HU225428B1 - Methods for altering organ mass, controlling fertility and enhancing asexual reproduction in plants - Google Patents

Methods for altering organ mass, controlling fertility and enhancing asexual reproduction in plants Download PDF

Info

Publication number
HU225428B1
HU225428B1 HU0500499A HUP0500499A HU225428B1 HU 225428 B1 HU225428 B1 HU 225428B1 HU 0500499 A HU0500499 A HU 0500499A HU P0500499 A HUP0500499 A HU P0500499A HU 225428 B1 HU225428 B1 HU 225428B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
ant
nucleic acid
promoter
plants
plant
Prior art date
Application number
HU0500499A
Other languages
English (en)
Inventor
Robert L Fischer
Yukiko Mizukami
Original Assignee
Univ California
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ California filed Critical Univ California
Publication of HUP0500499A2 publication Critical patent/HUP0500499A2/hu
Publication of HU225428B1 publication Critical patent/HU225428B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
    • C12N15/8223—Vegetative tissue-specific promoters
    • C12N15/8229—Meristem-specific, e.g. nodal, apical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8262—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield involving plant development
    • C12N15/827—Flower development or morphology, e.g. flowering promoting factor [FPF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8287—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for fertility modification, e.g. apomixis
    • C12N15/8289—Male sterility
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8287—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for fertility modification, e.g. apomixis
    • C12N15/829—Female sterility
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

A leírás terjedelme 26 oldal
HU 225 428 Β1
A találmány szerinti megoldás növényi géntechnológia területére tartozik. Közelebbről a találmány tárgyát képezik növényekben a szervek tömegének megváltoztatására, a termékenység ellenőrzésére és az aszexuális reprodukció fokozására szolgáló eljárások a növényi növekedés és sejtszaporodás módosítása útján.
A találmány szerinti eljárásokkal növényekben a szervek tömege és/vagy mérete változtatható meg, a termékenység szabályozható, és az aszexuális reprodukció fokozható.
A kereskedelmi célú mezőgazdaságban a növényi szervek tömegének és/vagy méretének és a termékenységnek az ellenőrzése fontos cél. A növényi hajtás vegetatív szervei és/vagy szerkezetei (például levelek, szár és gumó), a gyökerek, a virágok és a virágszervek (például murvalevél, csészelevél, szirom, porzószál, termőlevél, portok), a magkezdemény (beleértve a petét és a központi sejteket), a mag (beleértve a zigótát, az embriót, az endospermiumot és a magköpenyt), a termés (az érett magház) és a csíranövény a számos, mezőgazdaságilag fontos növény betakarított termékei. Ezeknek a szerveknek/szerkezeteknek méretének és/vagy tömegének genetikai ellenőrzésen keresztül történő manipulálása fontos mezőgazdasági eszköz. Hasonló módon, növényekben sterilitás kiváltása a növényi beporzás és reprodukció korlátozásában hasznos, amennyiben ez gazdaságilag kívánatos. Hímsteril növények például gyakran kedvezőek olyan terménynövényekben, amelyekben a hibrid állapot fokozza a hozamot.
A belső növényi szervek mérete genetikailag meghatározott, bár környezeti hatásokkal (például növekedési körülmények) nagymértékben változtathatók. Általánosságban a nagyobb szervek több sejtből állnak. Mivel a növényi fejlődés folyamán sem a sejtvándorlás, sem a sejthalál nem játszik fontos szerepet, ezért a növényi szövetekben a sejtek száma a sejtszaporodástól függ. A sejtszaporodás helyes szabályozása a növényt termékennyé tévő reproduktív szervek megfelelő fejlődéséhez is szükséges. Néhány alapkutatási munka során azonosítottak a növényi szervfejlődésben és termékenységben szerepet játszó géneket, azonban keveset lehet tudni a sejtszaporodás genetikai ellenőrzéséről vagy az organogenezlssel való kapcsolatáról, például növényekben a szervek méretének és/vagy tömegének ellenőrzéséről és a termékenységről. Ennélfogva fontos célkitűzés az organogenezist és a sejtszaporodást ellenőrző gének közötti kapcsolat megértése. Sok, alapkutatási eredmény szerint élesztőkben és állatokban a sejtciklust ellenőrző komponensek (például ciklindependens kinázok, ciklinek és inhibitoraik) és mechanizmusok (például foszforílációval történő szabályozás, ubiquitin közvetítette proteolízis) magasabb rendű növényekben is megőrződtek [Burssens és munkatársai, Plánt Physiol. Biochem. 36, 9-19 (1998)].
Arabidopslsban a fejlődő virág tartalmazza a magkezdeményt. A vad típusú magkezdemény fejlődését behatóan tanulmányozták ezekben a növényekben [Robinson-Beers és munkatársai, Plánt Cell 4, 1237-1249 (1992); Modrusan és munkatársai, Plánt
Cell 6, 333-349 (1994) és Schneitz és munkatársai, Plánt J. 7, 731-749 1995)]. Sokféle, a magkezdemény fejlődését érintő mutációt azonosítottak [Klucher és munkatársai, Plánt Cell 8, 137-153 (1996); Elliott és munkatársai, Plánt Cell 8, 155-168 (1996); Baker és munkatársai, Genetics 145, 1109-1124 (1997); Robinson-Beers és munkatársai, Plánt Cell 4, 1237-1249 (1992); Modrusan és munkatársai, Plánt Cell 6, 333-349 (1994); Ray, A. és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 5761-5765 (1994); Láng és munkatársai, Genetics 137, 1101-1110 (1994); LeonKloosterziel, Plánt Cell 6, 385-392 (1994); Gaiser és munkatársai, Plánt Cell 7, 333-345 (1995)], és ezek közül néhányról azt találták, hogy specifikusan a sejtosztódás mintázatára hatnak [Schneitz és munkatársai, Development 124, 1367-1376 (1997)]. Ezek közül néhány gént már klónoztak, például a következőket: AINTEGUMENTA (ANT) [Klucher és munkatársai, Plánt Cell 8, 137-153 (1996); Elliott és munkatársai, Plánt Cell 8, 155-168 (1996)], AGAMOUS [Yanofsky és munkatársai, Natúré 346, 35-39 (1990); Bowman és munkatársai, Plánt Cell 3, 749-758 (1991)], SUPERMAN [Sakai és munkatársai, Natúré 378, 199-203 (1995)]. Mivel ezek a gének nemcsak fejlődő magkezdeményekben expresszálódnak és működnek, hanem különböző fejlődő szervekben, ezeknek a mutációknak és géneknek a vizsgálata általános információt szolgáltat a növényi fejlődés során történő sejtszaporodás ellenőrzéséről.
Terménynövényfajok manipulációjánál egy másik fontos jellemző az a képesség, hogy a növényeket aszexuális eszközök segítségével reprodukálni vagy szaporítani tudjuk, előnyösen steril vagy hibrid növények vegetatív szaporításával és transzformált sejtekből növények regenerálásával. Aszexuális reprodukció például növények regenerálása sejtekből vagy szövetekből, növények szaporítása dugványozással, járulékos hajtások és gyökerek indukálásával és apomixissel, szomatikus embriók képzésével. Az aszexuális reprodukciónak az az előnye, hogy a kívánt jellemzőkkel bíró növények genetikai kiónjai könnyen elkészíthetők. Nem minden növény képes azonban járulékos hajtásokat vagy gyökereket kialakítani, vagy sejtekből vagy szövetekből teljes növényeket regenerálni.
A növényi sejtszaporodás genetikai kontrolljának meghatározásában történt jelenlegi fejlődés ellenére kis előrelépésről számoltak be a mezőgazdaságilag fontos jellemzőkre, például a szervtömegre és/vagy szervméretre, a termékenységre, az aszexuális reprodukcióra és hasonlókra, a sejtszaporodás szabályozásán keresztül ható gének azonosításáról és vizsgálatáról. Ilyen gének jellemzése lehetővé tenné számos kedvező tulajdonsággal bíró növény biotechnológiai úton történő manipulációját. A találmány szerinti megoldással ezeket és más igényeket céloztunk meg.
A következőkben röviden összefoglaljuk a találmányt.
A találmány tárgyát képezik eljárások növényekben a sejtszaporodás, és így a sejtszám megváltoztatására
HU 225 428 Β1 az ANT-aktivitás módosításával növényekben. Az eljárások során jellemzően az ANT expresszióját változtatjuk a növényekben, és a megváltozott méretű és/vagy tömegű, termékenységű, vagy mindkét tulajdonsággal bíró növényeket kiválasztjuk (szelektáljuk). Néhány előnyös megvalósítási mód szerint az ANT-aktivitást fokozzuk, és a fokozott mértékű sejtszaporodással, és így nagyobb sejtszámmal jellemezhető növényeket kiválogatjuk. Egy eljárás az ANT-expresszió módosítására a növénybe egy olyan expressziós kazetta bevitele, amely heterológ ANT-nukleinsavat tartalmaz működőképesen egy promoterhez kapcsolva. Az alkalmazható, lehetséges ANT-nukleinsavak például az 1. és a
4. azonosító számú szekvenciák szerinti szekvenciákkal legalább 50%-ban azonos nukleinsavak. További példák a 2. vagy az 5. azonosító számú szekvenciák szerinti szekvenciákkal legalább 60%-ban azonos polipeptideket kódoló nukleinsavak.
A találmány tárgyát képezik továbbá eljárások sejtszaporodás módosítására, és így a növényekben járulékos szervek kialakítására. Az eljárások során jellemzően fokozzuk a növényekben az ANT aktivitását vagy expresszióját, és kiválasztjuk a járulékos hajtásokat, szerveket vagy szerkezeteket, például embriókat hordozó növényeket. Egy eljárás az ANT expressziójának módosítására a növénybe egy olyan expressziós kazetta bevitele, amely heterológ ANT-nukleinsavat tartalmaz működőképesen egy promoterhez kapcsolva. Az alkalmazható, lehetséges ANT-nukleinsavak például az 1. és a 4. azonosító számú szekvenciák szerinti szekvenciákkal legalább 50%-ban azonos nukleinsavak. További példák a 2. vagy az 5. azonosító számú szekvenciák szerinti szekvenciákkal legalább 60%-ban azonos polipeptideket kódoló nukleinsavak.
A találmány tárgyát képezik továbbá növények aszexuális eszközökkel történő szaporítására szolgáló eljárások. Az eljárások során jellemzően fokozzuk az ANT aktivitását vagy expresszióját a növényekben, és kiválasztjuk a növényi sejtből vagy szövetből reprodukált növényt. Egy eljárás az ANT expressziójának módosítására a növénybe egy olyan expressziós kazetta bevitele, amely heterológ ANT-nukleinsavat tartalmaz működőképesen egy promoterhez kapcsolva. Az alkalmazható, lehetséges ANT-nukleinsavak például az 1. és a 4. azonosító számú szekvenciák szerinti szekvenciákkal legalább 50%-ban azonos nukleinsavak. További példák az akár a 2., akár az 5. azonosító számú szekvenciák szerinti szekvenciákkal legalább 60%-ban azonos polipeptideket kódoló nukleinsavak. Különböző megvalósítási módok szerint a növény járulékos hajtásból, szomatikus embrióból vagy dugványból származik.
A találmány egy másik megvalósítási módja szerint a növény merisztémaszövetében egy heterológ gént expresszálunk a növénybe egy olyan expressziós kazetta bevitelével, amely egy ANT-promotert tartalmaz működőképesen egy heterológ polinukleotidhoz kapcsolva. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint az ANT-promoter a 3. azonosító számú szekvencia szerinti szekvencia.
A találmány tárgyát képezik izolált nukleinsavmolekulák, amelyek Brassica napusbó\ izolált, 4. azonosító számú szekvencia szerinti szekvenciával specifikusan hibridizáló ANT-nukleinsavat tartalmaznak.
A találmány szerinti eljárásokban számos növényi promoter alkalmazható. A promoter lehet konstitutív, indukálható, vagy szervre, szövetre vagy sejtre specifikus. Néhány megvalósítási mód szerint egy ANT-génből származó promotert, például a 3. azonosító számú szekvencia szerinti szekvenciát alkalmazzuk. A találmány szerinti ANT-nukleinsavak expressziója a növényben bármilyen kívánt szervre, szövetre vagy sejtre irányítható. A találmány szerinti, néhány, előnyös megvalósítási mód szerint a promoter az ANT-nukleinsav expresszióját a hajtás vegetatív szerveiben és/vagy szerkezeteiben irányítja, például levélben, szárban és gumóban. Más előnyös megvalósítási módok szerint a promoter az ANT-nukleinsav expresszióját a gyökerekben irányítja. Más, előnyös megvalósítási módok szerint a promoter az ANT-nukleinsav expresszióját a virágokban vagy virágzati szervekben és/vagy szerkezetekben irányítja, például murvalevelekben, csészelevelekben, szirmokban, porzószálakban, termőlevelekben, portokokban és magkezdeményekben. Különböző megvalósítási módok szerint a promoter az ANT-nukleinsav expresszióját a magokban (például embrióban, endospermiumban és maghéjban) vagy a termésben irányítja.
A következőkben a leírásban alkalmazott meghatározásokat ismertetjük.
A „nukleinsavszekvencia” kifejezésen egyszálú vagy kettős szálú, dezoxiribonukleotid- vagy ribonukleotidbázisokból álló polimert értünk az 5’-végtől a 3’-vég felé olvasva. Idetartoznak például a kromoszomális DNS, az önreplikálódó plazmidok, a fertőző DNSvagy RNS-polimerek és az elsődlegesen szerkezeti szerepet betöltő DNS vagy RNS.
A „promoter” kifejezésen a transzkripciós starthelytől 5’-irányban és/vagy 3'-irányban elhelyezkedő szakaszokat vagy szekvenciákat értjük, amelyek az RNS-polimeráz és más fehérjék felismerésében és kötésében vesznek részt, és így a transzkripciót kezdeményezik. A „növényi promoter” növényi sejtekben transzkripció kezdeményezésére képes promoter.
A „növény” kifejezésen például a teljes növényt értjük, a hajtás vegetatív szerveit és/vagy szerkezeteit (például levelek, szár és gumó), a gyökereket, a virágokat és a virágzati szerveket (például murvalevelet, csészelevelet, szirmot, porzószálat, termőlevelet, portokot), a magkezdeményeket (beleértve a petét és a központi sejteket), a magot (beleértve a zigótát, embriót, endospermiumot és maghéjat), a termést (például az érett magházat), a csíranövényeket, a növényi szövetet (például szállítószövetet, alapszövetet és hasonlókat), a sejteket [például zárósejtek („guard cell”), petesejtek, trichomák és hasonlók) és ezek utódait. A találmány szerinti eljárásban alkalmazható növények osztálya általában megegyezik a magasabb rendű és alacsonyabb rendű növények azon osztályaival, amelyeknél transzformációs technológiák alkalmazhatók,
HU 225 428 Β1 például zárvatermők (egyszikű és kétszikű növények), nyitvatermők, páfrányok és többsejtű algák. Idetartoznak a különböző ploiditású növények, például aneuploid, poliploid, diplold, haploid és hemizigóta növények.
A „fokozott vagy nagyobb ANT-aktivitás vagy ANT-génexpresszió kifejezésen az ANT-aktivitásban bekövetkezett növekedést értjük. Ilyen fokozott aktivitás vagy expresszié például a következő. Az ANT-aktivitás vagy az ANT-gén expressziója a vad típusú, nem transzgenikus kontrollnövény szintjét meghaladja (azaz az ANT-aktivitás mennyisége vagy az ANT-gén expressziója fokozódik). Az ANT-aktivitás vagy az ANT-gén expressziója megjelenik olyan szervben, szövetben vagy sejtben, ahol a vad típusú, nem transzgenikus kontrollnövényekben normálállapotban nem mutatható ki (azaz az ANT aktivitásának vagy az ANT-gén expressziójának térbeli eloszlása fokozódik). Az ANT-aktivitás vagy az ANT-expresszió fokozódik, ha az ANT-aktivitás vagy az ANT-gén expressziója hosszabb ideig jelenik meg egy szervben, szövetben vagy sejtben, mint a vad típusú, nem transzgenikus kontroliokban (azaz az ANT aktivitásának vagy az ANT-gén expressziójának időtartama fokozódott).
A leírás szerinti értelemben az „aszexuális reprodukció” kifejezésen egy növényi sejtből hajtások, gyökerek vagy teljes növény kifejlődését értjük megtermékenyítés nélkül. Ha a teljes növény képződése szomatikus embrión keresztül történik, apomixisnek nevezzük.
A járulékos szerv” és „járulékos hajtás” kifejezéseken olyan szervet (például szár, levél vagy gyökér) és hajtást értünk, amely a szokásostól eltérő helyen keletkezik. Például gyökér fejlődik a száron, vagy hajtásrügy fejlődik a száron, de nem a levélzug helyén. Járulékos szervek vagy hajtások in vitro kalluszszövetből is fejlődhetnek. Ilyen járulékos szervek vagy hajtások azután teljes növény regenerálására alkalmazhatók a szakember számára jól ismert eljárások szerint.
Egy polinukleotidszekvencia „heterológ” egy szervezethez vagy egy második polinukleotidszekvenciához képest, ha idegen fajból származik, vagy ha ugyanabból a fajból származik, akkor eredeti formájából módosítva lett. Például az a kifejezés, hogy egy promoter működőképesen kapcsolódik egy heterológ kódolószekvenciához, azt jelenti, hogy az egyik fajból származó kódolószekvencia különbözik attól, amelyből a promoter származik, vagy ha ugyanabból a fajból származik, akkor olyan kódolószekvencia, amely természetes állapotban nem kapcsolódik a promoterrel (például géntechnológiai úton megváltoztatott kódolószekvencia vagy egy eltérő ökotípusból vagy változatból származó alléi).
Egy egyedi növényhez képest „exogén” polinukleotid kifejezésen olyan polinukleotidot értünk, amelyet szexuális keresztezés kivételével bármilyen más módon juttatunk be a növénybe. Ilyen módszerek például az alábbiakban ismertetettek, például Agrobacteríum közvetítette transzformáció, biolisztikus eljárások, elektroporáció és hasonlók. Az ilyen, exogén nukleinsavat tartalmazó növényt a leírásban Τ-,-generációs (például Arabidopsisban vákuuminfiltrációval) vagy Ro-generációs (in vitro transzformált sejtekből regenerált növényeknél) transzgenikus növényeknek nevezzük. Szexuális keresztezésből vagy önmegtermékenyítésből származó transzgenikus növények egy ilyen növény leszármazottai.
A találmány szerinti „ANT-nukleinsav” vagy ANT-polinukleotidszekvencia” egy olyan alszekvencia vagy teljes hosszúságú polinukleotidszekvencia (1. azonosító számú szekvencia), amely egy polipeptidet kódol (2. azonosító számú szekvencia), és komplementje, amelyet például Klucher és munkatársai [Plánt Cell 8, 137-153 (1996)] és Elliott és munkatársai [Plánt Cell 8, 155-168 (1996)] ismertetnek (lásd még GenBank U40256 és U41339 nyilvántartási számokat). A 4. azonosító számú szekvencia, amely az 5. azonosító számú szekvencia szerinti szekvenciát kódolja, egy másik, Brassicából származó ,ΑΝΤ-nukleinsavat” képvisel. A találmány szerinti ANT-géntermékek egy AP2-domén meglétével jellemezhetők, amelyet először AP2-ben azonosítottak, ez a minta egy körülbelül 60-70 aminosavból álló szakasszal jellemezhető, amelynek egy erősen konzervált magszakasza van, és amfipatikus α-hélixet képes alkotni, és/vagy kötődni tud a DNS-hez [Jofuku és munkatársai, Plánt Cell 6, 1211-1225 (1994); Ohme-Takagi és Shinshi, Plánt Cell 7, 173-182 (1995)]. A teljes hosszúságú ANT-fehérje két AP2-domént (a 2. azonosító számú szekvencia 281. aminosavától a 357.-ig és a 383.-tól a 451.-ig) és egy kapcsoló (linker) szakaszt (358. aminosavtól a 382.-ig) tartalmaz, és a többi AP2-doménfehérjével való homológia erre a szakaszra korlátozódik. A találmány szerinti ΑΝΤ-polinukleotid egy körülbelül legalább 30-40 nukleotid és körülbelül 2500 nukleotid közötti hosszúságú, de általában körülbelül 3000 nukleotidnál rövidebb kódolószakaszt tartalmaz. A találmány szerinti ANT-nukleinsavak általában körülbelül 100-tól körülbelül 5000 nukleotidot tartalmaznak, gyakran körülbelül 500-tól körülbelül 3000 nukleotid hosszúak.
Szakember számára nyilvánvaló, hogy mind transzgének expressziója, mind endogén gének gátlása (például antiszensz technológiával vagy koszuppresszióval) esetében a beépített polinukleotidszekvenciának nem kell azonosnak lennie, hanem elegendő, ha „lényegében azonos” a génszekvenciával, amelyből származott. Mint az alábbiakban ismertetjük, ezekre a lényegében azonos variánsokra is az ANT-nukleinsav kifejezést értjük.
Abban az esetben, ha a beépített polinukleotidszekvencia átíródik és transzlatálódik, hogy funkcionális polipeptid keletkezzen, a szakember számára nyilvánvaló, hogy a kodondegeneráció miatt több polinukleotidszekvencia kódolhatja ugyanazt a polipeptidet. Ezeket a variánsokat gyakorlatilag szintén az ANTnukleinsav”, „ANT-polinukleotid” és ekvivalens kifejezésekkel jelöljük. Ezenkívül a kifejezések tartalmazzák az ANT-polinukleotldszekvenciával lényegében azonos, teljes hosszúságú szekvenciákat (meghatározásukat lásd alább), és amelyek olyan fehérjéket kódolnak, amelyek megőrzik az ANT-polipeptid működését
HU 225 428 Β1 (például az ANT-polipeptidben lévő aminosavak konzervatív szubsztitúcióiból származnak).
A „megváltozott termékenység” kifejezésen a termékenység bármilyen átmeneti vagy állandó megváltozását értjük, beleértve az indukált sterilitást, valamint a virágzatfejlődés megváltozott kezdeményezését (például virágzási idő). Sterilitás többek között a pollenfejlődés, a felnyílás elrontásával (azaz hímsterilitás), a magkezdemény fejlődésének elrontásával (azaz nősterilitás) vagy a hím/női szervek abnormális fejlődése miatt (például bibés szemölcsök, a válaszfal átjárható szövete) a megporzás/megtermékenyítés folyamatainak elrontásával okozható. A virágzási idő az a fejlődési idő vagy állapot, amikor a növény virágzati szövetet kezd előállítani.
Két nukleinsavszekvenciát vagy polipeptidet akkor tekintünk „azonosnak”, ha a két szekvenciában a nukleotidok vagy aminosavak szekvenciája ugyanaz, ha a maximális megfeleltetés érdekében egymás mellé helyezzük őket, mint ezt az alábbiakban ismertetjük. Az „azonos” vagy százalékos „azonosság” kifejezéseken két vagy több nukleinsav- vagy polipeptidszekvencia esetében azt értjük, hogy a két vagy több szekvencia vagy alszekvencia ugyanolyan, vagy az aminosavaknak vagy nukleotidoknak meghatározott százaléka azonos, ha összehasonlítjuk és a maximális megfeleltetés érdekében egymás mellé helyezzük őket egy összehasonlítási ablakban, amely a következő szekvencia-összehasonlítási algoritmusok egyikével vagy manuális egymás mellé rendezéssel és vizuális vizsgálattal mérhető. Ismert, hogy ha a szekvenciaazonosság százalékát fehérjékre vagy peptidekre vonatkoztatjuk, az eltérő aminosavak gyakran konzervatív aminosavszubsztitúciókban különböznek, ahol az aminosavakat más, hasonló kémiai tulajdonságú (például töltés vagy hidrofobitás) aminosavak helyettesítik, így a molekula funkcionális tulajdonságai nem változnak. Ha a szekvenciák konzervatív szubsztitúciókban különböznek, a százalékos szekvenciaazonosság feljebb vihető, hogy helyreigazítsuk a helyettesítés konzervatív természetét. Ilyen korrekciókra szolgáló eszközök a szakember számára jól ismertek. Ilyen például a konzervatív szubsztitúciónak inkább részleges, mint teljesen helytelen párosodásként („mismatch”) történő értékelése, ezáltal a százalékos szekvenciaazonosság növelése. Tehát, ha egy azonos aminosav 1 értéket jelent, és a nem konzervatív szubsztitúció 0 értéket jelent, akkor a konzervatív szubsztitúció 0 és 1 közötti értéket jelent. A konzervatív szubsztitúciók értékelése például Meyers és Miller algoritmusával számolható [Computer Applic. Bioi. Sci. 4, 11-17 (1988)], amely a PC/GENEprogramban végrehajtható (Intelligenetics, Mountain View, Califomia, USA).
A „lényegében azonos” kifejezésen két nukleinsav vagy polipeptid vonatkozásában olyan szekvenciát vagy alszekvenciát értünk, amely legalább 25%-ban azonos egy referenciaszekvenciával. Egy másik lehetőségként a százalékos azonosság 25%-tól 100%-ig bármilyen egész szám lehet. Előnyösebb megvalósítási módok szerint legalább 25%, 30%, 35%, 40%, 45%,
50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% vagy 99% a referenciaszekvenciákkal összehasonlítva a leírásban ismertetett programok, előnyösen BLAST alkalmazásával, standard paraméterekkel az alábbiakban ismertetettek szerint. A kifejezés a vizsgálati szekvenciával komplementer szekvenciára is vonatkozik, ha a vizsgálati szekvencia lényegében azonos egy referenciaszekvenciával.
Szekvencia-összehasonlításoknál jellemzően az egyik szekvencia referenciaszekvenciaként szolgál, amelyhez a vizsgálati szekvenciát hasonlítjuk. Szekvencia-összehasonlítási algoritmus alkalmazásakor a vizsgálati és a referenciaszekvenciát bevisszük a számítógépbe, szükség esetén kijelöljük az alszekvencia-koordinátákat és az algoritmusprogram szekvenciaparamétereit. A program alapértelmezési paraméterei alkalmazhatók vagy alternatív paraméterek adhatók meg. A szekvencia-összehasonlítási algoritmus azután a program paraméterei alapján kiszámolja a vizsgálati szekvenciák százalékos szekvenciaazonosságát a referenciaszekvenciára vonatkoztatva.
A leírás szerinti értelemben az „összehasonlítási ablak” kifejezésen 20-tól 600-ig, általában körülbelül 50-től körülbelül 200-ig, gyakrabban körülbelül 100-tól körülbelül 150-ig terjedő számú alkotóelemből álló, egybefüggő szegmenst értünk, amelyben a szekvenciát az ugyanolyan számú, egybefüggő alkotóelemből álló referenciaszekvenciához hasonlítjuk, miután a két szekvenciát optimálisan egymás mellé rendeztük, összehasonlítás érdekében a szekvenciák egymás mellé rendezésére szolgáló eljárások a technika állása szerint jól ismertek, összehasonlítás érdekében a szekvenciák optimális egymás mellé rendezése például helyi homológia algoritmussal [Smith és Waterman, Adv. Appl. Math. 2, 482 (1981)], homológia egymás mellé rendezési algoritmussal [Needleman és Wunsch, J. Mól. Bioi. 48, 443 (1970)], hasonlóságkeresési eljárással [Pearson és Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 2444 (1988)], a következő programok számítógépes kivitelezésével (GAP, BESTFIT, FASTA és TFASTA a Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl) vagy manuális egymás mellé rendezéssel és vizuális vizsgálattal végezhető.
Az egyik alkalmas algoritmus például a PILEUP. A PILEUP többszörös szekvencia egymás mellé rendezést hajt végre rokon szekvenciák csoportjában fokozatosan haladó (progresszív), páronkénti egymás mellé rendezéssel, és rokonságot és százalékos szekvenciaazonosságot állapít meg. Fa vagy dendogram formájában ábrázolja a csoportosító kapcsolatokat, amelyek alapján az egymás mellé rendezést végrehajtotta. A PILEUP Feng és Doolittle progresszív, egymás mellé rendezési eljárásának [J. Mól. Evői. 35, 351-360 (1987)] egyszerűsített változatát alkalmazza. Az alkalmazott eljárás hasonlít a Higgins és Sharp által ismertetett eljáráshoz [CABIOS 5, 151-153 (1989)]. A program akár 300 szekvenciát képes egymás mellé rendezni, amelyeknek hosszúsága maximum 5000 nukleotid vagy aminosav. A többszörös egymás mellé rendezési
HU 225 428 Β1 módszer a két legjobban hasonlító szekvencia páronként! egymás mellé rendezésével kezdődik, amellyel két egymás mellé rendezett szekvencia csoportja jön létre. Ezt a csoportot rendezi azután a legközelebbi rokon szekvenciához vagy egymás mellé rendezett szekvenciák csoportjához. Szekvenciák két csoportját a két egyedi szekvencia páronként! egymás mellé rendezésének egyszerű kiterjesztésével rendezi egymás mellé. A végső egymás mellé rendezést a program progresszív, páronként! egymás mellé rendezések sorozatával állítja elő. A program a szekvencia-összehasonlítás szakaszaira a konkrét szekvenciák és az aminosav- vagy nukleotidkoordinátáik kijelölésével és a programparaméterek megadásával futtatható. A referenciaszekvencia például más, vizsgálati szekvenciákhoz hasonlítható a százalékos szekvenciaazonossági rokonság megállapítása érdekében a következő paraméterek alkalmazásával: alapértelmezésben a lyuk alapértelmezett súlya („default gap weight”) (3,00), alapértelmezésben a lyuk hosszúságának súlya („default gap length weight”) (0,10) és súlyozott végű lyukak („weight end gaps”).
A százalékos szekvenciaazonosság és a szekvenciahasonlóság meghatározására alkalmas további algoritmus például a BLAST-algoritmus, amelyet Altschul és munkatársai írtak le [Altschul és munkatársai, J. Mól. Bioi. 215, 403-410 (1990)]. A BLAST-vizsgálatokat végző szoftver nyilvánosan hozzáférhető a National Center fór Biotechnology Information hálócímén keresztül (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Az algoritmus először nagy találati értékű szekvenciapárokat azonosít (HSP, „high scoring sequence pairs”) a keresőszekvenciában W hosszúságú, rövid szavak azonosításával, amelyek vagy illeszkednek, vagy meghaladnak valamely pozitív értékű, T küszöbértéket, amikor az adatbázisban lévő szekvencia ugyanolyan hosszúságú szavával egymás mellé rendezzük őket. A T értéket a szomszédos szó találati küszöbértékének nevezik (Altschul és munkatársai, lásd fent). Ezek a szomszédos szótalálatok szolgálnak a keresés kezdetén kiindulásként az ezeket tartalmazó, hosszabb HSP-k keresésében. A szótalálatokat aztán mindkét irányban kiterjesztik mindkét szekvencián addig, amíg csak az összesített egymás mellé rendezési érték növelhető. A szótalálatok mindkét irányba történő terjedése akkor áll meg, ha: az összesített egymás mellé rendezési érték X értékkel eltér a maximálisan elért értékétől, az összesített érték zéró vagy ennél kisebb egy vagy több negatív értékű elem egymás mellé rendezésének köszönhetően, vagy valamelyik szekvenciának a végére ért. A BLAST-algoritmus W, T és X paraméterei az egymás mellé rendezés érzékenységét és sebességét határozzák meg. A BLAST-program alapértelmezésként 11-es szóhosszúságot (W) alkalmaz, a BLOSUM62 értékelő mátrix [lásd Henikoff és Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10915 (1989)] 50-es egymás mellé rendezést (B), 10-es elvárást (E), M=5, N=4 és mindkét szál összehasonlítását.
A BLAST-algoritmus két szekvencia közötti hasonlóság statisztikai vizsgálatára is alkalmas [lásd például
Kariin és Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5873-5787 (1993)]. A BLAST-algoritmus szerinti hasonlóság egyik mérése a legkisebb összeg valószínűség [P(N), „Smallest sum probability”], amely annak a valószínűségét jellemzi, hogy két nukleotid- vagy aminosavszekvencia illeszkedése véletlenül létrejöhet. Egy nukleinsav például akkor tekinthető hasonlónak a referenciaszekvenciához, ha a legkisebb összeg valószínűség a vizsgálati nukleinsavnak a referencianukleinsavval történő összehasonlításában körülbelül 0,01-nál kisebb, előnyösebben körülbelül 10_5-nél kisebb, legelőnyösebben körülbelül 10_2°-nál kisebb.
A „konzervatívan módosított változatok” kifejezés mind aminosav-, mind nukleinsavszekvenciákra vonatkozik. Konkrét nukleinsavszekvenciákra vonatkozva a konzervatívan módosított változatok kifejezésen olyan nukleinsavakat értünk, amelyek azonos vagy alapvetően azonos aminosavszekvenciákat kódolnak, vagy ahol a nukleinsav nem kódol aminosavszekvenciát és alapvetően azonos szekvenciákat. A genetikai kód degeneráltsága miatt nagyszámú, funkcionálisan azonos nukleinsav kódol minden ismert fehérjét. A GCA, GCC, GCG és GCU kodonok például mind az alanin aminosavat kódolják. Tehát mindegyik helyzetben, ahol egy kodon alanint határoz meg, a kodon az ismertetett, megfelelő kodonok bármelyikére cserélhető a kódolt polipeptid megváltozása nélkül. Ilyen nukleinsawáltozatokat „csendes változatoknak” nevezzük, amelyek a konzervatívan módosított változatok egyik fajtájának tekinthetők. A leírásban ismertetett, egy polipeptidet kódoló, mindegyik nukleinsavszekvencia a nukleinsav minden lehetséges csendes változatát is tartalmazza. Szakember számára nyilvánvaló, hogy egy nukleinsavban lévő mindegyik kodon (az AUG kivételével, amely rendszerint a metionin egyetlen kodonja) úgy módosítható, hogy funkcionálisan azonos molekulát eredményezzen. Ezek szerint egy polipeptidet kódoló nukleinsav mindegyik csendes változata magától értetődően benne foglaltatik a leírt szekvenciában.
Az aminosavszekvenciákat illetően a szakember számára ismert, hogy egyedi szubsztitúciók a nukleinsav-, peptid-, polipeptid- vagy fehérjeszekvenciákban, amelyek egyetlen aminosavat vagy aminosavak kis százalékát változtatják meg a kódolt szekvenciában, „konzervatívan módosított változatok”, ahol a változás egy aminosavnak egy kémiailag hasonló aminosawal történő helyettesítését eredményezi. A technika állása szerint jól ismertek a funkcionálisan hasonló aminosavakat eredményező, konzervatív szubsztitúciókat ismertető táblázatok.
A következő hat csoport mindegyike olyan aminosavakat tartalmaz, amelyek egymás konzervatív szubsztitúciói:
1. alanin (A), szerin (S), treonin (T)
2. aszparaginsav (D), glutaminsav (E)
3. aszparagin (N), glutamin (Q)
4. arginin (R), lizin (K)
5. izoleucin (I), leucin (L), metionin (M), valin (V), és
6. fenil-alanin (F), tirozin (Y), triptofán (W) [lásd például Creighton, Proteins (1984)]
HU 225 428 Β1
Két nukleinsavszekvencia vagy polipeptid lényegében azonos voltának jele, hogy az első nukleinsav által kódolt polipeptid immunológiailag keresztreakcióra képes a második nukleinsav által kódolt polipeptiddel szemben termelt ellenanyaggal. Egy polipeptid például jellemzően lényegében azonos egy második polipeptiddel, ha a két peptid csak konzervatív szubsztitúciókban különbözik. Két nukleinsavszekvencia lényegében azonos voltának egy másik jele az, hogy a két molekula vagy komplementjeik az alábbiakban ismertetett, sztringens körülmények között hibridizálnak egymással.
A „szelektíven (vagy specifikusan) hibridizál valamivel” kifejezésen azt értjük, hogy egy molekula csak egy bizonyos nukleotidszekvenciával kötődik, képez kettős szálat vagy hibridizál sztringens hibridizációs körülmények között, ha a szekvencia jelen van a komplex keverékben (például teljes sejtes vagy DNS- vagy RNSkönyvtár).
A „sztringens hibridizációs körülmények” kifejezésen olyan körülményeket értünk, amikor a próba hibridizál a célzott alszekvenciával, jellemzően nukleinsavak komplex keverékében, de más szekvenciákhoz nem kötődik. A sztringens körülmények szekvenciafüggőek és különböző körülmények között eltérőek lehetnek. Hosszabb szekvenciák magasabb hőmérsékleteken hibridizálnak specifikusan. A nukleinsavak hibridizációjához részletes útmutató Tijssen munkájában található [Tijssen, „OverView of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays”, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes (1993)]. Az erősen sztringens körülményeket általában úgy választjuk, hogy körülbelül 5-10 °C-kal legyen alacsonyabb az adott szekvencia hőmérsékleti olvadáspontjánál (TM), meghatározott pH ionerősségnél. A kismértékben sztringens körülményeket általában úgy állítjuk be, hogy a hőmérséklet 15-30 °C-kal legyen a TM alatt. A TM az a hőmérséklet (meghatározott ionerősségnél, pH-nál és nukleinsavkoncentrációnál), amelynél a céllal komplementer próba 50%-a hibridizál a célszekvenciához az ekvilibriumnál (mivel a célszekvenciák vannak feleslegben, a TM-nél a próbák 50%-a foglalt az ekvilibriumnál). Sztringens körülményeknél a sókoncentráció körülbelül 1,0 M nátriumionnál kevesebb, jellemzően körülbelül 0,01 M-tól 1,0 M nátriumion-koncentráció (vagy más só) pH 7,0-8,3 között, és a hőmérséklet legalább körülbelül 30 °C rövid próbák esetében (például 10-50 nukleotid) és legalább körülbelül 60 °C hosszú próbáknál (például 50 nukleotidnál nagyobb). Sztringens körülmények destabilizálóanyagok, például formamid hozzáadásával érhetők el. Szelektív vagy specifikus hibridizáció esetében pozitív szignálnak a háttér legalább kétszeresét, előnyösen a háttér tízszeresét tekintjük.
Az egymással sztringens körülmények között nem hibridizáló nukleinsavak mégis lényegében azonosak, ha a polipeptidek, amelyeket kódolnak, lényegében azonosak. Ilyen például akkor fordul elő, ha a nukleinsav másolata a genetikai kód által megengedett legnagyobb kodondegeneráció alkalmazásával készült. Ilyen esetekben a nukleinsavak jellemzően csak mérsékelten sztringens hibridizációs körülmények között hibridizálnak.
A találmány szerinti ANT-nukleinsavakat tartalmazó genomi DNS vagy cDNS hagyományos Southernblot-vizsgálattal azonosítható sztringens körülmények között, a leírásban feltárt nukleinsavszekvenciák alkalmazásával. A kitanítás céljából ilyen hibridizációkra alkalmas, sztringens körülmények például 40% formamidot, 1 M nátrium-kloridot, 1% SDS-t tartalmazó pufferben, 37 °C-on történő hibridizáció, és legalább egyszeri mosás 0,2 X SSC-vel legalább körülbelül 50 °C hőmérsékleten, általában körülbelül 55 °C-tól körülbelül 60 °C-lg, 20 percen keresztül, vagy ehhez hasonló körülmények. Pozitív hibridizáció a háttér legalább kétszerese. Szakember számára nyilvánvaló, hogy más hibridizációs és mosási körülmények is alkalmazhatók, amelyek hasonlóan sztringens körülményeket biztosítanak.
További jele annak, hogy két polinukleotid lényegében azonos, az, ha az oligonukleotid-láncindító párral amplifikált referenciaszekvencia sztringens hibridizációs körülmények között próbaként alkalmazható a vizsgálati szekvenciának cDNS-ből vagy genomi könyvtárból történő izolálására vagy a vizsgálati szekvencia azonosítására például RNS- vagy DNS-gél-blot hibridizációs vizsgálatban.
A következőkben az előnyös megvalósítási módokat ismertetjük.
A találmány tárgyát képezi növényekben a sejtszaporodás, és így a sejtszám ellenőrzése az ANT-aktivitás változtatásával a növényekben. A találmány tárgyát képezik például növényi biomasszának a sejtszám és a hajtás vegetatív szervek és/vagy szerkezetek (például levél, szár és gumó), a gyökerek, a virágok és a virágzat! szervek (például murvalevelek, csészelevelek, szirom, porzószál, termőlevél, portok), a magkezdemény (beleértve a petét és a központi sejteket), a mag (például a zigóta, embrió, endospermium és maghéj), a termés (az érett magház) és a cslranövények méretének és/vagy tömegének ellenőrzésén keresztül történő manipulálására szolgáló molekuláris stratégiák ANT-génkonstrukciók alkalmazásával. Az ANT-expresszió szabályozásával tehát fokozott vagy csökkent mértékű biomasszát tartalmazó, transzgenikus növények állíthatók elő. A gén megváltozott expressziója továbbá a hím- és a nőivarú reproduktív szervekben sterilitást okozhat a sejtszaporodás mintázatának megváltozásán keresztül. Ily módon hím- vagy nősteril, transzgenikus növények állíthatók elő az ANT-gén expressziójának a megfelelő szövetekben történő serkentésével vagy gátlásával. További megvalósítási módok szerint járulékos szervek, hajtások vagy szerkezetek, például szomatikus embriók képződése ellenőrizhető a találmány szerinti eljárással. Növények aszexuális reprodukciójának hatékonysága, előnyösen kívánt jellemzőkkel bíró, steril vagy hibrid növények reprodukciójának és transzformált szövetből transzgenikus növények regenerációjának hatékonysága javítható.
Mivel az ANT-gén nagyon valószínűen transzkripciós faktorként működik [Vergani és munkatársai,
HU 225 428 Β1
FEBS Letters 400, 243-246 (1997)], a szakember számára nyilvánvaló, hogy a megváltozott ANT-aktivitással kapcsolatos, kívánt fenotípusok az ANT-regulált gének expressziójának vagy aktivitásának módosításával nyerhetők. Erre a célra bármilyen, az ANT expresszióját vagy aktivitását fokozó vagy csökkentő eljárás alkalmazható.
ANT-aktivitás vagy ANT-génexpresszió fokozása
A technika állása szerint ismert, sokféle módszer közül bármelyik alkalmazható növényekben az ANT-aktivitás növelésére. A fokozott expresszió például aszexuális reprodukció kiváltására vagy fokozására, vagy a kívánt növényi szervekben a szerv méretének/tömegének növelésére alkalmazzuk. Bármilyen szerv megcélozható, például növényi hajtás vegetatív szervek és/vagy szerkezetek (például levelek, szár és gumó), gyökerek, virágok és virágzat! szervek (például murvalevelek, csészelevelek, szirom, porzószál, termőlevél, portok), magkezdemény (például a pete és a központi sejtek), mag (például a zigóta, az embrió, az endospermium és a maghéj), termés és a csíranövények. Az ANT-aktivitás megváltozásának kedvező hatásai nem szükségszerűen a fokozott sejtszaporodás közvetlen eredménye. A megnövekedett levélméret és/vagy levéltömeg a fotoszintézis növekedését okozza, amely viszont nagyobb hozamot eredményez. Hasonló növekedés a gyökerek tömegében és/vagy méretében fokozott tápanyagfelvételt és nagyobb hozamot eredményez. A vastagabb szár vagy kocsány a széldöntés következtében keletkezett veszteségek csökkentésére alkalmazható például gabona-terménynövényeknél és terméseknél.
Fokozott ANT-aktivitás vagy ANT-expresszió hímvagy nősteril növények előállítására is alkalmazható. A hím- vagy nősterilitás a mezőgazdaságban és a kertészetben fontos, előnyösen kereskedelmileg előnyös, kedvező tulajdonsággal bíró hibrid változatok előállításában. A hím- vagy nősterilitás a nemesítőknek hibridváltozatok készítését könnyíti meg a szülői növényekben az önbeporzás megakadályozásával. Fejlődő portokokban az ANT-expresszió megcélzása például hímsterilitást okoz, de nem zavarja a női ivarszerveket, így a növények nőivarúan termékenyek. A felnyílás megakadályozása szintén kívánatos a kereskedelmi vágott virágoknál. A beporzás például a virág öregedéséhez vezet, a pollen allergén lehet, és bizonyos növényekben (például liliomoknál) foltot hagy.
Az ANT-gén expressziója transzgenikus növényekben nősterilitást is okozhat. Az ANT-gént a magkezdeményben konstitutívan expresszáló növények nagy, érett magkezdeményt hoznak létre, amely azonban steril. Az ANT-működés ellenőrzésén keresztül a nősterilitás kialakítása késleltetheti a növények öregedését, és javítja a terménynövények és a kertészetileg fontos növények vegetatív hozamát és minőségét. Egy másik lehetőségként a nősterilitás csökkent ANT-expresszióból származik az alábbiakban ismertetett, az ANT-aktivitás vagy ANT-génexpresszió gátlására szolgáló eljárások alkalmazásával.
Az ANT-génexpresszió fokozása
A leírásban ismertetettek szerint készült, izolált szekvenciák egy konkrét ANT-nukleinsav expressziójának bevitelére alkalmazhatók az endogén génexpresszió fokozása érdekében a szakember számára ismert eljárások alkalmazásával. Alkalmas konstrukciók készítését és ezek növényekbe történő bevitelére szolgáló eszközöket a következőkben ismertetjük.
Szakember számára nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti gének által kódolt polipeptideknek, más fehérjékhez hasonlóan különböző doménjei vannak, amelyek különböző működéseket látnak el. A génszekvenciáknak tehát nem kell teljes hosszúságúaknak lenni, amennyiben a fehérje kívánt, funkcionális doménje expresszálódik. Az ANT-polipeptidek megkülönböztető vonásait, amelyek például az AP2-domén, a magi lokalizációs szignál és a transzkripciós aktivációs domének, Elliot és munkatársai (Elliot és munkatársai, lásd fent) vagy Klucher és munkatársai (Klucher és munkatársai, lásd fent) ismertetik.
Módosított fehérjeláncok szintén könnyen tervezhetők a szakember számára jól ismert, és az alábbiakban részletesen ismertetett, különböző, rekombináns technológiákkal. A láncok például a természetesen előforduló szekvenciától az elsődleges szerkezeti szinten aminosavszubsztitúcióban, -addíciókban, -deléciókban és hasonlókban különbözhetnek. Ezek a változtatások sokféle kombinációban alkalmazhatók a végső, módosított fehérjelánc kialakítása érdekében.
Endogén ANT-gének módosítása
Növényi génekbe genetikai mutációk bevitelére és a kívánt tulajdonságú növények kiválogatására szolgáló eljárások jól ismertek. Magok vagy más növényi anyagok például mutagén kémiai anyaggal kezelhetők a hagyományos technológiák szerint. Ilyen kémiai anyagok például, de nem kizárólag a következők: dietil-szulfát, etilén-imin, etil-metánszulfonát és N-nitozo-N-etilurea. Egy másik lehetőségként különböző eredetű ionizáló sugárzás, például röntgensugár vagy gamma-sugár alkalmazható.
Egy további lehetőségként homológ rekombináció alkalmazható célzott génmódosítások kiváltására az ANT-gén in vivő specifikus megcélzásával [lásd általánosságban Grewal és Klar, Genetics 146, 1221-1238 (1997); Xu és munkatársai, Genes Dev. 10, 2411-2422 (1996)]. Homológ rekombinációt növényekben kimutattak [Puchta és munkatársai, Experientia 50, 277-284 (1994); Swoboda és munkatársai, EMBO J. 13, 484-489 (1994); Offringa és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7346-7350 (1993); Kempin és munkatársai, Natúré 389, 802-803 (1997)].
A találmány szerinti géneken homológ rekombinációs technológia alkalmazásával az ANT-génszekvenciák kiválasztott részeiben (például 5’-irányban, 3’-irányban és gének közötti szakaszokban) in vitro mutációkat alakítottak ki, például a leírásban ismertetetteket, és a hagyományos technológiák alkalmazásával a kívánt növénybe vitték. Mivel a homológ rekombináció hatékonyságáról ismert, hogy az alkalmazott vektortól függ, ezért általában dicisztronos gént
HU 225 428 Β1 célzó vektorokat [Mountford és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 4303-4307 (1994); Vauiont és munkatársai, Transgenic Rés. 4, 247-255 (1995)] alkalmaznak transzgenikus növényekben a megváltozott ANT-génexpresszló kiválogatása hatékonyságának fokozására. A mutált gén kölcsönhatásba lép a célzott, vad típusú génnel oly módon, hogy a transzgenikus növényi sejtekben homológ rekombináció és a vad típusú gén célzott helyettesítése történik, amely az ANT-aktivitás gátlását eredményezi.
Egy másik lehetőségként a végükön kettős hajtű alakú véget tartalmazó, kettős szálú konformációjú RNSvagy DNS-darabok folyamatos szakaszából álló oligonukleotidok alkalmazhatók. Az RNS/DNS szekvenciákat úgy tervezzük, hogy egymás mellé rendezhetők a cél ANT-gén szekvenciájával, és a kívánt nukleotidváltozást tartalmazzák. A kiméra oligonukleotid bevitele egy extrakromoszomális T-DNS-plazmidon hatékony és specifikus ANT-génkonverziót eredményez, amelyet kiméra molekulák irányítanak a transzformált növényi sejtek kis százalékában. Az eljárást Cole-Strauss és munkatársai ismertetik [Cole-Strauss és munkatársai, Science 273, 1386-1389 (1996) és Yoon és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 2071-2076 (1996)].
További eszközök az ANT-aktivitás fokozására
Egy eljárás az ANT-expresszió fokozására az „aktivációs mutagenezis” [lásd például Hiyashi és munkatársai, Science 258, 1350-1353 (1992)]. Ezen eljárás szerint egy endogén ANT-gén az endogén ANT-génhez képest 5’-irányban erős/konstitutív promotereket tartalmazó T-DNS-szekvenciák beépítésével úgy módosítható, hogy konstitutívan, ektópiásan vagy feleslegben expresszálódjon. Mint az alábbiakban ismertetjük, ANT-t fokozott mértékben expresszáló transzgenikus növények készítése is alkalmazható az ANT-expresszió fokozására. Az endogén ANT-gén aktivációs mutagenezise ugyanazt a hatást eredményezi, mint transzgenikus növényekben a transzgenikus ANT-nukleinsav fokozott mértékű expressziója. Egy másik lehetőségként az ANT-aktivitás vagy az endogén ANT-gén expressziójának serkentőjét kódoló endogén gén T-DNS-szekvenciák hasonló módon történő beépítésével úgy módosítható, hogy expresszálódjon, és az ANT-aktivitás fokozható.
Az ANT-expresszió fokozására egy másik stratégia ANT domináns, hiperaktív mutánsainak alkalmazása módosított ANT-transzgének expresszálásával. Az ANT-aktivitás negatív szabályozójával történő kölcsönhatásban fontos szerepet játszó doménben károsodott, módosított ANT expressziója például domináns, hiperaktív ANT-fehérjék előállítására alkalmazható. Egy további lehetőségként olyan csonka ANT-fehérjék expressziója, amelyeknek csak olyan doménjük van, amely negatív szabályozóval lép kapcsolatba, elvonja a negatív szabályozót, ezáltal fokozza az endogén ANT-aktivitást. Domináns mutánsok alkalmazását célgének hiperaktív állapotba hozására Mizukami és munkatársai ismertetik [Mizukami és munkatársai, Plánt Cell 8, 831-845 (1996)].
ANT-aktivitás vagy ANT-génexpresszió gátlása
Mint az előzőekben tárgyaltuk, az ANT-aktivitás a sejtszaporodás szabályozásával számos növényi folyamat ellenőrzésében fontos szerepet játszik. Az ANT-génexpressziós aktivitás gátlása például növényi szervek méretének és/vagy tömegének csökkentésére vagy növényekben nősterilitás kialakítására alkalmazható. Előnyösen olyan ANT-nukleinsavak célzott expressziója, amelyek gátolják az endogén génexpressziót (például antiszensz vagy koszuppresszió útján) a magkezdemény fejlődésének korai állapotban történő gátlására, és így nősterilitás kiváltására alkalmazható. A transzgenikus növények élettartama ezáltal növelhető, mivel a megtermékenyítés (magképzés) aktiválhatja és felgyorsíthatja a növények vagy szervek öregedési folyamatait.
Az ANT-génműködés gátlása a vegetatív növekedés megrövidítésére is alkalmazható, amely korai virágzást okoz. A virágzási idő ellenőrzésére szolgáló eljárások a mezőgazdaságban különösen értékesek a betakarítási idő kívánság szerinti optimalizálásával. Növényekben az ANT-gének működésének szabályozásával tehát a virágzás ideje ellenőrizhető. Termékeny növények növekedésének gyorsulása érhető el például a vegetatív fejlődés idején ANT antiszensz RNS-ének expresszálásával, hogy korai virágzást érjünk el. Az ANT-transzgén expressziója azután a reproduktív fejlődés idején kikapcsolható, hogy termékeny növényeket kapjunk.
ANT-génexpresszió gátlása
A leírásban ismertetett nukleinsavszekvenciák nukleinsavak tervezésére alkalmazhatók, amelyek sokféle, növényekben az ANT vagy rokon gén expressziójának gátlására szolgáló eljárásban alkalmazhatók. Antiszensz technológia például könnyen alkalmazható. Ennek érdekében a kívánt génből egy nukleinsavszekvencia klónozható és működőképesen egy promoterhez kapcsolható oly módon, hogy az antiszensz RNS-szál íródjon át. A konstrukciót azután növényekbe transzformáljuk és antiszensz RNS-szálat termeltetünk. Növényi sejtekben az antiszensz szuppresszió feltehetőleg a génszabályozás minden szintjén hat, például RNS-transzláció gátlásával [lásd Bourque Plánt Sci. (Limerick) 105, 125-149 (1995); Pantopoulos, Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology, 48. kötet, 181-238 szerk.: Cohn, W. E. és Moldave, K., kiad.: Academic Press, Inc., San Diego, California, USA; London, England, UK; Heiser és munkatársai, Plánt Sci. (Shannon) 127, 61-69 (1997)] és az érdeklődés tárgyát képező fehérjét kódoló mRNS felhalmozódásának megakadályozásával [lásd Baulcombe, Plánt Mól. Bioi. 32, 79-88 (1996); Prins és Goldbach, Arch Virol. 141, 2259-2276 (1996); Metzlaff és munkatársai, Cell 88, 845-854 (1997); Sheehy és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 8805-8809 (1988) és Hiatt és munkatársai, US 4.801.340 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat].
A beviendő nukleinsavszegmens általában lényegében azonos a represszálandó, endogén ANT-gén
HU 225 428 Β1 vagy -gének legalább egy részével. A szekvenciának azonban nem kell tökéletesen azonosnak lennie az expresszió gátlása érdekében. A találmány szerinti vektorok úgy tervezhetők, hogy a gátlóhatás más génekre is kiterjeszthető a gének azon családjában, amelyek a célgénnel azonosak vagy lényegében azonosak.
Antiszensz szuppresszió esetében a bevitt szekvenciának nem kell teljes hosszúságúnak lennie akár az elsődleges transzkripciós termékhez, akár a teljesen feldolgozott mRNS-hez képest. Nagyobb azonosság általában rövidebb szekvenciák kompenzálására alkalmazható. A bevitt szekvenciának továbbá nem kell, hogy ugyanaz legyen az intron- és exonmintázata, és a nem kódoló szegmensek azonossága azonos módon lehet hatékony. Általában körülbelül 30 vagy 40 nukleotidból álló szekvencia és körülbelül teljes hosszúságú nukleotidszekvencia közötti nukleotidszekvenciát kell alkalmazni, bár legalább körülbelül 100 nukleotidból álló szekvencia előnyös, legalább körülbelül 200 nukleotidból álló szekvencia előnyösebb és körülbelül 500-tól körülbelül 3500-ig terjedő nukleotidszekvencia a legelőnyösebb.
Számos génszakasz megcélozható az ANT-génexpresszió gátlása érdekében. Célok lehetnek például a kódolószakaszok, az intronok, az exon/intron kapcsolódásokból származó szekvenciák, az 5' vagy 3' nem transzlatálódó szakaszok és hasonlók.
Egy további, jól ismert szuppressziós eljárás a szensz koszuppresszió. A szensz irányban orientált nukleinsav beviteléről a közelmúltban mutatták ki, hogy hatékony eszköz célgének transzkripciójának gátlására. Ennek az eljárásnak endogén gének expressziójának módosítására történő alkalmazására példa a következő közleményekben található: Assaad és munkatársai, Plánt Mól. Bioi. 22, 1067-1085 (1993); Flavell, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 3490-3496 (1994); Stam és munkatársai, Annals Bot. 79, 3-12 (1997); Napolj és munkatársai, The Plánt Cell 2, 279-289 (1990); US 5.034.323 és 5.231.020 és 5.283.184 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratok.
Gátlóhatás akkor jelentkezik, ha a bevitt szekvencia nem tartalmaz önmagában kódolószekvenciát, hanem csak intront vagy az endogén szekvencia elsődleges transzkriptumában lévő szekvenciákkal homológ, nem transzlatálódó szekvenciát. A bevitt szekvencia általában lényegében azonos a represszálandó endogén szekvenciával. A minimális azonosság jellemzően körülbelül 65%-nál nagyobb, de nagyobb azonossággal az endogén szekvenciák expressziójának hatékonyabb repressziója valósítható meg. Lényegesen nagyobb, körülbelül 80%-nál nagyobb azonosság előnyös, de körülbelül 95%-tól a teljes azonosságig a legelőnyösebb. Antiszensz szabályozás esetében a hatás bármilyen más fehérjére alkalmazható azonos vagy lényegében azonos gének hasonló családján belül.
Koszuppresszió esetében a bevitt szekvenciának nem kell teljes mértékben azonosnak lennie, és nem szükséges teljes hosszúságúnak lennie akár az elsődleges transzkripciós termékhez, akár a teljesen feldolgozott mRNS-hez képest. Ez fokozott mértékben termelő, néhány növény egyidejű előállításának elkerülése érdekében lehet előnyös. A teljes hosszúságúnál rövidebb szekvenciáknál a nagyobb azonosság kompenzálja a hosszabb, kevésbé azonos szekvenciákat. Továbbá a bevitt szekvenciának nem kell, hogy ugyanolyan legyen az intron- vagy exonmintázata, és a nem kódoló szegmensek azonossága azonosan hatékony. Antiszensz szabályozáshoz általában az előzőekben ismertetett mérettartományba eső szekvenciákat alkalmazzuk. Továbbá ugyanazok, az antiszensz szabályozásnál tárgyalt génszakaszok koszuppressziós technológiákkal is megcélozhatok.
Oligonukleotidon alapuló, hármas hélix formáció szintén alkalmazható az ANT-génexpresszió megzavarására. A háromszálú DNS gátolhatja a DNS transzkripcióját és replikációját, helyspecifikus mutációk keletkezhetnek, hasíthatja a DNS-t, és homológ rekombinációt válthat ki [lásd például Havre és Glazer, J., Virology 67, 7324-7331 1993); Scanlon és munkatársai, FASEB J. 9, 1288-1296 (1995); Giovannangeli és munkatársai, Biochemistry 35, 10539-10548 (1996); Chan és Glazer, J., Mól. Medicine (Berlin) 75, 267-282 (1997)]. A hármas hélixet tartalmazó DNS-ek az antiszensz szabályozásnál azonosított szekvenciák megcélzására alkalmazhatók.
Katalitikus RNS-molekulák vagy ribozimok szintén alkalmazhatók ANT-gének expressziójának gátlására. A ribozimok úgy tervezhetők, hogy specifikusan párosodjanak szinte bármilyen cél-RNS-sel, és egy bizonyos helyen hasítsák a foszfodiésztervázat, ezáltal a cél-RNS működését inaktiválva. A hasítás közben a ribozim maga nem változik, ezért új ciklusba léphet, és más molekulákat hasíthat, akár egy igazi enzim. Ribozimszekvenciáknak antiszensz RNS-ekbe zárása RNS-hasító aktivitást biztosít ezen molekuláknak, így fokozza a konstrukciók aktivitását. A ribozimok az antiszensz szabályozásnál azonosított szekvenciák megcélzására alkalmazhatók.
Ribozimok sokféle osztályát azonosították. A ribozimok egyik osztálya önmaguk hasítására és növényekben replikációra képes, kis, cirkuláris RNS-ekből származnak. Az RNS-ek replikálódhatnak akár egyedül (viroid RNS-ek), akár segítő („helper”) vírussal (szatellit RNS-ek). Ilyenek például az avokádó napfoltosság viroidból származó RNS-ek és dohány gyűrűsfoltosság vírusból, lucerna átmeneti csíkosság vírusból, bársonyos dohány foltosság vírusból, solanum nodiflorum foltosság vírusból és here föld alatti törpülés vírusból származó szatellit RNS-ek. A cél-RNS-re specifikus ribozimok tervezését és alkalmazását Zhao és Pick ismertetik [Zhao és Pick, Natúré 365, 448-451 (1993); Eastham és Ahlering, J. Urology 156, 1186-1188 (1996); Sokol és Murray, Transgenic Rés. 5, 363-371 (1996); Sun és munkatársai, Mól. Biotechnology 7, 241-251 (1997); Haseloff és munkatársai, Natúré 334, 585-591 (1988)].
Endogén ANT-gének módosítása
Az előzőekben ismertetett genetikai mutációk bevitelére szolgáló eljárások csökkent ANT-expresszióval jellemezhető növények kiválogatására is alkalmazhatók.
HU 225 428 Β1
További eszközök ANT-aktivitás gátlására
Az ANT-aktivitás az ANT sejtspecifikus génexpressziójához szükséges fehérjék megszüntetésével változtatható. A szabályozófehérjék és/vagy az ANTgénexpressziót ellenőrző szekvenciák expressziója az alábbiakban ismertetett eljárásokkal változtatható.
Egy másik stratégia az ANT-fehérje azon képességének meggátlása, hogy önmagával vagy más fehérjékkel kölcsönhatásba lépjen. Ez például ANT-re specifikus ellenanyagok alkalmazásával végezhető. Ezen eljárás szerint ANT-specifikus ellenanyagok sejtspecifikus expresszióját alkalmazzuk funkcionális domének inaktiválására ellenanyag:antigén felismerésen keresztül [lásd Hupp és munkatársai, Cell 83, 237-245 (1995)]. Az ANT-vel kölcsönhatásba lépő fehérje/fehérjék aktivitásával való kölcsönhatás hasonló módon alkalmazható. Egy másik lehetőségként ANT domináns, negatív mutánsai készíthetők csonka ANT-fehérjét kódoló transzgének expresszálásával. Domináns, negatív mutánsok alkalmazását transzgenikus növényekben célgének inaktiválására Mizukami és munkatársai ismertetik [Mizukami és munkatársai, Plánt Cell 8, 831-845(1996)].
ANT-nukleinsavak izolálása
Általánosságban az elnevezések és az alábbiakban ismertetendő, rekombináns DNS technológiai, laboratóriumi módszerek a technika állása szerint jól ismertek és általánosan alkalmazottak. A hagyományos technológiákat alkalmazzuk klónozáshoz, DNS- és RNS-izoláláshoz, amplifikációhoz és tisztításhoz. Az enzimreakciókat (DNS-ligáz, DNS-polimeráz, restrikciós endonukleázok és hasonlók) általában a gyártók útmutatásai szerint végezzük. Ezeket a technológiákat és különböző, más technológiákat általában Sambrook és munkatársai könyve [Sambrook és munkatársai, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1989)] vagy Current Protocols in Molecular Biology, 1-3 kötet, John Wiley & Sons, Inc. (1994-1998) című kiadvány alapján végeztük.
Az ANT-nukleinsavak izolálása többféle technológiával végezhető. A leírásban ismertetett szekvenciákon alapuló oligonukleotidpróbák a kívánt génnek cDNS- vagy genomi DNS-könyvtárakban történő azonosítására alkalmazhatók. Genomi könyvtárak készítése érdekében genomi DNS-ek nagy szegmenseit készítjük véletlenszerű fragmentálással, például restrikciós endonukleázok alkalmazásával, és vektor-DNSsel ligáljuk, hogy konkatemereket képezzünk, amelyek azután megfelelő vektorokba csomagolhatok. Egy cDNS-könyvtár készítéséhez a kívánt szervből, például virágokból mRNS-t izolálunk, és az mRNS-ből az ANT-géntranszkriptumot tartalmazó cDNS-könyvtárat elkészítjük. Egy másik lehetőségként ANT-géneket vagy ANT-homológokat expresszáló, más szövetekből kivont mRNS-ből cDNS készíthető.
A cDNS vagy genomi könyvtár azután a leírásban közzétett, klónozott ANT-gén szekvenciáján alapuló próba alkalmazásával szűrhető. A próbák genomi
DNS-sel vagy cDNS-szekvenciákkal hibridizáltathatók ugyanazon vagy eltérő növényfajokban homológ gének izolálása érdekében. Egy további lehetőségként ANTpolipeptidekkel szemben termelt ellenanyagok alkalmazhatók mRNS expressziós könyvtár szűrővizsgálatára.
Alternatív módon az érdeklődés tárgyát képező nukleinsavak nukleinsavmintákból amplifikálhatók amplifikációs technológiákkal. Például polimeráz-láncreakció (PCR) technológia alkalmazható az ANT-génszekvenciáknak közvetlenül genomi DNS-ből, cDNSből, genomi könyvtárakból vagy cDNS-könyvtárakból történő amplifikálására. Például PCR és más, in vitro amplifikációs eljárások alkalmazhatók az expresszálandó fehérjéket kódoló nukleinsavszekvenciák klónozására, hogy próbaként alkalmazható nukleinsavakat készítsünk mintákban a kívánt mRNS jelenlétének kimutatására, nukleinsavak szekvenálására vagy más célokra. A PCR-ről általános áttekintés a következő publikációban található: PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, szerk.: Innis, M., Gelfand,
D., Sninsky, J. és White, T., kiad,: Academic Press, San Diego (1990). Az ANT-szekvenciáknak növényi szövetekből történő azonosítására szolgáló, megfelelő láncindítók és próbák a leírásban ismertetett szekvenciák (például 4. azonosító számú szekvencia) és Klucher és munkatársai (lásd fent) és Elliot és munkatársai (lásd fent) által ismertetett szekvenciák összehasonlításaiból készíthetők.
Polinukleotidok jól ismert technológiák szerint szintetizálhatok, a technikában ismertetettek szerint [Carruthers és munkatársai, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Bioi. 47, 411-418 (1982) és Adams és munkatársai, J. Am. Chem. Soc. 105, 661 (1983)]. Ezután kettős szálú DNS-fragmensek nyerhetők akár a komplementer DNS-szál szintetizálásával, akár a szálaknak megfelelő körülmények között történő hibridizálásával, vagy a komplementer szál DNS-polimeráz segítségével történő hozzáadásával megfelelő láncindító szekvencia alkalmazásával. Mivel az Arabidopsis ANT-nukleotidszekvencia az 5’- és a 3’-végek legvégén nagyon hasonló Brassica ANT-nukleotidszekvenciához, de más, Arabidopsis AP2-domént tartalmazó génekhez nem, a 6., 7. vagy 8. azonosító számú szekvenciák szerinti nukleotidszekvenciájú láncindítók ANT-ortológok szűrésére és/vagy izolálására alkalmazhatók különböző fajokban RT-PCR-rel.
Rekombináns vektorok készítése
Izolált szekvenciáknak az előzőekben ismertetett technológiákban történő alkalmazása érdekében növényi sejtek transzformálására alkalmas, rekombináns DNS-vektorokat készítünk. Magasabb rendű növényfajok széles körének transzformálására szolgáló technológiák jól ismertek, és a technikában és a tudományos irodalomban megtalálhatók [lásd például Weising és munkatársai, Ann. Rév. Génét. 22, 421-477 (1988)]. A kívánt polipeptidet kódoló DNS-szekvencia, például egy teljes hosszúságú fehérjét kódoló cDNS-szekvencia előnyösen transzkripciós és transzlációs iniciációs
HU 225 428 Β1 szabályozószekvenciákkal egyesíthető, amelyek a génből származó szekvencia transzkripcióját irányítják a transzformált növény kívánt szöveteiben.
Fokozott mértékű expresszió („overexpresszió”) érdekében például olyan növényi promoterfragmens alkalmazható, amely a gén expresszióját egy regenerált növény minden szövetében irányítja. A leírásban az ilyen promotereket „konstitutív” promotereknek nevezzük, és a legtöbb környezeti körülmény között és a legtöbb fejlődési állapotban vagy a sejtdifferenciáció során többnyire aktívak. Konstitutív promoterek például karfiol-mozaikvírus (CaMV) 35S transzkripciós iniciációs szakasza, az T- vagy 2’-promoter Agrobacterium tumefaciens T-DNS-éből és más transzkripciós iniciációs szakaszok különböző, a szakember számára ismert, növényi génekből. Ilyen gének például az ACT11 Arabidopsisból [Huang és munkatársai, Plánt Mól. Bioi. 33, 125-139 (1996)] a Cat3 Arabidopsisból (GenBank U43147 nyilvántartási szám, Zhong és munkatársai, Mól. Gén. Génét. 251, 196-203 (1996)], Brassica napusból származó sztearil-acil-karrierfehérje-deszaturázt kódoló gén (GenBank X74782, Solocombe és munkatársai, Plánt Physiol. 104, 1167-1176 (1994)], a kukoricából származó Gpc1 (GenBank X15596, Martinez és munkatársai, J. Mól. Bioi. 208, 551-565 (1989)] és a kukoricából származó Gpc2 (GenBank U45855, Manjunath és munkatársai, Plánt Mól. Bioi. 33, 97-112 (1997)].
Egy másik lehetőségként növényi promoter irányíthatja az ANT-nukleinsav expressziőját bizonyos szövetben, szervben vagy sejttípusban (azaz szövetspecifikus promoterek), vagy más módon állhat pontosabb környezeti vagy fejlődési ellenőrzés alatt (azaz indukálható promoterek). Környezeti körülmények, amelyek az indukálható promoterek révén befolyásolják a transzkripciót, például az anaerob körülmények, magasabb hőmérséklet, fény jelenléte vagy vegyi anyagokkal/hormonokkal történő meghintés. Szakember számára nyilvánvaló, hogy szövetspecifikus promoterek irányíthatják a működőképesen kapcsolt szekvenciák expresszióját a célszövettől eltérő szövetekben. A szövetspecifikus promoter a leírás szerint tehát olyan promoter, amely az expressziót elsődlegesen a célszövetben vagy sejttípusban irányítja, de más szövetekben is eredményezhet bizonyos expressziót.
Számos szövetspecifikus promoter alkalmazható a találmány szerint. Például olyan promoterek alkalmazhatók a sterilitást kívánó eljárásokban, amelyek virágokban, magkezdeményben vagy portokban (előnyösen a tapetumban) irányítják a nukleinsavak expresszióját. Magkezdeményben az expressziót irányító promoter például a BEL 1 -génből származó promoter, amelyet Reiser és munkatársai ismertetnek [Reiser és munkatársai, Cell 83, 735-742 (1995); GenBank U39944)]. Tapetumspecifikus promoter például a dohánynövényből származó TA29 [Mariani és munkatársai, Natúré 347, 737-41 (1990)] és Brassicából származó A6 és A9 [Paul és munkatársai, Plánt Mól. Bioi. 19, 611-22 (1992); Hird és munkatársai, Plánt Journal 4, 1023-1033 (1993)]. Portokspecifikus promoterek szintén alkalmazhatók, például amelyet Twell és munkatársai izoláltak [Twell és munkatársai, Mól. Gén. Génét. 217, 240-45(1991)].
Hímsterilitás kiváltásához például a második és harmadik virágzati szervre (szirom és porzószál) specifikus AP3-promoter [Day és munkatársai, Development 121, 2887 (1995)] alkalmazható. A termőlevélre specifikus AGL1-promoter [Flanagan és Ma, Plánt J. 10, 343 (1993)] vagy AGL5-promoter [Savidge és munkatársai, Plánt Cell 7, 721 (1995)] alkalmazható csak nősterilitás kiváltására. Az ANT-gén konstitutív expresszálásával az AG-promoterrel [Sieburth és Meyerowitz, Plánt Cell 9, 355 (1997)], amely csak reproduktív szervprimordiában és fejlődő hím- és női szervekben aktív, még nagyobb lepelszervekkel bíró steril növények is nyerhetők.
Az AP1-promoter [Gustafson-Brown és munkatársai, Cell 76, 131 (1994)] alkalmazásával, amely virágzati primordiában expresszálódik a virágfejlődés korai szakaszaiban és fejlődő lepelszervekben, megnagyobbodott lepelszervekkel bíró, termékeny virágok állíthatók elő. A föld feletti vegetatív szerv biomasszájának növelése érdekében fotoszintetikus szervre specifikus promoterek, például RBCS-promoter [Khoudi és munkatársai, Gene 197, 343 (1997)] alkalmazhatók. A gyökér biomasszája konstitutív ANT-expresszióval növelhető a gyökérspecifikus ANR1-promoter ellenőrzése alatt [Zhang és Forde, Science 279, 407 (1998)]. A mag méretének és/vagy tömegének (egy mezőgazdaságilag fontos jellemzőnek) növelése érdekében magspecifikus promoterek, például LEC-promoter [Lotan és munkatársai, Cell 93, 1195 (1998)], a késői embriogenezis abundáns promoter [West és munkatársai, Plánt Cell 6, 173 (1994)], béta-konglicinin alfa-alegység promoter (West és munkatársai, lásd fent), a lektin-promoter [Goldberg és munkatársai, Science 266, 605 (1994)] vagy Kunitz tripszin inhibitor-3 promoter (Goldberg és munkatársai, lásd fent) alkalmazhatók. Bármilyen, erős, konstitutív promoter, például a CaMV 35S-promoter alkalmazható a teljes növényi biomassza növelésére.
Ha megfelelő polipeptidexpresszió kívánatos, a kódolószakasz 3’-végén poliadenilációs szakasznak is kell lenni. A poliadenilációs szakasz származhat a természetes génből, más növényi gének széles köréből vagy T-DNS-ből.
A találmány szerinti génekből származó szekvenciákat (például promoterek vagy kódolószakaszok) tartalmazó vektor jellemzően markergént is hordoz, amely a növényi sejtnek szelektálható fenotípust biztosít. A marker kódolhat például biocidrezisztenciát, előnyösen antibiotikumrezisztenciát, például kanamicinre, G418-ra, bleomicinre, higromicinre való rezisztenciát, vagy gyomirtószer-rezisztenciát, például kloroszulfuronra vagy Bastára való rezisztenciát.
A találmány tárgyát képezik az ANT-génből (3. azonosító számú szekvencia) származó promoterszekvenciák, amelyek az ANT kódolószekvencia vagy heterológ szekvenciák expresszióját irányítják a kívánt szövetekben. Az ANT a növényben a merisztémasejtekben
HU 225 428 Β1 expresszálódik. A találmány szerinti ANT-promoterszekvenciák tehát merisztémasejtekben történő expresszió megcélzására alkalmasak oldalgyökerekben, levélprimordiában, fejlődő levelekben, virágprimordiában, virágzati szerv primordiában, fejlődő virágzati szervekben, magkezdemény-primordiában, fejlődő magkezdeményben, fejlődő embrióban és szállítórendszerekben. A gének, amelyeknek expressziója ezekben a sejtekben az éretlen szervekben megcélozható, például betegségrezisztencia-gének, például Arabidopsis NPR1-gén [Cao és munkatársai, Cell 88, 57 (1997)] és a fonalféregrezisztencia-lokusz Gro1 és paradicsom Phytophthora infestans R7 rezisztencialokusza [Leister és munkatársai, Natúré Genetics 14, 421 (1996)] patogénekkel és rovarokkal szembeni rezisztencia fokozása érdekében a fiatal, szenzitív szervekben.
Mivel az ANT-promoter fejlődő embriókban késői állapotokban expresszálódik, néhány, raktározóolajok, fehérjék vagy keményítők bioszintézisének szabályozóit vagy kulcsenzimeit kódoló gén, például a BiP [Hatano és munkatársai, Plánt and Cell Physiology 38, 344 (1997)] expresszálható az ANT-promoter ellenőrzése alatt.
Transzgenikus növények előállítása
A találmány szerinti DNS-konstrukciók a kívánt növényi gazda genomjába sokféle, hagyományos technológiával vihetők be. A DNS-konstrukció közvetlenül bevihető a növényi sejt genomi DNS-ébe például elektroporációval és növényi sejtből készült protoplasztok mikroinjektálásával, vagy a DNS-konstrukciók közvetlenül a növényi szövetbe vihetők ballisztikus eljárásokkal, például DNS-részecskebombázással.
A mikroinjektálásos technológiák jól ismertek a technika állása szerint, és részletesen ismertetettek a tudományos és szabadalmi iratokban. DNS-konstrukciók polietilénglikolos kicsapással történő bevitelét Paszkowski és munkatársai ismertetik [Paszkowski és munkatársai, Embo J. 3, 2717-2722 (1984)]. Az elektroporációs technológiákat Fromm és munkatársai ismertetik [Fromm és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 5824 (1985)]. Ballisztikus transzformációs technológiákat Klein és munkatársai ismertetnek [Klein és munkatársai, Natúré 327, 70-73 (1987)].
Egy másik lehetőségként a DNS-konstrukciók alkalmas T-DNS szegélyező szakaszokkal egyesíthetők, és a hagyományos Agrobacterium tumefaciens gazdavektorba vihetők. Az Agrobacterium tumefaciens gazda virulenciaműködései irányítják a konstrukció és a szomszédos marker beépülését a növényi sejt DNS-ébe, ha a sejtet a baktériummal fertőzzük. Az Agrobacterium tumefaciens közvetítette transzformációs technológiákat, beleértve a lefegyverzést és bináris vektorok alkalmazását, a tudományos irodalomban részletesen ismertetik [lásd például Horsch és munkatársai, Science 233, 496-498 (1984); Fraley és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 4803 (1983) és Gene Transferto Plants, szerk.: Potrykus, kiad.: Springer-Verlag, Berlin (1995)].
Az előzőekben ismertetett transzformációs technológiák bármelyikével nyert, transzformált növényi sejtek tenyészthetők, és olyan teljes növénnyé regeneráltathatók, amelyek transzformált genotípussal, és így a kívánt fenotípussal bírnak, például nagyobb magtömeggel. Ezek a regenerációs technológiák bizonyos fitohormonoknak szövettenyésztési növekedési tápközegben történő manipulálásán alapulnak, jellemzően biocid és/vagy herbicid markeren, amelyet a kívánt nukleotidszekvenciákkal együtt juttatunk be. Tenyésztett protoplasztokból növény regenerálását Evans és munkatársai ismertetik [Evans és munkatársai, Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plánt Cell Culture, 124-176 kiad.: MacMillilan Publishing Company, New York (1983) és Binding, Regeneration of Plants, Plánt Protoplasts, 21-73 kiad.: CRC Press, Boca Raton (1985)]. Regeneráltatni lehet növényi kalluszból, explantátumokból, szervekből vagy ezek részeiből. Ilyen regenerációs technológiákat ismertetnek általánosságban Klee és munkatársai [Klee és munkatársai, Ann. Rév. of Plánt Phys. 38, 467-486 (1987)].
A találmány szerinti nukleinsavak kívánt jellemvonások kialakítására alkalmazhatók lényegében bármilyen növényen. A találmány szerinti megoldás tehát növények széles körén alkalmazható, például Anacardium, Arachis, Asparagus, Atropa, Avena, Brassica, Chlamydomonas, Chlorella, Citrus, Citxullus, Capsicum, Carthamus, Cocos, Coffea, Cucumis, Cucurbita, Cyrtomium, Daucus, Elaeis, Fragaria, Glycine, Gossypium, Helianthus, Heterocallis, Hordeum, Hyoscyamus, Lactuca, Laminaria, Linum, Lolium, Lupinus, Lycopersicon, Macrocystis, Malus, Manihot, Majorana, Medicago, Nereocystis, Nicotiana, Oiea, Oryza, Osmunda, Panieum, Pannesetum, Persea, Phaseolus, Pistachia, Pisum, Pyrus, Polypodium, Prunus, Pteridium, Raphanus, Ricinus, Secale, Senecio, Sinapis, Solanum, Sorghum, Theobromus, Trigonella, Triticum, Vicia, Vitis, Vigna és Zea nemzetségbe tartozó fajokon.
Szakember számára nyilvánvaló, hogy miután az expressziós kazetta stabilan beépült a transzgenikus növényekbe és működőképesnek bizonyult, szexuális keresztezéssel más növényekbe is bevihető. A sokféle, hagyományos nemesítési technológia bármelyike alkalmazható a keresztezendő fajoktól függően.
Szakember számára ismert módszerek alkalmazhatók a találmány szerinti növények szűrővizsgálatára a transzgenikus növényekben az ANT-mRNS vagy -fehérje növekedésének vagy csökkenésének kimutatására. Az mRNS-ek vagy fehérjék kimutatására és mennyiségi mérésére szolgáló eszközök a technika állása szerint jól ismertek. A találmány szerinti növények a kívánt fenotípus vizsgálatával is azonosíthatók. Szervek vagy növények nagyobb biomasszája például jól ismert technológiákkal mérhető. Hím- és nősterilitás életképes pollen és/vagy a magképzés képességének vizsgálatával azonosítható.
A következő példák csak a szemléltetést szolgálják, de nem korlátozzák a találmányt.
1. példa
Ebben a példában azt mutatjuk be, hogy a fokozott ANT-expresszió növeli a sejtek számát és a gyökerek,
HU 225 428 Β1 levelek, virágzati szervek, magkezdemények és magok méretét és/vagy tömegét Arabidopsisban.
Szintetikus oligonukleotid-láncindítók alkalmazásával polimeráz-láncreakcióval ANT-cDNS-t készítettünk egy öamHI-hellyel éppen az ANT-t kódoló nukleotidszekvencia iniciációs kodonja előtt. Ezt az ANT-nukleinsavat (az 1. azonosító számú szekvencia 268. helyzetű citozinjától a 2148. helyzetű timinjéig, azaz 1881 nukleotid) ligáltuk a pMON530-plazmidvektor [Rogers és munkatársai, Meth. Enzymol. 153, 253 (1987)] Sg/ll-helyére a konstitutív 35S-promoter ellenőrzése alá, és kiválasztottuk azt a rekombináns plazmidDNS-t, amelyben az ANT-cDNS a CaMV 35S-promoterhez képest szensz irányban épült be (35S::ANT). Agrobacterium sejteket transzformáltunk a rekombináns plazmid-DNS-sel, és Agrobacterium közvetítette növényi transzformációra alkalmaztuk Arabidopsis növények vákuuminfiltrációjára (Col-O-ökotípus). A transzformáit növényekről Trmagokat gyűjtöttünk körülbelül három héttel a vákuuminfiltráció után, és kanamicintartalmú MS-lemezekre telepítettük a transzgenikus T-|-csíranövények szűrővizsgálata érdekében.
A T-j-magok között voltak túl nagy méretű magok, amelyek könnyen megkülönböztethetők voltak, mivel adott méretű hálón nem mentek keresztül. Ezeknek a magoknak a többsége kanamicinrezisztens, amely a 35S::ANT-transzgént hordozza. Ez a fenotípus nem volt megfigyelhető a csak a vektort tartalmazó kontroliokban.
Több Tj-csíranövény nagyobb volt a csak a vektort hordozó, kontroll, transzgenikus csíranövénynél. A fejlődésük során a Tj-növények erősen elágazó gyökérrendszert fejlesztettek, amelynek tömege nagyobb, mint a csak a vektort hordozó kontrolloké. Ezenkívül a növényeknek nagyobbak a levelei, virágzati szervei és magkezdeményei a csak a vektort hordozó kontrolokkal összehasonlítva. A Trvonalak átlagos virág- és levélbiomasszája például körülbelül háromszorosa (virágbiomassza) és 2,5-szerese (levélbiomassza) a csak a vektort hordozó kontroliokénak. Pásztázó elektronmikroszkóppal (SEM, „scanning electron microscopy”) és DIC-mikroszkóppal ki lehetett mutatni, hogy a Tj-növények megnagyobbodott szervvel jellemezhető fenotípusa a szervekben a megnövekedett sejtszámnak tulajdonítható. Ezenkívül a T-, növények sterilek. Előzetes vizsgálatok azt mutatják, hogy a portokok nem bocsátanak ki pollent (amelyek morfológiailag normálisak), és a magkezdemények szokatlanul nagyok, nagyobb számú nucelluszsejttel, amelyek elnyomják és/vagy a helyéből kimozdítják a nőivarú gametofitát.
Mivel a sterilitás megnehezíti a homozigóta, transzgenikus vonalak előállítását és szaporítását, ezért kémiai indukciós rendszert alkalmaztunk, amelyet Aoyama és Chua, valamint McNellis és munkatársai írtak le ANT-transzkripció ektópiás szabályozására [Aoyama és Chua, Plánt J. 11, 605-612 (1997); McNellis és munkatársai, Plánt J. 14, 247-257 (1998)]. Ez a rendszer egy kiméra transzkripciós faktorgént (35S::GVG) alkalmaz, amely a 35S-promoterből, élesztő GAL4 transzkripciós faktorának DNS-kötő doménjából, egy távolra ható módon aktiváló doménból, és glükokortikoid receptor (GR) receptordoménjából áll. Az ANT-gént a GVG transzkripciós faktor kötőhelyét tartalmazó promotertől 3'-irányban építjük be (UAS::ANT). A 35S::GVG/UAS::ANT konstrukciót vad típusú Arabidopsisba vittük, és termékeny transzgenikus vonalakat nyertünk alapvetően az előzőekben ismertetettek szerint.
A transzgenikus T2-növényeket MS-agarlemezeken csíráztattuk, és akár kémiai indukálószert, dexamethasone-t (DEX) tartalmazó, akár anélküli lemezekre vittük át. A dexamethasone egy szintetikus glükokortikoid hormon, amely köti és aktiválja a GVG transzkripciós faktort. Több transzgenikus vonalat nyertünk, amelyeken nagyobb levéllel jellemezhető fenotípus volt megfigyelhető DEX-szel történő kezelést követően. A szervméretben és/vagy szervtömegben történt növekedés a sejtszám növekedésének köszönhető. A DEX nem volt hatással a csak a 35S::GVG/UAS-vektort tartalmazó, kontroll, transzgenikus növényekre. Összefoglalva, ezek az eredmények azt mutatják, hogy az ektópiás ANT-expresszió növeli a szerv méretét és/vagy tömegét a sejtszám növelésével.
2. példa
Ebben a példában azt mutatjuk be, hogy lényegében ugyanazok a fenotipikus változások figyelhetők meg dohánynövényen, mint Arabidopsisban. Az ANT-cDNS-t a konstitutív 35S-promoter ellenőrzése alatt expresszáló transzgenikus dohánynövények előállítása érdekében az előzőekben ismertetett, rekombináns plazmid-DNS-t alkalmaztuk dohánynövénykallusz Agrobacterium közvetítette transzformációjához. A dohánynövénykalluszokat kalluszindukáló lemezekre helyezett, sterilizált dohánylevelekből (SR1-változat) fejlesztettük, majd az előzőekben ismertetett, rekombináns DNS-t hordozó Agrobacterium sejtekkel tenyésztettük együtt három napon keresztül. A baktériumsejtek kimosása után a levélkalluszokat hajtásindukáló, kanamicint és carbenicillint tartalmazó agarlemezre helyeztük transzformált hajtások kialakítása érdekében. Ezeket az R0-hajtásokat gyökereztető agariemezekre vittük át, majd a gyökerek kifejlődése után talajba ültettük.
Az Rg-növények, amelyekben az ANT-gén konstitutívan expresszálódott a CaMV 35S-promoter ellenőrzése alatt, szélesebb leveleket hoztak (körülbelül 1,5-szerese a csak a vektort tartalmazó, kontroll, transzgenikus növényekének), viszonylag nagyobb virágokat fejlesztettek (körülbelül 1,7-szer nagyobb tömegű, mint a csak a vektort tartalmazó, kontroll, transzgenikus növényeké), és sterilitás ugyanúgy megfigyelhető volt, mint ArabidopsisnáY A sterilitást elsősorban az okozza, hogy a portokok nem képesek felnyílni, mint ez az Arabidopsis transzgenikus portokoknál is megfigyelhető volt. Néhány Rg-növény működőképes pollenszemet alakított ki a zárt portokban, és a portokból kivágott pollenszemekkel végzett, kézzel történő önbeporzás esetén magokat hozott (R-i-magok). Ezeknek az Rrmagoknak a tömege körülbelül 1,5-szerese volt a csak a vektort tartalmazó kontrollnövények magjának.
HU 225 428 Β1
3. példa
Ebben a példában növényi szerv méretének és/vagy tömegének csökkenését és a virágzásban történt változást mutatjuk be endogén génaktivitásnak az ANT-transzgén segítségével történő koszuppresszálással Arabidopsisban és dohánynövényben.
Az előzőekben ismertetett Arabidopsis T·,-vonalak között olyan vonalak is voltak, amelyeknél csökkent szervméret és/vagy szervtömeg tapasztalható, és a szervekben csökkent a sejtszám. Ezek a növények teljesen vagy részlegesen nősterilek, mint a működésüket elvesztett anf-mutánsok. Ezekben a vonalakban az ANT-mRNS expressziója erősen csökkent, amely azt mutatja, hogy az endogén ANT-gén, valamint az ANT-cDNS koszuppressziója történt ezekben a vonalakban. A részlegesen steril Trvonalakból transzgenikus T2-növényeket nyertünk, amelyek ugyanarra a koszuppresszált fenotípusra szegregáltak, mint a T1 szülői növényekben. A szerv méretének és/vagy tömegének csökkenése a koszuppresszált R0-dohánynövényekben is megfigyelhető volt.
Több koszuppresszált vonal korábban virágzott. Ezeknek a vonalaknak a növényei csökkent számban hoztak levélrozettát, és kevesebb nap telt el a felmagzásig. Mivel a működést vesztett anf-mutánsoknál korai virágzási fenotípus nem volt megfigyelhető, az ANT-transzgénnel történő koszuppresszió lehet, hogy más, ANT-vel rokon, ismeretlen génekre is hat, amelyek önmagukban vagy az ANT-vel együtt befolyásolják a virágzás idejét. Hasonló eredmények a koszuppresszált, transzgenikus dohánynövényekben is megfigyelhetők voltak.
4. példa
Ebben a példában azt mutatjuk be, hogy az ANT működésének elvesztése a sejtek számának csökkenésével okozza az érett szerv méretének csökkenését.
Mivel az ANT-mRNS a levélben halmozódott fel [Elliott, R. C. és munkatársai, Plánt Cell 8, 155-168 (1996)], vizsgáltuk a működést vesztett anf-mutáció hatását a vegetatív hajtásfejlődésre. A levélprimordia kezdeményezésének időzítésében vagy a levélprimordia számában nem volt különbség az anf-1 és a kontroll, vad típusú növények között (nem mutatjuk), azonban az érett an/-1-levelek szélessége és hosszúsága csökkent a megfelelő, vad típusú levelekkel összehasonlítva. Mivel az anf-mutánsok virágzati szerveinek mérete csökkent [Klucher, K. M. és munkatársai, Plánt Cell 8, 137-153 (1996); Elliott, R. C. és munkatársai, Plánt Cell 8, 155-168 (1996)], ezek a megfigyelések azt mutatják, hogy az ANT működésének elvesztése csökkenti a szervméretet végig a hajtásfejlődés folyamán.
A szervméret változása a sejtek méretének vagy számának vagy mindkettőnek megváltozásából eredhet. Annak vizsgálatára, hogy az anf-1-szervek miért kisebbek, vizsgáltuk a sejtek méretét és számát az érett anf-1-szervekben, és összehasonlítottuk a vad típusú kontrollokkal. Először a szirom epidermiszének disztális (távolabb eső) részét vizsgáltuk, mivel itt a sejtek diploidok és egyforma méretűek és alakúak. Azt tapasztaltuk, hogy az ant-1 -szerveknél kevesebb az egységnyi területre és szervre jutó sejt, mint a vad típusnál, azonban az anf-f-sejtek sokkal nagyobbak a normálisnál. Alapvetően ugyanez a fenotípus figyelhető meg valamennyi ant-1 virágzati szerv és levél epidermiszében és a szubdermális sejtrétegében. Az ant-1szervek méretének szisztémás csökkenése tehát a sejtek számának csökkenésével kapcsolatos, és nem a sejtek méretének csökkenésével.
Mivel az anf-mutánsokban csökken a virágzati szervek száma, felvetették, hogy az ANT valószínűleg részt vesz a szerv primordiamintázatában, valamint a szervnövekedésben. Ennek a lehetőségnek a vizsgálatára megfigyeltük a csészelevél-primordia mintázatát fejlődő vad típusú és ant-1 virágzati rügyekben SEMtechnológiával. A 4-es virágzati állapot végére [Smyth,
D. R. és munkatársai, Plánt Cell 2, 755-767 (1990)] mind a négy csészelevél-primordia kialakult a fejlődő, vad típusú virágzati rügyek szélén. Hasonló állapotban az ant-1 virágzati rügyekben a kialakult szervprimordia normálisan rendeződött az ant-1 virágzati rügyekben, de a virágzati szerv száma csökkent (nem mutatjuk). Az ANT-nek tehát kis szerepe van a virágzati szervprimordia helyzetének szabályozásában fejlődő virágzati rügyekben.
5. példa
Ebben a példában ANT-ortológ izolálását mutatjuk be Brassica napusból (Canola).
A Brassica cDNS nukleinsavszekvenciáját a 4. azonosító számú szekvenciában és a kódolt fehérjéét az 5. azonosító számú szekvenciában mutatjuk be.
Ennek a nukleinsavnak az elkészítése érdekében teljes RNS-t izoláltunk Brassica napus (Canola) csíranövények fiatal hajtásvégeiből TRIZOL alkalmazásával Colasanti és munkatársai szerint [Colasanti és munkatársai, Cell 93, 593-603 (1998)]. A cDNS-t reverz transzkripcióval állítottuk elő, és PCR-rel amplifikáltuk jó másolási hűségű, hőstabil PFU DNS-polimerázzal és oligonukleotid-láncindítókkal. A láncindítók rendre tartalmazták az iniciációs kodont, illetve és Arabidopsis ANT-nukleotidszekvencia stopkodonjától 3’-irányban lévő antiparalel nukleotidszekvenciát. A PCR-terméket
E. coli vektorba szubklónoztuk, és PCR-rel vizsgáltuk olyan különböző oligonukleotid-láncindítókkal, amelyeknek belső ANT-nukleotidszekvenciájuk van. A kiválasztott, rekombináns plazmidklónokba beépült, Brasslca-eredetű DNS nukleotidszekvenciáját meghatároztuk, és megerősítésképpen összehasonlítottuk Arabidopsis ANT-nukleotidszekvenciával. A Brassica ANT-gén (BÁNT) nukleotidszinten 85,5%-ban azonos az Arabidopsis ANT-génnel a kódolószakaszukban, és a BANT-polipeptidszekvencia 83,7%-ban azonos az ANT-polipeptidszekvenciával.
6. példa
Ebben a példában az ANT 5’-irányú nukleotidszekvencia (promoter) alkalmazását mutatjuk be heterológ gének expresszálására merisztémasejtekben.
HU 225 428 Β1
A helyesen orientált ANT-promotert tartalmazó H/ndlII-Bg/ll fragmenst a pBI101-plazmidvektor DNS-ébe (CLONTECH) építettük a H/'ndlll- és BamHl-helyekre, amelyek éppen a GUS-gén (béta-glükuronidáz-gén) iniciációs kodonja előtt helyezkednek el. Ugyanezt a fragmenst építettük be a pBIN m-gfp5-ER-plazmidba [Haseloff és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 2122-2127 (1997)] a Hindlll-öamHI-helyekre, amelyek közvetlenül a GFP-gén (zöld fluoreszcens fehérje, „green fluorescence protein”) iniciációs kodonja előtt helyezkednek el. Arabidopsis vad típusú növényeket transzformáltunk ezekkel a rekombináns plazmidokkal Agrobacterium közvetítette vákuuminfiltrációs eljárással. A Trvonalak és az ezeket követő generációk a várakozásunknak megfelelően GUS-aktivitást vagy GFP-expressziót mutattak a merisztémasejtekben a növény fejlődése során, bizonyítva, hogy az ANT-promoter alkalmas heterológ gén expresszálására merisztémasejtekben.
7. példa
Ebben a példában ciklin-D3 (CYCD3) génexpressziójának aktiválását mutatjuk be Arabidopsis növényekben az ANT-génexpresszió növelésével.
A sejtszaporodást a sejtciklust szabályozó gének, például a ciklinek és a cdk-k aktivitása közvetlenül szabályozza [Nasmyth, Trends Génét. 12, 405-412 (1996); Morgan, Natúré 374, 131-134 (1995) és Burssen és munkatársai, Plánt Physiol. Biochem. 36, 9-19 (1998)]. Mivel a T-, transzgenikus vonalakból, amelyekben az ANT-génexpressziót a CaMV 35S-promoter ellenőrzi, származó szerveknél nagyobb a sejtszám, és így fokozódott a sejtszaporodási aktivitás, mértük a ciklingének expresszióját T·)-növények fiatal és érett szerveiben kvantitatív RT-PCR-rel. Fiatal, fejlődő szervekben, ahol sejtszaporodást mind a 35S::ANT, mind a kontrollnövényekben megfigyeltünk, a ciklingének expressziós szintjének különbsége nem volt szignifikáns. Érett szervekben azonban a CYCD3, amely Arabidopsis sejtciklusában a G1/S átmenet kulcsfontosságú szabályozóját kódolja [Soni és munkatársai, Plánt Cell 7, 85-103 (1995); Fuerst és munkatársai, Plánt Physiol. 112, 1023-1033 (1996)], mRNS-ének felhalmozódását a kontroliban már nem lehetett kimutatni, míg a 35S::ANT-vonalakban még ki lehetett mutatni. Ezek az eredmények összhangban vannak azokkal a megfigyelésekkel, miszerint a szervfejlődés korai szakaszaiban a 35S::ANT-vonalak és a kontrollvonalak között növekedési különbség nem tapasztalható, azonban amikor a kontrollnövények szervei érettek voltak, és a sejtek már nem szaporodtak, a 35S::ANT-növények ugyanolyan korú szerveiben a sejtek tovább szaporodtak, és ennek eredményeképpen nagyobb szerveket fejlesztettek.
Ez az eredmény azt mutatja, hogy fokozott, konstitutív ANT-aktivitás közvetlenül és/vagy közvetve ellenőrzi a sejtciklus működéseit a sejtciklus szabályozógénje(i) expressziójának szabályozásával és fejlődő szervekben a folyamatosan aktivált sejtszaporodással. Ez azt is mutatja, hogy bizonyos, a sejtciklus működéseiben szerepet játszó gének az ANT transzkripciós faktorgén célpontjai (Klucher és munkatársai, és Elliott és munkatársai), összefoglalva, ezek az eredmények azt mutatják, hogy növényekben az ANT-célgének expressziójának módosítása szabályozhatja a szervméretet és/vagy szervtömeget és a termékenységet.
8. példa
Ebben a példában azt mutatjuk be, hogy BÁNT, egy Brassica napusbó\ (Canola) származó ANT-ortológ növeli Arabidopsisban a szervtömeget és/vagy szervméretet.
A Brassica ANT (BÁNT) cDNS-t, amelynek nukleinsavszekvenciája a 4. azonosító számú szekvencia szerinti szekvencia, a pMON530-plazmidvektorba [Rogers és munkatársai, Method. Enzymol. 153, 253 (1987)] építettük a konstitutív 35S-promoter ellenőrzése alá szensz orientációban. A rekombináns plazmid-DNS-t alkalmaztuk Agrobacterium közvetítette transzformációhoz, és a 35S::BANT-plazmid-DNS-sel transzformáit Agrobacterium sejteket alkalmaztuk Agrobacterium közvetítette növényi transzformációhoz vákuuminfiltrációval Arabidopsis növényekkel (Col-O-ökotípus). A vákuuminfiltráció után körülbelül három héttel T1-magokat gyűjtöttünk, és kanamicintartalmú MS-agarlemezeken neveltük a transzgenikus Trcsíranövények vizsgálata érdekében.
A 35S::BANT-transzgént ektópiásan expresszáló Trnövények többszörös szervi hiperpláziát mutattak, mint ez az előzőekben ismertetett, 35S::ANT transzgenikus növényeknél (1. példa) tapasztalható volt, vagyis a levelek és virágzati szervek többnyire háromszor nagyobbak a kontrollszerveknél. Ezek a transzgenikus növények alapvetően hímsterilek voltak, és gyakran nősterilek is. Néhány növény azonban vad típusú pollenszemekkel kézzel történő megtermékenyítés esetén magokat hozott, és a T2-magok nagyobb tömegűek és/vagy méretűek voltak. A kanamicinrezisztens T2-csíranövények növényekké fejlődve ugyanazt a fenotípust mutatták, mint a Trnövények, amely azt jelzi, hogy az ANT ektópiás expressziójának hatása örökölhető.
9. példa
Ebben a példában azt mutatjuk be, hogy fokozott ANT-expresszió aszexuális reprodukciót és járulékos hajtások, szervek és embriók képződését váltja ki Arabidopsis növényekben.
Teljesen érett szárakat vagy szerveket, például leveleket vágtunk le az ANT-t ektópiásan expresszáló ^-növényekről, és vízbe vagy fitohormonok nélküli MS-agarlemezekre helyeztük. Körülbelül kéthetes inkubációt követően járulékos gyökér képződését lehetett megfigyelni a szár vagy levél vágott felületén. Adott esetben járulékos gyökerek képződtek a levél felületéről is. Járulékos gyökérképződés soha nem volt megfigyelhető a hasonló módon kezelt kontrollszárakon vagy -leveleken.
ANT-t ektópiásan expresszáló, teljesen érett ^-növényekből kivágott virágzati (virágzó) szárakat fitohor16
HU 225 428 Β1 monok nélküli MS-agarlemezekre helyeztünk 10 napra. Járulékos gyökérképződést figyeltünk meg a szárak vágott felületén, míg az öregedő virágzati rügyeken járulékos hajtásképződés volt tapasztalható. Ezek a hajtások időnként gyökereket is képeztek, ily módon teljes növénnyé fejlődtek, amelyek ugyanazt a transzgenikus jellemzőt (nagyobb szervméret és/vagy tömeg) mutatták, mint az eredeti növény. A kontroll virágzati szárak ugyanilyen körülmények között nem mutattak semmilyen aszexuális reprodukciós aktivitást.
Hasonló aszexuális reprodukciós aktivitást figyeltünk meg fejlődő 35S::ANT transzgenikus magokból kivágott embriókban. A késői torpedó állapot és a közel érett embrió közötti állapotban lévő embriókat kivágtuk a fejlődő, zöld magokból, és fitohormonoktól mentes, 50 pg/ml kanamicint tartalmazó MS-agarlemezeken növesztettük. Ezek az embriók csíranövényekké fejlődtek, azonban néhány sejt másodlagos embriókat vagy járulékos hajtásokat képezett, amelyek szintén teljes növénnyé fejlődtek. A kontrollembriók aszexuálisan nem szaporodtak hasonló körülmények között.
összefoglalás
Magasabb rendű növények belső szerveinek mérete genetikailag meghatározott, azonban környezeti tényezőkkel nagymértékben befolyásolható. A szervek mérete a sejtek számát és méretét tükrözi. A szerv sejtjeinek teljes mennyiségét az osztódásra képes, nem differenciált merisztémasejtek szaporodása határozza meg. A hajtásfejlődés folyamán az oldalsó szervek primordiaként képződnek a csúcsi és az oldalsó merisztémákból. Míg a szervprimordiában lévő legtöbb sejt merisztematikus és szaporodik, a szerv fejlődése folyamán a sejtek elvesztik a merisztémás képességüket, és kilépnek a sejtciklusból. A sejtek merisztémás képességének a fenntartása tehát kulcsfontosságú mechanizmus, amely a szervek növekedését és a sejtszaporodást biztosítja a teljes sejtszám, és így a növényi szerv méretének meghatározásával. A merisztémás képesség molekuláris természete és a merisztémás képességet ellenőrző, fejlődési szabályozók azonban még nem teljesen ismertek.
Az Arabidopsis ANT-gén a csak növényi rendszerekben található AP2-doméncsalád transzkripciós faktorát kódolja. Az ANT-mRNS az összes oldalsó hajtásszerv-primordiában halmozódik fel, és a szervek fejlődésével csökken. Ez azt mutatja, hogy az ANT a szervnövekedésben valószínűleg általános szerepet játszik. A levélprimordiában és a nem differenciált, növekvő levelekben történő ANT-expresszióval összhangban az tapasztalható, hogy a működést vesztett anf-7-mutáns valamennyi, érett levelének mérete csökkent a megfelelő vad típusú levelekkel összehasonlítva. Mivel az ant-1 virágzati szervek szintén kisebbek voltak a normálisnál, az ANT nagyon valószínűen a szerv növekedéséhez szükséges a posztembrionális hajtásfejlődés folyamán. A szervméret a sejtek méretével, számával vagy mindkettővel befolyásolható. Azt tapasztaltuk, hogy az anf-/-szerveknél egységnyi területen és szervenként kevesebb sejt található, mint a vad típusnál, azonban az anf-í-sejtek sokkal nagyobbak a normálnál. Ez azt mutatja, hogy az ant-1 -szervek méretének szisztémás csökkenése a sejtszám csökkenésének, és nem a sejtek méretének csökkenésének köszönhető. Az ANT-működés tehát a növényi szervek valódi sejtszámának eléréséhez szükséges.
A leírásban ismertetett kísérletek bizonyítják, hogy ANT ektópiás expressziója elegendő szervméret és szervtömeg növelésére a szervnövekedés fokozásával, amelyet a szervmorfogenezis szabályoz Arabidopsis növényekben. A teljesen érett 35S::ANT-szirmokban a differenciált sejteknek ugyanolyan a mérete, mint a vad típusú szirmokban. Hasonló módon az epidermiszben a sejtek méretében látható különbség nem volt kimutatható a kontroll- és 35S::ANT-szervek között a szirmokon kívül. Ezek szerint a sejtek számának növekedése, és nem a sejtek méretének növekedése felelős elsődlegesen a nagyobb 35S::ANT-szervekért. A szervméretnél hasonló működésvesztési és működésnyerési hatások figyelhetők meg, ha a növényeket rövid nappalos, folyamatos megvilágítás mellett neveljük minimál- vagy kiegészített táptalajokon. Az ANT-működés tehát úgy tűnik, hogy független a külső, növekedési szignálok észlelésétől. A végső szervméretre gyakorolt szembetűnő hatásokkal szemben az ektópiás ANT-expresszió észlelhetően nem változtatja meg a csúcsi és oldalsó merisztémák méretét vagy szerkezetét, sem pedig a szervprimordia méretét vagy számát. Az ANT-működés elvesztése azonban csökkenti a virágzati szervek számát, a kialakult szervprimordia az ant-7-virágrügyekben normálisan rendeződik, és normális méretű. Az ANT tehát nem határozza meg a szervprimordia méretét, és nagyon valószínűen nem befolyásolja a szervprimordia számát a csúcsi és oldalsó merisztémák szerveződésének ellenőrzésével.
Hogyan szabályozza az ANT a sejtszámot az organogenezis folyamán? Általában a növényi szervnövekedés sem sejtvándorláshoz, sem sejthalálhoz nem kötődik, így a szerv sejtszáma alapvetően a merisztémasejtek szaporodásától függ a fejlődő szervekben. Mivel az ANT a fejlődő szervek merisztémasejtjeiben expresszálódik, befolyásolhatja a sejtszaporodást az organogenezis során, és így meghatározhatja az érett szervek teljes sejtszámát. Ennek az elképzelésnek az igazolása érdekében vizsgáltuk a sejtszaporodás mértékét a kontroll- és az ant-/-szervekben mind a fejlődő, mind a teljesen érett szirmok sejtszámának és sejtméretének mérésével. A 9-es, középső virágzati állapot során a vad típusú szirmok fonákoldali epidermális sejtjei nem differenciálódtak, és gyakran osztódtak, míg az ant-/-szirmoknál a normálnál kevesebb differenciálatlan sejt volt egységnyi területen és szervenként. A sejtszámban történt csökkenés még kifejezettebb a teljesen differenciált anf-/-szirmokban 15-ös állapotban. Az anf-7-szirmokban a normálnál kevesebb sejtosztódás történik az organogenezis során, előnyösen az érést megelőző, késői fejlődési állapotokban. A sejtnövekedés az ant-/-szirmokban sejtosztódás nél17
HU 225 428 Β1 kül történt, amely különlegesen nagy sejteket eredményezett.
Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az ANT a sejtszaporodás normális mértékéhez szükséges, de nem elsődlegesen a sejtnövekedéshez. Annak vizsgálatára, hogy az ANT hogyan szabályozza a sejtszaporodás mértékét, vizsgáltuk, hogy ANT ektópiás expressziója hogyan hat a szervméretre, sejtméretre és a sejtek számára a sziromfejlődés folyamán. Az anf-í-szirmok sejtszámára gyakorolt korai hatással szemben a 35S::ANT-szirmokban a sejtszám és sejtméret a 9-es állapotban normális volt. Ez azt mutatja, hogy ANT ektópiás expressziója nem növeli a sejtnövekedést vagy a sejtszaporodás gyakoriságát fejlődő szirmokban a korai állapotokban, és azt jelzi, hogy fokozott ANT-aktivitás nem változtatja meg a sejtciklus belső eredetű (intrinsic) idejét. A 15-ös állapotra azonban a teljesen érett 35S::ANT-szirmok teljes sejtszáma körülbelül 2,5-szerese a kontroliénak, amely azt mutatja, hogy a 35S::ANT-szirmokban további sejtosztódások történnek a szerv érése előtt, még csak a 9-es állapot után. A további sejtosztódásokat a sejtnövekedés koordinálja, mivel a sejtek mérete az érett 35S::ANTszirmokban normális. Valószínű tehát, hogy ANT ektópiás expressziója a sziromsejteket hosszabb ideig teszi szaporodásra képessé, mint a normál, a belső eredetű sejtciklusidő megváltoztatása nélkül. Hasonló eredményeket kaptunk 35S::ANT- és kontrollcsíranövények levélrozettái növekedésének összehasonlításával. A csírázás után 16 nappal (16 DAG, „days after germination”) mind a 35S::ANT, mind a kontrollcsíranövényeknek ugyanolyan számú levélrozettája volt, és a 35S::ANT-csíranövények összes levele ugyanolyan méretű volt, mint a megfelelő kontroli-levelek. A 35S::ANT-levelek azonban tovább növekedtek még azon időszak alatt is, amikor a megfelelő kontroli-levelek növekedése már megállt, adott esetben így a normálnál nagyobb leveleket képeztek. Ez a megfigyelés alátámasztja azt a feltételezést, hogy a sejtnövekedéssel koordinált, hosszan tartó sejtszaporodás hiperpláziát okoz a 35S::ANT-növényekben. Összefoglalva ezek a megfigyelések azt mutatják, hogy az ANT a sejtszaporodás időszakát szabályozza a sejtek merisztémás jellegének fenntartásával az organogenezis folyamán. A leírásban ismertetett eredmények azt is mutatják, hogy az ANT nem befolyásolja a CycD3-expressziót azokban a szövetekben, ahol a legtöbb sejt merisztéma jellegű. Hasonló eredményeket kaptunk CycB1b(Cyc1bAt), egy mitotikus ciklingén mRNSszintjeinek összehasonlításával. Az ANT tehát fenntartja a sejtek merisztémás képességét, és ennek következtében működésben tartja a sejtciklus szabályozóinak expresszióját.
Egy másik meglepő megfigyelés, amely összekapcsolja az ANT-működést a merisztémás képesség fennmaradásával, az Arabidopsis 35S::ANT-szervekben tapasztalt neoplázia, vagyis differenciálatlan sejtek csoportjai (azaz kalluszok) fejlődtek 35S::ANT-növények sérüléseiből vagy öregedő felületeiből vagy 35S::ANT-szervek teljesen differenciált, levágott végeiből külső fitohormonkezelés nélkül. Ezek a kalluszok gyakran szervekké, például gyökérré, levéllé vagy hajtássá differenciálódtak. Ez a neoplázia 35S::ANT-szervekben következetesen megfigyelhető volt, de a hasonló módon kezelt kontrollszervekben soha nem volt tapasztalható. Jól ismert, hogy differenciált növényi szövetek kalluszt képezhetnek fitohormonkezelést követően. Differenciált sejtekben, amelyek normálisan nyugalomban vannak, ANT ektópiás expressziója megőrzi a merisztémás képességet, és csökkenti a sejteknek a fitohormonoktól való azon függőségét, hogy újra belépjenek a sejtciklusba.
A leírásban ismertetett eredmények bizonyítják, hogy az ANT a szervméret belső eredetű szabályozója, amely a szerv növekedésére és a sejtszaporodás időszakára hat az organogenezis során. Az ANT-nek a növényi szervméret szabályozásában betöltött szerepére javasolt modell szerint a fejlődési növekedési szignálok aktiválják a növekedési szabályozókat, amelyek pozitívan szabályozzák az ANT-t az organogenezis alatt. Az ANT működése révén a sejtek merisztémás képessége megmarad, ezáltal megváltoztatva a sejtciklus és a sejtnövekedés szabályozóinak expresszióját. Ennek következtében az ANT fenntartja a sejtszaporodást, amely fejlődő szervekben a sejtnövekedéssel kapcsolódik. Ektópiásan expresszált ANT tehát a sejtek merisztémás képességének abnormális megtartását eredményezi, és hiperpláziát és neopláziát okoz, míg az ANT hiánya a sejtszaporodás és a szervnövekedés idő előtti leállását eredményezi. Növényi és állati rendszerekben a növekedési szignál útvonalai és a sejtciklus működése sok közös tényezőben osztoznak. Ismerve azonban a növényi élet röghöz kötött természetét és a szilárd sejtfallal körülvett növényi sejteket, a növényi növekedés és sejtszaporodás bizonyos vonatkozásai valószínűleg az állatokétól eltérő módon szabályozottak és koordináltak. Valószínűleg nem meglepő tehát, hogy az ANT specifikus növényi szabályozó, és az ANT 5’-irányú szabályozóinak és 3’-irányú célpontjainak azonosítása felderítheti, hogy a növények mennyire egyedülálló módon szabályozzák a sejtszaporodást mintázatképzéssel a szervméret ellenőrzésének érdekében. Felvetették, hogy fenotípusok fajok közötti eltérésének genetikai alapja az ortológ szabályozógének expressziójában vagy szerkezetében történt kis változások. Az ANT és ortológjai expressziós mintázatának és szerkezetének különbségei ezáltal legalábbis részben felelősök lehetnek magasabb rendű növényekben a szervméret fajok közötti különbségéért. Végül pedig ANT ektópiás expressziója révén történő szervtömeg-növekedés új eljárást nyújthat mezőgazdaságilag fontos növények hozamának fokozására.
Az előzőekben ismertetett példák csak szemléltetik a találmányt, de nem korlátozzák az oltalmi körét. Szakember számára nyilvánvaló, hogy a találmány egyéb változatai is elkészíthetők, amelyek a szabadalmi igénypontok oltalmi körébe tartoznak. A leírásban hivatkozott valamennyi publikáció, szabadalmi irat és szabadalmi bejelentés a leírás részét képezi.
HU 225 428 Β1
SZEKVENCIALISTA
1. azonosító számú szekvencia (GenBank U40256 nyilvántartási szám)
Arabidopsis ANT-nukleotidszekvencia (cDNS: 2148 nukleotid) agatcccaac ggattcaaac agcaaatttg tgctttgctc ttctctctta 61 ctctcaaaaa ccctctccta tatcctccta aagcccccct tccttgtttc 121 caaagaaaaa acaaaagttt gagaaaaatg gtgtgttcgt tgtgtaacca 181 tttagcttac tacttcgaga gattataaga aagaaagagt gaagatacat 241 agagaagcag aaaccaaaaa aagaaaccat gaagtctttt tgtgataatg 301 tcatagcaac acgactaatt tgttagggtt ctcattgtct tcaaatatga 361 aggtagagga ggtagagaag ctatttactc atcttcaact tcttcagctg 421 ttcttctgtt ccacctcaac ttgttgttgg tgacaacact agcaactttg 481 tggatctaac ccaaatggag gaatctattc tcacatgtct gtgatgccac 541 tggttctctt tgcttaatgg aagctctcaa cagatcttct cactcgaatc 601 ttcatctcca aaggtggagg atttctttgg gacccatcac aacaacacaa 661 agccatggat cttagcttag atagtttatt ctacaacacc actcatgagc 721 tacaaacttt caagagttct ttagcttccc tcaaaccaga aaccatgagg 781 aaattacggg aatgacccta gtttgacaca tggagggtct tttaatgtag 841 ggaatttcaa cagtcactga gcttatccat gagccctggg tcacaatcta 901 tggctctcac caccaccaac aaaaccaaaa ccaaaaccac caaagccaaa 961 gatctctgaa gctcttgtgg agacaagcgt tgggtttgag acgacgacaa 1021 gaagaagaag aggggacaag aggatgttgt agttgttggt cagaaacaga 1081 aaaatctatc gatacttttg gacaacgaac ttctcaatac cgaggcgtta 1141 atggactggt agatatgaag ctcatctatg ggacaatagt ttcaagaagg 1201 tagaaaagga agacaagttt atctgggagg ttatgatatg gaggagaaag 1261 atatgatctt gctgcactca agtactgggg tccctctact cacaccaatt 1321 gaattatcag aaagagattg aagacatgaa gaacatgact agacaagaat 1381 tttgagaagg aagagcagtg gtttctctag gggtgcttcc atctatagag 1441 acatcaccag catggaaggt ggcaagcacg gattggtaga gtcgctggaa 1501 ctaccttgga acttttggaa cccaagaaga agctgcagaa gcttacgatg 1561 taagttccgt ggcacaaatg ctgtgactaa ctttgatatc acgaggtacg 1621 tatcatgtct agtaacacac tcttgtctgg agagttagcg cgaaggaaca 1681 tgtcgtcagg aatactgaag accaaaccgc tctaaatgct gttgtggaag 1741 caaagaagtc agtactcccg agagactctt gagttttccg gcgattttcg 1801 agttaatcaa aagatgttcg gatcaaatat gggcggaaat atgagtcctt 1861 ccctcatgct gagcttaaga ccgtcgctct tactttgcct cagatgccgg 1921 ttgggctgat tcttgatcaa cttcaatgac taactctggt tttcttggtt 1981 gtgttttggt ttatctccgg ttttatccgg tttgaactac aattcggttt 2041 gtataaatag tatttgctta ggagcggtat atgtttcttt tgagtagtat
2101 cagaatgaat ctctctataa catattattt taatgaatct cctttgct
2. azonosító számú szekvencia (GenBank U40256 nyilvántartási szám)
Arabidopsis ANT-peptidszekvencia (555 aminosav) [GenBank NO.U40256] Arabidopsis ANT peptide sequence (555 amino acids)
MKSFCDNDDNNHSNTTNLLGFSLSSNMMKMGGRGGREAIYSSST
SSAATSSSSVPPQLWGDNTSNFGVCYGSNPNGGIYSHMSVMPLRSDGSLCLMEALNR
SSHSNHHQDSSPKVEDFFGTHHNNTSHKEAMDLSLDSLFYNTTHEPNTTTNFQEFFSF
PQTRNHEEETRNYGNDPSLTHGGSFNVGVYGEFQQSLSLSMSPGSQSSCTTGSHHHQQ
NQNQNHQSQNHQQISEALVETSVGFETTTMAAAKKKRGQEDWWGQKQIVHRKSIDT
FGQRTSQYRGVTRHRWTGRYEAHLWDNSFKKEGHSRKGRQVYLGGYDMEEKAARAYDL
AALKYWGPSTHTNFSAENYQKEIEDMKNMTRQEYVAHLRRKSSGFSRGASTYRGVTRH
HQHGRWQARIGRVAGNKDLYLGTFGTQEEAAEAYDVAAIKFRGTNAVTNFDITRYDVD
RIMSSNTLLSGELARRNNSTWRNTEDQTALNAWEGGSNKEVSTPERLLSFPAIFA
LPQVNQKMFGSNMGGNMSPWTSNPNAELKTVALTLPQMPVFAAWADS
3. azonosító számú szekvencia
ANT-promoterszekvencia (az ANT-gén 5’-irányú szekvenciája: 4228 nukleotid)
Az aláhúzott nukleotidszekvenciát már publikálták (Klucher és munkatársai) ttataatatc tctaccgcaa atgattgggt tatagaaaga atgataataa tgaaaatggg caacttcttc gtgtttgcta tcagatctga accatcaaga gtcacaaaga ccaacacgac aagaaactag gggtatatgg gctgcatcac accaccagca tggcggctgc ttgttcatag caagacatag aaggtcacag ctgctcgagc tctctgcgga atgttgcaca gagtcacaag acaaagatct tagcagcaat atgttgatcg acaacagcat gtggttccaa cgttgcctca ggacatcaaa ttttcgctgc tagttgctaa agtttcgtcg tcatgtgaaa
HU 225 428 Β1
5' GTCGACTCTAGGCCTCACTGGCCTAATACGACTCACTATAGGGAGCTCGAGGATCCTTTAGTTAGAAAAAACTT
TCTTTG
TACGTGTGTGTGTGTGTTTTAAGTTCAATTATAACTAGTCACATGTGATATCACAATATATATATTGAAATTGG
AATTAT
TCATATTAATGAGTTAGCATTAATATATATACGCTGACATTACCAACCAAATGTTTCTGCTTTTATGGATAGTT
CTATAT
GTTGCACTTGATTATAGATACTATATAAAACTGGGTTTATTTAAAATCCGTACCCATAACAAAAGTGGACCAAA
ACGAG
A
TCCATGGTTTTGTGTTTACTTTGTTGGTTAACCAGATAATATGATTATGGAAGATTAAATCTTTACTAAATTAT
AAAATA
ATTTGGAAAAACAAACTTAAATATGTTGAGTGTCTTCAGTGCTCACTGTTCAAGAATAATCTCGTGTTATCCTA
CTGAA
CTAGAAGTTGATATACATAAACACGTGAATATTTTAACGACCGTACATAAACACATGTATCGATCAAATACAAA
TTATT
A
TGAGACTAGAATCCAAGATGAGGATGACTCTAGCAGAATATACACAGCTAAGAATTTGTACAAAGAGAGTCGAA
AAATA
GA
TTCTAATCATTTAAAAAAGATATGGATTTCAGTTACGATTGATATTACCATTACGCAGTAGTACATACACATAA T T T T T
TGTTTTTGTTTTACCGATAATAGAATGAAAATGTTGTGTTAAAAATATTGGTTTTACTAAAACTCGTTTTATGT
TAACTA
TATAATGTCTTTCCGCATGTAAATTGAAACAAAACTGTAATACAAATTATGTTAAGCCATTGCAATTAAAAAAT
CCACG
G
GTAGTAAATCCTCAGAAGATTATGTTAAGTCTACAAATTTTCTCTTTAGATTAGTAAGGTTTGAGACAAAATTA
TGTATA
CCTTGCAGGGGTATAAAGGTCACTGCATAGTCAGACTCAGCATGAAGCCAAAGAGTCGTCTCTCTGTCCTAAAG
ATATCTA
C
AGCTGCTTCGCCTGTGAATAGAGAAGAAATTGAATGATGAGAGATCCCATCTAGCGTTTCACGTTTGCGTTCTT
CGTCG
C
AACTTTGGCGGTTGTTGACTTTTTTTCTTATGTCGTTGTTTGACTAATTTCTCAGAGTGAGAGTGTAATCAAGA
AAACT
AAT AT T CGAAAAGAAAGAAAAAAAAGGCAAGAAAAC TAT T GT CGAAAAGACATAAAT T GACAC TAAAAT T GGAT
TATTA
AA
AATGGTATATATGTTTGGTGGAATTTATAATCATTACCAAAATCAAAGGAAGGAGAGAGGGACCTCTTCGTGCT
TATGA
T
TTCCCTCCTAAACAACTGCTCCCACTATCCTTTTTACTTCCAACAAAATCATTCACACGAGAAAATCTGTCTCG
TGATC
ACTTTCATGCAAAATTAAACTAAATTTTGGTATTTTTTGTCAGTTCTTGCTGTTTTAAGTCGATTATTTGTTAA
TACTA
TATGTGTGGATATACACATCCAAGCTAATCAATAATTGATCTCCTTCTGCTTATCAATAAATTACACCACATTA
GCTAAT
CAAGCTAATAAATTACACCACATTCTCTTATCAATTTTTATATGGTATAAATAAAACAACCGACTATAGGCTAC GGTATTAAGGCATTATTGCCTTCTAGTCGAAGGAATTTTTTTGTTATGATAACACTCGTGGGAAAAAAATCCAG CCTAAT
ATGCTCATTTAAAGGATAATTGATTTAAATGCTTTAATCATTAAAATAAAAGGTTTTTGCTTTTAAAGGTTACC
ACCGCT
TAATTCATCATTAGGAGAATATTAACTTTGATCGAAATTCCAAAATACTTTTTTAACACATAAGAAAATTTTCA
GCATTT
TTAAATAAAGGGTACATTTATTGGGTTCAATAAATATGTTTCCACGTAAAGTTTGGAGGTTTAACCACATGAAT
GTTTTT
TGATTTAAAAAACACATAAATTTTCTAGTAATTACACATTTTTAACCGTCCATCCAGATTGTAATAAGTGACAA
ATCTGA
HU 225 428 Β1
AAACATTTTTTTTTTTCTTGAATCTTGTTTAAATTCTCTCTGCTGCATACTTGCAGGCATTTGACCAACGACTA
TACATA
TTGAAAGCAAAATATCCACCAGGGATGATAGGGTTAGATCCCACATTCAATATCTTTTGTCTTTGTTATTTATG
AAAAAC
AAATATTTATCAGGAAAAAAACGTTTCTTCTCTAGTGGTATAAGTATAAGATAATAACAAAATTTAATACTTAG
TTAAT
G
TATTTACTATCTTCAAACTTACCATCCTTCAACATTAATATTGATCAATTTTTATTTTTTTTACTAAACTACTT
CCACTA
AAAAAATGCAAAAGAAGAGATATATATTTAAGTCAAAGTAATTAAAGATGGATGGGTGATTCTTCAGCAAAACG
GCGC
CG
TAGAGGTGTCTTATCCTACATTACAGCTGGGTTGTGGCAGACATCATAGGGCCTACGTATATTTGAGCTTTACT
GTACGT
AAAGCTTTAACATATCTAGTTAGTTCTCACTGTACAAACAAAACAAAATCCAATTCGTAACATATATACAAATA
CTACT
A
GTACTAGATTACGCTACGTATACATCGCTTTTTCGCAAATTTCTAAACTAATCTATACAACAAACTTGAATGTT
TGTTTT
GTAATTTATCTTAAACCAAAGTTTTGAATTGTGCATTGGGAGCTACACTCTAGTCCCCTTTTTCCCCAAAATAA
TCTCC
TTACATCGACCGGTTAAAGTATTTAAACCAACAAATTTTAATTTGTTGCTGAAGGTACAAACATGTCACATATA
TAGAG
A
CAGCATCGTTTATACAAATAATGTTCGATGTTATTGGAAATCAAATATAAATACGAATTAGCGACTCACTTGGT
TTAATA
GTTTGGAAGATAATGAAATAAAAAATGAATTCAAAGGATACAGAGCTATATATGTCGGGTCATTTAGAGCCGTG
ACCA
AA
AGTTTCGTCGGTAATTTCTACGGGTCGGTCATAAGAAATTTTGGACTTTTCTTCACCCTTTTATGAACTTCTGT
ATAGTTTT
TGTCGGATTATATATTTGTATTCGTATATTTTTTGTTTCTAATAATGATACGTAAATTCACGATAAGAAAGACT
TCTTTT
TATTTAATTTGATTTAAAACTTTTGTTTTTGGAAATGACTCATACACAAGGTTAAAGTTTGATGGTATCCAATT
TACAAA
AATGTTTCGAGAGTGCGTTCGAGTGTCCTACCACCATCGTACCAACTCGTATGGGTTTATTATTAGGTTTTTTT
CTTCTT
TTTCCAATGTCTTTATAATTGAACCACTCTAAATTTCTTTTTTTAAATTAGGTTAAGAATCTTGAATTTTCTGT
TGATTT
TAAACCAAGGTTTTCAATTCTTCTTAGCACAAAAAAAAAAAAAAGGTTTTCAATTATTAAAGAATCTAAATTTT
TTGAGT
TCAAGAGTTTAATGATAGCTGAAAAGTTATGAATGATTGCAAGTTTGCAACAGAATGGTCGATGTAGTACATAT
CAAAA
A
CATGCATCAAAATAAATATTCGTGCTTAGCAAGAGAAACCATTGAAATAAACAGAACAATCGTTAACCACTTAA
AAAT
CT
TAGAATAATTTTGTAGTGATAATTTTCTGTAAGAGAGAGGTATCATATCTTACAAAAAAAAACTCATTTCAGAT
AAAAT
A
ATGTTGTCCAATCGTTACCAAGTATGTTTTTGCTGTCATCAGTTGTATTGTAACTCGTCTCTTAGCCATATAGT
TCTAAG
TTTTAAATGTTTTCAAAGACTTTACAAAAATAAAATAATAATAAGGTGGAATTTGTAGGGCTAAAAGCGAAAAA
TAAA
AA
TAAAATAAAAGTAAAGAAACGTCTTTCTCAATAAGAACACAGATCCCAACGGATTCAAACAGCAAATTTGTGCT
TTGCT
C
TTCTCTCTTATTATAATATCCTCTAAAAACCCTCTCCTATATCCTCCTAAAGCCCCCCTTCCTT
CAAAGAAAAAACAAAAGTTTGAGAAAAATGGTGTGTTCGTTGTGTAACCAATGATTGGGTTTTT
HU 225 428 Β1
A
GATTATAAGAAAGAAAGAGTGAAGATACATTATAGAAAGAAGAGAAGCAGAAACCAAAAAAAGAAACC-3'
4. azonosító számú szekvencia
Brassica ΑΝΤ-nukleotidszekvencia (részleges cDNS, amely tartalmazza a kódolószakaszt: 1738 nukleotid)
5' ATGAAGTCTTTTTGTGATAATGATGATAGTAATACGACTAATTTGCTAGGGTTCTCGTTGTCTTCAAATATGTT
GAAAAT
GGGTGGTGGAGAAGCTCTTTACTCATCTTCGTCGTCTTCAGTTGCAACTTCTTCTGTTCCACCACAGCTTGTTG
TTGGCG
ACAACAGTAGCAACTATGGAGTTTGCTACGGTTCTAACTTAGCAGCTAGGGAAATGTATTCTCAAATGTCTGTG
ATGCC c
CTCAGATCTGACGGTTCTCTTTGCTTAATGGAAGCTCTCAACAGATCTTCTCACTCGAATAATCATCACCATAG
TCAAGT
TTCATCTCCAAAGATGGAAGATTTCTTTGGGACCCATCATCACAACACAAGTCACAAAGAAGCCATGGATCTTA
GCTTA
G
ATAGTTTATTCTACAATACCACTCATGCGCCAAACAACAACACCAACTTTCAAGAGTTCTTTAGCTTCCCTCAA
ACTAGA
AACCACCATGAGGAAGAAACAAGAAACTACGAGAATGACCCCTGGTTTGACACATGGAGGAGGGTCTTTTAATG
TAGGG
GT
ATATGGGGAATTTCAACAGTCACTGAGCTTGTCCATGAGCCCTGGGTCACAATCTAGCTGCATCACTGCTCTCA
TCACC
ACCAAAACCAAACTCAAAACCACCAGCAGATCTCTGAAGCTTTGGTCGAGACAAGTGGATTTGAGACAACAACA
A
TG
GCGGCTGCTGCTGCAAAGAAGAAGAGAGGACAAGAAGTTGTCGTTGGACAGAAACAGATTGTTCATAGAAAATC
TATT
GA
TACTTTTCGACAACGAACTTCGCAATACCGAGGCGTTACAAGACATAGATGGACTGGTAGGTATGAAGCTCATC
TATGG
G
ACAATAGTTTCAAGAAGGAAGGTCATAGCAGAAAAGGAAGACAAGTTTATCTGGGGGGTTATGATATGGAGGAG
AAA
GCT
GCTCGAGCATATGATCTTGCTGCACTCAAGTACTGGGGTCCCTCTACTCACACTAATTTCTCTGTGGAGAATTA
TCAGAA
AGAGATTGATGACATGAAGAACATGACTCGACAACAATATGTTGCTCACTTGAGAAGAAAAACCAGTGGTTTCT
CTAG
GG
GTGCTTCCATCTATAGAGGAGTCACCAGACATCACCAGCATGGAAGGTGGCAAGCTCGGTAGAGTCGCTGGAA
AC
AAAGATCTCTACCTTGGAACTTTCGGAACTCAAGAAGAAGCGGCGGAAGCCTATGATGTAGCAGCTATCAAGTT
CCGTG
G
CACAAACGCGGTGACTAACTTTGACATAACAAGGTACGATGTTGATCGCATAATGGCTAGTAACACTCTCTTGT CT GGA G
AGATGGCTCGAAGGAACAGCAACAGCATCCTGGTCCGCAACATTAGCGACGAGGAGCCGCTTTAACCGCTGTCG
TGA
AC
GGTGGTTCAATAAGGAAGTGGGTAGCCCGGAGAGGGTTTTGAGTTTTCCGATATTTGCGTTGCCTCAAGTTGGT
C
C
GAAGATGTTCGGAGCAAATGTGGTCGGAAATATGAGTTCTTGGACTACGAACCCTAATGCTGATCTCAAGACCG
TTTCT
HU 225 428 Β1
C
TTACTCTGCCGCAGATGCCGGTTTTCGCTGCGTGGGCTGATTCTTAATTCAATCTAATGCTAACTCTGGTTTTC
TTGGTT
TAGGGTCAAGTGTTTAAGTTTATCTCCGGGTTTATCCGGTTTGAACTACAATTCGG-3'
5. azonosító számú szekvencia
Brassica ANT-peptidszekvencia (548 aminosav)
MKSFCDNDDSNTTNLLGFSLSSNMLKMGGGEALYSSSSSVATSSVPPQLVVGDNSSNYGVCYGSNLAAREMYSQ
MSVMP
LRSDGSLCLMEALNRSSHSNNHHHSQVSSPKMEDFFGTHHHNTSHKEAMDLSLDSLFYNTTHAPNNNTNFQEFF
SFPQTR
NHHEEETRNYENDPGLTHGGSFNVGVYGEFQQSLSLSMSPGSQSSCTTASHHHQNQTQNHQQIS
AAAAAKKKRGQEVWGQKQIVHRKSIDTFGQRTSQYRGVTRHRWTGRYEAHLWDNSFKKEGHSRKGRQVYLGGY
DMEEK
A
ARAYDLAALKYWGPSTHTNFSVENYQKEIDDMKNMTRQEYVAHLRRKTSGFSRGASIYRGVTRHHQHGRWQARI
GRVAG
N
KDLYLGTFGTQEEAAEAYDVAAIKFRGTNAVTNFDITRYDVDRIMASNTLLSGEMARRNSNSIWRNISDEEAA
LTAWN
GGSNKEVGSPERVLSPTTIFAPQVGPKMFGANWGNMSSWTTNPNADLKTVSLTLPQMPVFAAWADS
6. azonosító számú szekvencia
Konszenzus ANT-polinukleotidszekvencia-1 (33 nukleotid)
ATGAAGTCTTTTTGTGATAATGATGATAGTAAT
7. azonosító számú szekvencia
Konszenzus ANT-polinukleotidszekvencia-2 (39 nukleotid)
ACGACTAATTTGTTAGGGTTCTCATTGTCTTCAAATATG
8. azonosító számú szekvencia
Konszenzus ANT-polinukleotidszekvencia-3 (38 nukleotid)
AGAATCAGCCCAAGCAGCGAAAACCGGCATCTGCGGCA

Claims (45)

1. Eljárás növényekben sejtszaporodás módosításé- 40 ra, azzal jellemezve, hogy a növénybe a szekvencialista
2. vagy 5. azonosító számon megadott szekvenciájával legalább 80%-ban azonos szekvenciájú AINTEGUMENTA (ANT) polipeptidet kódoló, heterológ ANT-nukleinsavat működőképesen növényi promoterhez kapcsolt tor- 45 mában tartalmazó expressziós kazettát juttatunk be, és kiválasztunk egy megváltozott sejtszámú növényt.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejtszaporodás módosításával megváltozott növényméretet, növénytömeget vagy termékenységet 50 érünk el, és az eljárás során megváltozott növényméretű, növénytömegű vagy termékenységű növényeket választunk ki.
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az ANT-nukleinsav expresszióját fokozzuk, és az 55 eljárás során kiválasztjuk a megnövekedett sejtszámú növényeket.
4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy növényi szerv méretét vagy tömegét növeljük, és ilyen növényeket választunk ki. 60
5. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a termékenységet csökkentjük, és ilyen növényeket választunk ki.
6. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy ANT-nukleinsavként az 1. azonosító számú szekvencia szerinti szekvenciájú ANT-nukleinsavat alkalmazzuk.
7. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy ANT-nukleinsavként a 2. azonosító számú szekvencia szerinti polipeptidet kódoló szekvenciájú ANT-nukleinsavat alkalmazzuk.
8. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy ANT-nukleinsavként a 4. azonosító számú szekvencia szerinti szekvenciájú ANT-nukleinsavat alkalmazzuk.
9. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy ANT-nukleinsavként az 5. azonosító számú szekvencia szerinti polipeptidet kódoló szekvenciájú ANT-nukleinsavat alkalmazzuk.
10. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hajtás vegetatív szervében növeljük az ANT-aktivitást.
HU 225 428 Β1
11. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gyökérben növeljük az ANT-aktivitást.
12. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy virágzati szervben növeljük az ANT-aktivitást.
13. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy magban növeljük az ANT-aktivitást.
14. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy termésben növeljük az ANT-aktivitást.
15. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az ANT-expressziót csökkentjük, és az eljárás során kiválasztjuk a csökkent sejtszámú növényeket.
16. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy ANT-nukleinsavként az 1. azonosító számú szekvencia szerinti szekvenciájú ANT-nukleinsavat alkalmazzuk.
17. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy ANT-nukleinsavként a 2. azonosító számú szekvencia szerinti polipeptidet kódoló szekvenciájú ANT-nukleinsavat alkalmazzuk.
18. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy ANT-nukleinsavként a 4. azonosító számú szekvencia szerinti szekvenciájú ANT-nukleinsavat alkalmazzuk.
19. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy ANT-nukleinsavként az 5. azonosító számú szekvencia szerinti polipeptidet kódoló szekvenciájú ANT-nukleinsavat alkalmazzuk.
20. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hajtás vegetatív szervében csökkentjük az ANT-aktivitást.
21. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gyökérben csökkentjük az ANT-aktivitást.
22. A15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy virágzati szervben csökkentjük az ANT-aktivitást.
23. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy magban csökkentjük az ANT-aktivitást.
24. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy termésben csökkentjük az ANT-aktivitást.
25. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy növényi promoterként konstitutív promotert alkalmazunk.
26. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy növényi promoterként indukálható promotert alkalmazunk.
27. Az 1. igénypontok szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy növényi promoterként szövetspecifikus promotert alkalmazunk.
28. A 27. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy promoterként az ANT-nukleinsav expresszióját hajtásban mint vegetatív szervben irányító promotert alkalmazunk, és az eljárás során megváltozott méretű vagy tömegű hajtással mint vegetatív szervvel bíró növényeket választunk ki.
29. A 27. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy promoterként az ANT-nukleinsav expresszióját gyökérben irányító promotert alkalmazunk, és az eljárás során kiválasztjuk a megváltozott gyökérméretű vagy gyökértömegű növényeket.
30. A 27. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy promoterként az ANT-nukleinsav expresszióját virágzat! szervekben irányító promotert alkalmazunk, és az eljárás során steril növényeket vagy megváltozott virágzati szervmérettel vagy szervtömeggel bíró növényeket választunk ki.
31. A 27. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy promoterként az ANT-nukleinsav expresszióját magkezdeményekben irányító promotert alkalmazunk, és az eljárás során kiválasztjuk azokat a növényeket, amelyek nősterilek, vagy megváltozott a magkezdemény mérete vagy tömege.
32. A 27. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy promoterként az ANT-nukleinsav expresszióját portokban irányító promotert alkalmazunk, és az eljárás során kiválasztjuk azokat a növényeket, amelyek hímsterilek, vagy megváltozott a portok mérete vagy tömege, vagy amelyeknek portokja nem hasadt fel.
33. A 27. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy promoterként az ANT-nukleinsav expresszióját magokban irányító promotert alkalmazunk, és az eljárás során kiválasztjuk a megváltozott magméretű vagy magtömegű növényeket.
34. A 27. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy promoterként az ANT-nukleinsav expresszióját termésben irányító promotert alkalmazunk, és az eljárás során kiválasztjuk a megváltozott termésméretű vagy terméstömegű növényeket.
35. Az 1. igénypontok szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy növényi promoterként Arabidopsis ANTgénből származó promotert alkalmazunk.
36. A 35. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy promoterként a 3. azonosító számú szekvencia szerinti promoterszekvenciát alkalmazzuk.
37. Eljárás növényekben sejtszaporodás módosítására, azzal jellemezve, hogy a növénybe olyan expressziós kazettát viszünk be, amely egy növényi promotert tartalmaz működőképesen AlNTEGUMENTA-polipeptidet (ANT-polipeptidet) kódoló ANT-nukleinsavhoz kapcsolva, ahol az ANT-polipeptid szekvenciája legalább 80%-ban azonos a 2. vagy az 5. azonosító számú szekvenciával, és ahol az ANT-nukleinsav expressziójának növekedését érjük el a vad típusú, nem transzgenikus növénybeli ANT-nukleinsav-expresszióhoz képest.
38. A 37. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy ANT-nukleinsavként az 1. azonosító számú szekvencia szerinti szekvenciájú nukleinsavat alkalmazzuk.
39. A 37. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy ANT-nukleinsavként a 2. azonosító számú szekvencia szerinti polipeptidet kódoló szekvenciájú nukleinsavat alkalmazzuk.
40. A 37. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy ANT-nukleinsavként a 4. azonosító számú szekvencia szerinti szekvenciájú nukleinsavat alkalmazzuk.
41. A 37. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy ANT-nukleinsavként az 5. azonosító számú szekvencia szerinti polipeptidet kódoló szekvenciát alkalmazzuk.
42. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy növényi promoterként az ANT-nukleinsavhoz
HU 225 428 Β1 képest szensz orientációban elhelyezkedő promotert alkalmazunk.
43. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy növényi promoterként az ANT-nukleinsavhoz képest antiszensz orientációban elhelyezkedő promo- 5 tért alkalmazunk.
44. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az ΑΝΤ-polipeptid szekvenciája legalább 80%-ban azonos a 2. azonosító számú szekvenciával.
45. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az ANT-polipeptid szekvenciája legalább 80%-ban azonos az 5. azonosító számú szekvenciával.
HU0500499A 1999-01-08 2000-01-07 Methods for altering organ mass, controlling fertility and enhancing asexual reproduction in plants HU225428B1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US09/227,421 US6559357B1 (en) 1999-01-08 1999-01-08 Methods for altering mass and fertility in plants
PCT/US2000/000465 WO2000040694A2 (en) 1999-01-08 2000-01-07 Methods for altering organ mass, controlling fertility and enhancing asexual reproduction in plants

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUP0500499A2 HUP0500499A2 (hu) 2005-08-29
HU225428B1 true HU225428B1 (en) 2006-11-28

Family

ID=22853051

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0500499A HU225428B1 (en) 1999-01-08 2000-01-07 Methods for altering organ mass, controlling fertility and enhancing asexual reproduction in plants

Country Status (7)

Country Link
US (4) US6559357B1 (hu)
EP (1) EP1147122A4 (hu)
JP (1) JP2002534078A (hu)
AU (1) AU766797B2 (hu)
CA (1) CA2363911C (hu)
HU (1) HU225428B1 (hu)
WO (1) WO2000040694A2 (hu)

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6559357B1 (en) * 1999-01-08 2003-05-06 The Regents Of The University Of California Methods for altering mass and fertility in plants
EP1155123A4 (en) * 1999-02-25 2005-12-21 Ceres Inc ADC POLYNUCLEOTIDES AND POLYPEPTIDES AND THEIR USES, INCLUDING PROCESSES FOR IMPROVING SEED
US7126043B1 (en) 1999-02-25 2006-10-24 Ceres, Inc. ADC polynucleotides and polypeptides, uses thereof including methods for improving seeds
US6989473B1 (en) * 1999-11-19 2006-01-24 Incorporated Administrative Agency National Agriculture And Bio-Oriented Research Organization Method of making male sterile petunia plants by transformation with a nucleic acid encoding a zinc finger transcriptional factor
DE10048214A1 (de) * 2000-09-28 2002-04-11 Max Planck Gesellschaft Pflanzen mit maskierter Fruchtbarkeit
EP1343904A2 (en) 2000-12-21 2003-09-17 Monsanto Technology LLC Nucleic acid molecules associated with plant cell proliferation and growth and uses thereof
US7264964B2 (en) * 2001-06-22 2007-09-04 Ceres, Inc. Chimeric histone acetyltransferase polypeptides
US7294759B2 (en) * 2001-06-29 2007-11-13 E. I. Du Pont De Nemours And Company Alteration of oil traits in plants
US7071379B2 (en) * 2002-01-28 2006-07-04 The Regents Of The University Of California Methods for altering organ mass in plants
CA2499375A1 (en) * 2002-09-17 2004-04-01 Ceres, Inc. Biological containment system
US7476777B2 (en) * 2002-09-17 2009-01-13 Ceres, Inc. Biological containment system
AU2005210493B2 (en) 2004-02-02 2009-06-04 Pioneer Hi-Bred International, Inc. AP2 domain transcription factor ODP2 (ovule development protein 2) and methods of use
ES2389934T3 (es) * 2004-03-05 2012-11-05 University Of Bath Semillas
AU2005337132B2 (en) 2004-12-21 2011-01-20 Monsanto Technology, Llc Transgenic plants with enhanced agronomic traits
EP1928227A4 (en) * 2005-08-30 2009-05-20 Monsanto Technology Llc TRANSGENIC PLANTS WITH IMPROVED AGRONOMIC CHARACTERISTICS
WO2007078280A2 (en) * 2005-12-21 2007-07-12 Monsanto Technology, Llc Transgenic plants with enhanced agronomic traits
TWI347168B (en) * 2008-03-24 2011-08-21 Univ Nat Taiwan Plant senescence-inducible promoter
US20110258735A1 (en) * 2008-12-22 2011-10-20 Marie Coffin Genes and uses for plant enhancement
WO2011082310A2 (en) 2009-12-30 2011-07-07 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods and compositions for targeted polynucleotide modification
CA2793600C (en) 2009-12-30 2020-01-14 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods and compositions for the introduction and regulated expression of genes in plants
JP6397610B2 (ja) * 2013-09-10 2018-09-26 株式会社豊田中央研究所 師部組織増産に適した植物体及びその利用
BR112017018900A2 (pt) * 2015-03-02 2018-05-15 Stora Enso Oyj geração de biomassa
CN111662922A (zh) * 2019-03-05 2020-09-15 江苏师范大学 拟南芥ant基因在提高鸡冠花耐旱性和种子产量中的应用
CN114072512A (zh) * 2019-07-05 2022-02-18 未名生物农业集团有限公司 不育基因及其相关构建体和应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5110732A (en) 1989-03-14 1992-05-05 The Rockefeller University Selective gene expression in plants
US6559357B1 (en) 1999-01-08 2003-05-06 The Regents Of The University Of California Methods for altering mass and fertility in plants

Also Published As

Publication number Publication date
US6559357B1 (en) 2003-05-06
JP2002534078A (ja) 2002-10-15
EP1147122A4 (en) 2004-09-22
AU2497200A (en) 2000-07-24
US20050132445A1 (en) 2005-06-16
EP1147122A2 (en) 2001-10-24
US6639128B1 (en) 2003-10-28
WO2000040694A3 (en) 2000-11-30
US7220895B2 (en) 2007-05-22
AU766797B2 (en) 2003-10-23
CA2363911C (en) 2012-10-16
CA2363911A1 (en) 2000-07-13
US20090313723A1 (en) 2009-12-17
HUP0500499A2 (hu) 2005-08-29
WO2000040694A2 (en) 2000-07-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20090313723A1 (en) Methods for altering organ mass, controlling fertility and enhancing asexual reproduction in plants
RU2438297C2 (ru) Нуклеиновые кислоты и способы получения семян, имеющих в зародыше полный диплоидный геном, комплементарный материнскому
NZ552613A (en) Nucleic acid molecules and their use in plant male sterility
HU225685B1 (hu) Hímsterilitás létrehozása növényekben, avidin magas szintû expresszáltatásával
US7439416B2 (en) Indeterminate gametophyte 1 (ig1)gene from Zea mays and uses thereof
US6229064B1 (en) Nucleic acids that control endosperm development in plants
US20070011760A1 (en) Nucleic acids that control seed and fruit development in plants
US7595434B2 (en) Methods for altering organ mass in plants
US20220275383A1 (en) Sterile genes and related constructs and applications thereof
JP2002532069A (ja) 開花の制御
CN106893731B (zh) 大豆木葡聚糖转移酶水解酶基因GmXTH1及应用
US7273968B2 (en) Combinations of genes for producing seed plants exhibiting modulated reproductive development
US20020199219A1 (en) Modulation of abscisic acid signal transduction in plants
AU779114B2 (en) Control of flowering
US20060070142A1 (en) Methods of suppressing flowering in transgenic plants
US20050193447A1 (en) Modulation of abscisic acid signal transduction in plants
AU2005253642A1 (en) Nucleic acid molecules and their use in plant male sterility
MX2008007458A (en) Nucleic acids and methods for producing seeds having a full diploid complement of the maternal genome in the embryo

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees