HU203970B

HU203970B - Process for producing pharmaceutical compositions comprising 3-substituted-2-oxidol-1-carboxamide derivatives as active ingredient

Info

Publication number: HU203970B
Application number: HU891755A
Authority: HU
Inventors: Ivan George Otterness
Original assignee: Pfizer
Priority date: 1988-04-13
Filing date: 1989-04-12
Publication date: 1991-11-28
Also published as: EP0337627B1; MY103871A; EP0337627A3; DK174389D0; US4861794A; ZA892623B; JPH01305028A; PH25884A; IL89871A; AU3271189A; IE63458B1; KR890015739A; DE68906706T2; DK174389A; KR920002327B1; HUT52377A; IE891172L; PT90248B; ATE89724T1; EP0337627A2

Description

A találmány tárgya eljárás hatóanyagként egyes 3szubsztituált 2-oxíndoI-l-karboxamid-szánnazékokat vagy gyógyszerészetileg elfogadható bázikus sóikat tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására. E hatóanyagokat tartalmazó készítmények alkalmasak az interleukin-1 bioszintézis visszaszorítására emlősöknél. A találmány szerinti gyógyszerkészítmények hatásosak interleukin-1 közvetítette rendellenességek és diszfunkciók, mint csont- és kötőszöveti anyagcserezavarok és immunbetegségek kezelésére emlősöknél.

Bizonyos (I) általános képletű 3-szubsztituált 2-oxindol-l-karboxamid-származékokat és gyógyszerészetileg elfogadható sóikat - ahol egyebek között X hidrogén-, klór- vagy fluoratomot,

Y hidrogén- vagy klóratomot és

R benzil-vagy tienilcsoportot jelenta bejelentő tulajdonát képező 4 556 672 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetnek és igényelnek. E szabadalmi leírás szerint e vegyületek nemcsak hasznos gyulladásgátló és fájdalomcsillapító szerek, hanem bénítják a cikiooxigenáz (CO) és lipoxigenáz (LO) enzimeket is. Ezeket az adatokat e leírásban hivatkozásképpen közöljük.

Az interleukin-1 (IL-1) Hayward M. és FiedlerNagy Ch. szerint (Agents and Actions 22, 251-254 [1987]) in vitro és in vivő serkenti a csont reszorpciót Azt is leírták, hogy az IL-1 egyebek között fokozza a prosztaglandin E2 (PGE,) képződését is. A PGE₂ serkenti a csont reszorpciót és szerepet játszik a csontállomány veszteségében (Hayward M. A. és Caggiano T. J., Annual Reports in Medicinái Chemistry 22, IV. rész, 17. fejezett 172-177 [1987]). A csontritkulást a csont ásványi anyagainak megfogyatkozása jellemzi, ami fokozza a csonttörések gyakoriságát (lásd Hayward M. A. és Caggiano T. J. fenti közleményét és az abban idézett irodalmat).

Az interieukin-1 számos betegség kóroktanában szerepet játszik (lásd például Dinarello C. A., J. Clin. Immunoi. 5, 287-297 [1985] közleményét, melyet e lírásban hivatkozásként említünk meg). Ezenfelül pikkelysömör esetében egy IL-1 jellegű anyag szintjének emelkedését írták le (Camp R. D. és munkatársai, J. Immunoi. 137, 3469-3474 [1986]).

Az (1) képletű nem-szteroid gyulladásgátló vegyület, az l,8-dietil-l,3,4,9-tetrahidro-pirano[3,4-b]indol1-ecetsav (etodolac) a 4677 132 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás szerint csökkenti a PGE₂ termelést és a csontfelszívódást.

Leírták, hogy nem-szteroid gyulladásgátlók, mint indometacin és ibuprofen terápiás szintje nem csökkenti az IL-1 termelődést. A ciklosporin A sem rendelkezik ilyen hatással. Kortikoszteroidok azonban hatásosan gátolják az IL-1 termelést (lásd Dinarello C. A. fenti közleményét). Irodalmi adatok szerint bizonyos lipoxigenáz bénítók, mint az 5,8,11,14-eikozatetraénsav (ETYA) és 3-amino-l,3-trifluor-metil-fenil-2-pirazolin (BW755C) csökkentik a pirogén leukociták (feltételezett IL-1) in vitro képződését emberi monocitákból (Dinarello C. A. és munkatársai, Int. J. Immunopharmacol. 6,43-50 [1984]).

Mégis ez ideig nem található irodalmi adat arra vonatkozóan, hogy a találmányunkban leírt vegyületeket vagy sóikat az IL-1 bioszintézis lipoxigenáz-gátlástól független visszaszorítására, és az IL-1 közvetítette rendellenességek és diszfunkciók, mint egyes csont- és kötőszöveti anyagcserezavarok, valamint bizonyos immunbetegségek kezelésére alkalmazták volna. E vegyületek ilyen kezelésében játszott szerepét sem ismerték fel.

Azt találtuk, hogy bizonyos (I) általános képletű 3-szubsztituált 2-oxindol- 1-karboxamid-származékok és gyógyszerészetileg elfogadható bázikus sóik - ahol X hidrogén-, klór- vagy fluoratomot,

Y hidrogén- vagy klóratomot, és

R benzil- vagy tienilcsoportot jelent lipoxigenáz-gátló aktivitásuktól függetlenül visszaszorítják az IL-1 bioszintézisét és ezáltal IL-1 közvetítette rendellensségek és diszfunkciók, mint bizonyos csontés kötőszöveti anyagcserezavarok, valamint az autoimmun rendszer betegségeinek kezelésére használhatók emlősöknél, ilyen csontanyagcserezavar például a csontritkulás. Az említett kötőszöveti anyagcserezavarok közé tartozik például a periodontális (fog körüli) betegség és a szöveti hegképződés. Az IL-1 közvetítette immunbetegségek közé tartozik például az allergia és pikkelysömör.

A találmány szerinti eljárással előállított gyógyszerkészítmények az (I) általános képletű vegyületek hatásos mennyiségét tartalmazzák. A vegyületeket a gyógyászatban jól ismert bármely módon alkalmazhatjuk, így az alábbiakban meghatározott orális vagy parenterális úton.

A találmány szerinti (I) általános képletű vegyületeket és gyógyszerészetileg elfogadható bázikus sóikat ahol

X hidrogén-, klór- vagy fluoratomot,

Y hidrogén- vagy klóratomot és

R benzil- vagy tienilcsoportot jelent és e vegyületek előállítását a 4 556 672 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás ismerteti, amelyre itt hivatkozásképpen utalunk. Találmányunk tárgyát képező gyógyszerkészítmények az IL-1 bioszintézisének lipoxigenázgátlástól függetlenül visszaszorítását emlősöknél, és az IL-1 közvetítette zavarok és diszfunkciók, mint csont- és kötőszöveti anyagcsererendellenességek és immunbetegségek kezelésére is.

E vegyületeket és sóikat alkalmazó eljárások közül előnyben részesítjük azokat, ahol a használt (I) általános képletű vegyületekben X klóratomot, Y hidrogénatomot és R tienilcsoportot; vagy X fluoratomot, Y klóratomot és R 2-tienilesoportot; vagy X hidrogénatomot, Y klóratomot és R benzilcsoportot jelent. Különösen előnyben részesítjük azokat az eljárásokat, amelyeknél a használt (I) általános képletű hatóanyagban X klóratomot, Y hidrogénatomot és R 2-tienilcsoportot jelent.

A 4 556 672 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás szerint a találmány szerinti fentebb leírt vegyületek savasak és bázikus sókat képeznek. A bázikus sók valamennyien beletartoznak a találmány

HU 203 970 Β körébe és a fenti szabadalmi eljárás szerint állíthatók elő. A találmány körébe tartozó alkalmas sók közé tartoznak szerves és szervetlen sók, például ammóniával, szerves aminokkal, alkálifém-hidroxidokkal, alkálifém-karbonátokkal, alkálifém-hidrogén-karbonátokkal, alkálifém-hidridekkel, alkálifém-alkoxidokkal, alkáliföldfém-hidroxidokkal, alkáliföldfém-karbonátokkal, alkáliföldfém-hidroxidokkal és alkáliföldfém-alkoxidokkal képezett sók. Az ilyen bázikus sókat képező jellemző bázisok közé tartozik például az ammónia, primer aminok, mint n-propil-amin, n-butil-amin, anilin, ciklohexil-amin, benzil-amin, p-toluidin, etanolamin és glukamin; szekunder aminok, mint dietil-amin, dietanol-amin, N-metíl-glukamin, N-metil-anilin, morfolin, pirrolidin és piperidin; tercier aminok, mint trietil-amin, trietanol-amin, Ν,Ν-dimetil-anilin, N-etil-piperidin, és N-metil-morfolin; hidroxidok, mint nátrium-hidroxid; alkoxidok, mint nátrium-etoxid és kálium-metoxid; hidridek, mint kalcinm-hidrid és nátriumhidrid; és karbonátok, mint kálium-karbonát és nátrium-karbonát. Előnyösek a nátrium-, kálium-, ammónium, etanol-amin-, dietanol-amin és trietanol-amin-sók. Különösen előnyösek a nátriumsók,

A találmány körébe tartoznak a fent leírt vegyületek szolvátjai, mint a hemihidrátok és monohidrátok is.

Ismeretes, hogy az interleukin-1 legalább két formában létezik, amelyeket α és β fonnának neveznek (Dinarello C. A„ FASEB J. 2, 108-115 [1988]). E leírásban és az igénypontokban az interleukin-1 (IL1) meghatározás az IL-1 valamennyi alakjára kiterjed, beleértve az IL-1 a, IL-1 β formát és ezek kombinációját,

A találmány szerinti (I) általános képletű vegyületeket és farmakológiailag elfogadható sóikat tartalmazó gyógyszerkészítményeket emlősöknek adjuk be. A készítmények előállítása gyógyszerészétileg elfogadható hordozók vagy hígítók összekeverésével történik a gyógyszertechnológiában használatos Ismert eljárásokkal. Az alkalmazás orális vagy parenterális lehet. Parenterális alkalmazás alatt itt például intravénás, intramuszkuláris, intraperitoneális, szubkután, transzdermális és helyi alkalmazást értünk, beleértve az orális öblítést. Mégis általában előnyben részesítjük a vegyületek vagy sóik orális alkalmazását

E vegyületeket és sóikat általában mintegy napi 40200 mg dózisban alkalmazzuk orális úton és mintegy napi 1-200 mg dózisban parenterális úton, bár a kezelendő beteg testtömegétől függően szükséges lehet a dózis módosítására. Az IL-1 bioszintézis gátlására és az IL-1 közvetítette csontanyagcserezavar vagy IL-1 közvetítette autoimmun betegségek kezeléséhez szükséges adagot a szakember könnyen meg tudja határozni. Mégis hangsúlyozni kell, hogy e vonatkozásban más változtatások is eszközölhetők, függően a kezelendő emlős fajtájától és az adott gyógyszer iránti egyéni reagálásától, valamint a választott gyógyszerkészítményektől és a kezelés időtartamától. Egyes esetekben a fenti tartomány alsó szintje alatti adagok lehetnek alkalmasabbak, míg más esetekben még nagyobb dózisok is hanszálhatók veszélyes vagy káros mellékhatások nélkül, feltéve, hogy az ilyen magasabb dózisszinteket több kisebb dózisra osztjuk fel a nap folyamán.

Orális alkalmazás céljából tablettákat állíthatunk elő, amelyek segédanyagokat, mint nátrium-citrátot, kalcium-karbonátot, dikalcium-foszfátot tartalmazhatnak különféle szétesést elősegítő szerekkel, mint keményítővel, előnyösen burgonya- vagy tápiókakeményítővel, alginsavval és egyes komplex szilikátokkal, továbbá kötőanyagokkal, mint polivinilpirrolidonnal, szacharózzal, zselatinnal és akácia-gumival együtt. Ezenfelül a tabletták síkosító anyagokat, mint magnéziumsztearátot, nátrium-lauril-szulfátot és talkumot is tartalmazhatnak. Hasonló típusú szilárd készítmények lágy rugalmas és kemény zselatinkapszulákban is alkalmazhatók; ebben a tekintetben előnyös anyag például a laktóz, valamint nagy molekulatömegű polietilénglikolok. Ha orális úton vizes szuszpenziókat és/vagy elixíreket kívánunk alkalmazni, a hatóanyagot különböző édesítő vagy ízesítő szerekkel, színező anyagokkal vagy festékekkel, és kívánt esetben emulgeáló és/vagy szuszpendáló szerekkel, továbbá hígítókkal, mint vízzel, etanollal, propilénglikollal, glicerinnel és ezek különböző elegyeivel keverhetjük össze.

Bár a találmány szerinti vegyületeket és gyógyszerészetileg elfogadható bázikus sóikat előnyösen orálisan adagoljuk, a vegyületek parenterálisan is használhatók.

Parenterális alkalmazáshoz a vegyületeket szezámvagy földimogyoróolajban, vagy vizes propilénglikolban oldhatjuk, vagy a fentebb felsorolt megfelelő vízoldható bázikus sókból steril vizes oldatokat állítunk elő. E vizes oldatokat szükség esetén pufferozhatjuk és a folyékony hígítót elegendő konyhasóval vagy glukózzal izotóniássá tehetjük. E vizes oldatok különösen alkalmasak intravénás, intramuszkuláris vagy szubkután injekciókhoz. Ebben a vonatkozásban a használt vizes közegek jól ismert technikákkal könnyen előállíthatók. Például folyékony hígítóként rendszerint desztillált vizet használunk és a végső készítményt alkalmas baktériumszűrőn, mint szintereit üvegszűrőn vagy diatómaföldön vagy mázatlan porcelánszűrőn bocsátjuk át. Az ilyen típusú szűrők közül előnyben részesítjük a Berkefeld-szűrőt, a Chamberland-szűrőt vagy az azbeszt-fém szűrőréteget tartalmazó Seitz-szűrőt, ahol a folyadékot szivattyú viszi át steril tartályba. Természetesen a szükséges műveleteket a befecskendezésre szánt oldatok előállítása során folyamatosan kell alkalmazni, hogy biztosítsuk a végtermék sterilitását. Transzdermális alkalmazáshoz a vegyület dózisformája például oldat, öblítőoldat, balzsam, krém, gél, végbélkúp, nyújtott hatású készítmény lehet. Az ilyen dózisformák a használt vegyületet etanollal, vízzel, áthatolást elősegítő anyaggal és közömbös hordozókkal, mint gélképző anyagokkal, ásványolajjal, emulgeálószerrel, benzil-alkohollal és hasonlókkal együtt tartalmazhatják. Sajátos transzdermális áthatolást fokozó készítményeket ismertetnek a bejelentő tulajdonát képező és 1986. október 31-én benyújtott, 925 641 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban, amelyet itt hivatkozásképpen említünk meg. Helyi alkalmazás

HU 203 970 Β céljára a vegyület dózisformája például oldat, öblítővíz, balzsam, krém és gél lehet.

A találmány szerinti vegyületek interleukin-1 bioszintézist gátló képességét a következő próba segítségével mutatjuk ki.

C3H/HeN egereket (Charles River, Wilmington, Massachusetts) a nyakcsigolya meghúzása útján megölünk és hasukra 70% etanolt poriasztunk, hogy az elvégzendő sejtpreparálás során elkerüljük a baktériumos fertőzést. Minden egér hasüregébe 5% fötális borjúszérumot (FCS), penicillin-sztreptomicint [100 E/ml - 100 pg/ml] és glutamint (2 mM) tartalmazó 8 ml RPMI-1640 médiumot (Hazelton Research Products, Inc., Lenaxa, Kansas) fecskendezünk be. [Olyan fötális borjúszérumot használunk, amely megfelelő érzékenységgel rendelkezik IL-1 iránt a timocita próbában (Hyclone Laboratories, Logan, Utah) és kisfokú proliferáció következik be IL-1 távollétében.] A sejtek felszabadulásának elősegítése céljából a hashártyát megnyomkodjuk. Ezután a has bőrén bemetszést ejtve feltárjuk az alatta fekvő izomréteget. A hasűri folyadékot 20-as méretű injekcióstűvel leszívjuk, a tűt az izomrétegen át rézsútosan szúrva be a mellcsont alá. Hat egér hasűri folyadékát kúpos műanyagcsőben egyesítjük és mikroszkóposán megvizsgáljuk a baktériumos szennyezettséget A nem szennyezett folyadékot mintegy 600 x g-vel 6 percig centrifugáljuk és a felülúszót leöntjük. Hat cső leülepített sejtjeit egyesítjük és 20 ml RPMI-FCS közegben újraszuszpendáljuk. A sejtszámot bemacitométer segítségével határozzuk meg és a sejtek életképességét tripánkék festéssel ugyancsak hemacitométerben állapítjuk meg. Ezután RPMI-FCS médiummal a sejtszuszpenziőt olyan mértékben hígítjuk, hogy sűrűsége 3xl0⁶ sejt/ml legyen. 35 mm-es lemez mélyedéseibe 1-1 ml fenti sejtszuszpenziót mérünk be. A sejteket 2 órán át 37 °C-on CO₂atmoszférában inkubáljuk, hogy a makrofágok a mélyedések falához tapadjanak. A felületúszót a lemezek élénk mozgatása útján dekantáljuk. A letapadt sejteket (azaz a makrofágokat) kétszer RPMI-SF médiummal [penicillin-sztreptomicint (100 E - 100pg/ml) és glutamint (2 mM) tartalmazó RPMI] mossuk. A letapadt sejteket tartalmazó mélyedésekhez 1 ml vizsgálandó vegyületet adunk 0,1-100 ug/ml koncentrációtartományban, RPMI-SF médiumban oldva. Kontrollként 1 ml RPMI-SF médium szolgál. Ezután minden mélyedéshez RPMI-SF közegben oldott 100 ml LPS-t [1 mg/5 ml] adunk (LPS: Salmonella minnesota-ból kivont tisztított lipopoli-szacharid, amellyel szemben a C3H/HeJ egér érzéketlen.) A lemezeket 37 °C-on 24 órán át 5% CO₂ atmoszférában inkubáljuk. A felülúszókat eltávolítjuk és azonnal meghatározzuk IL-1 tartalmukat, vagy lefagyasztva tároljuk későbbi meghatározásig.

Az IL-1 vizsgálathoz 6-8 C3H/HeJ egeret (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine) a nyakcsigolya meghúzása útján megölünk és timuszukat (csecsemőmirigy) aszeptikus körülmények között eltávolítjuk. A timuszokat négyszer váltott médiummal mossuk [„Eagle’s minimum essential médium” Earle-sókkal, amely 6% fötális borjúszérumot, 100 E/ml-100 pg/ml penicilliu-sztreptomocint, 2 mM glutamint, 0,1 M nem-esszenciális aminosavat (M. A. Bioproducts, Rockville, Maryland) és 1 mM nátrium-piruvátot tartalmaz], A timuszokat szétdörzsöljük és a kapott sejtszuszpenziót 12 rétegű steril gézen (Johnson + Johnson Products, Inc., New Brunswick, New Jersey) átszűrjük. Szűrés után a sejtszuszpenziőt 6 percig 601 x g-vel centrifugáljuk, a felülúszót leöntjük és a sejtüledéket 25 ml fenti Eagle’s médiummal mossuk. A sejtsűrűséget hemacitométcr segítségével határozzuk meg és az élő sejtek számát tripánkék festés után szintén hemacitométerben számoljuk meg. Hígítással 2xl0⁷ sejt/ml sűrűségű szuszpenziót készítünk. A fentiek szerint kapott, LPS-stimulált felülúszóból felező sorozathígítást állítunk elő 96 mélyedést tartalmazó mikrotiter lemezeken, hígítóként a fent leírt Eagte's médiumot használva (50 μΐ felülúszó: 50 μΐ médium mélyedésenként). Minden mélyedéshez 50 μΐ 4xl0‘⁵ M 2-merkaptoetanolt adunk. Eagle’s médiummal készült törzsoldatból 50 μΐ fitohemaglutinin P-t (PHA) (Sigma Chemical, L-9132) adagolunk, hogy a PHA végkoncentrációja 12 mg/ml legyen. Ezután a fentiek szerint előállított timocita szuszpenzióból 50 μΐ-t adunk a mélyedésekhez, úgyhogy a végső sejtkoncentráció 5xl0⁶sejt/ml lesz. A lemezeket 37 °C-on 5% CO₂ atmoszférában 54 órán át inkubáljuk. Ezután minden mélyedéshez triciált timidint (1,48xl0⁴ Bq aktivitás 10 μΐ Eagle’s médiumban) adunk és a lemezeket a fentiek szerint további 18 órán át inkubáljuk. Inkubálás után a sejteket „sejtgyűjtő” készüléken (Ottó Hiller, Madison, Wisconsin) összegyűjtjük és a Whatman üvegrostszűrőkön fennmaradt pelleteket (Whatman, Clifton, New Jersey) megszárítjuk, A pelletek radioaktivitását szcintillációs béta-számláló segítségéve! toluol/omnifluor szcintillációs elegyben határozzuk meg. A jelen levő IL-1 mennyisége arányos a pelletekbe beépült triciált timidin mennyiségével.

A fenti timocita próbán kívül a felülúszók IL-1 tartalmát mennyiségileg az alábbi receptorkötési próbával határozzuk meg. Standard görbét veszünk fel a következőképpen: EL4-6.1 egéreredetű timómasejteket [ΙΟΙ 5x10⁶ sejt 0,4 ml kötőpufferben (RPMI 1640, 5% FCS, 25 mM HEPES, 0,01% NaN₃, pH 7,3)] adunk változó mennyiségű jelzetlen egéreredetű rIL-la-hoz [Escherichia co/i-ban létrehozott rekombináns IL-la, melynek aminosav szekvenciája megfelel az IL-la-ra közölt, 115-270 közötti szakasz aminosav szekvenciájának (Lomedico P. M. és munkatársai, Natúré 312, 458-462 (1984)] (40 pg - 40 ng IL-la 0,5 ml pufferben) és 1 órán át 4 °C-on folyamatos rázás közben inkubáljuk, majd 0,8 ng (0,1 ml) humán ¹²⁵J-rIL-iP-t (New England Nuclear, Boston, Massachusetts) adunk hozzá és a rázást további 3 órán át folytatjuk. A mintákat Yeda készülék segítségével szűrjük (Linca Co., Tel-Aviv, Izrael) Whatman GF/C2.4 cm üvegrost szűrőkön (0,5% poralakú tejjel 2 órán át 37 °C-on blokkolva) és egyszer 3 ml jéghideg pufferrel mossuk. A szűrők radioaktivitását Searle gamma-számlálóban mérjük le és nem-specifikus kötődésnek a 200 ng jel-41

HU 203 970 Β zetlen rIL-la jelenlétében mért radioaktivitást tekintjük (cpm). Hill-féle kalibrációs görbét készítünk a log(Y/l00-Y)-t lóg C-vel szemben ábrázolva, ahol Y a kontroll ¹²⁵J-rIL-lp kötődés %-át és C a jelzetlen rlLla koncentrációját jelenti. A legkisebb négyzetek elve alapján a 20-80% Y-értékek közé regressziós egyenest illesztünk. Ezután a fentiek szerint nyert felülúszók IL-1 szintjeinek megállapítása céljából a fenti eljárásban hígított felülúszókkal helyettesítjük az rIL-la-t és a mért %-os kötődési értékek felhasználásával meghatározzuk az IL-1 koncentrációt a standard Hill-diagramból. Minden hígításból párhuzamos próbákat végzünk és általában csak a 20-80% közötti Y értékeket használjuk az átlagos IL-1 szintek kiszámításához.

A továbbiakban a fentiek szerint kezelt letapadt makrofágok sejten belüli IL-Ια tartalmát a szakember által jól ismert és az alábbiakban leírt Westem-levonat módszerrel („Western biot analysis) vizsgáljuk. A kezelt, letapadt makrofágokat kikaparjuk a lemez mélyedéseiből. Minden kezelt csoport sejtjeit háromszor mossuk konyhasótartalmú foszfát pufferrel (PBS), majd a sejteket 10 mM diizopropil-fluor-foszfátot (DFP) (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wisconsin) tartalmazó foszfát pufferben (50 mM KC1, 10 mM NaCl, 50 mM KH₂PO₄, 1,0 mM EDTA, pH 7,5) oldott 0,5% NP-40 segítségével emésztjük. Az éppen maradt magokat leülepítjük és a felülúszókat kisméretű tiszta centrifugacsövekbe töltjük. Minden felülúszóból 15 μΐ-t (amely körülbelül 2xl0⁵ sejttel egyenértékű) Laemmli szerinti minta-pufferben oldunk [Laemmli U. K„ Natúré (London) 227, 680-685 (1970)], gradiens (10-20%) poliakrilamid-nátrium-dodecil-sziilfát (PAG-SDS) gélre visszük fel és az elektroforézist 3-4 órán át folytatjuk állandó 35 mA áramerősséget alkalmazva. Ezután a fehérjéket a gélről éjszakán át nitrocellulóz (NC) papírra (Micron Separations, Inc., Westboro, Massachusetts) visszük át 220 mA áramerősséget, valamint 192 mM glicint, 25 mM Triszt, 0,1% SDS-t és 25% metanolt tartalmazó puffért alkalmazva. Az NC papírra változatlan formában átvitt két másolatra olyan 1/250 hígítású antiszérumot rétegzünk, amelyet kecskében indukáltunk egyrészt Escherichia co/r'-ban létrehozott egér rIL-la-val és anti-egér rIL-lfi-val [rekombináns IL-la (rIL-Ία), amelynek aminosav szekvenciája megfelel az IL-la-ra leközölt, 115-270 közötti szakasz aminosavsorrendjének (Lomedico P. M. és munkatársai, Natúré 312,458-462 (1984)], másrészt E. coli-baa létrehozott rekombináns IL-lp-val (rIL-Ιβ) [melynek aminosav szekvenciája megfelel az IL-ip-ra megadott, 118-269 aminosavszakasz aminosavsorrendjének (Grey P. W. és munkatársai, J. Immunoi. 137, 3644-3648 (1986)]. Miután a levonatokat PBS pufferben oldott 0,5% Tween 20-szal mostuk, a másolatokat kecske IgG-vei (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, Indiana) szemben előállított sertésszérummal konjugált 1/1000 hígítású torma-peroxidázzal teszteljük és precipitáló 4-klór-l-naftol szubsztráttal előhívjuk. A sávok letapogatására LKB lézer denzitométert (2220 modell, LKB, Paramus, New Jersey) használunk. A pásztázás adatainak mennyiségi értékeléséhez AT+T PC 6300 számítógépbe betáplált LKB GelScan XL Evaluation softwaret alkalmazunk.

Amikor a fent leírt makrofágokat a találmány szerinti vegyülettel - ahol X klóratomot, Y hidrogénatomot és R 2-tienilcsoportot jelent - kezeljük 3,3% fötális botjúszérum jelenlétében, a vegyület nem gátolja a lipoxigenázt, minthogy nem következik be a leukotrién (LTC₄) képződés gátlása az LTC₄[³H]RIA készlettel (New England Nuclear, Boston, Massachusetts) végzett „radioimmunoassay” során, az IL-1 képződése azonban gátlódik. A radioimmunassay-t polipropilén csövekben hatjuk végre, és az összes reagenst 0,1% zselatint, 0,01 M EDTA-t és 0,1% NaN₃-ot tartalmazó 10 millimólos foszfátpufferrel (pH 7,4) hígítjuk. 50 μΐ felülúszóhoz pufferben oldott 4000 cpm radioaktív jelzőanyagot és hígított antiszérumot adunk, és éjszakán át 4 °C-on inkubáljuk. A nem kötődött radioaktív jelzőanyagot 0.5% Norit A szén és 0,5% dextrán T-70 szuszpenziójával (250 μΐ) távolítjuk el. Centrifugálás után a felülúszó 250 μΐ-éhez 1,0 ml Atomlight-et (New England Nuclear, Boston, Massachusetts) adunk és a radioaktivitást 1,5 ml polipropilén mikrocsövekben Beckman LS-250 folyadékszcintillációs spektrométer segítségével lemérjük. A minták radioaktivitását staadard log-logit görbéből extrapoláció útján határozzMÜSmeg (a standardokat a mintákkal együtt vizsgáljuk).

A fenti vizsgálat során az (I) általános képlett vegyületek az alább eredményeket adták:

X	Y	R	IL-lgftlás
Cl	H	2-tienil	60
F	Cl	2-tienil	59
F	Cl	benzil	39

* % az IL-1 gátlás két mérés átlaga.

A vegyidet koncentrációja 10 μΜ.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás hatóanyagként (I) általános képletű vegyületek vagy ezek gyógyszerészetileg elfogadható bázikus sóit - ahol

X hidrogén-, klór- vagy fluoratomot,

Y hidrogén- vagy klóratomot és

R benzil- vagy tienilcsoportot jelent tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy az ismert módon előállított hatóanyagot emlősök interleukin-1 bioszintézisének gátlására alkalmas gyógyszerkészítménnyé dolgozzuk fel.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (I) általános képletű vegyületeket vagy ezek gyógyszerészetileg elfogadható bázikus sóit emlősök interleukin-1 közvetítette csontanyagcsere-zavarainak kezelésére alkalmas gyógyszerkészítménnyé dolgozzuk fel.

HU 203 970 Β
3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (I) általános képletű hatóanyagot csontritkulás kezelésére alkalmas gyógyszerkészítménnyé dolgozzuk fel.
4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (I) általános képletű vegyületeket vagy ezek gyógyszerészetileg elfogadható bázikus sóit emlősök interieukin-1 közvetítette kötőszöveti anyagcserezavarainak kezelésére alkalmas gyógyszerkészítménnyé dolgozzuk fel.
5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (I) általános képletű hatóanyagot periodontális kötőszöveti betegség vagy szöveti hegképződés kezelésére alkalmas gyógyszerkészítménnyé dolgozzuk fel.
6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (I) általános képletű vegyületeket vagy ezek gyógyszerészetileg elfogadható bázikus sóit emlősök ínterleukin-1 közvetítette immunzavarainak kezelésére alkalmas gyógyszerkészítménnyé dolgozzuk fel.
7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (I) általános képletű hatóanyagot immunbetegségek, mint allergia és pikkelysömör kezelésére alkalmas gyógyszerkészítménnyé dolgozzuk fel.
8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként olyan (1) általános képletű vegyületet vagy e vegyület gyógyszerészetileg elfogadható bázikus sóját alkalmazunk, ahol X klóratomot,

Y hidrogénatomot és

R 2-tienil-csoportot jelent.
9. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként olyan (I) általános képletű vegyületet vagy e vegyület gyógyszerészetileg elfogadható bázikus sóját alkalmazunk, ahol

X fluoratomot,

Y klóratomot és

R 2-tienil-csoportot jelent.
10. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként olyan (I) általános képletű vegyületet vagy e vegyület gyógyszerészetileg elfogadható bázikus sóját alkalmazunk, ahol

X fluoratomot,

Y klóratomot és

R benzilcsoportot jelent.
11. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gyógyszerkészítményeket orális vagy parenterális alakra fomráljuk.