HU217890B - Marek-féle betegség vírus elleni vakcina - Google Patents

Abstract

A találmány tárgyát új, Marek-féle betegségvírus-(MDV) törzs ésbaromfikban a Marek-féle betegség (MD) ellen védettséget létrehozó, azúj törzset tartalmazó vakcina képezi. A találmány tárgykörébetartoznak továbbá az olyan bivalens vagy polivalens vakcinák is,melyek ezenkívül a Marek-féle betegséget okozó víruscsoportba tartozóegyéb vírusokat, például HVT-t is tartalmaznak. ŕ

Description

A találmány tárgyát új, Marek-féíe betegségvírus(MDV) törzs és baromfikban Marek-féíe betegség (MD) ellen védettséget létrehozó, az új törzset tartalmazó vakcina képezi.

A Marek-féle betegség (MD) a házibaromfiak rosszindulatú limfoproliferatív elváltozással járó betegsége, melyet egy herpeszvíras, a Marek-féle betegség vírusa (MDV) okoz. Az MD általánosan elterjedt betegség, világszerte előfordul a baromfitermelő országokban. A kórokozó vírus nagymértékben fertőző, és könnyen terjed a fogékony madarakra. Intenzív termelési rendszerben nevelt csirkéknél az MD elkerülhetetlen veszteségeket okoz. Az MD körülbelül 6 hetes kortól érinti a csirkéket, leggyakoribb az előfordulása

12—24 hetes kor között.

Klinikailag az MD három formája ismeretes; a klasszikus MD, a heveny MD és az átmeneti bénulás.

A klasszikus MD-t a limfoid beszűrődés és a mielín hüvely pusztulása okozta perifériás idegmegvastagodás jellemzi, és fő klinikai tünete a bénulás. Az elhullás mértéke változó, de általában 10-15% alatt marad.

A heveny formában a zsigeri szervekben gócos és diffúz lirafomatózus daganatok találhatók. Az MD ezen formájában az elhullás általában magasabb, mint a klasszikus formában, Vakcinázatlan állományokban az elhullás gyakran eléri a 10-30%-ot, és számolhatunk az állomány 70%-át érintő járvány kitörésével. A kórbonctani leletek mind a klasszikus, mind a heveny formában lényegében hasonlóak, maíignusan transzformált T-limfoblasztok proliferálnak és szűrik át a normál szöveteket, a klasszikus formában a perifériás idegeket, a heveny formában a zsigeri szerveket.

Az MDV-ről kimutatták továbbá, hogy felelős a fiatal csirkékben fellépő hirtelen bénulással járó agyvelőgyulladásért.

Csirkékben három, szeroíógiailag eltérő MD-vel kapcsolatos vírust mutattak ki:

I. típus: a csirkékben a betegség kialakulásáért felelős patogén és daganatképező formák, ide tartoznak a magas és alacsony viruíenciával rendelkező törzsek, valamint az ezekből származó gyengített, nem patogén törzsek;

II. típus: az MDV természetben előforduló, nem patogén törzsei;

HL típus: a pulykák herpeszvírusa (HVT), amely csirkékben nem patogén.

Napjainkban a gyakorlatban Marek-féle betegség ellen alkalmazható több vakcinatípus használatos. A legelső MD-vakcinák a Hí. szerotípushoz tartozó vírust tartalmaztak, melyet először pulykákból izoláltak [Witter és munkatársai: Am. J. Vet. Rés., 31, 525 (1970)]. A HVT-t kiterjedten használják MD elleni vakcinaként. Általában mint sejthez kötött készítményt használják, de a fertőzött sejtekből jelentős mennyiségű sejtmentes vírust lehet kivonni, sejtmentes vakcinát ír le az US 3 647 861 számú szabadalmi leírás.

A Π. szerotípusú MD-vírusok természetben előforduló nem onkogén vírusok, melyek vakcinázott csirkékben nem hoznak létre tumort. Ezeknél a vírusoknál tehát nincs szükség sorozatos passzálások révén létrehozott mesterséges attenuálásra, és miután ezek természetes állapotban vannak, nem képesek virulens formává revertálni. Az SB-l-törzset (US 4 160 024 számú szabadalmi leírás) eredetileg sejthez kötött készítményként adagolták, A gyakorlatban ez azt jelenti, hogy az említett vakcinák tárolásának és szállításának körülbelül -196 °C-on, folyékony nitrogénben kell történnie. Úgy találták, hogy ez a II. szerotípusú törzs önmagában gyenge védettséget hoz létre, ezért rendszerint HVTvel együtt, bivaíens vakcinaként alkalmazzák, mivel a két vírus együtt jobb védettséget hoz létre, mint bármelyik víruskomponens külön-külön. Ezt a jelenséget nevezzük „protektív szinergizmusnak”.

Az EP 90 314297 számú szabadalmi bejelentés SB-1 sejímentes formáját tartalmazó vakcinát ír le. Az SB-1-törzs még sejtmentes formában sesn hoz létre elegendő védettséget, ezért HVT-vei együtt adagolják.

Napjainkban több gyengített, I. szerotípusú MDV-t tartalmazó vakcinát fejlesztettek ki és alkalmaznak. Például a WO 85/04588 számon közzétett nemzetközi szabadalmi bejelentés a CVI-988 jelzésű MD-vírusból származó attenuált törzset ismerteti. Az előbbi leírásban szereplő valamennyi vakeinakészítmény sejthez kötött formában tartalmazza a vírust.

A 7 723 037 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés egy gyengített revertáns I. szerotípusba tartozó MD-vakcinát ír le. A fenti vakcinában alkalmazott törzs nem termel sejtmentes vírust.

Mostanáig tehát valamennyi I. szerotípusba tartozó vakcinát sejthez kötött készítményként kellett adagolni, ami azzal a hátránnyal járt, hogy a vakcinát folyékony nitrogénben kellett tárolni és szállítani. Amennyiben a vakcinát nem tárolják és kezelik megfelelő módon, az az MD-vírusok életképességének csökkenését, következésképp a vakcinázás sikertelenségét okozza. Különösen olyan országokban, ahol a folyékony nitrogénben való tárolás nincs gyakorlatban, vagy a folyékony nitrogén nem áll rendelkezésre, a sejthez kötött MD-vakcinák nem használhatók.

Ráadásul, a sejthez kötött készítményben szuszpendált MDV-tartalmú részecskék hajlamosak vakcinakicsapódásra, így a szuszpenziót a beadás előtt homogenizálni kell. A nem megfelelő homogenizálás a vakcina helytelen adagolását és a vakcinázás sikertelenségét eredményezi. Ezenfelül, az említett vakcina szigorúan sejthez kötött természete felelős a vakcinák fizikai behatásokkal szembeni érzékenységéért. A fertőzött sejtek nem megfelelő összegyűjtési és fagyasztást eljárások által okozott károsodása, valamint az ampullák helytelen olvasztása és a keltetőkben a vakcina helytelen kezelése a sejtek károsodását és pusztulását, következésképp a vakcina literének csökkenését eredményezik.

MDA (matemális/anyai eredetű ellenanyagok) minden MD-vírusszerotípus ellen gyakoriak a forgalmazott csirkékben, a tenyészetek MD-vírusokkal való természetes fertőződésének és/vagy a tenyészetek I., II. és III. szerotípusú vírasokkal való vakc Ínázásának köszönhetően, A homológ MDA kedvezőtlen hatása a vakc úrázásra közismert. Az ilyen matemális ellenanyag bekerül

HU 217 890 Β az utódokba, és csökkenti a későbbi vakcinázás hatékonyságát. Míg az I. és II. szerotípusokkaí szemben a matemáíis ellenanyagok termelődését nem tudjuk szabályozni, a Ili. szerotípussal, azaz HVT-vel szemben termelődő ellenanyagok szabályozása lehetséges oly módon, hogy a tény észállományokat HVT-rnentes MDVvakcinával yakeinázznk, hogy az utódok HVT-tartalmú monovalens, bivalens vagy polivalens vakcinával vakcinázva inkább védetté tehetők legyenek. Ezt a vakcinázásí stratégiát nevezik váltakozó generációs vakcinázásnak. Azokban az országokban, ahol a folyékony nitrogén tárolása és szállítása nem megoldott, nem lehet ezt a váltakozó generációs stratégiát alkalmazni, mivel az egyetlen rendelkezésre álló, fagyasztva szárított MDVvakcina HVT-t tartalmaz. Szükség van tehát fagyasztva szárított I. szerotípusú MDV-vakcinára.

Az I, szerotípusú MD-vírusokkal végzett korábbi tanulmányok azt mutatták, hogy a plakk-képző egységekben (pfu) megadott sejtmentes vírus mennyisége nem volt elegendő titerű vakcinázás céljára történő alkalmazásra [US 4 895 718 számú szabadalmi leírás; Witter, R. L. és munkatársai: Avian Diseases, 31, 829 (1987); Powell, P. C.: World’s Poultry Science Journal, 42, 205 (1986); Scbat, K. A.: Interaews, 3, 13 (1989)1.

Egy új, I. szerotípusú MDV-törzset találtunk azonban, amely csirkesejttenyészetben végzett sorozatos passzálásokkaí történő gyengítést követően nagy mennyiségű sejtmentes vírust eredményez, és nagyobb mértékű védettséget hoz létre, mint bármely eddig használt I. szerotípusú MDV-vakcina. Lehetővé vált tehát fagyasztva szárított I. szerotípusú MDV-vakcina előállítása. Ez a törzs még sejthez kötött formában is nagyobb mértékű védettséget hoz létre, mint a jelenleg rendelkezésre álló, legjobb I. szerotípusú MDV-vakcina.

A találmány tárgyát tehát, egyrészt új, gyengített Marek-féle betegségvirustörzs képezi. A fertőzött sejtekből ultrahangkezeléssel kiszabadított I. szerotípusú vírus a sejtmentes vírustiter legfeljebb 100-szoros csökkenését eredményezi, összehasonlítva a sejthez kötött vrrustiterrel.

A gyengített törzs előnyösen a sejtmentes vírustiter legfeljebb 50-szeres csökkenését, előnyösebben 10-szeres csökkenését hozza létre. Nyilvánvalóan kívánatos, hogy az ultrahangkezelésí követően a sejtmentes vírustiter a sejthez kötött viríts titeréhez képest ne csökkenjen.

A találmány szerinti gyengített sejtmentes I. szerotipusú MDV-törzset a Budapesti Egyezmény alapján V94062211 nyilvántartási szám alatt 1994. június 22-én letétbe helyeztük a „European Collection of Animál Cell Cultures” intézetben (Porton Down, Anglia).

A találmány szerinti I. szerotípusú MDV-törzset, melyet MR22-törzsnek neveztünk, 1971-ben mezei tenyészetből származó fehérvérsejtréteg („bufíy coat”) sejtekből izoláltuk csírkeembrióvese-sejttenyészeten, Ezután a törzset SPF (specifikus kórokozóktól mentes) tojásokból előállított csirkeembríó-fibrobíaszt (CEF) sejttenyészeten passzáltuk 18-szor. Ezt az izolátumot másodlagos CEF-sejteken még kétszer tovább passzáltuk, majd a fertőzött sejtek S.P.G.A. stabilizátor jelenlétében végzett ultrahangkezelésével sejtmentes készítményt állítottunk eíő [Bovamik és munkatársai: J. Bach, 59, 509 (1950)].

A fentiek szerint előállított MR22-törzsről kimutattuk, hogy az I. szerotípusú MD-vírus, annak alapján, hogy 2092 és 4859 jelzésű monoklonális ellenanyagokkal reagált, de nem reagált a II. szerotípusú és III. szerotípusú vírussal reagáló monoklonális ellenanyagokkal. Ezeket az ellenanyagokat Lee, L, F. [J. Immunology, 130, 1003 (1983)], valamint Siíva és Lee által leírtak szerint [Virology, 136, 307 (1984)1 állítottuk elő és alkalmaztuk. Az 1. táblázat különböző MD V-törzsek/szerotípusok fluoreszcens ellenanyag-vizsgálatának eredményét mutatja fajlagos monoklonális ellenanyagokkal szemben.

7. táblázat

MD-törzsek reakció mintája négy monoklonális ellenanyaggal szemben (fluoreszcens ellenanyag-vizsgálat eredményei )

Vírus	Szero·· típus	Monoklonális ellenanyagok
H19	2BN	Y5.9	L78.2
HPRS 16	1	V 4-	4-4-	...	...
VICTORIA	1	4-	-	-	-
RISMAVAC	1	-	-	-	-
CLONE C	1	-	-	-	-
MR22	1	4-	-	-	-
LPSB1	2	-	-	4- 4-	-
HP SB1	2	-	-	4- 4-	(+/-)
HVT/PB1	3	-	-	-	4. .4

A 2. táblázat azt mutatja, hogy az SPGA-stabilizátor jelenlétében ultrahanggal kezelt fertőzött esírkeembrió-fibroblasztokból nyert sejtmentes MR22-vírus mennyisége lényegesen nagyobb, mint más I. szerotípusú törzsekből nyert.

2. táblázat

Törzs	Szeratípas	Sejthez kötött titer (pfu/m!)	Sejtmentes titer (piu/ml)	Különbség
HPRS-16	1	10«	<102	>10 000:1
Ruspens (CV1988)		10«	102	10 000:1
MR22	1	I05-7	ÍO4·7	10:1

Az MR22-törzset csirkében tovább passzáltuk, snajd a vírust izoláltunk, ezután kétszer CEF-ben, majd sejtmentes vírusként csirkében passzáltuk. Az újbóli izolálást követően a vírust további hat alkalommal CEF-ben passzáltuk (=vírustörzstenyészet, MSV). A vírusnak azt a képességét, hogy nagy mennyiségben sejtmentes vírusként szabadul fel, több alkalommal, külön kísérletek során vizsgáltuk.

HU 217 890 Β

3. táblázat.

Passzálási szint	Kapott vímstiter (pfu/mí)	Különbség
sejthez kötött	sejtmentes
MSV=2	K)6,3	ÍÍR8	32:!
MSV-1-6	1Q6.9	105.4	32:1
MSV+6	106,8	10«,í	5:1
MSV+6	105,6	IO4,7	8:1

Egy további, nagy mennyiségű sejtmentes vírust termelő I. szerotípusú MDV-törzs a Victoria-10-törzs, melyet a nyolcvanas évek közepén egészséges állományból izoláltak Angliában. A vírust tízszer csirkevesesejteken (CK), majd 18-szor CEF-sej teken passzáíták, A sejtmentes vírustermelődés hatásfokának fejlődését az alábbi táblázatban foglaltuk össze.

4. táblázat

Passzálási szint	Kapott vímstiter (pfii/mí)	Különbség
sejthez kötött	sejtmentes
CK! 0CEF6	1 ()5,9	1()3,4	316:1
CK10CEF1!	10«,’-	IO5·?·	10: í
CK10CEF18	105,6	104,6	10:1

Az MR22, Victoria-10 vagy bármely más I. szerotípusú, nagyobb mennyiségben sejtmentes vírust termelő MDV-törzs előnye az, hogy lehetővé válik fagyasztva szárított vakcinakészítmények előállítása, ami kiküszöböli a vakcina folyékony nitrogénben való tárolásának és szállításának szükségességét. Mostanáig nem sikerült előállítani I, szerotípusú fagyasztva szárított MDV-vakcinát.

A vakcina előállítása céljára az MR22-törzset oly módon szaporítjuk fel, hogy CEF-sejtekkel beoltott görgő tenyészetet a fentiek szerint kapott, sejthez kötött vagy sejtmentes vírussal oltunk be. Néhány napos inkubálást követően a felül úszó táp folyadékot leöntjük, és a sejteket tripszin-verzén keverékkel eltávolítjuk, majd centrifugálással ülepítjük és a feíüíúszói leöntjük.

Abból a célból, hogy sejtmentes vírust kapjunk, az ülepített sejteket egy pufferben, például foszfátpufferes fiziológiás sőoldatban (BPS) vagy előnyösen egy stabilizátort tartalmazó tápfolyadékban, legelőnyösebben SPGA-t tartalmazó tápfolyadékban szuszpendáljuk.

A sejteket különféle módszerekkel roncsolhatjuk, például ultrahangkezeléssel vagy fagyasztás és olvasztás váltogatásával. Ép sejtek jelenlétet hemocitométerben történő vizsgálattal állapíthatjuk meg. Az ultrahanggal kezelt vagy gyorsan lefagyasztott készítményt ampullákba tölthetjük és - kívánt esetben EDTA jelenlétében --- fagyasztva száríthatjuk. Optimális esetben a fagyasztva szárítást megelőzően a sejttörmeíéket szűréssel vagy centrifugálással eltávolítjuk.

A fenti ismertetett eljárással nyert, sejtmentes I. szerotípusú MDV-t élő vagy inaktivált vírus formájában vakcinákhoz adhatjuk.

Az élő vírust tartalmazó vakcinát előállíthatjuk és forgalmazhatjuk szuszpenzió formájában vagy liofilizálva.

A liofilizált vakcinák előnyösen egy vagy több stabilizátort tartalmaznak. Megfelelő stabiíizátorok például az SPGA, szénhidrátok, például szorbit, mannit, keményítő, dextrán vagy glükóz; proteinek, például albumin vagy kazein vagy ezek lebontási termékei; pufferek, mint például alkálifém-foszfátok. Kívánt esetben egy vagy több adjuváns hatású összetevő is hozzáadható. Erre a célra alkalmas vegyületek például az E-vitaminacetát olaj/víz emulziója, alumínium-hidroxid, -foszfát vagy -oxid, ásványi olaj (mint például Bayol F® és Marcol-52®), valamint szapontnok.

A találmány szerinti I. szerotípusú MDV-törzset, különösen az MR22-törzset alkalmazhatjuk sejthez kötött formában MDV-vakcina aktív összetevőjeként. Az ilyen vakcinákat szokásos eljárásokkal állíthatjuk elő, élő vagy inaktivált formában.

Az MD-vírusok inaktiválásának célja, hogy megszüntessük a vírusok szaporodását. Általánosságban, ez kémiai vagy fizikai úton érhető el. A vírusok kémiai inaktiválását végezhetjük például a vírusok enzimekkel, formaldehiddel, béta-propiolaktonnal, etilen-iminnel vagy ezek származékával, organikus oldószerrel (mint Tween®-nel, Triton®-nal, nátáurn-dezoxikoláttaí, szulfobetainnal vagy eetil-trimetil-ammóniumsókkal) történő kezelésével. Amennyiben szükséges, az inaktiváló komponenst utólag neutralizáljuk; a formaldehiddel inaktivált anyag például tíoszuífáttaí neutralizálható. Fizikai inaktiválást előnyösen úgy hozhatunk létre, hogy a vírusokat nagy energiájú sugárzásnak tesszük ki, mint például az UV-fény, röntgensugárzás vagy gamma-sugárzás. Ha kívánt, a kezelés után a pH visszaállítható 7 körüli értékre.

Rendszerint egy adjuvánst (például a fent említetteket) és kívánt esetben egy vagy több emulgeálószer! (mint Tween®-t és Span®-t) is adunk az inaktivált vírushoz.

A vakcinát a víruskomponens hatásos dózisában adagoljuk, például az immunizáló sejtmentes vírusnak olyan mennyiségét adagoljuk, amely a virulens MDvírussal való fertőzéssel szemben immunitást hoz létre a csirkében. Immunitásként a védelemnek azt az indukált szintjét tekintjük, amely a csirkepopulációban a vakcinázást követően szignifikánsan magasabb, mint a nem vakcinázott csoport esetén.

Élő vakcináknál a vírus dózisa 1-6 fog pfú/csirke.

A találmány szerinti élő vakcinát tipikusan legalább 2,2 lóg pfu sejtmentesvirus-dózisban, még előnyösebben legalább 2,7 lóg pfu dózisban, legelőnyösebben legalább 3,2 lóg pfu dózisban adagoljuk.

Természetes úton (aeroszollal, szem- és orrcseppel) történő adagolás esetén az adagolható dózis 10⁶-10^? pfú/csirke.

Inaktivált vakcinák esetében az adagolandó vakcina madaranként 3-7 lóg pfu-nak megfelelő, előnyösen 4-6 lóg pfu-nak megfelelő antigént tartalmaz.

A találmány szerinti vakcinákat magas titerben adagolhatjuk aeroszolként, szemcseppként, orrcseppként,

HU 217 890 Β szájon át (például ivóvízzel), vagy izomba, bőr alá, vagy a tojásba oltva, a csirke immunkompetenciájának kialakulását követően bármely életkorban. A vakcinát általában 24-48 órával a kikelés után adagoljuk a csirkének.

A találmány tárgyát képezi továbbá sejtmentes,

1. szerotípusú MDV és sejtmentes HVT kombinációját tartalmazó bivaíens vakcina. Meglepő módon azt találtuk, hogy a sejtmentes, I. szerotípusú MDV a megnövelt passzálási fok ellenére képes a HVT hatékonyságának fokozására.

Közelebbről, az I. szerotípusú MR22-törzsből származó, sejtmentes MDV-t alkalmaztuk sejtmentes HVT-vei kombinálva. A találmány szerinti vakcinához adott HVT-vírus bármely rendelkezésre álló törzs lehet, például az FC12ó-törzs vagy a THV PB 1-törzs (kereskedelmileg hozzáférhető az Intervet Inc.-tői). Optimális esetben a HVT-vírus egy másik baromfi-kórokozóból származó antigént kódoló idegen gént is tartalmazhat a vírusgenomba inszertálva, ily módon poíivalens vakcinát kapunk.

A találmány tárgyát képezi továbbá sejtmentes,

I. szerotípusú MDV és sejtmentes, II. szerotípusú MDV kombinációját tartalmazó bivaíens vakcina, vagy az előbbi és sejtmentes, II. szerotípusú MDV, valamint sejtmentes HVT kombinációját tartalmazó trivalens vakcina. II. szerotípusú MDV-törzsként előnyösen az SB-1-törzset vagy a HPRS Β-24-törzsei alkalmazzuk. A II. szerotípusú MDV-törzset szintén módosíthatjuk géntechnikai úton úgy, hogy az egy másik baromfi-kórokozóból származó antigént tartalmazzon.

A találmány tárgyát képezik továbbá olyan kombinációs vakcinák, melyek a sejtmentes, I. szerotípusú MD-vírus mellett baromfikat fertőző egyéb kórokozóik) elleni vakcíná(ka)t is tartalmaznak. A sejtmentes,

I. szerotípusú MDV-t tartalmazó kombinációs vakcina további vakcinavírusként az alábbiak közül valamelyiket tartalmazhatja: baromfipestis- (Newcastíe Disease) vírus (NDV), a fertőző légcsőhurut vírusa (IBV) és a fertőző burzabetegség vírusa (IBDV).

A találmány szerinti megoldást az alábbi példákkal kívánjuk szemléltetni.

1. példa

A) Az I-es szerotípusú MR22 MD-vírus passzálása

Az MR22-törzs csírkeembrióvese-sejttenyészeten történő első izolálását követően, azt csirke embrió fibroblaszt- (CEF) sejttenyészeten passzáltuk.

cm átmérőjű Falcon típusú Petri-csészékben tenyésztett 24 órás SPF eredetű CEF-sejttenyészetet (1,5 χ 10 CEF/edény) sejthez kötött MR22-vírussal oltottunk be.

A lemezeken található 5 ml szövettenyésztő tápfolyadékot legalább 100 pfú-t tartalmazó, 0,1 ml térfoga tú inokulummal oltottuk be. A sejthez kötött vírusok leülepedtek az egyrétegű sejttenyészetre, és fertőzték a sejteket.

Miután a sejteket 5 napig, 38,5 °C-on, 5% CO₂-t tartalmazó atmoszférában inkubáltuk, a sejteket az alábbi módon eltávolítottuk az edényekről:

1. A tápfoíyadékot leöntöttük.

2. Abból a célból, hogy a sej teknek a Petri-csészékhez való tapadását fellazítsuk, a sejtekhez tripszin-verzén PBS keveréket adtunk.

3. Mielőtt a sejtek leváltak a Petri-csészérőí, a tripszin-verzén PBS keveréket leöntöttük.

4. A sejteket a növekedést elősegítő tápfolyadékkal lemostuk az edényekről.

A 4. lépésben kapott sejthez kötött vírusokat tartalmazó szuszpenzióí használtuk inokulumként a CEFsejteken végzett következő passzáíáshoz. A vírusokat a fentiekben ismertetettek szerint 18-szor passzáltuk.

B) A sejtmentes, I-es szerotípusú

MR22 MD- vakcina előállítása

Két, egyenként 200x10 CEF-sejttel beoltott görgő tenyészet (1750 cm^{1 2 *}) tápfolyadékát 24 órás inkubálást követően a fent leírt módon kapott, körülbelül 10 pfu/ml fiíerrel rendelkező, 1 ml térfogatú sejthez kötött MR22vírustörzstenyészettel fertőztük.

További 5 napos inkubálást követően a télül úszó tápfoíyadékot leöntöttük, és a sejteket tripszin-verzén keverékkel eltávolítottuk. A sejteket centriíúgáíássaí ülepítettük, a felülúszót leöntöttük, és a sejteket elkevertük 20 ml SPGA stabilizátorban, majd 20 másodpercig ultrahanggal kezeltük.

Az ultrahanggal kezelt készítményt 1 ml-es adagokban ampullákba töltöttük, és fagyasztva szárítottuk. Fagyasztva szárítást megelőző titer: 10⁴>⁷ pfu/ml. Fagyasztva szárítást követő titer: 10⁴>^{5 *} pfu/ml.

2. példa

A sejtmentes Marek-féle betegség-vírusvakcinák hatékonyságának összehasonlítása.

Egynapos korú SPF csirkéket 30 csirkét tartalmazó csoportokra osztottunk, a csirkéket negatív nyomású izolátorba helyeztük, és mindegyik csoportot az alábbi vakcinák vagy kombinációs vakcinák közül valamelyikkel vakcináztuk, 0,1 ml'csirke dózissal, izomba adva:

A) SB1 (sejtmentes, II. szerotípusú MR30-vakcinatörzs, Intervet, Boxmeer, Hollandia) 200 pfu/csirke dózisban;

B) MR22 (sejtmentes, II. szerotípusú vakcina) 200 pfu/csirke dózisban;

C) HVT (sejtmentes III. szerotípusú PB--1-törzs, Interveí) 1000 pfu/csirke dózisban, valamint SB1 (sejtmentes, II. szerotípusú MR30-vakcmatörzs, úttervet) 200 pfu/csirke dózisban;

D) HVT (sejtmentes, III. szerotípusú PB-1-törzs, Intervet) 1000 pfu/csirke dózisban, valamint MR22 200 pfu/csirke dózisban.

A vakcinázást követő 7. napon valamennyi csoportot, valamint másik 30 SPF-csirkéből álló csoportot virulens RB1B Marek-féle betegségvírussal kísérletesen fertőztünk 250 pfu/csirke dózissal, 0,1 ml/csirke térfogatban, izomba adva. A csirkéket a kísérlet végéig, azaz 91 napig megfigyelés alatt tartottuk. Mindegyik elpusztult csirkét felboncoítuk, és megállapítottuk az elhullás okát. A kísérlet végén valamennyi megmaradt csirkét ieöítük és felboncoítuk,

A kísérlet végére MD következtében elhullott csirkék száma arra mutatott, hogy a kísérletes fertőzés sú5

HU 217 890 Β íyos következményekkel járt (lásd 1. ábra). Valamennyi kontrollcsirke elpusztult a kísérlet 56. napjára; 90% Marék-féle betegség következtében, 10% nem megállapítható okok következtében. A csak SB 1 -vakcinával vakcinázott csoportban életben maradt madarakat a 63. na- 5 pon mind leöltük, mivel ebben a csoportban elfogadhatatlan szintre nőtt az MD előfordulása, az előbbi időpontra a madarak 13,3%-a már elpusztult MD következtében.

Ez a kísérlet azt mutatta, hogy MR22-törzs sejtmentes állapotban egyedül adagolva vagy HVT-vel való 10 kombinációban alkalmazva megfelelő védettséget hozott létre súlyos, Marek-féle betegséget kiváltó kísérletes fertőzéssel szemben.

3. példa 15

Az MR22 + HVT-vakcina által indukált immunitás összehasonlítása Rispens+HVT-vakcina hatásával Az alábbi vírastörzseket alkalmaztuk:

1. HVT-sejthez kötött vakcina (FC126-lntervet-törzs);

2. Rispens-sejtfaez kötött vakcina (CVI988-lnterveí- 20 törzs);

3. MR22-sejthez kötött vakcina.

Egynapos korú csirkéket körülbelül 40 csirkét tartalmazó csoportokra osztottunk, a csirkéket negatív nyomású izolátorba helyeztük, és az alábbi sejthez kötött 25 vakcinakombináeiók egyikével vakcináztuk. A csirkékről kimutattuk, hogy I., II, és III, szerotípussal szemben matemáíís (anyai eredetű) ellenanyagokkal rendelkeznek (MDA-pozitívak).

A) csoport

Ezek a csirkék 1000 pfu HVT-t és 1000 pfu Rispens-t kaptak 0,1 ml térfogatban, izomba adva.

B) csoport

Ezek a csirkék 1000 píú HVT-t és 1000 pfu MR22-t kaptak, mindkettőt 0,1 ml térfogatban, izomba adva.

Ötnapos korukban az A és B csoportba tartozó csirkéket, valamint 40 darab ötnapos, nem vakeinázott csirkét mint kontrollcsoportot kísérletesen fertőztünk. Valamennyi csirke 500 píú virulens Marek-féle RBlB-vírast kapott sejthez kötött formában, izomba adva. A madarakat 12 hétig megfigyelés alatt tartottuk. Az MDtüneteit mutató csirkéket leöltük, és ezeket az elpusztult madarakkal együtt felboncoltuk, hogy megállapítsuk az elhullás okát. Szükség esetén szövettani vizsgálatot végeztünk. A kísérlet végen valamennyi csirkét leöltük és felboncoltuk, hogy megállapítsuk az MD okozta elváltozások j elenlétét.

A nem vakeinázott kontrollcsirkék között az MD előfordulási aránya igen magas volt (lásd 5. táblázat és

2. ábra). Mindkét vakeinázott csoportban magas szintű immunitás létrejötte volt megállapítható, de a B csoportban tudtunk nagyobb fokú védettségei kimutatni a virulens kísérletes fertőzéssel szemben.

5. táblázat

MD előfordulási aránya kontroll- és vakeinázott madarak körében RBlB-törzzseí történő kísérletes fertőzést követően

	Madarak száma a kísérlet kezdetén	Nem fajlagos okból bekövetkezett elhullás	MD-tumorok	Szövettanilag kimutatott MD	Összíes MD	MD (%)
Kontroli	39	0	34	3	37	94
HVT+Rispens	41	0	9	4	13	31
HVT+MR22	38	1	3	2	5	13

Az eredmények azt mutatják, hogy sejthez kötött formában alkalmazva az MR22+HVT-vakcina jobb védettségei hoz létre RB1B MDV-vel kiváltott, súlyos betegséget okozó kísérletes fertőzéssel szemben, mint a Rispens+HVT-vakcina, amely jelenleg a kereskedelemben rendelkezésre álló legjobb vakcina.

Claims (7)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Gyengített, sejthez kötött formájú, I, szerotípusú Marek-féle betegségvírustörzs, amely V94062211 nyilvántartási szám alatt letétbe van helyezve a „European Collection of Animál Cell Cultures” intézetben (Porton Down, Anglia).
2. 2. Gyengített sejtmentes, I. szerotípusú Marek-féle betegségvírustörzs, amely V94062211 nyilvántartási szám alatt letétbe van helyezve a „European Collection of Animál Cell Cultures” intézetben (Porion Down, Anglia),
3. 3. Vakcina baromfíkban Marek-féle betegség elleni védettség létrehozására, amely valamely, az 1-2. igénypontok bármelyike szerinti gyengített, I. szerotípusú Marek-féle betegségvirustörzset, valamint a gyógyszergyártásban szokásos hordozóanyagot tartalmaz.
4. 4. A 3. igénypont szerinti vakcina, amely sejtmentes HVT-t is tartalmaz,
5. 5. A 3, vagy 4, igénypont szerinti vakcina, amely sejtmentes, II. szerotípusú MDV-t is tartalmaz,
6. 6. A 3., 4. vagy 5. igénypont szerinti vakcina, amely egyéb baromfi-kórokozókból származó antigént is tartalmaz.
7. 7. A 3-6. igénypontok bármelyike szerinti vakcina, amely li ofilizált formában van.