HU198952B - Process for producing a factor stimulating the release of growth hormone of mammalian pituitary gland origin (pgrf) - Google Patents
Process for producing a factor stimulating the release of growth hormone of mammalian pituitary gland origin (pgrf) Download PDFInfo
- Publication number
- HU198952B HU198952B HU832511A HU251183A HU198952B HU 198952 B HU198952 B HU 198952B HU 832511 A HU832511 A HU 832511A HU 251183 A HU251183 A HU 251183A HU 198952 B HU198952 B HU 198952B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- arg
- ala
- leu
- amino acid
- ser
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 37
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 10
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 title abstract 2
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 title description 29
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 title description 29
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 title description 28
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 title description 12
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 title description 12
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 92
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 33
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 16
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 claims description 49
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 43
- 150000001408 amides Chemical group 0.000 claims description 13
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 11
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 9
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 9
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 7
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 5
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 3
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 claims description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 20
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 abstract description 10
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 abstract description 7
- 238000007792 addition Methods 0.000 abstract description 6
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 abstract description 4
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 abstract description 4
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 abstract description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 abstract description 2
- WVRUNFYJIHNFKD-WDSKDSINSA-N Arg-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N WVRUNFYJIHNFKD-WDSKDSINSA-N 0.000 abstract 1
- SGYSTDWPNPKJPP-GUBZILKMSA-N Arg-Ala-Arg Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O SGYSTDWPNPKJPP-GUBZILKMSA-N 0.000 abstract 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 abstract 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 34
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 34
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 32
- -1 GnRap or GnRap) Chemical compound 0.000 description 27
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 21
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 20
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 17
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 16
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 13
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 12
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 12
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 12
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 12
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 11
- 102100022831 Somatoliberin Human genes 0.000 description 9
- 101710142969 Somatoliberin Proteins 0.000 description 9
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 9
- 230000002267 hypothalamic effect Effects 0.000 description 9
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 8
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 8
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 6
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 6
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 6
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical group C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N Fluorane Chemical compound F KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N anisole Chemical compound COC1=CC=CC=C1 RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 4
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 125000002221 trityl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1C([*])(C1=C(C(=C(C(=C1[H])[H])[H])[H])[H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 4
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 150000002148 esters Chemical group 0.000 description 3
- 150000002431 hydrogen Chemical group 0.000 description 3
- 239000000960 hypophysis hormone Substances 0.000 description 3
- 210000003016 hypothalamus Anatomy 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000003578 releasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- VYMPLPIFKRHAAC-UHFFFAOYSA-N 1,2-ethanedithiol Chemical compound SCCS VYMPLPIFKRHAAC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 1-Hydroxybenzotriazole Chemical compound C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1 ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000006877 Pituitary Hormones Human genes 0.000 description 2
- 108010047386 Pituitary Hormones Proteins 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 2
- 102000005157 Somatostatin Human genes 0.000 description 2
- 108010056088 Somatostatin Proteins 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- FFGPTBGBLSHEPO-UHFFFAOYSA-N carbamazepine Chemical compound C1=CC2=CC=CC=C2N(C(=O)N)C2=CC=CC=C21 FFGPTBGBLSHEPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PFKFTWBEEFSNDU-UHFFFAOYSA-N carbonyldiimidazole Chemical compound C1=CN=CN1C(=O)N1C=CN=C1 PFKFTWBEEFSNDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- XYWDPYKBIRQXQS-UHFFFAOYSA-N di-isopropyl sulphide Natural products CC(C)SC(C)C XYWDPYKBIRQXQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 2
- 230000000762 glandular Effects 0.000 description 2
- XLXSAKCOAKORKW-AQJXLSMYSA-N gonadorelin Chemical compound C([C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)NCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)C1=CC=C(O)C=C1 XLXSAKCOAKORKW-AQJXLSMYSA-N 0.000 description 2
- 125000002795 guanidino group Chemical group C(N)(=N)N* 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 229910000040 hydrogen fluoride Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000004029 hydroxymethyl group Chemical group [H]OC([H])([H])* 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 229910052751 metal Chemical class 0.000 description 2
- 239000002184 metal Chemical class 0.000 description 2
- UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N methoxybenzene Substances CCCCOC=C UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WXEHBUMAEPOYKP-UHFFFAOYSA-N methylsulfanylethane Chemical compound CCSC WXEHBUMAEPOYKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003488 releasing hormone Substances 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N somatostatin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)[C@@H](C)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N)C(O)=O)=O)[C@H](O)C)C1=CC=CC=C1 NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N 0.000 description 2
- 229960000553 somatostatin Drugs 0.000 description 2
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 125000001412 tetrahydropyranyl group Chemical group 0.000 description 2
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 1,3-diisopropylcarbodiimide Chemical compound CC(C)N=C=NC(C)C BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CFMZSMGAMPBRBE-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyisoindole-1,3-dione Chemical compound C1=CC=C2C(=O)N(O)C(=O)C2=C1 CFMZSMGAMPBRBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YOETUEMZNOLGDB-UHFFFAOYSA-N 2-methylpropyl carbonochloridate Chemical compound CC(C)COC(Cl)=O YOETUEMZNOLGDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MWOOKDULMBMMPN-UHFFFAOYSA-N 3-(2-ethyl-1,2-oxazol-2-ium-5-yl)benzenesulfonate Chemical compound O1[N+](CC)=CC=C1C1=CC=CC(S([O-])(=O)=O)=C1 MWOOKDULMBMMPN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- NNMUHYLAYUSTTN-FXQIFTODSA-N Asn-Gln-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O NNMUHYLAYUSTTN-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 241000416162 Astragalus gummifer Species 0.000 description 1
- 102400000748 Beta-endorphin Human genes 0.000 description 1
- 101800005049 Beta-endorphin Proteins 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 101000904177 Clupea pallasii Gonadoliberin-1 Proteins 0.000 description 1
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 1
- 101800000414 Corticotropin Proteins 0.000 description 1
- 206010013883 Dwarfism Diseases 0.000 description 1
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 239000000579 Gonadotropin-Releasing Hormone Substances 0.000 description 1
- 239000000095 Growth Hormone-Releasing Hormone Substances 0.000 description 1
- 206010056438 Growth hormone deficiency Diseases 0.000 description 1
- 101001075374 Homo sapiens Gamma-glutamyl hydrolase Proteins 0.000 description 1
- 101000664737 Homo sapiens Somatotropin Proteins 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N Hydrogen bromide Chemical compound Br CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000009164 Islet Cell Adenoma Diseases 0.000 description 1
- WTDRDQBEARUVNC-LURJTMIESA-N L-DOPA Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C(O)=C1 WTDRDQBEARUVNC-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- WTDRDQBEARUVNC-UHFFFAOYSA-N L-Dopa Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C(O)=C1 WTDRDQBEARUVNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SITWEMZOJNKJCH-UHFFFAOYSA-N L-alanine-L-arginine Natural products CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCNC(N)=N SITWEMZOJNKJCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MDXGYYOJGPFFJL-QMMMGPOBSA-N N(alpha)-t-butoxycarbonyl-L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)OC(C)(C)C MDXGYYOJGPFFJL-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N N-[2-(1H-indol-3-yl)ethyl]-N-methylprop-2-en-1-amine Chemical compound CN(CCC1=CNC2=C1C=CC=C2)CC=C GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GYMWSBVKAPVTPI-UHFFFAOYSA-N N1N=[C-]N=C1 Chemical class N1N=[C-]N=C1 GYMWSBVKAPVTPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N Palladium Chemical compound [Pd] KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000004451 Pituitary Gonadotropins Human genes 0.000 description 1
- 108010081865 Pituitary Gonadotropins Proteins 0.000 description 1
- 102100027467 Pro-opiomelanocortin Human genes 0.000 description 1
- 102000003946 Prolactin Human genes 0.000 description 1
- 108010057464 Prolactin Proteins 0.000 description 1
- WTKZEGDFNFYCGP-UHFFFAOYSA-N Pyrazole Chemical class C=1C=NNC=1 WTKZEGDFNFYCGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101000857870 Squalus acanthias Gonadoliberin Proteins 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010053615 Thermal burn Diseases 0.000 description 1
- 102000011923 Thyrotropin Human genes 0.000 description 1
- 108010061174 Thyrotropin Proteins 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 125000005076 adamantyloxycarbonyl group Chemical group C12(CC3CC(CC(C1)C3)C2)OC(=O)* 0.000 description 1
- 238000006136 alcoholysis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000783 alginic acid Substances 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 229960001126 alginic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000004781 alginic acids Chemical class 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 125000005907 alkyl ester group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 229940072107 ascorbate Drugs 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 1
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003236 benzoyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 125000001584 benzyloxycarbonyl group Chemical group C(=O)(OCC1=CC=CC=C1)* 0.000 description 1
- WOPZMFQRCBYPJU-NTXHZHDSSA-N beta-endorphin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 WOPZMFQRCBYPJU-NTXHZHDSSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 230000005587 bubbling Effects 0.000 description 1
- 150000003857 carboxamides Chemical group 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 238000010531 catalytic reduction reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 125000002668 chloroacetyl group Chemical group ClCC(=O)* 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 1
- IDLFZVILOHSSID-OVLDLUHVSA-N corticotropin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO)C1=CC=C(O)C=C1 IDLFZVILOHSSID-OVLDLUHVSA-N 0.000 description 1
- 229960000258 corticotropin Drugs 0.000 description 1
- 150000001912 cyanamides Chemical class 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N dihydroxy(oxo)silane Chemical compound O[Si](O)=O IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 125000003754 ethoxycarbonyl group Chemical group C(=O)(OCC)* 0.000 description 1
- RIFGWPKJUGCATF-UHFFFAOYSA-N ethyl chloroformate Chemical compound CCOC(Cl)=O RIFGWPKJUGCATF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- WMYNMYVRWWCRPS-UHFFFAOYSA-N ethynoxyethane Chemical group CCOC#C WMYNMYVRWWCRPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002534 ethynyl group Chemical class [H]C#C* 0.000 description 1
- 239000003269 fluorescent indicator Substances 0.000 description 1
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 125000002485 formyl group Chemical group [H]C(*)=O 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000001307 helium Substances 0.000 description 1
- 229910052734 helium Inorganic materials 0.000 description 1
- SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N helium atom Chemical compound [He] SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000777 hematopoietic system Anatomy 0.000 description 1
- 229940042795 hydrazides for tuberculosis treatment Drugs 0.000 description 1
- CTAPFRYPJLPFDF-UHFFFAOYSA-O hydron;1,2-oxazole Chemical class C=1C=[NH+]OC=1 CTAPFRYPJLPFDF-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000007928 imidazolide derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000011261 inert gas Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 125000005928 isopropyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(OC(*)=O)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229940072783 liquimat Drugs 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 230000001592 luteinising effect Effects 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N maleic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 230000002182 neurohumoral effect Effects 0.000 description 1
- 210000004522 neurosecretory neuron Anatomy 0.000 description 1
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 description 1
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000004810 partition chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000002304 perfume Substances 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N phenol group Chemical group C1(=CC=CC=C1)O ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N phenylmethyl ester of formic acid Natural products O=COCC1=CC=CC=C1 UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003170 phenylsulfonyl group Chemical group C1(=CC=CC=C1)S(=O)(=O)* 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 125000001557 phthalyl group Chemical group C(=O)(O)C1=C(C(=O)*)C=CC=C1 0.000 description 1
- 229920005990 polystyrene resin Polymers 0.000 description 1
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 229940097325 prolactin Drugs 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000000932 sedative agent Substances 0.000 description 1
- 230000001624 sedative effect Effects 0.000 description 1
- UQDJGEHQDNVPGU-UHFFFAOYSA-N serine phosphoethanolamine Chemical compound [NH3+]CCOP([O-])(=O)OCC([NH3+])C([O-])=O UQDJGEHQDNVPGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000011877 solvent mixture Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 125000005931 tert-butyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(OC(*)=O)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229960000874 thyrotropin Drugs 0.000 description 1
- 230000001748 thyrotropin Effects 0.000 description 1
- 125000005147 toluenesulfonyl group Chemical group C=1(C(=CC=CC1)S(=O)(=O)*)C 0.000 description 1
- 238000006257 total synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004044 trifluoroacetyl group Chemical group FC(C(=O)*)(F)F 0.000 description 1
- PQDJYEQOELDLCP-UHFFFAOYSA-N trimethylsilane Chemical compound C[SiH](C)C PQDJYEQOELDLCP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/60—Growth hormone-releasing factor [GH-RF], i.e. somatoliberin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
- A23K20/10—Organic substances
- A23K20/142—Amino acids; Derivatives thereof
- A23K20/147—Polymeric derivatives, e.g. peptides or proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S930/00—Peptide or protein sequence
- Y10S930/01—Peptide or protein sequence
- Y10S930/12—Growth hormone, growth factor other than t-cell or b-cell growth factor, and growth hormone releasing factor; related peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
A találmány tárgya olyan új peptid előállítási eljárása, amely befolyást gyakorol az agyalapi mirigy funkciójára emberben és más emlősökben. A pepiid elősegíti az agyalapi mirigyből a növekedési hormon kibocsátását.
Az 1950-es évek eleje óta a fiziológusok és klinikai szakemberek felismerték, hogy az agy hipotalamusa szabályozza az agyalapi mirigy öszszes kiválasztási funkcióját. Ez a szabályozás neurohumorális, a hipolalamusban fajlagos neuroszekréciós neurnnokkal, amelyek fajlagos polipeptideket termelnek, ezek szerepe az, hogy beindítsák alkalomszerűen vagy állandó jelleggel az egyes agyalapi mirigy hormonok kiválasztását. Ezideig a következő, hipotalamus által kiválasztott, kibocsátást elősegítő faktorokat azonosították: tirotropin és prolaktin (TRF tripeptid) agyalapi mirigy hormonok, luteinizáló hormon és a tüsző-stimuláló hormon, agyalapi mirigy gonadotropinok (LRF, LH —RH, GnRH vagy Gn-RF dekapeptidek), béta-endorfin és adrenokortikotropin agyalapi mirigy hormonok (41 aminosavat tartalmazó CRF polipeplid) kibocsátását elősegítő faktorok. Ezeken felül egy gátló faktort is jellemezlek: a hipotalamus-eredetű szomatostatin gátolja az agyalapi mirigyben a növekedési hormon kibocsátását. Minden egyes hipotalamus eredetű kibocsátó faktort, valamint a szomatostalint totálszintézissel reprodukálták, és a natív szerkezet több analógját is szintetizálták, amelyek közül néhánynak nagyobb az aktivitása, mint a természetes vegyületnek.
Ez ideig az agyalapi mirigyből a növekedési hormon kiválasztását elősegítő hipotalamus-eredetű, kibocsátást elősegítő faktor, vagy más néven szomatotropin és nincs azonosítva, bár jelentős fiziológiai és klinikai bizonyítékok vannak létezésére. A fő problémák egyike a hipotalamus eredetű, növekedési hormon kibocsátását elősegítő faktor (a továbbiakban GRF) jellemzésében és izolálásában az, hogy az aktív peptid a hipotalamus minden fragmensében végtelen kis mennyiségben látszik jelen lenni, úgy tűnik, hogy mindössze 5 és 150 femtomól közti mennyiségben. Ez sokkal kevesebb, mint amelyet a többi hipotalamus eredetű kibocsátást elősegítő faktor bármelyikéhez eddig kalkuláltak. Ebből az állításból egyenesen következik, hogy a hipotalamus eredetű GRF különlegesen nagy potenciálú.
A hipotalamus eredetű GRF izolálásának egy másik fő problémája a szomatostatin igen nagy mennyiségének jelenléte a hipotalamus kivonatában, amely természetesen gátolja a kísérleti biológiai méréseket vagy hibás eredményeket ad ezekben. Az elmúlt néhány évben több laboratórium is úgy nyilatkozott, hogy izolálták és azonosították a hipotalamus eredetű GRF-et; mindezek a nyilatkozatok azonban meseterséges termékekre vonatkoztak, amint ezt később a szerzők elismerték (Schally, A. V. S. és munkatársai: J. Bioi Chem. 246, 6647, 1971; Veber, D. F. és munkatársai: Biochem. Biophys. Rés. Commun. 45, 235, 1971). Az ilyen inkorrekt nyilatkozatokát részben meg lehet magyarázni a biológiai mérések nehézségeivel a növekedési hormon kibocsátásának becslésében.
Mi egy 44 aminosav-maradékból álló polipeptidet izoláltunk humán hasnyálmirigy Langerhans-sziget sejt tumorból, tisztítottuk, jellemeztük, szintetizáltuk és megvizsgáltuk. Ez a polipeptid elősegíti az agyalapi mirigyből a növekedési hormon (GH) kibocsátását. Ennek a pepiidnek a szekvenciája a következő:
H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg- Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-GIn-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-AIa-Arg-Leu-NH2·
Ezt tekintjük humán hasnyálmirigy-eredetű GRF-nek, és a továbbiakban PGRF-nek nevezzük, de szomatokrininnek is nevezhetjük. Két másik, jól tisztított pepiidet is izoláltunk ezzel együtt, amelyek szintén mutatnak GH kibocsátást elősegítő aktivitást; ezek PGRF (1-37) szabad savnak és PGRF (1-40) szabad savnak bizonyultak. Ezeket a peptideket lehet alkalmazni a melegvérű és hidegvérű állatok növekedésének elősegítésére az állattenyésztésben.
A találmány tárgyát nem képezik eljárások gyógyászati készítmények előállítására, amelyek PGRF-et, vagy annak analógját vagy biológiailag aktív fragmensét tartalmazzák, vagy a fentiek bármilyen nem toxikus sóját, gyógyszerészetileg elfogadható folyadékban vagy szilárd hordozóban diszpergálva. Az ilyen gyógyászati kompozíciókat mind a humán, mind az állatgyógyászatban lehet alkalmazni klinikai gyógyításban alkalmi vagy rendszeres adagolásban, diagnosztikai vagy terápiás célokra.
A következőkben a találmány szerinti eljárást részletesebben leírjuk. A peptidek meghatározásánál Schröder és Lubke nomenklatúráját alkalmaztuk [The Peptides, Academic Press (1965)], ahol a hagyományos megjelenítéssel összhangban az amino-csoport az N-terminálisnál a baloldalon van feltűntetve és a karboxilcsoport a C-terminálisnál a jobb oldalon. Ahol az aminosav gyöknek izomer formái vannak, a képletben mindig az aminosav L-formája értendő, hacsak határozottan másképpen nem jelöljük.
A találmány tárgya tehát eljárás:
H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gly-Gln-R34-Asn-Gln-Glu-Rjg-Gly-IUio-Arg-Ala-Arg-Leu (I) általános képletű peptidek ahol
R34 jelentése Ser vagy Alá,
R38 jelentése Arg vagy Ser, R40 jelentése Alá vagy Arg, valamint a fenti peptidek 1 — 28. aminosavszekvenciájától az 1 — 43. aminosav-szekvenciáig terjedő fragmenseinek és e vegyületek C-terminális amidjainak előállítására.
A peptideket a peptidkémiában szokásos módszerekkel lehet szintetizálni, így pl. kizárólagosan szilárd fázisú technikákkal, részlegesen
HU 198952 Β szilárd fázisú technikákkal, fragmens-kondenzációval, klasszikus, oldatban történő kapcsolásokkal. (gy pl. kizárólagosan szilárd fázisú technikák kivitelezhetők a Solid-Phase Peptide Syntbesis (szilárd fázisú peptid szintézis) című szakkönyv alapján (Stewart és Young szerkesztése, Freeman és Co. kiadás, San Francisco, 1969), és ilyen eljárást ismertet a 4.105.603. sz. amerikai egyesült államok-beli szabadalmi leírás leíró része is (Vale és munkatársai, 1978. aug.8.). A szintézis fragmens-kondenzációs módszere a 3.972.859. sz. amerikai egyesült államok-beli szabadalmi leírásban van részletesen ismertetve (1976. aug. 3.). Egyéb szintéziseket ismertet például a 3.842.067. (1974.okt.15.) és 3.862.925. (1975. jan. 28.) számú amerikai egyesült államok-beli szabadalmi leírás. Rekombináns DNS technikákat használó szintetikus peptid-termelések is valószínűleg kielégítik majd a nagy menynyiségű kereskedelmi igényeket (ez azonban nem képezi a találmány tárgyát).
A kapcsolásos típusú szintézisekben közös vonás a különböző aminosav-részek labilis oldallánc-csoportjainak védelme megfelelő védőcsoportokkal, amelyek megakadályozzák az adott helyen kémiai reakció megtörténtét, amíg a védőcsoportot végleg el nem távolítják. Általában szintén közös vonás egy alfa-amino csoport védelme egy aminosavon vagy egy fragmensen, amíg a többi rész a karboxil-csoportnál reagí' majd az alfa-amino csoportot védő csoport szelektív eltávolítása, hogy utat engedjenek a további reakciónak, amelynek ezen a helyen kell végbemennie. Következésképpen közös vonás, hogy a szintézis egy lépésében egy köztes vegyület képződik, amely a megfelelő csoportokhoz kötődő, oldalláncot védő csoportokkal együtt tartalmazza az egyes aminosav-gyököket a kívánt szekvenciának megfelelő helyzetben a peptid láncban.
A jelen találmány szerinti eljárásban először a következő terméket állítjuk elő, a peptidkémiában szokásos eljárással:
X1-Tyr(X2)-Ala-Asp(X3)-Ala-Ile-Phe-Thr == = (X4)-Asn-Ser(X5)-Tyr(X2)-Arg(X6)-Lys (X7)-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser(X5)-Ala-Arg (X6)-Lys(X7)-Leu-Leu-Gln-Asp(X3)-R34(X?)-Asn-Gln-Glu(X3)-R«(X5 vagy X6)-Gly-R40 (X6)-Arg(X6)-Leu-X j ahol X jelentése hidrogénatom, vagy a-amino-csoportot védő csoport. Az X’-el jelzett a-amino-csoportot védő csoportok jól ismertek a polipeptidek lépésenként! szintézisének gyakorlatából. Az X’-el jelzett, α-araino-csoportot védő csoportok a következő osztályokba sorolhatók: (1) acil-lípusú védőcsoportok, mint pl. formil-, trifluor-acetil-, ftalil-, toluolszulfonil- (Tos), benzolszulfonil-, nitrofenil-szulfenil-, tritil-szulfenil-, o-nitro-fenoxi-acetil-, klór-acetil- és 7-klór-butiril-csoport; (2) aromás uretán-típusú védőcsoporlok, mint pl. benzil-oxi-karbonil-(Z) és helyettesített (Z), úgy mint p-klór-benzil-oxi-karbonil-, ρ-bróm-benzil-oxi-karbonil-, p-metoxi-benzil-oxi-karbonil-csoport; (3) alifás uretán-típusú védőcsoportok, mint pl. t-butil-oxi-karbonil-(BOC), diizopropil-metil-oxi-karbonil-, izopropil-oxi-karbonil-, etoxi-karbonil-, allil-oxi-karbonil-; (4) cikloalkil-uretán típusú védőcsoportok, mint pl. ciklopentil-oxi-karbonil-, adamantil-oxi-karbonil- és ciklohexil-oxi-karbonil-csoport; (5) tiouretán-típusú védőcsoportok, mint pl. fenil-tiokarbonil-csoport; (6) alkiltípusú védőcsoportok, mint pl. trifenil-metil(tritil)-, benzilcsoport; (7) trialkil-szilán csoportok, mint pl. trimetil-sziláncsoport. A legelőnyösebb űr-amino-csoportot védő csoport a BOC.
X2 jelentése a Tyr fenolos hidroxilcsoportját védő csoport, amely tetrahidropiranil-, tercier-butil-, tritil-, benzil-, CBZ, 4Br-CBZ és 2,6-diklór-benzil-csoportok valamelyike lehet. A legelőnyösebb védőcsoport a 2,6-diklór-benzil-csoport. X2 lehet hidrogénatom is, amely azt jelenti, hogy nincs védőcsoport a hidroxilcsoporton.
X3 jelentése hidrogén vagy egy észtert képző védőcsoport az Asp vagy Glu karboxil-csoportján, amelyet benzil-, 2,6-dikIór-benzil·, metil- és etil-csoportok közül lehet kiválasztani.
X4 és X5 a Thr és Ser hidroxilcsoportjainak védőcsoportjai, amelyeket az acetil-, benzoil-, terc-butil-, tritil-, tetrahidropiranil-, benzil-, 2,6-diklór-benzil- és CBZ csoportok közül lehet kiválasztani. A legelőnyösebb védőcsoport a benzil. X4 és/vagy X5 lehet hidrogénatom is, amely azt jelenti, hogy nincs védőcsoport a hidroxilcsoporton.
X6 jelentése vagy védőcsoport az Arg guanidinocsoportjához, amelyet a nitro-, Tos, CBZ, adamanlil-oxi-karbonil- és BOC csoportok közül lehet kiválasztani; vagy hidrogénatom.
X7 jelentése hidrogénatom vagy védőcsoport a Lys oldalláncának amino-szubsztituenséhez. Ilyen védőcsoportok lehetnek többek között — csak illusztráció céljából felsorolva — a 2-klór-benzil-oxi-karbonil-(2-Cl-Z), Tos, CBZ, t-pentil-oxi-karbonil- és BOC csoport.
Az oldallánc amino-csoportját védő csoport kiválasztása nem kritikus, kivéve azt a követelményt, hogy olyannak kell lennie, amely az a-amino-csoportokról történő védőcsoport eltávolításánál nem szakad le a szintézis során. Vagyis az «-amino-csoportot védő csoport és az oldallánc aminocsoportját védő csoport nem lehet azonos.
X8 jelentése az -OH, -OCH3, észterek, amidok, hidrazidok, -O-CH2 tartalmú gyanták és NH-tartalmú gyanták (OH-csoporttól és amid-csoporttól eltérő csoportokkal) közül egy csoport, amelyek védőcsoportnak tekinthetők.
A köztes termék általános képletében az X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7 és X8 legalább egyikének védőcsoportnak kell lennie.
A peptidek szintézisénél felhasználandó, megfelelő oldalláncot védő csoport kiválasztásánál a következő szabályokat kell követni: (1) a védőcsoport legyen stabil az α-amino csoportot védő csoport eltávolításához kiválasztott reagensek és reakciókörülmények alkalmazása közben a szintézis minden lépésénél; (2) a védőcsoport őrizze meg védő tulajdonságait és ne hasadjon le a kapcsolás körülményei között, és (3) az oldal-31 láncot védő csoport legyen eltávolítható a szintézis teljessé tétele után (vagyis amikor a kívánt aminosav-szekvencia kialakult) olyan körülmények között, amelyek nem változtatják meg a peptid-láncot.
A peptideket előnyösen szilárd fázisú szintézissel készítjük, ahogyan ezt Merrifield leírta [J. Am, Chem, Soc., 85, 2149 (1963)]. A szilárd fázisú szintézis a pepiid C-terminális végéről kezdődik egy védett q-aminosav kapcsolásával a megfelelő gyantához. Ilyen kiindulási anyagot lehet készíteni az aminocsoporton védett Leu vagy Alá kapcsolásával egy észter-kötés útján egy klórmetilezett gyantához vagy egy hidroxi-metil gyantához, vagy egy amid-kötés útján BHA vagy MBHA gyantához. A hidroxi-metil gyanta készítését Bodansky és munkatársai írták le [Chem. Ind (london) 38, 1597-98 (1966)]. A klór-metilezett kereskedelmi forgalomban hozzáférhetők, a Bio-Rad Laboratories, Riehmond, California vagy a Láb. Systems, Inc. cégek termékei. Az ilyen gyanták készítését Stewart és munkatársai írták le [Solid Phase Peptide Synthesis (Szilárd fázisú peptid szintézis), Freeman and Co. kiadása, San Francisco, 1969, 1. fejezet, 1 — 6. oldal]. A BHA és MBHA hordozó gyanták kereskedelmi forgalomban kaphatók, és általában akkor használatosak, amikor a szintetizálandó polipeptid-karboxamid csoporttal rendelkezik a C-terminálison.
A BOC-al védett Alá a klór-metilezett gyantához Monahan és Gilon módszere szerint kapcsolható (Biopolymer, 12, 2513—19, 1973), amikor pl. 40 aminosavból álló pepiidet kell előállítani. A BOC-Ala gyantákhoz történő kapcsolását követően az λ-aminocsoportot védő csoportot eltávolítjuk metilén-kloridos közegben trifluor-ecetsawal (TFA), vagy csak TFA-val, vagy dioxános közegben sósavval. A védőcsoport eltávolítását 0 °C és szobahőmérséklet között kell végrehajtani, Egyéb szokásos hasító reagensek és körülmények is használhatók az egyes a-aminocsoportokat védő csoportok eltávolítására, amint ezeket Schröder és Lubke leírták [The Peptides, 1, 72 — 75 (Academic Press 1965)].
Az Alá Q-aminocsoportját védő csoport eltávolítása után a többi u-aminocsoportban és oldalláncban védett csoporttal rendelkező aminosavat lépésenként kapcsoljuk össze a kívánt sorrendben; az egyes aminosavak egyenkénti adagolásának alternatívájaként alkalmazhatunk olyan módszert is, amelyben néhány aminosavat egymáshoz kapcsolunk még a szilárd fázisú reaktorba történő adagolás előtt. A megfelelő kapcsolódó reagens kiválasztása a szakterületben jártassághoz tartozik. Különösen alkalmas kapcsolódó reagens az N, N’-diciklohexil-karbodiimid (DCC).
A peptidek szilárd fázisú szintézisében alkalmazott aktiváló reagensek jól ismertek a peptidkészítés gyakorlatában. A megfelelő aktiváló reagensekre a következő példák adhatók: (1) karboxiimidek, mint pl. N,N’-diizopropil-karbodiimid, N-etil-N’-(3-dimetil-amino-propil)-karbodiimid; (2) ciánamidok, mint pl. N,N’-dibenzil-ciánamid; (3) ketiminek; (4) izoxazólium sók, mint pl. N-etií-5-fenil-izoxazólium-3’-szulfonát;
(5) aromás jellegű monociklusos, nitrogén-tartalmú heterociklusos amidok, 1—4 nitrogénnel a gyűrűben, mint pl. imidazolidok, pirazolidok és 1,2,4-triazolidok. Jellegzetes heterociklusos amidok, amelyek itt használatosak, az N,N’-karbonil-diimidazol és az N,N’-karbonil-di-l,2,4-triazol;
(6) alkoxilezett acetilének, mint pl. etoxi-acetilén; (7) olyan reagensek, amelyek vegyes anhidridet képeznek az aminosav karboxilcsoportjával, mint pl. etil-kloroformát és izobutil-kloroformát; és (8) olyan reagensek, amelyek aktív észtert képeznek az aminosav karboxilcsoportjával, ilyenek pl. az olyan nitrogén-tartalmú heterociklusos vegyületek, amelyek egy gyűrű-nitrogénen hidroxilcsoporttal rendelkeznek, mint az N-hidroxi-ftalimid, N-hidroxi-szukcinimid és 1-hidroxi-benzotriazol (HOBT). Más aktiváló reagenseket és alkalmazásukat a kapcsolási reakciókban is leírták Schröder és Lubke a korábban idézet mű III. fejezetében, valamint Kapoor a J. Pharm. Sci. 59, 1 — 27 (1970) irodalmi helyen.
Minden védett aminosavat vagy aminosavszekvenciát kétszeres vagy nagyobb fölöslegben adagolunk a szilárd fázisú reaktorba, és a kapcsolást dimetil-formamid (DMF):CH2C12 (1:1) közegben hajthatjuk végre, vagy csak DMF-ben, ill. csak CH2Cl2-ben. Abban az esetben, ha a kapcsolás nem megy végbe tökéletesen, a kapcsolási eljárást még egyszer el kell végezni az aaminocsoportot védő csoport eltávolítása előtt, amely megelőzi a következő aminosav kapcsolását. A kapcsolási reakció sikerét a szintézis minden stádiumában ninhidrin reakcióval kell ellenőrizni, ahogyan ezt E. Kaiser és munkatársai [Anal. Biochem, 34, 595 (1970)].
Miután a kívánt aminosav-szekvencia teljessé vált, a köztes peptidet el kell távolítani a gyantáról, pl. folyékony hidrogén-fluoriddal, amely nem csupán lehasítja a peptidet a gyantáról, hanem lehasítja az összes megmaradt, oldalláncot védő X2, X3, X4, X5, X6, X7 és X8 csoportot és az α-aminocsoportot védő X1 csoportot, így a peptidhez jutunk.
Alternatív módszerként a védőcsoportokat tartalmazó terméket is el lehet különíteni a gyantáról alkoholízissel, majd a C-terminálison nyert alkil-épsztert hidrolízissel savvá lehet átalakítani. Bármelyik oldalláncot védő csoportot le lehet ez után hasítani a korábban leírt módszerek szerint vagy bármely más ismert módszerrel, pl. katalitikus redukcióval (pl. Pd báriumszulfáton). Amikor a hasításhoz hidrogén-fluoridot használunk, anizolt és metil-etil-szulfidot is adunk a reakcióedénybe öblítés céljából.
A következő példákban bemutatjuk a PGRF szintézisét szilárd fázisú technikával. A rövidebb peptid fragmensek szintézisét azonos módszerrel hajtjuk végre, csupán elhagyjuk a kívánt mennyiségű aminosavat a lánc valamelyik végénél, azt azonban tudni kell, hogy a biológiailag
HU 198952 Β aktív fragmenseknek tartalmazniok kell az aktivitáshoz szükséges szekvenciát az N-terminálisnál.
1. példa
A PGRF (1 — 44) szabad sav — amelynek képlete H-Tyr-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Gln-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-OH-szintézisét lépésenként hajtjuk végre, Beckman 990 Peptide Synthesiser-t használva klórmetilezett gyantán, amely a Láb Systems, Inc. terméke, és amely 0,9 mólekvivalens Cl-t tartalmaz grammonként. A BOC-Leu kapcsolódását a gyantához Monahan és munkatársainak általános módszereivel hajtjuk végre (Biopolymers, 12. kötet (1973) 2513-2519), ez a módszer mintegy 0,22 mmól Leu helyettesítést jelent 1 g gyantán. Minden felhasznált oldószert gondosan gázmentesítünk valamely inért gáz, előnyösen hélium átbuborékoltatásával, az oxigén eltávolítása érdekében, amely a kén nemkívánatos oxidációját okozhatja a Met gyökön.
A peptidláncot a védőcsoport eltávolítása és semlegesítés után lépésről-lépésre építjük fel a gyantán. A védőcsoportok eltávolítását a semlegesítést és az egyes aminosavak beadagolását általában a Guillemin és munkatársai által részletesen leírt eljárással végezzük (3.904.594. sz. amerikai egyesült államok-beli szabadalmi leírás). A kapcsolásokat részletesebben ismertetve a következő munkaterv szerint vébezzük el.
MUNKATERV
| Lépés Reagensek és műveletek száma | keverési idő, perc |
| 1. Mosás CH2Cl2-vel (kétszer) | 0,5 |
| 2. 50% trifluor-ecetsav(TFA) + + 5% 1,2-etán-ditiol CH2Cl2-ben egyszer) | 0,5 |
| 3. 50% trifluor-ecetsav (TFA) + 5% 1,2-etán-ditiol CH2Cl2-ben (egyszer) | 20,0 |
| 4. Mosás CH2Cl2-vel (háromszor) | 0,5 |
| 5. Mosás CH3OH-val (kétszer) | 0,5 |
| 6. Semlegesítés 10% trietil-aminnal (Et3N) CH2Cl2-ben (kétszer) | 0,5 |
| 7. Mosás CH3OH-val (kétszer) | 0,5 |
| 8. Semlegesítés 10% trietil-aminnal (Et3N) CH2Cl2-ben (kétszer) | 0,5 |
| 9. Mosás CHjOH-val (két- | |
| szer) | 0,5 |
| 10. Mosás CH2Cl-vel (kétszer) | 0,5 |
11. *BOC-aminosav (1 mmól/g gyanta) + ekvivalens menynyiségű diciklohexil-karbodiimid (DCC) CH2C12-
| ben 12. Mosás CH2Cl2-vel | 120,0 |
| (egyszer) 13. Mosás 50% dimetil-formamiddal CH2Cl2-ben (egy- | 0,5 |
| szer) 14. Mosás 10% trietil-aminnal CH2Cl2-ben | 0,5 |
| (egyszer) 15. Mosás CH3OH-val (két- | 0,5 |
| szer) 16. Mosás CH2C.l2-vel | 0,5 |
| (kétszer) 17. 25% ecetsavanhidrid CH2Cl2-ben (2ml/g | 0,5 |
| gyanta) 18. Mosás CH2Cl2-vel | 20,0 |
| (kétszer) 19. Mosás CH3OH-val | 0,5 |
| (kétszer) | 0,5 |
*Az Asn és Gin kapcsolásához 1-hidroxi-benzotriazolt (HODT) vezetünk be ebbe a lépésbe, 1,136-szoros moláris feleslegben
Röviden a kapcsolási reakcióhoz egy mmól BOC-al védett aminosavat használunk metilénkloridban lí g gyantához, és még egy mól ekvivalens 0,5 mólos Dl-ből metilén-kloridban vagy olyan keverékben, amely 30% DMF-et tartalmaz metilén-kloridban, a kapcsolási reakciót két órán ál folytatjuk. Amikor Arg-t kapcsolunk, olyan keveréket használunk, amely 10% DMF-ot tartalmaz metilén-kloridban. Benzil csoportot használunk hidroxil oldalláncot védő csoportként Ser-hez és Thr-hoz. 2-klór-benzil-oxi-karbonil (2 Cl-Z) csoportot alkalmazunk védőcsoportként a Lys oldalláncához. Tos-t használunk az Arg guanidinocsoportjának védéséhez, és a Glu vagy Asp karboxil-csoportját benzil-észterként védjük. A Tyr fenolos hidroxil csoportját 2,6-diklór-benzil csoporttal védjük. A szintézis végén a következő kompozícióhoz jutunk: X1-Tyr(X2)-Ala-Asp(X3)-Ala-Ile-Phe-Thr(X4)-Asn-Ser(X5)-Tyr(X2)-Agr(X6)-Lys(X7)-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser(X^)-Ala-Arg(X6)-Lys(X7)-Leu-Leu-Gln-Asp(X3)-Ele-Met-Ser(X5)-Arg(X6)-Gln-Gln-Gly-Glu(X3)-Ser(X5)Asn-Gln-Glu(X3)-Arg(X6)-Gly-Ala-Arg(X6)-Ala-arg(X6)-Leu-X8, ahol X1 jelentése BOC, X2 jelentése 2,6-diklór-benzil, X3 jelentése benzil-észter, X4 jelentése Bzl, X5 jelentése Bzl, X6 jelentése Tos, X7 jelentése 2C1-Z és X8 jelentése -O-CH2-benzol-polisztirol támasztó gyanta.
Miután a befejező Tyr gyököt hozzákapcsoltuk a gyantához, a BOC csoportot eltávolítjuk 45% TFA-val CH2Cl2-ben. A védőcsoportok lehasítása és a pepiidnek a gyantáról történő lehasítása érdekében 1 g peptid-gyanta komplexumra számítva 1,5 ml anizolból, 0,26 ml metil-etilszulfidból és 10 ml hidrogén-fluoridból (HF) álló keveréket használunk, a kezelést — 20 *C hő-51
HU 198952 Β mérsékleten fél órán át, majd 0 ’C hőmérsékleten fél órán át végezzük. A HF eltávolítása után nagyvákuumban, a megmaradó gyanta-peptid komplexumot váltakozva mossuk száraz dietil-éterrel és kloroformmal, és azután a peptidet gázroentesílett 2 n vizes ecetsavval leoldjuk. Az ecetsavas oldat liofilezésével fehér, vattaszerű anyaghoz jutunk.
A lehasílott és védőcsoportoklól megszabadított peptidet azután 30%-os ecetsavban oldjuk és Sephadex G-50 en finom gélszűrésnek vetjük alá.
A pepiidet azután tovább tisztítjuk CM-32 karboxi-melil-cellulózon (Whatman) kation-cserélő kromatográfiával (1,8 x 18 cm, Vágy = 50 ml) konkáv gradienst alkalmazva olyan módon, hogy 1 1 0,4 móVHteres ammónium-acetát-oldatot (pH 6,5) csepegtetünk egy 400 ml 0,01 mól/literes ammónium-acetát oldatot (pH = 4,5) tartalmazó keverőedénybe. Az utolsó tisztítási lépést megoszlási kromatográfiával hajtjuk végre n-butanol:etanol:piridin: 0,2% n-ecetsav (4:1:1:7) oldószer-rendszerrel, Sephadex G-50 finom hordozón (Pharmacia). A tisztítás részletei megtalálhatók Ling és munkatársainak közleményében (Biochem. Biophys. Rés, Commun. 95, 945 (1980)]. A kromatográfiás frakciókat vékonyréteg kromatográfiával (TLC) gondosan követjük és csupán azokat a frakciókat gyűjtjük össze, amelyek alapvetően tisztának mutatkoznak.
Aminosav-analíziseket is végzünk hidrolízist követően leforrasztott csövekben az Anal, Biochem., 126, 144- 156 (1982) irodalmi helyen leírt módszert alkalmazva, Liquimat III aminosav analizátorral dolgozva. Az aminosav-analízis célja, hogy ellenőrizni lehessen, vajon a helyes szekvenciát nyertük-e. A következő eredményt kapjuk: Asx(3,62), Thr(0,75), Se(3,5), Glx(6,83), Gly(2,87), Ala(5,10), Val(0,9), Met(l,23),
Ile(l,84), Leu(5,045), Tyr(2,09), Phe(Ü,91), Lys(2,3l) és Arg(6,61). Az analízis igazolja a korrekt szekvenciát.
2, példa
A PGRF (1 -40) — amelynek képlete H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-GIu-Arg-Gly-Ala-OH szintézisét lépései.xénti módszerrel hajtjuk végre, Beckman 990 Peptide Synthesisert használva klórmetilezett gyantán, az 1. példában leírt módszer szerint. A peptidet alapvetően tisztának találjuk TLC-vei és nagynyomású fotyadék-kromatográfiával (HPLC) vizsgálva.
Aminosav-analízist is végzünk hidrolízis után annak ellenőrzésére, vajon korrekt szekvenciát nyertünk-e. Az analízis a következő eredményeket adja: Asx(3,89), Thr(0,88), Ser(3,66), Glx (7,04), Gly(3,07), Ala(4,02), Val(0,9ó), Met (1,01), lle(l,86), Leu(4,28), Tyr(2,0), Phe(0,86), Lys(2,24) és Arg(4,15). Az analízis igazolja a korrekt szekvenciái.
2/a. példa
A PGRF (1 — 34) szabad sav — amelynek képlete H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-OH és amely nem tartozik az igényelt oltalmi körbe — szintézisét lépésenkénti módszerrel hajtjuk végre, Beckman 990 Peptide Synthesisert használva klór-metilezett gyantán, az 1. példában leírt módszer szerint. A peptidet alapvetően tisztának találjuk TLC-vel és HPLC-vel vizsgálva,
Aminosav-analízist is végzünk hidrolízis után annak ellenőrzésére, vajon korrekt szekvenciát nyertünk-e. Az analízis a következő eredményt adja: Asx(2,87), Thr(0,78), Ser(3,78), Glx(5,ll), C>ly0(l,93), Ala(3,03), Val(0,88), Met(0,96), He (1,88), Leu(4,14), Tyr(2,05), Phe(l,07), Lys (2,29) és Arg(3,22). Az analízis igazolja a korrekt szekvenciát.
2/b. példa
A PGRF (1-31) szabad sav — amelynek képlete H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-lle-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-OH és amely nem tartozik az igényelt oltalmi körbe — szintézisét a lépésenként! módszerrel hajtjuk végre, Beckman 990 Peptide Synthesisert használva klór-metilezett gyantán, az 1. példában leírt módszer szerint. A peptidet alapvetően tisztának találjuk TLC-vel és HPLCvel vizsgálva.
Aminosav-analízist is végzünk hidrolízis után annak ellenőrzésére, vajon korrekt szekvenciát nyertünk-e. Az analízis a következő eredményt adja: Asx(2,73), Thr(0,75), Ser(2,77), Glx(3,95), Gly(0,98), Ala(3,06), Val(0,80), Met(0,98), Ile (1,77), Leu(4,28), Tyr(2,23), Phe(l,14), Lys (2,34) és Arg(3,22). Az analízis igazolja a korrekt szekvenciát.
2/c. példa
A PGRF (1 — 28 szabad sav — amelynek képlete N-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-OH és amely nem tartozik az igényelt oltami körbe — szintézisét lépésenkénti módszerrel hajtjuk végre, Beckman 990 Peptide Synthesisert használva klór-metilezett gyantán, az 1. példában leírt módszer szerint. A peptidet alapvetően tisztának találjuk TLC-vel és HPLC-vel vizsgálva.
Aminosav-analízist is végzünk hidrolízis után annak ellenőrzésére, vajon korrekt szekvenciát nyertünk-e. Az analízis a következő eredményt adja: Asx(2,66), Thr(0,73), Ser(2,66), Glx(l,98), Gly(0,81), Ala(2,89), Val(0,90), Met(l,15), He (1,72), Leu(4,14), Tyr(2,43), Phe(l,58), Lys (2,15) és Arg(2,19). Az analízis igazolja a korrekt szekvenciát.
3. példa
A PGRF (1-44) amid - amelynek képlete H-Tyr-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-61
HU 198952 Β
-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2 szintézisét lépésenként! módszerrel hajtjuk végre, Beckman 990 Peptide Synlhesisert használva MBHA-gyantán, az 1. példában leírt módszer szerint. A peptidet alapvetően tisztának találjuk TLC-vel és HPLC-vel vizsgálva.
Aminosav-analízist is végzünk hidrolízis után annak ellenőrzésére, vajon a korrekt szekvenciát nyertük el. Az analízis a következő eredményt adja: Asx = 3,75), Thr(0,80), Ser(3,60), Glx (6,98), Gly(3,16), Ala(5,04), Val(0,77), Met (1,02), Ile(l,79), Leu(5,41), Tyr(2,03), Phe (0,84), Lys(2,39), és Arg(6,43). Az analízis igazolja a korekt szekvenciát.
Egy PGRF analóg — amelynek képlete H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Árg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ue-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ala-Asn-Gln-Glu-Ser-Gly-Arg-OH — szintézisét lépésenként! módszerrel hajtjuk végre, Beckman 990 Peptide Synthesisert használva klór-metilezett gyantán, amely a Láb Systems, Inc-től szerezhető be, az 1. példában leírt módszer szerint. A peptidet alapvetően tisztának találjuk.
Aminosav-analízist is végzünk hidrolízis után annak ellenőrzésére, vajon korrekt szekvenciát nyertünk-e. Az analízis a következő eredményt adja: Asx(4,35), Thr(l,06), Ser(3,80), Glx(7,53), Gly(2,96), Ala(4,05), Val(0,97), Met(0,86), Ile (1,94), Leu(3,70), Tyr(2,05), Phe(l,06), Lys (2,06) és Arg(3,53). Az analízis igazolja a koirekt szekvenciát.
5. példa
A PGRF (1— 40)-amid — amelynek képlete -H-Tyr-Ala-Asp-AIa-IIe-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-NH2 — szintézisét lépésenkénti módszerrel hajtjuk végre, Beckman 990 Peptide Synthesisert használva MBHA gyantán, az 1. példában leírt módszer szerint. A peptidet alapvetően tisztának találjuk TLC-vel és HPLC-vel vizsgálva.
Aminosav-analízist is végzünk hidrolízis után annak ellenőrzésére, vajon korrekt szekvenciát nyertünk-c. Az analízis a következő eredményt adja: Asx(3,76), Thr(0,88), Ser(3,68), Glx(6,89), Gly(3,12), Ala(4,08), Val(0,88), Met(l,36), He (1,76), Leu(4,24), Tyr(2,00), Phe(0,80), Lys (2,32) és Arg(4,16). Az analízis igazolja a korrekt szekvenciát.
6, példa
A PGRF (1-37) szabad sav — amelynek képlete H-Tyr-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Scr-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Lcu-Lcu-Gln-Asp-Ile-met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-OH, és amely nem tartozik az igényelt oltami körbe — szintézisét lépésenkénti módszerrel hajtjuk végre, Beckman 990 Peptide Synthesisert használva klór-metilezett gyantán, az 1. példában leírt módszer szerint. A peptidet alapvetően tisztának találjuk TLC-vel és HPLC-vel vizsgálva.
Aminosav-analízist is végzünk hidrolízis után annak ellenőrzésére, vajon korrekt szekvenciát nyertünk-e. Az analízis a következő eredményt adja: Asx(3,92), Thr(G,79), Ser(3,62), Glx(7,05), Gly(l,797), Ala(3,17), Val(l,03), Met(l,0), Ile (1,91), Leu(4,37\ Tyr(l,86), Phe(0,76), Lys (2,15) és Arg(3,4ü). Az analízis igazolja a korrekt szekvenciát.
6/a. példa
A PGRF (1 — 37) amid — amelynek képlete H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln 'sp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-GIn-GIy-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-NH2, és amely nem tartozik az igényelt oltalmi körbe — szintézisét lépésenkénti módszerrel hajtjuk végre, Beckman 990 Peptide Synthesisert használva MBHA gyantán, az 1. példában leírt módszer szerint. A peptidet alapvetően tisztának találjuk TLC-vel és HPLC-vel vizsgálva.
Aminosav-analízist is végzünk hidrolízis után annak ellenőrzésére, vajon korrekt szekvenciát nyertünk-e. Az analízis a következő eredményt adja: Asx(4,02), Thr(0,80), Ser(3,49), Glx(6,90), Gly(l,92), AIa(3,08), Val(l,05), Met(l,01), Ile (1,77), Leu(4,05), Tyr(2,02), Phe(l,14), Lys (2,50) és Arg(3,27). Az analízis igazolja a korrekt szekvenciát.
7. példa
A peptidek növekedési hormon felszabadítását elősegítő hatásának meghatározása in vitro méréseket végzünk, a 2. példa szerint előállított szintetikus PGRF (l-40)-et tisztított natív PGRF (l-40)-nel és GRF Referencia Standarddal hasonlítjuk össze, amelynek hatásossága ismert a növekedési hormon felszabadításának elősegítésében agyalapi mirigy sejtekből. A GRF Referencia Standard-ot Brazeau és munkatársai írták le és definiálták [Endocrinology, 110. kötet, A 538 (1982)]; ez olyan mennyiségű, patkány hipotalamus eredetű preparátumot jelent, amely maximális válaszfelét idézi elő a növekedési hormon (GH) felszabadítás vonatkozásában, egyréteges agyalapi mirigy sejttenyészetben végzett biológiai meghatározásban. Olyan tenyészeteket használunk, amelyek négy-öt nappal korábban eltávolított patkány agyalapi mirigy sejtjeit tartalmazzák. Mind meghatározott standard tápközeget tartalmazó, mind növekedési hormon kiválasztásához optimálisnak tekintett tápközeget alkalmazunk az összehasonlító vizsgálatban, azzal az általános módszerrel dolgozva amelyet Brazeau és munkatársai írtak le (Regulatory Peptides, 1, 255, 1981). A vizsgálandó vegyülettel történő inkubálást 3-4 óra hosszat végezzük, és a tápközegből alikvotokat véve meghatározzuk az immunreaktív GH(ir GH) tartalmat egy jól ismert radioimmun-méréssel.
HU 198952 Β
Ennek az összehasonlító vizsgálatnak az eredményei azt mutatják, hogy ekvimoláris arányban alkalmazva a szintetikus PGRF (1-40) rendszerint a natív peptid teljes biológiai aktivitásával, amint ezt az I. táblázat bemutatja. A szintetikus 5 pepiid EDsq értéke mintegy 113 pikogramm, ez tehát sokkal hatásosabb, mint bármely más olyan molekula, amelyet eddig GH felszabadító faktor-
| nak hirdettek. | |
| I. táblázat | |
| GRF Referencia GH kiválasztás Standard in vitro a kontroll | |
| százalékában | |
| 0,63 egység | 173± 0,4 |
| 1,25 egység | 230± 5,0 |
| 2,50 egység | 347±13,0 |
| 5,00 egység | 4741 3,0 |
| 10,00 egység | 674i 6,0 |
Natív PGRF (1-40)
12,5 femtomól 234±17 25 femtomól 351± 7 50 femtomól 528±16
100 femtomól 720±32 200 femtomól 748± 7 Szintetikus PGRF (1-40) femtomól 269±20 100 femtomól 70l± 6 1000 femtomól 990±42
A növekedési hormon kiválasztásának in vitro vizsgálatain kívül in vivő kísérleteket is folytatunk, a szintetikus peptidet kb. 200 g testsúlyú, pentobarbilállal érzéstelenített normál hím patkányokba injektálva. A II. táblázatban közölt eredmények azt mutatják, hogy a szintetikus PGRF peptid hatásosan segíti elő a növekedési hormon kiválasztását az agyalapi mirigyből.
II. táblázat
Szitetikus PGRF (1 — 40) in vivő hatása az agyalapi mirigy növekedési hormon kibocsátására, egyetlen intravénás injekció után normál patkányokban (4 állat kezelési dózisonként)
Dózisok Válaszok a szérum ir-GH nanogramm/ml-jeiben mérve a (mikrogramm) jelzett időpontokban injekció előtt és után (perc)
| -1 | + 5 | 10 | 15 | 30 | 60 | |
| 0 | 173±47 | 251±81 | 339±139 | 396±121 | 749±440 | 316±76 |
| 0,01 | 173±23 | 284 ±20 | 238±51 | 20l±47261±47 | 261 ±50 | 299±25 |
| 0,1 | 276±126 | 694±246 | 582±290 | 758±562 | 280± 280±70 | 242±129 |
| 1,0 | 142±24 | 4551±1825 | 1748 ±564 | 730±158 | 234±53 | 267±129 |
| 10,0 | 234±76 | 7077± 1943 | 4676±585 | 2464±378 | 616±112 | 223±26 |
6/a. példa
A PGRF (1 — 37) amid — amelynek képlete H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg- 40
-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-NH2, és amely nem tartozik az igényelt oltalmi körbe — szintézisét lépésenként! módszerrel hajtjuk végre, Beckman 990 Peptide Synthesisert használva 45 MBHA gyantán, az 1. példában leírt módszer szerint. A peptidet alapvetően tisztának találjuk TLC-vel és HPLC-vel vizsgálva.
Aminosav-analízist is végzünk hidrolízis után annak ellenőrzésére, vajon korrekt szekvenciát 50 nyertünk-e. Az analízis a következő eredményt adja: Asx(4,02), Thr(0,80), Ser(3,49), Glx(6,90), Gly(l,92), Ala(3,08), Val(l,05), Met(l,01), He (1,77), Leu(4,05), Tyr(2,02), Phe(l,14), Lys (2,50) és Arg(3,27). Az analízis igazolja a kor- 55 rekt szekvenciát.
A további vizsgálatok azt mutatják, hogy a 4. példa szerinti szintetikus PGRF analóg lényegileg ugyanazt a biológiai potenciált mutatja, mint a natív PGRF (1 — 40) és hogy a 6. és 6/a. példa szerinti szintetikus fragmensek is nagyon jelentős biológiai potenciállal bírnak. Továbbá az 5. példa szerinti (PGRF(1 —40) peptid, amely akarboxamid csoportot vise a C-terminálison, lényegileg kétszeres biológiai potenciállal rendelkezik, mint a 7. példában a vizsgált szintetikus peptid.
8. példa
A 7. példában leírt in vitro vizsgálatokat megismételjük natív PGRF (1 — 40)-et és natív PGRF (1 — 44)-et használva; az eredmények azt mutatják, hogy a natív PGRF(l-44) több, mint kétszeres biológiai potenciállal rendelkezik.
HU 198952 Β
A további vizsgálatok azt mutatják, hogy a szintetikus PGRF(1—44); és a szintetikus PGRF(1 — 44)-amid lényegében azonos potenciállal rendelkezik, mint a natív PGRF(1 —44). A szintetikus PGRF(1 — 44)-amid, amikor laboratóriumi állatokba (patkányokba) injektáljuk, azonos típusú GH-kibocsátó aktivitást mutat, mint amelyet a PGRF(1 — 40) fejt ki a 7. példa II. táblázatában, de mintegy 2,5 — 3-szorosan hatásosabb súly-alapon számolva, mint a PGRF(1— 40)-szabad sav.
Az Egyesült Államokban körülbelül 7000—15000 gyermek közül egyről ismeretes, hogy agyalapi mirigy-eredetű növekedési hormon hiánnyal küzd, vagyis agyalapi mirigy törpe, azaz ezek azért törpék, mert az agyalapi mirigy eredetű GH normális szintje nincs meg a vérükben. Klinikai bizonyítékok azt mutatják, hogy ezeknek a betegeknek a többsége normális agyalapi miriggyel rendelkezik, és problémáik oka a hipotalamus eredetű, GH kibocsátást elősegítő faktor szintézisének vagy kiválasztásának hiánya. A szintetikus PGRF-től az várható, hogy ideális kezelést ad azokban az esetekben, amelyekben korábban emberi agyalapi mirigy eredetű GH-t alkalmaztak kezelésként injekció formában, egy rendkívül drága, emberi agyalapi mirigyből boncolásnál nyert készítménnyel. A DNS-rekombináns módszerrel nyert humán GH, bár az irodalomból már ismeretes, még nem áll rendelkezés re rutin alkalmazásra. A szintetikus PGRF sokkal egyszerűbb molekula és alkalmazása jelentős előnyöket mutat bárhol a világon, ahol az ilyen agyalapi mirigy-törpék száma százakra vagy ezrekre becsülhető.
Mivel a szintetikus PGRF az első ismeri molekula, amely fajlagosan képes felismerni az agyalapi mirigy GH-kiválasztó funkcióját, ez jelentheti az első rutin-vizsgálatot a GH-kiválasztáshoz minden olyan esetben, amelyben az orvos az agyalapi mirigy funkciójának fajlagos defektusára gyanakszik. A szintetikus PGRF ezért a jövőben helyettesítheti a diagnosztikai eljárásként jelenleg használt nehézkes módszereket (arginin inúzió, hípoglikémia, L-DOPA injekció stb.) a GH kiválasztóképesség becslésében.
A szintetikus PGRF fontos lehet minden olyan esetben a klinikai gyógyászatban, amelyben az orvos előnyben szeretné részesíteni a pozitív nitrogén-egyensúlyt és anabolizmusl, ilyen pl. a sebgyógyulás, a kiterjedt égések kezelése, nagyobb műtétet követő poszt-operatív periódusok, és az általános gyengeség egyéb orvosi szituációi, beleértve a gerontológiai gyakorlatnak, valamint a koraszülött csecsemők gyógyászati gyakorlatának több szindrómáját. A GH kiválasztás elősegítése fontos a szilárd tumorok erősebb besugárzásos terápiája közben és utána a betegekben, részben elősegíteni az anabolizmusl, részben a GH hatásának előnyeit igénybe venni a vérképző rendszer nyeles sejtjeinek stimulálására. Az emberekbe történő adagoláshoz a PGRF peptideknek legalább 93%-os tisztaságúnak, előnyösen 98%-os tisztaságúnak kell lenniük. Ez a tisztaság azt jelenti, hogy a szóban forgó pepiid alkotja az összes jelenlevő peptid és peptidfragmens említett tömeg%-át.
A biológiailag aktív peptidek legtöbbjéről úgy találták, hogy más biológiai aktivitással is rendelkeznek, mint amelyekhez ezeket eredetileg felismerték. Tekintettel az ilyen példákra, valószínű, hogy a PGRF-ről is azt fogják találni, hogy az agyalapi mirigyen kívül is van aktivitása, amely gyakorlati jelentőségű. Bár a PGRF-et humán hasnyálmirigy tumorból izoláltuk és extraháltuk, az általános tapasztalat és a kísérletek alapján azt hisszük, hogy a PGRF(l-44)-amid aminosav-szekvenciája azonos a humán hipotalamuseredetű, GH-kibocsátást elősegítő faktor szék venciájával.
A szintetikus PGRF peptidek rendszeres adagolása háziállatokba vagy más melegvérű állatokba várhatóan elősegíti az anabolizmust és így növeli a testsúlyt az izomtömeg vonatkozásában. A tenyésztett halak és más hidegvérű tengeri állatok gyorsított növekedése szintén előirányozható. Az állatoknak 5% tisztaságú anyag beadása is elfogadható.
A szintetikus PGRF vagy nem toxikus sói, gyógyászatilag elfogadható hordozóval kombinálva gyógyászati készítményt alkothatnak, amelyeket be lehet adni emlősöknek, beleértve az embert is, intravénásán, szubkután, intramuszkulárisan vagy szájon át. A szükséges adag a kezelendő beteg pillanatnyi állapotától, az állapot súlyosságától, a kívánt kezelés időtartamától függ.
Ezek a peptidek gyógyászatilag elfogadható, nem toxikus só formájában, mint pl. savaddíciós sók vagy fémkomplexek pl. cinkkel vagy más fémmel alkotott (a bejelentésben ezeket is sóknak tekintjük) adagolhatok. A savaddíciós sókra példák a hidroklorid, hidrobromid, szulfát, foszfát, maleát, acetát, citrát, benzoát, szukcinát, malát, aszkorbát, larlarát stb. Ha az aktív alkotórészt tabletta formájában adagoljuk, a tabletta tartalmazhat valamilyen kötőanyagot, pl. tragakantot, kukorica-keményítőt vagy zselatint; valamilyen szétesést elősegítő anyagot, pl. algin-savat; és egy csúsztató anyagot, mint pl. magnézium-sztearátot. Ha folyadék formájú beadagolás kívánatos, édesítő- és/vagy illatosító anyagokat is lehet használni, az intraavénás beadagolást pedig izotóniás sóoldatban, foszfát-pufferban vagy hasonlókban lehet végrehajtani.
A peptideket orvosi felügyelettel kell adagolni; a gyógyászati kompozícióknak a peptideket általában hagyományos, gyógyászatilag elfogadható hordozókkal együtt kell tartalmaznia. Az adagolás mértéke általában 20 — 2000 nanogramm peptid a beteg egy testsúly-kg-jára.
A találmány szerinti eljárással előállított szintetikus peptidekben különböző változtatások lehetségesek, úgy találtuk azonban, hogy a biológiai hatékonyság szempontjából fontos, hogy az N-terminálislól számított első 28 aminosav jelen legyen, az azután következő aminosavak között lehetséges törlés vagy betoldás vagy csere.
A példákban leírt eljárásokkal előállított ter-91 mékeket vékonyréteg kromatográfiásan Rf értékekkel azonosítottuk. A vékonyrétegkromatográfiát 0,25 mm vastag, fluoreszcens indikátort nem tartalmazó szilikagél 60-nal (E. Merck, Darmstadt, NSZK) bevont üveglemezeken végeztük, a kifejlesztéshez használt oldószerelegy összetétele: 1-butanol, piridin, ecetsav, víz 6:6:1,2:4,8 térfogatarányban. A kimutatást ninhidrin-reagenssel végeztük (2 g ninhidrin 50 ml ecelsav és 950 ml 1-bulanol elegyében).
Táblázat
| Példa | Vegyület | Rf érték n | Kitermelés ig/g gyanta |
| 1. | PGRF(1 —44) szabad sav | 0,464 | 80 |
| 2. | PGRF(1 —40) szabad sav | 0,414 | 37 |
| 2/a. | PGRF(1—34) szabad sav | 0,500 | 121 |
| 2/b. | PGRF(1 —31) szabad sav | 0,536 | 143 |
| 2/c. | PGRF(1—28) szabad sav | 0,550 | 17 |
| 3. | PGRF(1 —44) amid | 0,464 | 67 |
| 4. | PGRF analóg | 0,421 | 39 |
| 5. | PGRF(1—40) amid | 0,464 | 60 |
| 6. | PGRF (1-37) szabad sav | 0,421 | 29 |
| 6/a. | PGRF (1-37) amid | 0,507 | 25 |
SZABADALMI IGÉNYPONTOK
Claims (8)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. EljárásN-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gly-Gln-R^-Asn-Gln-Glu-R38-Gly-R40-Arg-Ala-Arg-Leu (I) általános képletű peptidek előállítására.Az (I) általános képletbenRj4 jelentése Ser vagy Alá,R38 jelentése Arg vagy Ser,R40 jelentése Alá vagy Arg, valamint a fenti peptidek 1 — 28. aminosavszekvenciájától az 1—43. aminosav-szekvenciáig terjedő fragmenseinek és e vegyületek C-terminális amidjainak előállítására, azzal jellemezve, hogyX‘-Tyi(X2)-Ala-Asp(X3)-Ala-Ilc-Phe-Thr = (X4)-Asn-Ser(X5)-Tyr(X2)-Arg(X6)-Lys(X7)-Vaí-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser(X5)-Ala-Arg(X6)-Lys(X7)-Leu-Leu-GIn-Asp(X3)-Rj4(X3)-Asn-Gln-Glu(X3)-R3a(X5 vagy X6)-Gly-R40(X6)-Arg(X6)-Leu-X*(II) általános képletű védett peptidről vagy a fenti védett pepiid 1 — 28. aminosav-szekvenciójától az 1 — 43. aminosav-szekvenciáig terjedő fragmenséről - ahol (X1), (X2), (X3), (X4), (X*), (X6), (X7) hidrogénatom vagy a peptidkémiában önmagában ismert védőcsoport és (X8) a védett peptid mindenkori C-terminális végén levő hidroxil- vagy aminocsoport vagy a peptidkémiában önmagában ismert védőcsoport, és R34, R38 és R40 jelentése a fenti — lehasítjuk a védőcsoportokat.(Elsőbbsége: 1982.09.15.)
- 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás az (I) általános képletű peptidek 1 — 28. aminosav-szekvenciájától az 1 — 40. aminosav-szekvenciáig terjedő fragmenseinek és ezek C-terminális amidjainak előállítására, ahol R34, R38 és R4q jelentése az 1. igénypontban megadott, azzal jellemezve, hogy egy (11) álalános képletű védett peptid 1 — 28. aminosav-szekvenciájától az 1-40. aminosavszekvenciáig tenedő fragmenséről - ahol (X1), (X2), (X3), (Χή, (X5), (X6), (X7), (X8), R34, R38 és R40 az 1. igénypontban megadott - a védőcsoportokat lehasítjuk.(Elsőbbsége: 1982. 06. 16.)
- 3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (II) általános képletű - ahol R^ jelentése Ser, R3s jelentése Arg és R40 jelentése Alá, R, X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7 és X8 jelentése a 2. igénypont szerinti —, 1 — 40. aminosavszekvenciájú védett peptidről lehasítjuk a védőcsoportokat.(Elsőbbsége: 1982.06.16.)
- 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (II) általános képletű védett pepiidről - ahol R^, R38> R40, X1), X2, X3, X4, X5, X , X7 és X8 jelentése a 1. igénypont szerinti —, hasítjuk le a védőcsoportokat.(Elsőbbsége: 1982.09.15.)
- 5. Az 1. vagy 4. igénypont szerinti eljárás az (I) általános képletű peptidek — ahol R^, R38 és R4o jelentése az 1. igénypont szerinti — valamint a fenti peptidek 1 — 28. aminosav-szekvenciájától az 1 - 43. aminosav-szekvenciáig terjedő fragmensei C-terminális amidjainak előállítására. azzal jellemezve, hogy olyan (II) R^, R38, R4o, X1, X2, X3, X4, X5, ΧΛ X7 jelentése a 1. igénypont szerinti és X8 jelentése aminocsoport, vagy a fenti védett peptid valamely 1 — 28. aminosavszekvenciájától az 1 — 43. aminosav-szekvenciáig terjedő fragmenséről a védőcsoportokat lehasítjuk.(Elsőbbsége: 1982. 09.15.)
- 6. Az 1. vagy 4. igénypont szerinti eljárás olyan (I) általános képletű vegyületek, ahol R^, R38, R40. X1, X2> X3» X4. X5» X6» x? jelentése a 1. igénypont szerinti és X8 jelentése hidroxilcsoport, vagy a fenti védett peptid valamely 1 — 28. aminosav-szekvenciájától az 1 — 43. aminosavszekvenciáig terjedő fragmensei előállítására, azzal jellemezve, hogy olyan (II) általános képletű vegyületekről, ahol R^, R38, R40, X1, X2, X3, X , X5, X6, X7 jelentése a 1. igénypont szerinti és X8 jelentése hidroxilcsoport, vagy a fenti védett peptid valamely 1-28. aminosav-szekvenciájától az 1-43. aminosav-szekvenciáig terjedő fragmenséről a védőcsoportokat lehasítjuk. (Elsőbbsége: 1982.09.15.)
- 7. A 2. vagy 3. igénypont szerinti eljárás olyan (I) általános képletű vegyületek, ahol R^, R38 és R40 jelentése a 2. igénypont szerinti, 1 — 28. ami10-101HU 198952 Β nosav-szekvenciájától az 1 — 40. aminosav-szekvenciáig terjedő fragmensei C-terminális amidjainak előállítására, azzal jellemezve, hogy olyan (II) általános képletű vegyületek 1-28. aminosav-szekvenciájától az 1 — 40. aminosav-szekvenciáig terjedő fragmenséről. ahol R34, R38, R40, X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7 jelentése a 2. igénypont szerinti és X8 jelentése aminocsoport, a védőcsoportokat lehasítjuk.(Elsőbbsége: 1982.06.16.)
- 8. A 2. vagy 3. igénypont szerinti eljárás olyan (I) általános képletű vegyületek, ahol R34, R38 ésR40 jelentése a 2. igénypont szerinti, 1 — 28. aminosav-szekvenciájától az 1 — 40. aminosav-szekvenciáig terjedő fragmensei előállítására, azzal jellemezve, hogy olyan (II) általános képletű ve$ gyületek 1 — 28. aminosav-szekvenciájától az 1-40. aminosav-szekvenciáig terjedő fragmenséről, ahol R-m, R38, R40, X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7 jelentése a 2. igénypont szerinti és X8 jelentése hidroxilcsoport, 1 — 28. aminosav-szekvenciájától az 1-40. aminosav-szekvenciáig terjedő fragmenséről a védőcsoportokat lehasítjuk. (Elsőbbsége: 1982.06.16).
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US8200812 | 1982-06-16 | ||
| US06/418,248 US4517181A (en) | 1982-09-15 | 1982-09-15 | Mammalian PGRF |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU198952B true HU198952B (en) | 1989-12-28 |
Family
ID=23657331
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU832511A HU198952B (en) | 1982-06-16 | 1983-06-16 | Process for producing a factor stimulating the release of growth hormone of mammalian pituitary gland origin (pgrf) |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4517181A (hu) |
| JP (1) | JPS5916863A (hu) |
| AT (1) | ATE17737T1 (hu) |
| BG (1) | BG37523A3 (hu) |
| CZ (1) | CZ281507B6 (hu) |
| DE (1) | DE3362003D1 (hu) |
| DK (1) | DK162649C (hu) |
| HU (1) | HU198952B (hu) |
| IE (1) | IE55361B1 (hu) |
| RO (1) | RO88703A (hu) |
| SK (1) | SK435783A3 (hu) |
| YU (1) | YU44041B (hu) |
| ZA (1) | ZA834051B (hu) |
Families Citing this family (28)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4703035A (en) * | 1982-10-04 | 1987-10-27 | The Salk Institute For Biological Studies | Human pancreatic GRF amidated fragments |
| US4628043A (en) * | 1983-04-26 | 1986-12-09 | The Salk Institute For Biological Studies | Hypothalamic GRF agonists |
| BE898666A (fr) * | 1984-01-12 | 1984-05-02 | Wallone Region | Procede de preparation de clones bacteriens portant une information genetique optimalisee pour la production du facteur de declenchement de l'hormone de croissance humaine dans escherichia coli |
| US4747825A (en) * | 1984-06-29 | 1988-05-31 | Ferring Laboratories, Inc. | Apparatus and methodology for pulsed administration of growth promoting agents |
| FR2567524B1 (fr) * | 1984-07-10 | 1987-11-27 | Sanofi Sa | Procede de synthese de la somatocrinine en phase liquide et peptides intermediaires |
| CA1271600A (en) * | 1985-01-07 | 1990-07-10 | David Howard Coy | Growth hormone-releasing peptides and method of treating mammals therewith |
| US4880778A (en) * | 1986-05-12 | 1989-11-14 | Eastman Kodak Company | Combinations having synergistic growth hormone releasing activity and methods for use thereof |
| CA1296253C (en) * | 1986-10-20 | 1992-02-25 | Praveen Tyle | Stabilized growth hormone compositions |
| US4839344A (en) * | 1987-06-12 | 1989-06-13 | Eastman Kodak Company | Polypeptide compounds having growth hormone releasing activity |
| USRE33699E (en) * | 1987-07-09 | 1991-09-24 | International Minerals & Chemical Corp. | Growth hormone-releasing factor analogs |
| US4801456A (en) * | 1987-07-09 | 1989-01-31 | International Minerals & Chemical Corp. | Growth hormone-releasing factor analogs |
| US4880777A (en) * | 1987-09-01 | 1989-11-14 | Eastman Kodak Company | Synthetic peptides having growth hormone releasing activity |
| EP0400051B1 (en) * | 1988-01-28 | 1995-05-10 | Polygen Holding Corporation | Polypeptide compounds having growth hormone releasing activity |
| US5153175A (en) * | 1989-05-25 | 1992-10-06 | University Of Tennesee Research Corporation | Method of inducing sleep with GHRH complementary peptide compositions |
| US5756458A (en) * | 1989-06-16 | 1998-05-26 | Pharmacia & Upjohn Company | Stabilized potent GRF analogs |
| US5488033A (en) * | 1989-07-28 | 1996-01-30 | The Regents Of The University Of California | Treatment to reduce edema |
| US5137871A (en) * | 1989-07-28 | 1992-08-11 | Regents Of The University Of California | Treatment to reduce edema for brain and musculature injuries |
| US5015626A (en) * | 1989-08-02 | 1991-05-14 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | Porcine somatotropin to improve meat quality of pigs |
| AU656144B2 (en) * | 1990-06-29 | 1995-01-27 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Histidine substituted growth hormone releasing factor analogs |
| DK0490249T3 (da) * | 1990-12-10 | 1995-05-29 | Hoffmann La Roche | Fremgangsmåde til enzymatisk fremstilling af GRF(1-44)-NH2 |
| WO1992018531A1 (en) * | 1991-04-09 | 1992-10-29 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Growth hormone releasing factor analogs |
| US5246920A (en) * | 1992-06-15 | 1993-09-21 | University Of South Florida | Treatment of hyperprolactinemia |
| US5811074A (en) * | 1992-06-29 | 1998-09-22 | University Of South Florida | Method of diagnosing pituitary dependent growth hormone deficiency |
| US5817627A (en) | 1996-06-14 | 1998-10-06 | Theratechnologies Inc. | Long-acting galenical formulation for GRF peptides |
| BR0206919A (pt) * | 2001-02-02 | 2004-07-06 | Conjuchem Inc | Derivados de fator de liberação de hormÈnio de crescimento de longa duração |
| CN1688696A (zh) * | 2002-09-18 | 2005-10-26 | 蒙特利尔大学医疗中心 | Ghrh类似物 |
| US20080260820A1 (en) * | 2007-04-19 | 2008-10-23 | Gilles Borrelly | Oral dosage formulations of protease-resistant polypeptides |
| US20090088380A1 (en) * | 2007-07-12 | 2009-04-02 | Pierrette Gaudreau | Ghrh analogs and therapeutic uses thereof |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4201840A (en) * | 1977-10-06 | 1980-05-06 | Eastman Kodak Company | Photographic film units containing a polymeric mordant which covalently bonds with certain dyes |
| DE2846412A1 (de) * | 1978-10-25 | 1980-05-08 | Behringwerke Ag | Mittel zur behandlung allergischer reaktionen |
| JPS55152459A (en) * | 1979-05-18 | 1980-11-27 | Yamasa Shoyu Co Ltd | Method and reagent for measuring quantity of cyclic nucleotide |
-
1982
- 1982-09-15 US US06/418,248 patent/US4517181A/en not_active Expired - Lifetime
-
1983
- 1983-06-03 ZA ZA834051A patent/ZA834051B/xx unknown
- 1983-06-15 CZ CS834357A patent/CZ281507B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1983-06-15 IE IE1415/83A patent/IE55361B1/en not_active IP Right Cessation
- 1983-06-15 SK SK4357-83A patent/SK435783A3/sk unknown
- 1983-06-16 BG BG8361360A patent/BG37523A3/xx unknown
- 1983-06-16 DE DE8383303490T patent/DE3362003D1/de not_active Expired
- 1983-06-16 HU HU832511A patent/HU198952B/hu unknown
- 1983-06-16 AT AT83303490T patent/ATE17737T1/de not_active IP Right Cessation
- 1983-06-16 DK DK278383A patent/DK162649C/da not_active IP Right Cessation
- 1983-06-16 JP JP58108528A patent/JPS5916863A/ja active Granted
- 1983-08-01 RO RO83111789A patent/RO88703A/ro unknown
- 1983-09-15 YU YU1866/83A patent/YU44041B/xx unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3362003D1 (de) | 1986-03-13 |
| DK278383A (da) | 1983-12-17 |
| JPS5916863A (ja) | 1984-01-28 |
| DK162649B (da) | 1991-11-25 |
| DK162649C (da) | 1992-04-13 |
| SK278537B6 (en) | 1997-09-10 |
| CZ281507B6 (cs) | 1996-10-16 |
| ATE17737T1 (de) | 1986-02-15 |
| DK278383D0 (da) | 1983-06-16 |
| IE55361B1 (en) | 1990-08-29 |
| JPH0133118B2 (hu) | 1989-07-11 |
| RO88703A (ro) | 1986-04-30 |
| YU186683A (en) | 1985-12-31 |
| BG37523A3 (en) | 1985-06-14 |
| IE831415L (en) | 1983-12-16 |
| YU44041B (en) | 1990-02-28 |
| US4517181A (en) | 1985-05-14 |
| CZ435783A3 (en) | 1996-07-17 |
| SK435783A3 (en) | 1997-09-10 |
| ZA834051B (en) | 1984-10-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4517181A (en) | Mammalian PGRF | |
| FI83660B (fi) | Foerfarande foer framstaellning bukspottskoertelns grf hos maenniskan. | |
| US4316891A (en) | Extended N-terminal somatostatin | |
| FI92210B (fi) | Menetelmä farmaseuttisesti käyttökelpoisten GRF-analogien valmistamiseksi | |
| JP4249806B2 (ja) | ５位および６位で修飾されているＧｎＲＨ拮抗物質 | |
| US4529595A (en) | GRF Analogs | |
| JP4191259B2 (ja) | ＧｎＲＨ拮抗物質 | |
| US4610976A (en) | Porcine GRF | |
| US4585756A (en) | Bovine GRF | |
| HU206126B (en) | Process for producing growth hormone releasing factor derivatives | |
| US4605643A (en) | Ovine GRF | |
| HU199508B (en) | Process for producing grf analogues and pharmaceutical compositions comprising same as active ingredient | |
| EP0137689B1 (en) | Grf analogs | |
| CA1247599A (en) | Mammalian pgrf | |
| US4908352A (en) | Urotensin peptides | |
| US4703035A (en) | Human pancreatic GRF amidated fragments | |
| IE53488B1 (en) | Crf and analogues | |
| US4393050A (en) | Analogs of extended N-terminal somatostatin | |
| CA1271899A (en) | Grf analogs |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HU90 | Patent valid on 900628 |