HU205263B - Process for producing vaccine against streptococcus infections - Google Patents
Process for producing vaccine against streptococcus infections Download PDFInfo
- Publication number
- HU205263B HU205263B HU884433A HU443388A HU205263B HU 205263 B HU205263 B HU 205263B HU 884433 A HU884433 A HU 884433A HU 443388 A HU443388 A HU 443388A HU 205263 B HU205263 B HU 205263B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- protein
- streptococcus
- virulent
- typhimurium
- mice
- Prior art date
Links
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 title claims description 44
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 title claims description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 28
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims description 20
- 230000008569 process Effects 0.000 title description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 47
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 47
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 43
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 39
- 101710085938 Matrix protein Proteins 0.000 claims description 34
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 claims description 34
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 claims description 25
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 12
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 12
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 11
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 claims description 9
- 241000194023 Streptococcus sanguinis Species 0.000 claims description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims 1
- 230000001662 opsonic effect Effects 0.000 abstract description 19
- 241000193996 Streptococcus pyogenes Species 0.000 abstract description 13
- 108010010318 streptococcal M protein Proteins 0.000 abstract description 13
- 206010061372 Streptococcal infection Diseases 0.000 abstract description 9
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 abstract description 5
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 abstract description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 41
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 35
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 28
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 27
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 26
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 23
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 22
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 19
- ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 4-aminobenzoic acid Chemical compound NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 14
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 14
- 241000894007 species Species 0.000 description 13
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 11
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 11
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 10
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 10
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 9
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 9
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 9
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 8
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 8
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 8
- GLDQAMYCGOIJDV-UHFFFAOYSA-N 2,3-dihydroxybenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC(O)=C1O GLDQAMYCGOIJDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 7
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 7
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 6
- 229960004050 aminobenzoic acid Drugs 0.000 description 6
- 210000005003 heart tissue Anatomy 0.000 description 6
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 6
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 241001505901 Streptococcus sp. 'group A' Species 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 5
- 230000014207 opsonization Effects 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- 201000003068 rheumatic fever Diseases 0.000 description 5
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 4
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 4
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 4
- OOYGSFOGFJDDHP-KMCOLRRFSA-N kanamycin A sulfate Chemical compound OS(O)(=O)=O.O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N OOYGSFOGFJDDHP-KMCOLRRFSA-N 0.000 description 4
- 229960002064 kanamycin sulfate Drugs 0.000 description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 4
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 4
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 4
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 4
- 229940082044 2,3-dihydroxybenzoic acid Drugs 0.000 description 3
- 241001167018 Aroa Species 0.000 description 3
- 101100491986 Emericella nidulans (strain FGSC A4 / ATCC 38163 / CBS 112.46 / NRRL 194 / M139) aromA gene Proteins 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 3
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 3
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000000181 anti-adherent effect Effects 0.000 description 3
- 101150037081 aroA gene Proteins 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 3
- 230000034994 death Effects 0.000 description 3
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 3
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- 241000197194 Bulla Species 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241001607429 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium str. SL1344 Species 0.000 description 2
- 101100129180 Streptococcus pyogenes serotype M5 emm5 gene Proteins 0.000 description 2
- 208000002352 blister Diseases 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- APGFPQCBDNWQSB-UHFFFAOYSA-N cyclohexa-1,3-diene-1-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CCC1 APGFPQCBDNWQSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 2
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 2
- ZGEGCLOFRBLKSE-UHFFFAOYSA-N methylene hexane Natural products CCCCCC=C ZGEGCLOFRBLKSE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 208000004124 rheumatic heart disease Diseases 0.000 description 2
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- QCHFTSOMWOSFHM-WPRPVWTQSA-N (+)-Pilocarpine Chemical compound C1OC(=O)[C@@H](CC)[C@H]1CC1=CN=CN1C QCHFTSOMWOSFHM-WPRPVWTQSA-N 0.000 description 1
- UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N -2-Amino-4-hydroxybutanoic acid Natural products OC(=O)C(N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000509639 Agama Species 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 239000005711 Benzoic acid Substances 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 230000007023 DNA restriction-modification system Effects 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 241000588914 Enterobacter Species 0.000 description 1
- 241000305071 Enterobacterales Species 0.000 description 1
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 1
- 241000194032 Enterococcus faecalis Species 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 241000588915 Klebsiella aerogenes Species 0.000 description 1
- 241000588747 Klebsiella pneumoniae Species 0.000 description 1
- UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N L-homoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241000194034 Lactococcus lactis subsp. cremoris Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000036675 Myoglobin Human genes 0.000 description 1
- 108010062374 Myoglobin Proteins 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 101710194807 Protective antigen Proteins 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 208000025747 Rheumatic disease Diseases 0.000 description 1
- QCHFTSOMWOSFHM-UHFFFAOYSA-N SJ000285536 Natural products C1OC(=O)C(CC)C1CC1=CN=CN1C QCHFTSOMWOSFHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001138501 Salmonella enterica Species 0.000 description 1
- 241000596091 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Anatum Species 0.000 description 1
- 241001354013 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis Species 0.000 description 1
- 241000607132 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Gallinarum Species 0.000 description 1
- 241000210647 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Montevideo Species 0.000 description 1
- 241001546666 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Newport Species 0.000 description 1
- 241000531795 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Paratyphi A Species 0.000 description 1
- 241000577475 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Paratyphi C Species 0.000 description 1
- 241000293871 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi Species 0.000 description 1
- 241000405383 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium str. LT2 Species 0.000 description 1
- 241000607768 Shigella Species 0.000 description 1
- 241001134658 Streptococcus mitis Species 0.000 description 1
- 241000194024 Streptococcus salivarius Species 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 208000037386 Typhoid Diseases 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 210000003484 anatomy Anatomy 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003095 anti-phagocytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000003292 diminished effect Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 229940092559 enterobacter aerogenes Drugs 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000224 granular leucocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 230000007108 local immune response Effects 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 229940031348 multivalent vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 229940126578 oral vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 238000012510 peptide mapping method Methods 0.000 description 1
- 229960001416 pilocarpine Drugs 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 101150079601 recA gene Proteins 0.000 description 1
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000000552 rheumatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 210000005070 sphincter Anatomy 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 201000008297 typhoid fever Diseases 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 239000012130 whole-cell lysate Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/746—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for lactic acid bacteria (Streptococcus; Lactococcus; Lactobacillus; Pediococcus; Enterococcus; Leuconostoc; Propionibacterium; Bifidobacterium; Sporolactobacillus)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/09—Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
- A61K39/092—Streptococcus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/879—Salmonella
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/885—Streptococcus
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Public Health (AREA)
- Mycology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
A találmány tárgya eljárás Streptococcus-fertőzések, elsősorban a Streptococcus A csoport fertőzései elleni immunizálásra alkalmas vakcina előállítására.
A találmány szerinti megoldás széles körben tarthat számot érdeklődésre, mivel eddig nem volt ismert olyan élő biológiai hordozó, amely egy virulens baktérium védő antigénjét hordozza, ahol ez az antigén alkalmas a virulens baktérium által okozott fertőzések elleni immunizálásra.
Több mint 60 éve folynak kutatások biztonságos és hatékony vakcina kidolgozására Streptococcus A csoport azon törzsei ellen, amelyek reumás lázat és reumatikus szívbetegséget okoznak [Lancefield: „Current Knowledge of Type-Specífic M Protein Ántigens to Group A Streptococci”, J. Immunoi. 89, 307-313 (1962)]. Néhány baktériumfajjal kapcsolatban intenzívebb kutatást folytattak a század folyamán, így pl. a Streptococcus pyogenes vagy a Streptococcus A csoport tagjai kapcsán. Ahogyan a meggyőző bizonyítékok szaporodtak arra nézve, hogy ez az organizmus az elsődleges, sőt kizárólagos okozója az akut reumatikus láznak, a kutatók keresték a meghatározás lehetőségeit, és erőfeszítéseket tettek arra nézve, hogy kiválasszák a baktériumnak azt a termékét, amelynek toxikus vagy antigén komponensei beindítják a reumatikus folyamatot. A reumás lázzal és a Streptococcusfertőzésekkel kapcsolatban lásd Stollerman: Rheumatic Fever and Streptococcal Infection (New York Clinical Cardiological Monographs; Grune and Stratton, 1975). A Streptococcus A csoport tagjai elleni immunitásban az M fehérje központi szerepével kapcsolatban ad Stollerman összefoglalót. Referenciákat adnak erről a témáról Beachey és Seyer is [„Primary Structure and Immunochemistry of Group A Streptococcal M Proteins”, Seminars in Infections Disease, 4, 401-410 (szerkesztők: Robbins J. B., Hill J. C. és Sadoff J. C.; kiadó: Georg Thieme Verlag, New York és Stuttgart, 1982)].
A vakcina kifejlesztésében a legtöbb erőfeszítés meghiúsult a súlyos toxikus reakciók miatt, amelyet csaknem minden Streptococcus-eredetű termék előidéz, ha embernek adagolják. Ezek közül a termékek közül néhányról kimutatták, hogy olyan antitesteket vált ki, amelyek keresztreakcióba lépnek a gazdaszervezet szöveteivel, elsősorban a szív szöveteivel. [Káplán és Meyerserian: „An Immunological Cross-Reaction Between Group A Streptococcal Cells and Humán Heart Tissue”, Láncét, 1. kötet, 706-710 (1962); Zabriskie és Freimer: „An Immunological Relationshíp Between the Group A Streptococcus and Mammalian Muscle”, J. Exp. Med. 124, 661-678 (1966)]. Bár már régen megállapították, hogy a Streptococcus A csoport felületén levő M fehérje tartalmazza ezeknek az organizmusoknak a védő antigénjeit, félő volt, hogy az izolált M fehérje társulhat olyan, esetleg káros szövet keresztreaktív antigénekkel, amelyek sokkal inkább előidézik, mint gátolják a reumatikus lázat. Ezt a félelmet megerősítette az a felismerés, hogy bizonyos reumatogén Streptococcusok olyan M fehérjét termelnek, amelyek együtt jelennek meg szív keresztreaktív antigénnel [Káplán: „Immunologic Relatíon of Streptococcal and Tissue Ántigens I. Properties of an Antigén in Certain Strains of Group A Streptococci Exhibiting an Immunologic Cross-Reaction with Humán Heart Tissue” J. Immunoi. 90, 595 (1963)]. Sőt nemrégiben azt is megállapították, hogy az M fehérje-molekulák egyike kovalens szerkezetén belül tartalmaz egy olyan epitópot, amely Streptococcus elleni védő antitestet vált ki; ez szintén keresztreakciót ad a humánszív-szövet egyik szarkolemmás fehérjéjével [Dalé és Beachey: „Protectíve Antigenic Determinant of Streptococcal M Protein Shared with Sarcolemmal Membráné Protein of Humán Heart”, J. Exp. Med. 156, 11651176 (1982)].
A 4284537 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás (Beachey E.) az M24 típusú fehérjéből származó két peptidfragmentum aminosavszekvenciáját ismerteti. Ezek a természetes fragmentumok egy hordozóhoz, pl. polilizinhez kovalensen kötve képesek fajspecifikus opszonikus antitesteket kiváltani, amelyek hatásosak Streptococcus pyogenes ellen. Mindkét fragmentum természetes kivonat, és mindkettő 35 aminosavat tartalmaz.
A 4 454 121 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás (Beachey E.) egy szintetikus pepiidet (S-CB7) ismertet, ahol a védő determinánsok egyike az M24 fehérje típusú S-CB7 egy speciális fragmentumában helyezkedik el, amely fragmentum mindössze 12 aminosav-maradékot tartalmaz [S-CB7 (18-29)]. Az S-CB7 a natív CB-7 fragmentumtól annyiban különbözik, hogy -COOH-terminálisán homoszerin helyett metionint tartalmaz. A leírásban ismertetik az S-CB7 és megfelelő hepténhordozók kovalensen kötött konjugátumait. A hordozó lehet természetes, pl. BSA vagy ÓVA, vagy szintetikus, pl. polilizin. Ezzel a munkával kapcsolatban közleményt is publikáltak, ahol további részletek olvashatók [Beachey és munkatársai: Natúré, 292,457-459 (1981)].
A 4 521 334 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás (Beachey Edwin H.: „Synthetic Polypeptide Fragments”; megjelent 1985. június 4-én) három peptidfragmentum, a CB3, CB4 és CB 5 aminosav-szekvenciáját, valamint az M24 típusú peptid 35 és 37 aminosavas szekvenciáját ismerteti, amelyek a CB3-CB7-ben levő antigéndeterminánsoknak megfelelő antigéndeterminánsokat tartalmaznak. A 4 597 967 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás (Beachey Edwin H.: „Synthetic Polypeptide Fragments; megjelent 1986. július 1-jén) ismerteti, hogy ezek a fragmentumok egy hordozóhoz, pl. polilizinhez kovalensen kötve képesek típusspecifikus opszonikus antitesteket kiváltani Streptococcus pyogenes ellen.
A 4919 930 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás (Beachey Edwin H. és munkatársai: „Biologically Active Hybrid Peptides of Streptococcal M Protein and Compositions and Use”; bejelentve 1985. május 31-én) olyan peptidszekvenciákat ismertet, amelyek M5, M6 és M24 fehérjék olyan fragmentumait tartalmazzák, amelyek képesek opszo2
HU 205 263 Β nikus és baktericid antitesteket kiváltani Streptococcus pyogenes ellen, és amelyek szerológiailag nem keresztreaktívak az emberi vagy más gazdaszervezet szívszöveti antigénjeivel.
A 4 705 684 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás (Beachey Edwin H. és munkatársai : „Synthetic M Proteins-Streptococci Type 6”; bejelentve 1986. március 14-én) M6 fehérje típusú antigénkonjugátumok szintézisét ismerteti. A 4 919 830 amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás (Beachey Edwin H. és munkatársai: „Localization of Protective Epitopes of the Amino Terminus of Type S Streptococcal M Protein” bejelentve 1986. május 1jén) M5 fehérje típusú antigénkonjugátumok szintézisét ismerteti.
A fenti szabadalmak olyan kis peptidfragmentumokat ismertetnek, amelyek immunogének és lehetővé teszik a biztonságos és hatékony vakcina kifejlesztését olyan Streptococcus-fertőzések ellen, amelyek lázat és reumás szívbajokat váltanak ki. Ezen megoldások azon a felismerésen alapulnak, hogy a nagyon kis peptídek lehetővé teszik, hogy az M fehérje-molekula egy nagy részét eltávolítsák, és ezáltal a gazdaszervezet szövetei elleni immunológiai keresztreakciók kiváltásának esélyei csökkennek (lásd ezzel kapcsolatban a fentebb idézett 4 454 121 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás 1. és 2. oszlopait).
A Streptococcus pyogenes M fehérje szintetikus peptidjei által kiváltott fajspecifikus védő immunitást illetőleg további információk találhatók az alábbi irodalmi helyen: Beachey és munkatársai: „Type Specific Protective Immunity Evoked by Synthetic Peptide of Streptococcus pyogenes M Protein”, Natúré, 292, 5822,457-459 (1981).
Ezen a területen további információkat közölnek a következő irodalmi helyeken: Hasty és munkatársai: „Hybridomas Antibodies Against Protective and NonProtective Antigenic Determinants of a Structurally Defined Polipeptide Fragment of Streptococcal M Protein”, J. Exp. Med. 755,1010 (1982); valamint Hopp és Woods: „Prediction of Protein Antigenic Determinants from Amino Acid Sequences”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78,6,3824-28, (1981).
Ezen eredmények ellenére továbbra is fennáll az igény orálisan beadható vakcinákra, amelyek ilyen nem keresztreaktív polipeptideket tartalmaznak, ezt ugyanis eddig még nem sikerült megoldani. Ezeket a peptideket szintézisükre képes, legyengített, nem virulens, rekombináns baktérium formájában beadva, a találmány további lépést jelent előre, főleg a Streptococcus-fertőzések leküzdése terén.
Az M fehérjék számos szerotípusa ismert, amelyeket olyan gének kódolnak, amelyek egymás alléljai. Mindegyik szerotípus az S. pyogenes különböző törzseinek felel meg, és ezek a szerotípusok csupán aminosavszekvenciáikban különböznek.
A találmány szerinti eljárás általános megoldást jelent egy Streptococcus M fehérje-antigén vagy antigénfragmentum szintézisének genetikai manipulációs megközelítéséhez, ahol ezek az antigének vagy fragmentumok képesek Streptococcus-fertőzések elleni opszonikus antitestek kiváltására.
A találmány értelmében egy transzformált, nem virulens baktériumot állítunk elő, amely olyan heterológ nukleotidszekvenciát tartalmaz, amely nukleotidszekvencia egy Streptococcus M fehérje-antigént kódol és fejez ki.
Ez a transzformált, nem virulens gazdaszervezet, amelyben a Streptococcus M fehérje antigénje kifejeződik, alkalmas opszonikus antitestek kiváltására Streptococcus-fertőzés ellen.
Az antigén hatékony a nem virulens baktérium virulens formái ellen is.
A találmány értelmében közelebbről egy speciális Salmonella nembe tartozó, elsősorban a typhimurium fajba tartozó, transzformált, nem virulens baktériumokat hozunk létre, amelyek egy olyan plazmidot hordoznak, amely egy M fehérje-gént, pontosabban M5 típusú fehérjegént kódol.
Olyan Streptococcus M fehérje-antigént állítunk elő, amely alkalmas opszonikus antitestek kiváltására; ezek az antitestek szisztemikus immunitást adnak Streptococcus-fertőzések ellen.
A találmány értelmében olyan multivalens Streptococcus M fehérje-antigént is előállíthatunk, amely egynél több M szerotípusú Streptococcus törzs ellen képes opszonikus antitesteket kiváltani.
A találmány szerinti eljárással kifejezett Streptococcus M fehérje-antigén a citoplazmában és nem a baktériumfelületen fejeződik ki.
A találmány szerinti eljárással előállított Streptococcus M fehérje-antigén, amelyet egy gazdaszervezet főleg egy nem virulens, heterológ mikrobiológiai gazdaszervezet, amelybe a Streptococcus M fehérje-antigén génje bele van klónozva - fejez ki, olyan hatékony antigén, amely immunitást vált ki, és emellett szerológiailag nem keresztreaktív emberi szöveti antigénekkel, különösen azokkal, amelyek a szívben találhatók. A találmány értelmében egy olyan transzformált, nem virulens baktériumot hozunk létre, amely a Streptococcus nemzetség nem A csoportbeli fajtájához tartozik.
A találmány szerinti eljárással egy transzformált gazdaszervezetet, pl. egy baktériumot, elsősorban valamely nem virulens bélbaktériumot hozunk létre, amely annak ellenére, hogy nem virulens, még képes antitesteket kiváltani. A találmány szerinti eljárással transzformáit nem virulens gazdabaktérium nem telepszik meg az immunizálandó személyben, de mégis sokszorozódik olyan korlátozott mértékben, amely az antitestek kiváltásához szükséges.
A találmány értelmében Salmonella typhimuriumot vagy Streptococcus sanguist transzformálunk.
A találmány szerinti eljárás alkalmas olyan transzformáit, nem virulens gazdabaktériumok létrehozására is, amelyekbe egy másik baktériumfaj heterológ nukleotidszekvenciája van klónozva, amely nukleotidszekvencia olyan fehérjeantigént kódol és fejez ki, amely hatásos opszonikus antitestek kiváltására más baktériumfajok ellen.
A találmány szerinti eljárás alkalmas olyan gének
HU 205 263 Β által hordozott nukleotidszekvenciák előállítására, amelyek más baktériumfajok antigénjeit kódolják és fejezik ki.
A találmány szerinti eljárás alkalmas különböző más genetikai manipulációs komponensek előállítására, amelyek a transzformált, nem virulens gazdaszervezethez vezetnek.
A találmány szerinti eljárással a gazdabaktériumba olyan nukleotidszekvenciákat klónozunk, amelyek Streptococcus-fertőzések, főleg 5, 6, és 24 szerotípusú Streptococcus-fertőzések elleni opszonikus antitestek kiváltásához hatásos immunogén polipeptideket kódolnak.
A találmány szerinti eljárással a gazdabaktériumba olyan nukleotidszekvenciákat klónozhatnak, amelyek E. coli felületi antigéneket kódolnak; ezek a felületi antigének antiadhezív antitesteket váltanak ki.
A találmány további tárgya eljárás emlősök és emberek immunizálására alkalmas vakcina előállítására, amely a fentebb leírt, transzformált nem virulens baktériumnak olyan mennyiségét tartalmazza, amely hatékony opszonikus antitestek kiváltására, és amely szisztemikus immunitást ad Streptococcus-fertőzések ellen.
A találmány szerinti eljárással előállított vakcina adagolható orális vagy parenterális úton.
A találmány szerinti eljárással előállított antigén figyelemre méltó előnye, hogy a betegnek szísztemikus immunitást ad, ami gyorsan és teljes mértékben megy végbe akkor is, ha a vakcinát szájon át adjuk be.
Az 1. ábra pMK 207-tel transzformált Sahnonella typhimurium LB5000 (1, csík) és SL3261 (2-9. csík) által kifejezett M5 típusú fehérje immunfoltelemzése.
A fentebb említett szabadalmakon és más közleményeken kívül a jelen találmány leírásánál a technika állásában figyelembe vettük az alábbi irodalmi helyeket: Beachey és munkatársai: „Repeating Covalent Structure and Protective Immunogenicity of Native and Synthetic Polypeptide Fragments of Type 24 Streptococcal M Protein”, J. Bioi. Chem. 258 (21). 13 250-13 257 (1983).
van de Ríjn és munkatársai: „Group A Streptococcal Antigens Cross-Reactive with Myocardium”, J. Exp. Med. 146,579-599 (1977).
van de Rijn és munkatársai: „hnmunochemical Analysis of Intact M Protein Secreted From Cell WallLess Streptococci”, Infect. Immun. 32, 86—91 (1981).
Edman és Begg: „A Protein Sequenator”, European J. Biochem. 1,80-91 (1967).
Phillips és munkatársai: „Streptococcal M Protein: Helical Coiled-Coil Structure and Arrangement on the Cell Surface”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78 (8), 4689-4693 (1981).
Laver és munkatársai: „Antigénje Drift ín Type A Influenza Vírus: Peptid Mapping and Antigenic Analysis of A/PR78/34 (HONI) Variants Selected With Monoclonal Antibodies”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, (3), 1425-1429 (1979).
Atassi: „Antigenic Structure of Myoglobin: The Complete Immunological Anatomy of a Protein and Conclusions Relating to Antigénje Structures of Proteins”, Immunochemistry, 72, 423438 (1975).'
Kábát, Structural Concepts Immunology and Immunochemistry 89-100 [Holt, Rhinehart és Winston, New York (1968)).
Nisonoff: Methods in Immunology and Immunochemistry, 1,120-187 (1977).
Munoz, Methods in Immunology and Immunochemistry, 3,164-160 (1970).
Manjula és Fischetti: „Tropomyosin-like Seven Residue Periodicity in Three Immunologically Distinct Streptococcal M Proteins and its Implications fór the Antiphagocytic Property of the Molecule”, J. Exp. Med. 155,695-708 (1980).
Beachey és Stollerman: „Toxic Effects of Streptococcal M Protein on Platelets and Polymorphonuclear Leukocytes in Humán Blood” J. Exp. Med. 134,351-365 (1971).
Dalé és munkatársai: „Heterogenecity of Type-Specific and Cross-Reactive Antigenic Determinants Within a Single M Protein of Group A Streptococci”, J. Exp. Med. 755,1026-1038 (1980).
Beachey és munkatársai: „Purification and Properties of M Protein Extracted from Group A Streptococci with Pepsin: Covalent Structure of the Amino Terminál Region of Type 24 M Antigén”, J. Exp. Med. 145,1469-1483 (1977).
Beachey és munkatársai: „Primary Structure of Protective Antigens of Type 24 Streptococcal M Protein”, J. Bioi. Chem. 255, 6284-6289 (1980).
Beachey és munkatársai: „Repeating Covalent Structure of Streptococcal M Protein, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75,3163-3167 (1978).
Beachey és munkatársai: „Humán Immuné Response to Immunization with a Structurally Defined Polypeptide Fragment of Streptococcal M Protein”'J. Exp. Med. 750, 862 (1979).
Brown és munkatársai: „An Attenuated aroA Salmonella typhimurium Vaccine Elicits Humorai and Cellular Immunity to Cloned β-galactosidose in Mice”, The Journal of Infectious Diseases, 755 (I) (1987). Ez a közlemény tárgyalja a Salmonella typhimurium SL3261 törzset, és egy olyan aroA vakcinatörzset, amelyet hordozóként használunk a pXY411 plazmidhoz.
További, a téma szempontjából érdekes irodalmi publikációk az alábbiak:
Hoiseth és Stocker: „Aromatic-dependent Sahnonella Typhimurium are Non-Virulent Effective as Live Vaccines”, Natúré, 297 (1981).
Smith és munkatársai: „Aromatic-Dependent Salmonella Typhimurium are Non-Virulent and Effective as Live Vaccines”, Am. J. Vet. Rés. 45, (1) (1984).
Smith és munkatársai: Vaccination of Calves Against Salmonella Dublin with Aromatic-Dependent Salmonella Typhimurium”, Am. J. Vet. Rés. 75, (II) (1984).
HU 205 263 Β
Maskell és munkatársai: „Attenuated Salmonella Typhimurium as Live Órai Vaccines and Carriers fór Delivering Antigens to the Secretory Immuné System”, Vaccines 86 (Cold Spring Harbor Laboratory 1986).
A genetikai manipulációs technika területén az alábbi szabadalmak vonatkoznak ide elsősorban:
428 941 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás (Galibert Francis és munkatársai), amelynek címe: „Nucleotide Sequence Coding the Surface of the Hepatitis B Vírus, Vector Containing Said Nucleotide Sequence, Process Allowing the Obtention Thereof and Antigén Obtained Thereby”;
4518 584 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás (Mark és munkatársai), amelynek címe: „Humán Recombinant Interleukin-2 Muteins”;
588 585 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás (Mark és munkatársai), amelynek címe: „Humán Recombinant Cysteine Depleted Interferon-B Muteins”;
625 252 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás (Rutter és munkatársai), amelynek címe: „Recombinant Bacterial Plasmids Containing the Coding Sequences of Insulin Genes”;
666 846 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás (Fayerman és munkatársai), amelynek címe: „Növel Cloning Vectors Containing Selectable Genetic Markers fór Use in Streptomyces and Related Organisms”;
666 847 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás (Alford és munkatársai), amelynek címe: „Recombinant DNA Means and Methods”.
A találmány értelmében előnyös, ha a plazmidot, amely az M fehérje gént kódolja, először Escherichia coliban klónozzuk és fejezzük ki. Lehet használni más bélbaktériumokat, pl. Klebsiellákat vagy Enterobactereket, de az E. coli az előnyös. Miután az M gént hordozó plazmidot izoláltuk és tisztítottuk, egy konstrukciót építünk fel, hogy transzformáljuk a kívánt nem virulens baktériumot, pl. az aroA S. typhimuriumot (SL3261). Ez a mutáns törzs mind PABA-ra, mind 2,3-DHB-re nézve táplálkozási markert tartalmaz (lásd Brown és munkatársai fentebb idézett munkáját). Az S. typhimuriumnak egy másik előnyösen alkalmazható fajtája a recA S. typhimurium, elsősorban a Ty21a törzs [lásd Clements és munkatársai: „Construction of a Potential Live Aro Vaccine fór typhoid type fever and cholorea - E. coli-related diarrheas”, Infect. Immun. 46,564-9 (1984)]. A fentiekkel kapcsolatban lásd még azokat az irodalmi hivatkozásokat, amelyek Brown és munkatársainak fentebb idézett munkájában találhatók.
Előnyös, ha az M fehérje gént az S. pyogenes valamely virulens törzséből nyerjük ki. Eljárhatunk azonban úgy is, hogy a gént az S. pyogenes valamely legyengített, nem virulens törzséből nyerjük ki, vagy megszerkesztjük a kívánt M fehérjét kódoló nukleotidszekvenciát.
A találmány rekombináns DNS klónozó vektorai nem korlátozódnak egyetlen Salmonella fajra. Sőt a vektorok széles köre alkalmazható, és ezek transzformálhatok más Gram-negatív baktérium gazdasejtekbe is, ilyenek lehetnek pl. az Enterobacteriaceae nemzetség tagjai (pl. Shigella, Klebsiella, mint a Klebsiella pneumoniae, Enterobacter, mint az Enterobacter aerogenes). Az olyan Salmonellák, mint a Salmonella arizona, és a Citrobacterek is alkalmazhatók, ha megfelelően le vannak gyengítve vagy nem virulensek.
A szokásos Salmonella törzsek, amelyeket lehet alkalmazni, miután legyengítettük és nem virulenssé tettük, pl. a következők: S. paratyphi A; S. schottmulleri; S. typhimurium; S. paratyphi C; S. choleraesuis; S. montevideo; S. newport; S. typhi; S. enteritidis; S. gallinarum; S. anatum.
A találmány szerinti eljárásban, a rekombináns DNS klónozó vektorokhoz gazdaszervezetként alkalmazhatók a Streptococcus nemzetség baktériumai is, amelyek nem virulensek vagy le vannak gyengítve, ilyenek pl. az A-0 immunológiai csoport Streptococcusai, de lehetnek A-tól eltérőek is. Bakteriális gazdaszervezetként alkalmazható megfelelő Streptococcusok lehetnek pl. az S. cremoris; S. faecalis, S. salivarius, S. mitior, S. mitis, S. mutáns és S. sanguis; ez utóbbi az előnyös faj.
További megfelelő mikroorganizmusok is ismertek, amelyeket le lehet gyengíteni és transzformálni a találmány szerinti eljárással. Ezzel kapcsolatban referenciák találhatók az alábbi irodalmi helyen: Davis és munkatársai : Microbiology [Harper és Row kiadása; második kiadás, (1973)].
Általában bármilyen bélbaktérium szolgálhat gazdabaktériumként. Előnyös, ha a gazdabaktérium éppen csak annyi ideig él a szervezetben, amíg ki nem váltja az opszonikus választ, de általában bármilyen baktériumtörzs alkalmazható, amely olyan mértékig le van gyengítve, hogy telepeket ne képezzen, csupán korlátozott mértékben sokszorozódjon, hogy az idegen fehérje ellen antitesttermelést váltson ki. A találmány szerinti eljárás egyik előnyös kiviteli módjában az S. typhimurium aro törzsét alkalmazzuk, amely két olyan metabolitot, PABA-t és 2,3-DHB-A-t igényel, amely az emlősszövetekben nem található. Ennek eredményeképpen az inokulált baktériumok néhány generáció után elpusztulnak ezeknek a metabolitoknak a hiányában (lásd Hoiseth és Stocker fentebb idézett munkáját).
Bármely mutált olyan mikrobiológiai objektum alkalmazható azonban, amely metabolikusan hiányos olyan tápanyagra nézve, amely az immunizálandó személy szöveteiben hiányzik, vagy genetikai manipulációkkal ilyen hiányossá tettük.
Meg kell jegyeznünk, hogy a nem virulens aro Salmonella typhimurium SL3261, amelybe az M5 szerotípusú fehérjeantigént kódoló struktúrgént tartalmazó plazmidot transzformáltuk, kifejezi a teljes M5 fehérjemolekulát, amely kifejeződés csaknem kizárólag az S. typhimurium citoplazmatikus területére korlátozódik. Egyedülálló és meglepő, hogy egy immunogén és védő felületi antigén, mint a Streptococcus felületi antigén a nem virulens gazdabaktérium citoplazmájában fejeződik ki.
HU 205263 Β
Belátható tehát, hogy a találmány szerinti eljárással a kívánt nukleotidszekvenciát, amely Streptococcusfertőzések, elsősorban 5 szerotípusú fertőzések elleni opszonikus antitesteket kiváltó fehérjeantigént kódol és fejez ki, sokféle gazdaszervezetbe lehet klónozni. Szélesebben értelmezve tehát, a transzformált gazdaszervezetnek, amelyben a nukleotidszekvencia replikáció után található, nem szükséges heterológnak lennie a nukleotidszekvencia tekintetében, és a szekvenciának nem szükséges heterológnak lennie a mikroorganizmus tekintetében.
A melegvérű állatok immunizálásakor megfigyeltük, hogy a) legfeljebb l,65xl09 mutáns nem virulens Salmonella, amely az 5 szerotípusú Streptocőccus M fehérjét kódoló pMK207 plazmidot tartalmazza, perorális beadását az egerek jól tűrik; b) a pMK207 plazmid rendkívül stabil mind in vitro, mind in vivő; c) a legnagyobb baktériumdőzist (109) kapott egerekben a mikroorganizmusok a májban gyűlnek össze, három hétig nem okoznak betegségtüneteket; d) az 5 szerotípusú Streptococcus M fehérje-antigén gént kifejező, nem virulens transzformált Salmonellával orálisan immunizált egerek már a harmadik héten opszonikus szérumantitesteket termelnek M5 szerotípusú Streptococcusok ellen; és e) az immunizált egerek a harmadik héten teljesen védettek a homológ M5 szerotípusú intraperitoneális Streptococcus-fertőzések ellen (de nem védettek a heterológ M24 szerotípus ellen}. Érdemes megjegyezni, hogy keresztreaktív immunitás nem figyelhető meg, amikor a találmány szerinti eljárással előállított kompozíciót orálisan adjuk be. Orális adagoláshoz az M fehérje-antigén citoplazmában való kifejeződése nem virulens baktériumokban különösen előnyös. Az antigén a nem virulens baktérium citoplazmáján belül védve van a gyomorsavtól és más károsító anyagoktól, amíg el nem pusztul, és ki nem bocsátja az antigént, elsősorban a vékonybélben, amely az előnyös hely az antigének átadására.
A találmány értelmében a nem virulens baktériumot alkalmazni lehet gazdaszervezetként olyan nukleotidszekvenciákat tartalmazó rekombináns DNS kiónozó vektorokhoz, amelyek olyan immunogén polipeptideket kódolnak és fejeznek ki, amelyek különösen hatékonyak Streptococcus-fertőzések elleni immunitás átadására, és nem keresztreaktívak humán-szöveti antigénekkel, elsősorban a szív szöveti antigénjeivel.
A találmány szerinti immunogén polipeptidek között vannak szintetikus polipeptidek is, amelyek az M fehérje-molekulák autoimmun epitópokat nem tartalmaző területeinek másolatai, amint ilyeneket leírnak az alábbi szabadalmak:
4284537 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás (Beachey E.);
454 121 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás (Beachey E.);
4521334 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás (Beachey E.);
597 967 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás (Beachey E.);
919 930 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás (Beachey E. és munkatársai);
705 684 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás (Beachey E. és munkatársai); és
919 830 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás (Beachey E. és munkatársai).
A multivalens vakcinához hordozóként alkalmazott M24 szerotípusú polipeptidnek a kapacitását vizsgáljuk, a vizsgálatot más M szerotípusú polipeptid-fragmentumokkal végezve.
A találmány szerinti eljárás egyik előnyös megvalósítási módja az olyan Streptococcus sanguis baktériumok alkalmazása, amelyek az M fehérjét kifejező plazmidokkal vannak transzformálva. Az M5 szerotípusú fehérjének a kifejezését S. sanguisban hajtjuk végre. Az M fehérje-gént egy ingázó („shuttle”) vektorplazmid hordozza, amelyet a gazdabaktériumba transzformálunk, amely M5 szerotípusú fehérjerostokat fejez ki a felületén. Sőt, az organizmus képes fibrinogént is komi, ami viszont a mikroorganizmust rezisztenssé teszi a fagocitózisra.
A Streptococcus-fertőzések elleni immunizáláshoz a legyengített S. sanguist orron keresztül csepegtetjük be, hogy helyi immunválaszt váltson ki éppen azon a helyen, ahol a Streptococcusok általában belépnek a szervezetbe.
A találmány egy másik előnyös kiviteli módja egy harmadik baktériumfaj antigénjét kifejező plazmid klónozása a gazdaorganizmusba az M fehérjét kifejező plazmiddal együtt. Pontosabban egy, azE. coli CSH50 törzsből klónozott pSH-2 plazmidot klónozunk Sál. typhimuriumba, ezáltal előidézve, hogy a gazdaszervezet olyan 29 kilodaltonos E. coli felületi antigént fejezzen ki, amely FimH antiadhezív antitesteket vált ki. Ezek az antiadhezív (tapadásellenes) antitestek nemcsak E. coli ellen hatékonyak, hanem hatékonyak más Gram-negatív baktériumok ellen is.
A találmányt az alábbi, nem korlátozó jellegű kiviteli példákkal szemléltetjük.
1. példa
Nem virulens gazdabaktérium transzformálása streptococcus M fehérje kifejezésére A Salmonella typhimurium SL3261 aro- törzsét, amelyet Stocker és Hoseith (fentebb idézett munka) fejlesztettek ki, alkalmazzuk, mivel ez a mutáns képes a behatolásra, de nem okoz betegséget. Ez a mutáns törzs tápanyagigény-markert mutat mind p-amino-benzoesavra (PABA), mind 2,3-dihidro-benzoesavra (DHB) nézve (lásd Stocker és Hoseith fentebb idézett munkáját).
Az M5 fehérje-antigén struktúrgénjét (smp5) E. coli LE329-be klónozzuk és kifejezzük, ezzel kapcsolatban lásd az alábbi irodalmi helyeket: Kehoe és munkatársai: „Cloning and Genetic Analysis of Serotype M5 Protein Determinant of Group A Streptococci: Evidence fór Multiple Copies of the M5 Determinant in the Streptococcus pyogenes Genome”, Infect. Immun, 48, 190-197 (1985); valamint Poirer és munkatársai: „Expression of Protective and Cardiac Tissue Cross6
HU 205 263 Β
Reactive Epitopes of Type 5 Streptococcal M Protein in Escherichia coli”, Infect. Immun. 48, 198-203 (1985).
A pMK207 plazmidot izoláljuk, tisztítjuk és transzformáljuk először egy Sál. typhimurium LB5000 rm+ töizsbe; ezzel kapcsolatban lásd az alábbi irodalmi helyeket: Bullas és Ryo: „Salmonella typhimurium LT2 Strains which are r“m+ fór all Three Chromosomally Located Systems of DNA Restriction and Modification”, J. Bacteriol., 156, 471-474 (1983); valamint Lederberg és Cohen: „Transformatíon of Salmonella typhimurium by Plasmid Deoxyribonucleic Acid”, J. Bacteriol. 119,1072-1074 (1974). Az LB5000-ből izolált és tisztított plazmidot alkalmazzuk azután az aro Sal. typhimurium SL3261 transzformálására a fentebb idézett eljárásokat alkalmazva, tehát azokat, amelyeket Lederberg és Cohen, illetve Bullas és Ryo leírtak.
A pMK.207 plazmiddal transzformált LB5000 és SL3261 törzsek kifejezik a teljes M5 fehérjemolekulát, amint ezt a teljes sejtlizátum Westem-foltelemzése bemutatja (1. ábra; 1., és 2. csíkok). Az M5 fehérje tipikus triplettje (lásd Poirer és munkatársainak, valamint Kehoe és munkatársainak fentebb idézett munkáját) Mr 59; 56; és 54K csíkokként vándorol. Azok az előzetes tanulmányok, amelyek arra irányultak, hogy meghatározzuk az M5 fehérje elhelyezkedését, ahogyan ezt a Sál. typhimurium SL3261 kifejezi, azt jelzik, hogy a rekombináns fehérje csaknem kizárólag a citoplazmában helyezkedik el. Az M5 fehérje stabilan fejeződik ki SL3261-ben még antibiotikum szelekciós kényszer nélkül is, vagyis a kifejeződés nyilvánvaló ötnaponkénti ismételt átoltások után is; ez mintegy 35 növekedési generációt jelent (1. ábra; 3-8. csíkok).
2. példa
Az egerek tűrőképessége pMK207 plazmiddal transzformált Sál. Thyphimurium SL3261-re Előzetes tanulmányokban BALB/c egereket fertőzünk SL3261-pMK207 növekvő dózisaival, hogy meghatározzuk, vajon az állatok tűrik-e a transzformált organizmusokat. A legfeljebb l,65xl09 organizmust orális dózisban kapott egerek egyike sem betegedett meg vagy pusztult el. Az inokulálás után 1, 3, és 10 héttel mindegyik adagolási csoportból két-két egeret levágunk, és májukat, lépüket és beleiket SL3261pMK207-re tenyésztjük McConkey-féle agaron, amely 50 mg/ml kanamicin-szulfátot és 10-10 mg/ml PABA-t és DHB-t is tartalmaz. Laktózt nem fermentáló telepeket izolálhatunk egy hét múlva, de csak olyan egerekből, amelyek 106 organizmust vagy többet kaptak, illetve három hét múlva, de csak olyan egerekből, amelyek 109 organizmust kaptak (1. táblázat). Három hét után izolátumokat nem nyerünk ki. A harmadik héten izolált telepek egy ép M5 fehérjét fejeznek ki, amely arra utal, hogy az smp5 in vivő stabil (1. ábra, 9. csík). Az orálisan inokulált egerek 1, 3, 5, 9, 10, 15 és 20 hetes szérumai ELISA, illetve opszonizálási kísérletekben antitesteket váltanak ki M5 típusú fehérje és 5. típusú Streptococcusok ellen (2. táblázat). Az immunizálás után 20 héttel az egerekből kapott nyálról is kimutatjuk, hogy tartalmaz anti-M5 fehérje-antitesteket, elsősorban az IgA osztály antitestjeit. (Opszonikus antitest: olyan antitest, amelynek a kapcsolódása a megfelelő antigénhez meggyorsítja a fagocitózis által történő felvételt. Opszonizálási kísérlet: arra irányul, hogy megállapítsuk egy vakcina opszonikus antitesttermelést kiváltó képességét.)
1. táblázat
A salmonella Typhimurium SL3261-pMK207 eloszlása balblc egerek szerveiben orális immunizálás után
| Salmonellaeloszlás a szervekben2 | ||||||||||
| Indukáló adag1 | Bél | Máj-epe | Lép | |||||||
| Indító | Emlékeztető | 1. bét | 2. hét | 3. hét | 1. hét | 2. hét | 3. hét | 1. hét | 2. hét | 3. hét |
| l,7xl09 | Ι,ΙΧΙΟ9 | 2,1x104 | <50 | <50 | 4xl02 | 3xl02 | <50 | 4x102 | <50 | <50 |
| l,7xl08 | Ι,ΙΧΙΟ8 | <200 | <50 | ND3 | 8xl02 | <50 | ND | 4xl02 | <50 | ND |
| l,7xl07 | Ι,ΙχΙΟ7 | <200 | <50 | ND | lxlO2 | <50 | ND | lxlO2 | <50 | ND |
| l,7xl06 | Ι,ΙΧΙΟ6 | <100 | ND | ND | <50 | ND | ND | <50 | ND | ND |
| l,7xl05 | Ι,ΙχΙΟ5 | <100 | ND | ND | <50 | ND | ND | <50 | ND | ND |
| l,7xl04 | Ι,ΙχΙΟ4 | <100 | ND | ND | <50 | ND | ND | <50 | ND | ND |
1. Az egereknek tízszeres sorozathígításban, orális 55 dózisokban S. typhimurium SL3261-pMK207 törzset adunk l,7xl09 telepformáló egységgel (cfu) kezdve az 1. napon (induló dózis), emlékeztető orális dózisokkal, Ι,ΙχΙΟ9 cfu-val kezdve az 5. napon. Mindegyik dózist 25 μΐ foszfáttal pufferolt 60 fiziológiás sóoldatban szuszpendáljuk (PBS, pH 7,2), amely 5 μg/ml kanamicin-szulfátot és 11 μg/ml para-amino-benzoesavat (PABA) és 2,3dihidroxi-benzoesavat (DHB) tartalmaz. Az 1., 2. és 3. hét után (a kezdeti dózis beadásától számítva) az egereket levágjuk.
HU 205263 Β
2. A beleket (az alsó gyomorszáj záróizmától a végbélig), a májat, valamint a lépet aszeptikusán eltávolítjuk, PBS-be helyezzük, Cellecton-berendezéssel (0,149 mm; Belico) homogenizáljuk, és McConkey-agama helyezzük, amely 10-10pg PABA-t és DHB-t is tartalmaz 50 g/ml kanamicínnel vagy anélkül.
3. Nem határoztuk meg.
2. táblázat
M5 típusú S. pyogenes opszonizálása egér anti-M5-fehérje-szérummal, amelyeket S. typhlmurium SL326I-pMK207 törzsek orálisan immunizált BALBIc egerekből kaptunk; valaminta szérumok anti-pepMfehérje ELISA titerei
| Vizsgálati szérum | ELISA titer1 | Százalékos opszonizálás1 2 | |||
| IgA | IgG | IgM | 5. típus | 24. típus | |
| Immuni- zálás előtt | <50 | <50 | <50 | 0 | 2 |
| 1. hét | 100 | 200 | <50 | 4 | 4 |
| 3. hét | 400 | 400 | <50 | 36 | 0 |
| 5. hét | 800 | 800 | <50 | 52 | 2 |
| 9. hét | 100 | 1600 | 200 | 90 | 2 |
| 10. hét | 50 | 800 | 400 | 92 | 2 |
| 15. hét | 100 | 800 | 400 | 52 | 0 |
| 15. hét3 | 800 | 12800 | 800 | 82 | 0 |
| 20. hét | <50 | 400 | 200 | 10 | 2 |
| 20. hét3 | 400 | 3200 | 200 | 80 | 2 |
| Antipep M54 | ND5 | ND | ND | 96 | 2 |
| Anti- pep M244 | ND | ND | ND | 0 | 98 |
1. Az ELISA titereket úgy határozzuk meg, hogy immobilizált pepM5-öt BALB/c egér antiSL3261-pMK207 szérummal, majd peroxidázzal konjugált kecske anti-egér-IgA-val, -IgG-vel vagy -IgM-mel reagáltatunk. Az összes immobilizált pepM24 ellen reagáltatott egérantiszérum 50-nél kisebb titert ad.
2. Az opszonizálást úgy határozzuk meg, mint a Streptococcusokkal társult teljes neutrofilek százalékát.
3. Az egerek a vérvétel előtt 48 órával emlékeztető oltást kapnak 50 gg pepM5-tel 0,1 ml foszfáttal pufferolt fiziológiás sóoldatban (pH = 7,2).
4. Mind az anti-pepM5-öt, mind az anti-pepM24-et nyulakban állítjuk elő, hogy pozitív (homológ reakció) és negatív (heterolőg reakció) kontrollként szolgáljanak.
5. Az antitest titereket nyúl anti-pepM5-re vagy antipepM24-re nem határoztuk meg.
3. táblázat
Nyál antitest válasz1 M5 fehérje ellen S. typhimurium SL3261-pMK207 törzzsel orálisan immunizált BALB/c egerekben
| Vizsgálati szérum | ELISA titer5 pepM5 ellen | |
| ÍgA | IgA+IgG+IgM | |
| Immtmizálás előtt | <4 | <4 |
| 20 hét3 | 32 | 32 |
| 20 hét-(-emlékeztető oltás4 | 64 | 128 |
1. Nyálat veszünk és gyűjtünk az egerekből (csoportonként négyből) 0,1 ml 2%-os pilokarpinnal intraperitoneálisan végzett indukció után.
2. Az ELISA titereket úgy határozzuk meg, hogy pepM5-öt alkalmazunk, amelyet SL3261pMK207 törzzsel immunizált BALB/c egerekből gyűjtött nyállal (kétszeres sorozathígításban) majd peroxidázzal konjugált kecske anti-egérIgA-val vagy anti-egér-IgA+IgG+IgM keverékkel reagáltatunk.
3. Az egereket 20 héttel a nyálgyűjtés előtt immunizáljuk (lásd a 2. táblázatot).
4. Az egereket 60 órával a nyálgyűjtés előtt injektáljuk 50 μg pepM5 emlékeztető dózissal, 0,1 ml foszfáttal pufferolt fiziológiás sóoldattal (pH = 7,2).
3. példa
Egerek egy csoportját inokuláljuk orálisan két adag SL3261-pMK207 törzzsel, és 22 nappal az első fertőzés után másodszor fertőzzük 5 vagy 24 típusú Streptococcus, vagy a virulens Sál. typhimurium 1314 szülő törzs első adagjával (3. táblázat). Amint ezekből az eredményekből könnyen kiolvasható, azok az egerek, amelyek az M5-öt kifejező Sah typhimurium-mutánst kapnak, teljesen védve vannak az 5. típusú Streptococcus intraperitoneális fertőzése ellen, de nincsenek védve a 24. típusú Streptococcus fertőzése ellen. A kontroliegerek, amelyek intraperitoneálisan a virulens Sál. typhimurium SL1344-gyel vannak fertőzve, szintén védve vannak. Az 5. típussal másodszor fertőzött egerek védve vannak egy olyan adag ellen, amely 100-szorosan meghaladja az LD50 értéket (4. táblázat). Ez az 5. típusú Streptococcus által történt parenterális fertőzés ellent védelem jelzi, hogy az átadott immunitás szisztematikus.
HU 205 263 Β
4. táblázat
Orálisan M5 típusú fehérjét kifejező pMK207 plazmiddal transzformált élő aro S. typhimuriummal immunizált egerek fertőzése M5 típusú és M24 típusú
Streptococcus, illetve S. typhimurium SL1344 intraperitoneális injekciójával
| A fertőző organizmus2 | Dózis3 | Túlélés4 | 5 |
| Nem immunizált | Immunizált | ||
| M5 Streptococcus (Smith-törzs) | l,7xl04 | 2/4 | 4/5 |
| l,7xl05 | 0/4 | 5/5 | |
| l,7xl06 | 0/4 | 5/5 ' | |
| M24 Streptococcus (Vaughn törzs) | l,6xl03 | 1/3 | 1/3 |
| l,6xl04 | 0/3 | 0/3 | |
| l,6xl05 | 0/3 | 0/3 | |
| S. typhimurium (SL1344 törzs) | 7,3x10' | 0/3 | 3/3 |
| 7,3x102 | 0/3 | 3/3 | |
| 7,3xl03 | 0/3 | 3/3 |
1. Mindegyik immunizált egér l,2xl09 telepképző egység (cfu), pMK207 plazmiddal transzformált S. typhimurium SL3261-et kap 22 nappal és 1,6xl09 telepképző egységet 17 nappal a fertőzés előtt. Minden dózist orálisan adunk be 25 μΐ, foszfáttal pufferolt fiziológiás konyhasóoldatban szuszpendálva, amely tartalmaz még 5 pg/ml kanamicinszulfátot és 1-1 pg/ml para-amino-benzoesavat és 2,3-dihidroxi-benzoesavat.
2. Az LD50 érték M5 és M24 Streptococcusoknál, valamint az SL1344-nél BALB/c egerekben mintegy 2xl04,3xlO3, illetve 1x10° telepképző egység.
3. A dózist beadott telepképző egység formájában adtuk meg.
4. A túlélést úgy állapítjuk meg, hogy a túlélő egerek számát osztjuk a fertőzött egerek számával.
5. Az összes feljegyzett pusztulás a 3-6. napok között következett be. Az összes túlélő egér a fertőzéstől számított 30 nap után egészségesnek tűnik.
SL3261-pMK207 törzzsel orálisan immunizált
BALB/c egerek egy csoportját intranazálisan fertőzünk 5 vagy 24 típusú Streptococcussal, illetve virulens Sál. typhimurium SL1344 szülőtörzzsel. Amint az 5. táblázatban látható, csak az SL3261-pMK207 törzzsel orálisan immunizált egerek képesek túlélni egy intranazális fertőzést homológ organizmusok olyan dózisával, amely egyébként elegendő lenne elpusztítani az összes immunizált állatot. Ezenkívül az M5 rekombináns fehérjét kifejező Sál. typhimuriummal átvitt védelem M fajtaspecifikus, amely abban nyilvánul meg, hogy az intranazálisan fertőzött egerek nem képesek ellenanyagot termelni az M24 típusú Streptococcusok ellen. Az a tény, hogy az egerek képesek szembeszállni az intranazális inokulálással történő fertőzéssel, azt sugallja, hogy az M5 fehérjét kifejező Sál. typhimurium SL3261-pMK207 törzzsel végzett orális immunizálás elegendő a helyi immunitás létrehozására.
5. táblázat
Orálisan1 M5 típusú fehérjét kifejező pMK207 plazmiddal transzformált élő aro- S. typhimuriummal immunizált egerek fertőzése M5 és M24 típusú Streptococcusok és S. typhimurium SL1344 intranazális inokulálásával
| Fertőző organizmus2 | Dózis3 | Túlélés4 | 5 |
| Nem immunizált | Immunizált | ||
| M5 Streptococcus (Smith törzs) | 3,9xl07 | 0/4 | 6/6 |
| M24 Streptococcus (Vaughn törzs) | 3,5x107 | 0/4 | 0/6 |
| S. typhimurium | 4,3x104 | 0/4 | 6/6 |
1. Mindegyik immunizált egér l,2xl09 telepképző egység (cfu) dózisban pmK207 plazmiddal transzformáit S. typhimurium SL3261-et kap 1 nappal és l,6xl09 telepképző egységet 5 nappal a fertőzés előtt. Minden dózist orálisan adunk be 25 μΐ, foszfáttal pufferolt fiziológiás konyhasóoldatban (PBS; pH = 7,2), amely 5 μg/ml kanamicin-szulfátot és 1-1 pg/ml paraamino-benzoesavat és 2,3-dihidroxibenzoesavat is tartalmaz.
2. A fertőző dózis 20 μΐ PBS-ben (orrlyukanként ΙΟΙ 0 μΐ) intranazálisan beadott telepképző egységek száma.
3. Az egereket 13 héttel a beindító immunizálás (vagyis az 1. nap) után fertőzzük.
4. A túlélést úgy állapítjuk meg, hogy a túlélő egerek számát osztjuk a fertőzött egerek számával.
5. A Streptococcusok által kiváltott pusztulás a 2. és
4. nap között következett be, míg a Salmonella által kiváltott pusztulás az 5. és 7. nap között, a fertőzéstől számítva. Az összes túlélő egér egészségesnek tűnik a fertőzés utáni 30. napon.
A találmány szerinti eljárással bármely M szerotípusú Streptococcus fehérjeantigén immunogén polipeptidszekvenciái kovalens kötéssel valamely természetes vagy szintetikus hordozóhoz kapcsolható, ilyen módon olyan vakcinát állíthatunk elő, amely széles körű védelmet nyújt M szerotípusú Streptococcusok ellen.
Az M fehérje polipeptidszekvencia-hordozóként hasznosítható olyan módon, hogy más szekvenciákat kapcsolunk kovalensen hozzá, így ez opszonikus választ vált ki olyan Streptococcus szerotípusokra, amelyeknek polipeptidjei a hordozóra van kötve, valamint arra a Streptococcus szerotípusra, amelynek polipeptidje hordozóként szolgál.
A találmány szerinti eljárással megoldható egy ilyen multivalens polipeptidet kódoló nukleotidszekvencia beiktatása egy S. pyogenes kromoszómába az M fehér9
HU 205 263 Β je struktúrgén területében, ennek klónozása plazmidokba és a plazmidok transzformálása nem virulens gazdabaktériumba. A szintetikus nukleotidok az előnyösek, de élő baktériumsejtekből nyert nukleotidszekvenciák szintén alkalmazhatók. A klónozás történhet a már transzformált nem virulens gazdabaktériumba, hogy olyan immunogén polipeptidek fejeződjenek ki, amelyek opszonikus válaszokat idéznek elő M típusú Streptococcus-fertőzésekre. így olyan immunogén polipeptidek kifejezéséhez szolgáló genetikai anyagokat kapunk, amelyek opszonikus válaszokat idéznek elő más virulens baktériumfajokra. Ez a két típusú polipeptid kovalensen köthető. Az így létrejött legyengített, nem virulens gazdaszervezet orálisan beadható széles spektrumú vakcinaként, ez egynél több baktériumfajra képes opszonikus válaszokat kiváltani.
Claims (7)
1. Eljárás emlősöknek egy Streptococcus szerotípus fertőzés elleni immunizálására alkalmas vakcina előállítására, azzal jellemezve, hogy egy nem virulens baktériumot egy olyan heterológ nukleotidszekvenciával transzformálunk, amely a tárgyi kör szerinti Streptococcus szerotípus teljes M protein antigénjét és annak intracelluláris kifejeződését kódolja, és a transzformált baktériumot vakcinává alakítjuk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás M5 szerotípusú Streptococcus-fertőzés elleni vakcina előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő nukleotidszekvenciával transzformálunk.
3 . Az I. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy nem virulens baktériumként egy Salmonella nemzetségbe tartozó baktériumot alkalmazunk.
4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy nem virulens baktériumként Salmonella typhimuriumot használunk.
5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy nem virulens baktériumként ara S. typhimurium SL3261 törzset használunk.
6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy nem virulens baktériumként egy Streptococcus nemzetségbe tartozó, nem A csoportbeli baktériumot használunk.
'7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy nem virulens baktériumként S. sanguist használunk.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/088,626 US5162226A (en) | 1987-08-24 | 1987-08-24 | Therapeutic compositions against streptococcal infections, transformed hosts, methods of immunization and genetically engineered products |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUT50048A HUT50048A (en) | 1989-12-28 |
| HU205263B true HU205263B (en) | 1992-04-28 |
Family
ID=22212456
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU884433A HU205263B (en) | 1987-08-24 | 1988-08-23 | Process for producing vaccine against streptococcus infections |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5162226A (hu) |
| EP (1) | EP0305279B1 (hu) |
| JP (1) | JPH02420A (hu) |
| AT (1) | ATE120487T1 (hu) |
| AU (1) | AU631524B2 (hu) |
| CA (1) | CA1341255C (hu) |
| DE (1) | DE3853454T2 (hu) |
| DK (1) | DK472988A (hu) |
| FI (1) | FI97603C (hu) |
| HU (1) | HU205263B (hu) |
| NO (1) | NO174630C (hu) |
| PT (1) | PT88329B (hu) |
Families Citing this family (28)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6254874B1 (en) | 1995-04-13 | 2001-07-03 | President And Fellows Of Harvard College | Attenuated auxotrophic microorganisms having a combination of non-attenuating mutations and method for making same |
| US5846547A (en) | 1996-01-22 | 1998-12-08 | Regents Of The University Of Minnesota | Streptococcal C5a peptidase vaccine |
| US6355255B1 (en) * | 1998-12-07 | 2002-03-12 | Regents Of The University Of Minnesota | Streptococcal C5a peptidase vaccine |
| US6277399B1 (en) * | 1997-10-31 | 2001-08-21 | New Horizon Diagnostics Corporation | Composition incorporating bacterial phage associated lysing enzymes for treating dermatological infections |
| US6752988B1 (en) | 2000-04-28 | 2004-06-22 | New Horizons Diagnostic Corp | Method of treating upper resiratory illnesses |
| US20030129146A1 (en) * | 1997-10-31 | 2003-07-10 | Vincent Fischetti | The use of bacterial phage associated lysing proteins for treating bacterial dental caries |
| US20020136712A1 (en) * | 1997-10-31 | 2002-09-26 | Fischetti Vincent | Bacterial phage associated lysing enzymes for the prophylactic and therapeutic treatment of colonization and infections caused by streptococcus pneumoniae |
| US6399097B1 (en) | 1997-10-31 | 2002-06-04 | New Horizons Diagnostics Corporation | Composition for treatment of a bacterial infection of the digestive tract |
| US7232576B2 (en) | 1997-10-31 | 2007-06-19 | New Horizons Diagnostics Corp | Throat lozenge for the treatment of Streptococcus Group A |
| US6406692B1 (en) * | 1997-10-31 | 2002-06-18 | New Horizons Diagnostics Corp | Composition for treatment of an ocular bacterial infection |
| US20030082110A1 (en) * | 1997-10-31 | 2003-05-01 | Vincent Fischetti | Use of bacterial phage associated lysing proteins for treating bacterial dental caries |
| US6432444B1 (en) | 1997-10-31 | 2002-08-13 | New Horizons Diagnostics Corp | Use of bacterial phage associated lysing enzymes for treating dermatological infections |
| US6428784B1 (en) * | 1997-10-31 | 2002-08-06 | New Horizons Diagnostics Corp | Vaginal suppository for treating group B Streptococcus infection |
| US6423299B1 (en) | 1997-10-31 | 2002-07-23 | Vincent Fischetti | Composition for treatment of a bacterial infection of an upper respiratory tract |
| US6056954A (en) | 1997-10-31 | 2000-05-02 | New Horizons Diagnostics Corp | Use of bacterial phage associated lysing enzymers for the prophylactic and therapeutic treatment of various illnesses |
| US20030129147A1 (en) * | 1997-10-31 | 2003-07-10 | Vincent Fischetti | Use of bacterial phage associated lysing proteins for treating bacterial dental caries |
| US6399098B1 (en) | 1997-10-31 | 2002-06-04 | New Horizons Diagnostics Corp | Composition for treating dental caries caused by streptococcus mutans |
| US20020127215A1 (en) * | 1999-09-14 | 2002-09-12 | Lawrence Loomis | Parenteral use of bacterial phage associated lysing enzymes for the therapeutic treatment of bacterial infections |
| US7063837B2 (en) * | 1999-09-14 | 2006-06-20 | New Horizons Diagnostics Corp | Syrup composition containing phage associated lytic enzymes |
| US7256265B2 (en) * | 1999-12-03 | 2007-08-14 | Regents Of The University Of Minnesota | Streptococcal C5a peptidase vaccine |
| WO2001082945A2 (en) * | 2000-04-28 | 2001-11-08 | New Horizons Diagnostic Corporation | The use of bacterial phage associated lysing enzymes for treating various illnesses |
| US6395504B1 (en) | 2000-09-01 | 2002-05-28 | New Horizons Diagnostics Corp. | Use of phage associated lytic enzymes for the rapid detection of bacterial contaminants |
| CA2427928A1 (en) * | 2000-11-02 | 2002-12-27 | New Horizons Diagnostics Corporation | The use of bacterial phage associated lytic enzymes to prevent food poisoning |
| US20040213765A1 (en) * | 2001-07-13 | 2004-10-28 | Vincent Fischetti | Use of bacterial phage associated lytic enzymes to prevent food poisoning |
| WO2003065973A2 (en) * | 2001-10-26 | 2003-08-14 | Id Biomedical Corporation Of Washington | Multivalent streptococcal vaccine compositions and methods for use |
| US7255867B2 (en) * | 2002-11-15 | 2007-08-14 | Id Biomedical Corporation Of Quebec | Vaccine |
| AU2009313615B2 (en) | 2008-11-05 | 2012-11-29 | Regents Of The University Of Minnesota | Multicomponent immunogenic composition for the prevention of beta-hemolytic streptococcal (BHS) disease |
| US9777076B2 (en) | 2012-07-16 | 2017-10-03 | Pfizer Inc. | Saccharides and uses thereof |
Family Cites Families (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2480779B2 (fr) | 1979-08-30 | 1986-07-18 | Anvar | Vecteur contenant une sequence nucleotidique de l'antigene de surface du virus de l'hepatite b et procede de fabrication d'une molecule immunogene mettant en oeuvre ce vecteur |
| US4735801A (en) * | 1982-09-07 | 1988-04-05 | Board Of Trustees Of Leland Stanford Jr. University | Novel non-reverting salmonella live vaccines |
| US4550081A (en) * | 1980-05-19 | 1985-10-29 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. University | Non-reverting salmonella |
| US4284537A (en) | 1980-07-03 | 1981-08-18 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Conjugate of streptococcal M protein peptide vaccine |
| US4666847A (en) | 1981-01-16 | 1987-05-19 | Collaborative Research, Inc. | Recombinant DNA means and method |
| WO1982003088A1 (en) * | 1981-03-09 | 1982-09-16 | Corp Cetus | Vaccines |
| US4625252A (en) | 1981-09-03 | 1986-11-25 | Basf Aktiengesellschaft | Guide system and magnetic tape cassette comprising such a system |
| US4454121A (en) * | 1982-07-27 | 1984-06-12 | The University Of Tennessee Research Corporation | Synthetic peptides corresponding to antigenic determinants of the M protein of Streptococcus pyogenes |
| US4597967A (en) * | 1982-07-27 | 1986-07-01 | The University Of Tennessee Research Corp. | Synthetic polypeptide fragments |
| US4521334A (en) | 1982-07-27 | 1985-06-04 | The University Of Tennesse Research Corporation | Synthetic polypeptide fragments |
| US4588585A (en) | 1982-10-19 | 1986-05-13 | Cetus Corporation | Human recombinant cysteine depleted interferon-β muteins |
| US4518584A (en) | 1983-04-15 | 1985-05-21 | Cetus Corporation | Human recombinant interleukin-2 muteins |
| US4919930A (en) * | 1983-06-10 | 1990-04-24 | University Of Tennessee Research Corporation | Synthetic M proteins-streptococci type 5 |
| US4784948A (en) * | 1983-08-10 | 1988-11-15 | The Rockefeller University | Production of streptococcal m protein immunogens and molecular probes |
| AU589114B2 (en) * | 1984-02-01 | 1989-10-05 | Enterovax Limited | Genetically engineered bacteria useful as a vaccine |
| US4666846A (en) | 1984-02-17 | 1987-05-19 | Eli Lilly And Company | Novel cloning vectors containing selectable genetic markers for use in streptomyces and related organisms |
-
1987
- 1987-08-24 US US07/088,626 patent/US5162226A/en not_active Expired - Lifetime
-
1988
- 1988-08-22 FI FI883876A patent/FI97603C/fi not_active IP Right Cessation
- 1988-08-22 CA CA000575374A patent/CA1341255C/en not_active Expired - Fee Related
- 1988-08-22 EP EP88402132A patent/EP0305279B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-08-22 DE DE3853454T patent/DE3853454T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-08-22 AT AT88402132T patent/ATE120487T1/de active
- 1988-08-23 HU HU884433A patent/HU205263B/hu not_active IP Right Cessation
- 1988-08-23 NO NO883763A patent/NO174630C/no unknown
- 1988-08-23 JP JP63209327A patent/JPH02420A/ja active Pending
- 1988-08-23 AU AU21451/88A patent/AU631524B2/en not_active Expired
- 1988-08-24 PT PT88329A patent/PT88329B/pt not_active IP Right Cessation
- 1988-08-24 DK DK472988A patent/DK472988A/da not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FI97603B (fi) | 1996-10-15 |
| DE3853454D1 (de) | 1995-05-04 |
| PT88329B (pt) | 1995-07-03 |
| JPH02420A (ja) | 1990-01-05 |
| PT88329A (pt) | 1989-06-30 |
| AU631524B2 (en) | 1992-12-03 |
| FI883876A0 (fi) | 1988-08-22 |
| EP0305279B1 (en) | 1995-03-29 |
| NO174630C (no) | 1994-06-08 |
| EP0305279A1 (en) | 1989-03-01 |
| US5162226A (en) | 1992-11-10 |
| AU2145188A (en) | 1989-03-09 |
| FI883876A (fi) | 1989-02-25 |
| NO174630B (no) | 1994-02-28 |
| FI97603C (fi) | 1997-01-27 |
| ATE120487T1 (de) | 1995-04-15 |
| NO883763L (no) | 1989-02-27 |
| DK472988D0 (da) | 1988-08-24 |
| DE3853454T2 (de) | 1995-11-09 |
| HUT50048A (en) | 1989-12-28 |
| CA1341255C (en) | 2001-06-19 |
| DK472988A (da) | 1989-02-25 |
| NO883763D0 (no) | 1988-08-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5162226A (en) | Therapeutic compositions against streptococcal infections, transformed hosts, methods of immunization and genetically engineered products | |
| Poirier et al. | Protective immunity evoked by oral administration of attenuated aroA Salmonella typhimurium expressing cloned streptococcal M protein. | |
| EP0625043B1 (en) | Recombinant multivalent m protein vaccine | |
| US4888170A (en) | Vaccines obtained from antigenic gene products of recombinant genes | |
| JP5566684B2 (ja) | Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対する、組換え毒素Ａ／毒素Ｂワクチン | |
| Dougan et al. | Live oral Salmonella vaccines: potential use of attenuated strains as carriers of heterologous antigens to the immune system | |
| EP0618813B1 (en) | Antigen of hybrid m protein and carrier for group a streptococcal vaccine | |
| CN103893747B (zh) | 增强针对艾美球虫属的免疫反应的组合物和方法 | |
| EP0080806B1 (en) | Live vaccine and its method of production | |
| JP2577280B2 (ja) | 組換えポックスウイルス及び連鎖球菌ｍタンパク質ワクチン | |
| JPH08503602A (ja) | 弱毒化細菌における組換え融合タンパク質の発現 | |
| US5124153A (en) | Therapeutic compositions against streptococcal infections, transformed hosts, methods of immunization and genetically engineered products | |
| JP2011502165A (ja) | 鞭毛細菌に対する免疫応答を強化する組成物および方法 | |
| US4761372A (en) | Mutant enterotoxin of E. coli | |
| US5534256A (en) | Haemophilus somnus outer membrane protein extract enriched with iron-regulated proteins | |
| US6939548B2 (en) | Methods to produce high levels of C. difficile toxins | |
| US5364774A (en) | Treponema hyodysenteriae vaccine | |
| ES2224097T3 (es) | Suministro y expresion de una proteina de superficie hibrida sobre la superficie de bacterias gram positivas. | |
| US20050019335A1 (en) | Salmonella vaccine | |
| Beachey et al. | Prospects for group A streptococcal vaccine | |
| Lai et al. | Protection of mice against experimental murine mycoplasmosis by a Mycoplasma pulmonis immunogen in lysogenized Escherichia coli | |
| KR100216390B1 (ko) | 헤모필루스 외부막 단백질 | |
| AU2002223922A1 (en) | Salmonella vaccine |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HMM4 | Cancellation of final prot. due to non-payment of fee | ||
| HMM4 | Cancellation of final prot. due to non-payment of fee |