HU224000B1 - Robbanóanyagok kimutatása és biodegradálása - Google Patents

Robbanóanyagok kimutatása és biodegradálása Download PDF

Info

Publication number
HU224000B1
HU224000B1 HU9901395A HUP9901395A HU224000B1 HU 224000 B1 HU224000 B1 HU 224000B1 HU 9901395 A HU9901395 A HU 9901395A HU P9901395 A HUP9901395 A HU P9901395A HU 224000 B1 HU224000 B1 HU 224000B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
petn
enzyme
reductase
gene
nitrite
Prior art date
Application number
HU9901395A
Other languages
English (en)
Inventor
Peter Roland Binks
Neil Charles Bruce
Christopher Edward French
Stephen Nicklin
Original Assignee
The Secretary of State for Defence of Defence Evaluation & Research Agency
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GB9514138A external-priority patent/GB2303136A/en
Priority claimed from GB9607220A external-priority patent/GB2311784A/en
Application filed by The Secretary of State for Defence of Defence Evaluation & Research Agency filed Critical The Secretary of State for Defence of Defence Evaluation & Research Agency
Publication of HUP9901395A2 publication Critical patent/HUP9901395A2/hu
Publication of HUP9901395A3 publication Critical patent/HUP9901395A3/hu
Publication of HU224000B1 publication Critical patent/HU224000B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A62—LIFE-SAVING; FIRE-FIGHTING
    • A62D—CHEMICAL MEANS FOR EXTINGUISHING FIRES OR FOR COMBATING OR PROTECTING AGAINST HARMFUL CHEMICAL AGENTS; CHEMICAL MATERIALS FOR USE IN BREATHING APPARATUS
    • A62D3/00—Processes for making harmful chemical substances harmless or less harmful, by effecting a chemical change in the substances
    • A62D3/02—Processes for making harmful chemical substances harmless or less harmful, by effecting a chemical change in the substances by biological methods, i.e. processes using enzymes or microorganisms
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B09—DISPOSAL OF SOLID WASTE; RECLAMATION OF CONTAMINATED SOIL
    • B09C—RECLAMATION OF CONTAMINATED SOIL
    • B09C1/00—Reclamation of contaminated soil
    • B09C1/10—Reclamation of contaminated soil microbiologically, biologically or by using enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C02—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F3/00—Biological treatment of water, waste water, or sewage
    • C02F3/34—Biological treatment of water, waste water, or sewage characterised by the microorganisms used
    • C02F3/342—Biological treatment of water, waste water, or sewage characterised by the microorganisms used characterised by the enzymes used
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C06—EXPLOSIVES; MATCHES
    • C06B—EXPLOSIVES OR THERMIC COMPOSITIONS; MANUFACTURE THEREOF; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS EXPLOSIVES
    • C06B21/00—Apparatus or methods for working-up explosives, e.g. forming, cutting, drying
    • C06B21/0091—Elimination of undesirable or temporary components of an intermediate or finished product, e.g. making porous or low density products, purifying, stabilising, drying; Deactivating; Reclaiming
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0044—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on other nitrogen compounds as donors (1.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/008—Preparation of nitrogen-containing organic compounds containing a N-O bond, e.g. nitro (-NO2), nitroso (-NO)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001—Enzyme electrodes
    • C12Q1/005—Enzyme electrodes involving specific analytes or enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A62—LIFE-SAVING; FIRE-FIGHTING
    • A62D—CHEMICAL MEANS FOR EXTINGUISHING FIRES OR FOR COMBATING OR PROTECTING AGAINST HARMFUL CHEMICAL AGENTS; CHEMICAL MATERIALS FOR USE IN BREATHING APPARATUS
    • A62D2101/00—Harmful chemical substances made harmless, or less harmful, by effecting chemical change
    • A62D2101/06—Explosives, propellants or pyrotechnics, e.g. rocket fuel or napalm
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Environmental & Geological Engineering (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Water Supply & Treatment (AREA)
  • Soil Sciences (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Hydrology & Water Resources (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Business, Economics & Management (AREA)
  • Emergency Management (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

A találmány tárgyát egy pentaeritrit-tetranitrátból (PETN) nitriteltávolítását katalizáló enzim, a PETN-reduktáz enzim képezi. Azenzimet egy, az Enterobacter cloacae baktérium a természetből izoláltúj törzse tenyésztésével állították elő. A PB2-nek jelölt törzset azNCIMB-40 718-as számon helyezték letétbe. Az enzimaminosavszekvenciáját és az enzimet kódoló gén (onr-gén) szekvenciájátszintén meghatározták. A találmány tárgyát képezi tehát izoláltpentaeritrit-tetranitrát-reduktáz (PETN-reduktáz) enzim, amelypentaeritrit-- tetranitrátból (PETN) nitrit eltávolítását katalizálja,és az enzim származéka, továbbá az enzimet kódoló gén is. A találmánytárgyát képezik továbbá eljárások a PETN-reduktáz enzim nagymennyiségben történő előállítására, és az így előállított enzimalkalmazására biológiai helyreállítás során. A fentieken kívül atalálmány tárgyát képezi egy eljárás PETN jelenlétének kimutatásáraegy mintában, valamint egy ilyen eljárásban alkalmazható bioszenzor. Atalálmány szerinti megoldás alkalmas tehát a találmány szerinti enzimnagy tételben történő előállítására, valamint PETN-nel és rokonvegyületekkel szennyezett környezet megtisztítására. A találmányszerinti megoldás alkalmas PETN kis mennyiségben történő kimutatásárais. ŕ

Description

(54) Robbanóanyagok kimutatása és biodegradálása
HU 224 000 Β1 (57) Kivonat
A találmány tárgyát egy pentaeritrit-tetranitrátból (PETN) nitrit eltávolítását katalizáló enzim, a PETNreduktáz enzim képezi. Az enzimet egy, az Enterobacter cloacae baktérium a természetből izolált új törzse tenyésztésével állították elő. A PB2-nek jelölt törzset az NCIMB-40 718-as számon helyezték letétbe. Az enzim aminosavszekvenciáját és az enzimet kódoló gén (onr-gén) szekvenciáját szintén meghatározták.
A találmány tárgyát képezi tehát izolált pentaeritrittetranitrát-reduktáz (PETN-reduktáz) enzim, amely pentaeritrit-tetranitrátból (PETN) nitrit eltávolítását katalizálja, és az enzim származéka, továbbá az enzimet kódoló gén is. A találmány tárgyát képezik továbbá eljárások a PETN-reduktáz enzim nagy mennyiségben történő előállítására, és az így előállított enzim alkalmazására biológiai helyreállítás során. A fentieken kívül a találmány tárgyát képezi egy eljárás PETN jelenlétének kimutatására egy mintában, valamint egy ilyen eljárásban alkalmazható bioszenzor.
A találmány szerinti megoldás alkalmas tehát a találmány szerinti enzim nagy tételben történő előállítására, valamint PETN-nel és rokon vegyületekkel szennyezett környezet megtisztítására. A találmány szerinti megoldás alkalmas PETN kis mennyiségben történő kimutatására is.
A leírás terjedelme 16 oldal (ezen belül 5 lap ábra)
HU 224 OOO B1
A találmány szerinti megoldás a robbanóanyagok kimutatásának és biodegradációjának tárgykörébe tartozik. Ennek megfelelően a találmány tárgyát egy, robbanóanyagok kimutatására és biodegradálására alkalmas új enzim képezi, továbbá az enzim aminosavszekvenciája, az enzimet kódoló gén, valamint eljárások az enzim előállítására rekombináns úton. A találmány tárgyát képezi továbbá eljárás pentaeritrit-tetranitrát (a továbbiakban a közönségesen használt rövidítést alkalmazva: PETN) aerob biodegradálásának katalizálására és így szennyezett környezet megtisztítására az enzim alkalmazásával, valamint eljárás és készülék PETN kimutatására az enzim alkalmazásával.
A találmány szerinti megoldás előnyösen alkalmazható tehát a találmány szerinti enzim nagy tételben történő előállítására, valamint PETN-nel és rokon vegyületekkel szennyezett környezet megtisztítására. A találmány szerinti megoldás előnyösen alkalmazható PETN kis mennyiségben történő kimutatására is.
A találmány szerinti új enzim kísérletileg igazoltan glicerin-trinitrátból (nitroglicerin, GTN), valamint etilénglikol-dinitrátból (EGDN) is felszabadít nitritet, amely vegyületek további példák salétromsavészterekre. Az enzimet a leírásban PETN-reduktáznak nevezzük.
A salétromsav-észtereket, bár a természetben nyilvánvalóan különösen ritkán fordulnak elő, a kémiai ipar jelentős mennyiségben állítja elő. A salétromsavészterek egy része a magas energiatartalmú vegyületek fontos osztályát képezi. Ezeket a vegyületeket robbanóanyagokként és hajtóanyagokként alkalmazzák. A PETN-nek magának számos alkalmazási területe van, alkalmazzák például robbanószerként gyújtószerkezetekben és detonátorokban, továbbá gyógyászati készítmények hosszan ható, lassú felszívódású hatóanyagaként, mint koszorúér-tágító, szívtáji bántalmak megelőzésére. A PETN előállítása, kezelése és raktározása egyaránt PETN-nel a szennyezett környezethez vezethet. Vannak bizonyos aggodalmak a nitrátészterek környezetbeli sorsával kapcsolatban, így szükség van olyan módszerekre, amelyek alkalmasak ilyen jellegű szennyeződések eltávolítására a környezetből anélkül, hogy nem kívánt szennyező anyagokat termelnének. Sürgős követelmény egy, a PETN kimutatására szolgáló jobb eljárás is, mivel a jelenleg kínált analitikai rendszerek nagy és bonyolult elemekből álló felszerelések alkalmazásán alapulnak, mint például gázkromatográfok és tömegspektrométerek, illetve speciálisan képzett laboratóriumi segédszemélyzetet igényelnek.
A találmány szerinti megoldás célja egy olyan enzim biztosítása, amely képes katalizálni a PETN biodegradációját, és amely alkalmazható egy, a PETN-et mint szennyező környezetből való eltávolítására alkalmas biológiai helyreállító rendszerben. A találmány szerinti megoldás további célja egy, a PETN kimutatására szolgáló rendszerekben alkalmazható enzim biztosítása.
A találmány első szempontja szerint a találmány tárgyát képezi tehát egy PETN-reduktáz enzim, amelyet az jellemez, hogy nikotinamid-adenin-dinukleotidfoszfát jelenlétében (a továbbiakban: NADPH)
1. katalizálja nitrit eltávolítását PETN-ből, valamint
2. PETN nitrát-észter-kötésére specifikus reduktázaktivitást mutat.
Az enzimre jellemző továbbá, hogy pH-optimuma
6,5 környékén van, molekulatömege pedig gélszüréssel meghatározva kb. 40 000 D. SDS-PAGE-vel (poliakrilamid-gélelektroforézis) végzett becslés alapján az enzim egy alegységének molekulatömege szintén 40 000-nek adódott. Ezek az eredmények arra engednek következtetni, hogy a PETN-reduktáz egy kb. 40 000-es molekulatömegű monomer.
A találmány szerinti PETN-reduktáz enzimet a korábban leírt lényegi tulajdonságok jellemzik, de pontosabban is meghatározható egyéb jellemvonások segítségével, mint például a pH-optimum, katalitikus aktivitás, hőstabilitás vagy molekulatömeg. Ilyen további jellemvonásokat részletekbe menően a 3. példában adtunk meg, de hangsúlyoznunk kell, hogy ezek a jellemvonások bizonyos fokig változhatnak azoktól a körülményektől függően, amelyek között a mikroorganizmus az enzimet termeli, valamint attól függően, hogy a nyerstermék mennyire van megtisztítva. Az ilyen jellegű változások szakember számára nyilvánvalóak.
A tisztított enzim láthatóan sárga, és oxidált flavoproteinre jellemző abszorpciós spektrumot mutat. A flavin forralással felszabadítható volt a PETNreduktázból - a denaturált fehérjét centrifugálással távolítottuk el - jelezve, hogy a flavin nincs kovalensen kötve. Két vékonyréteg-kromatográfiás rendszerben a felszabadított flavin együtt vándorolt standardként alkalmazott flavinmononukleotiddal (FMN), flavinadenin-dinukleotiddal (FAD) viszont nem. A flavinstandardokat alávetve ugyanannak az eljárásnak, amit flavin PETN-reduktázból történő felszabadítására használtunk, azok nem változtak meg; ami különösen lényeges, a FAD nem hidrolizált el FMN-né. Ezen eredmények jelzik tehát, hogy az enzim egy monomer flavoprotein, amely nem kovalensen FMN-et köt.
Meghatároztuk ezért az enzim aminosavszekvenciáját és az azt kódoló gén nukleotidszekvenciáját. A találmány második szempontja szerint tehát a találmány tárgyát képezi egy PETN-reduktáz enzim, amelynek aminosavszekvenciája megegyezik a 4. ábrán bemutatott aminosavszekvenciával vagy annak egy származékával. A leírásban használt értelemben származékon az enzim 4. ábrán bemutatott szekvenciájának egy változata értendő, amely aminosavszekvencia inszerciókat, deléciókat és/vagy szubsztitúciókat tartalmaz olyanformán, hogy az enzim működőképessége megmarad.
Az aminosavszekvencia tanúsága szerint azt mondhatjuk, hogy az enzim az α/β hordómotívumot tartalmazó flavoprotein oxidoreduktázok családjának a tagja.
A találmány harmadik szempontja szerint a találmány tárgyát képezi a PETN-reduktáz enzimet kódoló gén (amelynek jele onr, az „organic nitráté ester reductase, azaz szerves nitrát-észter-reduktáz rövidítése2
HU 224 000 Β1 ként), amely gén a PETN-reduktáz enzimet vagy annak egy származékát kódolja. A gén származékán, a leírásban használt értelemben a gén olyan homológjait értjük, amelyek kódolószekvenciája legalább 70%-ban azonos az onr-génével, beleértve a génen történt bármely és egyben az összes egyszeres vagy többszörös nukleotidaddíciót, -deléciót, illetve szubsztiúciót.
A találmány negyedik szempontja szerint a találmány tárgyát képezi egy rekombináns DNS-molekula, amely tartalmazza az onr-gén nukleotidszekvenciáját vagy egy azzal legalább 70%-ban azonos nukleotidszekvenciát. Az onr-gén leírásban használt értelemben meghatározott nukleotidszekvenciáját a 3. ábrán mutatjuk be.
A találmány ötödik szempontja szerint a találmány tárgyát képezi egy, lényegében az onr-génről átíródásával keletkezett terméket tartalmazó enzim.
A találmány egy további szempontja szerint a találmány tárgyát képezi a PETN-reduktáz enzim, amelyet az onr-gén kódol.
Szakember számára teljesen nyilvánvaló, hogy ha egyszer az E. cloacae PB2 mikroorganizmus PETNreduktáz enzimjének genetikai anyagát azonosítottuk a találmány szerinti megoldás szerint, lehetőség nyílik ismert eljárások alkalmazásával megfelelő gazdasejt transzformálására az onr-génnel vagy annak egy származékával oly módon, hogy a gazdasejt termelje (expresszálja) a rekombináns génterméket, azaz a PETNreduktázt. Ez elvégezhető bármely alkalmas eljárással, mint amilyen például a gén vektorba illesztése és a gazdasejt transzformálása a vektorral.
Ennek megfelelően a találmány tárgyát képezi tehát egy rekombináns DNS-vektor, amely tartalmazza az onr-gént vagy annak egy származékát, valamint egy, az onr-génnel, vagy annak egy származékával transzformált gazdasejt. Ez a transzformálás elvégezhető egy ilyen vektor alkalmazásával.
Az a mód, ahogyan ilyen vektorok, valamint rekombináns DNS előállíthatok, szakember számára nyilvánvalóak, feltéve, hogy az alkalmazható eljárások, beleértve a megfelelő gazdasejt és megfelelő promoterek kiválasztását, általánosan közismertek ezen a területen.
Az erre a célra használható gazdasejtek közül előnyös lehet az onr-gén többletpéldányaival transzformáit E. cloacae PB2-sejtek alkalmazása.
A gazdasejt megfelelő promotere mögé illesztett onr-génnel vagy annak egy származékával transzformáit gazdasejt alkalmazásával lehetőség nyílik PETN-reduktáz enzim iparilag hasznosítható mennyiségben történő előállítására, megint csak a technika állása szerint jól ismert módszerek segítségével. A találmány tárgyát képezi tehát egy eljárás PETNreduktáz enzim, vagy annak egy származéka előállítására, azzal jellemezve, hogy az onr-génnel vagy annak származékával gazdasejtet transzformálunk, majd a gazdasejtet az onr-gén termékének expresszáltatása szempontjából megfelelő körülmények között tenyésztjük, és az onr-gén termékét a tápközegből vagy a gazdasejtekből - feltárás után - kinyerjük.
Előnyösebben a termelési eljárást folyamatos vagy félfolyamatos üzemben végezzük, és a termelt enzimet folyamatosan nyerjük ki a gazdasejt-tápközegből, a technika állása szerint jól ismert módszereket alkalmazva. Amennyiben a gazdasejt az enzimet intracellulárisan termeli, szükségessé válik a tenyésztett sejtek feltárása az enzimtermék kinyerése érdekében. A megfelelő gazdasejtek lehetnek eukarióta vagy prokarióta organizmusok.
A találmány szerinti új reduktáz enzim hatása a PETN redukciójának katalízise a PETN nitrát-észterkötését támadva, ami termékként pentaeritrit tri- és dinitrátokat eredményez. Az a képesség, hogy PETN nitrát-észter-kötését specifikusan támadja, ennek a PETN-reduktáz enzimnek megkülönböztető sajátsága, nem jellemző a kereskedelmi forgalomban kapható reduktázokra. A PETN-ből keletkezett reakciótermékek azonosítási módjának leírása az alábbi 2. példában található meg.
Az a képesség, hogy az új PETN-reduktáz enzim a nitrit eltávolítását katalizálja PETN-ből NADPH jelenlétében, lehetővé teszi az enzim alkalmazását PETN kimutatására. A találmány egy még további szempontja szerint tehát a találmány tárgyát képezi egy eljárás PETN kimutatására egy mintában, azzal jellemezve, hogy a mintát a találmány szerinti PETN-reduktáz enzim hatásának tesszük ki NADPH jelenlétében, olyan körülmények között, amelyek lehetővé teszik a mintában jelen lévő bármely PETN reakcióját és a reakció megtörténtének kimutatását. Előnyösen a reakció kimutatása biolumineszcenciateszt segítségével történhet bakteriális vagy valamilyen világító bogár luciferázának felhasználásával, vagy pedig kolorimetriás vagy amperometriás módszerrel, amint az a technika állása szerint jól ismert.
A találmány egy további szempontja szerint tehát a találmány tárgyát képezi egy bioszenzor PETN kimutatására egy mintában, azzal jellemezve, hogy a mintát PETN-reduktáz enzimmel hozzuk érintkezésbe NADPH jelenlétében, majd, amennyiben a mintában PETN van jelen, valamilyen módszerrel kimutatjuk PETN enzim által katalizált reakciójának megtörténtét. A reakció megtörténtének kimutatása során előnyösen alkalmazhatunk biolumineszcenciás jelátalakítót vagy amperometriás jelátalakítót. Ilyen szenzorok igen előnyös hordozható detektorok alapjául szolgálhatnak akár nyomnyi mennyiségű PETN kimutatására például csomagokban vagy ruházatban.
Tesztreakcióban amperometriás vagy biolumineszcenciás változásokon alapuló bioszenzorok készítésére szolgáló eljárások a technika állása szerint jól ismertek. Az egyesült királyságbeli, 2 231 332A számon (NRDC) közzétett szabadalmi bejelentés például módszereket és azok bioszenzorokban történő alkalmazásait tárja fel, amely publikáció tartalmát a kitanítás részeként kell tekinteni. Bármely ilyen eljárás alkalmazható PETN degradálódási reakciója megtörténtének kimutatására és így PETN kimutatására.
HU 224 000 Β1
Biolumineszcenciás bioszenzor esetében jellemző módon luciferázt alkalmazhatunk. Ez az enzim felelős a világító baktériumok fénykibocsátó reakciójáért, és ez katalizálja a molekuláris oxigén reakcióját redukált flavinnal és alifás aldehiddel, aminek során hosszú életidejű intermedierek képződnek, amelyek lassú bomlása elegendően magas kvantumhasznosulási aránnyal biztosít energiát a fényemisszióhoz. A PETN-reduktáz enzimet egy ilyen biolumineszcens rendszerrel társítva a PETN-reduktáz aktivitása révén keletkezett NADP+-t egy alkoholnak - amely lehet például dekanol, oktanol vagy hexanol - alkoholdehidrogenáz jelenlétében a megfelelő aldehiddé történő eloxidálódása révén detektáljuk. A keletkezett aldehidet azután úgy mutatjuk ki, hogy redukált flavinnal (FMNH2) reagáltatjuk oxigén jelenlétében, luciferázzal katalizálva a reakciót. A kibocsátott fény intenzitásának mennyisége jellemző a NADPH-vá átalakított NADP+ mennyiségére, amelyet viszont a jelen lévő PETN koncentrációja határoz meg.
Megjósolható, hogy amennyiben ilyen rendszert alkalmazunk, a PETN kimutatásának érzékenysége a 0,1 nmol-0,1 pmol közötti tartományban lesz.
Egy előnyös kolorimetriás kimutatási eljárás során Griess-reagenst alkalmazunk, amely nitrit jelenlétében jellegzetes bíbor elszíneződést ad. Ismert PETNkoncentrációjú talajminták sorozatán végrehajtott tesztek segítségével standardgörbét készíthetünk, amely a talajminták PETN-koncentrációja és az 540 nm-en mért abszorbancia közötti összefüggést mutatja. Ezeket a standardgörbéket használhatjuk azután arra, hogy meghatározzuk a PETN koncentrációját ismeretlen koncentrációjú, vizsgálatra szánt talajmintákban. (A kolorimetriás kimutatási eljárás további részleteit a 7. példában adtuk meg.)
Amperometriás bioszenzorban a NADPH PETNreduktáz katalizálta reakciója során keletkező NADP* enzimatikusan visszaredukálható (például marhamájból származó) L-glutamát-dehidrogenázzal, (például sertésszívből származó) glutamátpiruvát transzaminázzal és (például Pediococcus fajokból származó) píruvát-oxidázzal. A termék a hidrogén-peroxid, és ennek koncentrációját közvetlenül mérhetjük például platinaelektróddal 0,7 V-nál vagy közvetítő nélküli peroxidázelektródon keresztül.
Azt tapasztaltuk, hogy a PETN-reduktáz PETN-en kívül glicerin-trinitrátból (GTN) és etilénglikol-dinitrátból (EGDN) is felszabadít nitritet. A látszólagos Km-et GTN esetében pH 7,0-s 50 mM-os foszfátpufferben, 0,2 mM NADPH jelenlétében 5 μΜ és 200 μΜ közötti GTNkoncentrációt alkalmazva 22+2 μΜ-nak adódott (standard hiba). A GTN denitrálásának kezdeti termékét még nem határoztuk meg.
EGDN esetében a látszólagos Km 0,5 és 2,5 mM közötti EGDN-koncentrációkat alkalmazva kb. 2 mMnak adódott, összefüggésben azzal a megfigyeléssel, hogy a pentaeritrit-dinitrát láthatóan nem szubsztrátja az enzimnek, ez arra utal, hogy az enzim által redukálton kívül két nitrátcsoport lehet szükséges a jó kötődéshez, illetve az aktivitáshoz.
Ennek megfelelően azonkívül, hogy PETN kimutatására szolgáló készülékben alkalmazható, a PETNreduktáz enzim alkalmas PETN-nel, GTN-nel és/vagy EGDN-nel szennyezett környezet helyreállítására is. A környezet ilyen lehet olyan helyeken, ahol ezeket az anyagokat a történelem folyamán előállították, illetve előállítják, vagy azokon a helyeken ahol ezeknek az anyagoknak a jelenlegi gyártása és kezelése folyik, amivel összefügg a melléktermékek kiáramlásának kezelése stb.
így tehát előnyösen a találmány egy további szempontja szerint a találmány tárgyát képezi egy eljárás PETN-nel, GTN-nel vagy EGDN-nel szennyezett környezet biológiai helyreállító kezelésére, azzal jellemezve, hogy a szennyezett környezethez PETN-reduktáz enzimet adunk, és a keveréket olyan körülmények között tartjuk, amely megfelel a PETN, GTN, illetve az EGDN az enzim általi lebontásának úgy, hogy az anyagban jelen lévő PETN, a GTN és/vagy az EGDN elfogyjon.
Az illető anyag lehet például PETN-tartalmú robbanótöltetek megsemmisítése során keletkező kiáramló PETN-tartalmú hulladék anyag, PETN-tartalmú földből vett minta vagy egyéb anyag. Első esetben a biológiai helyreállító kezelést előnyösen egy reakcióedényben végezhetjük, míg utóbbiban az enzimet közvetlenül az anyagra juttathatjuk, az enzim hozzáadásával. A hatékony kezelés más megfelelő eljárásai szakember számára nyilvánvalóak.
A találmány szerinti PETN-reduktáz enzimet a természetből izolált baktériumtörzsből nyertük. A baktériumtörzs az Enterobacter cloacae a leírásban PB2-nek jelölt törzse. Ez az új bakteriális izolátum a találmány egy további szempontját képezi. Az új izolátumból származó mintát letétbe helyeztük szabadalmi eljárás céljából a mikroorganizmusok letétbe helyezésének nemzetközi elismeréséről szóló Budapesti Egyezmény szerint az Ipari és Tengeri Baktériumok Egyesült Királyságbeli Nemzeti Gyűjteményénél (UK National Collection of Industrial and Maríné Bacteria, 23 St Machbar Drive, Aberdeen AB2 1RY, Scotland) 1995 április 14-én az NCIMB-40 718 deponálási számon.
A találmány egy még további szempontja szerint ezért, a PETN-reduktáz enzim azon képessége, hogy a fent leírtak szerint lebontsa a PETN-et lehetőséget nyújt egy másik eljárásra is, amellyel a PETN-nel szennyezett környezet biológiai kezeléssel helyreállítható. Ez az eljárás a következő lépésekből áll: a környezetet beoltjuk az Enterobacter cloacae PB2-es törzsének izolátumával és az izolátum segítségével elfogyasztjuk a környezetben jelen lévő PETN-et. Az illető környezet lehet például PETN-tartalmú robbanótöltetek megsemmisítése során keletkező kiáramló PETNtartalmú hulladék anyag, PETN-tartalmú földből vett minta vagy egyéb anyag. Első esetben a biológiai helyreállító kezelést előnyösen egy reakcióedényben végezhetjük, míg utóbbiban az izolátumot közvetlenül az anyagra juttathatjuk, a szennyezett talaj izolátummal történő beoltásával. Más, megfelelő eljárások a hatékony kezelésre szakember számára nyilvánvalóak.
HU 224 000 Β1
A fentiekben meghatározott baktérium, amennyiben nitrogénforrásként PETN-et alkalmazunk a tenyésztés során, csupán a találmány szerinti enzimaktivitást mutatja. A letétbe helyezett PB2-es törzs további jellemzői:
Gram-festés -ve
spórák -ve
mozgékonyság +ve
növekedés 37 °C +ve
41 °C +ve
45 ’C +ve
kataláz +ve
oxidáz -ve
erjesztés glükóz OF-ben +ve
kolónia morfológiája kerek, szabályszerű, egész, egyenletes, csillogóan krémes, alacsony, konvex, féligáteresztő, átmérője 1 mm
Gyorsteszt (API): 24 óra 30 °C-on
β-galaktozidáz +
arginin-dlhidroláz +
lizin-dekarboxiláz -
omitin-dekarboxiláz +
citrátfelhasználás +
H2S-termelés -
ureáz -
triptofán-deamináz -
indoltermelés -
„Voges Proskauer” +
zselatin áz -
savtermelés
glükózból +
mannitolból +
inozitolból -
szorbitolból +
ramnózból +
szacharózból +
melibiózból +
amigdalinból +
L(+)arabinózból +
citokróm- oxidázból -
További tesztek, 70 C, 7 nap
metilvörös (37 °C) -
sav raffinózból +
sav a-metil-glükozidból +
sav adonitolból +
zselatin +
A PETN-reduktázt előállíthatjuk E. cloacae tenyésztésével nitrogénforrásként PETN-et alkalmazva. Amennyiben a tenyésztést NH4N03-on végezzük, az aktivitást PETN hozzáadásával indukálhatjuk. Ez nem áll fenn azonban akkor, ha NH4CI-on növesztjük a sejteket. A tenyésztést előnyösen oxigénhiányos környezetben végezzük, bármely szokványos hőmérsékleten, például 20 °C és 40 °C között, előnyösen 25 °C és 30 °C között. A PETN-reduktáz kinyerése érdekében a sejteket bármely szokványos eljárással feltárhatjuk. Előnyösen sejtmentes extraktumot készítünk, majd kinyerjük az enzimet az extraktumból.
Ahelyett, hogy pontosan a letétbe helyezett kiindulási organizmust alkalmaznánk, annak mutánsát, például gamma-sugárzással, vegyszeres kezeléssel vagy más táptalajon végzett indukálással nyert mutánsát, illetve más baktérium segítségével nyert transzkonjugánsát vagy más, mesterségesen előállított változatát is alkalmazhatjuk. Szakember minden nehézség nélkül képes meghatározni valamely ilyen organizmus által termelt enzimaktivitást.
A találmány szerinti PETN-reduktáz fent leírt aktivitásának egy további alkalmazása kapcsán a találmány tárgyát képezi egy eljárás a gyógyászati szempontból potenciálisan hasznosítható aktivitású (biotranszformálás) pentaeritrit-di- és trinitrátok előállítására, amely során PETN-et a találmány szerinti PETN-reduktáz enzimmel reagáltatunk NADPH jelenlétében.
A találmányt az alábbiakban ábrák segítségével is ismertetjük.
Az 1. ábra pNER-G1, pNER-G2, pNER1 plazmidokban elhelyezkedő DNS-inszerteket mutatja egymás mellé rendezetten.
A 2. ábra vázlatosan szemlélteti az onr és az azt szegélyező DNS-régiók szekvenálásánál alkalmazott stratégiát.
A 3. ábra az onr-gén nukleotidszekvenciáját és a PETN-reduktáz abból származtatott aminosavszekvenciáját mutatja.
A 4. ábrán az aminosavszekvencia önmagában látható.
Az 5. ábra egy PETN-reduktáz-alapú vizsgálati eljárás standardgörbéje PETN-nel szennyezett talajokra.
Az alábbi példák részletesebben is bemutatják a találmány szerinti megoldást, céljuk azonban nem a találmány oltalmi körének szűkítése.
1. példa
Enzimaktivitás előállítása az Enterobacter cloacae
PB2-es baktériumtörzsből
1. Anyagok és módszerek
Az Enterobacter cloacae PB2-t a technika állása szerinti szokványos eljárásokkal izoláltuk természetes eredetű, nitrogénforrásként PETN-nel dúsított mintákból.
Az E. cloacae 1 I, alábbi összetételű tápközegben növesztettük: 10 mM kálium-foszfát-puffer, pH 7,3, 0,25 mM MgSO4, 5 mM glükóz, 5 mM szukcinsav, 10 mM glicerin, 2 mM NH4NO3, PETN (10 mM), és nyomelemek [Pfennig és Lippert szerint, Arch. Microbio5
HU 224 000 Β1 logy, 55, 726-739, (1966)], kiegészítve CaCI2.2H2O-dal (100 mg/ml).
Az edényeket 180 ford./perccel rázattuk 30 °C-on. Baktériumok oldatban történő előállításához 1 I tenyészettel oltottunk be steril körülmények között 50 I steril tápközeget egy 75 l-es tenyésztőedényben. Az oldatfázisú kultúrákat 30 °C-on, 150 ford./perccel kevertettük, steril levegőztetessél, hogy az oldott oxigén szintjét 10%-os telítettségben tartsuk fent.
Az így növesztett sejtekből sejtmentes kivonatokat készítettünk. A sejteket 75 l-es oldatfázisú kultúrából gyűjtöttük össze, folyamatos átfolyású centrifugálást alkalmazva (Sorval ΤΖ-28-as rotor, Sorval RC-5Ccentrifuga). Azokat a sejteket, amelyeket kisebb térfogatú kultúrából nyertünk, 10 000 g-vel centrifugáltuk 15 percig 4 °C-on Sorval RC-SC-centrifugában, amelyet ezúttal GS-3-as rotorral szereltünk fel. Ezeket a lecentrifugált sejteket nedves sejtek grammjaiként 2 ml bisz-trisz-propán-pufferben oldottuk fel (pH 7). A sejteket szonikálással tártuk fel egy MSE Soniprep készülékben (Fisons Instruments, FSA Ltd.), 15 másodperces, 12 pm erősségű besugárzással, amelyet hat alkalommal ismételtünk, közöttük a 30 másodperces szünetekben a mintákat olvadó jégben hütöttük. A sejttörmeléket és az épen maradt sejteket centrifugálással távolítottuk el 20 000 g-vel 20 percig 4 °C-on Sorval RC-SC-centrifugában; amelyet SS-34-es rotorral szereltünk fel. így sejtmentes, tiszta extraktumot kaptunk.
2. Vegyszerek
Az alkalmazott PETN az elérhető legtisztább volt, míg a többi vegyszer analitikai tisztaságú. Hacsak külön nem jelezzük, a BDH Ltd-től (Poole, Egyesült Királyság), a Sigma Chemical Company Ltd-től (Poole, Egyesült Királyság), illetve az Aldrich cégtől (Gillingham, Egyesült Királyság) szereztük be őket.
3. Vizsgálati eljárások
PETN-reduktáz
A PETN-reduktáz aktivitását a PETN eltűnésének HPLC-vel való követésével határoztuk meg 50 mM bisz-trisz-propán-pufferben (pH 7,0), amely 47 μΜ-os végső koncentrációban PETN-et, 40 μΙ enzimet és 0,2 mM végső koncentrációban NADPH-t tartalmazott 1 ml végtérfogatban.
Másik lehetőségként a PETN lebomlását a nitritfelszabadulás mérésével is követtük, Greiss-reagens segítségével [Rosenblatt, Burrows, Mitchell és Parmer, „Organic Explosives and Related Compounds”, „The Handbook of Environmental Chemistry”, 3(G), szerk. O. Hutzinger, Springer-Verlag, (1991)]. A vizsgálati eljárás során az enzim reagáltatását a fentiek szerint végeztük és a végső koncentrációban 0,5 mM-os ferricianid hozzáadásával állítottuk le. Ezután szulfanilsavat (0,6 mM végső koncentrációban) adtunk hozzá, és állni hagytuk 15 percig. Ν-1-naftilén-etilén-diamint (0,4 mM végső koncentrációban) adtunk hozzá, és 5 perc múlva a kialakult színváltozást 540 nm-en spektrofotometriásán mértük. Az enzimaktivitás egységének az 1 μΜ nitrit percenkénti felszabadításához 30 °C-on szükséges enzim mennyiségét tekintettük.
A PETN lebomlását meghatározhatjuk a NADPH oxidációjának 340 nm-en történő követésével is.
Fehérjemeghatározás
A fehérjemennyiségét rutinszerűen határoztuk meg Bradford Coomassie-festékkötődési módszerével [Anal. Biochem. 72, 248-254, (1976)] kereskedelmi forgalomban kapható reagenst és marhaeredetü szérumalbumin-standardot [előállító: Pierce Ltd., beszerezve a Life Sciences Labs Ltd.-n (Luton) keresztül], A minta egy adott mennyiségét (20 μΙ-t), ami 0,2-1 mg fehérjét tartalmazott, hozzáadtunk 1 ml reagenshez és a reakciót 5 percig hagytuk végbemenni szobahőmérsékleten, majd leolvastuk az abszorbanciát 595 nm-en. Háttérként a puffer (20 μΙ) és reagens (1 ml) elegye szolgált. Standardértékekkel felvett (0-1 mg/ml) standardgörbével való összehasonlítás alapján kiszámolhattuk a fehérjekoncentrációt a mintában.
Gélszűrési standardok
Az alábbi enzimeket használtuk molekulatömegmarkerekként a gélszűrési kísérletekben: marhaszérumalbumin, ovalbumin, kimotripszin, ribonukleáz-A (megfelelő molekulasúlyok sorrendben: 67 000, 43 000,25 000, 13 700).
2. példa
PETN-reduktáz tisztítása
A 30 g sejtből nyert nyerskivonathoz 50%-os telítettségnek megfelelő ammónium-szulfátot adtunk. Miután 4 °C-on 5 percig kevertettük, a kapott csapadékot 20 000 g-vel 20 percig centrifugálva eltávolítottuk. A kapott felülúszóhoz annyi ammónium-szulfátot adtunk, hogy azt 90%-ra telítsük. A kapott csapadékot centrifugálással 4 °C-on kinyertük, majd feloldottuk 4 ml 50 mM-os bisz-trisz-propán-pufferben (pH 7). A mintát Sephadex G-25M-mel töltött PD-10-es oszloppal sómentesítettük, majd 8 ml-re töményítettük egy Amicon kevertethető ultraszűrőkamrát alkalmazva Diafío YM3 típusú membránszűrőn, amely 3 000 daltonnái nagyobb molekulatömegű fehérjéket nem enged át. Q-sepharose-oszloppal felszerelt FPLC-rendszert („fást protein liquid chromatography”, gyors fehérjefolyadékkromatográfia, Pharmacia) használtunk a minta további tisztításához. Az FPLC-rendszer két LKB P500-as pumpából (Pharmacia), egy LCC-500 PLUSgradiensvezérlőből (Pharmacia), egy Rheodyne injektorszelepből, egy egy fényutas UV-monitorból (Pharmacia), és egy LKB 2212 /-/EÍ/RAC-frakciószedőből állt. Az FPLC-t szobahőmérsékleten végeztük, de a frakciókat jégben hűtve gyűjtöttük össze. A koncentrátumot egy Q-sep/iarose-oszlopra (1*7 cm) vittük fel, amelyet előzőleg 50 mM bisz-trisz-propán-pufferrel (pH 8,5) ekvilibráltunk szobahőmérsékleten. Az oszlopot alaposan mostuk pufferrel, amíg már nem figyeltünk meg 280 nm-en további abszorbanciát az eluensben. A reduktázt 10 mM NaCl-dal eluáltuk. A frakciókat (14 ml) 1 ml/perces folyási sebességgel gyűjtöttük össze, sómentesítettük, majd ultraszűréssel betöményítettük a fent leírt módon. A mintát ezután egy Mimetic Orange 2-affinitási oszlopra vittük fel (8*20 mm, Affinity Chromatography Ltd.), amelyet előzőleg 50 mM
HU 224 OOO B1 bisz-trisz-propán-pufferrel (pH 7) ekvilibráltunk 4 °C-on.
Az oszlopot két oszloptérfogatnyi pufferrel mostuk.
A harmadik oszloptérfogat tartalmazta a reduktázaktivitást, ezt félretettük.
Eredmények 5
A PETN-reduktáz specifikus aktivitását a fent leírt tisztítás különböző fázisaiban mértük meg. A kapott adatokat az 1. táblázatban foglaltuk össze, amelyből látható, hogy a, nitrogénforrásként PETN-en növesztett E. cloacae PB2 sejtekből készült sejtmentes extraktumban a PETN-reduktáz 0,025 egység/mg fehérje specifikus aktivitással volt jelen. Az enzimet 182szeresére tisztítottuk.
1. táblázat
Tisztítási lépés Térfogat (ml) összes fehérje (mg) Összes aktivitás (egys/mg) Specifikus aktivitás (egys/mg) Aktivitás kitermelése (%) Tisztítási faktor (-szeres)
Nyersextra ktum 40 361,6 9,04 0,025 100 -
Ammónium-szulfát frakcionálás 8 31,4 3,47 0,110 39 4
Q-Sepharose ioncsere kromatográfia 10,5 15 0,83 0,720 9 29
Mimetic Or.2 affinitási kromatográfia 16 0,16 0,728 4,550 8 182
3. példa
A PETN-reduktáz tulajdonságai pH-optimum
A tisztított PETN-reduktázt (50 μΙ, 0,5 μΙ fehérje) percig inkubáltuk 30 °C-on 47 μΜ PETN jelenlétében 25 egy sor pufferben: 50 mM bisz-trisz-propán-puffer (pH 6,5, 7, 7,5 és 8), 50 mM 2-[N-morfolino]-etánszulfonsav (MES) (pH 5,5, 6, 6,5) és 50 mM bisz-trisz (pH 6,2, 6,3,
6,4, 6,5, 6,6, 6,7 és 6,8). A nitrit koncentrációját Greiss-reagens alkalmazásával mértük.
A PETN-reduktáz pH-optimuma 6,5-nek adódott.
Az enzim Km-je
A PETN-reduktáz Km-je a PETN maximális oldhatósága (47 μΜ) felett volt.
Molekulatömeg-meghatározás
A natív enzim molekulatömegét Andrews módszerével határoztuk meg [Biochem. J. 91, 222-223, (1964)]. A méréseket Superose 6 HR 10/30-as oszlopon végeztük (1*30 cm). A tisztított PETN-reduktázt (10 μg) összekevertük a markerfehérjékkel, és felvittük 40 az oszlopra. Az oszlopot bisz-trisz-propán-pufferrel (pH 7) eluáltuk, és a 0,4 ml-es frakciókat összegyűjtöttük.
A PETN-reduktáz elúciós térfogata 40 000 D-nek felelt meg.
A molekulatömeg-meghatározást SDS-PAGE-vel 45 is elvégeztük. A tisztított PETN-reduktáz különálló nagyobb csíkként jelentkezett, a helyzete alapján 42 000 D-nek felelt meg. Az, hogy így hasonló értéket kaptunk, mint a natív enzimre, mutatja, hogy a detergens-fehérje kölcsönhatásnak az enzim molekulatömegének meghatározására minimális hatása volt.
4. példa
A PETN-reduktázt kódoló onr-struktúrgén klónozása és szekvenálása
A PETN-reduktázt kódoló (az „organic nitráté ester reductase” azaz szerves-nitrátészter-reduktáz rövidítéseként) onr-nek jelölt gént a tisztított enzim N-terminális aminosavszekvenciája alapján készült, degenerált oligonukleotid-próbák felhasználásával klónoztuk.
A PETN-reduktáz N-terminális aminosavszekvenciájának meghatározása érdekében a tisztított enzimet (4,0 pg) átvittük SDS-poliakrilamid gélről poli(vinilidéndifluorid)-membránra (ProBlott; Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) Pharmacia PhastTransfer „semi-dry” biotolókészüléket (Pharmacia Biotech, St. Albans, UK) alkalmazva. A transzferpuffer 25 mM trisz-(hidroxi-metil)-amino-metánt, 190 mM glicint, 30 10 v% metanolt tartalmazott. A transzfert 25 mA áramerősséggel 30 percig folytattuk. Az N-terminális aminosavszekvenciát automatizált Edman-lebontással határoztuk meg a Cambridgei Egyetem Biokémiai Tanszéke Molekuláris Megismerési Központja Fehérje és Nuk35 leinsavkémiai Eszköztárának (Protein and Nucleic Acid Chemistry Facility, Cambridge Centre fór Molecular Recognition, Department of Biochemistry, University of Cambridge) igénybevételével.
Az aminosavszekvencia elemeinek felhasználásával a következő oligonukleotid-próbákat terveztük:
1. ACTTT(G/C)AG(G/C)GG(G/C)GTGAA(G/C)AGTTTTTC(G/C)GC
2. GT(G/C)AG(G/C )GG (G/C )GCC ATG AA(G/C)AC(G/C)CGGTT
Az oligonukleotidokat a Cambridgei Egyetem Biokémiai Tanszéke Molekuláris Megismerési Központja Fehérje és Nukleinsavkémiai Eszköztárának (Protein and Nucleic Acid Chemistry Facility, Cambridge Centre fór Molecular Recognition, Department of Biochemist50 ry, University of Cambridge) igénybevételével szintetizáltuk meg.
A genomi DNS-t E. cloacae PB2-ből Ausubel és munkatársai szerint [Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., és munkatársai, „Current Protocols in Mole55 cular Biology”, John Wiley and Sons, New York] állítottuk elő. A genomi DNS-t teljesen megemésztettük restrikciós endonukleázok különböző kombinációival, amelyeket a következő cégektől szereztünk be: Boehringer-Mannheim (Lewes, E. Sussex, UK), Gibco/BRL 60 (Paisley, Scotland, UK), valamint Promega (Southamp7
HU 224 OOO B1 tón, Hants., UK). A DNS-fragmenseket agarózgélelektroforézissel szeparáltuk, 0,8%-os agarózgélben, TAE-puffer alkalmazásával [Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T., „Molecular Cloning: A Laboratory Manual” 2. kiad., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) és nejlonmembránokra vittük át őket (Hybond N+ Amersham, Little Chalfont, Bucks., UK) alkalikus kapillárisblotolással a gyártó cég utasításai szerint.
A fent leírt oligonukleotid-próbákat végükön megjelöltük (y^PJATP (Dupont/NEN) és T4 Polinukleotidkináz (Promega) alkalmazásával. A biotokat 2 órán keresztül 42 °C-on hibridizáló pufferben prehibridizáltuk, amely 5*tömény SSC-ből (ahol az 1*SSC megfelel 0,15 M NaCI/0,015 M nátrium-citrát-oldatának), 5*tömény Denhardt-oldatból (ahol az 1 xtömény Denhardtoldat megfelel 0,02% Ficoll 40010,02% poli(vinilpirrolidon)/0,02% marha-szérumalbunin) és 0,02 mg/ml szonikált, denaturált lazacsperma-DNS-ből állt. A jelölt oligonukleotid-próbákat ezután 1 pmol/ml koncentrációban hozzáadtuk, és ugyanezen a hőmérsékleten hibridizáltattuk éjszaka. A biotokat négyszer 15 percig mostuk 0,5xSSC/0,1v% SDS-ben 45 °C-on, majd Fuji RX100-as röntgenfilmen hívtuk elő.
Azt tapasztaltuk, hogy mindkét oligonukleotidpróba hibridizál genomi DNS ugyanazon régiójához. Egy 45 kb. hosszúságú BamHI/HindlII-fragmenst választottunk ki klónozás céljából. Az alkalmazott vektor a pBluescriptSK+ (Stratagene, Cambridge, UK) volt. A genomi DNS-t BamHI-gyel és Hindlll-mal emésztettük és a 4 és 5 kb közötti hosszúságú DNSfragmenseket eluáltuk az agarózgélből a US Bioclean rendszert (United States Biochemical Corporation, beszerezve az Amershamen keresztül) alkalmazva. A vektor-DNS-t ugyanezekkel az enzimekkel megemésztettük, majd a vektort és az inszertet T4-DNSligázzal (Promega vagy Gibco/BRL) ligáltuk. Elektrokompetens Escherichia coli JM109-sejteket (Promega) transzformáltunk a ligálóeleggyel elektroporálással egy Bio-Rad Gene Pulser (Bio-Rad, Hemel Hempstead, Herts., UK) segítségével. Az ampicillinrezisztens transzformánsokból származó DNS-t Hybond-N+- membránra (Amersham) vittük át kolóniablotolással a gyártó előirata szerint. A biotokat radioaktívan jelölt oligonukleotid-próbákkal szkríneltük a fent leírtak szerint.
Az egyik klón, a pNER-G1-nek jelölt, egy 4,5 kb hosszúságú inszertet tartalmazott, amelyik mindkét próbával hibridizált. A DNS-szekvenálás azt mutatta, hogy a PETN-reduktáz N-terminálisát kódoló DNSszekvencia jelen van benne, de a Hindlll-hely a nyílt leolvasási fázison belül helyezkedik el, így tehát a gén 3’-vége hiányzott (1. ábra). A Hindlll-helyhez közeli DNS-szekvenciát alapul véve újabb oligonukleotid-próbát terveztünk, (amelynek szekvenciája GACGCCGTGGCCTTTGGCCGTGAC volt) és a fent leírt restrikciós emésztéssel nyert genomi eredetű DNS-fragmensek szkrínelésére használtuk, hogy a hiányzó régiót lokalizáljuk. Ezzel a próbával a hibridizációt 50 °C-on végeztük, a biotokat pedig 55 °C-on mostuk, két alkalommal 15-15 percig 1*SSC/0, 1 v% SDS-sel, majd két alkalommal 15-15 percig 0,2*SSC/0,1 v% SDS-sel. Klónozás céljából egy 0,5 kb hosszúságú Sall-Clal-fragmenst választottunk ki, és a fent leírtak szerint klónoztuk. A kiónt pNERG2-nek jelöltük. A pNER-G2 és a pNER-G1 onr-gént hordozó régióit együttesen pBluescriptSK+-vektorba ligáltuk, aminek során egy 1,5 kb hosszúságú NcolClal inszertet hoztunk létre, amely a teljes onr-gént hordozta. Ezt a konstrukciót pNER1-nek neveztük el (1. ábra). A pNER1-gyel transzformált E. coli JM109sejteket tápanyagdús tápoldatban növesztettük egy éjszakán át, a kultúrákból sejtkivonatokat készítettünk, amelyeket PETN-reduktáz-aktivitásra vizsgáltunk. Azt tapasztaltuk, hogy az oldható fehérjemennyiség kb. 15%-át a PETN-reduktáz alkotta.
A PETN-reduktázt kódoló régióból származó DNSfragmenseket a pNER-G1, a pNER-G2 és a pNER1 vektorokból pBluescriptSK+-vektorba klónoztuk, és a vektorszekvencián alapuló láncindítók segítségével szekvenáltuk. Az alkalmazott szekvenálási stratégiát a 2. ábrán mutatjuk be. A szekvenáláshoz használt DNS-t a Quiagen Plasmid Mini Kit (Qiagen Ltd., Dorking, Surrey, UK) alkalmazásával állítottuk elő. A DNS-szekvenálást a Cambridgei Egyetem Biokémiai Tanszéke Molekuláris Megismerési Központja Fehérje és Nukleinsavkémiai Eszköztárának (Protein and Nucleic Acid Chemistry Facility, Cambridge Centre fór Molecular Recognition, Department of Biochemistry, University of Cambridge) igénybevételével, egy Pharmacia ALF DNS-szekvenáló (Pharmacia Biotech, St. Albans, UK) alkalmazásával szintetizáltuk meg. Az onr-gén nukleotidszekvenciája és a PETN-reduktáz származtatott aminosavszekvenciája a 3. ábrán látható.
Alaposabban szemügyre véve az 1. ábrát, látható, hogy mindegyik inszert a pBluescriptSK+-vektor (Stratagene) többszörös klónozóhelyén található. A sötét nyíl jelzi a PETN-reduktázt kódoló onr-gén helyzetét. A pNER1 inszertjét úgy állítottuk elő, hogy a pNERG1 Ncol-Stul-régióját hozzáligáltuk a pNERG2 Stul-Clal-régiójához. A pNER1-beli Ncol-Clalfragmens a pBluescriptSK+ többszörös klónozóhelyének BamHI és Clal helyei közé lett inszertálva.
Amint azt különösen a 2. ábra jól szemlélteti, a szubklónokat pBluescriptSK+-ban készítettük el, és a vektor szekvenciáján alapuló láncindítók segítségével szekvenáltuk meg. A nyilak a szekvenálóreakciókat jelzik. A sötét nyíl jelzi a kódolórégió kezdetét. A szekvenálás során alkalmazott restrikciós hasítóhelyek pozícióinak számát feltüntettük, az 1-es a kódolórégió kezdő ATG-kodonja A-jának felel meg.
A 3. ábrán feltüntettük a nukleotidok számát, a kódolórégió kezdő ATG-kodonja A-ja az 1-es. Az ábrán jelezzük a feltételezett riboszómakötő helyet. Meg kell jegyeznünk, hogy a PETN-reduktáz N-terminális aminosavszekvenciája alapján az E. cloacae PB2-ben a kezdő metionin lehasad. Az aminosavszekvenciát önmagában a 4. ábra mutatja.
A gén előállításának és klónozásának más módjai szakember számára a génszekvencia ismeretében vi8
HU 224 000 Β1 lágosak. így például megfelelő restrikciós enzimeket alkalmazhatunk, hogy a gént szegélyező restrikciós helyeken „elvágjuk” a DNS-t. A gén amplifikálását elvégezhetjük PCR-technikákkal is, a gént szegélyező DNS-szakaszok alapján megfelelő láncindítókat alkalmazva.
5. példa
Teljes sejtek degradációs termékeinek azonosítása
PETN jelenlétében tenyésztett sejtek etil-acetátos kivonatai PETN-et és három metabolitot tartalmaztak (HPLC alapján). A metabolitokat vékonyrétegkromatográfiával választottuk el a PETN-től. Azt tapasztaltuk, hogy az Rrjük alacsonyabb (0,64, 0,53 és 0,23), mint a PETN-é (Rf 0,81), jelezve, hogy az ismeretlen metabolitok polárosabbak, mint a PETN.
Az ismeretlen metabolitok azonosságát elektronbecsapódásos (El) tömegspektrometriával vizsgáltuk. Az
1. metabolit El-tömeg spektruma egy 226 m/z-jű (az m/z az egy töltésre jutó molekulatömeget jelenti) molekulaiont mutatott ki, amely a C5H10N2O8 tapasztalati képletnek felel meg. A tömegspektrum tartalmazott egy fragmens-iont 209 m/z-nél. Erről a metabolitról azt gondoljuk, hogy a pentaeritrit-dinitrát (2,2-bisz[(nitroxi)metil]-1,3-propándiol), a PETN denitrálási terméke.
A 2. metabolit El-tömegspektruma kimutatott egy 224 m/z-jű molekulaiont, ami a C5H8N2O8 tapasztalati képletnek felel meg. A tömegspektrum 207, 170, 141, 99, 76, 74, 158, 46 és 44 m/z-nél tartalmazott fragmens-ionokat. Azt gondoljuk, hogy ez a 3-hidroxi2,2-bisz[(nitroxi)metil]propanal.
A 3. metabolit El-tömegspektruma kimutatott egy 222 m/z-jű molekulaiont, ami a C5H6N2O8 tapasztalati képletnek felel meg. A tömegspektrum 208, 177, 91 m/z-nél tartalmazott fragmens-ionokat. Azt gondoljuk, hogy ez a 2,2-bisz[(nitroxi)metil]propándial. A metabolitok javasolt szerkezete a következő:
HOH2C CH2ONO2 HOH2C CH2ONO2 O2NOH2C CH2OH O2NOH2C CHO
1. metabolit 2. metabolit
OHC CH2ONO2
O2NOH2C CHO
3. metabolit
Az 1. metabolit azonosítását 1H-NMR-rel is elvégeztük 400 Mhz-en. A tiszta PETN 1H-NMRspektruma egy szinglet csúcsot adott 4,77 ppm-nél, amelyik a PETN négy ekvivalens metiléncsoportjának felel meg, míg az ismeretlen metabolit két különálló csúcsot adott 4,77 és 2,08 ppm-nél. Úgy hiszszük, hogy a 2,08 ppm-es csúcs a hidroxilcsoporthoz kapcsolódó metiléncsoportoknak felel meg a javasolt szerkezeti képletben.
A PETN baktériummal végzett degradálása során keletkezett ismeretlen metabolitok (El) tömegspektrometriás és a 1H-NMR-analízise alapját sejthető, hogy PETN-molekulánként legalább két nitrogén felhasználása történt meg. Ezek a metabolitok nem tanúskodnak a harmadik nitrátcsoport eltávolításáról.
6. példa
A PETN-reduktáz reakciótermékeinek azonosítása
Miután PETN-et tisztított PETN-nel és NADPH-val kezeltük, a reakcióelegy etil-acetátos kivonata PETN-et és két metabolitot tartalmazott (HPLC-vel azonosítva). A metabolitokat vékonyréteg-kromatográfiával választottuk el a PETN-től. Azt tapasztaltuk, hogy az Rrjük alacsonyabb (0,78 és 0,64), mint a PETN-é (Rf 0,81),
Az ismeretlen metabolitok azonosságát elektronbecsapódásos (El) tömegspektrometriával vizsgáltuk. Az A metabolit El-tömegspektruma egy 271 m/z-jű molekulaiont mutatott ki, amely a CsHg^O-iQ tapasztalati képletnek felel meg. A tömegspektrum tartalmazott 239 és 207 m/z-jű fragmens-ionokat tartalmazott. Erről a metabolitról azt gondoljuk, hogy a pentaeritrit-trinitrát. A B metabolit El-tömegspektruma és Rrértéke megegyezett a sejtkultúra-felülúszóból izolált 1. metabolitéval (ld. a 2. példát). Ez a metabolit tehát a pentaeritritdinitrátnak (PEDN) felel meg. Úgy tűnik tehát, hogy a PETN-reduktáz reduktívan nitritet szabadít fel a PETN-ből pentaeritrit-trinitrátot majd a PEDN-et képezve, amely utóbbi nem szubsztrátja az enzimnek. Az ezen alkoholokból képződő aldehidek jelenléte a sejtkultúra-felülúszókban (2. példa) a következő lépést katalizáló dehidrogenáz-aktivitású másik enzim jelenlétére enged következtetni.
A PETN-reduktáz specifikus aktivitása a nyerskivonatban kb 0,32 egység/mg volt, ami 9,7 mmol PETN átalakulásának felel meg óránként és a fehérje grammjaiként Ez valószínűleg elegendő arra, hogy számot adjon a PETN specifikus degradációjának a tenyésztett sejtek esetében megfigyelt sebességére, ami 1,03 mmol PETN* (fehérje tömege g-ban)-1h1.
7. példa
PETN-reduktáz enzim alkalmazása PETN koiorimetriás kimutatására 1. módszerek
Ez az alkalmazás azon alapul, hogy a PETNreduktáz enzim PETN-ből nitritet szabadít fel, amelyet Griess-reagens segítségével nyomon követhetünk. Üveg forralóedénybe helyezett szennyezetten talajmintákhoz (John Innes, 2., minden esetben 1 g) ismert koncentrációjú PETN-et (1-500 pg) adtunk HPLCtisztaságú acetonban. A minták mindegyikét gondosan összekevertük, egy vákuumkemencébe helyeztük, és 1 órán át szobahőmérsékleten szárítottuk.
Ezeket a szándékosan szennyezett talajmintákat más, PETN-nel vagy RDX/TNT-vel szennyezett (1 gos) területről gyűjtött talajmintákkal együtt grammonként 1,5 ml acetonnal kezeltük és 10 percig ráztuk. Ezután hagytuk, hogy a talaj a gravitáció hatására leülepedjen, majd a folyadékból 25 μΙ-es mennyiségeket vettünk ki, az alábbi keveréket tartalmazó 5 ml-es Pyrex-csövekhez adtuk hozzá: 12,8 μΙ 7 mg/ml PETNreduktáz, 2 μΙ 20 mM NADPH (enzim-kofaktor) és
220,2 μΙ 50 mM sós foszfátpuffer. Minden mintát összekevertünk, majd 10 percig szobahőmérsékleten inkubáltunk. 200 μΙ térfogatban 1% szulfanilamidot és 2,5% sósavat adtunk minden egyes csőhöz (ezek nitrit9
HU 224 OOO B1 tel diazóniumiont képeznek) és további 2 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk, mielőtt 40 μΙ 0,5%-os vízben oldott N-(1-naftil)-etilén-diamint adtunk volna hozzá, ami PETN jelenléte esetén egy bíborszínű termék keletkezését eredményezi.
Minden mintából 200 μΙ-t vettünk ki, ezeket a mennyiségeket egy mikrotiterlemez mélyedéseiben helyeztük el, majd megmértük a minták abszorbanciáját egy Ceres 900 UV HDi leolvasóval. Azon mintákra kapott értékekből, amely minták ismert PETNkoncentrációjú talajmintákból származtak, a talaj PETN-koncentrációja függvényében felvett standard abszorbanciagörbét lehetett előállítani (5. ábra). Ennek felhasználásával az ismeretlen PETN-mennyiségű, szennyezett talajokból vett minták esetében kapott optikai sűrűségértékeket felhasználhattuk arra, hogy az egyes talajmintákban jelen lévő PETN-szennyezés szintjére jelzést adjunk.
A 2. táblázat, amint azt fel is tüntettük, minták egy sorozatára kapott adatokat mutatja be. Ezek azt mutatják, hogy a leírt vizsgálati eljárás specifikus választ ad a PETN szintjére a talajmintákban, valamint, hogy
PETN távollétében, illetve egyéb robbanószerek jelenlétében (RDX/TNT) nem ad hamis választ, továbbá, hogy a válasz a PETN-reduktáz enzim jelenlétének függvénye.

Claims (19)

1. Izolált pentaeritrit-tetranitrát-reduktáz (PETNreduktáz) enzim, amely pentaeritrit-tetranitrátból (PETN) nitrit eltávolítását katalizálja, és amelynek ami- 40 nosavszekvenciája megegyezik a 4. ábrán megadott szekvenciával vagy az enzim származéka, amely származék PETN-reduktáz-aktivitású és PETN-ből nitrit eltávolítását katalizálja, és amely származékot a 3. ábrán megadott kódolószekvenciával legalább 70%-ban azo- 45 nos nukleinsavszekvencia kódol, és amely a 4. ábrán megadott aminosavszekvenciához képest az alábbiak közül egyet vagy többet tartalmaz: inszerciók, deléciók és szubsztitúciók.
2. Az 1. igénypont szerinti, izolált PETN-reduktáz 50 enzim, amelynek aminosavszekvenciája a 4. ábrán megadott szekvencia.
3. Izolált gén, amely az 1. vagy 2. igénypont szerinti PETN-reduktáz enzimet kódol.
4. A 3. igénypont szerinti, izolált gén, amely a 55
3. ábra szerinti nukleotidszekvenciát tartalmaz, vagy a
3. ábra szerinti kódolószekvenciával legalább 70%ban azonos nukleotidszekvenciát, és amely PETN-ből nitrit eltávolításának katalizálására képes PETNreduktázt kódol. 60
5. A 4. igénypont szerinti, izolált gén, amely a 3. ábra szerinti szekvenciát tartalmaz.
6. DNS-molekula, amely a 4. vagy 5. igénypont szerinti gén nukleotidszekvenciáját tartalmazza.
7. Rekombináns DNS-vektor, amely 4. vagy 5. igénypont szerinti gént tartalmaz.
8. Gazdasejt, amely 4. vagy 5. igénypont szerinti génnel van transzformálva.
9. Gazdasejt, amely 6. igénypont szerinti DNSmolekulával van transzformálva.
10. Gazdasejt, amely 7. igénypont szerinti rekombináns DNS-vektorral van transzformálva.
11. Eljárás 1. vagy 2. igénypont szerinti pentaeritrit-tetranitrát-reduktáz (PETN-reduktáz) enzim vagy annak egy származéka előállítására, azzal jellemezve, hogy a 4. vagy 5. igénypont szerinti génnel gazdasejteket transzformálunk, a transzformált gazdasejteket alkalmas körülmények között tenyésztjük, a PETN-reduktáz enzimet kinyerjük a tápközegből, vagy feltárásuk után a gazdasejtekből.
12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gazdasejtet 7. igénypont szerinti rekombináns DNS-vektorral transzformáljuk.
HU 224 000 Β1
13. Eljárás pentaeritrit-tetranitrát (PETN) kimutatására mintában, azzal jellemezve, hogy a mintát egy olyan reakció hatásának tesszük ki, amely során PETN-ből nitrit távozik el, a reakciót nikotinamidadenin-dinukleotid-foszfát redukált formája (NADPH) és 1. igénypont szerinti PETN-reduktáz enzim jelenlétében végezzük NADP és a nitrit keletkezéséig, és kimutatjuk a reakció megtörténtét.
14. A13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a reakció során felszabadult NADP-t mutatjuk ki.
15. Bioszenzor pentaeritrit-tetranitrát (PETN), glicerin-trinitrát (GTN), és/vagy etilénglikol-dinitrát (EGDN) kimutatására egy mintában, amely a minta 1. igénypont szerinti PETN-reduktáz enzimmel NADPH jelenlétében történő érintkeztetésére szolgáló eszközt, és a PETN, GTN és/vagy EDGN - amennyiben bármelyik jelen van a mintában - PETN-reduktáz enzim által katalizált reakciója végbemenetelének kimutatására szolgáló eszközt tartalmaz.
16. Eljárás PETN-nel, GTN-nel vagy EGDN-nel szennyezett környezet biológiai helyreállító kezelésére, azzal jellemezve, hogy a szennyezett környezethez megfelelő mennyiségű 1. igénypont szerinti PETN-reduktáz enzimet adunk, és a keveréket olyan körülmények között tartjuk, amely megfelel a PETN, GTN, illetve az EGDN az enzim általi lebontásának, ezáltal az anyagban jelen lévő PETN, a GTN és/vagy az EGDN mennyiségét csökkentjük.
17. NCIMB-40 718 hozzáférési számon letétbe helyezett és „PB2”-nek jelölt Enterobacter cloacae baktériumtörzs, továbbá annak mutánsai és variánsai, amelyek képesek NADPH jelenlétében PETN-et lebontó enzimaktivitás termelésére.
18. Eljárás 1. igénypont szerinti PETN-reduktáz enzim előállítására, azzal jellemezve, hogy 17. igénypont szerinti Enterobacter cloacae sp. NCIMB-40 718-at vagy annak mutánsát, vagy variánsát tenyésztjük PETN, mint nitrogénforrás jelenlétében 20 °C és 40 °C közötti hőmérsékleten, a sejteket feltárjuk, majd a PETN-reduktáz enzimet a feltárt sejtekből kinyerjük.
19. Eljárás PETN-nel szennyezett környezet biológiai helyreállító kezelésére, azzal jellemezve, hogy a környezetet 17. igénypont szerinti Enterobacter cloacae bakteriális izolátummal oltjuk be, ezáltal a környezetben jelen lévő PETN mennyiségét csökkentjük.
HU9901395A 1995-07-11 1996-07-08 Robbanóanyagok kimutatása és biodegradálása HU224000B1 (hu)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB9514138A GB2303136A (en) 1995-07-11 1995-07-11 Pentaerythritol tetranitrate reductase enzyme
GB9607220A GB2311784A (en) 1996-04-04 1996-04-04 Pentaerythritoltetranitrate(PETN) reductase and the expression thereof
PCT/GB1996/001629 WO1997003201A1 (en) 1995-07-11 1996-07-08 Detection and biodegradation of explosives

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HUP9901395A2 HUP9901395A2 (hu) 1999-08-30
HUP9901395A3 HUP9901395A3 (en) 2001-10-29
HU224000B1 true HU224000B1 (hu) 2005-04-28

Family

ID=26307371

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9901395A HU224000B1 (hu) 1995-07-11 1996-07-08 Robbanóanyagok kimutatása és biodegradálása

Country Status (12)

Country Link
US (1) US5928859A (hu)
EP (1) EP0837941B1 (hu)
AU (1) AU6365296A (hu)
CA (1) CA2226729C (hu)
CZ (1) CZ295656B6 (hu)
DE (1) DE69626646T2 (hu)
ES (1) ES2189878T3 (hu)
HU (1) HU224000B1 (hu)
IL (1) IL122801A (hu)
NO (1) NO324210B1 (hu)
PL (1) PL188502B1 (hu)
WO (1) WO1997003201A1 (hu)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6334395B1 (en) * 1995-11-17 2002-01-01 The Ensign-Bickford Company Methods, apparatus, and systems for accelerated bioremediation of explosives
US6120627A (en) 1995-11-17 2000-09-19 The Ensign-Bickford Company Explosive with bioremediating capacity
GB2332432A (en) * 1997-12-19 1999-06-23 Secr Defence Biodegradation of Trinitrotoluene (TNT)
GB0328784D0 (en) * 2003-12-11 2004-01-14 Univ Wales Bangor Improvements in & relating to biosensors
DE102005007724A1 (de) 2005-02-18 2006-08-31 Heinrich Meurer Luftgestütztes Verfahren zur Exploration von Kohlenwasserstoffvorkommen
DE102005007723A1 (de) 2005-02-18 2006-08-24 Heinrich Meurer Luftgestütztes Verfahren zur Detektion von Landminen
US7673551B2 (en) 2007-08-15 2010-03-09 Heinrich Meurer Aerial-supported procedure for the detection of landmines
US7528949B2 (en) 2007-08-15 2009-05-05 Heinrich Meurer Aerial-supported procedure for exploration of hydrocarbon deposits
US8754284B2 (en) * 2008-02-01 2014-06-17 Orica Explosives Technology Pty Ltd Further improved blasting method
PL2305624T3 (pl) 2009-10-01 2018-05-30 Maxamcorp Holding, S.L. Samodegradowalne urządzenie wybuchowe
US8329455B2 (en) 2011-07-08 2012-12-11 Aikan North America, Inc. Systems and methods for digestion of solid waste
WO2019129506A1 (en) * 2017-12-31 2019-07-04 Dsm Ip Assets B.V. Denitrifying enzymes
CN113418940B (zh) * 2021-06-24 2023-03-14 电子科技大学 一种基于x射线示踪颗粒的检测方法及检测装置

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5215919A (en) * 1991-02-25 1993-06-01 Takeda Chemical Industries, Ltd. Process for producing optically active 2-hydroxycycloalkanecarboxylic acid esters using microbially derived reductase
EP0511729B1 (en) * 1991-03-20 1996-05-15 Thermedics Detection Inc. Detection method for checking surfaces for specific compounds
AU6490494A (en) * 1993-03-22 1994-10-11 Utah State University Foundation Methods for the biodegradation of environmental pollutants
GB9410805D0 (en) * 1994-05-28 1994-07-20 British Nuclear Fuels Plc Biosensors

Also Published As

Publication number Publication date
EP0837941A1 (en) 1998-04-29
PL188502B1 (pl) 2005-02-28
NO980107L (no) 1998-03-11
CZ295656B6 (cs) 2005-09-14
PL324481A1 (en) 1998-05-25
NO324210B1 (no) 2007-09-10
NO980107D0 (no) 1998-01-09
AU6365296A (en) 1997-02-10
EP0837941B1 (en) 2003-03-12
ES2189878T3 (es) 2003-07-16
DE69626646T2 (de) 2003-12-18
IL122801A (en) 2002-08-14
DE69626646D1 (de) 2003-04-17
HUP9901395A3 (en) 2001-10-29
CA2226729A1 (en) 1997-01-30
WO1997003201A1 (en) 1997-01-30
US5928859A (en) 1999-07-27
CA2226729C (en) 2008-05-13
IL122801A0 (en) 1998-08-16
HUP9901395A2 (hu) 1999-08-30
CZ6698A3 (cs) 1998-08-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Harms et al. S-formylglutathione hydrolase of Paracoccus denitrificans is homologous to human esterase D: a universal pathway for formaldehyde detoxification?
CN101535476B (zh) 修饰型黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶
Snape et al. Purification, properties, and sequence of glycerol trinitrate reductase from Agrobacterium radiobacter
Eulberg et al. Characterization of catechol catabolic genes from Rhodococcus erythropolis 1CP
CA2269640C (en) Enzymatic cofactor cycling using soluble pyridine nucleotide transhydrogenase
SK105699A3 (en) Novel carbonyl reductase, gene that encodes the same, and method of utilizing these
CN100413967C (zh) (r)-2-辛醇脱氢酶,产生此酶的方法,编码此酶的dna,以及使用此酶生产醇类的方法
HU224000B1 (hu) Robbanóanyagok kimutatása és biodegradálása
EP0373181B1 (en) Novel coenzyme independent l-sorbosone dehydrogenase
CA2253021C (en) New mutants of formate dehydrogenase from candida boidinii, new gene sequences encoding these and use of the new formate dehydrogenases
EP0920493B1 (en) Biodegradation of explosives
JPH0665300B2 (ja) フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ
US20040115691A1 (en) Mutants of enzymes and methods for their use
Daussmann et al. Purification and Characterization of an Alcohol: N, N‐dimethyl‐4‐nitrosoaniline Oxidoreductase from the Methanogen Methanosarcina Barkeri DSM 804 Strain Fusaro
JP2002017351A (ja) ホスホヘキシュロイソメラーゼ及びその遺伝子
JP4036667B2 (ja) 新規グルコース脱水素酵素及びそれをコードする遺伝子
JPWO2001048216A1 (ja) Ｌ−ピペコリン酸の生物学的な製造方法
KR20020056894A (ko) 신규 카르보닐 환원효소, 그의 유전자 및 그의 이용 방법
GB2303136A (en) Pentaerythritol tetranitrate reductase enzyme
JP4415247B2 (ja) 新規なグリセロールキナーゼ、該遺伝子及び該遺伝子を用いたグリセロールキナーゼの製造法
EP0322666A1 (en) Enzyme and process for its manufacture
JP3018092B2 (ja) 放線菌由来のサルコシンオキシダーゼの遺伝子およびその用途
US7618800B2 (en) Glycerol kinase, which has high resistance against preservative
JP4066203B2 (ja) 新規なクレアチニンアミドヒドロラーゼ
GB2311784A (en) Pentaerythritoltetranitrate(PETN) reductase and the expression thereof

Legal Events

Date Code Title Description
HFG4 Patent granted, date of granting

Effective date: 20050302

MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees