HU212277B - Process for producing m-csf - Google Patents

Process for producing m-csf Download PDF

Info

Publication number
HU212277B
HU212277B HU872369A HU236987A HU212277B HU 212277 B HU212277 B HU 212277B HU 872369 A HU872369 A HU 872369A HU 236987 A HU236987 A HU 236987A HU 212277 B HU212277 B HU 212277B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
nucleotide
sequence
csf
priority
ser
Prior art date
Application number
HU872369A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT47979A (en
Inventor
Steven C Clark
Gordon G Wong
Original Assignee
Genetics Inst
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US06/860,377 external-priority patent/US4879227A/en
Priority claimed from US06/940,362 external-priority patent/US4868119A/en
Application filed by Genetics Inst filed Critical Genetics Inst
Publication of HUT47979A publication Critical patent/HUT47979A/hu
Publication of HU212277B publication Critical patent/HU212277B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Transition And Organic Metals Composition Catalysts For Addition Polymerization (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Prostheses (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

A találmány tárgya eljárás humán M-CSF glikoprotein, ezt tartalmazó gyógyszerkészítmények, a fehérjét kódoló új DNS szekvencia és rekombináns DNS molekula, valamint a fehérje kifejezését szolgáló vektorok előállítása.
Az M-CSF vagy CSF-1 olyan fehérje, amely elősegíti a makrofágok telepeinek túlélését, növekedését és differenciációját; innen ered a neve: makrofág telepstimuláló faktor (M-CSF). Az M-CSF számos közlemény tárgya évek óta, amelyek leírják ennek kimutatását rágcsáló- és humán rendszerekben. Hasonlóképpen leírtak már eljárásokat ennek a fehérjének a tisztítására természetes forrásokból. így pl. a WO86/04587 számon közzétett PCT közzétételi irat eljárást ismertet humán és rágcsáló CSF-1 fehérjék természetes forrásokból történő tisztítására, immunaffmitás-kromatográfia és fordított fázisú, nagynyomású kromatográfia segítségével [lásd még pl.: Stanley E. R. és munkatársai: J. Bioi. Chem. 252, 4305 (1977); Das S. K. és munkatársai: Blood, 58, 630 (1982); valamint a WO86/04587 számú PCT szabadalmi közzétételi iratban idézett referenciák].
A humán CSF-1 egyik formáját kódoló cDNS szekvenciáról számoltak be Kawasaki E. W. és munkatársai [Science, 230, 291-296 (1985)]. Ezenkívül a W086/04607 számú PCT közzétételi irat eljárást ír le ilyen cDNS szekvencia által kódolt fehérje előállítási eljárására rekombináns módszerekkel.
A J. Bioi. Chem., 257, 13 679-13 689 (1985) helyen Das és munkatársai CSF-1 tisztítását ismertetik, és feltételezik, hogy a CSF-1 molekulatömege 47 0066 000 dalton, a CSF-1 vagy cDNS-e szekvenciáját azonban nem ismertetik.
A Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 2969-2973 (1979) helyen Stanley egy makrofág-termelést stimuláló CSF csoport kimutatását ismerteti CSFR1A-nak nevezett radioimmun-vizsgálattal, szekvenciáját azonban nem ismerteti, és nem utal arra, hogy a CSFR1A-tól eltérő CSF-ek részt vesznek-e a makrofág-stimulálásban.
Fennáll azonban az igény a szakterületen más humán CSF-1 vagy M-CSF fehérjék előállítására, amelyek utánozzák a természetben előforduló humán vizelet eredetű M-CSF-et a hematopoietikus (vérképzési) rendellenességek gyógyászati kezelésénél.
A találmány tárgya új eljárás egy korábban nem azonosított humán M-CSF fehérje előállítására, amely lényegében véve nem kapcsolódik össze más humán fehérjékkel. Az eljárás értelmében egy olyan új, M-CSF fehérjét kódoló cDNS szekvenciával transzformált megfelelő sejtet tenyésztünk, amely jelentősen különbözik azoktól a szekvenciáktól, amelyeket a szakterületen korábban leírtak. Ez az új szekvencia olyan fehérjét kódol, amely a természetes humán M-CSF biológiai és biokémiai jellemzőit mutatja, és amely fehérje azzal jellemezhető, hogy tartalmazza az I. táblázatban ábrázolt 1. aminosavtól a 223. aminosavig terjedő szekvenciával azonos vagy lényegében azonos peptid szekvenciát.
Az I. táblázat bemutatja a teljes 4 kb (kilobázis) méretű DNS szekvenciát, amely kifejeződéskor kódolja az M-CSF fehérjét. Ez a szekvencia tartalmaz egy 1662 nukleotidból álló hosszú, nyitott transzlációs leolvasó keretet, amely egy 554 aminosavból álló polipeptidet kódol. Három rész, azaz az 1. nukleotidtól a 415. nukleotidig, a 419. nukleotidtól a 689. nukleotidig és az 1584. nukleotidtól az 1823. nukleotidig, Kawasaki és munkatársai (fentebb idézett munka) szekvenciájában is jelen van. A 416. nukleotidtól a 418. nukleotidig és a 690. nukleotidtól az 1583. nukleotidig terjedő szekvenciák azonban újak, amelyek nem szakítják meg a kódoló szekvencia-leolvasó keretét. A 4 kb hosszúságú szekvencia fehérje-kódoló területe a 146. nukleotidtól (adenin a metionin kodonban) az 1807. nukleotidig terjed, amelyet egy TAG stop kodon követ. Négy potenciális, aszparaginnal kapcsolatos glikozilező hely van jelen benne, amelyeket az Asn-X-Ser és Asn-X-Thr szekvenciák jellemeznek. A 4 kb méretű terület 3' nem-kódoló szekvenciája megmaradó 2200 nukleotidjának szabályozó szerepe lehet az átírásban a természetes gazdaszervezetben. A szekvencia 3' vége szintén tartalmaz egy AT-ben gazdag szegmenst, beleértve az ATTTA szekvencia számos ismétlését, amelyről úgy hisszük, hogy kapcsolatban van az RNS üzenet stabilitásával [lásd Shaw G. és Kanén R.: Cell 46 (5), 659-677 (1986)].
A találmány szerinti eljárásban alkalmazott cDNS szekvencia operatív együttműködésben van egy kifejezést szabályozó kontroll szekvenciával. A cDNS szekvencia tartalmaz egy korábban nem azonosított új szekvenciát - azt a nukleotid szekvenciát vagy lényegében ugyanazt a nukleotid szekvenciát, mint amely az I. táblázatban a 242. nukleotidtól a 910. nukleotidig, illetve a 242. nukleotidtól a 1583. nukleotidig terjed. Ezenkívül az I. táblázat nukleotid és ennek megfelelő peptid szekvenciának alléi variánsai (vagy izozimjai) és a nukleotid szekvenciában való variációk, amelyek a genetikai kód degenerációjának eredményei, szintén benne foglaltatnak a találmányban, amennyiben ezek olyan polipeptidet kódolnak, amelynek M-CSF aktivitása van.
A találmány tárgya tehát egy olyan eljárás M-CSF előállítására, amelyben a tenyésztendő sejtet olyan MCSF fehérjét kódoló cDNS szekvenciával transzformáljuk, amely fehérje azonos vagy lényegében azonos peptid szekvenciát tartalmaz, mint a 150. aminosavtól a 223. aminosavig terjedő szekvencia. Az eljárásban felhasználandó cDNS szekvencia magában foglal egy olyan nukleotid szekvenciát, amely lényegében azonos vagy azonos a 689. nukleotidtól a 910. nukleotidig terjedő nukleotid szekvenciával, ahogy ezt az I. táblázat ábrázolja. A találmány tárgykörébe tartozik az öszszes olyan fehérje előállítása, amelynek M-CSF aktivitása van, amely fehérjék azonos vagy lényegében azonos részleges peptid szekvenciával bírnak, mint amelyeket ezek az új nukleotid szekvenciák kódolnak.
Az eljárásban alkalmazott transzformált sejtek az M-CSF DNS kódoló szekvenciával operatív együttműködésben megfelelő kifejezés-szabályozó szekvenciákat tartalmaznak. A megfelelő sejtek vagy
HU 212 277 Β sejtvonalak lehetnek emlős sejtek, pl. a kínai hörcsög petefészek (CHO) sejtek. A megfelelő emlős gazdasejtek, valamint transzformációs, tenyésztési, sokszorozási, átvizsgálási, termék-előállítási és tisztítási módszerek ismertek a szakterületen. Lásd például Gething és Sambrook: Natúré, 293, 620-625 (1981); vagy egy másik módszer: Kaufman és munkatársai: Mól. Cell. Bioi. 5 (6), 1750-1759 (1985) vagy Howley és munkatársai: 4 419 446 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás. Egy másik alkalmas emlős sejtvonal, amelyet a mellékelt példákban leírunk, a majom COS-1 sejtvonal. Hasonlóan hasznos emlős sejtvonal a CV-1 sejtvonal.
A találmány szerinti eljárásban alkalmazhatók bakteriális sejtek is. így például az E. coli különböző törzsei jól ismertek mint gazdasejtek a biotechnológia területén. AB. subtilis különböző törzsei szintén alkalmazhatók ebben az eljárásban.
Szakember számára nyilvánvaló, hogy számos élesztőtörzs alkalmazható gazdasejtként a találmány szerinti eljárásban polipeptidek kifejezéséhez. Ezenkívül kívánt esetben rovarsejteket is lehet gazdasejtként alkalmazni a találmány szerinti eljárásban. Lásd pl. Miller és munkatársai: Genetics Engineering, 8, 277298 (Plenum Press. 1986), és az ebben idézett referenciák.
A találmány tárgya továbbá eljárás olyan vektorok előállítására, amelyek ezen M-CSF fehérje kifejezésére használhatók. Ezek a vektorok ugyanazt vagy lényegében ugyanazt a nukleotid szekvenciát tartalmazzák. mint a 242. nukleotidtól a 910. nukleotidig, illetve a 689. nukleotidtól a 910. nukleotidig, illetve a 242. nukleotidtól az 1583. nukleotidig, illetve a 689. nukleotidtól az 1583. nukleotidig terjedő szekvencia, illetve a teljes nukleotid szekvencia, az I. táblázatban szerepel. A vektorok előnyösen tartalmazzák az I. táblázatban hivatkozott teljes DNS szekvenciát. A vektorok tartalmazhatnak megfelelő kifejezést szabályozó szekvenciákat, amelyek lehetővé teszik az MCSF DNS szekvencia kifejeződését. Azok a vektorok, amelyek módosított vagy természetben előforduló alléi szekvenciákat tartalmaznak, szintén a találmány tárgykörébe tartoznak, és használhatók az M-CSF termelésében. A vektorokat alkalmazhatjuk sejtvonalak transzformálására. A vektorok kiválasztott szabályozó szekvenciákat tartalmaznak operatív együttműködésben a találmány szerinti kódoló szekvenciákkal, amely szabályozó szekvenciák képesek irányítani ezek replikációját és kifejeződését a kiválasztott gazdasejtekben. Az ilyen vektorok alkalmas szabályozó szekvenciái jól ismertek a szakterületen jártas szakemberek számára, és a kiválasztott gazdasejtektől függően lehet megválasztani.
A találmány tárgya továbbá az I. táblázatban megadott DNS szekvencia és alléi változatainak előállítása. Az 1. táblázat mintegy 4 kb méretű DNS szekvenciáját az E. coli HB101-ben levő p3ACSF-69 plazmid tartalmazza, amely az American Type Culture Collection-nál (12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland) van deponálva ATCC 67092 deponálási számon, a deponálás dátuma 1986. április 16. Ez a szekvencia megfelelő gazdasejtbe átfertőzve olyan M-CSF fehérje kifejeződését kódolja, amely makrofág telepstimuláló aktivitást mutat in vitro egér és humán csontvelő vizsgálatokban.
Kisebb változtatások az I. táblázat 4 kb méretű szekvenciájában, amelyeket pontmutációk és hasonlók okoznak, nem változtatják meg a funkcionális fehérjét, amelyet a szekvencia kifejeződéskor kódol. Ennek megfelelően az ilyen kis változások a szekvenciában, beleértve azokat a változásokat is, amelyek a genetikai kód degenerációjának következményei, a találmány keretein belül vannak. Tudatosan is lehet tervezni nukleotid-módosításokat az ebben az eljárásban alkalmazott DNS szekvenciában, amely módosításokat bárki képes elvégezni, aki a szakterületen jártas, ismert technikákat alkalmazva. Az ilyen módosítások előidézhetik aminosavak kiiktatását, beiktatását vagy helyettesítését. így pl. egy vagy több cisztein gyök helyettesítése a kódoló szekvenciában eltüntethet egy megfelelő diszulfid-hidat. Ezenkívül egy aminosav kiiktatása egy vagy több, tripeptid-jellegű, aszparaginnal kapcsolt glikozilezés-felismerő helynél a glikozilezés hiányát idézheti elő ezeknél a helyeknél. A mutagén technikák az ilyen helyettesítésekhez vagy kiiktatásokhoz jól ismertek a szakterületen jártas szakemberek számára (lásd pl. a 4 518 584 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírást). Azok a vektorok, amelyekbe ezek a módosított szekvenciák be vannak építve, szintén a találmány tárgykörébe tartoznak, és alkalmasak az itt leírt M-CSF fehérje előállítására.
Az M-CSF, amelyet a találmány szerinti eljárással állítunk elő, mintegy 70-90 kD látszólagos molekulatömeggel jellemezhető, nem redukáló körülmények között SDS-poliakrilamid gélektroforézissel elemezve. Ha azonban az elemzést az M-CSF redukálása után végezzük, a fehérjét 35-45 kD látszólagos molekulatömeg jellemzi, azt sugallva, hogy az M-CSF 35-45 kD-s alegységek diszulfid-hidakkal kapcsolt homo-dimere.
Az 1. táblázat szekvenciája által kódolt mintegy 61 kD-s prekurzort részben az amino-terminálisánál dolgozzuk fel, eltávolítva egy 32 gyökös szignál peptidet, részben a karboxi-terminálisánál dolgozzuk fel, eltávolítva mintegy 229 gyököt; ilyen módon mintegy 223-224 aminosavas alegységei nyerünk, amelyek előre számított molekulatömege 21 kD. így az érett M-CSF monomer amino-terminális végén Glu-t tartalmaz és legalább az I. táblázatban a 223. helyen levő Arg-ig terjed. A fehérje tartalmazhatja az I. táblázat 224. helyén lévő Ser aminosavat is karboxi-terminálisaként. Ez az alegység megtart az I. táblázat szekvenciájában jelen levő lehetséges négy hely közül kettőt a szénhidrátok aszparagínhoz történő kapcsolása céljára. A 21 kD-s polipeptid ennél a két helynél és számos O-val kapcsolatos glikozilező helynél történő glikozilezése képezheti az M-CSF 35-45 kD-s alegysége további tömegének túlnyomó részét.
HU 212 277 Β
1. táblázat
10 20 30 40 50 60 70
CCTGGGTCCT CTCGGCGCCA GAGCCGCTCT CCGCATCCCA GGACAGCGGT GCGGCCCTCG GCCGGGGCGC
80 90 100 110 120 130 140
CCACTCCGCA GCAGCCAGCG AGCGAGCGAG CGAGCGAGGG CGGCCGACGC GCCCGGCCGG GACCCAGCTG
(-32) 160 175 190
CCCGT ATG ACC GCG CCG GGC GCC GCC GGG CGC TGC CCT CCC ACG ACA TGG CTG
MET Thr Ala Pro Gly Ala Ala Gly Arg Cys Pro Pro Thr Thr Trp Leu
205 220 235
GGC TCC CTG CTG TTG TTG GTC TGT CTC CTG GCG AGC AGG AGT ATC ACC GAG GAG
Gly Ser Leu Leu Leu Leu Val Cys Leu Leu Ala Ser Arg Ser Ile Thr Glu (1) Glu
250 265 280 295
GTG TCG GAG TAC TGT AGC CAC ATG ATT GGG AGT GGA CAC CTG CAG TCT CTG CAG
Val Ser Glu Tyr Cys Ser His MET Ile Gly Ser Gly His Leu Gin Ser Leu Gin
310 325 340 355
CGG CTG ATT GAC AGT CAG ATG GAG ACC TCG TGC CAA ATT ACA TTT GAG TTT GTA
Arg Leu Ile Asp Ser Gin MET Glu Thr Ser Cys Gin Ile Thr Phe Glu Phe Val
370 385 400
GAC CAG GAA CAG TTG AAA GAT CCA GTG TGC TAC CTT AAG AAG GCA TTT CTG CTG
Asp Gin Glu Gin Leu Lys Asp Pro Val Cys Tyr Leu Lys Lys Ala Phe Leu Leu
415 430 445 460
GTA CAA GAC ATA ATG GAG GAC ACC ATG CGC TCC AGA GAT AAC ACC CCC AAT GCC
Val Gin Asp Ile MET Glu Asp Thr MET Arg Phe Arg Asp Asn Thr Pro Asn Ala
475 490 505
ATC GCC ATT GTG CAG CTG CAG GAA CTC TCT TTG AGG CTG AAG AGC TGC TTC ACC
Ile Ala Ile Val Gin Leu Gin Glu Leu Ser Leu Arg Leu Lys Ser Cys Phe Thr
520 535 550 565
AAG GAT TAT GAA GAG CAT GAC AAG GCC TGC GTC CGA ACT TTC TAT GAG ACA CCT
Lys Asp Tyr Glu Glu His Asp Lys Ala Cys Val Arg Thr Phe Tyr Glu Thr Pro
580 595 610 625
CTC CAG TTG CTG GAG AAG GTC AAG AAT GTC TTT AAT GGA ACA AAG AAT CTG CTG
Leu Gin Leu Leu Glu Lys Val Lys Asn Val Phe Asn Glu Thr Lys Asn Leu Leu
(122) 1
640 655 670
GAC AAG GAC TGG AAT ATT TTC AGC AAG AAC TGC AAC AAC AGC TTT GCT GAA TGC
Asp Lys Asp Trp Asn Ile Phe Ser Lys Asn Cys Asn Asn Ser Phe Ala Gly Cys
685 700 715 730
TCC AGC CAA GAT GTG GTG ACC AAG CCT GAT TGC AAC TGC CTG TAC CCC AAA GCC
Ser Ser Gin Asp Val Val Thr Lys Pro Asp Cys Asn Cys Leu Tyr Pro Lys Ala
745 760 775
ATC CCT AGC AGT GAC CCG GCC TCT GTC TCC CCT CAT CAG CCC CTC GCC CCC TCC
Ile Pro Ser Ser Asp Pro Ala Ser Val Ser Pro His Gin Pro Leu Ala Pro Ser
790 805 820 835
ATG GCC CCT GTG GCT GGC TTG ACC TGG GAG GAC TCT GAG GGA ACT GAG GGC AGC
MET Ala Pro Val Ala Gly Leu (189) Thr Trp Gin Asp Ser Glu Gly Thr Glu Gly Ser
850 865 880 895
TCC CTC TTG CCT GGT GAG CAG CCC CTG CAC ACA GTG GAT CCA GGC AGT GCC AAG
Ser Leu Leu Pro Gly Glu Gin Pro Leu His Thr Val Asp Pro Gly Ser Ala Lys
910 925 940
CAG CGG CCA CCC AGG AGC ACC TGC CAG AGC TTT GAG CCG CCA GAG ACC CCA GTT
Gin Arg Pro Pro Arg Ser Thr Cys Gin Ser Phe Glu Pro Pro Glu Thr Pro Val
(223)
955 970 985 1000
GTC AAG GAC AGC ACC ATC GGT GGC TCA CCA CAG CCT CGC CCC TCT GTC GGG GCC
Val Lys Asp Ser Thr Ile Gly Gly Ser Pro Gin Pro Arg Pro Ser Val Gly Ala
1015 1030 1045
TTC AAC CCC GGG ATG GAG GAT ATT CTT GAC TCT GCA ATG GGC ACT AAT TGG GTC
HU 212 277 Β
Phe Asn Pro Gly MET 250 Glu Asp Ile Leu Asp Ser Alá MET Gly Thr Asn Trp Val
1060 1075 1090 1105
CCA GAA GAA GCC TCT GGA GAG GCC AGT GAG ATT CCC GTA CCC CAA GGG ACA GAG
Pro Glu Glu Alá Ser Gly Glu Alá Ser Glu He Pro Val Pro Gin Gly Thr Glu
1120 1135 1150 1165
CTT TCC CCC TCC AGG CCA GGA GGG GGC AGC ATG CAG ACA GAG CCC GCC AGA CCC
Leu Ser Pro Ser Arg Pro Gly Gly Gly Ser MET Gin Thr Glu Pro Alá Arg Pro
1180 1195 1210
AGC AAC TTC CTC TCA GCA TCT TCT CCA CTC CCT GCA TCA GCA AAG GGC CAA CAG
Ser Asn Phe Leu Ser Alá Ser Ser Pro Leu Pro Alá Ser Alá Lys Gly Gin Gin
1225 1240 1255 1270
CCG GCA GAT GTA ACT GGT ACA GCC TTG CCC AGG GTG GGC CCC GTG AGG CCC ACT
Pro Alá Asp Val Thr Gly Thr Alá Leu Pro Arg Val Gly Pro Val Arg Pro Thr
1285 1300 1315
GGC CAG GAC TGG AAT CAC ACC CCC CAG AAG ACA GAC CAT CCA TCT GCC CTG CTC
Gly Gin Asp Trp Asn His Thr Pro Gin Lys Thr Asp His Pro Ser Alá Leu Leu
1330 1345 1360 1375
AGA GAC CCC CCG GAG CCA GGC TCT CCC AGG ATC TCA TCA CTG CGC CCC CAG GGC
Arg Asp Pro Pro Glu Pro Gly Ser Pro Arg Ile Ser Ser Leu Arg Pro Gin Gly
1390 1405 1420 1435
CTC AGC AAC CCC TCC ACC CTC TCT GCT CAG CCA CAG CTT TCC AGA AGC CAC TCC
Leu Ser Asn Pro Ser Thr Leu Ser Alá Gin Pro Gin Leu Ser Arg Ser His Ser
1450 1465 1480
TCG GGC AGC GTG CTG CCC CTT GGG GAG CTG GAG GGC AGG AGG AGC ACC AGG GAT
Ser Gly Ser Val Leu Pro Leu Gly Glu Leu Glu Gly Arg Arg Ser Thr Arg Asp
1495 1510 1525 1540
CGG AGG AGC CCC GCA GAG CCA GAA GGA GGA CCA GCA AGT GAA GGG GCA GCC AGG
Arg Arg Ser Pro Alá Glu Pro Glu Gly Gly Pro Alá Ser Glu Gly Alá Alá Arg
1555 1570 1585
CCC CTG CCC CGT TTT AAC TCC GTT CCT TTG ACT GAC ACA GGC CAT GAG AGG CAG
Pro Leu Pro Arg Phe Asn Ser Val Pro Leu Thr Asp Thr Gly His Glu Arg Gin
1600 1615 1630 1645
TCC GAG GGA TCC TCC AGC CCG CAG CTC CAG GAG TCT GTC TTC CAC CTG CTG GTG
Ser Glu Gly Ser Ser Ser Pro Gin Leu Gin Glu Ser Val Phe His Leu Leu Val
1660 1675 1690 1705
CCC AGT GTC ATC CTG GTC TTG CTG GCT GTC GGA GGC CTC TTG TTC TAC AGG TGG
Pro Ser Val Ile Leu Val Leu Leu Alá Val Gly Gly Leu Leu Phe Tyr Arg Trp
1720 1735 1750
AGG CGG CGG AGC CAT CAA GAG CCT CAG AGA GCG GAT TCT CCC TTG GAG CAA CCA
Arg Arg Arg Ser His Gin Glu Pro Gin Arg Alá Asp Ser Pro Leu Glu Gin Pro
1765 1780 1795 1817
GAG GGC AGC CCC CTG ACT CAG GAT GAC AGA CAG GTG GAA CTG CCA GTG TAGAGGGAAT
Glu Gly Ser Pro Leu Thr Gin Asp Asp Arg Gin Val Glu Leu Pro Val
1827 1837 1847 1857 1867 1877 1887
TCTAAGCTGG ACGCACAGAA CAGTCTCTCC GTGGGAGGAG ACATTATGGG GCGTCCACCA CCACCCCTCC 1897 1907 1917 1927 1937 1947 1957
CTGGCCATCC TCCTGGAATG TGGTCTGCCC TCCACCAGAG CTCCTGCCTG CCAGGACTGG ACCAGAGCAG 1967 1977 1987 1997 2007 2017 2027
CCAGGCTGGG GCCCCTCTGT CTCAACCCGC AGACCCTTGA CTGAATGAGA GAGGCCAGAG GATGCTCCCC 2037 2047 2057 2067 2077 2087 2097
ATGCTGCCAC TATTTATTGT GAGCCCTGGA GGCTCCATG TGCTTGAGGA AGGCTGGTGA GCCCGGTCTA 2107 2117 2127 2137 2147 2157 2167
GGACCCTCTT CCCTCAGGGG CTGCACCCTC CTCTCACTCC CTTCCATGCC GGAACCCAGG CCAGGGACCC 2177 2187 2197 2207 2217 2227 2237
ACCGGCCTGT GGTTTGTGGG AAAGCAGGGT GGACGCTGAG GAGTGAAAGA ACCCTGCACC CAGAGGGCCT 2247 2257 2267 2277 2287 2297 2307
GCCTGGTGCC AAGGTATCCC AGCCTGGACA GGCATGGACC TGTCTCCAGA GAGAGGAGCC TGAAGTTCGT 2317 2327 2337 2347 2357 2367 2377
GGGGCGGGAC AGCGTCGGCC TGATTTCCCG TAAAGGTGTG CAGCCTGAGA GACGGGAAGA GGAGGCCTCT
HU 212 277 Β
2387 2397 2407 2417 2427 2437 2447
GGACCTGCTG GTCTGCACGT ACAGCCTGAA GGGTCTACAC CCTCGGCTCA CCTAAGTGCC CTGTGCTGGT
2457 2467 2477 2487 2497 2507 2517
TGCCAGGCGC AGAGGGGAGG CCAGCCCTGC CCTCAGGACC TGCCTGACCT GCCAGTGATG CCAAGAGGGG
2527 2537 2547 2557 2567 2577 2587
GATCAAGCAC TGGCCTCTGC CCCTCCTCCT TCCAGCACCT GCCAGAGCTT CTCCAGGAGG CCAAGCAGAG
2597 2607 2617 2627 2637 2647 2657
GCTCCCCTCA TGAAGGAAGC CATTGCACTG TGAACACTGT ACCTGCCTGC TGAACAGCCT GCCCCCGTCC
2667 2677 2687 2697 2707 2717 2727
ATCCATGAGC CAGCATCCGT CCGTCCTCCA CTCTCCAGCC TCTCCCCAGC CTCCTGCACT GAGCTGGCCT
2737 2747 2757 2767 2777 2787 2797
CACCAGTCGA CTGAGGGAGC CCCTCAGCCC TGACCTTCTC CTGACCTGGC CTTTGACTCC CCGGAGTGGA
2808 2817 2827 2837 2847 2857 2867
GTGGGGTGGG AGAACCTCCT GGGCCGCCAG CCAGAGCCGG TCTTTAGGCT GTGTTGTTCG CCCAGGTTTC
2877 2887 2897 2907 2917 2927 2937
TGCATCTTGC ACTTTGACAT TCCCAAGAGG GAAGGGACTA GTGGGAGAGA GCAAGGGAGG GGAGGGCACA
2947 2957 2967 2977 2987 2997 3007
GACAGAGAGG CTACAGGGCG AGCTCTGACT GAAGATGGGC CTTTGAAATA TAGGTATGCA CCTGAGGTTG
3017 3027 3037 3047 3057 3067 3077
GGGGAGGGTC TGCACTCCCA AACCCCAGCG CAGTGTCCTT TCCCTGCTGC CGACAGGAAC CTGGGGCTGA
3087 3097 3107 3117 3127 3137 3147
GCAGGTTATC CCTGTCAGGA GCCCTGGACT GGGCTGCATC TCAGCCCCAC CTGCATGGTA TCCAGCTCCC
3157 3167 3177 3187 3197 3207 3217
ATCCACTTCT CACCCTTCTT TCCTCCTGAC CTTGGTCAGC AGTGATGACC TCCAACTCTC ACCCACCCCC
3227 3237 3247 3257 3267 3277 3287
TCTACCATCA CCTCTAACCA GGCAAGCCAG GGTGGGAGAG CAATCAGGAG AGCCAGGCCT CAGCTTCCAA
3297 3307 3317 3327 3337 3347 3357
TGCCTGGAGG GCCTCCACTT TGTGGCCAGC CTGTGGTGGT GGCTCTGAGG CCTAGGCAAC GAGCGACAGG
3367 3377 3387 3397 3407 3417 3427
CGTGCCAGTT GCCCCTGGGT TCCTTTGTGC TGCTGTGTGC CTCCTCTCCT GCCGCCCTTT GTCCTCCGCT
3437 3447 3457 3467 3477 3487 3497
AAGAGACCCT GCCCTACCTG GCCGCTGGGC CCCGTGACTT TCCCTTCCTG CCCAGGAAAG TGAGGGTCGG
3507 3517 3527 3537 3547 3557 ' 3567
CTGGCCCCAC CTTCCCTGTC CTGATGCCGA CAGCTTAGGG AAGGGCAGTG AACTTGCATA TGGGGCTTAG
3577 3587 3597 3607 3617 3627 3637
CCTTCTAGTC ACAGCCTCTA TATTTGATGC TAGAAAACAC ATATTTTTAA ATGGAAGAAA AATAAAAGG
3647 3657 3667 3677 3687 3697 3707
CATTCCCCCT TCATCCCCCT ACCTTAAACA TATAATATTT TAAAGGTCAA AAAAGCAATC CAACCCACTG
3717 3727 3737 3747 3757 3767 3777
CAGAAGCTCT TTTTGAGCAC TTGGTGGCAT CAGAGCAGGA GGAGCCCCAG AGCCACCTCT GGTGTCCCCC
3787 3797 3807 3817 3827 3837 3847
CAGGCTACCT GCTCAGGAAC CCCTTCTGTT CTCTGAGAAG TCAAGAGAGG ACATTGGCTC ACGCACTGTG
3857 3867 3877 3887 3897 3907 3917
AGATTTTGTT TTTATACTTG GAAGTGGTGA ATTATTTTAT ATAAAGTCAT TTAAATATCT ATTTAAAAGA
3927 3937 3947 3957 3967 3977
TAGGAAGCTG CTTATATATT TAATAATAAA AGAAGTGCAC AAGCTGCCG 1 1 TGACGTAGCT CGAG
A találmány tárgya továbbá eljárás olyan gyógyászati kompozíció előállítására, amely a vérképző (hematopoietikus) sejtekben, főleg a mieloid eredetű sej- 50 tekben (beleértve a monocitákat és makrofágokat) levő hibák kezelésére alkalmas. Az M-CSF alkalmazható közvetlenül monocita- és makrofágtermelés stimulálására, míg közvetett módon más hematopoietikus eredetű sejtek stimulálására. A találmány szerin- 55 ti eljárással előállított polipeptidekkel való kezelésre fogékony állapotok például a leukopénia, a cirkuláló fehérvérsejtek számának csökkenése a perifériás vérben. A leukopénia vírusok és besugárzás hatására, valamint gyakran különböző rák elleni kezelések 60 mellékhatásaként alakul ki. Ha a leukopéniát MCSF-fel kezeljük, az ilyen mellékhatások kiküszöbölhetők. Ezenkívül súlyos fertőzés esetén az M-CSF az érett fehérvérsejteket és a monocitákat GM-CSF termelésére aktiválhatja. Az M-CSF alkalmazható intracelluláris parazitafertőzések, bakteriális fertőzések és hasonlók kezelésére is. Ezenkívül az M-CSF önmagában vagy más hematopoietinekkel, pl. IL-l-gyel, IL-2-vel, IL-3-mal, IL-4-gyel IL-5-tel, B-sejt differenciációs faktorral, BSF-2-vel és interferonokkal kombinálva növelheti a makrofág funkciót, rábírva az aktivált makrofágokat, hogy pusztítsák el a tumorsejteket, bocsássanak ki alfa-interferont, pusztítsák el a
HU 212 277 Β parazitákat vagy bocsássanak ki más CSF-eket, illetve fokozzák ezek kibocsátását.
Az M-CSF alkalmazható más vérsejt-hiányosságok kezelésére is, beleértve a trombocitopéniát vagy anémiát, az olyan betegek kezelésében, akik csontvelő-átültetésen estek át; ezenkívül az M-CSF fokozza a szervezet védelmét sebészeti beavatkozás közben és égési sérült betegek esetén. Az M-CSF valamely antitesttel együtt [pl. az antitest-függő sejttoxicitási módszer szerint, lásd Lopez A. F. és munkatársai: J. Immunoi. 131 (6), 2983-2988 (1983)] aktiválhatja a tumorsejtek pusztítását a humán monociták révén, és ezáltal hatásos kezelés lehet bizonyos rákok ellen.
A találmány szerinti eljárással előállított gyógyászati kompozíció az M-CSF fehérje terápiásán hatásos mennyiségét tartalmazza valamely gyógyászatilag elfogadható hordozóval együtt. A kompozíció adagolható parenterálisan, intravénásán vagy szubkután, pirogén-mentes, parenterálisan elfogadható vizes oldat formájában. Egy ilyen parenterálisan elfogadható fehérjeoldat előállítása, amely a megfelelő pH-val, izotonicitással, stabilitással stb. bír, a szakterületen jártas szakember számára rutin feladat.
Az adagolási menetrendet a kezelőorvos különböző, a gyógyszer hatását esetleg módosító tényezőket figyelembe véve határozhatja meg, ilyen tényezők pl. a fizikai állapot, testtömeg, nem, a beteg étrendje, bármiféle fertőzés súlyossága, a beadás időpontja, és más klinikai tényezők. A napi adag általában 1-1000 mikrogramm fehérje vagy 50-5000 egység fehérje testtömeg kg-onként (az egység a polipeptideknek az a koncentrációja. amely a maximális stimulálás felét idézi elő standard rágcsáló csontvelő vizsgálatban). A gyógyulás előrehaladását a hematológiai profil időnkénti becslésével követhetjük, pl. fehérvérsejt-számlálással és hasonlókkal.
A gyógyászati kompozíció más humán faktorokat is tartalmazhat az M-CSF mellett. Más alkalmas hematopoietinek, CSF-ek és interleukinok, amelyek a találmány szerinti eljárással előállított M-CSF mellett alkalmazhatók, a fentebb felsorolt faktorok, valamint GM-CSF, G-CSF, Meg-CSF, eritropoietinek és eozinofil differenciációs faktor. A fentebb idézett adatolási menetrendet úgy kell beállítani, hogy figyelembe vesszük a gyógyászati kompozícióban jelen levő ilyen további komponenseket. Az MCSF-et adagolhatjuk olyan gyógykezelésben is, amelyek során monoklonális antitestek kerülnek alkalmazásra.
Az alábbi példákkal a találmány szerinti eljárást szemléltetjük, amely eljárásban az I. táblázat szerinti DNS szekvenciát alkalmazzuk M-CSF vagy a természetben előforduló allélváltozatai (izozimok), illetve tudatosan módosított M-CSF fehérjék előállítására. A példákban említett műveleteket (pl. illesztés, ligálás, transzformálás stb.) a Maniatis, Fritsch, Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y„ 1982) szakkönyv ismerteti.
1. példa
Eljárás p3ACSF-69 emlős kifejező vektor megalkotására
Az I. táblázat teljes DNS szekvenciáját az SV40nel transzformált TPA-30-1 trofoblaszt sejtvonal (ATCC CRL-1583) PoliA+ mRNS-éből izoláljuk. Az MCSF kifejezésére szolgáló emlős vektor megalkotására az I. táblázatban ábrázolt teljes cDNS szekvenciát ΛΤιοΙ restrikciós endonukleáz enzim-kapcsolókhoz (New England Biolabs) adaptáljuk, és Xhol-gyel emésztett, foszfatázzal kezelt pXM COS-sejt kifejező vektorhoz ligáljuk. A pXM az SV40 fokozót, nagyobb adenovíras késői promotort, DHFR kódoló szekvenciát, SV40 késői poliA hozzáadóhelyet és a Val gént tartalmazza. A pXM Xhol-gyel végzett emésztésének, valamint a kapcsoló és az Xhol-gyel kezelt, I. táblázat szerinti DNS szekvencia beiktatásának eredményeképpen létrejött plazmidot p3ACSF-69-nek nevezzük.
Részletesebben ismertetve a következőképpen járunk el: TPA30-1 sejtekből RNS-t izolálunk, és Yang módszerével [Cell 47, 3 (1986)] kettősszálú cDNS-t készítünk. A kapott cDNS felét arra használjuk, hogy pXM vektorral Yang módszerével (ibid.) plazmid cDNS könyvtárat (35 000 klón) hozzunk létre. A CSF1-re specifikus szekvenciákat kolóniahibridizációval azonosítjuk, olyan szintetikus oligonukleotid használatával, amelyeket a Kawasaki [Science 230, 291 (1985)] által ismertetett szekvenciákból vezetünk le: az 1643 jelű oligonukleotid szekvenciája; GCCCAGCCATGTCGTGGGAGGCAGCGCCCGGCGGCGG CCGGCGCGGTCAT, amely a CSF-1 első 17 kodonjának antiszensz szekvenciáját reprezentálja; az 1646 jelű oligonukleotid szekvenciája: CACTGGCAGTTCCACCAGTCTGTCATCCTGAGTCAGGGGCTGC CTCTGG, amely a CSF-1 utolsó 17 kodonjának antiszensz szekvenciáját reprezentálja. Ezeket a mintákat Yang módszerével (ibid.), standard hibridizációs körülmények között szűrőkhöz hibridizáljuk, miközben azonban a hőmérsékletet 55 °C-ra csökkentjük, hogy az oligonukleotidok hosszúságát kompenzáljuk. A 35 000 klón ezen mintával végzett átvizsgálása során két olyan kiónt azonosítunk, amelyek hibridizálnak az 1646 jelű oligonukleotidhoz, míg az 1643 jelűhöz hibridizáló nincs közöttük. A két cDNS közül a hosszabbik (p3ACSF-3.5) 3,7 kb hosszúságú, és a 205-3981. nukleotidok szekvenciájának felel meg. A többi cDNSt a következő EcoRI adapterhez ligáljuk:
AATTCCTCGAGAGCT
GGAGCTCTCG és Lgt 1 ] fág-vektorba inszertáljuk, Maniatis módszerével [Maniatis, Fritsch, Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1982)]; egy 400 000 cDNSklónt tartalmazó könyvtárat átvizsgálunk az 1643 próbával és a p3ACSF-3.5 jelzett inszertjével [Toole, Natúré (London) 312, 342 (1984)]. Négy olyan plakkot azonosítunk, amelyek hibridizálnak mindkét próbához. Mivel az £coRI adapter tartalmazza az Xhol felismerőhelyet, ezen kiónok inszertjeit egyszerűen kivágjuk ilyen enzimmel végzett emésztéssel, és a pXM Xhol
HU 212 277 B helyénél beiktatjuk. Egy ilyen kiónt (p3ACSF-1.3), amely tartalmazza az 1-1332 nukleotid-szekvenciáját, használunk arra, hogy kiegészítsük a p3ACSF-3,5 hiányzó szekvenciát. Ezt úgy végezzük, hogy a p3ACSF-1.3 1-478 szekvenciáját (a 478. helynél levő egyedüli PvuII hely felhasználásával) kapcsoljuk a pACSF-3.5-ből származó 478-3981 szekvenciával. Ezt a DNS-t azután a pXM expressziós vektorba szubklónozzuk, így a CSF-l-t kifejező plazmidot kapjuk, amelyet p3ACSF-69 jellel jelölünk.
A p3ACSF-69-et (ATCC 67092) hagyományos technikákkal transzformálhatjuk megfelelő emlős gazdasejtekbe M-CSF fehérje kifejezése céljából. Gazdasejtek lehetnek például emlős sejtek és sejtvonalak, főleg főemlős sejtvonalak, rágcsáló sejtvonalak stb.
A szakterületen jártas szakemberek alkothatnak a p3ACSF-69-től eltérő emlős kifejező vektorokat is, amelyek az I. táblázat teljes szekvenciájánál kevesebbet tartalmaznak. így pl. kívánt esetben az 5' és 3' szegélyező szekvenciákat le lehet hasítani az I. táblázat szekvenciájából, vagy az I. táblázat módosított vagy alléi változatait alkalmazhatjuk, az I. táblázat szekvenciáját megfelelően manipulálva. Az I. táblázat DNS szekvenciáját Xhol-gyel lehet kihasítani a plazmidból, és jól ismert genetikai manipulációs technikákat lehet alkalmazni a szekvencia módosítására vagy ennek beiktatására más ismert vektorokba, pl. pCD-be [Okayama és munkatársai: Mól. Cell. Bioi. 2, 161-170 (1980) és pJL3-ba vagy pJL4-be Gough és munkatársai: EMBO J. 4, 645-653 (1985)]. Ezeknek a vektoroknak a transzformálása megfelelő gazdasejtekbe M-CSF fehérje kifejezését eredményezi.
Egy a szakterületen jártas szakember a szekvenciákat módosíthatja úgy, hogy a kódoló szekvenciát szegélyező emlős szabályozó szekvenciákat eltüntetik vagy helyettesítik élesztő-, baktérium- vagy rovar-szekvenciákkal, hogy nem-emlős vektorokat alkosson meg. Ennek megfelelően az ilyen szekvenciákat azután ki lehet fejezni élesztő-, baktérium- vagy rovar-gazdasejtekben. így pl. az I. táblázat kódoló szekvenciáját Xhol-gyel ki lehet hasítani a p3ACSF-69-ből és további műveleteknek alávetni (pl. ligálni más ismert kapcsolókhoz vagy módosítani, kiiktatva belőle nem kódoló szekvenciákat vagy megváltoztatva benne levő nukleotidokat más ismert technikákkal). A módosított M-CSF kódoló szekvenciát azután beiktatjuk pl. valamely ismert bakteriális vektorba, a Taniguchi I. és munkatársai által leírt eljárást alkalmazva [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 5230-5233 (1980)].
Hasonló manipulációkat hajthatunk végre valamely rovar vektor megalkotásában (lásd pl. a 155 476 számú európai szabadalmi közzétételi iratban leírt eljárásokat) vagy élesztő vektor megalkotásában (lásd pl. a WO 86/00639 számú PCT szabadalmi közzétételi iratban leírt eljárásokat), hogy az M-CSF fehérjét kifejezzük rovar- vagy élesztősejtekben.
II. példa
M-CSF fehérje kifejezése p3ACSF-69-et tartalmazó E. coli HB101-bői preparált plazmid DNS-t, ahol a preparálást úgy végezzük, ahogyan Maniatis és munkatársai leírták [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)], hagyományos módszerekkel tisztítunk, beleértve az egyensúlyi centrifugálást etidium-bromidot tartalmazó cézium-klorid gradiensben. COS sejteket (ATCC CRL 1650) fertőzünk át a tisztított DNS-sel mintegy 5 pg plazmid DNS/106 COS sejt koncentrációban, és klorokinnal kezeljük Wong G. G. és munkatársai által leírt eljárások szerint [Science, 280, 810-813 (1985)], valamint a Kaufman R. J. és munkatársai által leírt eljárások [Mól. Cell. Bioi. 2, 1304 (1982)] szerint. Az átfertőzés után 72 órával a p3ACSF-69-et tartalmazó COS sejtek kondicionált tenyészközegét kinyerhetjük; ez olyan fehérjét tartalmaz, amely M-CSF akti vitást mutat standard csontvelő vizsgálatokban, amint ezt alább, a ΠΙ. példában tárgyaljuk.
III. példa
M-CSF aktivitás in vitro vizsgálatokban
A. Egér vizsgálatok
Egér csontvelő vizsgálatokat végzünk olyan módon, amint ezt Metcalf D. leírta [The Hemopoietic Colony Stimulating Factors; Elsevier Press, New York (1984)], az alábbi módosításokkal:
(a) a vizsgálatban 2.105 csontvelősejtet alkalmazunk milliliterenként;
(b) a végső vizsgálati térfogat 100 μΐ; és (c) a vizsgálatokat standard, 96 üreges mikrotitráló lemezeken végezzük.
A csontvelőt 6-25 hetes korú nőstény Balb/c egerek (Jackson) combcsontjából vesszük, WEHI 3 kondicionált tápközeget alkalmazva [Lee J. C. és munkatársai: J. Immunoi, 128, 2392-2398 (1982)], amely egér Lsejt kondicionált tápközeget tartalmaz standard kontrollként, az aktivitás egy hígítási egységét úgy határozzuk meg, mint a fehérjének azt a koncentrációját, amely maximális választ eredményez ebben a csontvelő vizsgálatban, vagyis mintegy 15-20 telepet 2.104 egér csontvelősejtre számítva.
A p3ACSF-69-et tartalmazó COS sejtekből származó kondicionált tápközegről úgy találjuk, hogy legalább 104 hígításig aktív egér csontvelő vizsgálatban, és főleg monocita eredetű, típusú telepeket alakít ki. A sejtek típusa és száma a maximális válaszban változhat a törzstől és az egér donor korától függően.
B, Humán vizsgálat
Humán csontvelő-vizsgálatokat végzünk, nem-letapadó csontvelősejteket alkalmazva, amint ezt Wong G.
G. és munkatársai leírják (fentebb idézett munka). A p3ACSF-69-tartalmú COS sejt kondicionált tápközeg 1:50 hígításban is aktív humán csontvelő vizsgálatban, és zömmel monocita-típusú telepeket alakít ki.
ÍV. példa
Az M-CSF molekulatömeg-elemzése
Kaufman R. I és Sharp P. A. eljárását követve [J. Mól. Bioi. 159, 601-629 (1982)] 35S metionint metabolikus úton beépítünk abba a fehérjébe, amelyet p3ACSF-69 DNS-sel átfertőzött COS sejtekkel készí8
HU 212 277 Β tettünk. Amikor 35S metioninnal jelzett p3ACSF-69tartalmú COS sejtek kondicionált tenyészközegét nem redukáló körülmények között poliakrilamid gélelektroforézissel elemezzük [Laemmli U. K.: Natúré, 227, 680-685 (1970)], egy széles csík mutatható ki mintegy 70 kD látszólagos molekulatömegnél, amely a glikozilezést jelzi. A megfelelő átfertőzés pXM vektor DNSsel nem termel ekvivalens 35S fehérje-csíkot.
A 35S metioninnal jelzett p3ACSF-69 kondicionált tenyészközeget 100 mmól/1 béta-merkapto-etanollal redukáljuk és SDS poliakrilamid gélelektroforézissel elemezzük. A 70 kD-os csík eltűnik, és egy mintegy 35 kD-s széles csík mutatható ki, amely a glikozilezést jelzi. A redukált p3ACSF-69-tartalmú COS sejt kondicionált tenyészközege inaktív mind az egér, mind a humán csontvelő vizsgálatokban. így az M-CSF fehérje a COS sejt kondicionált tenyészközegében dimerként aktív, míg alkotó monomerjeivé redukált állapotban inaktív.
A 35S-sel jelzett, redukált p3ACSF-69-et tartalmazó COS sejtek kondicionált tenyészközegét neuramidázzal (Sigma) kezeljük Bradford M. és munkatársai eljárása szerint [Anal. Biochem. 72. 248 (1976)], hogy eltávolítsuk a sziálsavat, és peptid N-glikozidáz F-fel [amelyet N-glikanáznak (Genzyme) is neveznek] kezeljük, hogy eltávolítsuk az N-kötött szénhidrátokat. Az SDS poliakrilamid gélelektroforézis elemzés egy mintegy 18 kD-s jól elkülönült csíkot tár fel a neuramidázzal és N-glikozidáz F-fel kezelt p3ACSF-69-tartalmú COS sejtek kondicionált tenyészközegében, amely a redukált, nem kezelt, 35S metioninnal jelzett, kondicionált tenyészközegben nincs jelen. A csak N-glikanázzal kezelt, redukált, 35S-sel jelzett p3ACSF-69-tartalmú COS sejtek kondicionált tenyészközegében egy mintegy 18 kD-s csíkot fedezünk fel az SDS-poliakrilamid gélelektroforetikus elemzésben.
Az N-glikozidáz F-fel és neuramidázzal végzett kísérletekből kitűnik, hogy a p3ACSF-69-ceI átfertőzött COS sejtek által termelt M-CSF fehérje két, mintegy 35 kD-s glikozilezett monomer dimerje, ahol mindegyik monomer egy mintegy 18 kD-s polipeptidet tartalmaz, amely erőteljesen módosítva van N-kapcsolt glikozilezéssel.
V. példa
M-CSF-et magas szinten kifejező CHO sejtvonalak megalkotása
Az egyik eljárás M-CSF magas szintű termelésére emlős sejtekből magában foglalja olyan sejtek megalkotását, amelyek a heterológ M-CSF gén több kópiáját tartalmazzák. A heterológ gén egy sokszorozható markerhez, pl. dihidrofolát reduktáz (DHFR) génhez kapcsolható, és a megnövekedett számú génkópiákat tartalmazó sejtek olyan módon válogathatók ki, hogy a szaporítást metotrexát (MTX) megnövekedett koncentrációinál végezzük Kaufman és Sharp eljárásai szerint (J. Mól. Bioi., fentebb idézett munka). Ezt a megközelítést lehet alkalmazni egy sor különböző típusú sejthez.
A p3ACSF-69-et és a pAdA26SV-(A)3 DHFR kifejező plazmidot (Kaufman és Sharp, Mól. Cell. Bioi., fentebb idézett munka) együtt fertőzzük át a DUKXBII DHFR-hiányos CHO sejtekbe, a kalciumfoszfátos együtt-kicsapási és fertőzési eljárással. A DHFR kifejező transzformánsokat először a növekedés alapján választjuk ki alfa tápközegekben, amely dializált borjúembrió szérumot tartalmaz, majd további szelektálást végzünk szaporítás alapján MTX növekvő koncentrációiban való növesztésnél (a növekedési lépések sora: 0,02; 0,2; 1,0 és 5 mmól/1 MTX), amint ezt Kaufman és munkatársai leírják [Mól. Cell. Bioi. 5, 1750 (1983)].
Az egyik klónról, amelyet CHO-3ACSF-69-nek nevezünk, és amelyet 0,25 mikromól/ml MTX-ben való növekedéssel szelektálunk, úgy találjuk, hogy magas szinten fejez ki biológiailag aktív M-CSF-et. Ez a sejtvonal következésképpen olyan kondicionált tenyészközeget alakít ki, amely aktív a rágcsáló makrofág telepképzés elősegítésében 1:60 000 végső hígításban. Ezeket a sejteket (1 db 10 cm-es lemez), valamint a szülő CHO sejteket jelezzük 1 mCi 35S-Met-tel (NEN) 4 ml minimál esszenciális tápközegben (MÉM) 4 órán át 37 °C hőmérsékleten. Az így létrejött kondicionált tenyészközeg mintákat nyulakban képződött, tisztított, vizelet-eredetű M-CSF elleni antiszérummal inkubáljuk. Az antigén-antitest komplexeket Staphylococcus aureus sejtekre (Calbiochem) való adszorpcióval kicsapjuk. A komplexeket szolubilizáljuk olyan ráterhelő pufferban, amelyben nincs redukálószer, Laemmli U. K. szerint [Natúré, 227, 680-685 (1970)]. Abból a célból, hogy a mintákat redukáljuk, 100 mmól/1 2-merkapto-etanolba visszük, és 37 ‘C hőmérsékleten 30 percig inkubáljuk. Az elektroforézist követően 10%-os poliakrilamid gélben, a jelzett fehérjék mintáit fluorográfiával (Enhance, NEW) láthatóvá tesszük, Kodak XAR filmet alkalmazva.
Ezeknek az immun-csapadékoknak az elemzése SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel nem redukáló körülmények között feltárja, hogy az M-CSF fehérjetermelő CHO sejtekből származó kondicionált tenyészközeg két heterológ M-CSF fehérje-fajtát tartalmaz 70-90 kD, illetve több, mint 150 kD látszólagos mérettel. Ezeknek a fehérjéknek a megfigyelt méret-heterogenitása tipikus sok glikoprotein esetén.
Ugyanazoknak a mintáknak az elemzése redukció után azt mutatja, hogy az M-CSF fehérje 70-90 kD-s fajtájának mobilitása olyan helyzetbe tolódott el, amely 35-45 kD molekulatömeggel vág egybe, míg a nagyobbik fajtára (nagyobb, mint 150 kD) a kezelés nem hat. így a CHO-3ACSF-69 sejtek legalább két különböző M-CSF fehérjét fejeznek ki: egy 70-90 kD-s fehérjét, amely 35-45 kD-s alegységek diszulfiddal kapcsolt dimerjéből áll, és egy sokkal nagyobb fajtát. A sejtvonalakat, amelyekre fentebb utaltunk, szérummentes, teljesen definiált tápközegekhez adaptáljuk.
VI. példa
M-CSF tisztítása
A CHO sejtek 0,5% borjúembrió szérumot és DMEM-F12-t tartalmazó kondicionált tenyészközegét
HU 212 277 Β
1:1 arányban hígítjuk vízzel. A hígított tápközeget azután egy QAE „Zeta-Prep” töltettel ellátott oszlopra (LKB) visszük fel, amely 40 mmól/1 trisz-szel (pH = 7,4) van kiegyensúlyozva. A meg nem kötött fehérjét tartalmazó átfolyó folyadékot elöntjük. A kötött fehérjét 40 mmól/1 trisz-szel mossuk (pH = 7,4), és eluáljuk olyan oldattal, amely 40 mmól/1 íriszt (pH = 7,4) és 0,75 mól/1 NaCl-t tartalmaz. Az eluátumot azután vízzel hígítjuk 0,5 mól/1 NaCl koncentrációra. Tween 20at adunk hozzá 0,05% koncentrációig, és ezt a keveréket mintegy 1 oszloptérfogat/óra sebességgel egy lencse Lektin-Sepharose 4B oszlopra (Pharmacia) visszük fel, amely előzőleg ki volt egyensúlyozva 20 mmól/1 triszt (pH = 7,4), 0,5 mól/1 NaCl-t és 0,05% Tween 20-at tartalmazó oldattal. Az oszlopot 2-5 térfogat oldattal mossuk, amely 20 mmól/1 triszt (pH = 7,4) és 0,5 mól/1 NaCl-t tartalmaz. A fajlagosan megkötött fehérjéket 20 mmól/1 triszt, 0,2 mól/1 alfa-metil-mannopiranozidot, 0,5 mól/1 NaCl-t és 0,05% Tween 20-at tartalmazó oldattal eluáljuk, majd megsavanyítjuk 10%-os trifluor-ecetsavas (TFA) oldattal. Az eluátumot fordított fázisú folyadék-kromatográfiának vetjük alá olyan oszlopon, amely 30% acetonitrillel és 0,1% TFAval van kiegyensúlyozva. A fehérjét növekvő acetonitril-koncentrációval eluáljuk 0,1% TFA-ban. A 45 és 50% acetonitril között összegyűjtött fehérjét csövekben semlegesítjük trisz-szel (pH = 8,5), és elemezzük.
A tisztítási eljárás magában foglal egy méret-kizárási lépést is, hogy eltávolítsuk a nagy molekulatömegű aggregátumot. Az M-CSF előzetes elemzése mintegy 106 csontvelő-egység/mg fajlagos aktivitást mutat (lásd a csontvelő-vizsgálatot a III. példában).

Claims (10)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás humán makrofág telepstimuláló faktor (humán M-CSF) előállítására, azzal jellemezve, hogy egy az I. táblázat szerinti 1-522. aminosavat és kívánt esetben az I. táblázat szerinti (-32)-(-1). aminosavat tartalmazó polipeptidet kódoló cDNS-szekvenciával alkalmas vektorba iktatva, amelyben az említett cDNSszekvencia a megfelelő expressziós szabályozó szekvenciával működőképes kapcsolatban van - alkalmas gazdasejtet transzformálunk, és a transzformált gazdasejtet tenyésztjük. (Elsőbbsége: 1986. 05. 06.)
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy cDNS-szekvenciaként az I. táblázatban megadott 242. nukleotidtól az 1583. nukleotidig terjedő nukleotidszekvenciát alkalmazzuk. (Elsőbbsége: 1986. 05. 06.)
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az I. táblázat szerinti 1-223. aminosavat és kívánt esetben az I. táblázat szerinti (-32)-(-1). aminosavat tartalmazó polipeptidet kódoló cDNS-szekvenciát alkalmazzuk. (Elsőbbsége: 1986. 05. 06.)
  4. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy cDNS-szekvenciaként az I. táblázatban megadott 242. nukleotidtól a 910. nukleotidig tetjedő nukleotidszekvenciát alkalmazzuk. (Elsőbbsége: 1986.05.06.)
  5. 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként CHO vagy COS sejtvonalat, míg cDNS-szekvenciaként az I. táblázatban megadott 146. nukleotidtól a 241. nukleotidig terjedő szignálszekvenciát is tartalmazó nukleotidszekvenciát alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1986. 05. 06.)
  6. 6. Eljárás gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy egy az 1. igénypont szerinti eljárással előállított humán M-CSF-t gyógyászatilag elfogadható segédanyagokkal és kívánt esetben további hatóanyagokkal összekeverve gyógyszerkészítménnyé alakítunk. (Elsőbbsége: 1986. 05. 06.)
  7. 7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy további hatóanyagként legalább egy hematopoietint vagy interleukint alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1986. 05. 06.)
  8. 8. Eljárás vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy egy a természetes humán M-CSF biológiai és biokémiai tulajdonságaival rendelkező fehérjét kódoló, az I. táblázat szerinti nukleotidszekvenciát vagy annak alléi változatát - expressziós szabályozó szekvenciákkal működőképes kapcsolatban - alkalmas vektorba iktatunk. (ELsőbbsége: 1986. 12. 11.)
  9. 9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagok vektorba iktatásával a p3ACSF-69 jelű plazmidot állítjuk elő. (Elsőbbsége: 1986. 12. 11.)
  10. 10. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy nukleotidszekvenciaként az I. táblázat szerinti 242. nukleotidtól a 910. nukleotidig terjedő nukleotidszekvenciát alkalmazzuk. (Elsőbbsége: 1987. 04. 13.)
HU872369A 1986-05-06 1987-04-13 Process for producing m-csf HU212277B (en)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US06/860,377 US4879227A (en) 1986-05-06 1986-05-06 Production of a recombinant human colony stimulating factor
US06/940,362 US4868119A (en) 1986-12-11 1986-12-11 Hematopoietic growth factors
PCT/US1987/000835 WO1987006954A1 (en) 1986-05-06 1987-04-13 Production of m-csf

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT47979A HUT47979A (en) 1989-04-28
HU212277B true HU212277B (en) 1996-04-29

Family

ID=27127565

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU872369A HU212277B (en) 1986-05-06 1987-04-13 Process for producing m-csf

Country Status (21)

Country Link
US (1) US5573763A (hu)
EP (1) EP0307402B1 (hu)
JP (2) JP2579981B2 (hu)
KR (1) KR960004453B1 (hu)
AT (1) ATE92966T1 (hu)
AU (1) AU606056B2 (hu)
CA (1) CA1334942C (hu)
DE (1) DE3787020T2 (hu)
DK (1) DK2688A (hu)
ES (1) ES2007341A6 (hu)
FI (1) FI884877A0 (hu)
GR (1) GR870688B (hu)
HU (1) HU212277B (hu)
IE (1) IE60835B1 (hu)
IL (1) IL82400A0 (hu)
MX (1) MX9203130A (hu)
MY (1) MY101209A (hu)
NO (1) NO880022L (hu)
OA (1) OA09112A (hu)
PH (1) PH24301A (hu)
WO (1) WO1987006954A1 (hu)

Families Citing this family (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5573930A (en) * 1985-02-05 1996-11-12 Cetus Oncology Corporation DNA encoding various forms of colony stimulating factor-1
US5422105A (en) * 1985-02-05 1995-06-06 Cetus Oncology Corporation Use of recombinant colony stimulating factor 1
US5556620A (en) * 1985-02-05 1996-09-17 Cetus Oncology Corporation Use of recombinant colony stimulating factor-1 to enhance wound healing
US6156300A (en) * 1985-02-05 2000-12-05 Chiron Corporation Point mutants of N∇2 CSF-1 and carboxy truncated fragments thereof
US6103224A (en) * 1985-02-05 2000-08-15 Chiron Corporation N∇2 CSF-1 (short form) and carboxy truncated fragments thereof
US5837229A (en) * 1985-02-05 1998-11-17 Chiron Corporation Uses of recombinant colony stimulating factor-1
WO1986004607A1 (en) * 1985-02-05 1986-08-14 Cetus Corporation Recombinant colony stimulating factor-1
US4847201A (en) * 1985-02-05 1989-07-11 Cetus Corporation DNA encoding for CSF-1 and accompanying recombinant systems
US5104650A (en) * 1985-02-05 1992-04-14 Cetus Corporation Uses of recombinant colony stimulating factor-1
US4808611A (en) * 1986-07-30 1989-02-28 Immunex Corporation Use of interleukin-1 to induce development of multipotent hemopoietic cell populations
US5650297A (en) * 1986-09-17 1997-07-22 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. DNA encoding human colony-stimulating factors
JP2583770B2 (ja) * 1986-09-17 1997-02-19 大塚製薬株式会社 遺伝子
JP2583829B2 (ja) * 1986-09-17 1997-02-19 大塚製薬株式会社 ヒトｍ−ｃｓｆ
JPH07100720B2 (ja) * 1987-07-17 1995-11-01 森永乳業株式会社 コロニー刺激因子の製造法
CA1339757C (en) * 1987-04-16 1998-03-17 Robert F. Halenbeck Production of purified biologically active, bacterially produced recombinant human csf-1
IL86090A (en) * 1987-04-16 1993-03-15 Cetus Oncology Corp Production of purified, biologically active, bacterially produced recombinant human csf-1
US4929700A (en) * 1987-04-16 1990-05-29 Cetus Corporation Production of purified, biologically active, bacterially produced recombinant human CSF-1
EP0643972B1 (en) * 1987-09-22 2002-03-06 Chiron Corporation Use of recombinant colony stimulating factor-1 for the preparation of a medicament for cytomegalovirus infections
US5260421A (en) * 1987-12-21 1993-11-09 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Site-directed mutagenesis modified glycoprotein hormones
US4847325A (en) * 1988-01-20 1989-07-11 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
DK54589A (da) * 1988-02-08 1989-08-09 Otsuka Pharma Co Ltd Humane kolonistmulerende faktorer
JPH0610137B2 (ja) * 1988-02-29 1994-02-09 新技術事業団 ヒト単球−マクロファージコロニー刺激因子を有効成分とする造血器疾患治療剤
WO1989010158A1 (en) * 1988-04-27 1989-11-02 Immunomedics, Inc. Improved radiotherapy
US5888495A (en) * 1988-05-23 1999-03-30 Genetics Institute, Inc. Method of producing storage stable M-CSF lyophilizates
US5171675A (en) * 1988-07-28 1992-12-15 Cerretti Douglas P Macrophage colony stimulating factor-γ
WO1990008554A1 (en) * 1989-01-30 1990-08-09 Schering Corporation Treatment of leukocyte dysfunction with gm-csf
ES2091816T3 (es) * 1989-02-10 1996-11-16 Cetus Oncology Corp Anticuerpos monoclonales del factor estimulador de colonias de macrofagos (m-csf) que reconocen un epitope conformacional neutralizante.
CA2011050C (en) * 1989-02-28 2000-08-08 Fumimaro Takaku Human monocyte-machrophage-csf preparations
US5288487A (en) * 1989-02-28 1994-02-22 Morinaga Milk Industry Co., Ltd. Human monocyte-macrophage-CSF preparations
AU5355790A (en) * 1989-04-19 1990-11-16 Cetus Corporation Multifunctional m-csf proteins and genes encoding therefor
EP0410751B1 (en) * 1989-07-27 1996-04-10 Denki Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha Gene encoding M-CSF and related recombinant systems thereof
AU6125294A (en) * 1993-01-13 1994-08-15 Genetics Institute Inc. Process for producing m-csf 223
DE69738521T2 (de) 1996-04-05 2009-05-07 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc., Emeryville Alphaviren-vektors mit einer reduzierten inhibierung der synthese von zellmakromolekülen
US6455678B1 (en) * 1996-04-26 2002-09-24 Amcell Corporation Human hematopoietic stem and progenitor cell antigen
CA2260014A1 (en) * 1996-07-10 1998-01-15 Meiji Milk Products Co., Ltd. Novel use of mk family as hematopoietic factor
EP2266542A3 (en) * 1998-10-01 2013-07-31 Elan Pharma International Limited Controlled release nanoparticulate compositions
US7108852B2 (en) 2000-03-20 2006-09-19 Warner-Lambert Company Llc Methods of treating inflammation using antibodies to M-CSF
AR045563A1 (es) * 2003-09-10 2005-11-02 Warner Lambert Co Anticuerpos dirigidos a m-csf
WO2008060610A2 (en) * 2006-11-17 2008-05-22 Biogen Idec Ma Inc. Systemic administration of colony stimulating factors to treat amyloid associated disorders
WO2024017998A1 (en) 2022-07-21 2024-01-25 Technische Universität Dresden M-csf for use in the prophylaxis and/or treatment of viral infections in states of immunosuppression
EP4309666A1 (en) 2022-07-21 2024-01-24 Technische Universität Dresden M-csf for use in the prophylaxis and/or treatment of viral infections in states of immunosuppression

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4784949A (en) * 1984-04-19 1988-11-15 Cetus Corporation Universal dominant selectable marker cassette
US4847201A (en) * 1985-02-05 1989-07-11 Cetus Corporation DNA encoding for CSF-1 and accompanying recombinant systems
WO1986004607A1 (en) * 1985-02-05 1986-08-14 Cetus Corporation Recombinant colony stimulating factor-1
WO1986004587A1 (en) * 1985-02-05 1986-08-14 Cetus Corporation Purification of native colony stimulating factor-1
JP2583770B2 (ja) * 1986-09-17 1997-02-19 大塚製薬株式会社 遺伝子
JP2644794B2 (ja) * 1986-10-24 1997-08-25 カイロン コーポレイション 新規な型のコロニー刺激因子―１

Also Published As

Publication number Publication date
JPH07147989A (ja) 1995-06-13
DE3787020D1 (de) 1993-09-16
EP0307402A4 (en) 1990-02-22
FI884877A (fi) 1988-10-21
IE870994L (en) 1987-11-06
IE60835B1 (en) 1994-08-24
DK2688D0 (da) 1988-01-05
JP2579981B2 (ja) 1997-02-12
PH24301A (en) 1990-05-29
MX9203130A (es) 1992-07-01
GR870688B (en) 1987-09-07
AU606056B2 (en) 1991-01-31
FI884877A0 (fi) 1988-10-21
NO880022D0 (no) 1988-01-05
US5573763A (en) 1996-11-12
MY101209A (en) 1991-08-17
EP0307402A1 (en) 1989-03-22
OA09112A (en) 1991-10-31
DE3787020T2 (de) 1993-12-16
ATE92966T1 (de) 1993-08-15
DK2688A (da) 1988-03-07
IL82400A0 (en) 1987-11-30
NO880022L (no) 1988-01-05
EP0307402B1 (en) 1993-08-11
KR880701288A (ko) 1988-07-26
HUT47979A (en) 1989-04-28
AU7289087A (en) 1987-12-01
KR960004453B1 (en) 1996-04-06
CA1334942C (en) 1995-03-28
WO1987006954A1 (en) 1987-11-19
ES2007341A6 (es) 1989-06-16
JPH01502397A (ja) 1989-08-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU212277B (en) Process for producing m-csf
US4868119A (en) Hematopoietic growth factors
US4959455A (en) Primate hematopoietic growth factors IL-3 and pharmaceutical compositions
EP0494268B1 (en) Method for inhibiting growth of stem cells
EP0316319B1 (en) Production and use of non-glycosylated IL-6
US6066317A (en) Method of using IL-11 for treating deficiencies in hematopoietic progenitor or stem cells
US4877729A (en) Recombinant DNA encoding novel family of primate hematopoietic growth factors
US5639453A (en) Therapeutic uses of IL-3
AU641949B2 (en) Compositions and methods for treating or preventing infections in canine and feline animals
US6348191B1 (en) Production and use of IL-6
US6284237B1 (en) Methods of treatment using IL-6
KR970004941B1 (ko) 신규 영장류 조혈 성장 인자족(family) 발현용 벡터 및 형질전환체
IE871727L (en) Novel family of primate il3-like hematopoietic growth¹factors.

Legal Events

Date Code Title Description
HPC4 Succession in title of patentee

Owner name: GENETICS INSTITUTE, LLC, US

HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee