túlmenően, mivel különféle antitestek állnak rendelkezésre, amelyek a különböző immunglobulinok Fo-régiója ellen irányulnak, a fúziós polipeptidek immunológiai vizsgálati eljárásai - Forégió elleni antitestek alkalmazásával - könnyen végrehajthatok.

A találmány szerinti polípeptid, polipeptíd-fragmens és fúziós polípeptid nem. kizárólag a fentebb említett rskombináns üNS-teohnoIócia alkalmazásával, hanem egyéb ismert eljárások alkalmazásával (pl. kémiai színtézises eljá49 rássei, sejtt-enyésztési eljárással, vagy erek kombinációjával; is eiállitható.

A találmány szerinti gén fentebb említett, találmány szerinti polipeptidet vagy polipeptid-fragmenst kódoló DNS-t tartalmaz; az ilyen gének közé tartozik valamennyi, a találmány szerinti polipeptidet vagy polipeptid-fragmenst kódoló nukisotidszekvenciát tartalmazó gén.

A találmány szerinti gének jellemző példái közé tartoznak a következő polipeptideket vagy polipeptid-fragmensekét kódoló gének:

1} Polipeptid, amelyet az - 1. azonosítószámú nukieotidszekvenciát tartalmazó DNS-sei sztr.ingens feltételek mellett hibridizálódó - DNS kódolja, .2) Polipeptid, amely 2, azonosítószámú aminosavszekvenciával 60 %-os vagy még nagyobb arányú homológiát mutató aminosav-szekvenciát tartalmaz,

3) Polipeptid, amely 2, azonosítószámú aminosav-ssekvéneiét vagy azzal lényegében azonos aminosav-szekvenciát tartalmaz (közelebbről, a humán 3TT-l-antigént alkotó polipeptid vagy annak származéka}.

4} Polipeptid, amely a 3. azonosítószámú szekvencia 2β-β25·. nukleotídjárnák megfelelő nukleotidszefcvencia által kódolt ami.no sav-szekvenciát vagy azzal lényegében azonos aminosav-szekvenciát tartalmaz (közelebbről, a humán JTT-1antigent alkotó polipeptid vagy származéka}.

5} Polipeptid, amely a 4, azonosítószámú szekvencia

35-637, nukieot idja inak megfelelő nukl.eotid.szekven.cia által kódolt aminosav-szekvenciát vagy azzal lényegében azonos a * aminosav-szekvenciát tartalmaz (közelebbről, a patkány JTT1-antigént alkotó polípeptid vagy származéka)6) Polipeptid, amely az 5. azonosítószámú szekvencia 1-603. nukleotidjainak megfeleld nukleotidszekvencia által kódolt aminosav-szekvsnciát vagy azzal lényegében azonos aminosav-szekvsnciát tartalmaz (közelebbről, az egér JTT-Íantigént alkotó polípeptid vagy származéka).

7) Polípeptid, amely a 6. azonosítószámú szekvencia 35-635, nukleotidjainak megfelelő nukleotidszekvencia által kódolt amínosav-szekveneiát vagy azzal lényegében azonos aminosav-szekvenciát tartalmaz (közelebbről, a mutáns patkány JTT-l-antigént alkotó polípeptid vagy származéka) .

8} Polipeptid, amely a találmány szerinti sejtfalaiéti molekulát alkotó polipeptidet kódoló DNS által kódolt amino'sav-szekvenciát (vagy azzal lényegében azonos amino sav-szekvenciát; tartalmaz, mely DNS a FSRN BP-5725 deponálási számon letétbe helyezett transzformánsba van bejuttatva (közelebbről, a humán JTT-l-antigént alkotó polípeptid vagy származéka;,

Itt az ”azzal lényegében azonos- aminosav-szekvencia” kifejezésen a fentebb megadottakat értjük.

A találmány szerinti gének jellemző példái közé tartoznak a következő CNS-ek vagy DNS-fragmensek.

(1; DNS, amely az. 1. azonosítószámú szekvenciát tartalmazza, és DNS, amely ezzel a DNS-sel sztringens feltételek mellett hi.bridizálódik.

(4) DNS, amely a 3< azonosítószámú szekvencia 26-625, nükleotidjeinak megfelelő nukleotidszekvenciát tartalmaz.

(5-} DNS, amely a 4. azonosítószámú szekvencia 35-637. nukieotidjainak megfelelő nukleotidszekvenciát tartalmaz.

(6) DNS, amely az 5. azonosítószámú szekvencia 1-603, nukieotidjainak megfelelő nukleotidszekvenciát tartalmaz.

(7) DNS, amely a 6. azonosítószámú szekvencia 35-635, nukieotidjainak megfelelő nukleotidszekvenciát tartalmaz, (8j DNS, amely találmány szerinti sejtfelületi molekulát alkotó polípeptidet kódol, mely DNS a FERM BP-5725 deponálási számon letétbe helyezeti transzformánsfca van bej uttatva.

Az immunglobulin nehéz lánc konstans régiójának egy részét (amely a találmány szerinti fúziós polipeptid egyik komponense) kódoló DNS lehet cDNS vagy - az egyes exonok (például, a CH1-domént, a kapocsrégiőt, a CH2-domént, CH3domént, C'H4-domént, stb. kódoló DNS) között íntronokat tartalmazó - genom! DNS.

A találmány szerinti DNS bármilyen kodonokat tartalmazhat,· feltéve, hogy azok ugyanazon aminosavat. kódolják.

A találmány szerinti DNS bármilyen eljárással előállítható; lehet például mRNS-bőI előállított komplementer DNS (eDNS), genom! DNS-ből előállitott DNS, kémiai szintézissel előállított DNS, RNS- vagy DNS-templát alkalmazásával végzett polimeráz-láncreakcióé ampliflkadéval előállított DNS vagy ezen eljárások megfelelő kombinálásával előállitott DNS.

A találmány szerinti polípeptidet kódoló DNS hagyományos eljárásokkal állítható elő, például, a találmány szerinti polípeptidet kódoló mRNS-böl oDNS klónozásával; geno52 » e ft - » » *'>· * * v *.**♦ ft * * * **?

mi DNS izolálásával és feldarabolásával, kémiai szintéziss e . ί., s fc o .

(Ii Találmány szerinti polipeptidet kódoló aüdíS-ből cDNS-t, például, a kővetkező eljárással klónozhatunk.

Elsőként találmány szerinti sejtfelületi molekulát (polipeptidet) expresszálő és termeld szövetekből vagy sejtekből (pl. GonA-vai stimulált thymus-sejtekből vagy léperedetű, limfoblaszt-sejfékből) mP.MS~t állítunk elő. Az uRNS eiőállitásához ismert eljárásokkal össz-RNS-t izolálhatunk, például a guanídin-fiocianátos eljárással (Chirgwín és mtsai.: Bíochemistry 18, 5294 (1979)], forró feno.los eljárással vagy AGPC-eljárással, és az izolált RNS-t - oligodT-cellulóz vagy polí-U-Sapharose alkalmazásával affinitás! kromatográfiának vetjük alá.

Ezt kővetően, a kapott mBNS'-t templátként alkalmazva, cDNS-t szintetizálunk, például, jói ismert reverz transzkriptázos eljárással, mint az Okayama és mtsai... [Mól, Cell Bioi. 2, 161 (1982); Mól. Cell Bioi. 3, 280 (1983)] vagy a Hoffman és mtsai. [Gene 25, 263 (1983)] által leírt eljárás, és a kapott cDMS-t kettős szálú cDNS-sé alakítjuk. Az előállított oDNS-t hordozó plazmidvektorokkal, fágvektorok£, coli-t transzformálva vagy E.

után transzfaktáivá. cDNS-könvvkal vagy kozmi.dvektorok.kal ooii-t in vi tro csomagolás tárat állítunk elő.

A találmány szerinti megoldás gyakorlati kivitelezése során alkalmazott plazmidvektorokkal és fágvektorokkal szemben nem támasztunk különösebb követelményeket, feltéve, hogy a gazdában képesek replikálódni és fennmaradni. Az általánosan alkalmazott klónozóvektorok közé tartozik pMSISS, λΖΑΡΧΙ (IZAPII), pdC19, kgtlO, XgtlL, stb. Amennyi oen a yextor?

későbbiekben leirt módon ~ immunoióoia) szkríneiésre alkalmazzuk, olyan vektor előnyös, amely a találmány szerinti polipeptidet kódoló gén gazdában történő expresszáltatásának elősegítésére alkalmas promótert tartalmaz .

A cDNS, például, Maniatís és mtsai. eljárásával (Molecular Cloning, A Laboratory Manuai, második kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory, 1.5,3 old. (1989)1 inszertálhatő plazmádba. A cDNS fágvektorba történő inszertálasára, például, a H'yunh és mtsai. által leírt eljárás alkalmazható .(DNA. cloning, A. Practical Approacb 43 (193.5)]. Ezek az eljárások kereskedelmi forgalomban (pi. a Takara Shuso-töl) beszerezhető kiónozó reagenskészlet alkalmazásával hajthatók végre. Az így kapott rekombináns plazmidot vagy fágvektort megfelelő gazdasejtekbe, például prokarióta sejtekbe (E. coli: XliSlus MRF^!, DN5a, HB10Í, MC1061/P3, stb.) juttatjuk be.

A piazmídok gazdasejtekbe történő bejuttatására alkalmas eljárások közé tartozik a kalcium-klóridős eljárás, a kaicium-klorid/rubídium-kloridos eljárás (Molecular Cloning, A Laboratory Manuai, második kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory, 1.74 old. (1989) j, valamint az elektroporáciös eljárás. A fágvektorok, például, olyan eljárással juttatható be a gazdasejtekfce, melynek során a fág-DNS-eket ín vitro csomagolás után juttatjuk be a szaporodó sejtekbe. Az in vitro csomagolás kereskedelmi forgalomban (pl. a » 9 99 9» 9 > 9 * ♦ ί 9 · 9 Λ * * ( « 99 X 99* * ♦ *

Stratagene-től vagy as Amersham~tól) beszerezhető in vítrc csomagoló reágenskészlet alkalmazáséval hajtható végre.

A találmány szerinti polípeptidet kódoló cDNS a fentebb leírt eljárással létrehozott cWS-könyvtár bői, szokványos cDNS-szkrinelési eljárások kombinálásával izolálható.

Például, a kívánt cDNS-t tartalmazó klón ismert te-

áciős	élj	árassal [Crunstein és mtsai,:	p .l? o c a
ς r- < Va·' 'U* Uk «·	USA	72, 3961 (1975)1 vagy plakk-hibrí	Új. id'
ássa!	(Mól	.ecular Cicning, A Laboratory Ma	nuai.
idá «,	Coid	Spring Harbor Laboratory, 2.1OS	s-· 1 .·-< ~ ' f

(1989) ], próbaként ^x2P--íso-téppal jelzett, kémiai úton szintetizált (a találmány szerinti. poiipeptid aminosav-szekvenciájának megfelelő') oligonukleotidok alkalmazásával, szkrisíelhető. Más módon, a találmány szerinti poiipeptid speciális .régióját kódoló DNS-fragmenst hordozó klón. az adott régió.;. - szintetikus iáncindítő-oligonukleotidok alkalmazásával végzett ~ polimeráz-láncreakcióval amplífikálva sz-kríneIható.

Amennyiben cDHS expresszíós vektor (pl. XSAPIl-fágvektor) alkalmazásával előállított oDNS-könyvtárat alkalmazunk, a kívánt klón a találmány szerinti poiipeptid elleni antitest felhasználásával, antigén-antitest reakció segítségével szkrínelhető - Ha sok ki ónt vetünk alá szkrínelésnek, előnyösen a polimeráz-iáncreakciőssal végzett szkrínelést alkalmazzuk.

Az igy kapott DNS nukleotidszekvenciája a MaxamGilbert-féls eljárással {Maxam és mtsai.: Proc. Natl, Acad.

Sci. USA 74, 560 (19-77)) vagy a szintetikus didezoxinuklec* ♦ » t 99 * * * « *** ♦ ♦ « % ♦ tt tid'os lánc záró eljárással (Sanger és mtsai..: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463 (1977)} határozható meg, A találmány szerinti polípeptidet kódoló gén egészét vagy részét a fentiek szerint kapott klón restrikciós enzimekkel végzett hasításával, stb. nyerhető ki.

(2) A, találmány szerinti polípeptidet kódoló DNS a poiipeptidat exprssszélé sejtekből származó genomi DNS-ből, a következő eljárások alkalmazásával izolálható.

A megfelelő sejteket - előnyösen SDS-sel vagy proteináz-K-val - szolubilizáljuk, és a DNS-eket többszöri fenolos extrakeióvai proteinmentesítjük. Az RNS-eket előnyösen ríbonukleázzal emésztjük. A kapott DNS-eket megfelelő restrikciós enzimekkel részlegesen emésztjük, és a kapott DNSfragmenseket alkalmas tággal vagy kozmiddal amplifikáljuk, miáltal könyvtárat hozunk létre, Ezt követőén a kívánt szekvenciát tartalmazó klőnokat (pl. radioaktivan jelzett DNS-prébák alkalmazásával) detektáljuk, és a találmány szerinti polípeptidet kódoló gén egészét vagy egy szakaszát restrikciós enzimes emésztéssel nyerjük ki a kiónokbói.

A emberi eredetű, polípeptidet kódoló cDNS-t a követ-

k:32ŐIC S2	érint kap j uk. Ml.u.	tán a humán genomi DNS-t	fkromo-
52ónális	DNS-t) tartalmaz	.6 közmidkönyvtárat előáll	4 j*- Τ* 1 > V
(Labor a)	bory Manna1: Humán	. Genome Mapping, Marüzen	Press),
a kívánt	proteint kódoló	régió DNS-ét tartalmazó	y\ A·, *y t* k. -λ- V
klőnokat	a ko :zmi dkönyvtár	szkríneiésévei azonosít j-	ok. Ezt

követően a fentebb említett cDNS-könyvtárat a humán cDNS előállítása céljából - próbaként a pozitív klónbói kivágott kódoló DNS alkalmazásával - szkrineljük.

(3) A találmány szerinti DNS - az i., 3. 4., 5. vagy 6. azonosítószámú szekvencia alapján - szokványos eljárással, kémiai úton is szintetizálható.

A találmány tárgyát képezi az olyan rekombináns vektor is, amely találmány szerinti sejtfelületi molekulát (polipeptidet} kódoló DNS-t tartalmaz. A találmány szerinti rekombináns vektorral szemben támasztott egyetlen követelmény, hogy különböző prokariőta és/vagy eukarióta gazdasejte'kben replikálódjon és fennmaradjon vagy önálló replikádéra legyen képes. A találmány szerinti vektor plazmidvektor és fágvektor egyaránt lehet,

A rekombináns vektor a találmány szerinti polipeptídet kódoló DNS rekombinációra alkalmas vektorral (plazmádDNS-sel vagy bakteriedág-DNS-selj történő (szokványos eljárással végzett) iigálásával könnyen előállítható. A rekombinációra alkalmas vektorok jellemző példáiként az ő, coli eredetű plazmidok (pBA322> pBR32S, pdC12, pUCI3 és püClSP / az élesztőeredetű plazmidok (pSH19 és pSHiőj; valamint a Sadllus sufetilis eredetű plazmidok (pUBllO, pTP5 és pCI94j említhetők. Az alkalmas rágok példái közé tartoznak a bakteriofágok, pl. λ-fág, valamint az állati vagy rovarvírusok (pV11393; Invitrogen), pl. retrovírusok, vaccíniavírusok és a sejtmaoi políhedrózis-vírus.

Az expressziós vektorok, a találmány szerinti xpex}·'· tidet kódoló DNS-ex.presszáltatására, és a találmány szerinti polipeptid termeltetésére, alkalmasak. Az alkalmazott expressziós vektorral szemben nincsenek különösebb korlátozások, feltéve, hogy különböző prokariőta és/vagy eukariőta •gazdasejbekben képesek a gén expresszáltatására és a protein termeltetésére. Az ilven expressziós vektorok példái kö. ÜSA 91, 1 zé tartozik a pEFn-e-o. [Proc. Na ti. Acad. Se (1994)1; pEF-SOS [Nucieic Acids Rés. 18, 5322 (1990)], pME'ISS [Experimental Medicina·: SEPPLSMENT, Handbook of Génétic Sngineerlng (1992}], pMAL C2, stb.

Amennyiben gazdasejtként baktériumot, elsősorban ő, colí-t alkalmazunk, az expressziós vektornak rendszerint legalább - promóter/operátor-régiót, iniclácios kodont, találmány szerinti polípeptidet kódoló DNS-t, termináciős kodont, termlnácíós régiót és repiikont keli tartalmaznia.

Ha gazdasejtként élesztősei tat, állati sejtet vagy rovarsejtet alkalmazunk, az expressziős vektor előnyösen legalább - promotért, ínlcíácíós kodont, találmány szerinti polipeptídet kódoló DNS-t és termináciős kodont tartalmaz. Ezen túlmenően, az ilyen gazdasejbekben alkalmazott expressziós vektor tartalmazhat szignálpepti.det kódoló DNSt, erősítőszekvenciát, a találmány szerinti polipeptid génjének S-~ és 3’-oldali nem transziáiődö régióját, spiieing kapcsolódási helyeket, poiiadenilációs helyet, szelektálható markerrégiót és repiikont is. Kívánt esetben az expressziős vektor tartalmazhat - általánosan alkalmazott - génamplitikáciot lehetővé tevő gént (markért) is,

A találmány szerinti polipeptid baktériumokban történő expresszáltatására alkalmas promőtsr/operátor-régiő promptért, operátort, és Shine-Daigarno (SD) szekvenciát (pl. .AAGG·} tartalmaz. Például, Sscherlchía gazdasejt alkalmazása esetén a megfelelő promőter/operátor-régió előnyösen Trp5**·* * ** * ♦ ♦♦·£ * Φ »»·.♦* * promötert, lac-promótert, recA-promdtert, kPL-promótert, ipp-promótert, lae-promótert vagy hasonlókat tartalmazhat. A találmány szerinti polipeptid élesztősejtekben történő expresszáltatására alkalmas promőterek között említhető a RH05~promőter, RSK-promóter, GAP-promóter, ADH-promőter, stb. Ha gazdasejtként Saoíllus sejteket alkalmazunk, az alkalmas promóterek példáiként az SLOT-promóter, SPQ'2promoter, penP-promötsr és hasonlók, említhetők, Eukarióta gazdasejtek {pl. emlőssejtek; alkalmazása esetén promőterként SV4ő~eredatű promőter, retrovirus-promófcsr, hosokkpromőter, EB'-promóter és hasonlók, előnyösen SV-40, SRa és retrovírus-promőter alkalmazható. Természetesen a felhasználható promóterek nem korlátozódnak csupán a felsoroltakra. Az axprasszió szempontjából hatásos az erősitőszebráncíák alkalmazása.

Az expressziós vektorok inicíácíós ködönként előnyösen, például, metionin kodont (ATG; tartalmaznak, míg términációs ködönként szintén a szokványos termináeiös kodonok (pi. TAG, TGA, TAA, stb.) alkalmazhatók.

Lánczáró (termináeiös; régióként az általánosan alkalmazott, természetes vagy szintetikus te.rminátorokat használjuk.

A replíkon olyan DNS, amely gazdasej tekben. a teljes DNS-szekvencia repiikálásara képes; ezek közé tartoznak a természetes plazraldok, mesterségesen módosított plazmátok (természetes plazmádból előállított DNS-fragmens), szintetikus plazmidok, stb. Az előnyös plazmátok példái közé tartozik az A, colí-ban alkalmazható p3R322 és mesterséges *«»* ··»♦ » * * * ♦·*? « X ♦· ♦» · származékai (a pSE.32.2 megfelelő restrikciós enzimekkel történő kezelésével kapott DNS-fragmens); az élesztőseitekben alkalmazható, élesztő 2p-plazmíd vagy az élesztő kromoszómális DNS; illetve az emlőssejtekben alkalmazható pSKneo, pMEISS, pRSVneo ATCC 3 7198, pSVZdhfr ATCC 3714.5, pdSPVMM'Tneo ATCC 37224, p.SV2neo ATCC 37149, stb.

Az expressziős vektorban alkalmazhatók az általánosan, használt e-rősitőszekvencíák, políadeniiációs hely és ^wsplic.ing” kapcsolódási helyek (pl. az SV40-vírusfoól· származók) ,

A vektorokban szokványos szelektálható markerek is alkalmazhatók; ezek példái az antibiotikumokkal (pl. tetraciklinnel, neomicinnel, ampieíllinnsl vagy kanamicinnel} szemben rezisztenciát biztosító· gének és a timídin kináz gén.

- A génamplifikációra alkalmas gének példái közé tartozik a dihidrofolát .reduktáz (KEFE) gén, timidin kináz gén, neomicin-resisztencia gén, glutamát szintetás gén, adenozin deaiaináz gén, ornitin dekarboxiláz gén, higromicín-S foszfo transzferár gén, aszpartát transzkarbamiláz gén, stb.

A találmány szerinti expressziós vektor legalább a fentebb említett promóter, iníciációs kodon, találmány szerinti polípeptidet kódoló DNS (gén), terminá-ciós kodon, és terainátor-régió megfelelő replikonhoz - folytonosan vagy gyűrűszerűén történő - kapcsolásával állítható elő. Kívánt esetben., hagyományos eljárással megfelelő DNS-f ragma nsek •(pl. linkerek., egyéb restrikciós enzimekkel létrehozott restrikciós felismerési helyek) alkalmazhatók, például restrikciós enzimmel végzett emésztéssel vagy T4-DNS-ligáz alkalmazáséval végzett ligálással.

.A találmány szerinti transzformánsok a fentiekben leírt expresszíós vektor gazdasejtekbe történő bejuttatásával állíthatók elő.

A találmány szerinti megoldás értelmében bármilyen gazdasejt alkalmazható, azzal a feltétellel, hogy kompatibilisek a fenti expresszíós vektorokkal, és transzformálhatók. Az ilyen gazdasejtek példáiként különféle természetes, illetve mesterségesen létrehozott, rekombináns sejtek említhetők, például, baktériumok lEscóericbia és Bacillus), >k (Saccharoiayces, Pichia, stb.), áll;

'agy róvarsej tek.

A találmány szerinti megoldás értelmében gazdasejtként előnyösen £. coli sejteket vagy állati sejteket alkalmazunk, melyek jellemző példáiként A. coli sejtek (DHSc, XLlSlue MRF^f, IBI, HBIÖ1, stb..); egér-eredetű sejtek (COP, L, C127, Sp2/Ö, N'S-1, NIH 3Ϊ3, stb.); patkányeredetű sejtek; hörcsögeredetű sejtek (BAK, CHO-ΚΙ, CEO, stb.),· majomeredetű sejtek (CQSI, COS3, COS7, CV1, Vélő, stb.); és emberi eredetű sejtek (HEK293, HeLa, dipioíd fibroblaszteredefcű sejtek, myslomasejtek, Namalwa, stb.).

Az expressziős vektorok a gazdasejtekbe ismert eljárással juttathatók be (transzformálhatók, transzdukálhaA bakteriális ·{'£. coli, Sacillus subtills, stb.) gazdasejtek transzformációja, például, Cehén és mtsai. eljárásával (Proc. Natl. Acad, Sói, USA 63, 2110 (1972)1, ♦ # * V » » ί » ’ « ♦ * * * ♦ χ ♦ ♦ * * * * *· *.

«♦).< ♦ ♦·«'* * '♦ * **ί > * »♦ ♦* protoplaszfc eljárással ÍMol. Gén. Génét. 168, 111 (1979)] vagy kompetens eljárással [J. Mól. Siói. 56, 209 (1971) j hajtható végre. A SacchaT&myces cer-evisiae Hínnen és mtsaí. eljárásával (Proc. Natl, Aead. Sói. USA 75, 1927 (1978)) vagy a Iltiumos eljárással ÉJ. Bacteriol. 153, 163 (1333)1; az állati eredetű sejtek. Graham eljárásával fVirology 52, 456 (1973)]; a rovarsejtek pedig Summers és mtsaí. eljárásával (Mól. Ceil. Bioi. 3, 2156 (1983)] transzformálhatok.

A találmány szerinti polipeptid a fentebb leírtak szerint előállított expressziős vektort hordozó transzfermánsok (a továbbiakban ez a kifejezés magábaxx foglalja a transzduktánsökat) tápközegben végzett tenyésztésével állítható elő.

Az alkalmazott tápközeg előnyösen a gazdasejtek (transzformánsok) szaporodásához szükséges szénforrást és szervetlen vagy szerves nítrogénforrást tartalmas. Szénforrás kánt glükóz, dextrán, oldható keményítő és szacharóz alkalmazható, mio szervetlen vagy szerves nitrooénforrásként asmosnaséK, tón, kazein, nitrátok, aminosavak, kukoríca-áztatőlé, pephúskivonat, szójabab-massza. és burgonyakivonat alkalmazható. A tápközeg kívánt esetben tartalmazhat egyéb tápanyagokat, például szervetlen, sókat (kalcium-kloridot, nátrium-dihidrogén-foszfátot és magnézium-kloridot), vitaminokat és antibiotikumokat (pl. tetracikiint, neomicint, ampiciliint, kanamicint stb.).

A transzformánsokat jól ismert eljárásokkal tenyészthetjük. A tenyésztési feltételeket, igy pl. a tápközeg hőmérsékletét és pH~ját, valamint a tenyésztés időtartamát » « úgy választjuk meg, hogy a találmány szerinti polipeptid túlzott mennyiségben termelődjön.

A gazdasejtektől függően kiválasztott tápközegeket ss tenyésztési feltételeket a következőkben ismertetjük, azonban a találmány szerinti megoldás érbeimében alkalmazható tápközegek és tenyésztési feltételek nem korlátozódnak kizárólag az itt leírtakra.

Amennyiben gazdasejtként baktériumot, Acíiromycetast, élesztőket vagy fonalas gombákat alkalmazunk, a fent említett tápanyagforrást tartalmazó folyékony tápközegek előnyösek, melyek pH-ja 5-tól 8-lg terjedhet,

A, coll gazdasejt tenyésztésére előnyösen LS-tápközeget és M9-tápközeget [Miller és mtsai,: Eop. Mól, Génét. Coid Spring Harbor Laboratory, 431. old (1972)], S tápközegek alkalmazásakor a tenyésztést - szükség esetén levegőztetéssel és keveréssel - rendszerint 14 °C és 43 ®C közötti hőmérsékleten, kb. 3-24 óra hosszat végezzük,

A Bacillus gazdasejtek tenyésztését ~ szükség esetén levegőztetéssel és keveréssel - általában 30-40 ^sC-on, kb. 1S-96 óra hosszat végezzük.

Amennyiben gazdasejtként élesztősejtet alkalmazunk, a tenyésztést Surkholder-féle minimál tápkőzegskben (Bestián: aroc. Nafcl, Acad, Scí. GSA 77, 4505 (1980)] - szükség esetén levegőztetéssel és keveréssel - 20-35 *C-on, előnyösen 5 és 8 közötti pH-η, kb. 14-44 óra hosszat végezzük.

Az állati eredetű gazdasejtek tenyésztésére alkalmas tápközegek jellemző példái a (kb. 5-20 % magzati borjüszérumot tartalmazó) HEM-tápközeg (Science 122, 501 (1952); a * * * * Λ *Χ»· * * ' * * ' üMBM-tápkÖzeg [Vírology 8, 396 (1359)], RPMi-164ö-tápközeg [J. Am. Med. Assoc.. 199, 519 (1967)] és a 199-es tápközeg [Proc. Sec, Exp. Bioi. Med. 73, 1 (1950)1, A tápközeg pHját előnyösen kb. 6 és 8 közötti értékre állítjuk be, és a tenyésztést - szükség esetén levegőztetéssel és keveréssel - 39-40 °C~cn, kb. 15-72 ára hosszat végezzük.

A rovareredetű gazdasejtek esetében magzati borjüszérumot tartalmazó Srace-féle tápközeg [Proc. Natl. Acad. Sci. OSA 32, 3404 (1985)1 alkalmazható, melynek pH-ját előnyösen kb. 5 és 8 közötti értékre állítjuk be, és a tenyésztést - szükség esetén levegőztetéssel és keveréssel to 'O-on, kr

15-100 óra hosszat végezzük,

A fentebb említett transzformánsok - és különösen az állati eredetű sejtek ~ tenyésztésével a sejtek felületén a találmány szerinti polípeptid tűlexpresszáitatása érhető

A találmány szerinti polípeptid. oldható polípeptidfragmensként (pi. extracelluláris régiéként) állítható elő, oly módon, hogy a gazdasejteket as extracelluláris régiót vagy valamely domént kódoló DNS alkalmazásával transzformáljuk, és a transzformánsokat olyan feltételek mellett tenyésztjük, hogy azok a tenyészeti felüiűszóba oldható polipeptideket szekretáljanak. A találmány szerinti fúziós polípeptid hasonló módon állítható elő.

A tenyészeti szűrletet (felülászót) a tenyészet szűrésével vagy centrifngálásával kapjuk, és a találmány szerinti polipeptidet vagy polipeptid-fragmanst a természetes vagy szintetikus proteinek tisztítására és izolálására ál64 «·«. v talánosán, alkalmazott eljárásokkal tisztítjuk és izoláljuk a tenyészeti szűrletből.

Az alkalmas ízolálási és tisztítási eljárások példáiként említhetők az oldékonyságküíönbséget kihasználó eljárások, mint pl. a kisózási és oldószeres .kicsapási eljárások; a molekulatömeg különbségeit kihasználó eljárások, mint pi. a dialízis, ultra szűr é-s, gélszűrés és nátriumdodeci 1-szulfát/poli Cakril-amid} -géielektroforézis; a töltéskülönbségeket kihasználó eljárások, mint pl. az ioncserélő kromatográfia és a hidroxii-apatit kromatográfia; a hidrofóbitási .különbségeket kihasználó eljárások, mint pl. a reverz fázisú, nagyteljesítményű folyadékkromatográfia; valamin az ízoelektromos pont különbségeit kihasználó eljárások, pl. az ízoelektromos fókuszálás.

Amennyiben a találmány szerinti polipeptid vagy :ket vagy sejtekei

transzformáns ok
ielen, először a	gombates-
eljárással (pl.	szűréssel.
tjük, majd megfe	lelő pof-

ferben. szuszpendáljuk. Miután a sejtek sejtfalát és/vagy sejtmembránját, ultrahang-kezeléssel, lizozimos kezeléssel vagy fagyasztással/felolvasztással feltártuk, a találmány szerinti polipeptidet tartalmazó membrántrakciót centrifugáiással vagy szűréssel kinyerjük. A membránfrakciót - a nyers kivonat kinyerése céljából - detergenssei (pl. Triton-XlOO-zal - szolubilizáljuk, végül a polipeptidet vagy polipeptid-fragmenst a nyers kivonatból hagyományos eljárással izoláljuk és tisztítjuk.

A. találmány szerinti transzgenikus egér kifejezésen olyan transzgenikus egeret értünk# amely endogén lókuszba integrálva nem egérből származó# találmány szerinti polipeptidet (nem saját polipeptidet}- kódoló DNS-t (c'DNS-t vagy genomi DNS-ti tartalmaz. A transzgenikus egérben expresszilődik a nem saját polipeptid# és az az egér testébe választódik ki,

A transzgenikus egér a transzgenikus állatok létrehozására általánosan alkalmazott eljárással hozható létre (id. pl. Newest Kannal of Animál Cell Experimént”# L.1C Press# 7. fejezet# 361-408. old (1998)),

Például, a normális egér-hőiyagcsirából nyert embrionális őssejteket (ES-sejtek) olyan expressziós vektorral transzformáljuk# amelybe működőképesen a találmány szerinti humán polipeptidet (vagyis a humán ŰTT-l-antigént) kódoló gén>van inszertálva, Azokat az SS-sejteket# amelyekben az endogén génbe találmány szerinti# emberi eredetű polipeptidet kódoló gén van inszertálva# szokványos eljárással szkríneljük, majd a szkrínéit sejteket egy másik# normális egérből származó megtermékenyített petesejtbe (hólyagosira) mikro injektál juk fProc. Kati. Acad. Sci. USA 77(12) # 7380 (1380); 4 873 191 számú Egyesült Áilamok-foeli szabadalmi leírás). Ezután a hólyagcsírát egy újabb normális egér (dajkaanyag) méhébe ültetjük. A dajkaanya által világra hozott utódokat alapító” (feunder”) egereknek nevezzük# és ezeket normális egerekkel keresztezve heterozigőts, transzgenikus egereket kapunk. A heterozígőta# transzgenikus egereket egymással keresztezve - a Mendel-féie törve66 nyék értelmében - homozigóta transzgenikus egereket kapunk,

A találmány szerinti	kuockout	egér )	Kifejezés olyan
egeret jelent, amelyben a	találmány	szerír	> .+· d fc U. -X.	egéreredetü
polipeptidet (azaz az egér JTT-l-antí	.gént}	köc	iolő endogén
gén inaktiválva van. Az ii	yen egerek,	példái	rl,	homológ re-

kombináció alkalmazásával végzett pozitív-negatív szelekcióval hozhatók létre (5 464 764; 5 487 932 és 5 627 059 számú Egyesült Államok-beli szabadalmi leírások; ?roc. Natl. Acad. Sói, USA 86, 8932 (1389}; Natúré 342, 435 (1989} ?

stb J ,

A találmány szerinti antitest” lehet poliklonális antitest (antíszérum} és monoklonális antitest; előnyösen monoklonális antitest.

Közelebbről, a találmány szerinti antitest olyan antitest, amely a fentebb említett, találmány szerinti polípépeiddé! vagy polipeptíd-fragmenssel reaktív.

A találmány szerinti antitest olyan természetes antitest lehet, amelyet emlősök (pl. egerek, patkányok, hörcsögök, tengeri-malacok vagy nyulakj antigénnel - így pl, találmány szerinti sejtfeiületi molekulákat expresszálő sejtekkel (természetes sejtekkel, sejtvonalakkal, tumorsejtekkel, stb.}, felületükön találmány szerinti polipeptidet vagy sejtfeiületi molekulákat túlzott mértékben expresszálő transzformánsokkal vagy találmány szerinti polipeptidfragmenssel vagy fúziós polipeptídekkel - végzett immunizálásával kaptunk. Ezenfelül, a találmány szerinti antitest lehet rekombínáns DNS-technika alkalmazásával előállított kiméra-antítest vagy humanizált antitest [komplementaritást meghatározó régió (CSR) átültetésével létrehozott antitest}, továbbá - humán antitestet termelő - transzgénikus állatok alkalmazásával -előállított humán antitest ís.

A monoklonális antitestek az IgG, IgK, IgA, IgD vagv ígE izotípusok bármelyikébe tartozhatnak, melyek közül az IgG és az Igái az előnyös.

A találmány szerinti poliklonális antitest (antlszéna), illetve monoklonális antitest ismert eljárásokkal állítható elő, melyek során emlősöket (az ember kivételéve) előnyösen egeret, patkányt, hörcsögöt, tengsrimaiacot, nyulat, macskát, kutyát, sertést, kecskét, lovat vagy szarvas marhát (még előnyösebben egeret, patkányt, hörcsögöt, tenger imalacot vagy nyalat) - fentebb említett antigénnel és (szükség esetén) Ereund-féie adjuvánssal immunizálunk.

A poliklonális antitest az így immunizált állatokból nyert antiszérumböl izolálható. A. monoklonális antitestek a következők szerint állíthatok elő. Az immunizált állatokból nyert antitest-termelő sejtekből és autoantitestsk termelésére nem képes mísiömassjtekbői hibridómákat állítunk elő. A hibridómákat klónozzuk, és olyan kiónokat szkrinelünk, amelyek az emlős immunizálására alkalmazott antigénre specifikus affinitást mutató monoklonális antitesteket termeiη θ ’Z

Közelebbről,	a	monoklonális antite	st a következők
szerint állítható	elő,	A fentebb említett	antigént - szűk-
ség esetén Ereund-	-féle	adjuvánssal együtt	~ egy vagy több
alkaiommal, szubku	.tán,	intramusskalárisán,	talpba vagy in-
traperitoneálisan	nem	humán emlősállatba i	'egérbe, patkány-

ο»

iizá	it emlő-sál
SO	immunizálá
Lsek	gyakorisé

ba, hörcsögbe, tsngsrlmalacba. vagy nyálba, előnyösen egérbe, patkányba vagy hörcsögbe; ideértve az olyan transzgenikus állatokat, melyek egy másik állatfajból származó antitest termelése céljából vannak létrehozva, mint pl. a későbbiekben említett, humán antitestet termelő transzgenikus egér) injektáljuk vagy implantáijuk. Az immunizálásokat rendszerint egyszer - vagy az első immunizálás után 1-14 naponként 2-4 alkalommal - végezzük. Az immunizált emlőséi latból az antitest-termelő sejteket az ut után kb. 1-5 nappal izoláljuk. Az immunizálások gyakoriságát és az egyes immunizálások közötti intervallumot az alkalmazott immunogén tulajdonságaitól függően határozzuk meg. A monoklonális antitestet szekretálő hibridómák Kohler és Milstein eljárásával {Natúré 256, 495 (1975)), illetve annak módosított változatával állíthatók elő. Közelebbről, a hibridómákat a fentiek szerint immunizált nem humán emlősállatból vett lépben, nyirokcsomóban, csontvelőben vagy mandulában (előnyösen lépben) lévő antitest-termelő sejtek autoantitsstek termelésére nem képes mieiőmákkal történő íuzíonáitatásával állítjuk elő, mely mielőmák emlősállatból, például egérből, patkányból, tengerimaiscből, hörcsögből, nyűiből vagy emberből, előnyösebben egérből, patkányból vagy emberből származnak.

A sejtfúzióra, például, az egéreredetű P3/X63-AG8.653 (553), ?3/NSI/i-Ag4-l (NS-1), ?3/X63-Ag8 ,UI (P3Ui), SP2/0-

Ag'iS (Sp2/0, Sp2) , PAI,	FO	vagy BW5147 mi szórna; :	i patkány-
eredetű 210RCY 3-Ag.2.3 .	mi	.eiöma vagy a emberi e	-redeoü V-
2S6AR1, GM1500-61G-AÍ-2,	ü<	3729-6, CEM-AGR, D1R11	vagy CEM-

« «

Τ15 míelóma alkalmazható.

A monoklónális antitesteket, termelő hibridóma-klónok a hibridómák - pl. mikrotiter-tálcákon végzett - tenyésztésével és a hibridóraa-szaporo-dást mutató üregekben a tenyészeti feldiűszó - immunizálásra alkalmazott immunogénre vonatkozó - reaktivitásának (pl. enzimes· immunvízsgálati eljárással - mint pl. a RIA vagy az ELISA - végzett)· mérésével azonosíthatók.

A monokionális a •stek hibridőmákból történő előállítása céljából a hibridómákat ín vitro vagy ín vivő nyésztjük (pl. egér, patkány, tengerimalac, hörcs og vagy nyúl, előnyösen egér vagy patkány, még előnyösebben egér hasűrí folyadékában), és a tenyészeti felülüszőból vagy a hasűri folyadékból izoláljuk az antitesteket.

A hibridómák in vitro tenyésztését, a tenyészteni kívánt sejtektől, a tesztelési vizsgálat céljától és a tenyésztési eljárás különféle feltételeitől függően (a híbridómák szaporítására, fenntartására és tárolására alkalmas, ismert alaptápközegek alkalmazásával) hajthatjuk végre.

A aiaptápközegek példái közé tartoznak a kis kalciumkoncentrácíójö tápközegek, mint pl. a Ham-féle F12-tápközeg, a MCDBISS-tápközeg vagy a kis kalciumkQmcen'trácíójű ΜΞΜ-tápközeg; valamint a nagy kalcíumkoneentrációjú. tápközegek, mint pl, az MCDB104-, KEM~, D-MEM-, RPMI164QASFlOí- és RD-tápközeg. Az alaptápközeg - a tesztelés célfüggően - tartalmazhat szérumokat, hormonokat, oitokineket és/vagy különböző szerves vagy szervetlen, anyago/0 ~

A monoklonálís antitestek a tenyészeti felülúszőbói vagy a hasűri. folyadékból telített ammőnium-szuifátos precipitációval, euglobulin-precipítáciővai, kapronsavas eljárással, kaprli. savas eljárással, ioncserélő kromatograf iával (D£AE vagy DS52), anti-immunglobuiin vagy protein-A oszlop aIkalmazásáva1 vég2e11 affini t a s -krómatográf íáva1 i 2olátható és tisztítható;

A találmány szerinti monoklonális antitestek előnyös példái a következők:

1; Monokionális antitest, amely 2. azonosítószámú aminosav-szekvencíát tartalmazó polipeptiddei, annak fragmensével vagy az ilyen polipeptidet tartalmazó, emberi eredetű sejtfelületi molekulával reaktív.,

2} Monoklonáils antitest, amely találmány szerinti polipeptiddei, annak fragmensévsl vagy találmány szerinti polipeptidet tartalmazó sejtfelületi molekulával reaktív, mely antitestnek a mitogén-stimniálta limfoblaszt-sejtekrs kifejtett hatása azoxios a FEKM BP-57Q7 nemzetközi -deponálási számon letétbe helyezett híbridöma által termeit monokionális antitest mitogén-stimulálta patkányiimfoblaszt-sejtekre kifejtett hatásával,

3) Momoklonális antitest, a polipeptiddei, annak fragmensével polipeptidet tartalmazó sejtfelül? mely antitestnek a mitogén-stimulálta limfobl kifejtett hatása azonos a FSAM BP-5708 nemzetközi deponálási számon letétbe helyezett hibridóma által termelt monokionáiis antitest mitogén-stimulálta patkánylímfoblaszt-

ív	találmány	szeri
így	találmány	szeri
tv	loiefculával	y ρ Λ ly
a	limfobiaszt-	-sej te

• 1 ...

j tökre	kifejtett
Ez	an túlmenő··
testek	közé tart
tközi	deponálási
rmeit :	monok!ónál
A	találmány

Esen. túlmenően, a találmány szerinti monoklonális an:ek közé tartoznak a FSRM BF-5707 és FEBM 3F-5703 nem:i deponálási számon letétbe, helyezett hibrídöms által ,t monoklonális antitestek is.

A találmány szerinti kiméra monoklonális antitest?’ kifejezés génsebészeti, módszerekkel előállított monoklonális antitestet jelent, például, olyan, egér/humán kiméra. monoklonális antitestet, amelynek variábilis régiói nem humán emlős (egér, patkány, hörcsög, stb.) immunglobulinjából, konstans régiói pedig humán immunglobulinból származnak .

A humán immunglobulinból .származó konstans .régió az egyes izotipusokra - IgG (IgGI, IgG2., IgG3, igGé), IgM, IgA, IgD és IgE - jellemző aminosav-szekvenciát tartalmaz. A találmány szerinti rekombínáns kiméra monoklonális antitest konstans régiója bármilyen izotípusba tartozó humán immunglobulinból származhat, de előnyösen humán IgG-ből s £ Δ mis λ- X K <

A találmány .szerinti kiméra monoklonális antitest, például, a következők szerint állítható elő. Szükségtelen megjegyeznünk, hogy az ilyen monoklonális antitestek előállítására egyéb eljárások is. alkalmazhatók.

A.z egér/humán kiméra monoklonális antitest előállítási eljárást illetően id. Experimemtal .Meőicine:

1,8(10) (1.388); valamint a Hei 3-73280 számú, közzétett japán szabadalmi bejelentés (JF~S). Az ilyen an titest előállítása során - azonos vacv eltérő vektorokba vxzso;

♦ * Μ « humán immunglobulint kódoló DMS-bői származó CH-gént (a Hlánc konstans régióját kódoló C~gén) ~ monokionáiis egérantitestet termelő hiforidómábol izolált, monokionálís egérantitestet kódoló DNS-ből származó aktív VH-génektől (a H~ lánc variábilis régióját kódoló, újrarendezett VDJ-gén) 3’~ irányba inszertálunk; és humán immunglobulint kódoló DNSből származó Cl~gént {az L-lánc konstans régióját kódoló Cgén) monokionáiis egérantítestet termelő hibrídómából izolált, monokionáiis egérantitestet kódoló DNS-bői származó aktív VL-génektői {az L-lánc variábilis régióját kódoló, újrarendezett VJ-gén) 3’-irányba inszertáiunk, majd a kapott expressziős vektorral gazdasejteket transzformálunk, és a transzformánsokat tenyésztjük.

Közelebbről; a DNS-eket először a monokionáiis egérantitestet termelő híbrídómákból. szokványos eljárással kivonjuk, megfelelő restrikciós enzimekkel (pl. ScoRI-gyel és Hindlll-mal) emésztjük, elektroforizáljuk (pl. 0,7 %-os agarőzgéien), majd Southarn-blot eljárással analizáljuk. Az eiektrofo.rizáló gél (pl. etídium-bromiddál végzett) megfestése és lefényképezése után a gélen bejelöljük a markerek pozícióját, vízzel kétszer lemossuk, majd 0,25 M sósavban 15 percig áztatjuk. Ezt kővetően a gélt - óvatos keverés mellett - 10 percig 0,4. N NaOH-oldatban. áztatjuk, majd a DNS-eket hagyományos módon, 4 óra hosszat filterre viszszílk át. A filtert 2xSSC~vei kétszer lemossuk., majd megszárít juk, és 75 ^öC-on bárom óra hosszat hőkezeijük. Ezután a filtert 65 ⁵C-on 30 percig 0,lxSSC/ö,I % SDS aléggyel kezeljük, majd 3xSSC/0,. 1% SDS elegyben áztatjuk, végül i Jí müanyagzsákfoan, 65 °C-on 3-4 órán át eiőhíbridizácios oldattal kezeljük.

Ezt követően a müanyagzsákba ³²P~izotőppal jelzett próba-DNS-t és hibridizációs oldatot adunk, ás 65 '’C-on kb. 12 óra hosszat inkubáljuk, A hibrid!záitatás után a filtert megfelelő sókoncentrációs és. hőmérsékleti feltételek mellett, kellő ideig mossuk (pl. 2xSSC/O,l % SOS, szobahőmérséklet, 10 perc). A filtert egy kevés 2xSSC~oidattai együtt müanyagzsákba tesszük, a zsákot lezárjuk, és autóradiográfiás analízist végzünk.

A monoklonális egérantitest H- és L-láncát kódoló, űjrarendeződótt VDJ-gént., illetve VJ-gént a fentebb leírtak szerint, Southern-biot·' vizsgálattal azonosítjuk. Az azonosított .DNS-fragmenst tartalmazó régiót szacharóz-sűrűséggradiens centrifugálással frakciónáljuk, és fágvektorba (pi, Charon 4A, Cheren. .28, XEMBL3, kEMBLí, stb.) inszertáijuk, A fágvektorral S, coli (pl, LE.392, NM539, stb.) sejteket transzformálva genomi könyvtárat hozunk létre, melyet az újrarendesődött VDO— vagy VJ-gént tartalmazó pozitív kiónok .azonosítása céljából - megfelelő próbák (H-'lán Jgén, L-lánc (k) J-gén, stb.] alkalmazásával végzett plakkhibridizációval, pl. a Benton-Davis eljárással (Science 196, 180- (197?) ] ssk.rínelünk, A kapott kiónok restrikciós térképének elkészítésével és nukieotidssekvencíájuk meghatározásával igazolható, hogy az újrarendeződött VH- (VD6-) gént vagy VL- (Va-j gént kaptuk-e,

A kimerizácíőra alkalmazott humán CH-gént és humán

CL-gént külön izoláljuk. Például, ha. humán IgGi-gyei ál 11•τ tünk elő kiméra antitestet, CH-génként cyi-gént, CL-génkén pedig €x~génfc izolálunk. Ezek a gének a humán genomi könyv tárból - próbaként a humán Cyi-génnek megfelelő egér—Cyl gén,, illetve a humán Qe-génnek megfelelő egér-CK-gén alkal mázasával (az egér és· emberi eredetű immungiobulin-géne nukleot idszekvenciája. közötti nagymértékű homológra kihasz náiásávai) izolálhatok.

A humán Cx-gént és “enhanoer-régiót tartalmazó DÚS fragmens eket humán λ Charon 4A Hae.IXI-AIul genomi könyvtár bői (Celi 15, 1157 (1378)] izoláljuk, próbaként, például az Ig,145-klón (Proc, Natl. Acad. Sci. USA 75, 4709 (1978) 3 kb-os Hindi 11/BamHI- fragmens ével és a MEPIO-fclón (Proo Natl. Acad. Sci.. USA 78, 474 (1981;) δ, 8 kb-os ScoRl fragmensével. Ezenfelül, miután a humán magzati hepatocita DNS-t HindiII-endonukleázzal emésztettük, és a fragmense.ke agarőzgél-elektroforéz.i.ssel frakcionáituk, X?88-ha 5,9 kb os fragmenst inszertálunk, majd a humán Cyl-gént a fentéb említett próbák alkalmazásával izoláljuk.

Sgér-VH-gén, egér-VL-gén, humán CH-gén és humán CL gén .alkalmazva., és figyelembe véve a promóter-régiót és a enhancer^-régiót, a humán CH-, illetve Cl-gént - megfelel restrikciós endonukleázok alkalmazásával, szokványos eijá rássál - az egér-VH-géntől, illetve egér-VL-géntői 3’ irányban expressziós vektorba (pl. pSVrgpt vagy pSV2neo inszertáljuk. Az egér-VH-gén/humán CH-gén és egér-VL-gén·/ humán CL-gén összetételű .kiméragének azonos vagy eltérő ex.

oressziós vektorba inszertálhafcők.

ϊί♦ » ·

Az ínszártáit kiméragérst hordozó expressziós vek tortok) protoplasztfúziős eljárással, DEAE-dextrán eljárás sál, kalcium-foszfátos eljárással vagy elektroporációvá antitesteket nem termelő mielómákba (pl. F3X63 üAgS'653 sejtekben vagy SF210-sejtekbei juttatható {ki be, A transz formánsokat - az expressziós vektorba inszertálfc r-e-ziszfcen ciagénnek - megfelelő hatóanyagokat tartalmazó tápközegbe tenyésztve szkrlneljük, miáltal a kívánt monokionáiis kimé raantítesteket termelő sejteket kapunk.

A kívánt monokionáiis kíméraantitesteket az azonos!

tort antitest-termelő sejtek tenyészeti feiüiúszőjáből izoláljuk..

A találmány szerinti humanizált monokionáiis antí test (komplementaritást meghatározó régió (CDR) áfüiteté sével' létrehozott antitest] génsebészeti módszerekkel elő állított monokionáiis antitest, közelebbről, olyan humán! záit monokionáiis antitest, amelyben a hipervaríábliis ré gió komplementaritást meghatározó régióinak egy része vág egésze egy nem humán emlősből (egér, patkány, hörcsög stb.) származó monokionáiis antitest hipervaríábliis régió iának komplementaritást meghatározó régióiból; a vsriábíii régió vázrégiói humán immunglobulin variábilis régióiána vázrégiőiból; a konstans régió pedig humán immunglobuli konstans régiójából származik,

A hipervaríábliis régió komplementaritást meghatároz régiói az antitest variábilis régiójának hípervariábiií régiójában találhatók; három olyan régióról van szó, amelyek közvetlenül és komplementer módon kötődnek az antigén hez (CDR1, CDR2 és CDR3;. A variábilis régió vázrégiői kifejezésen négy, viszonylagosan konzervált régiót értünk, amelyek a három komplementaritást meghatározó régiótól 5’irányban, 3-irányban vagy azok között helyezkednek el íFRl, FR2, FP.3 és FR4Í .

Más szavakkal; s humanizált monoklonális antitest olyan antitest, amelyben a teljes régió - kivéve a nem .humán emlősből származó- monoklonális antitest hipervariábílis régiójának komplementaritást meghatározó régiójának sgy részét vagy egészét - humán immunglobulin megfelelő régióival van helyettesítve.

A humán immunglobulinból származó konstans régió az egyes izotipusokra - IgG (IgCI, IgG2, l.gG3, IgC4), IgM, IgA., IgD és XgS - jellemző aminosav-szekvenciát tartalmaz. A találmány szerinti humanizált monoklonális antitest bármely izotípusba tartozó humán immunglobulinból - előnyösen humán IgG-bői - származhat. A humán immunglobulinból .származó konstans régió vázrégióivai szemben nincsenek különösebb megszorítások.

A találmány szerinti humanizált monoklonális antitest, például, a következők szerint állítható elő. Szükségtelen megjegyeznünk, hogy az ilyen monoklonális antitestek előállítására egyéb eljárások is alkalmazhatók.

Például, monoklonális egérantitestből származó humanizált monoklonális antitest génsebészeti eljárásokkal állítható elő (id·. a Hal 4-503458 számú, nem vizsgáit, közzétett japán szabadalmi leírást (JP-WA) és a Sho 62-296890 számú, nem vízsoált, közzétett Japán szabadalmi leírást **** V · (JP-A)1. Monoklonális egérantitestet termelő hibridőmékből legalább egy egér-iro®.ungXobulin H-iánc CSE-gént és legalább egy - egér-immunglobulin H-lánc CDR-génnek megfelelő egér-immunglobulin L-iánc CDR-gént izolálunk. Humán immunglobulin-génekből - ss egér-immunglobulin H-iánc ÜDR-génnek megfelelő humán i»unglobulin H-lánc-CDR kivételével - a teljes régiókat kódoló H~lánc-gént és - az egér-immunglobulin L-lánc CDR-génnek megfelelő humán immunglobulin L-iáncCDR kivételével - a. teljes régiót kódoló L-iánc-dént izoAz igy kapott, egér-immunglobulin H-lánc CDRgéniekeit és a humán immunglobulin H-lánc-gén (eke) t - az expresszáitatás lehetővé tétele érdekében - működőképesen megfelelő vektorba inszertáljuk. Hasonlóan, egér-immunglobulin L-láno: CDR-gén(eke)t és a humán immunglobulin L-iánc•gén. {eke) t egy másik, alkalmas expressziős vektorba inszertáljuk. Más módon, az egér-immunglobulin H-iánc CDRgéniekéit és a humán immunglobulin H-lánc-gén (eke) t, illetve as egér-immunglobulin L-lánc CDR-gén(eke)t és a humán immunglobulin L-iánc-gén(eke)t azonos expressziős vektorba inszert álhatjuk.· Az igy előállított expressziős vektorral gazdasejteket trans2formálunk, miáltal humanizált monoklonáiis antitestet termelő transzformánsokat nyerünk. A transzformánsok tenyésztése révén a kívánt, humanizált monokionális antitestet a tenyészeti felüiússőbői izolálhatjuk.

A találmány szerinti “humán monoklonális antitest olyan immunglobulin, amely valamennyi régió (ideértve a H! 8 lánc és a.z L-lánc variábilis és konstans régióját; humán immunglobulinból származik.

A humán antitest - a poriklónálís és monoklonális antitestek előállításával kapcsolatban fentebb leírtakhoz hasonlóan - transzgeníkus állat antigénnel végzett inaaunizálásával állítható elő, mely transzgenikus (nem humán; állat (például egér) megfelelő lókuszába, például, legalább humán immunglobulín-gén(ek) van ínak) integrálva.

Humán antitesteket termelő transzgenikus egér létrehozását illetően Id.: Natúré Genetics 7, 13 (1994); Natúré

Genetics 15, 146 (1997); JP-WA Hal 4-504365 és JP-WA Kei 7503137; Nikkel S-cience 6, 40 (1395); WOS4/255S5 számú nemzetközi közzétételi irat; Natúré 3 68, 856 (1994); és JP-WA

Hsi 6-50023,3.

Szén túlmenően, alkalmazható a emberi eredetű protein transzgenikus tehén vagy sertés tejéből történő előállítására kifejlesztett eljárás is [Id. Nikkel Science, 73-84. oáo. í. z397 , április) j ,

A találmány leírásában alkalmazott ”egy antitest része kifejezésen monoklonális antitest részleges régióját értjük, közelebbről, F(ab*)₂~frsgmenst, Fab^!-fragmenst, Fab-fr&gmenst, Fv-fragmenst (antitest variábilis fragmense;, sFv-fragmenst, dsFv-fragmenst (diszulfid-kötássel stabilizált Fv-régió; vagy dáb-fragmenst (egydoménes antitest) (Exp. Opin, Ther. Patents 6(5), 441 (1996)].

Az Fiald)?- és Fab’-fragmens immunglobulin (monokionális antitest) protaázzai - pl, pepszinnel és papaínnal végzett kezelésével állítható elő. Ezek a antitest-fracmen79 * # ♦ « sek as immunglobulin - két 'K~·lánc kapocsrégiöi között lévődíszülfi.d-'hibak közelében történő - hasításával jönnek létre. Például, a papain az IgG-t a két H-lánc kapocsrégiöi között lévő díszfulfid-kötésektől up.st.ream” irányban hasítja, miáltal két homológ antitest-fragmenst hoz létre, amelyekben egy L-lánc variábilis régióból (VI) és egy Llánc konstans régióból (CL) állő L-lánc és agy H-lánc variábilis régióból (VH) és egy CHyl-régióből (a H-lánc konstans régiójának γΙ-régiója) álló H-lánc kapcsolódik egymáshoz óiszulfid-kötéssei (C-terminálisuknál1. Mindkét homológ antitest-fragmenst Fab'-fragmensnek nevezzük. A pepszin az IgG-t a két .H-láncban. lévő kapocsrégiők közötti diszulfidkötésaktői -downstream” irányban hasítja, miáltal valamivel nagyobb antítest-fragmens képződik, mint az a fragmens, amelyben a fenti Fan*-fragmensek a kapocsrégiőn keresztül kapcsolódnak egymáshoz.. Ezt az antitest-f ragmenst F(ab’) ₂-fragmensnek nevezzük.

A találmány szerinti gyógyászati készítmény a fentebb említett, találmány szerinti poiipeptídek bármelyikét; ilyen polipeptideket tartalmazó homodímer molekulát, polipeptid-fragmenst vagy fúziós poiipeptidet.; fúziós poiipeptidet tartalmazó homodímer molekulát; vagy antitestet vagy antItest-fragmenst; valamint gyógyászati szempontból elfogadható hordozót tartalmaz.

A gyógyászati szempontból elfogadható hordozó kifejezésen kötőanyagot, diluens-t, töltőanyagot, szétesést elősegítő anyagot, stabilizátort, tartósítószert, puffért, emulgeálószerfc, aromát, színezéket, édesítőszert, viszkozitest növelő anyagot, 1sesifőanyagot, oldékonyságot fokozó anyagot és egyéb adalékanyagokat értünk. Az ilyen hordozók közül egy vagy több alkalmazásával a gyógyászati készítmény tablettákká, pirulákká porokká, szemcsecKe, xnjakciórxa, oldatokká, kapszulákká, pasztillákká, slixirefcké, szuszpenzlókká, emulziókká vagy szirupokká alakítható, A gyógyászati készítmény perorálísan vagy parentarálísan adagolható, A oarenterálís adacoiásra alkalmas eovsb alakok közé tartoznak a külsőleg alkalmazandó oldatok, a végbélkúpok ct pesszárlumok, melyek egy vagy több aktív összetevőt tártál .UÍCt súi.i<h Λ. <

A gyógyászati készítmény adagolása a páciens körétől, nemétől, testtömegétől és tüneteitől, a kezelés hatásától, a beadás módjától, a. kezelés Időtartamától és a készítményben lévő aktív összetevőtől (polípeptid vagy antitest) függően változó, A gyógyászati készítményt felnőttnek rendszerint alkalmanként 10 ^g~töl 100ö mg-ig (vagy 10 hg-töl 500 mg-ig) terjedő dózisban adagoljuk, Bizonyos esetekben az alkalmazott dózis - különböző körülményektől függően - kisebb is lehet, más esetekben viszont a fentebb megadottól nagyobb dózisok adagolására lehet szükség.

Injektálható készítmény előállítása céljából az antitestet gyógyászati szempontból elfogadható, nem. toxikus hordozóban, például fiziológiás sőoldatban vagy kereskedelmi forgalomban beszerezhető, injektálható desztillált, vízben, a hordozó térfogatára vonatkoztatva 0,1 pg/ml-től lö mg/ml-ig terjedő koncentrációban oldjuk vagy szüszpendáijuk. Az igy előállított injektálható készítmény a kezelésre rászoruló páciensnek 1 pg/testtömeg-kílogrammtól 100 mg/~ testtömeg-kilogrammig, előnyösen 50 μσ/testtömeg-kilogrammtöl 50 mg/testtömeg~kilogrammig terjedő -dózisban, naponta egyszer vagy többször adagolható. A beadás történhet intravénás, -sxübkután, intradermáiis, intramuszkuiáris vagy intraperitoneálís injektálással, előnyösen intravénásán.

A injektálható készitmény nem vizes diluensben - pl. propilén-glikölban, polietiién-giikolban, növényi olajban (pi. olívaolajban} vagy alkoholban (pl. etanolban; - szuszpenzióként vagy emulzióként is előállítható.

A injektálható készítmény baktériumokat át nem eresztő filteren végzett szűréssel, baktericíd hatóanyaggal végzett elegyítéssel vagy sugárkezeléssel sterilizálható. Az injektálható készítmény olyan alakban is előállítható, amely közvetlenül a felhasználás előtt oldható fel; így pl. liofílizálással szilárd, halmazállapotú, steril készítményt állíthatunk elő, amely felhasználás előtt sí :eri

Iáit vízben vagy más oldószerben oldható.

A találmány szerinti gyógyászati készítmény különböző

- a limfoeíták (mint pl. a T-sejtek} aktiválása és az aktivált iimfocíta-funkoiék szabályozása által okozott - autoimmun betegségek, allergiás betegségek vagy gyulladásos betegségek kezelésére vagy megelőzésére alkalmazható. Az ilyen betegségek példáiként említhető a raumaszerü izületi gyulladás, a szkierözis multiplex, az autoimmun pajzsmirigy-gyű11adás, az allergiás kontakt bőrgyulladás, a krónikus gyulladásos dermatosis (pl. a líchen pianush, a szisztémás erítémás lupus, az inzulinfüggő díabetes meilitus és a ρ ί κ ke#. y somö r,

A találmány szerinti gyógyászati készítmény különféle betegségek tüneteire vonatkozó terápiás hatása hagyományos eljárással# adott betegség ismert áilatmodeligének történő adagolással tesztelhető.

Az ilyen áilatmodsllek példái közé tartozik & humán szisztémás eritémás lupus (3LE) modelljeként szolgáló (NZS/báW)Fi-egér [Science 125# 1225 (1394)]; a szklerőzis multiplex £KS.) modelljeként szolgáló kísérleti allergiás encephalomyeiitis (EAE) (ő. Clin. Invest. 95# £783 (1995)]; az inzulinfüggő diabetes mellitus (1DDM) modelljeként szolgáló, nem elhízásos díabeteses (dOb) egér [J. Sxp. Med. ISI# 1145 (1995)]; a veseglomerulus alapmsmbrán immunitás okozta vesegyulladás patkanymodeilje £Goodpasture-féie vesegyulladás modellje; (Sur. J. Immunoi, 24 £ő) , 1243 (1994; jt és a humán reumaszerű izületi gyulladás áiiatmodelljeként szolgáló DBA/l-egér [Eur. ű, Immunoi. 25# 2320 (1995)],

A következőkben az ábrák rövid leírását ismertetjük.

Az I, ábrán FTL435~sejtek JTT-1-antltest által indukált aggregáoiöjának mértékét bemutató fényképek# illetve a sejtaggregáciö JTT--antitest általi gátlásának mértékét bemutató fényképek láthatók,

Az i/a ábrán a sejtek hibrid.őma-feiülúszó hiányában megfigyelt állapota; az 1/b ábrán a sejtek JTT-l-antitest által indukált aggregációs állapota; az l/o ábrán a sejtek ICAŰ-1 elleni antitest és J2T-1-antitest jelenlétében megfigyelt aggregáoiős állapota; az IZd ábrán pedig a sejtek

JTT-.2-.anfitest és JTT-l-antitest jelenlétében megfigyelt aggregációs állapota látható.

A 2« ábrán az FTL435~sejfek és aktivált patkányiimfotalasztok JTT-l-antitsst által indukált aggregáeiójának mértékét bemutató fényképek, illetve a -sejtaggregáció JTT—aotltsst általi gátlásának mértékét bemutató fényképek láthatók .

Az (a) ábrán az FLT43S~.se3 tek antitest hiányában megfigyelt állapota; a (b) ábrán az FTL4.35—sejtek FMA jelenlétében megfigyelt állapota; a (ci ábrán az FTL435~sajtek JTT-l-antitest jelenlétében megfigyelt állapota; a íd) ábrán az FTL435-sejtek LFA-1 elleni antitest és JTT-1antitest jelenlétében megfigyelt állapota; az fai ábrán az FTL435-sejtek CDI-8 elleni antitest JTT-l-antitest jelenlétében megfigyelt állapota; az (f) ábrán as FTL435~sajtek ZCAM-1 elleni antitest és JTT-l-antitest jelenlétében megfigyelt állapota; a íg) ábrán az aktivált limfoblasztok antitest hiányában megfigyelt állapota; a (hi ábrán az aktivált limfoblas2tok PMA jelenlétében megfigyelt állapota; a. íi) ábrán az aktivált limfoblasztok JTT-1-antite.st jelenlétében megfigyelt állapota; a íj) ábrán a2 aktíváit limfoblasztok LFA-I elleni antitest és JTT-l-antitest jelenlétében megfigyelt állapota; a ík) ábrán as aktivált iimfobiasztok CDI8 elleni antitest JTT-1-antitest jelenlétében megfigyelt állapota; az (1) ábrán pedig az aktivált limfoblasztok 1CAM-1 elleni antitest és JTT-l-antitest jelenlétében. megfigyelt áilaoota látható,

S4

A 3. ábrán a J7T-1-antigén és JTT-2-antigén - különböző sejtekben áramlási citómétőrrel - meghatározott expressziős mintázatát mutatjuk be.

A 4. ábrán a Jli-l-antigen - különböző Iimfocíta-sejtekben áramlási eítóméterrel meghatározott - expressziós mintázatát mutatjuk be.

Az 5. ábrán a J7T-1-antigén SDS-PAGE analízissel kapott elektroforetogramját mutatjuk be.

A 6, ábrán patkánythymoeiták tisztított JTT-i-antígénnel bevont míkrotiter-tálcához történő tapadását bemutató fényképek láthatok.

A β/a ábrán a sejtek JIT-l-antigénnel be nem vont tálcához történő tapadása; a β/b ábrán a sejtek JTT-1antigénnel bevont tálcához taoadása; a G/c ábrán a

- antitest hiányában ~ történő sejtek JTT-l-antigénnei bevont tálcához - JTT-l-antitest Eab-fragmensei jelenlétében történő tapadása; a S/d ábrán a sejtek JTT-I-antigénnel bevont tálcához - JET-2-ancitest és a Jll-i-antí- ' ~ ' fragmensei jelenlétében - történő tapadása látható

A 7. ábrán a tisztított 1TT-1-antigénnel bevon cához tapadó timocíták - fluoreszcencia-intenzitás alapján meghatározott - relatív sejtszámát mutatjuk be« Az á ”Ag<-)” jelentése a JTT-l-antigénnel b megfigyelt relatív sejtszám; Ag(é)^,s jelentés: antigénnel bevont tálcán - antitest hiányában - megfigyel relatív sejtszám; Agj-H + JTT-I-Fab” jelentése a JTT-i antigénnel bevont tálcán - JTT-l-antitest Fab-fragmense jelenlétében - megfigyelt relatív sejtszám; és ^!!Ag(e}

uk be«	Az	ábrán
nem von	t	tálcán
en t é s e	a	γ >γ< «<

* *»** **·

JTl-l-Fab e JTT-2’* jelentése a iT7~I-antigénnel bevont tálcán - -JTT-l-anfeitest Fab~fragmsnssi és JTT-2-antitest jelenlétében - megfigyelt relatív sejtszám.

A 8. ábrán a patkány JTT-1-antigén és a patkány JTT2-antigén - patkány JTT-l-antigént kódoló cDNS-sel transzformált - COS~sejtekben áramlási eitometriával megállapított expressziós mintázatát mutatjuk be.

A 9. ábrán a JTT-l-antigén aminosav-szekvenciájának hiáropátiás görbeanaiízíssel kimutatott - strukturális jellemzőit mutatjuk be.

A 10. ábrán a humán, patkány- és egéreredetű JTT-lanfcígén és a mutáns patkány JTT-l-antigén aminosav-szekvenoiája közötti homolögíát mutatjuk be.

ábrán a humán JTT-1 -antigén, a humán CD28molekula és a humán CT.LA- 4-molekula aminosav-szekvencia ja közötti homoiógíát és e molekulák motívumainak konzerváltsági állapotát mutatjuk be.

A 12. ábrán a humán JTT-l-antigén, a humán CD28molekula és a humán CTuA-4-molekula másodlagos szerkezetét és a közöttük lévő hasonlóságokat mutatjuk be.

A 13. ábrán az egéreredetű JTT-l-antigént kódoló genomi DNS sematikus szerkezetét mutatjuk be.

A 1-4. ábrán a patkányeredetű JTT-l-antigén aminosavszekvenciája és alternatív spiícing eredményeként létrejött mutánsának aminosav-szekvenciája közötti különbségeket mutatjuk be.

A 15. ábrán a humán perifériás vérből származó limfociták humán JTT-l-antigén elleni monokionáiis antitest által indukált szaporodásának mértékét mutatjuk be La szaporodást a *H~timiáin felvétele alapján mértük; az Ytengelyen a H~t isii din felvett mennyiségét ídpm; ábrázolá X X < V 1 ]U&j φ

A 16. ábrán a JTT-I-antigén elleni monokionális antitest kísérleti allergiás agy-gerincvelőgyuliadás {SAS} patkánymodelljében kifejtett terápiás hatását mutatjuk be. Az Y-tengelyen a betegség tüneteinek pontozott súlyosságát, mig az X-tengelyen az EAE indukálása céljából végzett immunizálás után eltelt napok számát tüntettük fel.

A 17. ábrán a JTT-I-antigén elleni, monokionális antitest glomerulonephritis· patkánymodeiTjében kifejtett terápiás hatását mutatjuk be. Az Y~tengelyen a viseletbe kiválasztott proteinek mennyiségét, az 'X-tengelyen, pedig a glomerulonephritis indukálása céljából végzett immunizálás után eltelt napok számát tüntettük fel.

A 13. ábrán a patkányeredetú JTT-I-antigén extraeelluláris régióját ás a humán XgFc-régíőt tartalmazó fúziós protein (rJTT-i-IgFo) protein-A-Sepharose affinitás! oszlopon végzett tisztításának, hisstogramját mutatjuk be.

a IQ .áhHn a? Τ’Γ'Τ— 1 ~ T re íi'jT-iAe y\y y·. -t- λ í rs CnC! — ΟΙΟΡ bT. i. .j· .» a. Ιάα a di & λ. \«* λ. 1 .1. 1. a V». 2b -χ- tb v tv. Ί. a a *.-* ó v .biv n· analízisével kapott elektroforetogram fényképét mutat

A 20. ábrán a humán JTT-1-antigén extracelluláris régióját és a humán IgFc-régiót tartalmazó fúziós protein ÍrJTT-l-IgFc) protein-A-Sepharose affinitást oszlopon végzett tisztításának hisztogramját mutatjuk be.

A 21. ábrán a hJTT-l~IgFc fúziós protein S'BS-PAGE analízisével kapott eiektroforetogram fényképét mutatjuk bö .

A 22. ábrán a genomjában patkányeredetű JTT-1-antigént kódoló cDNS-t hordozó: transzgenikus egér létrehozására alkalmazott génbej untató (célbajuttató) vektor szerkezetét mutatjuk be.

A kővetkezőkben a találmány szerinti megoldást kísérleti példákon keresztül szemléltetjük, azonban a példákban leírt speciális megvalósítási módok nem jelentik a. találmány oltalmi körének korlátozását.

Monoklonális antitestek előállítása

Az antitest-termelő hifcrídómákat Kohler és mtsai, eljárásával tömöri és mtsai.: Blood 81, 101 (1993)1, míg a monoklonális antitesteket Kannagi és mtsai. eljárásával (Handbock of Experimental Immunoiogy, 4. kötet 117.21117.21 (1986;) állítottuk elő.

Először SALS/c-egerek talpába. - immunizáló antigénként ~ FTL435 thymoma-sejbeket adtunk he. Az immunizálást a 0., 7., 14. és 28. napon 10'' sejt/egér mennyiségben végeztük. Az első immunizálás alkalmával az antigént Ereund-fél-e komplett adjutánssal együtt adtuk be. Az utolsó immunizálás után két nappal az egerek nyirokcsomóit kivettük, és - a monoklonális antitesteket termelő- hibridómák előállításának szokványos eljárásának alkalmazásával - FAI egérm.ielómaseitekkel (JCR No. 30113; Stocker és mtsai.: Rés.

Di.sclo.sure 217, 155 (1932)] fuzionált attak.

2. példa

A hibridómák szkrxnelése és a monok lónál xs antitestek kara k téri sálása

Az 1. példában leírtak .szerint előállított hibrídómákat - a hibridómák tenyészeti fe luxus zójában. felhalmozódott antitestek - immunogénként alkalmazott FTL435~sejtekre gyakorolt hatásának vizsgálatával szkríneltük. 96 üregű míkrotiter-tálca üregeibe FTL435-se.jtsfcet (5 x 10 sejt/ml; 0,1 ml) helyeztünk, és azokat - az egyes hibridómák tenyészeti feiülószójának (10 pg/ml) jelenlétében - 37 °C~on egy óra hosszat tenyésztettük. A. OTT-l és JTT-2” hibrídómskiónrs kapott eredményeket az 1., illetve 2. ábrán mutatjuk

XV ·χ· »

Kimutattuk, hogy a JTT-l-hiforidőmaklón által termeit monoklonális antitest (OTT-i-antítest) jelentős mértékben agglutinálta az FTL435~sejteket (X/b és 2/c ábra), míg a JT?~2~antitsst hozzáadása erőteljesen gátolta az FTL435sejtek - JTT-X-antitest által indukált - aggregácíóját. Kontrollként olyan kísérleteket végeztünk, amelyekben a sejtekhez hibridőmatenyészeti fsiülűszét nem adtunk (i/a és 2/a ábra).

Annak meghatározása- céljából, hogy az FTL435-sejtek JTT-1-antitestte.l indukált - aggre-gációját az intercelluláris adhéziós molekula-! (XCAH-I) és a limfoclta-funkcióval asszociált antigén-1 (LFA-X) egymáshoz történő kötődése (ami a seitadhézió jellemző reakcióűtvonala) révén bekövet« ·^; “ ·« «<. ♦ * - * ,. . * * .

' »» »»»< . ^k «»· » .

»· \ * < »*« késő sejtadhéz.iő okozza-e, az FTL435~sej£eket patkány-ICAK1 elleni lA29~antitast (10 ug/ni; IgGI}, illetve patkányLEA-l elleni antitest (10 p.g/l; lgC2a) jelenlétében (JTT-j antitesttel együtt), 37 *C-an egy óra hosszat szaporítottuk.

FTL435-sejtek	ΤΓΓ< 'J X	T-l-antitest	által indukált aggra-
sem az 1CAM-I	ejt	leni antites	t, sem az LEA-i elleni
nem. gátolta	•t i /	c ábra, anti	-ICAM-1 antitest; íl-
d ábra, anti-L	orys χ λ''!’·*'	1 antitest) .

A JTT-1-antitest sejtagglutinációt indukáló képességének további vizsgálata céljából, a fentiekhez hasonlóan, a JTT-i-antitest eoncanavalin-A-val aktivált patkányÜmfoblssztsej teket agglutináló képességét vizsgáltuk. Az eredményeket a 2. ábrán mutatjuk be.

Hasonlóan az B’TL435-sej tekre gyakorolt hatáshoz, az aktivált limfobiasztsejtek aggregációját JTT-I-antitesttel végzett stimulációval indukáltuk (2/i ábra}, Az aktivált limfobiasztsej tek JTT-l-antitesttel indukált aggregációját nagyrészt gátolta az anti-LFA-I antitest és az anti-ICÁM-1 antitest (2/j, illetve 2/1 ábra), azonban részleges aggragáciö előfordult.

Ahogy az a kontroll kísérletből nyilvánvalóvá vált (ahol a sejtekhez nem. adtunk antitestet; Id. 2/g ábra), az aktivált iimfociták (aktíváit iimfoblasztok) a sejtadhézlón keresztül nem aggregálődnak, hacsak nem stimuláltuk őket az LFA-l-et aktiváló forboi-mirisztát-acetátfal (AMA; 2/h ábra) vagy JTT-1-antitesttel (2/i ábra). Ennek megfelelően, <A χ.;

tény, hogy az LFA-1 elleni antite a

T-r-an * κ «« «** χ ♦ ♦ <

testtel végzett stimuláció- hatására részlegesen, gátolta a sejtaggregá-ciót, arra utal, hogy az aktivált iimfoblasztsejtekben az LFA-i~et a JTT-l-antitest aktiválta, továbbá, hogy a JTT-l-antitest által felismert molekulák valamilyen szígnálátvitelben játszanak szerepet.

A JTT-1 és JTT-2 hiferidóma-kiónt a Budapesti Szerződés értelmében., 1996., október 11-én, a National lns-H of Bioscience and. Humán Technology, Agency of Industriai Science and Technology, Ministry -of International Trade and. Industry-nál (1-1-3, Higashi, Tsukuba-shi,· Ibaraki, Japán) FEAM RP-57Q7, illetve FSPM BP-5703 deponálási, számon helyeztük letétbe.

A monoklonális egéranfcitest-ízotípus azonosító reágsnskészlet (Amersham) alkalmazásával végzett vizsgálattal megállapítottuk, hogy a hibrldomák által termelt monoklonáIísí antitestek (JTT-1- és JTT-2-ant.itest) izotipusa egyaránt IgGl volt.

A JTT-1- és JTT-2-antitest, reaktivitása különböző sejtekkel A JTT-1- és JTT-l-antitest által különböző sejtekben felismert molekulák exp-resszíő-s mintázatának tanulmányozása céljából az antitestek, különféle sejtekre vonatkozó reaktivitását vizsgáltuk. A JTT-1- és JTT-2-antítest által felismert molekulákat JTT-l-antigénnek, illetve JTT-2'-antigénnek nevezzük..

5-10 hetes., 150-250 g test tömegű Wistar-patkányt dietil-éte.rrel elaltatva leöltünk, thymusát és lépét celiofcóSÍ ralival kivettük, és homogenizéiással sejtszuszpanziot állítottunk aló. Az igy kapott l.éps-ej tekét - 2 ug/ml conc&navalin-A-t és lö % magzati borjűszárumot (FCS! tartalmazó RPMX-lSAQ-tápközagben 37 °C-on. három napig tenyésztve aktivált limfofoiasztokat hoztunk létre.

Az FTL435-sej fceket, a ttymoeitákat, 1épsejteket és aktivált iimfoblasztokat (mindegyikből 5 x 10^s sejt} JXX-1es JTX-2-antitesttel, majd FITC-vel jelölt antí-egér IgGvei tCappai) reagáltattűk. A megfestett sejtek fluoreszcencia-intenzitását SPlCS-EIlte áramlási citométerral mérφ.;: A

LU-K >

Az eredményeket a 3. ábrán mutatjuk be-. FTL435-sejtskben a JTT-i- és JTT-2-antigén jelentés mértékű expraszsziöját figyeltük meg. Miközben az antigének a thymooifákban expr ess záródtak, lépsejtekb-en alig tapasztaltunk expressziét. Ugyanakkor, a lépsejtek concanavaiin-A-val végzett stímniál&sávai kapott, aktivált iimfoblasztokhan a JTX-1- és JTT-2-antlgén jelentős mértékben expresszáiódott, sót, a két antigén expressziós mintázata mindkét sejttípusban hasonló volt. Ezek az eredmények azt jelzik, hogy a JXX-1- és JTX-2-antigén azonos molekulák.

4. példa

A JTT-1-antitest különböző limfocita-sejtekre vonatkozó reaktivitása

A JXT~i~antitest által felismert molekulák -(J7T-1anfcigén} expressziós mintázatának különféle limfocitasejbekben történő vizsgálata céljából a JTT-I-antítest 92 * ·♦ # kétféle (Wístar és F344) patkányból vett - nyirokcsomókra, 1épből származó T-Ilmfoblasztokra és iépből származó Blirnf obi asz tokra vonatkozó· reaktivitását tanulmányoztuk.

5-10 hetes, 150-250 g test tömegű Wistar- és. F344patkányokat dietil-éterrel elaltatva leültünk, thymusukat és 1 épüket ce 1;ío tömi á val kivettük, és homogenizálássa-l sejtszuszpenziót állítottunk elő. Az így kapott lépsejtszuszpenziót - 2 μα/ml concanavalin-A-t és 10 % magzati borjűsz-érumot (FCS) tartalmazó - REMI-164 Ö-táp közegben 3? ®C-on három napig tenyésztettük. A kétféle patkányból származó, aktivált T-limfoblasztokat és aktivált B-l.imfoblasztokát egy és három napos tenyésztés után kaptuk.

A 1- és B~limfobissztokat (mindegyikből 5 x 10 sejt) patkány-T-sejt elleni, biotinnal jelölt antitesttel, illetve patkány B-sejt elleni, biotinnal jelölt antitesttel (10 μσ/ml; Seíkagakn Corp.s, majd fikoeritrinnel jelölt sztreptavidinnel reagálhattuk. A sejteket ezután 10 μσ/ml, FITCvei jelzett JTT-l-antitesttel reagálhattuk. A megfestett sejtek fluoreszcencia-intenzitását SPICS-Elíte* áramlási eltörnétérrel mértük.

Az eredményeket a 4. ábrán mutatjuk be. A Wistar- és

F344-pat	kényből származó, ak
aktíváit	B-iimfofolasztokban -
utáni. 1.	naptól kezdve - a J1
expressz	/lóját figyeltük meg.
antigén	expressziós mintázata
csaknem	tökéletesen azonos vol

JTT-1 - ant 1 g én j e 1 ént ő s mé r t é kő * * * , ««*«

A JTT-l- és ü'TT-2-antigén karskterizálása ímmunpreoipítációval

A JTT~i~ és JTT-2-anfigent FT1435~sejtek alkalmazásával végzett imaunprecipitációvai karakterizáltuk.

1) Bíotinilált, oldható sejtfeiületi molekulák előáílltása

Az F?L435-sejteket foszfátpuffereit sóoldattai mostuk, majd - 100 gg/ml NHS-biotint és 0,1 M HSFES-puffart (pH = 8,0} tartalmazó ~ fiziológiás .sóoldatban (1 x. 10^? sejt/mi mennyiségben) szusspendáltuk, és a sejtszuszpenziőt szobahőmérsékleten 40 percig inkubáltuk. A sejteket foszfátpuffezeit sóoldattai háromszor mostuk, lizálópuffért fi % NP-40, 10 ni? Trie-HCi (pH - 7,4), 0,15 M NaClj adtunk hozzájuk (5 x. lö' sejt/ml sejtsörűs-éget beállítva) , majd az •elegyet a sejtek feltárása céljából 30 percig 4 °C”on ínkuháltuk. A sejtlizátumot lecentrifugáltuk, és a bíotinilált, oldható sejtfelületi molekulákat tartalmazó felülüszót -30 '^sC-on tároltuk.

2) Xmxaunprecipitáció és SSS-PAGF analízis

Az 1. példában leírtak szerint előállított ÖTT-ihíbridomaklón tenyészeti feiülüszójából szokványos eljárással tisztított JTT-l-antitest mintát 2 mg/m.1 arányban protein-S-Sepharose gyöngyökkel elegyítettük, és az antitest gyöngyökhöz történő kötődésének elősegítése céljából az elegyet 4 *C-on egy óra hosszat inkubáltuk. A gyöngyök lemosása után a gyöngyök 10 μΐ-éhez 500 μ! bíotinilált FTL43S~sejflisátumot adtunk, és az elegyet 4 °C~on két óra hosszat hagytuk reagálni. A gyöngyöket ezután lizálópuffer34 rei háromszor mostuk, majd 50 gl glükanáz-puffért (0,15 % SDS-t tartalmazó nátrium-foszfát puffer (pH ~ 7,0)1 adtunk hozzájuk, és az szegyet az antitest-kötött gyöngyök által befogott” molekulák eluálása céljából forraltuk, Az igy eluált frakcióhoz 1,25 % ΝΒ-40-et és 20 egység/mi N~ glükanázt adtunk, és az eiegyet - az M-kötésű cukorláncok emésztése céljából - egy éjszakán át reagáltattuk.

Az eluált minta 5 ul-éhez azonos térfogatú, SDS-RAGE analízishez alkalmas mintapuffert (Enprotsch) adtunk (2merksptc-etanoi jelenlétében vagy hiányában), és az eiegyet felforraltuk, Eiektroforézís után a gélt PVűF-msmbránra másoltuk, a membránt 3 % szarvasmarha szérumaibumínt tartalmazó foszfátpufterelt sóoidattai blokkoltuk, majd - a JTT1-antitest által befogott, biotíniiáit, oldékony sejtfelüleci molekulák kimutatása céljából - peroxidázzal jelzett sztreptavidinnel reagáltáltűk. A kimutatást ECL-rendszer (Amersham) alkalmazásával, a használati útmutatás szerint végeztük,

Az eredményeket az 5, ábrán mutatjuk be. Az ETL435sejteken lévő - JTT-1-antitest által felismert - molekula (JTT-l-antigén) molekulatömege nem redukáló feltételek mellett kb. 47 kS (5. ábra, míg redukáló feltételek mellett kb. 24 kD és 23 kD volt (5. ábra, (a-)]. Az N~ kötésű oukoriáncok lahasitásának eredményeként (5. ábra, ^f’+N~gly”) a JTT-l-antigén molekulatömege nem redukáló feltételek mellett kb. 36 kD-hoz, mig redukáló körülmények között kb. 20 kD-hoz közelített. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a JTT-l-antigén olyan dimert alkot, amelyben » X « Φ ·*>' * ugyanazon core”-proteinek eltérő cukrokat tartalmaznak,. A JTT-2-antltest alkalmazásával végzett, teljesen azonos kísérletben ugyanezeket az eredményeket kaptuk. Ezeket az adatokat a 3., illetve a 7, példa eredményeivel összevetve arra a következtetésre jutottunk, hogy a JTT-l-antigén (a JTT-1-antitest által felismert molekula) és a JTT-2-antigén (a JTT-2-antitest által felismert molekula) eoymássai azoFatkány-thymociták tisztított JTT-1-antigénhez történő adhéziójának vizsgálata; ^-terminális analízis.

A következő kísérleteket annak vizsgálata céljából végeztük, hogy a JTT-i~antitest által felismert molekula ;JTT-l-antigén) adhéziós molekulaként funkcionál-e. Ezenfelül; a JTT-l-antigén N~termináiís aminosav-szekveneiájának analízisét is elvégeztük.

1) JTT-i-antltest-affinitási oszlop előállítása

Az 1. példában leírtak szerint előállított JTT-Íhibridömaklön tenyészeti felülúszójából szokványos eljárással tisztított JTT-l-antitest mintáját <2 ml oldatban 2 mg antitest) 1 mi protein-G-Sspharose gyantával elegyítettük, és az elegyet 4 °C-on egy óra hosszat reagaitattuk. A gyantát háromszor 200 mM tríetanol-aminnal (pH - 8,2) mostuk, a JTT-l-antitest gyantához történő kováién maga

5? T* ,·*< <

sének elősegítése	céljából	~ szobahőmérsékleten egy	óra
hosszat 10 mM	dimetii-p	imelimídátot (uMP) tartam	sazó
t r i e t a no1-aminban	í::: S / Cf / sü	) inkubáituk.

í · ♦ « X í » ♦·»» ♦ ♦ i

2) JTT-1-antigén. tisztítása.

Az F?L43S-sejtokét 10 % magzati borjúszérumot tartalmazó RMPI164Q-tápköregben tenyésztettük. A sejteket centrifuga lássa! összegyűjtöttük, és az üledéket foszfátpufterelt sóoldattal háromszor mostuk.. A mosott üledékhez annyi iizálópuffert (1 % NP-40·, 10 sói Tris-HCl (pH « 7,4), 0,15 M NaCI) adtunk, hogy az elegy sejtsűrűsége 5 x 10' ssjt/ml legyen, majd az elegyet a sejtek lizáiása céljából 4 ^öC-on 30 percig reagáltattuk. A sej tlizátumot lecent.ri fugái tűk, és az oldható sejtfeiületi molekulákat tartalmazó felülúszót -80 ^cC-on tároltuk.

A lízátumot (400 ml) a JTT-l-antitest-affinitási oszlopra töltöttük, az oszlopot 50 ml üzálópufferrel és 20 ml foszfátpufferelt sőoldattal mostuk, majd a JTT-'l-antigént 0,2 M glioin-puffersl (pH « 2,8) eluáltuk. Az élúálódott JTTrl-antigént 1 hí Tris-puf ferrel semlegesítettük, majd -80 ®C-on tároltuk.

3) A JTT-l-antígén N-terminális aminosav-szekvénciáiának meghatározása

A tisztított JTT-1-antigént SDS-PAGS analízisnek vetettük alá, és N-terminális aminosav-szekvenciáját a szokványos eljárással határoztuk meg. Az eredmények azt mutatják, hogy a JTT-l-antigén Glu-Leu-Asn-Asp-Leu-Ala-Asn-HisArg szekvenciát tartalmaz.

4) Agnezros Kísérlet öt-tíz hetes Nistar-patkányt (150-250 g) diétáiétares altatással leöltünk, thymusát celiotómiával kivettük, majd thymocita-szuszpenzió előállítása céljából homo97 * * * * * Φ Χ Χ· * * #Φ Φ Φ ♦ φ φ ΧΦ φ φ φ φ Μ>φ genizáltuk. A szuszpenziőhoz 10 uM z’tó’-diőkarboxi-etii;karboxi-f luore-sscein-te traacstoxi-met il-észtert (SCECF-AM; Molecular Probes) adtunk, és az -elegyet - a thymociták fluoreszcens jelölése céljából ~ 30 percig 37 ®c-cn inkubáituk. A sejteket fossfátpufferelt sóoldattal mostuk, és 10 % magzati borjúszérumot tartalmazó RPMI1640~tápk-özegben. - 2 x 10' sejt/ml sejtsűrűségben - szuszpendáltuk.

üregű ErlSA-tálca üregeit egy éjszakás kezeléssel a 2. pontban leírtak szerint kapott, tisztított JTT-ia.n ti génnel (üregenként lö μΐ) vontuk be. A tálcát foszfátpuffereit só-oldattal mostuk, majd mindegyik üreghez. 200 μί ~ 3 % szarvasmarha, szérumaibumint tartalmazó - foszfátpuffarait. s-öoldatot adtunk. A tálcát ismét fossfátpuf tereit sóoldattal mostuk, majd az üregekhez (I; csak fluoreszcensen jelölt thymocitákat (2 x lö⁷ sejt/ml; 0,1 ml;; (2; fluoreszcensen jelölt thymocitákat (előzővel azonos sejtsürűségben? és szokványos eljárással előállított JTT-l-antitest Fab-fragmenst (5 pg/ml/; vagy (3, fluoreszcensen jelölt thymocitákat (előzővel azonos sej-^sűrűségben), szokványos eljárással előállított JTT-l-antitest Fab-fragmenst (5 pg/ial) és JTT~2~antitestet (1Ü pg/ml) adtunk, és a tálcát

37 cC-on egy óra hosszat	inkubáliuk.	A nem kötődött	sej tek
eltávolítása céljából az	üregeket 10	% magzati borj;	ísséru-
met tartalmazó RAM!1640-	'tápközeggel	egyszer mostuk.	Vala-

mennyi üreget fénymikroszkóppal vizsgáltuk. Szt követően az üregekhez - a falukhoz tapadt sejtek Iízálása céljából 100 μΐ 0,1 %-os ΝΡ-40-et adtunk. Az üregekhez tapadt, fluoreszcensen jelölt thymociták relatív sejtszámát a fluoreszsa * * * «««« « X « « * * «« «>» ί cencia-intenzitás - Fluoroscan II Kicroplate Fluorometer’' (Flow Laboratories) alkalmazásával 538 nm-néi (485 nm-nél gerjesztett) végzett ~ mérésével határoztuk meg. Kontrollként a tisztított JTT-l-antigennel be nem vont tálcával végzett vizsgálat eredményét, alkalmaztuk..

A fénymikroszkőpos megfigyelés eredményeit a 6, ábrán mutatjuk be.

A thymociták a tisztított JTT-1-antigenhez csak a JTTü-antítest Fab-fragmensei jelenlétében tapadtak jelentős mértékben (β/c ábra). A tapadást a JTT-2-antitest nagymértékben gátolta (ó/d ábra).

A 7. ábrán a JTT-l-antigénnel bevont üregekhez tapadó thymociták relatív .sejtszámát a fluoreszcencia-intenzitáson keresztül szemléltetjük.

A kapott eredmények azt mutatják, hogy a JT'T-'lantigén adhéziós molekulaként funkcionál.

7. példa

A patkány JTT-l-antigént kódoló cDNS klónozása

1) cDNS-kő.nyvtár létrahozása

a) Poli (A)⁺~RHS kivonása ConA-val stimulált patkány1ímf ob1as z tokból

Patkányiépbol származó, ConA-val stimulált limfoblaszto.kat (ConA-blaszt) 4 °C—on 5 percig 2000 x g-vel centrifugáltunk. A precipitált sejteket ISOGEN-nel (Nippon Gena) ssuszpendáltuk és kloroformmal extraháltul, rázattuk, s a fe'lülúszót összegyűjtöttük. A felülűszóhoz izopropanolt adtunk, az elegyet szobahőmérsékleten 10 percig állni hagy»♦.«* »·*♦ 9*4 * ♦**.* * * φφ »* · tűk, majd - az RNS kicsapása érdekében. - 4 °C-on 10 percig 12000 x g-vel centrifugáltuk. A precipítált RNS-t etanollal mostuk és TE-pufferben feloldottuk. Az így kapott össz-RNSbői mRNA Purification Kit” reagenskészlet (Pharmacia) alkalmazásával polí (Ap-RNS-t tisztítottunk.

b) cDNS előállítása

TamplátRént a fentebb előállított polí (A)*-RNS S ugj&nak felhasználásával, “Time Saver cDNA Synthesis Kit reagenskészlet (Pharmacia) alkalmazásával cöNS-t szintetizáltunk. A szkrineiés hatékonyságának növelése céljából Kötihelyet tartalmazó oligo-dT láncind!tőt (Pharmacia) alkalmaztunk. EcoEI-adapter hozzáadása és Notl-gyel végzett emésztés után egyirányúsított” cDNS-t kaptunk, majd Spuri Column oszlop (Pharmacia) alkalmazásával méret szerinti frakcionálást végeztünk.

c) A cDNS inszertálása vektorba

•S-y	6i>	NőtI-véget	tartalmazó c'DNS-t	pMSl.83-
vektorba (Hara	es	Miyajimá: E)	ISO ü, ii, 1875	(1992)]
ligáituk, melyet	tt .Λ.	özetesen EcoR	1-gyel és Noti-gyei	emész-

tettünk. A lígáiást DNS-iigáió reagenskészlet (Takara Shuzo) alkalmazásával végeztük. A kapott reakciótermékkel B. coli DHS-sejteket (Toyobo) transzformáltunk, és a transz formánsokat 0, β-ss ODsoc- érték eléréséig tenyésztettük, majd a sejteket a plazmid-DNS-ek kinyerése céljából összegyűjtöttük. A piazmíd-DNS-e.k tisztítására ”QUIAGENT.ip-et (Quiagen) alkalmaztunk...

« ·* * ft ft

2} cDNS-könyvtár szkrínelése

A szkrinelést a panning eljárással végeztük [Seed és mtsai.: Proe. Natl. Acad. Sex. USA 84, 3365 (198?)j .

a) Génbevitel COS-sejtekbe

A létrehozott könyvtárat elektroporáciö alkalmazásával CO-S-7-sejtekbe juttattuk be (Pottar és mtsai.: Proe. Natl. Acad. Sci. USA 85, 2238) . A transsformánsokat a bevitel után 60 óra hosszat tenyésztettük,· a feiülűszőt eltávolitottuk, és az üledéket foszfátpufferelt sóoidattal háromszor mostuk. Ezután a sejtüledéket - 0,5 mM EDTA-t tartalmazó - foszfátpufferelt sóoldattal 3? °C-on 3Ό percig kezeltük, a .sejteket pipettázással eitávoiitottuk, majd ”Lymphprep (Nycomed) alkalmazásával csak az élő sejteket

gyűjtöttük össze.
b) A génexpresszálő-	sejtek koncentrál	asa
eljárassal
A fentiek szerint kai	octt élő sejteket
bo r 5 ú s z é rnmo t (EC S > é s	0,5 oM EDTA-t	tar-
foszfátpufferelt sőoldatban	am... ·· i··'0:..:c.	5

ziőt JTT-l-antitestteí bevont tenyésztőcsészékbe helyeztük, és szobahőmérsékleten három őrs hosszat inkubáituk. A csészéhez nem tapadó sejteket eitávoiitottuk, majd a csészét foszfátpufferelt sóoldattal háromszor mostuk, .e tapadt sejtekből a plazmid-DNS-t a Hirt-féle eljárással (Hirt: J.

Mól. Bioi. 23, 335] kivontuk. A coli DHIöS-sejtefcet (Gibco SRI) mid-DNS-eket a fenti 1. pont (c) kapott piazmid-DNS-sel E. transzformáltunk. A plazrészében leírtak szerint.

amplifikáltuk és tisztítottuk. A. 2. pont (a) és (b) részéιοί. ben ismertetett eljárásokat még kétszer megismételtük.

c) Pozitív klón izolálása

A harmadik panníng” után a transzformált s. coli DNlDS-sejteket egy éjszakán át'ampicillint tartalmazó L3iemezeken tenyésztve telepeket hoztunk létre.. Húsz ampicillin-rezisstens telepet tenyésztettünk, melyekből a plazmidDNS-eket alkalikus miniprep-eijárással (Mániátis és mtsai.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cola Spríng Karbon Laboratory, Coid Spríng Harhor, New York] nyertük ki, és a DNS-inszertet agarózgél-elektroforésissel analizáltuk. A vizsgálat eredményeként megállapítottuk, hogy a kb. 0,9 kb-os oDNS-t tartalmazó klón ·{:**TI32A7) koncentrálódott.

A Ti32A7~kiént - az ía) pontban leirt eljárás alkalmazásával - átmenetileg CGS7~sejtekben expresszáltattuk. Szt követően a transzformánsokat JTT-i- vagy JTT-2-antitesttel, majd FX?C-vel jelölt anti-egér XgG-vel (Cappei) reagálhattuk, és a megfestett sejtek fluoreszcencia-intenzitását SPICS-Eiite-” áramlási citom-éterrel (Couiter) mértük. A JTT-1- és JTT-2-antítest egyértelműen felismerte a TI32A?-génterméket. Az eredményeket a δ. ábrán, mutatjuk be.. 3) Mukleotidszekvencia és amlnosav-szekvencla meghatározása

A T132A7-kiőn nukleotidszekvenciáját - ^wAuto Read Seguencing reagenskészlet (Pharmacia) és A.L.F DNA Sequencer készülék (Pharmacia) alkalmazásával - didezoxieijárással határoztuk meg. A nukleotidszekvencia által kódolt patkány JTT-1-antigén le-származtatott aminosav-szekvenciáját a. GSNSNORNS génanalízálő szoftver UnteTliGenetícs) alkalmazásával vizsgáltuk, A nukleotídX * * » ΐ 02

999 X tt 9

Χ· « * * XX* X- « ♦ « * 9 99^ szekvenciát és a leszármaztatott amínosav-szekveneiát a 4, azonositőszámú szekvenciában mutatjuk be.

A klónozott génből leszármazhatott ~ 200 aminosavas aBinosav-szekvencia. magában foglalja a 6. példa 3. pontjában meghatározott N--terminális amínosav-szekveneiát. Figyelembe véve, hogy a TI.32A7~klőnnal transzformált sejtek erőteljes reakcióba lépnek a JTT-1-antitesttel, arra következtethetünk, hogy a T132A?-kión. a patkány JTT-1-antigént kódoló cDNS-t tartalmazza, ii Számítógépes vizsgálat

A JTT-l-antigén leszármaztatott amínosav-szekvenciájának elsődleges szerkezetének hidropátiás analízisét Kibe és Docíittie eljárása ÍJ. Mól. Bioi. 157, 105 (1982)] szerint végeztük (id. 9. ábra) . Az eredmények azt mutatták, hegy a JTT-1-antigén olyan transzmembrán-protein, amely Ntermináiis végén szignál-szekvenciát tartalmaz. Ezen túlmenően, a motivumanalizís. eredményei alapján megállapítottuk, hogy a JTT-i-antigén extracelluláris dóménjében két Asnkötött cuko-riánc-kötőhelyet, eitoplazmikus d©ménjében pedig két kazein-kináz foszforílácíős helyet és egy proteinkínáz-C foszforiiácíós helyet tartalmaz.. A 9, ábrán CHO jelentése N-kötött oukorlánc-kötőhely; P jelentése- főszforiláciős hely; CK'il jelentése kazein-kináz-ll; és “PKC” jelentése protein-kínáz-C.

» χ * * »4* X ¢.

»»«« χ X φ * *-Φχ * * <·<#

8. példa

A humán JTT-1-antigént kódoló oDNS klónozása

1? Próba előállítása

A patkány JT?-!~antígént kódoló cDNS-t (kb. 0,9 kb) a 7, példában kapott T13-2A7-klőn SeoRl-gyel és Noti-gyel végzett emésztésével kaptuk# és agarözgéi-elektroforézissei frakcionáituk, Az elválasztott DHS-fragmenseket QUIAEX gélextrakciós reagenskészlet (QUXAGEN) alkalmazáséval tisztítottuk# és a kapott DNS-fragmenseket '^!Aeady-To~Go^!f DNSjeiöiő reagenskészlet (Pharmacia) alkalmazásával jelöltük. Az igy kapott# jelölt DNS-fragmenseket a plakk-hibridizácíő próbáiként alkalmaztuk.

2) cDNS-könyvtár előállítása

a) Poli (A) ’-SRS kivonása

A poli (A)'-RNS-t humán perifériás vérből származó# ConA-vai stimulált limfobiasztokbői (ConA-blaszt)# a 7. példa 1/a pontjában leírtak szerint vontuk ki, bi cDNS előállítása

Templátként a fentiek szerint kapott poli (A) *~RNS 5 pg-ját felhasználva# a cDNS-eket oiigo-dT-lánoindltő (Pharmacia) és Time Saver cDNS-szintetizáló reagenskészlet (Pharmacia) alkalmazásával szintetizáltuk. A cDNS-ekhez ScoRI-adaptert adtunk# majd ”3ρυη Coiumn oszlopon (Pharmacia) méret szerint frakcionálási végeztünk.

c) Inszertálás vektorba és csomagolás

Az EooRI-végeket tartalmazó cDNS-eket DNS-1igáiő rea~ genskészlet (Takara Shuzo) alkalmazásával kCAPil-vektorral (Stratagens) ligáitűk# melyet előzetesen EcoRI-gvei emészaltettünk. A ligáit DNS GIGA PACK II GOLD (Stratagenej kalmazásával végzett in vitro csomagolása után. a kapott fágrészacskékkel. D. coli XL-lBlue-MRI”-sejteket (Stratagene) transzfaktáitünk, miáltal - rekombináns fágot tartalmazó plakkból álló eDNS-könyvtárat hoztunk létre.

3? A cDNS-könyvtár szkrlnelése

A cDNS-könyvtárat Rapid hibridizációs puff-er (Amersham)' alkalmazásával, plakk-hibridizácios eljárással [Mániáiig és mtsai.: Molacuiar Cloning; A Laboratory bánnál⁵', Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New Yorki szkríneitük, Először a. oDMS-könyvtárat (1. x lö*) agarlemezekre szélesztattük, majd Hybond-N” nylon-membránra (Amersham) átmásoltuk. A. plafck-híhridízációt a másolati membrán és az I. pontban leírtak szerint előállított, ^i!'²P~ izotóppal jelölt próba felhasználásával, Rapid hibridizációs puffarban (Amersham; végeztük. Első és második szkrínőiest elvégezve nyolc pozitív kiónt kaptunk. Az egyes klórokból egy-egy plakkot izoláltunk, és a Stratagena használati útmutatása szerint in vívó kimetszettük. Diaziaíö-DNSként hét pozitív kiónt gyűjtöttünk össze.

4} A klónok nukleotidszekvenciájának maghatározása

A hét klón nuklaotídszekvencíáját Autó Read

Sequencing reágenskészlet (Pharmacia; ás A.L.F. DNA Sequancer (Pharmacia} alkalmazásával határoztuk meg. A hát klón nuklaotítíszskvenciája azonos volt. Azt találtuk, hogy a pBSMl-kión a teljes hosszúságú humán JIT-l-antigént, kódolja. A humán JIT-l-antigén nyitott leolvasási fázisának (OBI; megfelelő cDNS-szekvenciát az 1. azonosítószámú szék“ 105 * * « β» a $ « * ♦ v *«. » « v*<;' * ♦ 4fi»9 * ·* I*·· «fe <

véneiéként, a humán JTT-l-antigén teljes hosszúságú, leszármazhatott aminosav-ssekvenciáját a 2. azonosítószámú szekvenciaként, mig az 5’- és 3’-szekvenciákat magában foglelő nyitott leolvasási fázis) a 3. azonosítószámú szekvenciaként mutatjuk be. A klón nukleotidszekvencíaja a teljes hosszúságú humán JTT-X-antigént kódolja, mivel a nukieotidszekvenciából lessármaztatott .aminosav-szekvencia jelentős mértékű homológiát mutat a patkányeredetű. JTT-l-antigén aminosav-szakvencíájávai (lö. ábra). Ahogy a lö. ábrán, látható, a humán és patkányeredetű JTT-l-antigén aminosavszekvenciája közötti homológra 60 %-os vagy még nagyobb arányú.

A pSShél-klonnal transzformált .ö, coli DHlOB-sejteket {Gihco BAL) a Budapesti .Szerződés érteimében, 19Ső. október 25-|n, a National In.stltu.te of Bioscience and Humán Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Min.ístry of International. Trade and lnáustry-ná.l (1-1-3, Eigashi, Tsukuba-shí, ibaraki, Japán) FEBM BP-5725 deponálási számom helyeztük letétbe.

5) A JTT-l-antigén strukturális jellemzői_ és biológiai funkciója

A humán JTT-l-antigén leszáxmaztatott aminosav™szekvencia javai ismert humán proteinek amincsav-szekvenciáiban végzett motívumbarésés eredményeként megállapítottuk, hogy a humán JTT-l-antigén strukturális hasonlóságot mutat az ímmunglobulin-szuperesaládba tartozó humán CD28- és CTLA-4molekuiával {sejtmembrán proteinekkel), melyeket fentebb * * « részletesen, ismertettünk (Id. 11. és 12. ábra). Ahogy fentebb leírtuk, a CD28 és CTLA-4 a T-sejtek aktiválásának és gátlásának szabályozásában rendkívül fontos szerepet betöltő molekulák.

A strukturális hasonlóság a következőkben nyilvánul meg: (1) 20 vagy több aminosav - köztük cisztelnek - nagymértékben konzervált; (2) konzervált ismétlődő prolinszekvencia ÍPro-Pro-Pro; PPP) , amely a CD28~ban és· CTLA-4ben iigandumkötő-régioként játszik kulcsfontosságú szerepet; <3f a citoplazmikus régióban konzervált Tyr-Xa.a-XaaMet (TxxM) szekvencia .(ahol Xaa és x bármely aminosav lehet) van jelen, amely a C328~ban és CTLA-4-ben szignálétvivő régióként játszik fontos szerepet.

Mivel a JTT-l-antigén - az immunreakciók fő komponenseiként szereplő T-sejtek aktiválásának szabályozásában fonfos szerepet betöltő - CD28- és CTL&-4-molekula specifikus .szerkezetével azonos szerkezetű, arra a következtetésre jutottunk, hogy a JTT-1-antigén a limfociták (T-sejtek) aktiválásának szabályozásában hasonlóan fontos szerepet játszik, mint a CD-28 és CTLA-4.

9. példa

Sgéreredetű JTT-1-.antigént kódoló oDNS klónozása

1) Próba előállítása

A patkány JTT-l-ant.igénfc kódoló cDNS-t (kb. 0,9 kb) a. ?. példában kapott T132A7-klőn EcoRI-gyel és Notl-gyel végzett emésztésével kaptuk, és agarózgél-elektroforézissel frakcionáltuk. Az elválasztott DNS-fragmenseket QUIAZX” « «** **· * ·:·»· Κ ♦ · 4 4 4 *« ♦ * Λ * ♦ X ί gélextrakciós reagenskészlet (QUIAGEN) alkalmazásával tisztítottuk, és a kapott DNS-fragmenseket ^!íReady-To-Go’^! DNSjelölő reagenskészlet (Pharmacia) alkalmazásával jelöltük.

Az így kapott, jelölt DN'S-fragmenseket a plakk-'hiforidizáciő próbáiként alkalmaztuk,

2} cDNS-könyvtár előállítása

a) Poli (A) '-RNS kivonása

A poli (A)''-RNS-t egérlépből származó, ConA-vai stimulált iimfoblasztökből ;kb, 1 x 1Q^? sejf/ml), a 7. példa 1/a pontjában leírtak szerint vontuk ki.

fo) cDNS-könyvtár előállítása

Templátkénfc a fentiek szerint kapott polí{AÜ~RNS 5 mg-ját felhasználva, a cöNS-eket oiigo-d?-Iáncínditó (Pharmacia) és «Time Saver” cDNS-szintetizáiö reagenskészlet (Pharmacia) alkalmazásával szintetizáltuk. A cDNSebhez EeoRI-adaptert adtunk, majd ^í?Spun Coluan* oszlopon (Pharmacia) méret szerinti frakcíorálást végeztünk.

c) Inszertálás vektorba és csomagolás

Az DcoRi-végeket tartalmazd cDNS-ekst DNS-lígálö reagens-készlet (Takara Shuzo} alkalmazásával kZAPlI-vektorrai (Stratagene) ligáitok, melyet előzetesen ScoRI-gyel emésztettünk, A ligáit DNS «GIGA PACK 11 GOLD” (Stratagene) al-

kaImazásával végzett in	vitro csomagolása ut	án a kapott
fágrészecskékkel E. coli	XLlBlue-M.RFí -sej te két	(Stratagene)
transzfektáitunk, miáltal	t - rekombiráns fágot	tartalmazó -
plakkokboi álló cDNS-könv	'vtárat hoztunk létre.

108 > « « 9 9 * ♦ * * « >* » X

3) A c.ONS~ könyvtár szkrinelsse

A cDNS-könyvtárat Rapid hibridizációs puffén (Amersham) alkalmazásával, plakk-hibridizáclós eljárással (Maniati-s és mtsai.: Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lahoratory, Cold Spring Harbor,

New Yorki szkríneitük,

A 2. pontban leírtak, szerint előállított cDNSkönyvtárat ti x lö⁴) agarlemezekre szeles zt ettük, majd Hybond-N nylon-membránra (Amersham) átmásoltuk - A plakkhibridizáciöt a másolati membrán ás az 1. pontban leírtak szerint, előállított, ^F-izotóppal jelölt próba felhasználásával, Rapid hibridizációs puffőrben (Amersham) végeztük. Első és második szkrinelést elvégezve bt pozitív klőnt kaptunk. Az egyes kiónokból egy-egy plakkot izoláltunk, és a Stratagene használati útmutatása szerint ín vivő kimetszettük. Flazmid-DNS-ként öt pozitív kiónt gyűjtöttünk őszs z e.

4) A kiónok nukleotídszekvsncíáiának meghatározása

Az öt klón nukleotidszekveneiáját Autó Read Sequencing reagenskészlet (Pharmacia:) ss A.L. F. DNA Seouencer” (Pharmacia) alkalmazásával határoztuk meg. Az öt klón közül négy nukleotidszekveneiája azonos volt. A teljes hosszúságú, egéreredetö JT'T-1 -antigént kódoló cDNS nukleot.idsze.kvenciáját és a leszármazhatott aminosav-szekvenciát az 5. azonosítószámú szekvenciaként mutatjuk be.

Ahogy a 10. ábrán látható, az egéreredetö JTT-iantígén - hasonlóan a patkányersdetű ŰTT-I-antigenhez - 200 aminosavat tartalmaz. Az egér-, patkány- és emberi eredetű ·*ί^χ

JTT-1-antigének aminosav-szekvenclája közötti homológra 50 %-os vagy még nagyobb mértékű.

5) Az egéraredatű JTT-i-antigent kódoló gén lőkuszának vizsgálata

Az egéreredetű JTT-l-antigént kódoló gén iókuszát in sítu fluoreszcens hibridizációs eljárással analizáltuk.

Az egéreredetű JTT-l-antigént kódoló cDNS-t - hibridizációs próbák előállítása céljából - szokványos eljárással izotóppal jelöltük. & próbák alkalmazásával 129SYJ egér genomi DNS-könyvtárat (Stratagene) szkríoeitünfc, miáltal az egéreredetű JTT-l-antigént kódoló exonokat tartalmazó egér genomi DNS-klőnokat kaptunk. A genomi DNS szerkezetét sematikusan a 13. ábrán mutatjuk be.

A fentelk szerint kapott genomi DNS-klőnokat - próbák létrehozása céljából - niek/’-transziáció alkalmazásával, digoxlgenin-áüTP-vel jelöltük. A jelölt próbákat hasított egér-DNS-nez kapcsoltuk, és - 50 % formaldehidet, 10 % dextrán-szuifátot és zxSSC-t tartalmazó oldatban - embrionális egérfibroblasztokbői származó, normái metafázisos stádiumó kromoszómákkal hibridizáitattuk. Hibridizációs tárgylemezt fluoreszcensen jelölt anti-digoxigenin antitesttel inkubáltunk, majd a specifikus hibridizációs jelet DAPI-val végzett festéssel detektáltuk. Az első tesztben a mérete alapján 1. kromoszómának tartott - legnagyobb kromoszóma közelében lévő szakaszt jelölődött specifikusan. Ezen információ alapján a fentebb leírt genomi DNS-klónt az 1. kromoszóma centromer-régiójára specifikus próbákkal kohibridizáitattuk, aminek eredményeként az 1. kromoszóma ~ ί X U ~ * * * « ♦ ♦:

* » > * χ ' * * X χ ΦΧ* X «

ΦΧΦΦ ΦΦΦΧ « < Φ φ χβχφ » * ΦΦ #9 * centromer-régíója és az ahhoz közeli régiók jelölődtek specifikusan. A specifikus hibridizációt mutató .1. kromoszóma tíz- mintáját vizsgáltuk, és kimutattuk, hogy a fentebb említett genomi DNS-klőn a heterokromatin/eufcromatin határ ás az 1, kromoszóma telomere közötti távolság .33 %-ának megfelelő pozícióban helyezkedik el, nevezetesen ugyanazon az ÍC3-csíkon, mint az egár-GD23~gén ás egér-CTLA-4-gén fókuszai. SO metafázísos sejt vizsgálatának eredményeként az említett pozícióban specifikus jelölődést 79 sejt esetében azonosítottunk.

Ezek és a 3. példában kapott, a JTT-1-antigén CD23oal és CTLA-4-gyei mutatott strukturális hasonlóságát jelző eredmények arra utalnak, hogy a JTT-l-antigén. - hasonlóan a CD28-hoz és a CTLA-4-hez - fontos szerepet játszik a kostímulátor szignál átvitelének és/vagy a iimfociták aktíváié s e n a k s z abáIyo z ásáb an.

XQ, példa

Mutáns patkányeredetű JTT-1-antigént kódoló cDNS- klónozása

1) Próba előállítása

A patkány JTT-1-antigént kódoló cDAS-t (kb. ö,9 kb) a 7. példában kapott T132A7~klön ScoRT-gyei és Noti-gyei végzett emésztésével kaptuk, és agarözgél-eiektroforézisssl frakcionáltuk., Az elválasztott DhS-fragmenseket QUIASX gslextrakciós reagenskésziet (QüIAGEN) alkalmazásával tisztítottuk, és a kapott DNS-fragmensekeé Ready-To-Go” DNSjelölő reagenskésziet (Pharmacia; alkalmazásával jelöltük. Az így kapott, jelölt DNS-fragmenseket a piakk-hibrídizáció .11 >*» « « R.« próbáiként alkalmaztuk,

2) cDNS-könyvtár előállítása

a) Poli(A)⁺-RNS kivonása A poli (A; '-RNS-t az sejtvonalból (kb. 1 χ IQ sejt/mi), a 7. példa i/a pontjában leírtak szerint vontuk ki.

b) cDNS-könyvtár előállítása

Templátként a fentiek szerint kapott poli (A) '-RNS 5 rag-ját felhasználva, a cDNS-eket oiigc-dT-láncinditő (Pharmacia) ás Time Savét cDNS-szintetizáló reagenskészlet (Pharmacia) alkalmazásával szintetizáltuk. A cDNSekhez EeoRI-adaptert adtunk., majd Spun Coiumn oszlopon (Pharmacia) méret szerinti frakcionálási végeztünk.

c) Inszertáiás vektorba és csomagolás

Az EcoRI-v'égeket tartalmazó cDNS-eket. DNS-ligálö reagens kész let (Takara Shuzo) alkalmazásával λΖΑΡΙΙ-vektorral (Stratagene) ligái tűk, melyet előzetesen EcoRI-gyel emésztettünk, A ligáit DNS GIGA PACK II GOLD (Stratagene) alkalmazáséval végzett in vítro csomagolása után a kapott fágrészecskékkel £. coli XLlSlue-MRF’-sejteket (Stratagene) transzfektéitünk, miáltal - rekombínáns fágct tartalmazó - plakkokböi álló cDNS-könyvtárat hoztunk létre:.

3) A cDNS-könyvtár szkrlnelése

A cDNS~könyvtárat Rapid hibridizációs puffer (Amersham) alkalmazásával, plakk-hibridizáeíós eljárással [Mániátis és mtsai.; Moleeular Cloning; A Laboratory Manual”, Cold Spring Ha.rbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York] szkríneltük.

112 ♦ ♦ »R «« 4 *r

A 2. pontban leírtak szerint előállított cDNS-könyvtárat (1 x 10*) agarlsmezekrs szélesítettük, majd HybondN nylon-membránra (Amersham) átmásoltuk. A plakk-hibridízációt a másolati membrán és az 1. pontban, leírtak szerint előállított, ‘⁵²P-izotőppaI jelölt próba felhasználásával,· Rapid hibridizációs pufferben (Amersham) végeztük. Első· és második szkrinelést elvégezve két pozitív kiönt kaptunk. Az egyes kiónokbói egy-egy plakkot izoláltunk, és a S'tratagene használati útmutatása szerint ín vívó kimetszettük. Plazmíd-DNS-ként két pozitív kiónt gyűjtöttünk össze. íi A kiónok nukleotidszekvenciájának meghatározása neac

A két klón nukieotidszekvencíáját Sequencing*’ reagenskészlet (Pharmacia) és Sequencer (Pharmacia) alkalmazásával határoztuk meg. A két klór· nu'kleotidszekvenciája azonos volt. A teljes hosszúságú,;. patkányeredetű JTT-1-antigént kódoló cDNS nukleofidssekvenciáját és a leszármaztatott aminosav-szekvenciát a

6. azonosítás zárná szekvenciaként műtétjük be. A kapott cDNS-szekvenciából leszármaztatott aminosav-szekvenciát (6. azonosítószámú, szekvencia) a A példában leírtak szerint klónozott, patkány-eredetű JTT-Í-antigént kódoló cDNS-szekvenclából leszármazhatott aminosav-szekvenciávai (4. azonosítószámú szekvencia) hasonlítottuk össze (Id. 14. ábra).

Ahogy a 14. ábrán látható, az e kísérletben kiónozott cDNS által kódoló aminosav-szekvencia teljesen azonos volt a 7. példában kapott, patkányeredetü JTT-l-antigént kódoló cDNS által kódolt amínosav-szekvenciával, azzal a kivétellel, hogy a szóban forgó aminosav-szekvenciában (1) a három egyDNA

113 más utáni, C-terminális: aminosav (Met-Thr-Ser} helyett ThrAla-Pro található,; és [25 a Thr-Ala-Pro szekvencia után 16 további, egymás után következő aminosav (heu-Arg-Aia-LeuGl y-Ar g-G1 y ~ Glu - H i s - Ser- Ser - Cys - G1 n-Asp -Ar g-As h 5 t alá. I Íz utóba arra utal, hogy az e kísérletben kiónozott oDN'S a 7. példában kapott patkényeredetű JTT-l-antigén alternatív ^!fsp.Iicing^!í eredményeként létre jött változatát kódolja11. példa

Rekomfeináns humán JTT-1-antigént expresszáló sejtek előállítása

A 8. példában előállított pSShsi-piazmídkiónt EooRTandonuklaáz.zal emésztettük, és a teljes hosszúságú humán JTT-í-antigént kódoló cDMS-t tartalmazó OhS-íragmenst kivágtuk. Ezt a DES-íragmemst DhS-iigálé reagéhskészlet (Takara Shuzo Co,, Ltd-5 alkaimazásával - előzetesen szintén EcoRl-gyei hasított - pEPneo-piasmidba [Proc, háti, Acad. Sci, OS A 91, 158 (1994)] ins zártáitok- Az így kapót expresszíós vektorral - elektroporáciő alkalmazásával CHOK1 -sej tűket (ATCC CCL-Gl? transzformáltunk - A sejteket - 0,8 mg/ml Genecleint (Gibco SÁL; ás 10 %· magzati borjúszérumot tartalmazó - RPAIl 840—tápközegben kb. két hétig tenyésztve Genetlein-rezisztens transzformánsokat szelek(szokványos eljárással végzett ^:í nor thern-bio t^íf anaií z issei ibááó^l(tűk((-((s((^((((((i(((((4((;((((((((((((s([(((s((((((i(((((((((((((((:(([ (;;-(<( ((·,( ( [ ( ct

114 ♦♦♦ν ♦#

12. példa

Humán JTT-l-antigén elleni monoklonálís antitestek előállítása

A 11. példában előállított, rekombináns humán JTT-lantigént expresszáló transzformánsokat homogenizáltuk és 100 000 x g-vel ultracentrifugáitűk. A sejtmembrán-frakciót tartalmazó üledéket foszfátpufsereit sóoldatban szuszpsnháltuk, és a kapott szuszpenziót - komplett Freund-féle adjutánssal - BALB./c-egerek talpába injektáltuk (0. nap) , Az egerek talpába ezt a sejtmembrán-frakció antigént 7., 14. és 28. napon is beadtuk. Az nappal az egerek nyirokcsomó‘s azokat 5:1 aránvban FA:

iαa uvans neikui ltolsó immunizálás után két sejtjeit kivettük, igérmielóma.sejtekkel (-JGR No. 30113; Rés. Disclosure 217, 155 (1932)1 elegyítettük és - polietilén-glikoi-4000 (Gíbco) alkalmazásával - fűzíonáltattuk. A fúzió eredményeként monoklonálís antitesteket termelő hibrí dó-mákat kaptunk. A híbridómák szkrlnelése: céljából azokat - 10 % magzati borjüszőrummal és amirtop tér lnnél kiegészített - HAT-tartalmú ASF104-tápközegben (.Ajinomoto) tenyésztettük, majd az egyes híbridómák tenyészeti felülúszóját a 11, példában előállított, rekombináns humán JTT-l-ant i.gé-nt expresszáló transzformánsokkal· reagáltattuk. Az FiTC-vel jelölt anti-egér IgG-vei végzett reagáitatással festett sejtek fluoreszcencia-intenzitását EPICS-ELITE áramlási citcméterrsl mértük, hogy igazoljuk a tenyészeti felülúszókbsn termelődött monoklonálís· antitest humán OTT-1-antigén elleni reaktivitását. Az eredmények alapján megállapítottuk, hogy tíz vagy több olyan hifcrídő.15 ►>** 0 X 0 0 *<·χ* * * 00 0.0 ί mát kaptunk, amely humán JT'?-l-antigénnel reaktív monoklonáíis antitestet termeit.

E hibridőmák közül kettőt (SA12- ás SG4.30~kl.0n): Íntraperítoneálisan - külön-külön - 7-8 hetes nőstény ICRnu/nu-egerekbe injektáltunk ílíi-lö' sejf/0,5 mi/eger). 1020 nap elteltével az egereken altatás mellett eeiiotőmíát végeztünk, és a szokványos eljárással kinyert hasürí folyadékból a humán JTT-í-antigénnel reaktív monokionáiis antitestek két fajtáját ÍSA12 és SG430) állítottuk elő,

13, példa

A humán JTT-l-antigén elleni monokionáiis antitestek humán perifériás vérből származó limfooirákra gyakorolt hatása

Ahogy a 8. példában említettük, a J?T-l-anti.gén - a

CD28-hoz és a C7LA.-4-hez hasonlóan - az immunraakciók során szerepet játszhat a lint

íták	aktiválásának	szahályozá	sá
iából	a humán oTT-1	-antigén el	I e
barna	n limfooiiákra	gyakorolt	ha

tását a sejtszaporodás tükrében vizsgáltuk.

SS üregű míkrotiter-tálea üregeibe íl) a 12. példában.

előállított, humán JlT-l-antigén elleni SAÍ2- vagy SG430antítestet íl pg/mi) vagy (2) SA12- vagy SG430~antftest (1 pg/mi) és CD3 elleni OKT3 monokionáiis antitest (1 gg/ml; Ortbodiagnostie Systems) elegyét adtuk (az utóbbi antitestet a íimfociták aktiválásának primer szignáljának biztosítása céljából alkalmaztuk) . A tálcát - az üregek falának antitesttel történő bevonása céljából - egy óra hosszat 37 C-on inkubáltuk, majd RRMI1648~tápközeggei mostuk, és az .16 * ♦ X φ χ * ♦ « »««. * φ ►X» Χ*ΦΦ φ χ « « Χ«χ« * * ** 44 ί üregekhez normális humán perifériás vérből származó limfocitákat (1 x lö⁵/üreg} adtunk, és - IQ % magzati borjúszérumot tartalmazó - REMII640-tápközegben három napig inkubáltuk. Szükség esetén az üregekhez I ng/mi forbol-miriszfcát-acetátot (PMA) adtunk. Ezt követően mindegyik üreghez H-timidint (3,7 pkBq/üreg) adtunk, és a tálcát hat órán át 37 ®c-on inkubáltuk. Ezután a sejteket betakarítottuk, és a DNS-be épült timidin mennyiségét folyadékazcíntiilációs számlálóval (Beckman] mértük. Kontrollként antitestek hozzáadása nélküli üregeket alkalmaztunk. Az eredményeket a 15. ábrán mutatjuk be.

Az SA12-es vagy SG430^:-as mono klónál is antitesttel bevont tálcák alkalmazásával végzett kísérletben a límfociták száma a kontrolihoz képest kb. 10-szeres volt. Ha akár az. SA12, akár az SG43Q mono klónál! s antitest mellett OKI 3antitest volt jelen, a límfociták száma 100-szorosára növekedett .

Ezek az eredmények azt jelzik, hogy a JTT-1-antigén szerepet játszik a límfociták aktiválásának szabályozásában. Az a tény, hogy a sejtszaporodás az 0KT3-antítest együttes alkalmazásakor fokozódott, arra utal, hogy a JTTl-antigén - a CD28-hoz és CILA-4-hez hasonlóan - ko-stimuiátor szignál átvitelében játszik szerepet.

Ί *7 .«»*♦· * * * ♦ « **χ χ « ♦ » *· **♦'♦ * χ * * ·χ».« » ♦ <* 99 V

14, példa

A JTT-2-antitest kísérleti allergiás agy-gerincveXőgyulládáéra (KAS) gyakorolt hatása

Ahogy azt fentebb említettük, az utóbbi években számos kísérletet tettek a különféle autoimmun betegségek (pi, reumaszerű izületi gyulladás, sclerosls multiplex, autoimmun pajzsmírigy-gynlladás, allergiás kontaktus-típusú dermatitís és krónikus gyulladásos d-e.rmatos.is, pl, libben planus, szisztémás erythemás lupus, inzulinfüggő diabetes mellitus, pikkelysömör, stb.) CD28/ÜTLA-4 és CD80/CD88 közötti szígnálátvítel szabályozásával történő- kezelésére.. A hatást az autoimmun betegségek különböző állatmodelljeiben már bizonyították [-(1) humán szisztémás erythemás lupus modelljében; (2) a sclerosls multiplex modelljeként szolgáló kísérleti allergiás agy-gerincvelögyulladás (SAS) -modellben; (3) az inzulinfüggő díabetes mellitus (1DDM) modelljében; (4) a Goodpasture-féle vesegyuiiadás modellben; és (5) a humán reuma-szerű ízületi gyulladás modelljében] .

Annak meghatározása céljából, hogy a találmány szerinti JTT~l~antigán a limfocíta-aktíváiásában vagy -gátlásban szerepet játszó molekula-e (mint a CD-28 és CT'LA-4), sclerosls multiplex modelljeként szolgáló kísérleti allergiás agy-geríncveiőgyulladásos i£AJ£) patkányokat hoztunk a JTT-2: monoklonális antitest JTT-1-antigénre

látra, és a	ÜTT-2: mór
gyakorolt haté	sát vizsg-
Ksr't lsy‘w	tsngeríma.

:ooi szármázó agy-gerrncvexo nomogená turnét (fiziológiás sóoldatban 800 mg/mi) azonos mennyiségű, Freund-féle komplett adjuvánssal elegyítve immunogénként alkalmazható emulziót állítottunk elő. Az immunizáláshoz az emulziót intradermálisan 15 hat hetes, nőstény Lewis-patkány jobb és bal talpába injektáltuk (0,25 ml/talp mennyiségben;, ami patkányonként 200 mg homogenátum-dózist eredményezett. Az immunizálás kísérleti allergiás agygerincvelőgyulladást (EAE5 indukált.

Az immunizált patkányokat három, egyenként ót patkányból álló csoportba osztottuk, és közvetlenül az immunizálás után (a Ou napon), illetve a 3., 6., 9. és 12. napon az alábbi anyagok valamelyikével intravénásán beoltottuk:

(15 a 2. példában leírtak szerint előállított - patkányeredetű JTT-I-antigén elleni - JT?-2-antitest (dózis: 2 rag/ml ESS, 5 mg/kg} ;

(2) prednizolon, szteroid hatóanyag (dózis; 4 mg/ml ESS, 10 mg/kg);

. (3; patkányeredetű JTT-l-antigsnnei nem reaktív kontroli antitest (dózis: 2 mg/mi ESS, 5 mg/kg),

A tüneteket az immunizálás után az idő előrehaladásával. Az SAS megjelenése után a tünetek súlyosságát a következő kritériumok alapján értékeltük:

pont: a farok feszességének megszűnése;

pont: hátsó lábak vonszoiása és enyhe paralizis;

pont: hátsó lábak vonszoiása és súlyos paralizis;

pont: az egész testre kiterjedő paralizis vagy az állat pusztulása.

Az eredményeket a 16.. ábrán mutatjuk be. Abban a csoportban, amelyben a kontroll antitestet adagoltuk, az EAE, tünetei az immunizálás utáni II. és 15. nap között érték el * «> * * * X ♦ * « ♦ ♦ * χ. «φφ φ 4

4444 44X4 « φ χ « ♦**,.» maximális szintjüket, majd fokozatosan csillapodtak., szemben, a Ο'ΤΤ-2-anfcitesttel kezelt csoportban az EAE tünetei az immunizálás utáni 11, napon jelentős mértékben gátoltak voltak. Sz a gátló hatás lényegesen nagyobb, mint a prednizoIonnal kezelt csoport esetében.

Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a JTT-l-antígén olyan molekula, amely szerepet játszik az immunraakció indotálásában (pl, a Iimfociták idegen antigénekkel végzett immunizálással indukált aktiválásában), és a JTT-i-antigén vagy líganduma működésének szabályozása gátolhatja a különféle autoimmun betegségek tüneteit.

15. példa

A JTT-2-antitest hatása a glomerulonephritzsre

A. 14. példában leírtakkal azonos célból glomerulusalapmemforán (GBMi nephritls-modeii patkányokat hoztunk létre, és. a JTT-2-antitest JTT-l-antigénre gyakorolt hatását izsgáltuk.

λ szarvasmarha gzomerurUs-azapmemorant tbhigei ^«dica.1 Institutei kollagenázzai emésztettük, maid fíziológiás sóoldattal 2Ό0 ug/rai koncentrációra hígítottuk. Az elegyet Freund-féle komplett adjuvánssal elegyítve immunogénként alkalmazható emulziót kaptunk.. Az immunizáláshoz az emulziót - érzéstelenítés mellett - íntraáermáiisan 48, kb. 200 grammos wister kyoto patkány hátsó talpaiba injektáltuk. Az emulziót mindkét, talpba 0-,2-0,2 mi mennyiségben adtuk be (dózis; 15 μη). Az immunizálással gl.omerulus-al.apmembrán (GBM) nephritist indukáltunk..

Ο * ♦ « « γ * * * χ « » < χ γ.

ΦΧί» ίφχχ γ γ φ φ * ♦ »« 9-Κ 9 &ζ immunizált patkányokat nyolc, egyenként hat patkányból állő csoportba osztottuk, és az állatokat közvetlenül az immunizálás után (a ö. napon), illetve öt egymás után héten, heti bárom alkalommal a következő anyagok valamelyikével kezeltük:

Cl) a 2. példában leírtak szerint előállított - patkanyeredetű JTT-1-antigén elleni - JTT-2-antitest (dózis: 3 mg/kg, 2 ml PB'S/kg., intravénás injekcióval; ;

(.2) prednizolon, szteroid hatóanyag (pozitív kontroll, 0,5 %-os karboxi-metil-celiuiózban (CMC) szuszpendálva; dózis: 4 mg/kg, 2 ml PBS/kg, pero.rálisan adagolva);

(3) 0,5 % cmc (negatív kontroll; dózis: 5 ml/kg, perc rá Hsán adagolva).

A tesztelt anyag beadása után mindegyik patkánynak erőszakkal, psrorálisan sterilizál ml/kg), és az “anyagcsere-ketrecbe) nélkül - tartott állatokból öt órán ét vizeletet gyűjtöttünk. Az összegyűlt vizelet térfogatát megmértük, a vizelet proteinkoncentrácíóját Terein TP-II” (ötuka} alkalmazásával meghatároztuk, ás kiszámítottuk a protein vizeletbe történő - öt órára vonatkoztatott - kiválasztódását (egység: mg proteín/öt óra). A vízeietgyűjtest és a vizelet proteintartalmának meghatározását az immunizálás után egy, kettő, három és négy héttel megismételtük.

Az eredményeket a 17. ábrán mutatjuk ba. A protein vizeletbe történő kiválasztása a JTT-2-antitestteI kezeit csoportban - három héttel az immunizálás után - a kontrolihoz képest jelentős mértékben csökkent, vizet adtunk bí

- 121 -

»***

Ezek az eredmények, arra utalnak, hogy a JTT-l-antigén olyan molekula, amely szerepet játszik az immunreakció indotálásában (pl. a limfociták idegen antigénekkel végzett immunizálással indukált aktiválásában), és a JTT-l-antigén vagy üganduma működésének szabályozása gátolhatja a különféle autoimmun betegségek tüneteit.

16, példa

A JTT-1-antigénből és .IgFc-bőI álló fúziós protein előállítása

Ahogy a 8. és 13-15, példákban említettük, a találmány szerinti JTT-1-antigénről azt tartjuk, hogy olyan molekula (mint pl, a CD28 és a CTLA-4), amely szerepet játszik a ko-stimulátor szignál átvitelében (ami a limfociták aktiválásának szabályozásában kulcsfontosságú). Ezenfelül, ahogy a 14, példában említettük, a CTLA-4 extraceliulárls dóménjéhei és a humán XgGl. Ec-régiójából álló fúziós proteinről (CTLA-4/xgEc) leírták., hogy különböző autoimmun betegségekre terápiás hatást fejt ki. Ebben a példában a JTTl-antigén extraceliulárls régiójából és a humán IgGFcfragmensből álló fúziós protein előállítását Írjuk le, E fúziós protein alkalmazásával azt vizsgáltuk, hogy az óidékony JTT-l-antigén - a CTLA-4/Ig'Fc-hez hasonlóan - alkalmazható-e a különféle autoimmun betegségek kezelésére,

1) Fatkányeredetú JTT-l-antigénből , és humán IgGl-Fc-fragaensből. ál iofúziós protein (rJTT-l/ lg Fc) élőéi 11 tás a

A patkányeredetű JTT-l-antigén extraceliulárls régióját kódoló cDNS -amplífikálása céljából egy (terminálisán

X 9 « « ♦ » ír '4 * X ♦ φ ♦ φ 9 *♦»» **** X * * * **»« ♦ * »* *-* 9

XhoX-felismerési helyet tartalmazó} 5’-láncindítőt £S’~ CTGC’rCGAGATGAAGCCCTACTTCTCG~3'*; 7. azonosítószámú szekvencia) és egy (terminálisán BamHI-feiismerési helyet tartalmazó ) 3 ^f-iánclndi tőt (5 * -ACCCTACSGGTAAGGGATÜCTTCAGCTGGCAA3’) terveztünk és szintetizáltunk. Templátként a teljes hosszúságú patkányeredetű JTT-l-antigent kódoló# 7. példában kapott Ti32A7-kÍön és a szintetizált iáncinditők alkalmazásával polimerét-láncreakciót végeztünk# miáltal a pat~ kányeredetü JTT-l-antigén extracelluiáris régióját kódoló két végén Xhol-# illetve BamHI-heiyet tartalmazó - cDNS-t kaptunk. A kapott PCR-termékeket Xhol-gyei és SamHI-gyei emésztettük# majd agarözgéi-elektroforézissei elválasztva kb.. 45Q bp-os csikót izoláltunk, amely feltehetően a kívánt extracelluiáris régiót kódoló cDNS-fragmens. Az izolált .DNS-fragmenst - Xhol-gyei és BamHI-gyei emésztett pBlnescriptll-SK(+)-vektorba (Stratagene) szubkiőnoztuk. Automata fluoreszcens DRS-szekvsnáió készülék (Applied Bíosystems) alkalmazásával végzett szekvencia-analízissel megállapítottuk, hogy a kapott cBNS-fragmens a patkányeredetű JTT-1-ant.igén 1-141. aminosavaínak megfelelő aminosavszekvenciát kódoló régiót tartalmazza (4, azonosítószámú szekvencia) .

A humán TgGI Fc-ragiőját kódoló DRS-t (fúziós partnerként) a Bead és mtsai, (Massachusetts General Hospital) által előállított plazmádból 1,3 kb-os BamHl-Xbalfragmensként vágtuk ki (Id, Cell 61# 1303 Í19S0) I . Ez a fragmens a humán IgGl kapocsrégióját, cy-_;2- és cy;.3~régióját kódoló exonokat tartalmaz.

Ο Ό >. * »« # « 9 * * » ♦ ♦ * * « ♦ # χ »·>·>* # * V X X ♦ Φ χ XX XX » » >*' *«τ 9

A patkányeredetű JTT-l™antigén extreeslluláris régióját kódoló Xhcl/BamHI-fragmenst. és a humán lgG.1 Fc-régiöját (IgFc) kódoló exonokat tartalmazó Bariéi/Xbar-fragmenst Xhol-gyei és Xhal-gyel emésztett - pBluesoríptlI-SK(+)-vektorba (Stratagene) ssubklónoztuk.

Ezt követően a plazmádat Xhol-gyei és Xbal-gyei emésztettük, és - a patkányersdetű JTT-l-antigén extracelluláris régiót és a humán igPc-t kódoló fúziós DNS~t tartalmazó ~ 1,8 kb-os DNS~fra.gm-en.st kivágtuk. Ezt a fúziós DNS-fragmenst - Tá-DNS-iigázzai - a pMEXSS expresszíós vektor (Medical Immunology 20(1},· 27 (1930; ; Exparimentsl Maciciné: SU.PPLEMENT, Handbook of Genetic Englneering”, dosha 101-107. old (1932)j Xhol- és Xbar-h • ye inszertáltuk, miáltal a prJTT-1-IgFc-pIazmídot kaptuk.

% magzati borjúszérumot tartalmazó BMEM-tápközegben, egy sejtrétegben, kontinens állapot eléréséig tenyésztett BEK293~sejteket (ATCC CRL 1573) elsktroporáoió alkalmazásával prJTT-I-lgFo-piazmiddal transzformáltuk.

A kapott transzformánsokat - az rJTT-l-XgFc fúziós protein szpresszáltstása céljából - szérummentes· ASF104tápközegben 72 óra hosszat tenyésztettük.

Az rJTT-l-IgFc fúziós proteint Broteín-G-Sepharose affinitás! oszlopon (Pharmacia), a következők szerint tiszti tót tűk .

A fentebb említett tenyésztő tápközeg oentrifugáiásá.^•;t ielúiúszót ~ előzetesen kötöpufferrei ekvilibral kapott.

iit - Proteíü-G-Sepharose affinitási oszlopra töltöttük, ijd az oszlopot a kötöpufferrei mostuk, és eiuáió pufferrai elváltuk. Az eluátumot összegyűjtöttük és .foszfátpufferrel szemben, dialízáltuk, miközben a külső oldatot kétszer vagy többször cseréltük. A dialízis eredményeként tiszta a rJTT-l-Ig'Fc fúziós proteint kaptuk.

Az affinitási kromatográfía eredményét a. 18. ábrán, míg a tiszta rJTT-l-IgFc fúziós protein SDS'-PAGS analízisének eredményét a 19.. ábrán mutatjuk be.

A humán ŐTT-1-antigénből és a humán IgG1-Ft-régidbe1 álló fúziós protein (hJTT-l-Igac) előállítása

A hJTT-1-lgFc fúziós proteint az előző, 1. pontban leírtak szerint állítottuk elő, azzal a különbséggel, hogy a poiimeráz-Iáncreakcióhoz más templátot, illetve láncindítékát alkalmaztunk. Ebben az esetben templátként a teljes hosszúságú humán JTT-1-antigént kódoló cDMS-t tartalmazó,

8. példában előállított pS3h4í-klánt, mig iáneindítóként az 5^T-TAACTGTTTCTCGÁGAACATGAAGTCAGGC-3’· i9. azonosítószámú szekvencia? és az 5^! -ATCCTATGGGTAACGGATCCTTCAGCTGGC-3 ’ lánc indítót (10. azonosítószámú szekvencia; alkalmaztuk..

Az affínitás-kromatográfía eredményét a £0, ábrán, a tiszta hJTT-1-lgFc fúziós protein SDS-PAGS analízisének eredményét pedig a 21. ábrán mutatjuk be,

17, példa

Transzganikus egér létrehozása, amelynek genomjábe patkányeredetű JTT-1-antigént kódoló cOHS van integrálva

A teljes hosszúságú, patkányeredetű JTT-l-antigént kódoló, 7. példában előállított cDNS~t DMA űiunting” reagenskészlet (Takara Shuzo) alkalmazásával ~ csirke-B-aktin12 * *« fc ϊ-fc fc * fc fc * fc;

*«·**» promótert tartalmazó - pCAGGS expressziós vektorba [Gene 103» 193 (1991)] inszertáltuk, miáltal a prjTT-l-plazmidot kaptuk, Transzgenikus egér létrehozása céljából a prJTT-iplazmádat restrikciós enzimes kezeléssel linearizáltuk.

Dajkaanya-egérként - fehér XCR-egér (Nihon LSC) és elkötött ondóvezetékű, him fehér ICR-egér (hihon LSC) pároztatásával kapott - vaglnális dugóval ellátott nőstény ICR-egeret alkalmaztunk. Abból a célból, hogy olyan megtermékenyített petesejtet kapjunk, aaelybe bejuttatható a patkány eredetű JTT-l-antigent kódoló gén, PSAMEX <5 -egység, Sankyo Coki) és Pregnii (5 egység, Grganon) beadásával szuperovulációra késztetett nőstény SDF~i~egeret (Nihon LSC) hím BDF-l-egérrei pároztattunk, A pároztatás után a nőstény BDF-l-agér petevezetékét kimetszettük, és a megtermékenyült petesejteket híaluronidázos kezeléssel kinyertük és tápközenben tároltuk.

A patkáryeredetú JTT-1-antigént szokványos eljárással, mikroszkóp alatt, manipulátor alkalmazásával juttatjuk be a megtermékenyített petesejtbe. A petesejtet rögzítófűvel fixáltuk, majd a fentebb említett ~ patkányeredetű JTTi-antigént kódoló - linearízált gént tartalmazó, Tris-SDTApufferrel hígított oldatot 37 °C-on, DNS~bejuttató tűvel a megtsrmékenyítét petesejt hím-pronucleusaba injektáltuk.

A génbejuttatás után kiválasztottuk a normális állapotban maradt, megtermékenyített petesejteket (amelyekbe a patkányeredetű JTT-l-antigént kódoló gént bejuttattuk), és a dajkaanya-egérbe (fehér IGE-egér) petefészkébe ültettük.

»**<

A dajkaanya-agár által megszült utódegér (alapító egér) .farkát levágtuk, és a genomi gént kinyertük belőle. Polimeráz-láncreakcióval megállapítottuk, hogy az egérgenomba. a patkányeredetű JTT-1-antigént kódoló gén integrálódott. Ezt követően az alapító egeret normális egérrel pá~ roztatva olyan heterozigóta, transzgenikus egereket hoztunk létre, amelyek nagy mennyiségben expresszálták a patkányeredetű JTT-l-antigént. A heterozigóta egerek egymással történő keresztezésével homozigóta transzgenikus egerek hozhatók létre.

A patkányeredetű JTT-l-antigént kódoló gént tartalmazó, mikroinjektált konstrukciót a 22. ábrán mutatjuk be sematikusan.

18. ábra

KnoekoutJ'-egér létrehozása, amelynek egéreredetű JTT-lantigént kódoló endogén génje .inaktiválva. van 1; Célbajuttató vektor előállítása

Az egéreredetű JTT-l-antigént kódoló endogén gén inaktiválására - homológ rekombinációval - alkalmas célbaA 9< példa 5. pontjában leírtak szerint kiónozott egéreredetű JTT-l-antigént kódoló régiót tartalmazó - egérgenomi DNS-kión Pstl-gyei és Hindlll-mal végzett emésztésével kapott Pstl/HindlIX-fragmsnst (1. homológ DNS) pGEM-3plazmídba (Promega) szubklónoztuk. Ezután a pGEM-3~piazm±~ dót Xhol-gyel línearizáltuk, és - a pMCl-neo-poliA-plazmidból (Stratagene) Xhol-gyel és Sall-gyel végzett emésztéssel

127 > » «,« *

V * ί * » ♦ » >.«·. * « kivágott - neomíοinrezissténeia-gént (neo? az 1.

DNS-tői 5’-irányba inszertáltuk, majd a plazmidot összeírgáltuk.. A. fentebb említett egérgenomi DNS-kiónt Xhoí-gyel és Notl-gyel emésztettük, miáltal kb, 5,5. kb-os gént (2. homológ DNS) vágtunk ki, amely az 1, homológ DNS-től 5·'irányban helyezkedett el. A ne.o/1, homológ DNS” fragmenst hordozó pGEM“ 3-plazmidot Xhol-gyel és HindiiI-mal emésztve a plazmádból kivágtuk a neo/1. homológ DNS .fragmenst, majd a 2. homológ DNS-t és a neo/l, homológ DNS fragmenst a - Notl-gyel és Hindii I-mal linearizált pSEA?2~CONTplazmidba (Clontech) szubklőno-ztuk.

Az így kapott, 2, homológ DNS/neo./1. homológ DNS” fragmenst tartalmazó· plazmidot az 1, homológ DNS 3 ' -végén Nrul-gyel végzett hasítással líne-arizáltuk, majd az 1. homológ DNS 3*-végére - a pMCl-TK-plazmid. (Stratagene) Pvu'IIvel végzett emésztésével kapott timidin-kináz-gént (TK) inszertáltuk, miáltal a ”2. homológ DNS/neo/I, homológ DNS fragmenst tartalmazó célbajuttató vektort kaptuk.

2} A célbajuttató vektor bevitele ES-sejtekbe % magzati borjúszérumot tartalmazó DMFM-tápközegben tenyésztett embrionális egér-őssejteket [Natúré 352, 255 (Í993); Natúré 3-26, 292 (1937) ] tripszinnel kezelve különálló sejteket kaptunk, majd ezeket háromszor mostuk, és foszfát-puffer hozzáadásával 1 χ I0⁷ sejt/ml sejt sűrűséget állítottunk be. A sejtszuszpenzióhoz· hozzáadtuk az. előző- pontban leírtak szerint előállított célbajuttató vektort (25 ug vektor/1 ml sejtszuszpenzi.ó arányban) , és a szuszpenziót 350 V/cm (25 pF) kapacitású elektromos impulzussal

8 «*κ« «*«* *♦ »β kezeltük. Ezt követően 1 χ. 10' ES-sejtet 10 αη-es csészébe helyeztünk. és fenntartó tápközegben egy napig tenyésztettünk, majd a tápközeget szelektáló tápközegrs cseréltük, amely 250 pg/rnl G41S~at és 2 μΝ gancíclovirt tartalmazott. A sejtek tenyésztése során a tápközeget kétnaponta cseréltük. A célbajuttató vektor sejtekhez történő hozzáadása után tíz nappal, mikroszkóp alatt raíkropipettával 573 neomícin-rezísztens ES-sejtkiört izoláltunk. E kiőnok mindegyikét külön-külön - ^!?Feeder^!’~sejtekkel bevont - 24 üregű tálcákon tenyésztettük, miáltal 768 neomieín-rezisztens ESutődot kaptunk.

3; A knockout^-sejfcek szkrlnelese

Pciimeráz-láncraakcióval igazoltuk, hegy az egéreredetű JTT-l-antigént kódoló endogén gén a neomícin-rezísztens ES-sejbekben - a homológ rekombináció következtében i na k ti vá 1 ó do b1 - e.

A polim.eráz-láncreakciöhoz (1). a fenti neomicín-rezisztencia gén (neo) szekvenciája alapján tervezett és szintetizált láncinditőt (5⁵ -CGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGC

GGCGAáTGGGC-3”; 11. azonosítószámú szekvencia); valamint (2) az 1, homológ DNS szekvenciája alapján tervezett és szintetizált láncinditőt (5’-CATTCAAGTTTCAGGGAA.CTAGTCCATG

CGTTTC-3’) alkalmaztuk.

A neomícin-reziszzens ES-sejfékből külön-külön kivontuk a genom! DNS-t, és azokat templátként felhasználva, a fenti láncinditokkal polimaráz-láncreakcíöt végeztünk. A reakciót 94 °C-O'n 3 perces inkubálással kezdtük, majd 30 cikluson keresztül, ciklusonként 94 C-on agy percig, 60 rza ’C-on egy percig és 72 ^Oc~on 3,5 percig végzett inkubálássál folytattuk, végül a reakcióeiegyet 10 percig 72 °C-on tartottuk. A termékeket 4 ^Cc~on tároltuk. Ha a polimerázláncreakcióval kb. 4 kb-ná.l kisebb fragmens amplifíkálódik, az arra utal, hogy az ES-sejtklónfcan az egéreredetű JTT-1antigént kódoló endogén gén - homológ rekombináció következtében - ínaktiváiódott (knocked out”).

A tesztelt 768 ES-seitklón közül háromból kaptunk kívánt PCR-térmékét. E három klón további szkrinelése céljából genomi Southarn-blot analízist végeztünk. A három kiónból kivontuk a genomi-DNS-t, azt SamHX-gyel emésztettük, és a kapott fragmenseket agarözgél-elektroforézisnek vetettük alá. A kapott DNS-akét nylon-membránra vittük át, és az egéreredetü JTT-I-et tartalmazó genomi DNS-szekvenciából készített próbával hibridizációt végeztünk. A próbát a homológ rekombináció bekövetkezési helyétől kívül eső szekvencia alapján terveztük, ami lehetővé teszi a mutáns típusú genom és a normális genom (méretbeli) megkülönböztetését .

A hibridizáció eredményeként a három, klón egyíkes esetében két csíkot azonosítottunk, melyek a mutáns, illetve normális típusnak feleltek meg. A ^!fknockout”-egér létrehozásához ezt az ES-sej tklónt. alkalmaztuk.

4) ^fíKhocfcont^H~egér létrehozása

A fentiek szerint kapott ES-sejteket - melyek egérJTT-1-antigénjét kódoló endogén génje homológ rekombináció következtében .inaktiválva volt - nőstény C5'7BL6-egér (Nihon Charles Elver) hím egérrel végzett pároztatásával kapott .130

φ.» * hólyagos1rákba (hőiyagcsiránként 15 SS-sejt) injektáltuk. Közvetlenül a mikroinjektálás után a hólyagcsirákat (a méh egyik oldalára 10 hólyagosára mennyiségben) dajkaanya TCRegér (CLSA Japan) - amely 2,5 napja álterhességet előidéző kezelésben részesülő egér volt - méhébe. ültettük, összesen 38 utódegeret kaptunk, melyek közül 13 a kívánt kiméraegér volt. A kiméraegerek közül 11 olyan kiméraegér volt, amelyben az ES-sejtek szőrszín-génje a. szörszin meghatározásában. 80 %-os vagy még nagyobb arányban részesedett.

Az Így kapott kiméraegereket normális ü57SL6-egerekkel keresztezve olyan agoutí-egereket kaptunk, amelyek színét az SS-sejtek szőrszín-génje határozta meg.

Antitestet tartalmazó gyógyászati készítmény előállítása

Injektálható készítmény előállítása céljából a patkányeredetű JTT-1-.an.tígén elleni, 1. példában leírtak szerint előállított mono klónál! s antitesteket (JTT-1-, i.lletv« J?I~2~antítest} 50-15Ö fig/ml. mennyiségben, illetve a humár JTT-l-antigén elleni SA12 és SG430 monoklonális· antitesteket - külön-külön - injektálható desztillált vízhez (10· ml)

A következőkben a találmány szerinti, emlősökből (emberből, egérből és patkányból) származó sajtfeiületi molekulákat <JTT-l-antigéneketj jellemezzük..

(1) A JTT-l-antigén a következő sajátságokban hasonlít a CD£3~hoz (amely iimfocitákon, pl. ϊ-sejteken léve sejtfelületi molekula, amely sejtadhéziő révén a T-sej taktiválásban fontos ko-stimuiátor szignált közvetit) és a CTLA-4-h.es (amely límfocitákon, pl. T-sej teken lévő sejtrelöleti molekula, amely a szignállal együttműködve az aktivált límfociták, például aktivált T-sejtek, működését szabályozza) :

(1) 20 vagy több aminosav - köztük risztéinek - nagymértékben konzerválva van;

(ii) az extracelluláris régióban a - ligandumköto régióként kulcsfontosságú - Pro-Pro-Pro (FPP) ismétlődő szekvencia konzerválva van;

(iií) a cíteplazmikus régióban a szignálátvivö régióként kulcsfontosságú Tyr-Xaa-Xaa-Met (YxxM) szekvencia (ahol Xaa és x jelentése tetszőleges aminosav) konzerválva van;

(iv) az egérkromoszómán az egér JTT-l-antígenz kódoló gén lókusza az 1C3, amely azonos az egér-CDzé és egérCTLA-4 lokalizációjával.

(2) A JTT-1-antigén képes a thymociták, a mitogénnel (pl. ConA-vai) stimulált Iimfoblasztok és tbymomák sejtadhéziőjárnak közvetítésére (hasonlóan a CD23-hoz és CTLA-4hez) .

(3) A JTT-l-antigén nagy mennyiségben ezpresszálődik, legalább a thymecítáfcban, a mitogénnel (pl, ConA-vai) aktíváit iímfcblasztokban (aktivált T-iimfobiaszt-sejtekben, aktivált 8-iimfoblaszt-sejtekben, stbj, a perifériás vér limzoeitáiban és a thymomáfcban.

(4) A. JTT-1-antigén elleni antitest a humán perifériás vér iimfocifáinak jelentős mértékű prolii©rációját indu32 · „._r «* ft* kádja, ami a T-sejbeken található - az antigén-prezentáló sejtektől érkező# T-sejt-aktíváiásban kulcsfontosságú elsődleges szignált felfogó - TcR/CD3-k.omplexet alkotó CD3 elleni monoklonális antitest jelenlétében fokozódik.

(Sí A ŰTT-l-antigén elleni antitest adagolása jelentős mértékben gátolja a kísérleti allergiás agy-gerincvelőgyulladás (EAE) tüneteit.

(ő) A J?T~1-antigén elleni antitest giomerulusalapmembrán (G3M) vesegyulladás pstkánymodeiljének adagolva jelentős mértékben gátolja e betegség tüneteit.

A találmány szerinti JTT-l-antigént - hasonlóan a CDzS-hoz és CTLA-4-hez - olyan molekulának tartjuk, amely szerepet játszik a limfoeiták (pl, T-sejtek) aktiválása szempontjából kulcsfontosságú másodlagos szignál (ko-stimuiátor szignál) átvitelében é:

szignállal eoyüttműködve

- az aktíváit limfoeiták (pl. aktivált T-sejtek) működésének szabályozásában.

ilyenformán, a találmány szerinti sejtfelületi molekulákat alkotó polipeptidek, azok fragmenseí, illetve a belőlük létrehozott fúziós molekulák, valamint a találmány szerinti antitestek rendkívül hasznosak különböző - a limfoeiták (pl. T-sejtek) aktiválása és az aktivált limfocífamükődés szabályozásának rendellenességei okozta autoimmun betegségek, allergiás betegségek és gyulladásos betegségek (közelebbről, reumaszerű izületi gyulladás, solerosis multiplex, autoimmun pajzsmirigy-gyuliadás, allergiás kontaktus-típusú dermatitis, krónikus gyulladásos dermatosís, pi. liohen planus, szisztémás erythem.ás lupus,

33 ♦« > * * 0 « «00 >««« «000 0 0 » <

* 00 0* inzulinfüggő diabetes: aseliitus és pikkelysömör) kezelésére vagy megelőzésére alkalmas gyógyszerek hatóanyagaiként.

Hasonlóan, a találmány szerinti poiipeptideket, illetve polipeptid-fragmenseket kódoló gének nemcsak a fentebb említett, különféle betegségek génterápiájára, hanem antíszensz hatású gyógyszerek előállítására is alkalmasak.

A találmány szerinti antitestek közül a. humán monokionáiis antitestek es az azokat tartalmazó gyógyászati készítmények rendkívüli mértékben fokozzák az antitesttartalmú gyógyszerek gyógyászati értékét, mivel emberekkel szemben nem fejtenek ki antigénhatást, ami a nem humán emlősökből származó antitesteket (pi. sgéreredetü antitesteket) tartalmazó gyógyszerek egyik súlyos mellékhatása.

A találmány szerinti gének (DNS-ek), polipeptidek, poiipeptíd~fragmensek és antitestek nem csupán gyógyszerként, hanem a találmány szerinti sejtfeiületi molekulákkal különcsöühatásba lépő molekulák (iigandumok) keresésére, a ligandum funkciójának tisztázására, illetve a iigandumokat megcélzó hatóanyagok kifejlesztésére is alkalmasak.

Ezen túlmenően, a találmány szerinti transzgenikus egér nem csupán a találmány szerinti sejtfeiületi molekula (JTT-i-antigén) fiziológiai funkciójának tanulmányozására szolgáló állatmodeilként, hanem különböző, a JTT-l-antigén működését szabályozó (gátló, szuppresszálö, aktiváló, serkentő, stb.) hatóanyagok (kis molekulatömegű vegyületek, antitestek, antiszegsz anyagok, polipeptidek, stb.) sz.kr.i~ nőiesére is alkalmazhatók. Az ilyen tesztelni kívánt anyagok a kísérleti állatban megfigyelhető, különféle fiziolő134 gíai, biológiai és farmakológiai paraméterek mérése és vizsgálata céljából adhatók be a transzgeníkus egereknek, és a kiváltott hatások alapján meghatározható a beadott, tesztelt anyag aktivitása.

A találmány szerinti '*knockott^>í~egér alkalmazásával ~ az egér különböző (fiziológiai, biológiái, farmakológiai, patológiai és genetikai) szempontoknak megfelelő jellemzőinek vizsgálatával - tisztázható a találmány szerinti sejtfelületi molekulák funkciója.

’> * Φ *' * X » » 'Sf. Ϊ

SZEKVENCIALISTA

AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI;

HOSSZA: SOO

TÍPUSA: nukíeinsav

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULÁTíPUS;: cDNS-től mPNS

EREDETE FORRÁS:

ÉLŐLÉNY: Homo sapiens

SAJÁTSÁG::

NÉV/MEGJELÖLÉS: cds

ELHELYEZKEDÉS: 1,.,600

AZONOSÍTÁSI ELJÁRÁS: S

AZ I. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

ATG	AAG	TCA		CTC	rp·.·**:,·*»· J. mm		φίΤίρ •I L Π		Μ -l	30
Met	Lys	Ser	Gly	Leu	Trp	Tvy - Λ ~	Phe	Phe	Leu 1 A
>y< 'P i 1 ó	>T< .<*·<**:	TTG	CGC	ATT	AAA	z*wt« Ul i	TTA,	ACA	<*»..·* -x MmA	60
Phe	n· y	πβ íi	Arg	He 15	Lys	Vei	Leu	Thr	Gly 20
GAA	\\ en >·** a*Á.Í	AAT	<-< /-'• m MM 1	X v i	GCC	AAT	TAT	GAG	ATG	OÁ
Gin	He	Asn	Gly	Ser	Aa a	Asn	Tyr	G .1U	Met
				25					-Λ JU
JV?	ATA	TTT	CAC	AAC	GGA	Λ-x <-«vt	GTA	CAA.	r. rfx .-r» ÍTU. Λ	±.2 tí
Phe	He	Phe	Ha s	Asn	Gly	Gly	Val	Ül.u	Tle
				35					•4 U

1Ο * * « s. .<* * * * * Λ » X * ·> ««,*»« >

* > * * '*♦** « χ :, » λ» λ » * *r Ay *

*V4 fp« Τ' 1

TGC

AAA

TAT

CCT

GAC

ATT

V? χ V

CAG

/-x TV 7*. UUi

> C ‘A

Τ Λ ’ t Jmí V· Ά

Cys

T x ,* zr •Smí V

Tyr

P / £·

Asp

lle

Val

Gin

Gin

4 5

50

ηχ .-ρ φ .1 .x j.

AAA

ATG

CAG

rncv* X X VT

CTG

AAA

GGG

GGG

CAA

1

8

A *VJ

Phe

Lys

Met

Gin

Len

Len

Lys

Gly

zS 1 . . •^1}'

Gin

SS

SO

ATA

/'· «”> y'í

φ gc

GAT

CTC

ACT

•η Τ'

AGA

AAA

GGA

2

1

V

lle.

UGU

Cys

Asp

Len

Tt. p

Lys

Thr

Lys

Gly

55

70

τ' .··** rn jT’l'J? X

,— .··* 1\ tjein.

AAC

ACA

,C*ÍR A* \3 1 XJ

TCC

ATT

AAG

AGT

W v~* V.' X kJ

X\

4

0

Ser

Gly

Asn

Thr

Val

Ser

11 e

Lys

Ser

Leu

75

80

AAA.

re-í rp/**

TGC

CAT

TCT

CAv.i

C'fT»

TCC

AAC

AAC

*7

0

Lys

Phe

Cvs: -· 1 ~

Hís

•XÜ'f'

Gin

Len

Ser

Asn

Asn

85

90

hG ϊ ..

f'· CT/*' xj x x-

TCT

Í/CÍJ·· f?>

?γχ?ρ<γ>

CTA

TAC

AAC

Φ o ··’·’ 1 X 'J

/·* Λ

3

/**

7\

Ser	Val Ser	Phe	Phe	Leu	Tyr		Leu	Asp
			95					100
f·'· ·& T •XAJ.	TCT CAT	GCC	AaL	TAT	IAC	«nv* x. 1 v	TGC	AAC	3	30
Hx.s	Ser His	Alá	Asn	Tyr	Tyr	Phe	Cys	Asn
			10 5					X x v
CTA	TCA ATT	TTT	GAT		CCT	CCT	cpzftrft	nAA		60
U c u	Ser lle	Phe	Asp	Pro	T»<r\ Js· X W	i. X Vz	PHía	Lys
			115					.120
,-’ WK kJ 1 Jk	AGT CTT	ACA	GeA	GGA	TAT	TTG	CAT	ATT	3	90
aX~ *f V &	Thr Leu	Thr	Gly	ery	Tyr	Χώ	Hís	Lle
			125					x 3 u
TAT	GAA TCA	CAA	/·* cp-ffii. V. i i	TGT	TGC	CAG	CTG	AAG	4	2 0

Ο

							137				*
											* *
T7r	G1 ti	Ser	ttsoL n	Leu	Cys	C ys'	Gin	Tv<»vt Λ, KÍ l*	Lys
				135					140
«7 rjs .·*> Λ X ttz	i 'tttt?	TTA	tt, tt, tt	>\ >t»t\	CGA	TGT	•'-'Z'^TS ttíttx-r*.·.	Z^Z*/** ttJtt,ttfc	J*x rp ftt	4	50
Ph e	Φ >~r>. X Α» £.·>	ΙίβΧΛ	Pro	Ile	Oly	Cys	η Ί — Λ.Χ. tt.	.£Lt tt	Phe
				145					150
Λ. ,ν, »γγ tt? X X	CTA	tt? i tt.	'TttsC	ATT	TTG	GGA	<n X tt3tt.·	ATA	z'* :p <p	4	80
Va 1	Va 1	V-s ?	Cys	Ile	Len	Gly	Cys	He	Len
				Χζ £ X. ...'					160
ATT	TGT	TGG	»JT51*fí tt, i X	ACA	nAA	AAG	AAG	TAT	TCA	5	- e j. ·,
11«	Cys	Trp	L<eii	X XXx,	~. v— » .1 -	Ly»	Lys	Tyr	Ser
				x £ •X O tt					170
«ν'τ 1. X^.'C··		{·-*ΓΗ f'·'	s-X 'X. ,*»	GAC	CCT	AAC	GGT	GAA	TAC	5	40
3 β ,r	3 β .ι;	Val	His	Asp	Pxo	Asn	r-* 7 . , ttr x. v	Glu	Tvr .i
				175					180
X W..*í .íó.,.1 tt?	.“{> w <*» X Λ tt-	ATG	AGA	GCA	tt? X tt?	AAC	ACA	GCC	AaA	5	70
Ίi*·; tt tt ,	Phe	Me t	Arg	Ala	Val	Asn	Thr	Ala	nys
				135					190
áAá	TCT	AGA		ACA	GAT	GTG	ACC	..'vfW -X tt.. χ	TAA	b	00
Lys	Ser	Arg	Len	Thr	Asp	Val	Thr	neu

195

X , * fc fc. fc Φ * «

V Φ*φ «

A 2 , AZONOSÍTÓ: SSÁMÜ SZEKVENCIA ADATAI A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 139

TÍPUSA: aminosav

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: protein

U<£

FORRÁS:

♦ :·«:«

ÉLŐLÉNY:· Homo sapiens

A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA;

Met	Lys	Ser	Gly Leu 5	Trp	Tyr Phe	Phe	Leu 10
Phe	cys	Leu	Arg	He	Lys	Val	Leu	Thr	Gly
				IS					20
Glu	11 e	A S *:	Gly	Ser	Alá	Asn	Tyr'	Glu	Met
				25					30
Phe	He	Phe	His	Asn	Gly	Gly	Val	Gin	He
				35					40
Leu	Cys	Lys	Tyr	Pro	Asp	Tle	Val	Gin	Gin
				45					50
Phe	Lys	Met	Gin	Leu	Leu	Lys	Gly	Gly	Gin
				55					60
He	Leu	cys	Asp	Leu	Thr	Lys	Thr	Lys	Gly
				65					70
Ser	Gly	Asn	Thr	Val	Ser	He	Lys	Ser	Leu
				75					80
Lys	£?*·*;£>	Cys	His	Ser	Gin	Leu	Ser	Asn	Asn
				85					50
Ser	Val	Ser	Phe	Phe	Leu	Tyr	Asn	Leu.	Asp
				95					100
His	Ser	His	Alá	Asn	Tyr	Tyr	Phe	Cys	Asn
				105					110
Leu	Ser	He	Phe	Asp	r	Pro	Pro	Phe	Lys

115 12 0

V fti

Tvr lle

- 139 Thr Leu Thr Gly Gly Tyr Leu Kis

125

Glu Ser Gin Leu Cys Cys Gin Leu

135

Trp Leu Pro lle Gly Cys. Alá Alá

145 vei Val Cys Ire Leu Gry Cys ile

155

Cys Trp Leu Thr Lys Lys Lys Tyr

165

His Asn Pro Asn Gly Glu «λ. Vei.

175

Ile

130

Lys

140

Phe

Ι. 0 v

Leu

16' 0

Ser

170

Tyr

180

Phe Met Arg Alá Val Asn Thr Alá Lvs

Ser Arg Leu Thr Asp Val Thr Leu

195

A 3, AZONOSÍTÓ SZÁMÖ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 2510

TÍPUSA; nukieinsav

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULÁT!PUS: egyéb nukieinsav (3'és 5’ nem transzlatált szekvenciákat tartalmazó cDNS

EREDDTT FORRÁS;

ÉLŐLÉNY: Homo sapiens

SAJÁTSÁG:

UÉV/MSGJELÖLÉS: eás .40 * * « jr « «

ELHELYEZKEDES : 26. .. 625

AZONOSÍTÁSI ELJÁRÁS: S

A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GlxAe	:tgt:	CAA CTGTTTCTGG CAAAC
ATO	AAG	TCA	z*» z·» .«x <2?U^ Vlt	TGe	TAT	η- m,·^	rp>	CTG
Á/f ;p J	Lys	Ser	Gly Leu	Trp	Tyr	Ph.<5	Phe	Leu
			5					10
•ví m ,*» x X· x»·	fX5 x lóA*»	φίΤ> .·*« X X \x	CGC ATT	AAA	ÁJ Λ 1	TT.A		GGa.
PlóíS	Gys	Leu	Arg lie	Lys	v a.1	Leu	Thr	GI y
			15					-*j {>
GAA	•a rn X'XX	AAT	ÁJ<XJ X X \y .X	OCC	AAT		GAG	ATG
Giu	He	Asn	Gly Ser	Λ.Ι a	Asn.	Tyr	Gr u	Met
			25					30
.Τ' ·ΤΪ ΓΠ i X i	ATA		CAC AAC	GGA	Á5'G? X	GTA	ΓΪ s.	ATT
Phe..	He	Phe	His Asn	/** J χ * <25 Λ V	Cl χ* 'CJX λ/	t? .~. T V 5SX	Giu	T : Λ X -X
			35					40
ί'η/φτν	rt°!>N S*< X	AAA	TAT CCT	z*'* /**		z-· ρτ> ··* >XS X	CAG	GAA
L$U	JV-S \z j· 'S	Lys	X X. X X *X'	Asp	I is	Vei	ÁJ Λ Ti	Glu
			45					50

Τϊτγχ,Τ	AAA.	7^Zf<z-		X X \2	CTG	AAA	GGG	Z-'Z-'Z*'	CAA	•‘Ά ·.*.
Fii	TjVS	Met	Gin	Leu	reu	-i-j y S	Z' C ,· uxy	G'J v	Gin
				55					O <J
ATA	CTG	TGC	yx Ti ro	CTC	ACT	AAG		AAA		y\ ys .·· Z y$ *'j
lie	Α^Λ.'	vy c<	Asp	7 ctiix Ú LX	Thr	Lys	Thr	Lys	Giy
				.e. ~·					_
				W					'* vy
x z-> cr> .ídÁJ X	/»» X UájM	AAC	ACA	GTG	TGC	ATT	AAG	AGT	C* Pp Z'' \y X \J	2 65

Ser	Gly	Asn	Thr	V 3.1	Ser	lle	LiV S	Ser	Τ,Λ’Μ x3 vx
				7 5					80
AAA	TTC	TGC	CAT	TCT	y	TTA	C	AAC	AAo	295
Lys	Pne	Cys	His	Ser	k3ükXl	Len	Ser	Asn	Asn
				85					90
•a xXks I	O 1 X·	<T>f · >T» 1 \e A	TTT	W:C£!7?<	k.. ΪΛ	wn ,*«	AAC	TTG	f-' 7. f'' XTx -«.k»·	325
Ser	x 7-\ $ V d X»	Ser	Phe	Phe	L<&u	Tyr	Asn	Len	Asp
				95					•Γ tt y\ x V V
γ”· Tt rpi X	T q rV:	CAT	GCC	AAC		TAC		TGC	Λ TV s* j’U’lk*	355
Hi s	.Ser	His	Azt d	Asn	:ep , X V X-	Tyr		Cys	Δ jS'vx Au x i
				j. v O					1 « A X x v/
U ’l jÍ<	yn y'’	ATT	TTT	GAT	CCT	CCT	.-γ,·'· vp	TTT	AAA	385
Len	S β Γ	v X .1	'O V' Λ X i i kí	Asp	O -V-/*». X X W	Pro	Pro	Phe	Lys
				115					120
GTA	ACT		ACA	GGA	GGA	c> >5 φ	TTG	CAT		415
val	_ Thr	Len	Thr	Gly	Gly	Tyr	Leu	His	lle
				125					130
TA’T	GAA	TCA	CAA	y-»mw V.· i X		TGC	CAG	CTG	AAG	4 .4 · 4 4 3
Tyr	om	Ser	Gin	Leu	Cys	Cys	Gin	Len	Lys
				x •s ·-/					140
X 1 '·..,	<m ..«·« y-» x <51.7	TTA	CCC	ATA	GGA	1 X	GCA	Z- λύ. y* sX?k.«Xw>	TTT	Λ Ü* ti : 0
PHíS	Trp		Pro	Lle	(3 < χ x <z.i. je	Cys	Ala	Ala	p b y*
				145					150
GTT	GTA	\3 1 ku	m .•χ ,·' 1 ;-3X~.	ATT	>rtη·χ x x kx‘	GGA		ATA	/’n.rt'ljíp· <. i x	C Λ C xU 3
Val	Val	Val	Cys	lle	Len	Gly	Cys	Lle	Len
				155					ISO
y. ?*> ftí fk.-i 1	rf< r*» w	TGG	OTT	ACA	AAA	AAG	AAG	m y, w X Λ1	TCA	3 0
TI 1 x «	Cvs	Trp	Len	Thr	LíVS	Lys	Lys	Tyr	Ser

- 142 ♦· «χ

165

0

TCC AGT CTG CAC CAC CCT .AAC GGT GLA TAC

SS

Ser .Ser Val His Asp Pro Asn. Gly Glu Tyr

175

180

ATG TTC ATG AGA. GCA CTG AAC ACA GCC AAA

95

Met Phe Met Arg Alá Val Asn Thr Ara Lys

185

190

AAA TCT ACA CTG ACA GAT CTG ACC CTA TAA

5

Lys Ser Arg Leu Thr Asp Val Thr Leu

135

TATGGAACTC

TGGCACCCAG

GCATGAAGCA

CGTTGGCCAG

TTTTCCTCAA

5

CTTGAAGTGC

AAGATTCTCT

TATTTCCGGC

ACCACGGAGA

GTCTGACTTA

725

ACTACATACA

TCTTCTGCTG

GTGTTTTGTT

CAATCTGGAA

GAATGACTGT

5

ATCAGTCAAT

GGCCATTTTA

A.CAGACTGCC

T7GG7ACTGC

CCAG7CCTC7

625

CAAAACAAAC

ACCCTCTTCC

AACCAGCTTT

GGAGAAAGGC

CAGCTCCTGT

675

GTGCTCACTG

GGAGTGGAAT

CCCTGTCTCC

ACATCTGCTC

CTAGCAGTGC

925

ATCAGCCAST

AAAAcAAACA

CATTTACAAG

AAAAATGTTT

TAAAGATGCC

975

AGGGGTACTG

AATCTCCAAA

GCAAATGAGC

ACC CAAGGAC

CAGCATCTGT

1025

CCGCATTTCA

CTATCATACT

ACCTCTTCTT

TCTGTAGGGE

TGAGAATTCC

1075

TCTTTTAATC

ACTCAAGGCA

GATGCTTC.A?.

AGG TGGPGCT

ATTTTATTTC

1125

TGAGATGTTC

ATGTGAACTC

TACATTAGTA

CATA.CTCAGT .ACTCTCCTTC

1175

AATTGCTGAA

CCCCAGTTGA

CCATTTTACC

AAGA.CTTTAG

ATGCTTTCTT

1225 sT GCo r T CruS.

TTTTCTTTTT

AAAAATACTT

CTACATGACT

GCTTGACAGC

1275

CCAACACCCA

CTCTCAATAG

Claims (16)

1. AGAGCTATGT

   CTTACATTCT

   TTCCTCTGCT

   1325

   SCTCAATAGT

   TTTATATATC

   TATGC.ATAC.A

   TATATACACA

   CATATGTATA

   1375

   TAAAATTCAT

   AATGAATATA

   TTTGCCTATA

   TTCTCCCTAC

   AAGAATATTT

   1425

   TTGCTCGACA

   AAGACATGTT

   CTTTTCTCAA

   ATTCAGTTAA

   AATGGTTTAC

   147 5

   TTTGTTCAAG

   TTAGTGGTAG

   GAAACATTGC

   CCGGAATTGA

   AAGCAAATTT

   1525

   - 143 AWWTTATTAT

   CCTATTTTCT

   ACCATTATCT

   ATGTTTTCAT

   GGTGCTATTA

   1575

   ATTACAAGTT

   TÁGTTCTITT

   TGTAGATCAT

   ATTAAAATTG

   CAAACAAAAT

   1625

   CATCTTTAAT

   GGGCCAGCAT

   ICTCATGGGG

   TAGAGCAGAA

   TATTGATTTA

   1675

   GCGTGAAAGC

   TGCAGTTACT

   ATAGGTTGCT

   GTCAGACTAT

   ACCCATGGTG

   1725

   CCTCTGGGCT

   TGACAGGTCA

   AáATGGTCCC

   CATCAGCCTG

   GASCAGCCC T

   1775

   CCAGACCTGG

   GTGGAATTCC

   AGGGTTGAGA

   GACTCCCCTG

   AGCGAGAGGC

   1825

   CACTAGGTAT

   TCTTGCTCCC

   AGAGGCTGAA

   GTCACCCTGG

   GAATCACAGT

   1875

   GGTCTACCTG

   CATTCATAAT

   TCCAGGATCT

   GTGAAGAGCA

   CATATGTGTC

   1025

   AGGGuACAAT

   TCCCTCTCAT

   AAnAACCACÁ

   CAGCCTGGAA

   ATTGGCCCTG

   1075

   GCCCTTCAAG

   ATAGCCTTCT

   TTAGAATATG

   ATTTGGCTAG

   AAAGATTCTT

   2025

   AaÁ'Í n T G1 Ge

   AATATGATTA

   TTCTTAGCTG

   GAATATTTTC

   TCTACTTCCT

   2075

   GTCTGCATGC

   CCAAGGCTTC

   TGAAGCAGCC

   AATGTCGATG

   CAACAACATT

   2125

   TGTAAGTTTA

   GGT.AAACTGG

   GATTATGTTG

   TAGTTTAACA

   TTTTGTAACT

   2175

   GTGTGCTTAT

   AGTTTACAAG

   TGAGACCCGA

   TATGTCATTA

   TGCATACTTA

   2225

   TATTATCTTA.

   AGCATGTGTA

   ATGCTGGATG

   TGTACAGTAC

   AGTACWTAAC

   227 5

   TTGTAATTTG

   AATCTAGTAT

   GGTGTTCTGT

   TTTCAGCTGA

   CTTGGACAAG

   2325

   OTGACTGGCT

   TTGCAGAGGT

   GTTCCCTGAG

   TTGTTTGCAG

   GTTTCTGTGT

   2375

   AgGgGTGGG

   GTATGGGGAG

   G.AGAACCTTC

   ATGGTGGCCC

   ACCTGGCCTG

   2425

   GTTGTCCAAG

   CTGTGCCTCG

   ACACATCCTC

   ATCCCAAGCA

   TGGGACACCT

   2475

   CAAGATGAAT

   AATAATTCAC

   AAAATTTCTG

   TGAAATCAAA

   TCCAGTTTTA

   525

   AGAGGAGCCA

   CTTATCAAAG

   AGÁT TI TAAC

   AGTAGTAAGA

   AGGOAAAGAA

   575

   TAAACATTTG

   ATATTCAGCA

   ACTGAAAAAA

   AAAAA

   2610

   A. 4 . AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI::

   A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

   HOSSZA; 2072

   TÍPUSA; nukleinsav

   TOPOLÓGIÁJA: lineáris

   144

   MOLEKULÁTIPUS: egyéb nukieinsav {3’és nem transzrátáit szekvenciákat tartalmazó cDNS

   EREDETI FORRÁS:

   ÉLŐLÉNY: Kartus

   SAJÁTSÁG:

   NÉV/MEGJELÖLÉS: cds

   ELHELYEZKEDÉS: 35..,637

   AZONOSÍTÁSI ELJÁRÁS: S

   •Λ C*,

   ONÖS

   ÍTó ;

   SZÁMÚ SZERVEI

   7C IA

   LEÍRÁSA:

   ,·-' m-,^χ tv z~ £ ebAGG¹ ρ TV

   AGAG’

   TGCAGC TGTTCC “·:(ϊ,ζ<^:Ζ< λ ’v Z· TV ,·“*

   .. £ tjük, Λ«Λυ £ m z'·

   AAG

   CCC

   GTC

   Ο ·Ή ’V ··*' ·*ύ Z> iii (5 4

   Met

   Lys

   Pro iyr

   Phe Ser Cys

   Val

   Phe Val

   I

   · π

   U. V

   TTC i UíV-£t Φ <·**

   CTA ,ATC .AAA OTT

   TTA

   ACA GGA

   Phe

   ..Cys

   Phe

   Leu

   Tle Lys Len

   Áí S oi

   Thr Gly

   iÖ

   GAA rn ,··*’ s«» 1 Ί»·

   AAT

   GAC

   TTG GCC AAT

   AGG ATG

   124

   Glu

   Leu

   Asn

   Asp i;St Al a Asn

   Kis

   Arg Met

   .1 i m ·~χ i w

   TTT

   Γ'τχ r·» •vAV

   GAT GGA GGT

   GTA

   CAG ATT

   154

   Phe ς_;=>τ

   Plv s

   His

   Asp Gly Gly

   Val

   Gin He

   «V J~

   Őz

   m ,'-s rn i 1

   TGT

   AAC

   TAC

   CCT GAG ACT

   GTC

   CAG CAG

   184

   Ser kx V kJ

   Asn

   Tyr

   Pro Glu Thr

   Val

   Gin Gin

   c; n •^r V'

   TTA

   AAA •η o z' <3

   CAG

   TTG TTC AAA

   GAC

   AGA GAA

   214 * ΛΑ φ »Φ

   Leu cys

   Met

   Gin

   Leu

   Phe uy s

   Asp

   Ar g

   Ό1 Li

   Aw X*¹

   6G

   GTC

   CTC

   TGC

   GAO

   ACC

   PAG

   ACC

   AAG

   GGA

   Leu

   Cys

   Asp

   Leu

   Thr

   Lys

   Thr

   Lys

   Gr y

   AGC oG.A.

   AAC

   ACC

   GTG

   TCC κ τ ΛΧν

   AAG

   AAT

   CCC

   Ser

   Gly

   Asn

   Thr v a i

   Ser

   Ile rys

   Asn

   Pro

   T 3

   Λ X ^!-c .ψ f» r·*'*’

   X •T> f⁹ Τ'

   X t

   U.· \^ΆΊ·

   ÍV? V\ 'Τ' ,·”· Ά f'* G?X'

   CTG

   T·?***/**·

   X.

   PÁC

   AAC

   Met

   Ser

   Cys

   Pro

   Tyr <2Ί rs xU ^ν,ΧΪ

   Leu

   Ser

   Asn

   Asn

   S a

   ‘Λ .·* ’Τ* -i

   GTC .**<>*< x e -C ^TT ίΤίΤ/*· * X· \*.·

   CTA

   GAC

   AAC <·«» f** Λ sJfWt.

   GAC

   Ser

   Val

   Ser

   Phe

   Vx

   Leu

   Asp

   Asn

   Alá

   Asp

   100

   AGG

   CAG .·** <*«·/*«· acr .Xxí\.

   TAC

   TTT

   TTA

   TGC

   AGC

   S e r.

   Ser

   Gin

   Gly

   Ser

   Tyr

   Phe

   Leu

   Cys

   Ser

   105

   110

   CTG .i vb

   ATT

   TTC

   GAC

   CCA

   Geo

   CCT νρτψ

   CAA

   Γ.,:5'._Ί

   S e^;r

   Ile

   Phe

   Asp

   Pro

   Pro

   Phe

   Gin

   115

   * ΎΛ X, jÍ. xJ

   GAA

   7! Ti a'WO

   AAC /-ví*tfr>

   ACT

   GGA

   GGA.

   ívj v, τ X.Í-5.X,

   TTG r X í

   Glu

   Lys

   Asn

   Leu

   Ser

   Gly

   Gly

   Tyr

   Leu

   Leu

   125

   130 .ATT

   TAT

   GAA ff* ν'* «Τ'*

   X s-x \~·

   CAG f-fíljVV d 1 i

   TGT

   X 'Cíü·

   CAu

   Γ<?γ· x·^ X '-0?

   Is

   Tyr < > . , v r u

   Ser l vx xi il

   Leu

   Cys

   Cys

   Gin

   Leu

   135

   140

   AAe

   χγχ z- s*

   TTA

   TT.--N x^U\>· /*».<« r< x3 ÍJ**

   GGG

   TGT

   CCa

   GCT

   JÓS

   64

   424

   454

   484:

   146 ·*' fc „ *0 ***· *♦* * * **£

   Lys

   Leu Trp Len Pro .145

   Val

   Gly

   c.ys

   Alá

   Alá

   150

   ITT

   GTG

   GCA

   GCG

   CIC

   CTT

   ITT

   GGA

   TGC

   AIA

   514

   Phe

   Val

   Alá

   Alá

   Leu

   Leu

   Phe

   Gly Cys lle

   155

   160

   TIT

   AIC

   GTG

   IGG

   GCA

   AAA

   AAG

   AAG

   TAG

   544

   Phe lle

   Val

   Trp

   Phe

   Alá •LVS

   Lys

   Lys

   Tyr

   165

   170

   AGA

   ICC

   AGT

   CTG

   CAC

   GAC

   CCT

   AAT

   AGC

   GAG

   574 .Arg

   Ser

   Ser

   Val

   Hís

   Asp

   Pro

   Aso

   Ser

   Gr u

   175

   ISO

   IAC

   A.TG

   TTC

   ATS

   GCG

   GCA

   GTC

   AAC

   ACA

   AAC €04

   Tyr

   Met

   Phe

   Met

   Alá

   Alá

   Val

   Aon

   Thr

   Asn

   165

   190

   AAA

   AAG

   ICC

   AGA

   CTT

   GCA

   GGT

   ATG

   ACC

   ICA €34

   Lys

   Lys

   Ser

   Arg

   Leu

   Alá

   Gly

   Met

   Thr

   Ser

   195

   200

   TAA

   637

   TCIGGAACAC

   GGGAACCCAT

   GGAGGAACIA

   CACTGICTAG

   ITCCCCTGAA

   637

   ACTTGAATGG

   AeAAAG T CIT

   CIAIITTGIG

   GACCACAGGG

   CATCIGACII

   737

   GAITAACTAC

   TGA.TACCTCC

   TITTGGKGII

   ITGITIGTCT

   GGATCAGTGA

   737

   CTATCAGTCA

   CICGGAATIT

   CAG CAG ACIG

   CCCIGGGTIT

   GCTGAGTCCI

   837

   TTIAAGGCAA

   ACCCCTTCTT

   AIAGAAGACC

   CGGCTCATAT

   GTATTCAACA

   37

   AACAGACCTC

   ACIGGGATAC

   AATCCCCTCT

   TTCTGCGCCT

   GCTTCTAGCI

   337

   AIGCACCGGC

   CAGCAAgACA.

   AACAIATCIC

   CAGCAITTIT

   ACAAAAAT G C

   387

   CAGGGTATGA

   AICTGIAAAG

   I ÁG.AC Ao G CA

   3CCATTGACC

   ACCCICTGIC

   1037

   ClCGTITTIT

   CAGATICTAT

   TUTI ICC. AT

   AGAGAICAGC

   ATTCCTTCIA.

   1037

   GAA.T CAGiACA,

   GIAGAGGGAG

   ATGCTICACA

   ACAGAAGCIC

   ITA-TGITTC?

   1137

   1. ^5

   L L L* ♦ * X.GAGATGTTGA

   TGAATTCATG

   CTTTAGTACC

   ACCATGTTCT

   CTAACAACTT

   1187

   CTATATTCCA

   GCTGATCACT

   GCTTCAGGGC

   TTAGATGCCT

   GCTTTTGCCT

   1237

   TCAAGTCTCC

   CCTTAAAGAT

   ACTCCCACAG

   GTGTACTTGG

   TGGCCTGCAG

   1287

   OCACTCTGAA

   TAGGAAGTTT

   GGTCTACAAT

   TTCCCCCCTC

   TGCTGCTCAA

   1337

   AAAAAAAAAT

   TAGTAGATAT

   GATTTTCCCA

   TATTCTCCCT

   GCCAAAGTAA

   1387

   TTTTTTCCAG

   CAAAGaCATC

   TAAATTCAGT

   TA.ATATGGTT

   TACTGTGTIG

   1437

   ATATTA.GTGG

   CAGTAAACAT

   TTCTCAGAAT

   CAAAAGCAAA

   TTAATTTTGC

   1437

   GGTGGTGTTT

   TTCTACCATT

   AICTTGGGTT

   TCCATGGTGC

   TATTACTCAC

   1537

   AAGTTTAGOT

   ATTITTTTAT

   GCATCATATT

   AAAGTTGGAA

   GCAAGCAGAG

   1537

   C AAC C c T CG G

   TTAATGGGCA

   AACATTCTCO

   TGGGGTAGAA

   TGAATTGTCT

   1637

   ATTTAGCCGG

   AAAACTGCAG

   TTTCTGTGGG

   TGGCTGCCAG

   ACTAGAGCCG

   1637

   TGCTTTGCTC

   TGGCTTTGAC

   AGGTTGAAAT nG Y CCCOATu

   AS U-ST <';oA.A.C

   1737

   AGWACTCCAG

   ACTGTGCTOG

   AGTCCCAAAG

   TTAGGAGGGC

   CATGGAGCCT

   1787

   GGGACAGGCT

   GCTGC7TTGG

   TCTTTAGGAT

   CTAGGAARAA

   TTACAGAGGG

   1837

   GCCAAGACAG

   AGTTCCCTCC

   CCTAGAAACT

   GTGCAGCCTG

   GAAGTCAGCC

   37

   CTGGCACTTT

   AAGATAGCCT

   TCTTTAGAAC

   ATGAGTTAGT

   TGGTAGTATT

   1937

   CTGACGTGTA

   AACAGCCTAT

   KGT7GCTCGG

   AGCTGGACCA

   TTTTCTCCAC

   1937

   TTCGCTGTCT

   GCAIGCCTAA

   GACTTCTAGA

   GCAGCCAACG

   TATATGCAAC

   037

   ATTAAAGAAA

   AAAAAAAAAA

   AAAAAAAAAA aAAAA

   2072

   Α3 5, AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

   KOSSZÁ: 60 3

   TÍPUSA: nukieinsav

   TOPOLÓGIÁJA; lineáris

   MOLEKULATÍPUS: cDNS-től nRNS

   EREDETI FORRÁS:

   ÉLŐLÉNY: Pfos

   SAJÁTSÁG:

   MÉV/MSGJSLÖLÉS; cds ELHELYEZKEDÉS; 1,.603 AZONOSÍTÁSI ELJÁRÁS; E

   s.Z S. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA;

   ATG

   AAG kzk/kX

   TAG

   TTG

   TGC

   GÁT ψ/~* ki X '-^· >γι φφ

   W ;-X

   IJ i k30

   Ms t

   Lys

   Tyr

   Phe

   Cys

   His

   Val

   Phe

   Val

   I

   d

   Ttrr'y*'

   1'vJs^

   -ct ?*·< £* ·—!)T< 7\ k-· X JÁ,

   T\ rp.·'· ΛΧ

   AGA

   CTT

   TTA

   AGA

   Phe

   Cys

   Ph β

   Leu lis

   S v* .·>> Λ#

   Leu

   Leu

   Thr

   Giy

   Í5

   0? Γ; í, s?‘

   GAA

   ATC

   AAT

   GGC r*x/r· ζ·*

   GCC

   GAT

   GAT

   AGG

   ATG

   Glu

   He

   Asm

   Gly

   Ser'

   Alá

   Asp

   His

   Arg

   Met

   T'TT

   TCA !vi-pfn ra r

   L.-r-L\v

   AA?

   GGA

   GTA

   C'AG

   ATT

   120

   Phe

   Ser

   Phe

   Kis
2. 2, ,-rv »

   Gly

   Val

   Gin lis

   0

   TCT

   TGT

   AAA

   T ar» /*·>

   X

   GAG

   ACT k? x

   CAG

   GAG

   150

   Ser

   Cys

   Lys 'Τ'.. V.

   ~y~ >3 v*f\

   - ». sy

   Glu

   -!>kr.

   i iix,

   Val

   Gin

   Gin

   TTA

   AAÁ

   Τ' ‘·”τ~

   CGA

   TTG 'TTC

   AGA.

   .-x -x S*' kGÖXÖJ

   AGA

   GAA

   180

   T νς

   Met

   Arg

   Leu

   Phe

   Arg

   Glu

   Arg y^ ? VV

   \.?.X 5X

   C* Λ* ro

   g-TC

   •.jy j» kv

   CTC *T> ,·· f'¹

   A X·

   GAA ρφΓ«

   L· X k.

   A<-k„

   AAG

   ÁCC

   AAG

   GGA y*\ λ y»>

   Zi'J

   V 3.X \A

   Glu •XíSXX

   Thr

   Lys

   Thr

   Lys

   Gly

   **»

   GGA

   AAT ^ι4·^υ·

   GTG ,·γ\

   X O.'k.·

   ATC

   AAG

   AAT

   0^* *xxÍ

   240

   149 ♦ * » «»

   Ser

   Gly

   Asn

   Al a

   Var

   Ser

   He

   Lys

   Asn

   P T'< j

   ATG /Ύ >T< γ»

   X VTGT

   CTA, fp TT?

   GAT .*·< fp

   \.γ x k<y

   TCA.

   AAC

   AAC

   Mer

   Leu

   Cys

   Leu

   Tyr

   His

   Leu

   V <:> ·>'Asn

   Asn

   S 5

   AGC

   GTC

   «Τ<γϊζγχ

   X -ΑΛ **λ·

   CTA

   AAC

   AAC

   CGA

   GAC

   Ser

   Val

   V £>->*

   KY .<

   Phe r\% zm,

   Λ . ,. κΛ^λ

   AzÖ U.

   Asn

   Asn

   Pro •>\

   A*ÍjC> W

   z>

   100

   AGC

   TCC

   CAG

   GGA

   AGC fp^s m

   TAC

   TTC

   TGC

   AGC

   Ser

   Ser

   Gin

   Gly

   Ser

   T>v·,T Tyr

   P ;*) ·°

   Cys

   Ser

   105

   110 z-» «fi ,··*«

   V- ÍVJ crt ./»«»*<

   ATT φ :γ> rr»

   GAC

   /··> ,·*·* rp

   X

   CCT rpípvp

   CAA

   Leu

   Jm lie

   Phe

   Asp

   Pro

   Pro

   Pro

   Phe

   Gin

   115

   120 /** Ά Ti bttA

   AGG

   AAC

   Z-í ΓΗ :rp

   AGT

   GGA

   CGA

   TAT írurtt^ x i \y

   GAT

   Glu

   Arg

   Asn

   Leu

   Ser

   Cí x.y biy

   Tyr

   Leu

   HÍS

   125

   130

   X ίΤ-Λ λ i .γϊ-'Ί?

   TCC

   CAG

   S.- 4, v

   TGC

   TGC

   CAG

   CTG

   He

   Tyr

   Gin

   Ser ii

   Leu

   Cvs

   Cys

   Gin

   Leu

   135

   140

   AAG

   CTC

   TGG

   CTA

   CCC

   GTA.

   /-» v'cb rpíT'/*»

   X ,l\3'

   CCA

   GCT

   V , ,.

   -U' ö

   Leu

   TXTv

   Leu

   Pro

   Val

   o.iy

   Len

   Pro .Ai.s

   1-43

   150

   TTC

   GTT

   GTG

   GTA

   CTC

   CTT ’T

   GGA <T>f* S*· i\K.

   ATA

   Phe

   Val y& 1

   Val

   JLíGIÍ

   T ixtí ti

   Phe t~ h . _v

   Cys lie

   £*

   ISO

   GTT

   ATC

   Λ 'ftr·'

   W :,.«·* ,·-«

   KJVT

   Wfprfi

   TCA

   AAA

   AAG

   AAA fp Ti ?*

   270

   300

   420

   150 ♦ * * Μ φ « φ

   Len

   I1 e

   He

   Trp

   Ser

   Lys rys

   Lys .Τ' - * V»

   X V X.

   165

   g '? A

   X / V

   GGA

   TCC

   AGT s~> cr>z* U 1 k?

   CAT

   GAC

   CCT

   AAT

   AGT

   GAA

   540

   G1 y

   Ser

   Ser

   Val

   His

   Asp

   Pro

   Asn

   Ser

   Glu

   175

   1S 0

   T '71 ·/** lAb

   ATG

   TTC

   ATG

   GCG

   GCA

   GTC

   AAC

   AGA r\ * .·*<

   570

   Tyr

   Met

   Phe

   Met

   Alá

   Alá

   Val

   Asn

   Thr

   Asn

   185

   190

   •λ r.

   ArkA

   AAG

   TCT

   AGA

   CTT

   GCA

   GGT k3 1 -kJ

   ACC

   TCA

   600

   Lys

   Lys

   Ser

   Arg

   Leu

   Alá s'' 1 . . ’sj 1, γ

   V 3. ±

   Thr

   Ser

   195

   -> A .fs

   X 'L v

   TAA

   603

   U>‘ r, ·<? z . AZ»1
3. 3NOSÍTÖ S

   ZÁMÍ r

   >KVSN rr»T 7v ; 1Λ

   ADATAI:

   A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

   HOSSZA: 836

   TÍPUSA: nukleinsav

   TOPOLÓGIÁJA: lineáris

   MOLEKULATÍPUS; egyéb nukleinsav C3’és szekvenciákat tartalmas!

   5’ nem transz latéit rpwq

   U· ύ^'Λ\ KV

   EREDETI FORRÁS:

   ÉLŐLÉNY: Áattrs

   SAJÁTSÁG:

   NÉV/MFGJELOLÉS: cds tv χχτττ G\ i « w sí v s Φ W Vovi

   AZONOSÍTÁSI ELJÁRÁS: E

   A 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

   CTGGAGGGGA AGAG’

   TGCAt

   TTC

   3C TGTTC

   CTGGC AGAC

   ATG

   AAG

   CCC

   TAG

   Π*/-»,·-*

   A

   TGC

   VJ 1 ffí íjl fft \J3 i. '·...·

   Met

   Lys

   Pro ^JT* < l y £

   Phe

   Ser

   Cys

   Val

   Phe

   Va X

   s

   Ί Π

   .t, v

   •η ζγχ s*'

   J. \JV., φίΤ«ν~> x :. V.,

   CTA

   ATC

   AAA

   CTT

   TTA

   ACA.

   GGA.

   ρ H

   Cys

   Phe

   Leu

   Ϊ X β x rs;

   x.(

   Leu

   Leu ?í\ £>.

   1-Λ'Λ.Έ·

   Gly

   (γ A Ά

   CTC

   AAT

   CAC

   TTG ccc

   AAT

   CAC £ /'C-'x

   ATG

   124

   Leu

   Asn

   Asp

   Leu

   Alá

   Asn

   Bi s

   Arg

   Met

   .·'Λ

   -J V

   my>V_f.-X

   U' uj

   Τΐψφ

   111 .««•λ: .«-»

   GAT

   GGG.

   s*· s-ni VjVj 1

   GTA

   CAG

   ATT

   154 £»·}-· m Λ, Ía\^·

   A? ΐ~

   W ·*. 4»

   Phe

   His

   Asp

   Gly

   S* 1 · X v-ny

   Val

   Gin lle

   Τ'. λ xy

   PP j*’'' H?

   ψϊ'^ψ

   AAC

   TAC

   CCT

   GAC

   ACT \J x 1^·

   CAG

   CAG

   184 .V . . v2> λ;

   cys

   Asn

   Tyr

   S”

   .. ...

   Glu.

   Thr

   Val '\3Xii

   Cin

   ii

   TTA i-v er> .··** _A~i.X \v

   CAC

   TTC

   X' <5· '.y

   AAA

   GAC

   AGA

   GAA

   214

   Leu

   Lys

   Mer

   Gin

   Leu

   Phe

   Lys

   Asp .Arg

   Glu

   /“'ffl r**

   CTC

   TGC

   GAC

   CTC

   ACC ηΑθ:

   ACC

   AAG

   GGA

   244

   Val

   Leu

   Cys

   Asp

   Leu

   Thr

   Lys

   Thr

   Lys

   C ’ ' r

   •í\ r·* y-x

   AAC

   ACC <?1 VJ

   TCC

   ATC .AAG

   AAT .>·< /% r~>

   \z Ί3
4. 4

   Ser

   C l <^r J. V

   Asn

   Thr

   V~v «

   V &-i

   Cí a r tj. A, lle

   Lys

   Asn

   Pro

   jHU. Vj

   TCT

   Gvrt

   TAT

   UW i VJ

   Cí-Ϊ yxr·*

   Í \ζ⁵·ν·

   AAC

   AAC

   304

   Met

   Ser

   Cys

   Pro

   Tvr

   Gin

   Leu

   Ser .Asn

   Asn

   - 152 AGT

   m/vrp X U· Zx

   TTT

   TTC

   CT A.

   Gne

   AJ-· C

   GCA

   GaC

   334

   Ser

   Val

   Ser

   Phe

   Phe

   Leu

   Asp

   Asn

   Alá

   Asp

   100

   AGC >*Γϊ/•’N lw

   CAG

   GGC

   TAG

   TTA

   TGC hbt

   364

   Ser

   Ser

   Gin

   Gly

   Ser

   Tyr

   Phe

   1SU

   Cys

   Ser

   1QS

   110

   CTG

   X· \z\u

   ATT .γ,ηχ.··· z. X w

   GAC z? j**’ r_v •CC.A

   CCC

   \..-v 1.

   TTT

   CAA

   394

   Leu

   Ser lle

   Phe

   Λ íg γ\

   Pro

   Pro

   P r o

   Phe

   Gin

   115

   x *' 0

   GAA

   AAG

   AAC .-xrfí m \z X X

   AGT

   GGA

   GCA

   TAT

   TTG

   CTT

   424

   Glu

   Lys

   Asn

   Leu

   Ser

   Gly

   Gly

   Tyr

   T rs * :

   Leu
5. 5

   130

   'Τ’^JT* <-p 7^’Ή

   GAA

   TCC

   CAG

   CTT

   TGT

   TGC

   CAG yX-myX

   X VP

   454 lle ’T > y\.x

   X YX

   Glu

   Ser

   Gin

   Len

   Cys

   Cys

   Gin

   Leu

   135

   140

   AAG γ—.ψφ .i.

   TTA

   GTA

   GGG

   TGT

   GCA

   GCT

   484

   Lys

   Leu

   Trp ceu

   Pro

   Val <>±y

   Cys

   Air

   Alá

   145

   150

   rprpft*’ j. .i. X ‘“‘ΐγΐΓ· X? .i. ’<3

   GCA bCG

   f. Vk.

   Z-’rpfp \<X xi.

   TTT íjG-U

   TGC

   ATA

   514

   Phe

   Val

   Alá

   Alá

   Leu

   Leu

   Phe

   Giy

   Cys

   I ze

   155

   160

   rct rp rr>

   χ m/** Ar Ί· .·** >yt r*»

   TGG

   TTT

   GCA

   AAA

   AAG

   AAG

   TAG

   544

   Phe lle

   Val

   Trp

   Phe

   155

   Alá

   Lys

   L vs

   Lys

   Tyr

   0

   AGA

   Φ-r» ,·-* i V‘v

   AGT

   Z-* •'T! /'·’ ‘•XJ X X3 r&r

   Vó X'-y

   GAC

   C v x

   AAT

   AGC

   GAG

   O í hí

   Arg

   Ser

   Ser

   Val

   His

   Asp

   Pro

   Asn

   Ser

   Glu

   175

   130

   W-ta ,♦·,

   ATG

   TTC

   Τ' φ·Λ χίΊ Χ y-'Z-» yx

   GCA

   GTC

   AAC

   ACA

   AAC

   Ό v ht

   - 153 »·*♦»·

   Tyr

   Met

   Phe

   Met

   Ala

   185

   Ala

   AAA

   AAG

   TCC

   AGA

   OTT

   GCA

   Lys

   Lys

   Ser

   Arg

   Leu

   195

   Ala

   CTT

   AGG

   GCT

   TTG

   GGG

   AGA

   Leu

   Arg

   Ala

   Leu

   Gly

   205

   Arc?

   X. 'νΛ φν-Ν/ρ:

   CAA

   GAC

   CGG

   AAT

   Ser ey S e Iii

   Asp

   Arg

   Asn

   215

   Vai

   Asn

   Thr

   Asn

   190

   GGT

   ACA

   GCA

   CCC

   534

   Gly

   Thr

   Ala

   Pro

   200

   GGA

   GAA

   CAG

   TCT

   664

   Gly

   Glu

   His

   Ser

   210

   ΤΑΑ 535

   TTTGTTTATT

   TCIAITTT.AA

   AAGAAAGACA

   TTTTTTCCCC

   TAAAGATAAT

   735

   TTTTGTATTT

   TTATGTGAAA

   GTCTGAATCT

   TCATTTTAAC

   TCGACTTATA

   735

   TACTCTGTGG

   TATATTAAAA

   ATAATGTTTG

   TGAÁAAAÁAA

   h. AA/tS

   835

   A

   335

   A 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

   A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

   HOSSZA; 27

   TÍPUSA: nukíeinsav

   TOPOLÓGIÁJA; lineáris

   MOLEKULÁTíPUS: egyéb nukíeinsav (szintetikus DNS) SAJÁTSÁG:

   NÉV/MEGJELÖLÉS; primer bind

   ELHELYEZKEDÉS: 1..,27

   AZONOSÍTÁSI ELJÁRÁS: S

   A 7, AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA;

   CTGCTCGAGA TGAAGCCCTA CTTCTCG 27 * * * « ♦

   A 8. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ΑΒΑΤΑ)

   A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

   HOSSZA:

   TÍPUSA; nukleinsav

   TOPOLÓGIAJA; lineáris

   MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav (szintetikus BNS) SAJÁTSÁG;

   NÉV/MEGJELÖLÉS: primer bind

   ELHELYEZKEDÉS : 1...32

   AZONOSÍTÁSI ELJÁRÁS; E

   A 8. AZONOSÍTÓ SZÁMÓ SZEKVENCIA. LEÍRÁSA;

   ACCCTACGGG TAACGGATCC TTCAGCTGGC AA 32

   A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÓ SZEKVENCIA ADATAI;

   A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

   HOSSZA: 30

   TÍPUSA: nukleinsav

   TOPOLÓGIÁJA: lineáris

   MOLEKULATÍPUS:, egyéb nukleinsav (szintetikus DNS;

   C Tv Τ·?\ 'Τϊ ίΤ' Λ v* V bAí/r*..i Ο.ΛΛ3 v .NÉV/MEGJELöLÉS: primer bind

   ELHELYEZKEDÉS ; 1. ... 30

   AZONOSÍTÁSI ELJÁRÁS: S

   A 9. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

   (ŰACTGTTTC TCGAGAACAT GAAGTCAGGC

   15:

   A 10. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

   A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

   HOSSZA: 30

   TÍPUSA: nnkleinsav

   TOPOLÓGIÁJA: lineáris

   MOLEKULATÍPÜS; egyéb nukleínsav (szintetikus DNS) SAJÁTSÁG;

   NÉV/MEGJELÖLÉS: primer bind

   ELHELYEZKEDÉS: 1... 30

   AZONOSÍTÁSI ELJÁRÁS: E

   A 10. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

   ATCCTATGGG TAACGGATCC TTCAGCTGGC 30

   A 11. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

   A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

   HOSSZA: 35

   TÍPUSA: nukleinsav

   TOPOLÓGIÁJA: lineáris

   MOLEKULÁTíFOS: egyéb nuklein.sav (szintetikus DNS) SAJÁTSÁG:

   NÉV/MEGJELÖLÉS: primer bind

   ELHELYEZKEDÉS; 1... 35

   AZONOSÍTÁSI ELJÁRÁS; E

   A 11. AZONOSÍTÓ SZÁMÓ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

   OGTGATATTG CTGAAGAGCT TGGCGGCGAA TGGGC

   - IS
6. 6

   A 12 , AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

   A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

   HOSSZA: 34

   TÍPUSA: nukleinsav

   TOPOLÓGIÁJA: lineáris

   MOLEKULA?íPUS: egyéb nukleinsav (szintetikus DNS: SAJÁTSÁG:

   NÉV/MEGJELÖLÉS: primer bind.

   ELHELYEZKEDÉS: 1...34

   AZONOSÍTÁSI ELJÁRÁS: S

   A 12, AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

   CATTCAAGTT TCAGGGAACT AGTCC&TGCG TTTC > Λ O

   - 157 -

   SZABADALMHGÉNYPONTOK

   1, Nukleinsav-molekula amely a kővetkezőkből átlő csoportból van kiválasztva:

   (a) a SEQ ÍD NO: 2 szerinti amínosav-szekveneiá.já pehpeptidet kódoló nukfeiosav-molekula;

   (b) a SEQ3D NO; 1 szerinti mikieotldszekvcnciájú r$u^«tsav>molekula;

   (c) a SEQ ID NO: 3 szériát nnkieotídszekvencia 26-625. nakleotitijainak szekvenciájával megegyező szekvenciája mskleinsav-moleknla; és (4) a SEQ ID NO: 2 szerinti aminosav-szekveneia 1-140. zminosavainak szekvenciájával megegyező szekvenciája polípeptidet kódold aaktówv-msíetóa.

   2, Az i. igénypont szerinti nukieinsav-moieknla, amely cDNS.

   3, Gén, amely 1, vagy 2. igénypont szerinti nökleinsava· tartalmaz,

   4, Vektor, amely 1. vagy 2. igénypont szerinti nakleinsav-molekniát vagy 3, igénypont szerinti géni tartalmaz.

   5, Rekombináns sejt, amely 4. igénypont szerinti vektort tartalmaz.

   é. Az 5. igénypont szerinti rekombináns sejt, amely a EERM BP-5725 nemzetközi deponálási számmal azonosítható.
7. 7. Pohpeptid, melynek sminesnv-szekvendsja megegyezik a SEQ lö NO; 2 szerinti ammesavszekvenciával
8. 8. A 7. igénypont szerinti polipsptitire specifikus ellenanyag, az ellenanyag a következőkből. álló csoportból yan kiválasztva: patkány-ellenanyag, tengerimalac-eilenanyag, nyól-elíeaaay&g, kiméra-ellenanyag, humanizált ellenanyag és mariin ellenanyag,
9. 9. A 8, igénypont szerinti ellenanyag, ahol az ellenanyag monoklonális ellenanyag vagy monoklonális ellenanyag része, ahol a rész a kővetkezőkből álló csoportból van kiválasztva: F(abj2, Fab* és Fáb, lö. Gyógyászati készítmény, amely tartalmaz 8. vagy 9.. igénypont szerinti ellenanyagot vagy ilyen monoklonális ellenanyag 9, igénypont szerint definiált részét, valamint gyógyászatilag elfogadható hordozói,
10. 11, A 8. vagy 9. igénypont szerinti ellenanyag: vagy ilyen monoklonális ellenanyag 9, igénypont szerint definiált részének alkalmazása gyulladásos megbetegedések kezelésére vagy ilyen betegségek tünetei kialakulásának megelőzésére alkalmas gyógyászati készítmény előállítására,
11. 12. Ellenanyag-termelő sejt, amely 9, igénypont szerinti monoklonális ellenanyagot, termel.

    A meghatalmazott:

    DANUBIA

    Szabadalmi és Jogi Iroda Kft.

    Dr, P/thÖ Árpád szabadalmi ügyvivő

    PCT/JF98/ÖÖ837

    1.

    {

    PCT/JPS8/00837

    2/22

    FTL435 ConA’Vai stimulált hmfobbsztok

    2, ábra

    PCTOFWÖ0837

    3/22

    JTI43S

    JTT. 2

    TImocíta

    Nyugvó limfocila

    Aktivált

    Hmfodta £

    fű

    ÍÖ

    J»

    J2 φ

    sx

    Fluoreszcencia-intenzitás (lóg)

    3. ábra **

    PCT/JP98/0Q837

    4/22 «s£

    O

    ConA-val stimulált, ConA-val stimulált,

    IS ,p js«L ~o

    Jsá

    O

    ÍM

    ÖS

    -Ω .O £8

    Ό

    Φ

    S

    Φ ti

    Mjö

    Relatív sejtszám

    Fluoreszcencia-intenzitás (lóg)

    0. nap i. nap 3, nap Nyirokcsomó \ léperedetű Hmíoblasztok

    4. ábra

    Φ «w

    FCT/JPB8/0ÖS37

    S ♦ *·*«

    97,4~

    66,34531- ,5-

    5, ábra

    00« *·*

    X * *** « ·* «♦

    PCT/JP98/80837

    8/22 ’*r

    Ο» «

    ♦ ♦ » * * s * <

    í X * t » » χΐ?} í

    *»« *4

    PCT/JP98/00837 /22

    COS-sejtek

    T rsnszfof mánsok

    Fíuöreszeeneia*intenzítás (lóg)

    Relatív sojtszám

    8, ábra / f i

    M ícá ropssti^ .««* i

    w #

    » )

    > * * ^x ' , . ♦ « í ** ί í >' ί ΐ * »

    r s* # «# »»<

    ««» ♦ >« ♦ » « « í « \·;*

    - USö

    Ο Π- HU

    Μ δV8I» rn-m μ ϊ nrW te» h;

    £O ηι

    ΜΗ

    F-PS

    Π Η tnmummm μ omn ΚΗΗΠΠδ 33 sm?nm λδ Π'Κί δ δ λ m ί $ , tus, SS, ¥.,•CSLÍÜT nSSKHSIK

    HM

    CL > , H n HO, H

    Bl S H M « nr|í tara «,. le

    MUS η ο ο η ΐ|ψ |c κ nvn omo «υ,π

    M?!

    £ B

    Π 4054 nnnsw n-isim

    Ο , < OG nm mm mm un ohm w mo mnmn nmmo m h -nunm n un,.,,, x

    S S V Η 0 o ••hu $ψ

    -HH GVh m ftm mou mbn p|u< <

    nnsl·— —mm*

    22S

    233

    H

    X c

    Φ »

    x a

    ®

    Öl »

    »*«x

    X

    XXX

    X ♦♦xx ♦

    *»X

    X

    X X » * X» X x xx ♦*x > X » » X » X χ X 4 X

    Áw4 X ♦**

    X

    X to

    X íí Η i

    ♦íí ί

    ί · ί » « ί «

    I «♦ ί»» ♦ « * ί < ♦ >

    »«Μ κ

    •ΦΦ

    L WCC5E· δ® pstty,, íbbfsg nm sa

    216

    Π ( M M IH

    PGT/JP98/OO837 1A/22

    Cm

    Φ α

    PCTOP9S/Q0837 ,* *^xr

    A betegség tüneteinek sűiyc {átlagpontok)

    Ό

    Ö5 <0

    12 mmunizálás

    18 18 ín eltelt napok

    18, ábra

    Φ Φ Φ 4 *·*:♦* Φ

    PCT/JP98/Ö0S37

    17/22 φ

    -φ tt

    -φ <35 «3

    S

    Μ C ω '~ ® .£ -Φ ο .> <2 X/* iv

    2$ ό U c α α

    S-í φ 7 χ> V φ '>

    .χ

    Φ

    S φ

    Ο

    Ω.

    2 Immunizálás
12. 17, ábra »* •♦ί* <s ο

    Ο ?\ί ;λ ·© £

    ο <Ν *

    4 * *

    χ. 0 <i 4 4 4 4 *
13. 18,

    Φ·ΧΧ·'

    X φ φ * *· ♦ 9 φ X Φ ♦·* * * «φ»« Φφ*« X χ ♦ » *»'£* φ ♦ φ φ ♦* *
14. 19/22

    Ί 9 ábra « » %Λ W <8 ΦβάΦ.

    «I

    280 ms-néf mért abszorbancia icsas

    3 4

    Frakciöszám
15. 20. ábra * fcfc » fc fc X fc * fc V 4 9 ♦ fc *
16. 21/22

    PCT/ÜS98/056S5

    21, ábra *

    ί c

    tó

    Φ %

    © ©

    » a

    KH* s

    Hí *

    <*»* í

    íí<

    í <t X « í f Χ· ΐ * *«

    W 'J 4 «

    V