HU202553B

HU202553B - Process for producing isopolypeptides composed of diamino monokarboxylic acids and pharmaceutical compositions comprising same, as well as plant protective comprising polyisolysine

Info

Publication number: HU202553B
Application number: HU874723A
Authority: HU
Inventors: Karolyne Almas; Richard Gaborjanyi; Karolyne Lapis; Bela Szende; Gyula Szokan; Ernoe Tyihak
Original assignee: Mta Kutatas Es Szervezetelemzo; Noevenyvedelmi Kutato Intezet
Priority date: 1987-10-21
Filing date: 1987-10-21
Publication date: 1991-03-28
Also published as: FI884890A; KR890006670A; DK585988A; IT1230584B; NL8802604A; SE8803765D0; DK585988D0; SE8803765L; FI884890A0; IT8822389A0; GB8824278D0; ES2012559A6; DE3835962A1; FR2622195A1; JPH02124861A; GB2212810A; CN1033633A; HUT48279A; GB8824694D0

Description

A találmány tárgya új eljárás D és/vagy L konfigurációjú, azonos vagy különböző diamino-monokarbonsavakból álló izopolipeptidek és sóik, ezen belül az (I) általános képletű izopolipeptidek és sóik előállítására. Az (I) általános képletben r értéke 20- 5

400 közötti átlagérték, m értéke 0,1,2,3 és az egyes monomerekben azonos, és az egyes monomerek azonosan D vagy L konfigurációjúak.

A találmány tárgya továbbá eljárás az (I) általános képletű vegyületeket vagy gyógyszerészetüeg 10 elfogadható sóikat tartalmazó daganatellenes és antivirális hatású gyógyszerkészítmények előállítására.

A találmány tárgyát képezik továbbá azok a fitopatogén virusgátló hatású növényvédőszer kompo- 15 zíciók, amelyek hatóanyagként a poliizo-L-lizint vagy annak sóját tartalmazzák.

A természetben előfordulnak diamino-monokarbonsavakból felépülő, izopeptid kötéseket tartalmazó peptidek is, így például egyes peptid antibi- 20 otikumokban, baktériumok sejtfalában és a klavicepaminokban. Ezek az izopeptidek biológiai hatással rendelkezhetnek, és biológiai úton is előállíthatok. Ismeretesek továbbá szintetikus úton előállított, biológiailag aktív izopolipeptidek is. 25

Japán kutatók megállapították, hogy a Streptomices albulus 25-30 monomer egységből álló L-lizin polimert is termel, amelyben a monomerek bizonyítottan izopeptid kötéssel kapcsolódnak [Shima,

S., Sakai, H.: Agric.Biol. Chem. 45,(11) 2503-2508 30 (1981)]. Kimutatták, hogy ennek a természetes εpoli-L-lizinnek erős bakteriofág inaktiváló hatása van [Shima, S. et al.: Agric. Bioi. Chem. 46, (7) 1917—

1919 (1982)], és fermentációs eljárást dolgoztak ki ennek az izopeptidnek az előállítására [Shima, S. et 35 al.: Nippon Nogeigaku Kaishi 57,221-226 (1983)].

Indiai kutatók szintetikus poli-e-L-lizinek, ezek aminosavakkal acilezett származékai, továbbá szintetikus poli(p-L-a,p-diamino-propionsav) előállítását és antivirális hatását ismertették. Megállapí- 40 tották, hogy ezek a vegyületek interferonszerű antivirális faktort indukálva fejtettek ki antivirális hatást, amely hatás gyengébb volt a poli-a-L-lizinénél [Biopolymers, 79,219-229 (1980), Indián J. Exper. Biology 20,227-229 (1982), Indián J. Chem. 21B, 45

483-484(1982)].

A klavicepaminok az anyarozs (Claviceps purpurea-Fr. (Túl.) szaprofita tenyészeteiből izolálható bázisos fehérjék. Ezek a fehérjék több frakcióra bonthatók, melyek móltömege 2000-17000 között 50 van, és lizintartalmuk 30-95 mól%. Nem ismeretes azonban a frakciók aminosavszekvenciája, tehát a klavicepaminok kémiai szerkezetét csak részben tekinthetjük felderítettnek [Tyihák E.: Kandidátusi disszertáció, 1978]. Megállapítottuk, hogy a klavi- 55 cepaminokban a lizinmolekulák izopolipeptid kötésben vannak, vagyis ε-aminocsoportjuk vesz részt a peptidkötésben [Szókán, Gy., Kelemen, G„ Török,

A.: J. Chromatography 366,283-292 (1986)].

A klavicepaminok kísérletes körülmények kö- 60 zött in vitro és in vivő gátolják bizonyos sejtek, így néhány fajta daganatsejt proliferációját. Ez a hatás jelentős és szignifikáns, de nem vezet a sejtproliferáció teljes leállásához.

Tekintettel arra, hogy a klavicepaminok bioló- 65 giai hatása és kémiai szerkezete közötti összefüggés tisztázatlan, felmerült annak szükségessége, hoy azt szisztematikus vizsgálatokkal tanulmányozzuk. Elsősorban az izopeptidkötésben lévő lizin felé irányult figyelmünk. Nem ismeretes ugyanis, hogy az izopeptidkötésben lévő lizinmolekulák, vagy a klavicepaminokban jelenlévő más aminosavak, esetleg ezek és a lizinek együttesen fejtik-e ki a sejtproliferációt gátló hatást. Ugyancsak ismeretlen a klavicepaminokban megtalálható izopeptidkötésben lévő polilizinek lánchosszúsága, azaz pontos molekulatömege.

A szerkezet és a biológiai hatás közötti összefüggések tanulmányozása érdekében diamino-monokarbonsavak 20-400 tagszámú tartományon belüli, adott átlag-molekulatömegű, kis polidiszperzitású izopeptidjeinek ipari mértékben is megvalósítható előállítását tűztük ki célul. Az előállítandó anyagokkal szemben alapvető követelmény volt a nagy tisztaság, a molekulatömeg kis szórása adott átlagérték esetén (kis polidiszperzitás), továbbá az aminosavrészek előre megtervezett konfigurációjának megtartása.

Ismeretes, hogy a biopolimerek élettani hatását erősen befolyásolja móltömeg-eloszlásuk. Korábbi kutatásaink során pedig bizonyítottá vált, hogy az aminosavak és polipeptidek biológiai hatását döntően befolyásolja azok optikai konfigurációja. Az ellentétes konfigurációjú molekulák ellentétes hatásúak lehetnek, ezt több aminosav esetén tapasztaltuk. így például az átoltható állati daganatok növekedését a D-arginin (monomer) gátolja, az L-arginin (monomer) pedig serkenti [Szende B.: Kandidátusi disszertáció, 1974]. így ha a D- és L-konf igurációjú aminosavak racém elegyben vagy egy polimerben együtt fordulnak elő (racém polimerek), akkor egymás hatását kiolthatják.

A20-400 tagszámú polimerek előállítására szintetikus út látszott járhatónak, elsősorban monomerek polimerizáclójával.

A leírás keretében használt rövidítések jelentését — a IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature, J. Bioi. Chem. 247,977-983 (1972) szerint — a következőkben adjuk meg:

Z benzil-oxi-karbonil-csoport

Cl-Z klór-benzü-oxi-karbonü-csoport (2, 3, 4, 2.4)

Fmoc9-fluoenil-metil-oxi-karbonü-csoport

Boc terc-butü-oxi-karbonil-csoport

Bpoc 2-(4-bifenüil)-izopropil-oxi-karbonil-csoport

Aoc terc-amil-oxi-karbonil-csoport

Adc adamantil-oxi-karbonil-csoport

Ddz 2-(3,5-dimetil-oxí-fenil)-propü(2)-oxi-karbonil-csoport

Poc2-fenü-propU(2)oxi-karbonil-csoport

Tcp triklór-fenil-csoport

Np p-nitro-fenil-csoport

Su N-hidroxi-szukcinimidil-csoport

Pcp pentaklór-fenil-csoport

Pfp pentafluor-fenil-csoport

Bt N-hidroxi-benzotriazol-csoport

Bu'OCO izobutil-oxi-karbonil-csoport

EtOCO etü-oxi-karbonil-csoport

N3 azidocsoport

-2HU 202553Β

EEDQ N-etoxi-karbonil-2-etoxi-l,2-dihidrokinolin

IIDQ N-izobutoxi-karbonil-2-izobutü-l,2-dihidrokinolin

További rövidítések:

THF tetrahidrofurán

DMF dimetil-formamid

HPLC nagy hatékonyságú folyadékkromatográfia

OPLC túlnyomásos rétegkromatográfia

IEF izoelektromos fókuszálás

MS tömegspektrometria

NMR magmágneses rezonancia spektroszkópia

ZcO2 szén-dioxid alapon mért Z-csoport

Reprodukáltuk a következőkben felsorolt eljárásokat. Hull et al.: Biopolymers 17, 2427-2443 (1978) módszerét alkalmazva alfa-aminocsoportján Z-vel védett lizin pentaklór-fenil-észterét, továbbá Gangopadhyay és Mathur: Indián J. Chem. 21B, 483-484 (1982) publikációban ismertetett eljárása szerint az alfa-aminocsoportján Boc védőcsoporttal védett lizin pentaklór-fenil-észterét polimerizáltuk, továbbá Nishi et al.: Int. J. Bioi. Macromol. 2,53 (1980) szerint Z-vel védett lizint difenilfoszforil-aziddal (DPPA) polimerizáltunk.

A fenti közlemények szerzői nem közöltek adatokat termékeik móltömegére, móltömegeloszlására és optikai tisztaságára vonatkozóan.

Tapasztalataink azt mutatták, hogy ezeken az utakon céljainkhoz képest kis molekulatömegű (15-20 tagszámú, azaz legfeljebb 2500 móltömegű) poliizolizint nyertünk. Az előállított termékek papírkromatográfiás vizsgálata azt mutatta, hogy azok erősen polidiszperzek voltak, továbbá a hozam — a gyakorlati szempontokat is figyelembe véve — alacsony volt. A termékek biológiai vizsgálatainkban hatástalanoknak bizonyultak.

Kis polidiszperzitású polimerek előállítására legalkalmasabbnak látszott Kushwaha és munkatársai [Biopolymers 19,219-229 (1980)], valamint Mathur és munkatársai [Int. J. Peptide Protein Rés. 17, 189-196 (1981)] módszere. Az előbbi idézet ε-polilizin, az utóbbi δ-poliornitin előállítását ismerteti. Mindkét eljárás alapelve az, hogy a megfelelően védett aminosav metü-észterből kiindulva védett aktív észterrel vagy aziddal tripeptid-metü-észtert állítanak elő, melynek karboxilcsopor t ját lúgos hidrolízissel felszabadítják. Az ω-ΝΗ2 terminális védőcsoportot eltávolítva nyerik a polikondenzációra már alkalmas aktív tripeptidet. Polikondenzáció után az α-helyzetű aminocsoportokat felszabadítják, és az izopolipeptidet kinyerik. Az idézett eljárásokban az α-helyzetben Boc, az ω-helyzetben Z amino védőcsoportot alkalmaznak, ez utóbbit katalitikus hidrogénezéssel távolítják el. E közleményekben a végtermékek molekulatömege, polidiszperzitásra, és optikai tisztaságra (L- és D-konfigurációra) nézve nincsenek jellemezve.

Kushwaha, illetve Mathur eljárásait reprodukálva azoknak egy lényeges hátrányát tapasztaltuk. Az oligomer előállítása folyamán ugyanis a reakcióban részt nem vevő karboxilcsoportot metilészter formájában védjük, így a kapott oligomer közvetlenül nem alkalmas polikondenzációra. Az aktív származék kialakítása érdekében a karboxilcsoportot lúgos hidrolízissel kell felszabadítanunk, ez a lépés pedig — az előbbiek szerint nagy valószínűséggel hátrányos — racemizációra, a hozam csökkentésére és nemkívánatos mellékreakciókra vezet. Ugyanakkor a kapott polimerek erős polidiszperzitást is mutattak. Hátrányos továbbá az ω-helyzetű Z amino védőcsoport alkalmazása és a csoport katalitikus hidrogénezéssel való eltávolítása az eljárás ipari léptékű kivitelezésében.

A fenti eljárással nyert poliizolizinek biológiai vizsgálatainkban hatástalannak bizonyultak.

A találmány célja olyan, meghatározott móltömegű, kis polidiszperzitású izopolipeptidek előállítása, amelyek meghatározott konfigurációjú (D-, illetve L-) diamino-monokarbonsavakból épülnek fel.

A találmány alapja az a felismerés, hoghy az ismert módszerek hátrányai kiküszöbölhetők, ha először polikondenzációra közvetlenül alkalmas, diamino-monokarbonsavakból álló, amino-védett dimereket vagy oligomereket, előnyösen oligomereket állítunk elő úgy, hogy az aminocsoportjukon megfelelően védett kiindulási monomerek karboxilcsoportját aktív észtercsoporttal védjük, és a peptidkapcsolást olyan módszerrel végezzük, amelynek körülményei között a savamid kötést kialakító, karboxilcsoportján aktivált származék lényegesen nagyobb sebességgel lép reakcióba az aminokomponenssel, mint a védő aktív észtercsoport aminolízisének sebessége.

A találmány további alapja az a felismerés, hogy diamino-monokarbonsavak esetén a karboxilcsoport átmeneti védelmére és egyben aktiválására a pnitro-fenü-észter csoport, a peptidkötés kialakítására a vegyes anhidrides módszer különösen alkalmas, a savamidkötésben résztvevő aminocsoport Boc védőcsoporttal, a reakcióban részt nem vevő aminocsoport Z védőcsoporttal való védelme mellett.

Felismertük továbbá, hogy a fenti eljárással bármely diamino-monokarbonsav homo vagy szekvencia izopolipeptidjeit, vagyis azonos vagy különböző aminosavakból álló izopolipeptidjeit előállíthatjuk úgy, hogy az aminosavrészek eredeti konfigurációjukat (L-, illetve D-) megtartják.

A találmány értelmében D és/vagy L konfigurációjú, azonos vagy különböző diamino-monokarbonsavakból álló izopolipeptideket és sóikat állítjuk elő azonos vagy különböző monomerek kapcsolásával és a kapott dimerek vagy oligomerek polikondenzációjával úgy, hogy a ω-aminocsoportján szabad és a peptidkötésben részt nem vevő aminocsoportján ismert módon védett, karboxilcsoportján valamely ismert aktívészter csoporttal védett D vagyLkonfigurációjúdiamino-monokarbonsavhoz vegyes anhidrides, azidos vagy szuperaktív észteres módszerrel kapcsolunk az aminocsoportjain ismert védőcsoportokkal védett azonos vagy különböző D vagy L konfigurációjú diamino-monokarbonsavat, az így kapott dimer ω-amino-védőcsoportját lehasítjuk, és kívánt esetben az ω-aminocsoportján szabad dimerbez vegyes anhidrides, azidos vagy szuperaktív észteres módszerrel kapcsolunk az amino3

-3HU 202553Β csoportjain ismert védőcsoportokkal védett, az előbbiekkel azonos vagy azoktól eltérő D vagy L konfigurációjú diamino-monokarbonsavat, és kívánt esetben az ω-amino-védőcsoport lehasítását és a kapcsolást továbbfolytatjuk, majd az ω-aminocsoportján szabad di-, dekapeptidet ismert módon polikondenzáljuk, a peptidkötésben részt nem vevő aminocsoportok védőcsoportjait lehasítjuk, és kívánt esetben az izopolipeptidet ismert módon sóvá alakítjuk, vagy a savaddíciós só formában kapott izopolipeptidet sójából felszabadítjuk, és kívánt esetben másik sóvá alakítjuk.

A találmány szerinti eljárásban a kiindulási diamino-monokarbonsavak aminocsoportjait a peptidkémiában ismert, egymástól eltérő, egymás mellől szelektíven eltávolítható védőcsoportokkal védjük. A peptidkötésben részt nem vevő aminocsoport védelmére előnyösen Z, Cl-Z, Fmoc csoportot, az ωhelyzetű aminocsoport védelmére előnyösen Boc, Bpoc, Aoc, Adc, Ddz, Poc csoportot alkalmazunk.

A karboxilcsoport védelmére és egyben aktiválására ismert aktív észter védőcsoportot, előnyösen ONp, OTcp, OPcp csoportot használunk.

A megfelelően védett aminosavak kapcsolását ismert módon, vegyes anhidrides, azidos vagy szuperaktív észteres módszerrel végezzük. Szuperaktív észteres kapcsolás esetén az aminocsoportjain a fentiek szerint védett diamino-monokarbonsav ismert szuperaktív észterét, előnyösen OPfp vagy OBt észterét kapcsoljuk az ω-aminocsoportján szabad, a peptidkötésben részt nem vevő aminocsoportján és karboxilcsoportján a fentiek szerint védett diamino-monokarbonsavhoz.

A találmány szerinti legelőnyösebb eljárásváltozatban az ω-aminocsoportján szabad és a peptidkötésben részt nem vevő aminocsoportján Z-vel védett, karboxilcsoportján p-nitro-fenil-észter-csoporttal védett diamino-monokarbonsavhoz az ωaminocsoportján Boc-cal, a peptidkötésben részt nem vevő aminocsoportján Z-vel védett diaminomonokarbonsavat vegyes anhidrides módszerrel kapcsolunk, az így kapott dimer ω-amino-védőcsoportját lehasítjuk, és az ω-aminocsoportján szabad dimerhez vegyes anhidrides módszerrel kapcsolunk az ω-helyzetben Boc-cal, a peptidkötésben részt nem vevő aminocsoportján Z-vel védett diaminomonokarbonsavat, az így kapott trimer ω-helyzetű Boc csoportját lehasítjuk, majd az ω-aminocsoportján szabad tripeptidet ismert módon polikondenzáljuk.

A legelőnyösebbnek bizonyult vegyes anhidrides kapcsolási módszer szisztematikus vizsgálatával a következő reakciókörülményeket találtuk a legmegfelelőbbnek:

a) oldószer: acetonitril, THF, DM, diklór-metán;

b) anhidridképző reagens: klór-hangyasav-etilészter, klór-hangyasav-izobutil-észter, EEDQ, IIDQ; tercier bázis: trietil-amin, diizopropil-etilamin, N-metil-morfolin;

C) aktiválási idő és hőmérséklet: 10-30 perc, 10 °C és -20 ’C között;

d) az aminokomponens felszabadítása sójából: trietil-aminnal vagy diizopropil-aminnal a reakcióelegyben.

így 60-80%-os átlagtermeléssel állítottuk elő a tiszta végterméket.

A di-, tri-, dekapeptideket ismert módon, oldószer és bázis jelenlétében polikondenzáljuk (ld. Houben-Weyl: Methoden dér organischen Chemie, ed. E. Müller /G. Thieme Verlag, Stuttgart, 1974/, XV/2, ed.E. Wünsch: SynthesevonPeptidenp. 408423, E. Schröder, K. Lübke: The Peptides I-Π., Acad Press, New York, 1966, MA Stahmann: Polyamino Acids, Polypeptides, and Proteins, The Univ. Wisconsin Press, Madison, 1962).

A végtermék polimerizációfok tartományát a fenti irodalmakból ismert módon, a di-, tri-, dekapeptid koncentrációjának, a reakció hőmérsékletének és idejének, továbbá az oldószer megfelelő megválasztásával állíthatjuk be. Oldószerként előnyösen DMSO-t, DMF-et vagy hexametil-foszforsavtriamidot (HMPT), bázisként előnyösen trietilamint, N-metil-morfolint vagy düzopropil-etilamint használunk, az oligomerből 200500mmól/dm³ koncentrációjú oldatot készítünk, és a reakciót szobahőmérsékleten 14-180 órán át végezzük. A biológiai hatás szempontjából különösen kedvező, 60-120 tagszámú izopolipeptideket az oligomerek 40-150 órán át végzett polikondenzációjával állíthatjuk elő. A biológiai hatás szempontjából legkedvezőbb (I) általános képletű izopolipeptidek előállítására legelőnyösebben úgy járunk el, hogy a reakcióban részt nem vevő aminocsoport védelmére Z védőcsoportot alkalmazunk, az oligomerből 350-450 mmól/dm³ koncentrációjú oldatot készítünk pl. DMSO-val, és a polikondenzációt teljes gélesedésig végezzük. Ha oldószerelegyet (pl. DMSO és HMPT 1:1 arányú elegyét) használunk, a teljes gélesedést elkerüljük, és a reakcióelegy oldatban tartásával a polikondenzációt 150-180 órán át végezzük, így magasabb tagszámú polimert kapunk. A 20-60 tagszámú izopolipeptideket 24-40 órán át végzett polikondenzációval állítjuk elő. A fentiek szerint mind a móltömeg, mind a móltömegeloszlás szempontjából jól reprodukálhatóan állíthatjuk elő a kívánt terméket, melynek biológaii hatása szintén jól reprodukálható.

A végterméket ismert módon, előnyösen kicsapással és mosással (pl. vízzel, éterrel), ezt követően gélkromatográfiával, ismételt átcsapással vagy dialízissel tisztítjuk.

A találmány szerinti eljárással mind L-, mind Dkonfigurációjú díamino-monokarbonsavakból felépülő homo- és szekvencia izopolipeptideket állíthatunk elő a kiindulási vegyületek eredeti konfigurációját megtartva, ezek között olyanokat is, amelyekben az L- és D-konfigurációjú aminosavak vegyesen fordulnak elő.

A találmány szerinti eljárással a peptidkötésben részt nem vevő aminocsoportokon védett izopolipeptideket állítunk elő. A védőcsoportokat ismert módon lehasítjuk, és így az izopolipeptideket savaddíciós sójából felszabadítjuk, és kívánt esetben egy másik sóvá alakítjuk.

A fentiek szerint állítjuk elő az (I) általános képletű izopolipeptideket és sóikat is úgy, hogy kiindulási anyagokként valamely (Π) és (M) általános képletű vegyületeket alkalmazunk. A (Π) és (ΙΠ) általános képletű yegyületekben m és 0,1,2,3, R¹ és R²jelentése egymás mellől szelektíven eltávolítható

-4HU 202553 Β amino-védőcsoport, előnyösen R¹ jelentése Z, ClZ, Fmoc, R^z jelentése Boc, Bpoc. Aoc, Adc, Ddz,

Poc, R³ jelentése ismert aktív észter csoport, előnyösen Np, Tcp, Pcp, és a szubsztituensek jelentése a (H) és (ΙΠ) általános képletű vegyületekben 5 megegyező, és a (Π) és (EH) általános képletű vegyületek konfigurációja azonos.

Az előállított izopeptidek analízisénél modem elválasztástechnikai módszereket (HPLC, OPLC,

IEF) és szerkezetvizsgálati módszereket (például 10 MS, NMR) használtunk. Ezek a vizsgálatok azt igazolták, hogy a kívánt anyagokat sikerült előállítanunk.

A biológiai vizsgálatok alábbiakban ismertetett eredményei azt igazolják, hogy a találmány szerinti 15 eljárással előállított, L-konfigurációjú izopolipeptidek és sóik előnyös biológiai aktivitással rendelkeznek szemben az ismert eljárásokkal előállított termékekkel.

A találmányunk szerinti eljárás előnyeit a Kush- 20 waha illetve Mathur, továbbá Hull által publikált szintézisekkel szemben a következőkben foglaljuk össze:

- Ha optikailag tiszta izomerekből indulunk ki, akkor az azoknak megfelelő konfigurációjú, kis po- 25 lidiszperzitású polimert kapjuk.

- Polikondenzációra közvetlenül alkalmas oligomert nyerünk úgy, hogy elkerüljük az előbbiekben említett hidrolízis lépést. így kiküszöböljük a racemizációt, ami döntő jelentőségű a biológiai hatás 30 szempontjából, továbbá meglepően kedvezőbb mólsúlyeloszlású (kis polidiszperzitású) terméket kapunk, ami szintén előnyös a kívánt biológiai hatás elérése szempontjából.

- Magasabb hozamot érünk el, a köztitermékek 35 és a végtermékek optikai tisztasága nagyobb. Mind a köztitermékek, mind a végtermékek jól kristályosodó anyagok, ennél fogva jól izolálhatok.

- Az egyes peptidkapcsolási lépések lényegesen rövidebb idő alatt mennek végbe. 40

- Az általunk legelőnyösebbnek talált eljárásváltozatban alkalmazott amino-védőcsoport kombinációval elkerülhetjük a savamidkötésben részt vevő aminocsoport katalitikus hidrogénezéssel végzett felszabadítását. Ez az ipari megvalósítás szempont- 45 jából előnyös. Poliizolizin és poliizoornitin esetén ugyanakkor az is előnyös, hogy a biológiai hatás szempontjából kedvező móltömegű izopolipeptid

Z-vel védett köztitermékét a polikondenzáció folyamán gél formájában kapjuk meg, ami könnyebben izolálható a3oc-cal védett, oldatban lévő védett polimernél.

A találmány í,jerinti eljárással előállított vegyületek biológiai hatását in vitro és in vivő körülmények között vizsgáltuk, eredményeinket a következőkben ismertetjük. A tumorgátló hatást állati tumortörzsek, a vírusgátló hatást növényi vírus felhasználásával vizsgáltuk.

Kísérleteinkben meglepően hatékonynak bizonyultak a 40-200 tagszámú (5500-25600 közötti móltömegű) poliizo-L-lizinek, amelyek közül is kiemelkedően jó hatást mutattak a 60-120 tagszámú (10200-15400 közötti móltömegű) termékek

Tumorgátló hatás vizsgálata

A sejtproliferációt befolyásoló vegyületek hatásának vizsgálata általában in vitro, sejttenyészetek és in vivő átoltható állati daganatok felhasználásával történik. Ezért a szóban forgó anyagokat is egy humán erythroleukaemia (K-562) sejttenyészet (eredete: Karolinska Institut, Stockholm) és négy átoltható egér daganat (L1210 Iymphoid leukaemia, P388 macrophag eredetű tumor, Ehrlich carcinoma, Lewis-féle tüdőrák) felhasználásával teszteltük. Az L1210, a P388 és az Ehrlich tumor esetében paraméterként az állatok túlélése szolgált, míg a Lewis Lung Tumor esetében a daganat által létrehozott tüdő, illetve májáttétek számát, nagyságát határoztuk meg a kezelt és kezeletlen kontroll egerekben. A vizsgálatokat a következő injekciós oldat felhasználásával végeztük: 10 ml fiziológiás NaCl-oldatban oldott 50 mg vizsgált anyag, sterilre szűrve.

A vizsgált anyagokat a következőképpen jelöltük:

SZTP: a találmány szerinti eljárással előállított poliizo-L-lizinek

SZTO: a találmány szerinti eljárással előállított poliizo-L-omitin

H-17: Hull et al. eljárásával előállított poliizo-Llizin

K-17: Kushwaha et al. eljárásával előállított poliizo-L-Iizin

A-3: poli-L-lizin HBr-só (kereskedelmi forgalomban kapható a-polilizin)

A vizsgált anyagok fizikai jellemzőit az I. táblázatban foglaljuk össze.

I. táblázat

A biológiai vizsgálatokban felhasznált vegyületek jellemzői

Anyag	Átlag-	Papír-*	Optikai	Pol. fok
	móltömeg	kromato-	forgató kép. [aj d	R
	±200	gráfiás	±2
		tisztaság	(c=2;H₂O)

SZTP-14:

poli(e-L-lizin-HBr),

átcsapással tisztított! 12.700⁺	tiszta	+32,4’	QQ
SZTP-15:
poli(e-L-lizin-HBr), gélszűréssel tisztított
(H2O)	11.600	tiszta	+31,9’	90	5

-5HU 202553Β

I. táblázat folytatása

A biológiai vizsgálatokban felhasznált vegyületek jellemzői

Anyag	Átlagmóltömeg ± 200	Papír-* kromato- gráfiás tisztaság	Optikai forgató kép. [a]^2üD (c-2;H₂O)	Pol. fok R ±2
SZTP-16:
poli(e-L-lizin-HCl), dialízissel tisztított
(NaCl) SZTP-17:	13.400	tiszta	+32,2’	105
poli(e-L-lizin) szabad bázis, ioncserével tisztítva	14.500	tiszta	+33,5°	113
H-17:		sok
poli(e-L-lizin) szabad		olígomert
bázis	900-3.200	tartalmaz	+32,5’	7-23
K-17:		kevés
poli(s-L-lizin-HBr)	9.400⁺⁺	oligomert tartalmaz	+24,2°	73
A-3:
poli(a-L-lizin-HBr) Sigma Chem. Co.	40.000			148
SZTO-18: poli(8-L-omitin-HBr)	8,900			70

+polidiszperzitás 3,7 (számátlag/súlyátlag) ++ polidiszperzitás 6,4 (számátlag/súlyátlag) *W 1 papír, 23x62 cm, eluens: n-BuoH:AcOH:Pyr:H2O; 30:6:24:20 v/v előhívás: ninhidrin

Amint az adatokból látható, a találmány szerint előállított poliizolízinek egységes termékek, míg az 35 ismert eljárásokkal előállított vegyületek oligomereket is tartalmaznak. AH-17 jelű anyag móltömege tág határok közötti érték, és a K-17 jelű anyag polidiszperzitása is lényegesen nagyobb a találmány szerint előállított termékénél. Az optikai forgatóké- 40 pességi adagok azt mutatják, hogy a H-17 jelű vegyület előállításakor az aminosavak konfigurációja nem változott, míg a K-17 jelű vegyűlet előállításakor recemizáció következett be.

A daganatsejtek proliferációjára vonatkozó kísérletek összefoglalása

Megállapítottuk, hogy a találmány szerinti vegyületekkel végzett kezelés hatására in vitro a daganatsejtek száma dózisfüggően csökkent a kontroll- 50 hoz viszonyítva. Ez kisebb dózisok esetében a sejtszám stagnálásában, nagyobb dózisok esetében sejtpusztulásban is megnyilvánult. AH-17 ésK-17 jelű anyagok hatástalanok voltak, az α-polilizin (A-3) csupán a sejtszám stagnálását idézte elő. 55

Az in vivő kísérletek tanúsága szerint az SZTP kezelés azLi2ioésP388 tumor esetében a kezelt állatok élettartamának meghosszabbodását eredményezte. Az Erhlich tumor esetében a kezelés igen hosszú daganatmentes időszakot eredményezett és 60 csak a kezelés abbahagyása után volt észlelhető daganatnövekedés.

A Lewis Lung Tumor áttétképzésére az SZTP olyan módon hatott, hogy a májáttétek képződését (lépbe oltott primer daganat mellett) teljesen meg- 65 6 gátolta, a tüdőáttétek képződését (izomba oltott primer daganat) jelentős mértékben csökkentette.

Mindezek alapján a találmány szerinti poliizolízinek és poliizoornitinek daganatsejt-proliferációt gátló anyagoknak bizonyultak. Ezek között is meglepően jó hatást mutattak a poliizo-L-lizinek. Ezek tumorgátló hatása összemérhető az ismert legjobb citosztatikumokéval az állatok túlélését tekintve, külön ki kell emelnünk emellett az áttétek kialakulását váratlanul jól gátló hatásukat. E vegyületek további előnye az ismert citosztatikumokéval szemben az, hogy toxicitásuk messze elmarad a jelenleg alkalmazott citosztatikumok toxicitásától.

A biológiai vizsgálatok azt igazolták, hogy például az SZTP jelű vegyületek terápiás indexe, azaz az (LD50/minomális effektív dózis) hányados értéke 10 fölött van, míg a legtöbb citosztatikum esetén ez az érték 10 alatti.

A hím és nőstény állatok között a biológiai hatást illetően különbség nem mutatkozott, amely szintén előnyösnek mondható.

A találmány szerinti eljárással előállított poliizolizinek biológiai vizsgálatának eredményei értelmében a sejtproliferációt gátló hatás függ a peptid molekulatömegétől. Kiemelkedő hatást mutat az SZTP-14 jelű, 12700 ±200 molekulatömegű termék. Más poliizolízinek sejtproliferációt gátló hatása e pepiidénél kisebb mértékű. A korábban ismert eljárásokkal előállított anyagok ugyanakkor hatástalanoknak bizonyultak.

-6HU 202553Β

Irt vitro vizsgálatok

Az 1. a, b, c. táblázat a különböző eljárásokkal előállított poliizo-L-lizinekkel, a találmány szerinti eljárással előállított poliizo-L-omitinnel, és az apoli-L-lizinnel végzett kezelés hatását mutatja a K- 5

562 sejtekre.

A vizsgálatok paraméterei a következők voltak:

Sejtek: A K-562 sejtvonal (humán erythroleukaemia, eredete: Karolinska Institut, Stockholm) került felhasználásra. 10

Sejtszám: 5.10 /ml, 5-5 ml, üveg kémcsövekben

Mintaszám: dózisonként 3-3 kémcső

Médium: M-199 (Parker-féle médium), 1Q% borjúsavóval (Flow, Irwine, Scotland)

Hőmérséklet, atmoszféra: 8Ί ’C, 5% CO2 + 95% 15 levegő keverék

Kezelés: 24 órával a tenyészetek hígítása után

Értékelés: sejtszámolás a hígítás után 24,48,72 és 96 órával, Buerker kamrában

Kísérletek száma: 2 20

Dózis: 1-10-100 μg/ml

Az la. táblázatban jól kivehető, hogy jelentős, dózisfüggő proliferációgátlás következett be. Figyelemre méltó, hogy már 1 ^g/ml koncentrációban értékelhető proliferációgátlás volt észlelhető.

Az lb. táblázat azt mutatja, hogy a fentiekkel ellentétben a H-17 jelű anyag nem gátolta meg a K562 sejtek szaporodását.

Az le. táblázatból kitűnik, hogy az α-polilizin a kontrolihoz viszonyítva a sejtszám stagnálását eredményezte, de magasabb koncentrációban (100 μ-g/ml) sem okozott sejtszám-csökkenést.

A táblázatokban feltűntetett értékek az egyes időpontokban észlelt sejtszámot jelentik. Egy időpontban mindhárom dózis, illetve a kontroll esetében egyaránt 3-3 tenyésztő csőben számoltuk le a sejteket. A táblázatokban ezek a sejtszámok szerepelnek, a szórás értékét is feltüntettük. A sejtszám ml-re értendő.

la. táblázat

A találmány szerinti eljárással előállított SZTP és SZTO mintákkal végzett in vitro vizsgálatok K-562 sejten Kezelés: a enyészet 24. órájában, 100,10 és 1 pg/ml koncentrációban e

sejtszam x 10 /ml tápfolyadek t óra 72 óra 96 óra

SZIP-14 100 (ig/ml	0	0	0
ΙΟμ^ηαΙ	90	90	150
	110 ±20	80±5	120 ±15
	70	80	140
1 μβ/ml	80	170	180
	100 ±11	180±5	190 ±20
	100	120	150
Kontroll,	130	220	260
	120 ± 10	230 ±5	230 ±17
	110	220	230

100 p^/ml dózis teljes sejtpusztulást idézett elő, ami hatékony dózisfüggő hatást mutat.

SZTP-15 100 μg/ml	40 50 ±15 20	10 20 ±5 10	10 10±5 20
10 μ^πιΐ	80	100	160
	60 ±15	120 ±19	110 ±25
	50	100	140
1 μβ/πύ	120	150	200
	100 ±11	140 ±15	190 ±10
	120	120	210
Kontroll	140	210	270
	120 ±15	190 ± 11	250 ±15
150	190	280

-7HU 202553Β

100 pg/ml dózis teljes sejtpusztulást idézett elő, ami hatékony dózisfüggő hatást mutat.
SZTP-16
100 pg/ml	100 120 ±15 100	160 120 ±10 140	160 140 ±20 140
10 pg/ml	120 120 ±14 140	160 160 ±17 180	220 240 ±23 240
1 pg/ml	140 120 ±13 140	180 210 ±20 240	260 280 ±22 250
Kontroll	140 130 ±10 140	220 200 ±15 200	280 260 ±20 270
SZTP-17
100 pg/ml	110 120 ±10 110	180 190 ±14 200	200 210 ±20 200
10 pg/ml	120 120 ±10 120	200 200 ±17 190	260 260 ±20 280
1 pg/ml	150 130 ±12 130	260 210 ±16 210	280 280 ±18 260
Kontroll	140 150 ±15 130	250 220 ±18 220	280 280 + 20 260
SZTO-18
100 pg/ml	100 100 ± 11 90	160 130 ±15 130	180 180 ±20 160
10 pg/ml	120 120 ±10 120	180 160 ±15 190	220 230 ±20 230
1 pg/ml	140 140 ±12 130	200 210 ±17 220	280 260 ±22 280
Kontroll	140 150 ±14 140	220 230 ±18 230	280 280 ±20 270

-8HU 202553Β lb. táblázat

Η-17 és K-17 kezelés hatása a K-562 sejtek proliferációjára in vitro Kezelés: a tenyészet 24. órájában, 100,10 és 1 pg/ml koncentrációban sejtszám x 10³/ml tápfolyadék t óra 72 óra 96 óra

H-17 100 pg/ml	125 110±10 120	230 210 ±16 210	280 270 ±20 280
10 pg/ml	120	220	290
	130 ± 11	240 ±12	280 ±21
	125	210	220
1 pg/ml	130	240	290
	120 ±10	2140 ±14	290 ±22
	120	220	270
K-17
100 μ-g/ml	120	220	280
	110±5	210 ±10	290 ±19
	120	220	270
10 pg/ml	125	240	290
135 + 11	240 ±10	290 ±19
120	210	270
1 μ-g/ml	140	240	290
	120 ±11	220 ±15	280 ±20
	120	230	280
Kontroll	120	210	290
	130 ±12	200 ±15	280 ±17
	120	220	285

le. táblázat

Az A-3 anyaggal végzett kezelés hatása a K-562 sejtek proliferációjára in vitro Kezelés: a tenyészet 24. órájában 100,10 és 1 μ-g/ml koncentrációban

	48 óra	2 sejtszám x 10 /ml tápfolyadék t 72 óra	96 óra
100 \|xg/ml	110	110	100
	12” ±11	110±5	100 ±10
	120	120	110
10 μ-g/ml	130	120	120
	120 ± 10	110± 10	110 ±5
	120	120	110
1 μ-g/ml	110	110	100
	120 ±10	110±5	110±7
	120	120	110
Kontroll	120	250	300
	120 ±11	240 ±14	290 ±20
	125	240	290

-9HU 202553Β

In vivő vizsgálatok

a) L121 o tumor, SZTP-14 jelű anyag vizsgálata Tumor eredete: ChesterBeatty Institute, London Állattörzs: DBA/2 beltenyésztett egér, saját tenyészet 5

Állatok súlya, neme: 20-23 g, nőstény csoportonként 5-5

Tumorsejtszdma: 10/állat, intraperitoneálisan Kezelés: 50 mg/kg i.p„ a tumor-oltás után 24 órával kezdve 8 napon át, naponta lx. 10

Kontroll csoport: physiologiás NaCl oldat, i.p.

0,2-0,2 ml

Értékelés: az állatok elhullása

Eredmény: a 2. táblázatból kitűnik, hogy a kezelt állatok túlélték a kontroll állatokat. A tumor-oltás 15 után 10 nappal már egyetlen kontroll állat sem élt, ugyanekkor meg minden kezelt állat életben volt. Az első kezelt állat a tumor-oltás után 13 nappal, az utolsó a tumor oltás után 15 nappal hullott el.

2. táblázat mg/kg SZTP-14-gyel kezelt és kontroll L1210 tumoros DBA/2 egerek túlélése tönként 5-5 állat

Sejtszám: 2.8xl0⁶sejt/állat, intraperitoneálisan

Kezelés: 10 mg/kg i.p., naponta, a tumor beoltása után 24 órával kezdve. Kontroll: ugyanakkor phys. NaCl oldat: 0,2-0,2 ml i.p.

Étékelés: az állatok elhullásának regisztrálása

Eredmények: a 3. táblázat mutatja a túlélő állatok számát. Megállapítható, hogy valamennyi kezelt állat túlélte a kontrollokat.

3. táblázat mg/kg SZTP- 14-gyel kezelt és kontroll P-388 tumorral oltott BDF/1 egerek túlélése

Oltás	Életben	Életben
utáni	levő	levő
napok	kontroll	kezelt
9.	3	5
10.	-	5
11.	-	5
12.	-	5
13.	-	4
14.	-	3
15.	-	-

Oltás utáni napok	Életben levő kontroll	Életben levő kezelt
9.	4	5
10.	-	5
11.	-	5
12.	-	5
13.	-	5
14.	-	5
15.	-	4
16.	-	2
17.	-	1
18.	-	-

b) P-388 tumor, ascites formája, SZTP-14 jelű anyagvizsgálata 40

Állattörzs: BDF/1 hybrid, saját beltenyészt Állatok súlya, neme: 20-23 g-os hímek, csoporc) Erhlich ascites tumor, SZTP-14 jelű anyag vizsgálata

Állattörzs: Swiss non imbred, saját tenyészet

Állatok súlya, neme: 20 g-os, csoportonként 5 hím, 5 nőstény

Tumorsejt szám oltáshoz: 10 vállat, intraperitoneálisan

Kezelés: 50 mg/kg és 75 mg/kg i.p., naponta, a tumor beoltása után 24 órával kezdve, 20 napon át. A kontroll 0,2-0,2 ml. phys. NaCl-ot kapott i.p.

4. táblázat

Ehrlich ascites tumorral oltott, 50, ill. 75 mg/kg SZTP-14-gyel i.p. kezelt (20 napon át) és kontroll hím és nőstény Swiss egerek testsúly alakulása a tumor beoltását követő 16. naptól Kiindulási testsúly átlag 20 g O: elhullott tumor miatt +: elhullott egyéb okból

Tumor oltása utáni	Kontroll O	5.	1.	Kontroll O+	75 mg/kg O	5.
nap	1.	2.	3.	4+.	2.	3.	4.	5.	1.	2.	3.	4+.
16.	43	37	41	46	40	40	34	40	35	41	17	22	24	21	22
17.	44	39	42	46	41	40	35	0	35	42	17	23	24	25	22
18.	45	42	43	47	49	42	35	0	35	43	18	23	24	21	24
19.	0	43	43	50	0	0	36	0	0	44	19	23	24	21	24
20.	0	46	0	42	0	0	42	0	0	46	16	21	23	20	21
21.	0	48	0	43	0	0	47	0	0	47	18	23	25	23	22
22.	0	0	0	0	0	0	0	0	0	51	19	23	26	29	24
24.	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	19	24	26	24	25
25.											20	24	26	24	26
26.											20	24	27	24	25,5

-10HU 202553Β

4. táblázat folytatása

Tumor oltása utáni nap 1.	Kontroll O 2. 3. 4+. 5.	1.	Kontroll O+	75 mg/kg O	5.
2. 3. 4.	5. 1.	2.	3.	4+.
27.				21	25	28	25	26
28.				21	25	28	25	26
29.				21	25	28	25	26
33.				22	25	28	25	26
34.				22	25	28	25	26
42.				23	26	27	25	28
50.				24	27	27	25	28
55.				26	29	0	27	32

A 4. táblázat folytatása

Tumor oltása	75 mg/kg O	50 mg/kg O	50 mg/kg O	5.
utáni nap	1.	2.	3.	4+.	5.	1.
2.	3.	4.	5.	1.	2.	3.	4+.
16.	28	23	28	25	29	18	19	22	23	+	29	30	31	26	27
17.	28	23	28	24	28	18	19	22	23		28	30	31	26	28
18.	29	24	27	25	30	19	20	23	23	+	29	30	32	27	29
19.	29	24	28	26	30	20	20	23	23	+	29	30	32	28	29
20.	27	22	25	24	27	17	18	21	21	+	27	28	30	24	27
21.	29	23	27	27	29	18	18	22	22	+	27	30	29	25	27
22.	29	24	28	27	30	20	20	24	22	+	29	30	32	25	29
24.	29	25	29	28	31	20	20	24	23	+	29	30	32	26	30
25.	30	26	30	29	31	21	21	24	24	+	30	30	32	26	31
26.	30	25	30	29	31	22	22	24	25	+	30	31	32	26	31
27.	30,5	26	31	30	31	22	22	25	25	+	30	31	32	25	32
28.	31	26	31	30	31	22	22	25	25	+	30	31	31	25	32
29.	31	26	31	30	31	22	22	25	25	+	30	31	32	26	32
33.	30	27	32	31	32	23	22	27	26	+	28	32	30	24	33
34.	30	27	32	31	32	23	22	30	26	+	28	32	30	24	33
42.	32	29	33	34	28	24	25	30	31	+	27	33	30	26	35
50.	34	30	35	37	24	24	26	30	26		0	34	30	26	36
55.	33	32	38	0	37	26	28	32	43	+	0	36	31	27	38

Értékelés: testsúlymérésfolyamatosan.elhullás 50 követése. Az oltás után 55 nappal az életben levő kezelt állatok leölése, boncolása, az ascites mennyiség meghatározása, az esetleges solid tumor képződés regisztrálása.

Eredmények: A 4. táblázat mutatja az egerek 55 testsúlyváltozását, a tumor beoltását követő 16. naptól. Látható, hogy a kontroll egerek a 17. és 22. nap között mind elhullottak, a nagyfokú súlytöbblet a képződött nagymennyiségű tumoros ascitesből adódik. A kezelt állatok valamennyi csoportjában az állatok — csoportonként 1-1 egér kivételével még a tumor beoltása utáni 55. napon is éltek Ekkor az egereket leöltük. A hasüregben fellelhető ascites mennyiséget és a solid tumor jelenlétét mutatja az 5. táblázat. Ebből látható, hogy egyetlen állat sem volt tumormentes a leölés pillanatában, viszont a 20 kezelt egér közül 16 életben volt, az utolsó kontroll elhullása után 33 nappal.

-11HU 202553Β

5. táblázat

A kísérlet 55. napján leölt Ehrlich ascites tumoros Swiss egerek (50 illetve 75 mg/kg SZTP-14 kezelés után) ascites és solid tumora a hasüregben Kezelés

	75 mg/kg O	75 mg/kg O	50 mg/kg O	50 mg/kg O
Ascites ml	- - 0 - 4	1 6 - 0 -	- 5 2 4 0	- 1 - 4 0
Solid hasüreg! tumor	+ + 0 + +	+ + + 0 +	+ + + + 0	+ + + + 0

0: az állat korábban elhullott +: solid tumor található a hasüregben

Tumoráttételek gátlása SZTP-14 jelű anyaggal

a) Lewis Lung tumor

Állattörzs: C57BI egér. LATI, beltenyésztett Állatsúly és nem: 20-23 g-os nőstény (6 kontroll és 4 kezelt)

Tumorsejt: 5xlO⁶LLTsejtintralienalisan(lépbe oltva)

Kezelés: 75 mg/kg, 8 napon át a tumor oltása után

Értékelés: Leölés és a májáttétek számának megállapítása

Eredmények: A 6. táblázat mutatja az áttét számokat. Látható, hogy SZTP kezelés után egyetlen áttét sem képződött.

6. táblázat

Májáttét számLLT tumor lépbe oltása után 8 nappal, C57BIO egerekben SZTP-14 kezelés (8 napon át napi 75 mg/kg i.p.) és kontroll

Kontroll	31	20	Májáttétek száma 63 36 38	56
SZTP-14	0	0	(x= 40,66; s= 16,02; n= 6) 0 0	(n=4)

b) Lewis Lung tumor, intramuscularis oltás, tüdőáttét számolás

Állattörzs: C57BIQ, 5-5 állat csoportonként 40 Tumor: LLT, 5xl0⁵ sejt/állat, intramuscularisan, a jobb comb izomzatúba. Tíz nap múlva a tumoros végtag amputálása, majd a 11-17. nap között kezelés: naponta 50 mg/kg i.p. A kontroll phys, NaCl-ot kapott (0,2-0,2 ml) i.p.

Értékelés: a 18. napon leölés, áttét szám és átlagos áttét köbtartalom meghatározás, stereo microscop alatt.

Eredmények: A 7. táblázat mutatja a tüdőáttétek számát és átlagos átmérőjét. Megállapítható, hogy a kezelés mind az áttét számot, mind az átmérőt jelentősen csökkentette.

7. táblázat

LLT-vel i.m. oltott C57B1 egerek tüdőáttét száma 18 nappal a tumor beoltása, 8 nappal a primer tumor eltávolítása után

Kontroll, ill. SZTP kezelt (a 11 -17. napok között, napi 50 mg/kg, i.p.)

Kezelés	Áttétek száma átlagban	Áttét köbtartalom átlagban (mm³)
Kontroll	63,13 ± 27,53	49,45 ± 29,07
SZTP-14	26,29 ± 18,87	20,10 ± 35,38

Anbtivirális hatás bemutatása 60

Dohány mozaik vírus szintézis gátlása

Normál üvegházi körülmények között mechanikai úton inokuláltuk (fertőztük) a dohány mozaik vírus fertőzésére fogékony intakt dohányokat (Nicotiana tabacum cv. Samsun). A fertőzéshez 500 65 mesh szemcseméretű karborundumport használtunk. Az inokulum 200 p-g/ml dohány mozaik vírust (U1 törzs) tartalmazott 0,1 M-os foszfát pufferben (Sörensen foszfát puffer pH 7,2). Az inakt leveleket a fertőzés után 3 órával kezeltük permetezés jelleggű kijuttatással. A kezeléseket naponta egyszer

-12HU 202553Β megismételtük még három egymást követő napon. Az inokulációt követő két hét múlva bíráltuk a szisztematikus fertőzés tüneteinek erősségét és mintát szedtünk a fertőzött növény összes levélemeletéről, azaz a különböző magasságokban lévő, és ennek megfelelően különböző korú levelekből. A vírustartalom meghatározása 1 g fagyasztott minta alapján történt. A levélmintákat dörzsmozsárban homogenizáltuk 4 ml pH- 7,2 Sörensen foszfát pufferben, majd Eppendorf csövekben centrifugáltuk 5 percig (kb. 10.000ford/perc).Afelülúszó 15 μΐ-ét használtukfel kvantitatívvírusmeghatározásra. Avírustartalom meghatározása rockét immunoelektroforézissel történt vírus specifikus qntigén (anti -TMV Cl) segítségével (1 μΐ IgG/cm²). A futtató oldat 0,2 M Na-barbiturát-barbitursav puffer volt.

A víruskoncentrációt a standard kalibrációs görbe alapján számítottuk ki a precipitációs ívek magasságából. Az eredményeket a 8. táblázat mutatja be. Látható, hogy az SZTP-14 jelű anyag már 2 mg/1 koncentrációban hatásos.

8. táblázat

Az SZTP-14 jelű anyag vírusgátló hatása

SZTP-14 koncentráció	Vírustartalom
200 mg/1	ll,00mg/ml
20 mg/1	24,66 mg/ml
2 mg/1	29,30 mg/ml
0 (Kontroll)	51,33 mg/ml

A biológiai vizsgálatok eredményeit összefoglalva megállapíthatjuk, hogy a találmány szerinti eljárással előállított poliizo-L-lizinek igen előnyös sejtproliferációt gátló hatással rendelkeznek, és toxicitásuk messze elmarad az ismert citosztatikumokétól. A sejtproliferációt gátló hatás függ a peptid molekulatömegétől, kiemelkedő hatást mutat a 12.700 ± 200 molekulatömegű, SZTP-14 jelű termék.

Új és meglepő hatásnak tekinthető, hogy az SZTP-14 jelzésű anyag in vitro körülmények között magasabb dózisban (100 pg/ml) alkalmazva a sejtek proliferációjának teljes gátlását okozza. Ugyancsak új és meglepő adat, hogy az SZTP-14 in vivő is teljes sejtproliferáció-gátlást eredményez több modellben. Új és nem várt adat továbbá, hogy az SZTP-14 in vivő a daganat áttét képződésre is gátló hatással rendelkezik. Ilyen jellegű hatást a kémiailag bizonyos mértékben rokon klavicepaminokról nem közöltek.

A találmány szerint előállított poliizo-L-lizinek alapvetően abban különböznek a klavicepaminoktól, hogy kizárólag lizinmolekulákból állnak, amelyek ε-kötésben vannak, és a polimerek molekulatömege meghatározott, szűk tartományban van. Ezzel szemben a klavicepaminok más aminosavakat is tartalmaznak, és tág határokközötti molekulatömegű frakciókból tevődnek össze. Új felismerés, hogy a klavicepaminokban található egyéb aminosavak nem szükségesek a hatás kifejtéséhez, sőt a tiszta és z

adott molekulatömegű poliizo-L-lizinek közül az SZTP-14-nek a biológiai hatása mennyiségileg és minőségileg is meghaladja a klavicepaminok biológiai hatását.

Ami az SZTP-14 jelű anyag vírusgátló hatását illeti, az a dohány mozaikvírussal szemben tapasztalt direkt vírusgátló hatás. Ez különbözik a korábban indiai szerzők által leírt, más eljárással előállított poliizolizinek vírusellenes hatásától. Mathur és munkatársai az Indián J. Exp. Bioi. 20, 227-229 (1982) közleményük szerint ugyanis megállapították, hogy a poliizolizinek nem fejtettek ki direkt antivirális hatást, hanem interferon hatású antivirális faktort indukáltak, így fejtették ki — indirekt módon — hatásukat. A fenti biológiai vizsgálatokban észlelt direkt hatás tehát új és meglepő, és az SZTP14 növényvédőszerként való alkalmazása szempontjából döntő jelentőségű.

A találmány szerinti eljárással előállított poliizoL-ormitinnak ugyancsak nem várt, sejtproliferációgátló hatását tapasztaltuk.

A találmány szerinti izopolipeptideket mind szabad bázis, mind gyógyszerészetileg elfogadható nem toxikus sók formájában alkalmazhatjuk gyógyszerek hatóanyagaiként úgy, hogy azokat a gyógyszerészeiben elfogadott segédanyagokkal elegyítve a szokásos módon gyógyszerkészítménnyé alakítjuk. Alkalmazhatjuk továbbá a találmány szerinti vegyületeket mind szabad bázis, mind pedig sók formájában növények vírusfertőzésének megelőzésére, ületve gátlására úgy, hogy a növényvédelemben szokásos segédanyagokkal együtt ismert módon készítménnyé alakítjuk azokat.

Gyógyszerészetileg elfogadható sók lehetnek például a savaddíciós sók, úgymint hidroklorid, hidrobromid, hidrojodid, szulfát, foszfát, nitrát, oxalát, fumarát, glükonát, tartarát, maleát, acetát, citrát, benzoát, aszkorbát, laktát, alginát és hasonlók.

A találmány szerinti vegyületeket hatóanyagként tartalmazó gyógyszerkészítmények lehetnek injekciós oldatok, tabletták, drazsék, kúpok, szuszpenziók, ivóoldatok, porkeverékek stb.

kA találmány szerinti vegyületek gyógyszerként való hatékony mennyisége függ az adagolási módtól és a beteg állapotától. Általában 0,02-20 mg/testsúly kg napi dózist alkalmazunk, amelyet előnyösen osztott dózisban, napi 2-4 alkalommal viszünk be. A dózisok orális adagolás esetén magasabbak

Előnyös gyógyszerfonnák az injekciós oldatok, amelyeket intravénásán, szubkután vagy intramuszkulárisan adhatunk be. Injekciók készítéséhez izotóniás sóoldatot, kívánt esetben foszfát puffért, aszkorbinsav stabilizátort és hasonlókat használunk

A hatóanyagokat orálisan is adagolhatjuk, szilárd vagy folyadék gyógyszerkészítmény formájában. Ha folyékony formát akarunk alkalmazni, a gyógyszerészetileg elfogadható hígító részeként édesítő és/vagy ízesítő anyagot használhatunk. Előnyös szilárd alakú orális adagolási egységek például a tabletták, drazsék és kapszulák. Ezek készítéséhez a hatóanyagot a szokásos gyógyszerészeti vivőanyagokkal összekeverjük, és az elegyet tablettákká préseljük, drazsírozzuk vagy kapszulákba töltjük. Vivőanyagokként a szokásos töltő- és adalékanya13

-13HU 202553Β gokat alkalmazzuk, ilyenek például a tejcukor, magnézium-sztearát, szacharóz, talkum, sztearinsav, zselatin, agar, pektin, tragakant, kolloid kovasav, kukoricakeményítő, alginsav és hasonlók. Kúpok készítéséhez előnyösen kakaóvajat használunk.

Növények kezelését célszerűen úgy végezzük, hogy a találmány szerinti vegyületekből szokásos adalékanyagokkal, pl. szilárd vagy folyékony hordozókkal — előnyösen kaolinnal, talkummal, hígított alkohollal — és/vagy egyéb segédanyaggal, pl. nedvesítőanyaggal — előnyösen Tween 20-szal — szüárd vagy folyékony készítményeket áüítunk elő, amelyek a hatóanyagot 1-40 tömeg%-ban tartalmazzák. A készítményekből a hatóanyagra nézve 1 500 ppm, előnyösen 5-500 ppm koncentrációjú oldatot vagy szuszpenziót készítünk, és azt a szokásos módon juttatjuk ki célszerűen 0,5-50 g/ha mennyiségben.

Találmányunkat az alábbi példákkal szemléltetjük:

1. példa

Poli(e-L-lizin) hidrogén-bromidos sója

a) N“-benzüoxikarbonü-L-lizm-p-nitrofenilészter sósavas sója g N“-benziloxikarbonü-(N^e-terc-butüoxikarbonü)-L-lizin-p-nitrofenüésztert oldunk 40 ml trifluorecetsavban és mólekvivalens mennyiségű 2 N sósavas etilacetátot adunk hozzá. Egy óra áüás után az oldatot térfogatának mintegy a felére betöményítjük, és éter hozzáadásával kristályosítjuk. Termék: 8,3 g (96,06%); Op.: 83-86 ’C.

TLC: Rf- 0,68 (n-butanol-jégecet-víz 4:1:1 v/v).

b) N^a-benzüoxikarbonÍl-N®(N^,0£-benzUoxÍkarbonü-N’^e-terc- butüoxikarbonil-L-lizü)-L-lizin-pnitrofenilészter

7,69 g (20 mmól) N“-benzüoxikarbonü-(N^eterc-butil-oxikarbonil)-L-lizint absz. acetonitrüben oldunk és hidegen mólekvivalens mennyiségű trietilamint (2,8 ml), majd klórszénsav-izobutilésztert (2,8 ml) csepegtetünk hozzá. Aktiválás után hozzáadunk 9 g la. szerint készült sót és vele párhuzamosan mólekvivalens mennyiségű trietilamin (2,8 ml) acetonitriles oldatát. A terméket a reakcióelegy sósavas vízre öntésével nyerjük. Etüacetátpetroléterből kristályosítjuk. Hozam: 12,9 g (89,02%); Op.: 128-131 ’C. Analízis: ONp tartalom 99,8%.

TLC: Rf- 0,64 (EtOAc-ciklohexán 3:1)

Rf-0,91 (n-BuOH-AcOH-ví4:l:l)

HPLC tR= 8,8 perc (k’= 2,2) oszlop: ODS-Hypersil-6 (125x4 mm) eluens: MeOH-CH3CN-0,02 mól NaOAc pH4,0 40:30:30 v/v sebesség 1 ml/p. detektálás: 254 nm (UV)

c) N^a-benzÜoxikarbonü-N(N’^a-benzüoxikarbonil-L-lizü)-L-lizin-p-nitrofenilészter sósavas sója

10,5 g N^a-benzüoxikarbonU-N^e(N’^a-benzüoxikarbonil-N’^e-terc- butiloxikarbonü-L-lizil)-L-lizin-p-nitrofenüészterből la) szerint 10,25 g (98%) sót nyertünk. Op.: 109-113 °C.

TLC: Rf- 0,70 (n-BuOH-AcOH-H2O 4:1:1).

d) N^e-terc-butiloxikarbonü-trí(N^a-benzüoxikarbonil-L-lizin)-p-nitrofenUészter

5,71 g (15 mmól) N^a-benziloxikarbonil(N^e-terc14 butüoxikarbonil)-L-lizinból lb) szerint acetonitrüben mólekvivalens mennyiségű trietilaminnal, klórszénsav-izobutilészterrel vegyes anhidridet készítünk. 10,5 gN^a-benziloxikarbonU-N^E(N^,0£-benzüoxikarbonü-L-lizU)-L-lizin-p-nitrofenüészter sóját adjuk hozzá trietüamin bázis jelenlétében, lb) feldolgozás szerint 13,9 g terméket nyerünk. Acetonitrü-éterből kristályosítjuk. Op.: 145-150 ’C. Analízis: ONp tartalom 99,6%, TLC: Rf= 0,98 (n-BuOHAcOH-H2O 4:1:1); HPLC: ír- 18,2 perc, k’- 8,1 oszlop: ODS-Hypersü-6 (125x4 mm), eluens: MeOH-CH3CN-0.02 mól NaOAc puffer (pH 4) 40:30:30 v/v, 1 ml/perc; detektálás: UV254 nm.

e) Tri-(N^a-benzüoxikarbonü-L-lizin)-p-nitrofenü-észter sósavas sója

12,2 g ld) szerint készült észtert la) szerint kezelünk.

12,1 g (95,4%) sót kapunk. Op.: 108-125 ’C. TLC: Rf=0,71 (n-BuOH:AcOH:H2O 4:1:1).

f) Poli(e-N^a-benzüoxikarbonü-L-lizin) g (24 mmól) tri(N^a-benziloxikarbonil-L-lizin)-p-nitrofenilészter sósavas sóját 60 ml absz. dimetil-szulfoxidban 4,5 ml trietüamin jelenlétében kondenzáljuk teljes gélesedésig. Szódaoldatba öntéssel izoláljuk a polimert. Hozam: 16,8 g (89,6%). Analízis: ZcO2 16,8% (számított) 16,3% (talált), [ns_P]/c= 31,92 cm³/g (c= 4,95 g/1, diklórecetsav).

g) Poli(e-L-lizin) hidrogén-bromidos sója lóg védett polimert 100 ml trifluorecetsavban oldunk és 100 ml 4 n hidrogén-bromidos jégecetet adunk hozzá. A csapadékos oldat éterbe öntésével izoláljuk a végterméket. 14,7 g (91,6%). Analízis: Br 37,7% (számított) 36,8% (talált) A254 nm- 0, Papírkromatográfia: W1 23x62, eluens: n-BuOHAcOH-Pyr-H2O 30:6:24:20. Hozam: védett monomertől a polimerig 36,82%, szabad lizinből indulva 18,85%. A kapott polimerek átlagos móltömege 5.500-20.300 közötti érték.

h) Nyerstermék tisztítása

A fenti g) pont szerinti 250 mg polimer vizes oldatát Sephadex G-50 (fine) oszlopon (80x4 cm) gélkromatografáljuk. Eluensként desztillált vizet, vagy 0,9%-os NaCl oldatot vagy 0,1 n HCl-t használunk. 220 nm-nél detektáljuk az 1 ml-es frakciókat.

így állítottuk elő az SZTP-15 jelű anyagot vizes eluálással: M_w«11600 D; [a]²⁰D- 31,9° (c- 2; H2O); papírkromatográfiásan tiszta termék; Br-tartalom: 36,9 s% r értéke, vagyis a polimer tagszáma: 90 ± 2

i) Nyerstermék tisztítása

A fenti g) pont szerinti 2 g poli(e-L-lizin).HBr-t oldunk 2 ml vízben, majd 20 ml alkoholt adunk hozzá. Digeráljuk, majd 80 ml éterrel kicsapjuk. Az étert kétszer cseréljük dekantálással. Egy éjjelen át hűtve tároljuk, majd szűrjük, éterrel mossuk, szárítjuk. A terméket 1,26 g (83%). Hozam: 57,7% a kiindulási védett tripeptidre vonatkoztatva.

így áüítottuk elő az SZTP-14 jelű anyagunkat (M_w-12.700 D, [a]²⁰D- +32,4’ (c- 2; H2O) papírkromatográfiásan tiszta termék; polidiszperzitás: 3,7 (számátlag/sőlyátlag) Br-tartalom: 36,8 s% r értéke, vagyis a polimer tagszáma: 99 ± 2

A papírkromatográfiás vizsgálatok eredményei azt igazolták, hogy a példában leírtak szerint előállí-14HU 202553Β tott poliizolizin nem tartalmazott oligomereket. Ezzel szemben az ismert eljárásokkal csak olyan termékeket tudtunk előüállítani, amelyek kis tagszáma oligomereket is tartalmaztak.

2. példa

Poli(e-L-lizin) sósavas sója

Az 1. példa szerint előállított 1 g polimer 40 ml 2 mólos NaCl-ban készített oldatát 2 mólos NaCl oldattal szemben, ezt követően pedig vízzel szemben dializáltatjuk. Az anyagot liofilizálással nyerjük.

így kaptuk az SZTP-16 jelű anyagot: Mw13.400 D, [a] D- +32,2’ (c= 2,víz): papírkromatográfiásan tiszta, vagyis kistagszámú oligomerektől mentes.

Analízis: Cl’ tartalom: 22,1 s% elméleti, 22,08 s% mért r értéke, vagyis a polimer tagszáma: 105 ± 2

3. példa

Poli(e-L-lizin) (szabad bázis) ml OH’ ciklusos Dowex 1 anioncserélő gyantából kolonnát készítünk Az 1. példa szerint előállított 1 g polimer 20 ml vízben készített oldatát engedjük át rajta 1 ml/perc sebességgel. A bázisos pHjú frakciókat egyesítjük, majd liofilizáljuk így kaptuk az SZTP-17 jelű anyagot, M_w14.500 D, [a]² d- +33,5° (c- 2,víz); papírkromatográfiásan tiszta, vagyis kis tagszámú oligomerektől mentes.

Szabad bázis egyenérték:Ebázis= 127,8 r értéke, vagyis a polimer tagszáma: 113 ± 2

4. példa

Poli(e-D-lizin)

Az 1. példában leírt módon 10 g (N^a-benzil-oxikarbonil)-(N^e-terc- butil-oxi-karbonil)-D-lizin-pnitro-fenil-észterből kiindulva 1,3 g szabad polimert kapunk

M_w- 8900, [a]² D- -30,08’ (c- 0,92;víz), r értéke, vagyis a polimer tagszáma: 70 ± 2.

Az 1 -4. példákban leírtakkal azonos polimereket állítottunk elő úgy, hogy a kiindulási anyagok védőcsoportjaiként Z helyett 2-C1-Z, Boc helyett Bpoc, Aoc, Adz, Ddz, Poc, továbbá ONp helyett EPcp vagy OTcp csoportokat használtunk.

5. példa

Poli(S-L-omitin) előállítása

Az 1. példa módszere szerint 10 g N“-benziloxikarbonü-(N-tere- butiloxikarbonil)-L-omitin-pnitrofenüészterből kiindulva 7,9 g N^a-benziloxikarbonil-L-omitin-p-nítrofenilészter sósavas sót nyerünk.

Dp.: 87-90 ’C. Ezt a sót N“-benziloxikarbonil(N-tercrbutiloxikarbonil)-L-omitinnel lb) szerint Ν^α-Ζ-Ν^δ(Ν^α-Ζ-Ν -tere- butüoxikarbonil-L-ornitü)-L-omitin-p-nitrofenilészter dipeptiddé kapcsoljuk (12,1 g). Op.: 133-136 ’C. Megismételve la) eljárást a dipeptidből N^a-Z-N°(N -Z-L-omitil)L-omitin-p-nitrofenilészter sósavas sójához jutunk (11,99 g,Op.· 115-119 ’C), melyből lb) szerinti kapcsolással N-BOC-tri(N^a-Z-L-ornitin)-p-nitrofenilésztert kapunk (14,8 g).Op.: 150-153 ’C. le) szerint tri(N^a-Z-L-omitin)-p-mtrofenilészter sót ké28 szítve, p. 115-130 ’C dimetilszulfoxidban lf) szerint 22 g-ot polikondenzálva 15,4 g 6-poli-(N -benziloxikarbonil-ö-L-omitint) (87,6%) nyerünk, melyet lg) szerint kezelve 13,1 g poli-8-L-omitint ka5 púnk hidrogénbromidos só formájában (93%). Ez az

SZTO-18 jelű anyag, M_w= 8900 D r értéke, vagyis a polimer tagszáma: 70 ± 2

6. példa

Poli(Ó-D-omitin) hidrogén-bromidos sója

Mindenben az 5. példa szerint járunk el, kiindulási anyagként 1 g (N“-benziI-oxi-karbonil)-(N^öterc-butil-oxi-karbonil)-D-omitin-p-nitro-fenil-é sztert alkalmazunk. 1,2 g szabad δ-poli-D-omitint nyerünk HBr-só formájában (89%).

7. példa

Poli(y-L-a,y-diamino-vajsav)-hidrobromid Az 1. példa módszere szerint 9,8 g N“-benziloxi20 karbonil-(N*y-terc-butiloxikarbonil)- L-a,y-diaminovajsav-p-nitrofenilészterből kiindulva 6,9 g N benziloxikarbonil-L-a,y-diaminovajsav-p-nitrofenilészter sósavas sót nyerünk. Op.: 67-70 ’C. Ezt a sót N^a-benziloxikarbonil-(N^-terc-butiloxikarbo25 nü)-L-a,y-diaminovajsawal 1/b. szerint N^a-ZNT(N’^a-Z-N’”^-terc- butiloxikarbonil-a,y-diaminovajsav-p-nitrofenilészter dipeptiddé kapcsoljuk (10,8 g). Op.: 125-127 ’C. Megismételve az la. szerinti eljárást, a dipeptidből N^a-Z-N^-(N’^a-Z-L30 a,y-diaminovajsav)- L-a,y-diaminovajsav-p-nitrofenüészter sósavas sójához jutunk (10,35 g, op.: 108-112°C), melyből az lb. szerinti kapcsolással N0 -BOC-tri(N^a-Z -L-a,y-diaminovajsav)-p-nitrofenüésztert kapunk (13,7 g). Op.: 143-145’C. le) szerint tri(N^a-Z-L-a,y-diaminovajsav)-p-nitrofenilészter sót képezve (op. 105-110 ’C) dimetilszulfoxidban lf. szerint 10,5 g-ot polikondenzálva 7,8 g y-poli-N“-benziloxikarbonil-L-a,7-diaminovajsavat (86,5%) kapunk, melyet lg. szerint kezelve 6,2 g poli(-y-L-a,-y-diaminova jsav)-at kapunk hidrogénbromidos só formájában (90,5%).

8. példa

Ρο1ΐ(β- L-a,p-diamino-propionsav)-hidrobro45 mid

Az 1. példa módszere szerint 9,6 g N^a-benziloxikarbonil(NP-terc-butil-oxikarbonil)- L-a,p-diaminopropionsav-p-nitrofenilészterből kiindulva 7,1 g N -benziloxikarbonil-L-ot, β- diaminopropionsav50 p-nitrofenilészter-sósavas sót nyerünk. Op.: 6567 ’C. Ezt a sót N^a-benziloxikarbonil-(NP-terc-butiloxikarbonil)-L-a^-diaminopropipnsawal lb. szerint N^a-Z-NP-(N^,OÍ-Z-N’P-terc-butiloxikarbonil-L-a^-diaminopropionsav)-L-a^-diami55 nopropionsav-p-nitrofenilészter dipeptiddé kapcsoljuk. (11,0 g).Op.: 119-122 ’C.Megismételve la) eljárást a dipeptidből N“-Z-N^(N’^a-Z-L-a^-diaminopropionsav)-L-a^- diaminopropionsav-pnitrofenüészter sósavas sójához jutunk (10,65 g).

Őr.: 102-105 ’C melyből lb. szerinti kapcsolással NP-BOC-tri(N“-Z-L-a^-diamino-propionsav)-pnitrofenilésztert kapunk (12,6 g) Op. 138-140 ’C.

le) szerint tri-(N^a-Z-L-a,B-diaminopropionsav)-p-nitrofenilészter sót készítve, op.: 102-lóO’C, dimetilszulfoxidban l.f) szerint 12,4 g-ot polikon15

-15HU 202533Β denzálva 8,7 g β-ρο1ί-Ν^α-1)εηζϊ1οχϊ1αΐΓ6οηΐϋ-α,βdiaminopropionsavat (90,2%) nyerünk, melyet lg) szerint kezelve 5,6 g poli^-L-a,f}-diaminopropionsav)-at kapunk hidrogénbromidos só formájában (88,7%).

9. példa ± -Poliizohomolizin g ±-2,7-diamino-heptánsavból(homolizinből) a 2-helyzetben Z-vel, a 7-helyzetben Boc-cal védett, Pcp-aktivészter származékot állítunk elő ismert módon. Ebből a kiindulási anyagból az 1. példában leírt eljárás szerint 0,12 g polimert (szabad bázist) állítunk elő, amely optikai forgatóképességet nem mutat.

10. példa ±-Poli(y-2,4-diamíno-4-metil-valeriánsav) g ± -2,4-diamino-4-metil-valeriánsavból a 2helyzetben 2-ClZ-vel, a 4-helyzetben Bpoc-val védett nitrofenilészter származékot állítunk elő ismert módon. Az 1. példában leírt eljárás szerint 0,1 g polimert (szabad bázist) állítunk elő, amely optikai forgatóképességet nem mutat.

11. példa ± -Poli(<ú-7,8-diamino-oktánsav) g ±-7,8-diamino-oktánsavból ismert módon a 7-helyzetben 2-ClZ-vel, a 8-helyzetben Bpoc-val védett Tcp-aktívészter származékot állítunk elő, az 1. példában leírtak szerint 0,15 g védett polimert kapunk, amelyből 0,09 g szabad polimert nyerünk, ez optikai forgatóképességet nem mutat.

12. példa

A találmány szerinti hatóanyagot tartalmazó injekciós oldat ml fiziológiás NaCl-oldatban 500 mg poliizoL-lizin-hidrobromid sót oldva injekciós oldatot készítünk, és sterilre szűrjük. 1-10 mg/kg dózisban adagoljuk naponta a beteg állapotától függően.

13. példa

A találmány szerinti hatóanyagot tartalmazó tabletták

Tablettákat készítünk a következő anyagok felhasználásával:

g poliizo-L-lizin sósavas só g laktóz lóg szacharóz g kukoricakeményítő g magnézium-sztearát

2galginsav

Az anyagokat homogenizáljuk, és a keverékből 100 db tablettát préselünk.

14. példa

Eljárás növények vírusfertőzésének gátlására g poliizolizinből 100 1 vizes oldatot készítünk, melynek pH-ját 7,0-7,2 közötti értékre állítjuk be NaOH oldat adagolásával, és 1 ml Tween 20 nedvesítő anyagot adunk hozzá. Az oldatot 1 ha területre juttatjuk ki a növények kikelés utáni állapotában. Ezt a kezelést három hét múlva megismételjük

15. példa

Növényi vírusfertőzés elleni készítmény

A készítményhez a következő anyagokat használjuk:

g poliizo-L-lizin-hidroklorid g szacharóz g laktóz g kaolin

A fenti anyagokat homogenizáljuk, és por formában légmentesen dobozoljuk.

Egy doboz tartalma vizes oldással (100 1) és 1,5 ml Tween 20 adagolásával 1 hektár kezelésére elegendő. A permetlevet szokásos módon juttatjuk ki.

16. példa

Növényi bírusfertőzés elleni készítmény

A készítmény összetétele a következő:

g poliizo-L-lizin-hidroklorid g talkum

A fenti anyagokat homogenizáljuk, és por formában légmentesen dobozoljuk.

A doboz tartalma vizes szuszpendálással, illetve oldással (100 1) és 2 ml Tween 20 adagolásával 1 hektár kezelésére elegendő. A permetlevet szokásos módon juttatjuk ki.

17. példa

Növényi vírusfertőzés elleni készítmény

100 g poliizo-L-lizin-hidrokloridot 1000 ml 50%-os etilalkoholban oldunk, és 15 ml Tween 20at adunk hozzá. Az oldatot sötét üvegben vagy fémdobozban tároljuk.

Az üveg, illetve doboz tartalmát 100-100 ml-nyi mennyiségben 100-1001 vízben oldjuk. 1001 oldat 1 hektár kezelésére elegendő.

Eljárhatunk úgy is, hogy a 1000 ml alkoholos oldatot 10.0001 vízben oldjuk, s szükség szerint a szokásos módon 1001/ha dózisban kijuttatjuk.

A15-17. példa szerinti készítmények hatóanyagaként poliizo-L-lizint (szabad bázist) is alkalmazhatunk.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás D és/vagy L konfigurációjú, azonos vagy különböző diamino-monokarbonsavakból álló izopolipeptidek és sóik előállítására azonos vagy különböző monomerek kapcsolásával és a kapott dimerek vagy oligomerek polikondenzációjával, azzal jellemezve, hogy az ω-aminocsoportján szabad és a peptidkötésben részt nem vevő aminocsoportján ismert módon védett, karboxilcsoportján valamely ismert aktív észter csoporttal védett D vagy L konfigurációjú diamino-monokarbonsavhoz vegyes anhidrides, azidos vagy szuperaktív észteres módszerrel kapcsolunk az aminocsoport jain szelektíven eltávolítható, ismert védőcsoportokkal védett D vagy L konfigurációjú, az előbbivel azonos vagy attól különböző diamino-monokarbonsavat, az így kapott dimer ω-amino-védőcsoportját lehasítjuk, és kívánt esetben az ω-aminocsoportján szabad dimerhez vegyes anhidrides, azidos vagy szuperaktív észteres módszerrel kapcsolunk az aminocsoport ja16

-16HU 202553Β in szelektíven eltávolítható ismert védőcsoportokkal védett D vagy L konfigurációjú, az előbbiekkel azonos vagy azoktól eltérő diamino-monokarbonsavat, és kívánt esetben ω-amino-védőcsoport lehasítását és a kapcsolást továbbfolytatjuk, majd az ωaminocsoportján szabad di- dekapeptidet ismert módon polikondenzáljuk, a peptidkötésben részt nem vevő aminocsoportok védőcsoportjait lehasítjuk, és kívánt esetben az izopolipeptidet tisztítjuk és/vagy ismert módon sóvá alakítjuk, vagy a savaddíciós só formában kapott izopolipeptidet sójából felszabadítjuk, és kívánt esetben más sóvá alakítjuk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás D és/vagy L konfigurációjú, azonos vagy különböző diaminomonokarbonsavakból álló izopolipeptidek és sóik előállítására, azzal jellemezve, hogy a kiindulási vegyületek peptidkötésben részt nem vevő aminocsoportjának védelmére benzil-oxi-karbonil-csoportot vagy klór-benzil-oxi-karbonil-csoportot, karboxilcsoportjának védelmére p-nitro-fenil-oxicsoportot, triklór-fenil-oxi-csoportot vagy pentaklór-fenil-oxi-csoportot, és ω-helyzetű aminocsoportjának védelmére terc-butil-oxi-karbonil-csoportot, 2-(4-bifenilil)-izopropil-oxi-karbonil-csoportot, terc-amü-oxi-karbonil-csoportot, adamantil-oxi-karbonil-csoportot, 2-(3,5-dimetiI-oxi-fenil)-propi(2)-oxi-karbonil-csoportot vagy 2-fenilpropü(2)-oxi-karbonil-csoportot használunk.
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás D és/vagy L konfigurációjú, azonos vagy különböző diamino-monokarbonsavakból álló izopolipeptidek és sóik előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelően védett kiindulási vegyületeket vegyes anhidrides módszerrel kapcsoljuk.
4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás az (I) általános képletű izopolipeptidek és sóik előállítására, ahol r értéke 20-400 közötti átlagérték, m értéke 0, 1, 2, 3 és az egyes monomerekben azonos, és az egyes monomerek azonosak D vagy L konfigurációjúak, azzal jellemezve, hogy kiindulási diamino-monokarbonsavakként olyan (Π) és (Hl) általános képletű vegyületeket alkalmazunk, melyekben R¹ jelentése valamely, a peptidkötésben részt nem vevő aminocsoportot védő csoport, előnyösen benzü-oxi-karbonil-csoport, klór-benziloxi-karbonü-csoport, R² jelentése az ω-helyzetű aminocsoportot védő, az R¹ mellől szelektíven eltávolítható csoport, előnyösen terc-butoxi-karbonilcsoport, 2-(4-bifenilü)-izopropiloxi-karbonil-csoport, terc-amil-oxi-karbonil-csoport, adamantiloxi-karbonü-csoport, 2-(3,5-dimetil-oxi-fenil)propi(2)-oxi-karbonil-csoport, 2-fenil-propil(2)oxikarbonil -csoport, R³ jelentése a karboxilcsoportot védő ismert aktív észter csoport, m értéke a tárgyi körben megadott, majd a kapott pepiidet ismert módon, előnyösen kicsapással és mosással, gélkromatográfiával és/vagy ismételt átcsapással és/vagy dialízissel tisztítjuk.
5. A 4. igénypont szerinti eljárás az (I) általános képletű izopolipeptidek és sóik előállítására, ahol r és m értéke a 4. igénypontban megadott, és az egyes monomerek azonosan D vagy L konfigurációjúak, azzal jellemezve, hogy kiindulási diamino-mono10 karbonsavakként olyan (Π) és (ΙΠ) általános képletű vegyületeket alkalmazunk, amelyebben R* jelentése benzil-oxi-karbonil-csoport, R^z jelentése tercbutil-oxi-karbonil-csoport, R³ jelentése p-nitro-fenil-oxi-csoport, m értéke a tárgyi körben megadott, és a kapcsolást vegyes anhidrides módszerrel, előnyösen klór-szénsav-izobutil-észter alkalmazásával végezzük.
6. A 4. vagy 5. igénypont szerinti eljárásD vagy L konfigurációjú diamino-monokarbonsavból álló olyan (I) általános képletű izopolipeptidek és sóik előállítására, ahol r értéke 20-400 közötti átlagérték, ésm értéke 3, azzal jellemezve, hogy kiindulási anyagokként megfelelően védett D vagy L lizint alkalmazunk.
7. A4-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás L konfigurációjú diamino-monokarbonsavból álló olyan (I) általános képletű izopolipeptidek és sóik előállítására, ahol r értéke 60-120 közötti átlagérték és m értéke 3, azzal jellemezve, hogy kiindulási anyagokként megfelelően védett lizint alkalmazunk, és ω-aminocsoportján szabad di- dekapeptidet 350-450 mmól/dm³ koncentrációjú, előnyösen dimetil-szulfoxiddal vagy dimetil-formamiddal vagy hexametü-foszforsav-triamiddal készített oldatban szobahőmérsékleten, a di- dekapeptid 1 móljára számítva legalább 1 mólekvivalens mennyiségű tercier bázis, előnyösen trietil-amin, N-metilmorfolin vagy diizopropil-etil-amin jelenlétében 40-150 órán át polikondenzáljuk.
8. A 4. vagy 5. igénypont szerinti eljárás D vagy L konfigurációjú diamino-monokarbonsavból álló olyan (I) általános képletű izopolipeptidek és sóik előállítására, ahol r értéke 20-400 közötti átlagérték és m értéke 2, azzal jellemezve, hogy kiindulási anyagokként megfelelően védett D vagy L omitint alkalmazunk
9. A 4., 5. vagy 8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás L konfigurációjú diamino-monokarbonsavból álló olyan (I) általános képletű izopolipeptidek és sóik előállítására, ahol r értéke 60-120 közötti átlagérték és m értéke 2, azzal jellemezve, hogy kiindulási anyagokként megfelelően védett L ornitint alkalmazunk, és az ω-aminocsoportján szabad di- dekapeptidet 350-450 mmól/dm³ koncentrációjú, előnyösen dimetil-szulfoxiddal vagy dimetü-formamiddal vagy hexametil-foszforsavtriamiddal készített oldatban szobahőmérsékleten, a di- dekapeptid 1 móljára számítva legalább 1 mólekvivalens mennyiségű tercier bázis, előnyösen trietilamin, N-metü-morfolin vagy diizopropil-etilamin jelenlétében 40-150 órán át polikondenzáljuk.
10. Eljárás gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként valamely, a 4-9. igénypontok bármelyike szerint előállított (I) általános képletű, L konfigurációjú azonos diaminomonokarbonsavakból álló izopolipeptidet vagy gyógyszerészetileg elfogadható sóját, melyben m és r értéke a 4. igénypontban megadott, a gyógyszerészeiben szokásosan alkalmazott segédanyagokkal összekeverünk, és gyógyszerkészítménnyé alakítunk.
11. A10. igénypont szerinti eljárás gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy

-17HU 202553Β hatóanyagként 60-120 közötti átlagértéknek meg- , felelő tagszámú poliizo-L-lizint vagy gyógyszerészetileg elfogadható sóját alkalmazzuk.
12. A10. igénypont szerinti eljárás gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy 5 hatóanyagként 60-120 közötti átlagértéknek megfelelő tagszámú poliizo-L-omitint vagy gyógyszerészetileg elfogadható sóját alkalmazzuk.
13. Vírusgátló hatásúnövényvédőszer, azzal jellemezve, hogy 1-40 tömeg% mennyiségű, 20- 10

400 közötti átlagértéknek megfelelő tagszámú poliizo-L-lizint vagy sóját tartalmazza szilárd hordozóanyaggal, előnyösen talkummal vagy kaolinnal, folyékony hordozóanyaggal, előnyösen Tween 20 nedvesítőszerrel elkeverve.
14. A13. igénypont szerinti növényvédőszer, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként 60-120 közötti átlagértéknek megfelelő tagszámú poliizo-L-lizint vagy sóját tartalmazza.