HU211056B - Method of preparation of improved l-lysine-producing microorganismen - Google Patents
Method of preparation of improved l-lysine-producing microorganismen Download PDFInfo
- Publication number
- HU211056B HU211056B HU9202242A HU224292A HU211056B HU 211056 B HU211056 B HU 211056B HU 9202242 A HU9202242 A HU 9202242A HU 224292 A HU224292 A HU 224292A HU 211056 B HU211056 B HU 211056B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- lysine
- strains
- caprolactam
- microorganisms
- acl
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
Landscapes
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
A találmány tárgya eljárás L-lizin termeléséhez szükséges mikroorganizmusok előállítására.
Az L-lizin eszenciális aminosav, és széleskörűen alkalmazzák élelmiszer- és állati takarmány-adalékként. A gyógyászatban is alkalmazzák infúziós oldatok alkotórészeként.
Az L-lizint fehérjék savval végzett hidrolízisével, D,L-lizin szintézise és a racemát ezt követő szétválasztása útján, valamint mikroorganizmusok segítségével végzett szintézissel állítják elő. Az L-lizin előállítására szolgáló mikrobiológiai eljárásokat például a Trends in Biotechnology I, 70-74 (1983) közleményben írnak le.
Bizonyos Corynebacterium és Brevibacterium nemzetségbe tartozó mikroorganizmusok képesek lizint termelni és kiválasztani. Körülbelül 109-10’° baktérium közül egy olyan baktérium (mutáns) van, amely a lizint lényegesen nagyobb mennyiségben termeli, mint a többi baktérium. A mutánsok száma 106 sejt között eggyel növelhető mutagenézíssel, például Nmetil-N'-nitro-N-nitrozo-guanidinnel.
Azonban továbbra is fennáll ezeknek a mutánsoknak az összes többi baktérium közül történő kiválasztásának nehézsége. Rendszerint ezt egy szelektív agar alkalmazásával oldják meg. Ez a szelektív agar olyan anyagokat tartalmaz, amelyek a mutánsokat szelektálják, azaz a nemkívánatos mikroorganizmusok növekedését gátolják. Lizint termelő mikroorganizmusok esetében ilyen anyag például az amino-etil-cisztein, ahidroxi-valeriánsav stb. A kaprolaktámok is alkalmasnak bizonyultak lizint termelő mikroorganizmusok szelektálására. így a 175 309 számon nyilvánosságra hozott európai szabadalmi bejelentés, illetve az 5119 186 számon nyilvánosságra hozott japán szabadalmi bejelentés α-szubsztituált amino-e-kaprolaktámok, illetve oc-halogén-e-kaprolaktámok ilyen célú felhasználását ismerteti. Különösen előnyös az a-klór-e-kaprolaktám (CCL). Ezekkel a szelektálás valószínűsége 1:10’-5.
Ha a szelekciós vegyületet, például az a-klór-εkaprolaktámot sikeresen alkalmaztuk, a szelektált, lizint termelő mikroorganizmusok rezisztenssé válnak erre a szelekciós vegyületre. Ezzel a vegyülettel már nem lehetséges további szelekció. Az a-klór-e-kaprolaktámhoz való nagyfokú szerkezeti hasonlóság ellenére azonban további szelekciós lehetőséget kínál az aazido-e-kaprolaktám (ACL). Ezt igazolják a CCL rezisztens mutánsoknak ACL jelenlétében tapasztalt növekedési gátlása (érzékenysége). Megfordítva, az ACL-re rezisztens mutánsok nem szelektálhatok CCLel. Ezek a mikroorganizmusok CCL-re is rezisztensek és nem mulatnak növekedési gátoltságot.
Az a-azido-e-kaprolaktám alkalmazása a korábban ismert kaprolaktámok helyett növeli egy alkalmas mikroorganizmus megtalálásának esélyét. Ezt bizonyítja az a tény is, hogy az ismert kaprolaktámokra rezisztens törzsek tovább szelektálhatok a-azido-e-kaprolaktám jelenlétében és így olyan törzsek találhatók, amelyek a lizint nagyobb hozammal termelik. Az a-azido-e-kaprolaktám tehát lehetővé teszi jobb lizin-termelóképességű törzsek gyorsabb kiválasztását.
Találmányunk eljárás fokozott L-lizin-termelőképességű mikroorganizmusok előállítására a Corynebacterium és Brevibacterium nemzetségekhez tartozó mikroorganizmusok ismert mutagénekkel ismert módon végzett mutációjával és szelekciójával, oly módon, hogy az említett nemzetségbe tartozó, L-lizint termelő törzseket mutálunk, és szelektáljuk azokat a törzseket, amelyek a-azido-e-kaprolaktám által kifejtett visszacsatolásos gátlással szemben rezisztensek.
Meglepő módon az a-azido-e-kaprolaktám a mutagenezis utáni mutánsszelekció során lényegesen hatásosabbnak bizonyult, mint az 51-19 186 számú japán és a 175 309 számú európai nyilvánosságra hozott bejelentésekben közölt vegyületek, például a fluor- vagy klór-kaprolaktám vagy az α-szubsztituált amino-e-kaprolaktámok.
Azido-kaprolaktámmal végzett szelekcióval a törzsek lizintermelése több, mint 10%-kal fokozható.
A találmány szerint a mutánsok hagyományos mutagenezissel. például N-metil-N'-nitro-N-nitrozo-guanidinnel vagy ultraibolya fénnyel való besugárzással végzett kezeléssel állíthatók elő.
A Corynebacterium (C) és Brevibacterium (B) nemzetséghez tartozó mikroorganizmusok közül például a következők megfelelők:
B. amoniagenis, B. divaricatum, B. flavum, B. ketoglutamicum, B. lactofermentum, B. linens, B. sp., C. acetoacidophilum. C. acetoglutamicum, C. glutamicum, C. lilum és C. sp. Előnyös a B. flavum és C. glutamicum, különösen a B. flavum ATCC 21 474 és a C. glutamicum ATCC 21 526. Az utóbbinak az a különleges előnye van, hogy homoszerin-tűrő, és ezenkívül S-(2-amino-etil)-L-ciszteinnel szemben rezisztens.
Mint már említettük, kedvező, ha a törzsek homoszerin-tűrők. Továbbá jó, ha a törzsek S-(2-amino-etil)-Lciszteinnel szemben is rezisztensek. Mivel ez a rezisztencia nincs meg a törzsekben, ez a 3 707 441 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás szerint a törzsek N-metil-N'-nitro-N-nitrozo-guanidinnel végzett kezelésével és ezt követő szelekciójával vihető be.
1. példa
Corynebacterium glutamicum ATCC 21 526-ot 6,0 pH-jú trisz/maleinsav pufferban 30 °C-on 30 percig kezelünk 250 pg/ml N-metil-N'-nitro-N-nitrozo-guanidinnel. Utána a sejteket 7,2 pH-jú 0,1 mólos trisz pufferral mossuk, minimál agarlemezeken szélesztjük, és ezt követően 4-14 napig inkubáljuk 28 °C-on.
A minimál agar összetétele a következő:
g/1 agar g/1 ammónium-szulfát
0,5 g/1 kálium-dihidrogén-foszfát
0,4 g/1 magnézium-szulfát - 7 víz
0,01 g/1 vas(II)-szulfát - 7 víz
0,1 g/1 mangán-szulfát - víz
100 μ g/1 biotin
30-30 mg/1 metionin, treonin és leucin g/1 laktát mmol/l a-azido-e-kaprolaktám pH = 7,0.
HU 211 056 Β
A telepekből, amelyek inkubálás után a fenti összetételű agarlemezeken fejlődnek, kiválogatjuk azokat, amelyek lizint termelnek. Azt a törzset izoláljuk, amely a kiindulási törzsnél 10%-kal több lizint termel.
A találmány szerint szelektált mikroorganizmusok lizint termelő képességét vizsgáltuk az a-klór-e-kaprolaktámmal szelektált mikroorganizmusokkal összehasonlítva.
A mikroorganizmusokat a Biochem. Biophys. Rés. Commun. 18, 788 (1965) és a Manual of Methods fór General Bacteriology, American Society fór Microbiology, Washington, D. C. (1981) közleményekben ismerten általános módszerek szerint mutáltuk a következő módon:
A baktériumokat Luria táptalajon [Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. 433 (1972)] logaritmikus középszakaszig tenyésztettük (optikai sűrűség 575 nm 0,5-nél). Ezt követően a sejteket centrifugáltuk (10 perc, 4 °C, 5000xg), kétszer 100 mmólos trisz/HCl pufferrel (pH 7.2) mostuk és azonos térfogatú trisz/maleinsav pufferben (pH 6,0) ismét szuszpendáltuk.
0,5 ml így készített sejthez trisz/maleinsav puffért (pH 6,0) adva 4,75 ml-re kiegészítettük. Az elegyhez 0,25 ml dimetilformamidban 250 pmoL/ml N-metil-N'nitro-N-nitrozo-guanidint adtunk. A sejteket 30 percig 30 °C-on rázás nélkül inkubáltuk.
Ezt követően a sejteket kétszer 100 mmólos trisz/HCl pufferrel (pH 7,2) mostuk, hígítás után az előzőkben ismertetett összetételű minimál agaron szélesztettük és 40 mmol a-azido-e-kaprolaktámmal (ACL) vagy 60 mmol a-klór-e-kaprolaktámmal (CCL) szelektáltuk.
4-14 nap elteltével a rezisztens telepek kifejlődtek és megvizsgáltuk lizint termelő képességüket az US 4 066 501 számú szabadalmi leírásban ismertetett táptalajon 48 órás tenyésztési idő után.
A következő táblázatban ACL vagy CCL rezisztenciájuk alapján szelektált néhány törzs fenotípusának lizint termelő képességét adjuk meg.
ACLS = a-azido-e-kaprolaktám érzékeny
ACLr = a-azido-e-kaprolaktám rezisztens
CCLS = a-klór-e-kaprolaktám érzékeny
CCLr = a-klór-e-kaprolaktám rezisztens
Lizint termelő képesség
| Szülötörzs | Törzs | Fenotípus | Lizin, g/1 |
| ATCC 21 526 | Lul485 | ACL5 | 42 |
| ATCC 21 526 | Lu6570 | ACLr | 63 |
| ATCC 21 526 | Lu6571 | ACLr | 58 |
| Szülőtörzs | Törzs | Fenotípus | Lizin, g/1 |
| ATCC 21 526 | Lu6715 | ACLr | 66 |
| ATCC 21 474 | Lu3383 | ACL5 | 32 |
| ATCC 21 474 | Lu6464 | ACLr | 45 |
| ATCC 21 474 | Lu6566 | ACLr | 44 |
| ATCC 21 474 | Lu6567 | ACLr | 45 |
| ATCC 21 527 | Lu5951 | CCL5, ACL5 | 40 |
| ATCC 21 527 | Lu6511 | CCLr, ACL5 | 49 |
A táblázatban megadott eredmények azt mutatják, hogy az ACL nagyobb mértékben növeli a lizin termelést, mint a CCL.
Az ismertetett körülmények között 40 mmol CCLnek nincs szelekciós hatása.
A CCL-rezisztens Brevibacterium lactofermentum NRRL Β 11 470 mutáns (US 4 411 997 sz. leírás) a minimális táptalajon 80 mmol ACL-al lényegesen kisebb mértékben fejlődött, míg a C. glutamicum ATCC 21 526-ból származó ACL-rezisztens Lu6715 mutáns nem mutatott csökkenést 80 mmol CCL-ot tartalmazó minimális közegben.
A C. glutamicum Lu6511 törzset mutagenezis után 60 mmol CCL-mal szembeni rezisztencia alapján a C. glutamicum ATCC 21 527 törzsből szelektáltuk. A Lu6511 törzs jól szaporodik 60 mmol CCL-ot tartalmazó minimális táptalajon, de nem szaporodik 40 mmol ACL-ot tartalmazó táptalajon. Ugyanez érvényes a C. glutamicum ATCC 21 526 és ATCC 13 032 szülőtörzsekből származó CCL rezisztens mutánsokra is.
Ez a megállapítás összhangban van azzal a ténnyel, hogy a CCL-rezisztens törzsek szelektálása javítható ACL-mal végzett szelekcióval, de ez nem igaz megfordítva.
Claims (1)
- SZABADALMI IGÉNYPONTEljárás fokozott L-lizin-termelőképességű mikroorganizmusok előállítására Corynebacterium vagy Brevibacterium nemzetséghez tartozó mikroorganizmusok ismert mutagénekkel ismert módon végzett mutációjával és szelekciójával, azzal jellemezve, hogy az említett nemzetségbe tartozó, L-lizint termelő mutáns törzsek közül szelektáljuk azokat a törzseket, amelyek a-azido-e-kaprolaktám által kifejtett visszacsatolásos gátlással szemben rezisztensek, és izoláljuk a kiindulási törzsekhez képest legalább 10% termelésjavulást mutató törzseket.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4023576A DE4023576A1 (de) | 1990-07-25 | 1990-07-25 | Verfahren zur herstellung von l-lysin produzierenden mikroorganismen |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9202242D0 HU9202242D0 (en) | 1992-10-28 |
| HUT68739A HUT68739A (en) | 1995-05-17 |
| HU211056B true HU211056B (en) | 1995-10-30 |
Family
ID=6410961
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9202242A HU211056B (en) | 1990-07-25 | 1991-07-13 | Method of preparation of improved l-lysine-producing microorganismen |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0540556B1 (hu) |
| JP (1) | JPH05508543A (hu) |
| CA (1) | CA2075044C (hu) |
| DE (2) | DE4023576A1 (hu) |
| FI (1) | FI106043B (hu) |
| HU (1) | HU211056B (hu) |
| WO (1) | WO1992001785A1 (hu) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4204361A1 (de) * | 1992-02-14 | 1993-08-19 | Degussa | Verfahren zur herstellung von l-lysin durch fermentation von coryneformen bakterien |
| KR100688575B1 (ko) * | 2004-10-08 | 2007-03-02 | 삼성전자주식회사 | 비휘발성 반도체 메모리 소자 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0175309A3 (en) * | 1984-09-14 | 1987-11-11 | Toray Industries, Inc. | A method for producing l-lysine |
-
1990
- 1990-07-25 DE DE4023576A patent/DE4023576A1/de not_active Withdrawn
-
1991
- 1991-07-13 EP EP91912793A patent/EP0540556B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-07-13 JP JP91511992A patent/JPH05508543A/ja active Pending
- 1991-07-13 WO PCT/EP1991/001316 patent/WO1992001785A1/de active IP Right Grant
- 1991-07-13 DE DE59103718T patent/DE59103718D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-07-13 HU HU9202242A patent/HU211056B/hu not_active IP Right Cessation
- 1991-07-13 CA CA002075044A patent/CA2075044C/en not_active Expired - Fee Related
-
1992
- 1992-12-28 FI FI925887A patent/FI106043B/fi active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2075044C (en) | 2001-07-10 |
| HU9202242D0 (en) | 1992-10-28 |
| FI925887A0 (fi) | 1992-12-28 |
| HUT68739A (en) | 1995-05-17 |
| EP0540556A1 (de) | 1993-05-12 |
| DE59103718D1 (de) | 1995-01-12 |
| CA2075044A1 (en) | 1992-01-26 |
| DE4023576A1 (de) | 1992-01-30 |
| JPH05508543A (ja) | 1993-12-02 |
| FI925887A (fi) | 1992-12-28 |
| FI106043B (fi) | 2000-11-15 |
| WO1992001785A1 (de) | 1992-02-06 |
| EP0540556B1 (de) | 1994-11-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5393671A (en) | Mutant Escherichia coli capable of enhanced L-glutamic acid production | |
| US5595906A (en) | Corynebacterium strain for producing L-tryptophan decreased in phosphoenolpyruvate carboxylase activity | |
| US5908768A (en) | Process for producing L-glutamic acid by fermentation with E. coli resistant to aspartic acid antimetabolite | |
| US3707441A (en) | Method of producing l-lysine by fermentation | |
| US4996147A (en) | Process for producing L-threonine by fermentation | |
| FR2461749A1 (fr) | Micro-organisme obtenu par une technique de recombinaison genetique et son utilisation dans la preparation de la l-lysine par fermentation | |
| HU214909B (hu) | Eljárás L-triptofán előállítására | |
| JPH0728749B2 (ja) | Ｌ−アルギニンの製造法 | |
| KR950005133B1 (ko) | L-발린의 제조방법 | |
| JPS6257315B2 (hu) | ||
| US5695972A (en) | Method for producing L-isoleucine with a fermentation process | |
| US4588687A (en) | Method for producing L-tryptophan by fermentation | |
| US5188949A (en) | Method for producing L-threonine by fermentation | |
| KR100438146B1 (ko) | L-루이신생산미생물인코리네박테리움글루타미컴ch25 | |
| Tsuchida et al. | Improvement of an L-leucine-producing mutant of Brevibacterium lactofermentum 2256 by genetically desensitizing it to α-acetohydroxy acid synthetase | |
| US4601982A (en) | Method for producing L-tryptophan by fermentation with a brevibacterium flavum mutant | |
| HU211056B (en) | Method of preparation of improved l-lysine-producing microorganismen | |
| EP0213536A2 (en) | Process for producing L-threonine by fermentation | |
| JP3006929B2 (ja) | 発酵法によるｌ−バリンの製造法 | |
| US3759789A (en) | Process for the microbial production of lysine and isoleucine | |
| HU200797B (en) | Process for producing l-lysine | |
| US4560652A (en) | Process for producing L-tryptophan by fermentation | |
| JPH0665314B2 (ja) | 発酵法によるｌ−バリンの製造法 | |
| EP0469517A2 (en) | Process for producing L-glutamic acid | |
| EP0117740A2 (en) | Process for producing L-glutamic acid by fermentation and mutant microorganisms for use therein |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HMM4 | Cancellation of final prot. due to non-payment of fee |