HU201515B

HU201515B - Process for producing 2,6-difluorobenzamide by microbial hydrolysis and method of producing the microorganism culture applicable in the process

Info

Publication number: HU201515B
Application number: HU872990A
Authority: HU
Inventors: Kenneth Henry Clifford; Philip John Geary; Robert John Pryce
Original assignee: Gist Brocades Nv; Shell Int Research
Priority date: 1986-07-02
Filing date: 1987-07-01
Publication date: 1990-11-28
Also published as: EP0252564A2; CN87104545A; ATE88217T1; JPS6339592A; DE3785395D1; CN1024023C; HUT48200A; EP0252564B1; EP0252564A3; GB8616160D0

Description

A találmány tárgya eljárás 2,6-difluor-benzamid előállítására.

A 0 133 927 számú európai közrebocsátást irat ismerteti egy nitrilvegyület átalakítását a megfelelő amiddá. bizonyos, e célra alkalmas mikroorganizmusok hatására. Ezeknek a mikroorganizmusoknak a hatásossága általában fokozható fénybesugárzással. A bejelentésben ismerteti e célra alkalmas mikroorganizmusok az alábbi gramm-pozitív baktérium-nemzetséghez tartoznak:

(a) Corynebacterium;

(b) Nocardia;

(c) Bacillus:

(d) Bacteridium;

(e) Mikrococcus: és (f) Brevibacterium.

Ezt az eljárást elsőként akrilamidnak akrilnitrilből és nikotinsavnak ciano-piridinből való előállításra közölték. Konkrétan leírták továbbá az acetonitril acetamiddá. metakrilnitril metakrílamiddá, valeronitril valeramiddá, benzonitril banzamiddá, propionitril propionamiddá, n-butironitril n-butiramiddá, malonsavnitril matonamiddá, borostyánkőnitril borostyánkősavamiddá, furmársavnitril furmársavamiddá, klór-acetonitril klór-acetamiddá és β-hidroxi-propionitril β-hidroxi-propionamiddá történő átalakítását.

D. B. Harper [Biochem. J. J 65, 309 (1977)] leírja benzonitril metabolizmusát benzoesavvá a Nocardia Sp. NCIB 11216 törzs hatására, továbbá a nitriláz-enzim elkülönítését ezen mikroorganizmusból és az enzim sajátságait. A 317. oldalon található 4. táblázatban a szerző közli különbözőképpen szubsztituált benzonitrilek hidrolízisének viszonylagos sebességét az enzim hatására.

Úgy látszik, hogy e sebességet messzemenően befolyásolja a 2-es helyzetben kötődő szubsztituens sztérikus gátlása. Ennek következtében a 2-fluor-benzonitril hidrolízisének sebessége kisebb, mint a benzonitril hidrolízis-sebességének 30 százaléka; a 2-klór-benzonitril és a 2-metil-benzonitril hidrolízisének sebessége lényegében zérus; ezzel szemben a 4-fluor-, 4-klór- és 4-metil-benzonitril hidrolízisének sebessége lényegesen nagyobb, mint a benzonítrilé. Ebből ésszerűen az következik, hogy egy 2,6-díszubsztituált benzonitril - mivel sztérikusan még inkább gátolt - az enzimes hidrolízissel szemben teljes mértékben ellenálló. Valóban, Harper azt találta, hogy az enzim a 2.6-diklór-benzonitrilt (ez a dichlobenil néven ismert herbicid szer) még nagy koncentrációk esetében sem támadta meg; sőt a 3.5-dibróm-benzonitril (a bromoxynil néven ismert herbicid) is változatlan maradt az enzim nagy koncentrációinak jelenlétében is. azon tény ellenére, hogy a 3-bróm-benzonitril hidrolízisének sebessége több mint 70 %-al haladta meg a benzonitril hidrolízis-sebességét. Harper megjegyzi továbbá, hogy Verloop szerint [Residue Rév. 43. 55 (1972)] az orto-helyzetű monoszubsztitúció csökkenti aromás nitrílek alkálikus hidrolízisének sebességét és az orto-. orto-helyzetű diszubsztitúció teljesen meggátolja a folyamat lejátszódását.

Meglepő módon azt találtuk, hogy a 2.6-difluor-benzonitril mikrobális úton (mikroorganizmusok segítségével) hidrolizálható; továbbá váratlanul egy olyan új mikroorganizmust találtunk, amelynek hatására a 2,6-difluor-benzonitril magánál a benzonitrilnél is gyorsabban hidrolizál.

Mindezek alapján a találmány tárgya eljárás

2,6-diluor-benzamid előállítására, amely abban áll, hogy 0-37 °C hőmérsékleten, 6-9 pH-értéken 2,6-difluor-benzonitrilt Rhodococuss Sp. NCIB 12218 mikroorganizmus törzshöz tartozó mikroorganizmus10 sál vagy annak mutánsaival vagy variánsaival kezelünk.

A Rhodococcus nemzetségének a találmány szerinti eljárásban előnyösen alkalmazható baktériumfajtáját talajból különítettük el a Shell Haven Refinery iszap15 kezelő telepén (Stanford-le-Hope, Essex, Anglia) és letétbe helyeztük a Nationál Collection of Industrial Bacteria (NCIB)” gyűjteményében (Torrey Research Station, 135 Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, Scotland) 1986. március 13-án a Szabadalmi Eljárás Cél20 jaira Szolgáló Mikroorganizmusok Letételének Nemzetközi Elismerése Tárgyában Kötött Budapesti Megegyezés” előírásai szerint. E letétben a fenti baktériumfaj az NCIB 12218 lajstromszámot kapta: az alábbiakban e mikroorganizmust Rhodococcus Sp. NCIB

12218”-nak nevezzük.

Ez az új Rhodococcus Sp. NCIB 12218 mikroorganizmus - amint ezt az alábbiakban részletesen leírjuk - képes arra, hogy a 2,6-difluor-benzonitrilt a benzonnitrilnél nagyobb sebességgel hidrolizálja.

Ennek megfelelően a találmány szerinti eljárásban a Rhodococcus Sp. NCIB 12218 mikroorganizmust vagy annak valamilyen mutánsát vagy variánsát, célszerűen a Rhodococcus Sp. NCIB 12218 mikroorganizmust alkalmazzuk.

A találmány tárgya továbbá eljárás a Rhodococcus Sp. NCIB 12218 mikroorganizmus törzs előállítására, mely eljárás során Rhodococcus Sp. NCIB 12218 mikroorganizmust megfelelő táptalajon tenyésztünk.

A Rhodococcus Sp. NCIB 12218 mutánsai ismert eljárásokkal képezhetők, elkülöníthetők és elválaszthatók. A mutációt elérhetjük kémiai úton, például N-metil-N'-nitro-N-nitrozo-guanidinnal; vagy fizikai eszközökkel, például ibolyántúli besugárzással.

A 2,6-difuor-benzamid ismert közbenső termék ismert inszekticid vegyületek - például a diflubenzuron - előállítása során (lásd az 1 324 293 számú nagy-britanniai szabadalmi leírást). Az 1 460 419 számú nagy-britanniai szabadalmi leírás és a 0

161 019 számú európai közrebocsátási irat további eljárásokat közölnek, amelyek során a 2,6-difluorbenzamidot közbenső termékként használják inszekticid hatású vegyületek előállítására.

A találmány szerinti eljárásban alkalmazható mikroorganizmusok olyan megfelelő, ismert táptalajokon szaporíthatok, amelyek asszimilálható nitrogénforrást (például ammónium-szulfátot, ammónium-nitrátot vagy ammónium-kloridot), szerves tápanyagforrást (például élesztőkivonatot, malátakivonatot.

peptont vagy húskivonatot) és szervetlen nyom-tápanyagokat (például foszfátot, magnézium-, kálium-, kalcium-, mangán-, cink- és/vagy vassókat) tartalmaznak.

A mikroorganizmusokat általában 20-37 ”C hőmérséklettartományban, 5-9 pH-tartományban. oxi-21

HU 201515 Β gén vagy levegő jelenlétében, keverés (például rázás vagy mechanikai keverés) közben szaporítjuk. A sejteket ismert módon gyűjthetjük össze, és kívánt esetben ferde agarlemezeken, fagyasztott vagy liofilizált állapotban tarthatjuk a szabadalmi eljárásban való használat előtt.

A találmány szerinti eljárást célszerűen 0-37 ’C hőmérséklettartományban, előnyösen 20 ’C és 30 ’C közötti hőmérsékleten, 6 és 9 közötti, előnyösen 7-8 pH-értéken. előnyösen fénnyel való besugárzás 10 közben hajtjuk végre.

A Rhodococcus Sp. NCIB 12218 mikroorganizmust az NCIB az alábbiak szerint jellemezte és azonosította.

A vizsgálatokat 30 ’C hőmérsékleten, a sza- 15 porítást Oxoid CM3 márkanevű (gyártó cég: Oxoid,

US) agar-táptalajon végeztük, ha erre vonatkozóan külön megjegyzést nem teszünk.

A sejt alaktani sajátságai 20 órán át 30 °C hőmérsékleten 0,75 tömeg% agart tartalmazó Oxoid CM 1 márkanevű (gyártócég: Oxoid,

US) leveses táptalajon végzett szaporítás után 630-szoros nagyítással, fázis-kontraszt mikroszkóp alatt a sejtek párhuzamos oldalú, enyhén hajlott pálcikáknak lát- 25 szanak, a sejtek némileg halmozódnak.

A sejt gramm-pozitív; spóráit és motilitását nem figyeltük meg.

A sejtkolóniák alaktani sajátságai 30

A 3 napos szaporítás után kapott kolóniák kerek alakúak, szabályosak, ép körvonalúak, felületük lágy, opálos enyhén domború; igen halványan rózsaszínűek, átmérőjük megközelítőleg 1 mm.

Szaporítás glukózt, peptont. vizet és cukrot tartalmazó táptalajon ’C : + nyomok ’C : Kataláz : + 40

Oxidáz, Kovács : O-F glukóz : oxidatív.

O-F glukóz vizsgálatot a Hayward és Holdgkiss [J. Gén. Mikcrobiol. 26. 133 (1961)] által leírt 1 tömeg%, szűrővel sterilizált D-glukózzal kiegészített 45 oxidációs-fermentációs közeg alkalmazásával végeztük. A csőben elhelyzett mintát Rhodococcus Sp. NCIB 12218 mikroorganizmussal oltottuk, és 14 napon át inkubáltuk.

A Rhodococcus Sp. NCIB 12218 előnyösen 50 tárolható ferde agarlemezeken 4 ’C hőmérsékleten; vagy a sejtek elkülöníthetők pufferközegben, és alacsony hőmérsékleten, például -15 ’C-on tárolhatók.

Úgy találtuk, hogy a sejtek -15 ’C hőmérsékleten aktivitásuk csökkenése nélkül tárolhatók. 55

A találmány szerinti eljárást az alábbi példákban részletesen ismertetjük.

1. példa

Szaporításra alkalmas közeget készítünk az 60 alábbi komponensekből:

2.0 a KoHPO4

0.2 a MaSO4.7H₂O

2.5 ma FeSCUJfUO 65

12,5	mg	CaCb.2H2O
2,5	mg	MnSÖ4.3H2O
1,0	σ β	(NH4)2SO4
10,0	g	glükóz
5,0	g	pepton
3,0	σ Cs	élesztőkivonat
3,0	g	malátakivonat

Ezeket a komponenseket 900 ml vízben oldjuk, a pH-értéket sósav hozzáadásával 7,2-re állítjuk, és az oldatot víz hozzáadásával 1 literre töltjük.

A fenti szaporító közegből 50 ml-t 250 ml-es kúpos lombikban Rhodococcus Sp. NCIB 12218 mikroorganizmussal oltunk, és rázókészüléken 48 órán át. 30 ’C hőmérsékleten inkubáljuk.

A sejteket (15 percen át 20000 percenkénti fordulatszámmal. Sorvall” márkanevű centrifuga segítségével) centrifugálással összegyűjtjük, 50 mmólos foszfátoldattal (pH 8) mossuk, ismét centrifugáljuk, és 2,5 ml pufferoldatban ismét szuszpendáljuk.

A szuszpenzióból egy kis mintát félreteszünk a benne lévő sejtek száraztömegének a meghatározására.

A szuszpenziónak olyan mennyiségét, amely számítás alapján 0,5 mg Rhodococcus Sp. NCIB 12218 száraz sejttömeget tartalmaz, a fenti pufferoldattal 1 ml-re hígítjuk. Az így kapott szuszpenziót 25 ’C-on tartjuk, és 5 percig 60 wattos wolframlámpával 25 cm távolságról besugározzuk az 1 mg 2,6-difluor-benzonitril hozzáadása előtt. Ezután a besugárzást folytatjuk, és az elegyet a difluor-benzonitril hozzáadása után 25 ’C-on tartjuk 15 percig. Ekkor mintát veszünk, amelyben gázkromatográfiás úton meghatározzuk a 2,6-difluor-benzonitrilt és a 2.6 difi uor-benzam időt, hogy a reakció előrehaladásának mértékét megállapítsuk. A kapott termék infravörös spektruma azonos az 5. példában előállított termékével.

A fenti eljárást benzonitril, illetve 2.6-diklórbenzonitril alkalmazásával összehasonlítás céljából megismételtük. Eredményeinket az alábbi I. táblázat tartalmazza.

I. táblázat

Szubsztrátum Termék Termelőképesség

2.6- difluor-benzonitril -benzonitril

2.6- diklór-benzonitril

2.6- difluor-benzamid -benzamid

2.6- diklór-benzamid

25.5 g/g sejt/óra (0.178 mól/g sejt/óra)

15.6 g/g sejt/óra (0,146 mól/g sejt/óra) 0,053 s/g sejt/óra (3x1ο^-41 mól/g sejt/óra)

2. példa

Az 1. példában leírt, 400 ml szaporító közeget Rhodococcus Sp. NCIB 12218 mikroorganizmussal oltjuk, és 30 ’C-on 48 órán át inkubáljuk.

A keletkezett sejteket összegyűjtjük és az 1. példában leírt módon mossuk, majd (440 mg száraztömeggel) 2 liter I. példa szerinti foszfát-pufferoldatban szuszpendáljuk.

A sejtszuszpenziót mágneses keverővei végzett keverés közben, üvegedényben. 25 ’C hőmérsékleten

-3I

HU 201515 Β percig 25 cm távolságról 60 wattos wolframlámpával besugározzuk, utána 75 g 2,6-difluor-benzonitrilt adunk hozzá, és az elegyet 16 órán át besugárzás közben 25 ’C-on tartjuk. Ebben az időpontban a gázkromatográfiás elemzés szerint a nitril 98,9-os konverzióval 2,6-difluor-benzamiddá alakult; amely az oldatból a képződése során kikristályosodik. A kristályos csapadékot közvetlenül kinyerjük, és etil-acetátból átkristályosítva 50,3 g 2,6-difluor-benzamidot kapunk. A reakcióelegy további hűtésével és bepárlásával még 16 g 2.6-difluor-benzamidot izolálhatunk.

A kapott termék IR-spektruma azonos az 5. példában előállított termékével.

3. példa μΐ Rhodococcus Sp. NCIB 12218 foszfát-pufferoldatos sejtszuszpenziót állítunk elő, és a 2. példában leírt módon besugározzuk, majd 5 μΐ 2,6difluor-benzonitril 1 ml n-heptánnal készült oldatát adjuk hozzá. A besugárzást és keverést szobahőmérsékleten folytatjuk. Az oldatból kristályok válnak ki;

óra elmúltával további 10 μΐ 2,6-difluor-benzonitrilt adunk hozzá, és 18 óra elmúltával a kristályokat kiszűrjük. Az elemzés szerint a 2,6-difluor-benzonitril 25 lényegében teljes mértékben 2,6-difluor-benzamiddá alakult át. A kapott termék IR-spektruma azonos az 5. példában előállított termékével.

4. példa

Az 1. és 2. példában leírt módon foszfát-pufferoldatban Rhodococcus Sp. NCIB 12218 sejtekből szuszpenziót készítünk. 3,2 ml szuszpenziót mágneses keverővei keverve, üvegedényben, 25 ’C hőmérsékleten a 2. példában leírt módon 5 percig besugárzunk, 35 és utána 50 ml térfogatig n-heptánt adunk hozzá. A besugárzást és keverést 28 ’C-on folytatjuk, és 3,24 g 2.6-difluor-benzonitrilt adunk hozzá. Az 5 óra múlva végzett gázkromatográfiás elemzés szerint a nitril 92 %-ban amiddá alakult. A kapott termék IR-spektruma azonos az 5. példában előállított termékével.

5. példa

Az 1. és 2. példában ismertetett módon Rhodococcus Sp. NCIB 12218 foszfát-pufferoldatos (pH=8,0) sejtszuszpenziót állítunk elő. 5 ml szuszpenzióhoz 0,1 ml 2,6-difluor-benzonitrilt adunk, majd 10 a kapott elegyet 25 ’C hőmérsékleten 62 percen át inkubáljuk. Az oldatból kivált kristályokat elkülönítjük és etil-acetátban felodjuk, majd az oldatot magnézium-szulfáton vízmentesítjük. Az oldószert desztillációval eltávolítjuk. A terméket kristályos anyag for15 májában kapjuk, a kiindulási nitril vegyületre vonatkoztatva 99,5 %-os konverzióval. A termék azonosítását infravörös spektroszkópiás analízissel végezzük. A csatolt ábrákon bemutatjuk a kapott termék 1. ábra, valamint a 2,6-difluor-benzonitril (DFNB) 2. 20 ábra, a 2,6-difluor-benzoesav (DFBA) 3. ábra, és a 2,6-difluor-benzamid (DFBAM) 4. ábra hiteles mintáinak infravörös spektrumát. A spektrumok összevetése alapján megállapítható, hogy a kapott kristályos termék 2,6-difluor-benzamid.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás 2,6-difluor-benzamid előállítására, azzal jellemezve, hogy 0-37 ’C hőmérsékleten, 6-9 pH-értéken 2,6-difluor-benzonitrilt Rhodococcus Sp. 30 NCIB 12218 mikroorganizmus törzshöz tartozó mikroorganizmussal vagy annak mutánsaival vagy variánsaival kezelünk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mikroorganizmusként Rhodococcus Sp. NCIB 12218 mikroorganizmust alkalmazunk.
3. Eljárás Rhodococcus Sp. NCIB 12218 mikroorganizmus tenyészet előállítására, azzal jellemezve, hogy a tárgyi körben megadott mikroorganizmust megfelelő táptalajon tenyésztünk.