HU198075B - Process for producing new vinblastine conjugates and pharmaceutical compositions comprising same - Google Patents

Process for producing new vinblastine conjugates and pharmaceutical compositions comprising same Download PDF

Info

Publication number
HU198075B
HU198075B HU865216A HU521686A HU198075B HU 198075 B HU198075 B HU 198075B HU 865216 A HU865216 A HU 865216A HU 521686 A HU521686 A HU 521686A HU 198075 B HU198075 B HU 198075B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
formula
dioxo
solution
priority
est
Prior art date
Application number
HU865216A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT45264A (en
Inventor
Jean A Hannart
Andre B Trouet
Kandakuri S Rao
Original Assignee
Omnichem Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from LU86212A external-priority patent/LU86212A1/fr
Priority claimed from LU86515A external-priority patent/LU86515A1/xx
Application filed by Omnichem Sa filed Critical Omnichem Sa
Publication of HUT45264A publication Critical patent/HUT45264A/hu
Publication of HU198075B publication Critical patent/HU198075B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D519/00—Heterocyclic compounds containing more than one system of two or more relevant hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system not provided for in groups C07D453/00 or C07D455/00
    • C07D519/04—Dimeric indole alkaloids, e.g. vincaleucoblastine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6805—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a vinca alkaloid
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
    • Y10S424/809—Drug, bio-affecting and body treating compositions involving immunoglobulin or antibody fragment, e.g. fab', fv, fc, heavy chain or light chain
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/807—Hapten conjugated with peptide or protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier
    • Y10S530/812—Peptides or proteins is immobilized on, or in, an organic carrier
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/827—Proteins from mammals or birds
    • Y10S530/828—Cancer
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/863—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof involving IgM
    • Y10S530/864—Monoclonal
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/866—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof involving immunoglobulin or antibody fragment, e.g. fab', fab, fv, fc, heavy chain or light chain

Landscapes

  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)

Description

A találmány tárgya eljárás új vinblasztin konjugátumok, valamint ezeket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására.
A találmány tárgya közelebbről indol-dihidroindoltípusú vinka alkaloidoknak fehérjékkel képzett konjugátumainak előállítására, amelyek gyógyászati, elsősorban citosztatikus hatással rendelkeznek.
Az indol-dihidroindol-típusú vinka alkaloidok, így a vinblasztin, vinkrisztin és vindezin, rákos megbetegedések kezelésére alkalmazhatók. A vegyületek kemoterápiás alkalmazása azonban a mellékhatások miatt korlátozott. A mellékhatások csökkentésére számos származékot szintetizáltak.
Ismert a vinblasztin és több származéka, így a vinkrisztin vagy vindezin fehérjékkel, például albuminnal vagy egyes immunoglobulinnal történő kapcsolása. A kapcsolt termékeket konjugátumnak nevezik.
Ezekkel a konjugátumokkal a következő irodalmi helyen foglalkoznak:
J. D. Teale, Jacqueline M, Clough és V. Marks. Br. J. Clin. Pharmac. 4,169-172 <1977);
C. H. J. Ford, C. E. Newman, J. R. Johnson, C. S. Woodhouse, T. A. Reeder, G. F. Rowland és R. G. Simnionds: Br. J. Cance, 47, 35—42 (1983);
M. J. Embleton, G. F. Rowland, R. G· Simnionds, E. Jacobs, C. H. Marsáén és R. W. Baldwin: Br. J. Cancer 47, 43-49 (1983);
J. R. Johnson, C. H. J. Ford, C. E. Newman, C. S. Woodhouse,G. F. Rowland és R. G. Simnionds: Br. J. Cancer, 44, 472-475 (1981);
322. számú európai közrebocsátási irat;
R. A. Condrad, G. J. Cuílinan, K. Gerson és G. A. Poore: J. Med. Chem. 22, 391 (1979);
137 210. számú nagybritanniai közrebocsátási irat; és
124 502. számú európai közrebocsátási irat.
A fenti indol-dihklroindul-dimcrck kapcsolásával nemcsak új immunológiai reagenseket, hanem olyan hatékony antitumor-hatású szereket nyertek, amelyek szelektivitása erősebb és toxieitása alacsonyabb.
Az eddig ismert kapcsolási eljárások általában az alábbi két típusba sorolhatók:
a) C3 kapcsolás azid-származék segítségével (56 322. számú európai közrebocsátási irat);
b) C4 kapcsolás a vinka alkaloid 4-es helyzetű szénatomján lévő hidroxil-csoportból kialakított észtercsoport segítségével (2 137 210. számú nagybritanniai közrebocsátási irat, és
124 502. számú európai közrebocsátási irat).
Az új konjugátumok előállításához az indol-dihidroindol-típusú vinka alkaloidokat a fehérjével szintén a vinka alkaloid 4-es helyzetű szénatomján lévő hidroxilcsoportból kialakított észtercsoport segítségével kapcsoljuk.
A találmány tárgya tehát eljárás az indol-dihidroindol-típusú vinka alkaloidok és ezek fehérjével képzett (I) általános képietű konjugátumainak előállítására, a képletben
Rí jelentése meicxi-karbonilcsoport,
R3 jelentése metilcsoport vagy -CHO csoport,
R4 jelentése hidroxilcsoport,
Rs jelentése etilcsoport,
A jelentése (a) vagy (b) általános képietű csoport, ahol
X jelentése 1 12 szénatomos egyenes szénláncú alkilénlánc, 2-5 szénatomos egyenes vagy elágazó szénláncú alkilidénlánc, benzil -oxi -karbonil -csoport tál szubsztituált 2-3 szénatomos alkilidénlánc,
Rí jelentése immunoglobulin vagy adott esetben galaktozilált humán albumin, amelynél valamely (A) általános képietű (2,5-dioxo3-pirrolin-l-il)-származékot, a képletben X jelentése a fenti, valamely (II) általános képietű C4-hidroxil-vegyülettel kondenzálunk, a képletben
R2, R3j R4 és Rs jelentése a fenti, és a kapott köztiterméket kívánt esetben immunoglobulinnal vagy adott esetben galaktozilált humán albuminnal kondenzáljuk.
Az új konjugátumokban tehát a fehérje egy olyan karon keresztül kapcsolódik a vinka vegyülethez, amelynek kialakításához a 4-dezacetil-indol-dihidroindol-vinka alkaloidot előzetesen egy (A) általános képietű (2,5-dioxo-3-pirrolin-l-il)-származékkal kondenzáljuk.
Ha a fent definiált származék aszimmetrikus centrummal rendelkezik, alkalmazható a reacém forma vagy az egyik, optikailag aktív forma.
A fenti definíción belül előnyösek azok az (I) általános képietű konjugátumok, ahol Rj jelentése immunoglobulin vagy adott esetben galaktozilált humán albumin,
R2, R3j R4 és R5, X jelentése a fenti.
Az (A) általános képietű vegyület előállítható N-alkoxi-maleinimid és aminosav kondenzációjával, éspedig glicinnel kondenzálva X = —CH2-, alaninnaí kondenzálva X = —CII(CII3)-, béta-alaninnal kondenzálva X — - CIl2-C1I2-, fenll-alaninnal kondenzálva X = —CH(CH2C6HS)-, alfa-amino-vajsavval kondenzálva X =-CH(CH2CH3)-, valinnal kondenzálva X = -CH-CH(CH3)2, norvalinnal kondenzálva
I
X =-CH-CH2-CH2~CII3, leucinnal kondenzálva I
X = -CH-CH2-CH(CH3)2, izoleucinnal kondenzálva I
X =-CH—CH(CH3)-C2H5,norleucinnal kondenzálva I
X = -CH-(CH2)3-CH3, 6-amino-kapronsawal kon!
dcnzálva X = —(ClI Jj-, 1 l-uiniiio-uiidekánsavval kondenzálva X = —(CH2)(3- és 12 amino-dodekánsawal kondenzálva X = -(CH2)n-.
Fehérjeként előnyösen alkalmazható szarvasmarha vagy humán szérum albumin, fetuin vagy immunoglobulin.
Az alkalmazott fehérje előzetes kezeléssel szelektíven módosítható. A módosított feiiérjét tartalmazó konjugátumok lehetővé teszik, hogy terápiás alkalmazás esetén a hatóanyag meghatározott szövetben, például a májban dúsuljon fel.
így például lehetőség van arra, hogy a vinka alka-23
198 075 loid-származékhoz történő kondenzálás előtt a fehérjét galaktolizáljuk.
A rosszindulatú scjtfclület antigénre specifikus immunoglobullnok, valamint immunizált állatok szérumából vagy monoklón antitestet kiválasztó hibridek tenyésztéséből történő előállítása ismert. A találmány szerinti eljáráshoz antitestként előnyösen alkalmazható a humán IgG osztályba tartozó immunoglobulin.
A találmány szerint azonban alkalmazhatók egyéb eredetű immunoglobulinokra is. Ezek néhány képviselői:
— karcioembrionális antigénnel immunizált kecske vagy juh lg;
— nyúl anti-LLA lg;
— majom anti-LLa, anti-LMA, anti-LLC, anti-LMC
Ig-k;
— tüdőrák membránjával immunizált kecske vagy juh lg;
— humán kolorektál karcinoma ellen antitestet kiválasztó egér hibridből származó monoklón lg;
— humán melanóma ellen antitest kiválasztó egér hibridből származó monoklón lg;
— humán leukémia sejtekkel reakcióba lépő antitestet kiválasztó egér hibridből származó monoklón lg;
— humán neuroblasztóma sejtekkel reakcióba lépő antitestet kiválasztó egér hibridből származó monoklón lg;
— humán mellrák antigénnel reakcióba lépő antitestet kiválasztó egér hibridből származó monoklón lg;
— humán petefészek rák sejtekkel reakcióba lépő antitestet kiválasztó egér hibridből származó monoklón lg;
— humán oszteoszarkóma sejtekkel reakcióba lépő antitestet kiválasztó egér hibridből származó monklón fg;
— tüdőrák antitestet kiválasztó egér hibridből származó monoklőm lg.
A fenti immunoglobulint az alábbi irodalmi helyek ismertetik:
— Ghose T. és Blair A. H.: „The Design of Cytotoxic Agent-Antibody Conjugates”, 3. kötet, 263-361 (1987), CRC Critical Revieuws in Therapeutic Drug Carrier Systems, — Baldwin R. W. és Byers V. S.: „Monoclonal Antibodies fór Canccr Detcclion and Thcrapy”, Academic Press, London—New York (1985), — Seii S. és Reisfeld R.: „Monoclonal Antibodies in Cancer”, Humana Press, Cliftoh-New Jersey (1985), — Thompson, C. H., Jones S. L., Phil. E. és Coll.: „Monoclonal Antibodies to Humán Colon and Colorectal Carcinoma” Brit. J. Cancer, 47, 595— 606 (1983), — Koprowsky H., Streplewski L., Herlyn D.: „Study of Antibodies against Humán Melanóma”, Proc. Nat. Acad. Sci. (USA), 75, 3405-3409 (1978), — Ritz J., Pcsando J. M„ Notis-McConarty J.: ,,A Monoclonal Antibody to Humán Acute Lymphoblastic Leukémia Antigén”, Natúré, 283, 583-585 (1980),
- Ball E. D„ Frangcr M. W.: „Monoclonal Antibodies
Rcactivc with Iluman Myeloid Leukémia Cells”,
Clin. Exp. Immunot, 48, 655 (1982),
- Kennet R. H., Gilbert R.: „Hybrid myelomes producing Antibodies against a Humán Neuroblastoma Antigén present of Fetal Brain”, Science,, 205,1120 1121(1979), — Thompson C. II., Whítchcad R. 11., McKcnzic L. F. C.: ,,A Humán Breast Associated Antigén Detected by a Monoclonal Antibody”., J. Nat. Cancer. Inst., 70, 409-420 (1983), — Leclef B. és Trouet A.: „Tumor Markers, Diagnosis, Imaging and Therapeutics of Canccr, Review IRE,
11. kötet 2 (1987),
- Masuko Y., Zalutsky M., Knapp R. C., Bast R C. Jr.: „Interactíon of Monoclonal Antibodies with Cell Surface Antigens of Humán Ovarian Carcinomas”, Rés. 44, 2813-2819 (1984), — Embleton M. J., Glunn B„ Bayers B. S.: „Antitumor Reactions pf Monoclonal Antibody Against a Humán Osteogenic Sarcoma Cell Line”, Brit. J. Cancer, 78, 1791-1795 (1981),
- Sikora K., Wrigth R.: „Humán Monoclonal Antibodies to Lung Cancer Antigens”, Brit J. Cancer, 43, 696-700 (1981), — Ball E. D., Grazziano R. F., Péttengill O. S., Sorenson G. D., Frangcr M. W.: „Monoclonal Antibodies Reactive with Small Ceti Carcinoma of tbc Lung”, J. Nat. Cancer Inst. 72, 593-598 (1987).
A konjugátumok előállíthatok immunoglobulin fragmensekkel is, így Fab, Fab' vagy Ffab'^ fragmensekkcl, vagy monomer IgM-mcl, amelyeket az antitestből protcolitikns enzimmel emésztve nyerünk ki.
A konjugátumok találmány szerinti előállítása során az első lépésben (A) általános képletű vegyületet (II) általános képletű 4-dezacetil-indol-dihidroíndol-vinka-alkaloid 4-es helyzetű szénatomjáhozkapcsolódó hidroxilcsoporttal kondenzálva (III) általános képletű származékot kapunk, amelyben
X, R2, R3, R4 és Rs jelentése a fenti.
A második lépésben a (III) általános képletű származékot fehérjével kondenzáljuk, a fehérje szabad tiol-csoportjainak vagy szabad aminocsoportjainak például a fehérje lizincsoportjaihól származó aminocsoportjainak a pirrolingyűrű ofcfmcs kettó's kötésére Michacl-féle addíciós mechanizmussal történő addicionálásával (Means G. E. és Feeney R. E.: Chemical modofications of proteins, 110—138 (1971), Holdén Day Inc., San Francisco, USA), az eljárás során (I) általános képletű konjugátum keletkezik.
Kémiai szempontból:
(A) általános képletű vegyülct előállítását O. Keller és J. Rudinger: Helv. 58, 531 (1975); D. H. Rich, P. D. Gesselchen, A. Tong, A. Cheung és C. K. Buckner: J. Med. Chem. 18, 1004 (1975) és A. Sato és M. Nakao: J. Biochem. 90, 1117 (1981) módszerével végezzük;
(A) általános képletű vegyülct és a vinka alkaloid kondenzációja megvalósítható a szokásos módon,
198 075 klórhangyasav-alkilészter, előnyösen klórliangyasavetil- vagy izobutilészter segítségével amin-bázis, így trietil-amin, N-mctil-pipcridin vagy N-mctil-morfolin jelenlétében szerves oldószerben, így etil-acetátban, tetrahidrofuránban vagy metilén-kloridban.
A kapott származékot izoláljuk a reakcióelegyből és a kémiában szokásos módszerekkel tisztítjuk.
A vinka-alkaloiddal történő kondenzációhoz az (A) általános képletű vegyület karboxil-csoportja bármely más módszerrel, például a peptid-kánuában alkalmazott módszerekkel is aktiválható.
A konjugátum előállítása során eljárhatunk úgy is, hogy a fehérjét, a poliklón vagy monoklón antitestet a (III) általános képletű vinka vegyülettel szokásos körülmények között, például vizes közegben 4—40 °C közötti hőmérsékleten és pH = 7,5-9,5 értéken reagáltatjuk.
A rögzített csoportok száma a reagens koncentrációjától és a reakcióidőtől függ, de az átlagos szám általában 5—20 között van.
Az eljárás megvalósítása során eljárhatunk úgy, hogy a (III) általános képletű vegyület szerves oldószerben, így dioxánban felvett oldatát a feliérje pufférolt, például 0,1 mól/liter foszfátpufferral pH = 8,2 értékre beállított oldatához csepegtetjük. Az elegyet egy éjszakán keresztül szobahőmérsékleten állni hagyjuk, majd a konjugátumot gélszűréssel izoláljuk, ultraszűréssel koncentráljuk és sterilizáljuk. A fehérjetartalmat Lowry módszerével mérjük, míg az alkaloidtartalmat a radioaktivitás mérésével határozzuk meg.
A konjugátumok in vitro és in vivő vizsgálatával megállapítottuk, hogy az (A) általános képletű vegyiiletből származó (a) vagy (b) általános képletű oldalláncot tartalmazó konjugátumok lényegesen előnyösebb tumor elleni hatást mutatnak, mint az —0—CO—X—CO- láncot tartalmazó konjugátumok.
Az oldallánc lehetővé teszi, hogy a fehérjét, vagy fehérjefragmenst mind a szabad aminocsoportokon, mind a szabad tiolcsoportokon keresztül megkössük. Emellett, lizozomál enzimmel végzett emésztés azt mutatja, hogy a vinka alkaloid sokkal nagyobb arányban szabadul fel malcoillánc esetén. A konjugátum tehát szérumban és savas pH-η stabil.
A vegyületeket BDFi egereken vizsgáltuk, amelyekbe intraperitoneálisan P388 leukémiát ültettünk be. Az első eredmények azt mutatják, hogy a vegyületek jelentős hatást fejtenek ki a vizsgált modellben, mivel megnövelték a túlélés idejét.
Az új konjugátumok tehát előnyös és a humán terápiában felhasználható antitumor hatással rendelkeznek.
A hatóanyagot előnyösen parenterálisan, gyógyászatilag alkalmazható oldószerben oldva alkalmazzuk.. Oldószerként alkalmazható fiziológiás sóoldat vagy más pufferolt, például foszfátpufferrel beállított oldószer. A hatóanyag dózisa általában 50 még és néhány gramm között változik.
Az új hatóanyagok más antitumor szerekkel kombinálhatok.
A találmány szerinti eljárást a következő példákkal vüágítjuk meg, az oltalmi kör korlátozása nélkül.
1. példa
N-Meioxikarbonil-tnaleiniinid
3,8 g (0,04 mól) és 4 g (0,04 mól) trietil-amin 150 ml etil-acetátban felvett oldatát 0 °C hőmérsékleten 3 ml (0,04 mól) metil-kloroforrnát 20 ml etilacetátban felvett oldatával kezeljük. Az elegyet 1 órán keresztül keverjük, a csapadékot szűrjük és etil-aeetáttal mossuk. Az egyesített szerves fázisokat vízzel mossuk, vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk és vákuumban szárazra pároljuk. A maradékot etii-acetát/izopropil-éter elegyben kristályosítva 4,19 g N-metoxikarbonil-malcinimidct kapunk.
NMR spektrum: (CDCI3, δ), 6.75 (2H, s), 3.9 (3H,s).
2. példa
-(2,5-dioxo-3-pirrolin-l -il)-í -etdnkarbonsav
2,3 g (0,025 mól) L-alauln 100 írd telített nátriumhidrogén-karbonát oldatban felvett oldatát 0 °C hőmérsékleten intenzív keverés közben 3,87 g (0,025 mól) N-metoxikarbonil-maleinimiddal kezeljük. Egy óra elteltével az oldatot 200 mi vízzel hígítjuk és 40 °C hőmérsékleten egy órán keresztül keverjük. Az oldatot (pH = 8,2) koncentrált kénsav segítségével pH = 6,4 értékre állítjuk. Ezután 100 ml térfogatra bepároljuk és 1 mól/liter kénsav segítségével pH = 2 értékre állítjuk. Etil-acetáttal háromszor extraháljuk, az egyesített szerves fázisokat vízmentes nátriumszulfáton szárítjuk és vákuumban szárazra pároljuk. A maradékot szilikagélen kloroforin/ccctsav 95 :5 eleggyel kromatográfiásan tisztítjuk. így 1,2 g (1-(2,5dioxo -3 -pirrolin-1 -il)-1 -e tánkarboiisavat kapunk.
Kitermelés: 48%.
ÍR spektrum (KBr) cm-1: 3400, 3100, 2930, 1780, 1740, 1700, 1460, 1420, 1390, 1370, r345, 1220, 1175, 1118,1080,1068,1015,970,835,700.
NMR spektrum (CDClj,δ): 6.7 (2H, s); 4.8 (1II,g);
1.65 (3H, d).
3. példa
5-( 2,5-dioxo-3-pirrolin-J -il}-] -pentánkarbotisav
4,2 g (32,3 mmól) 5-amino-l-pentánkarbonsav 163 ml telített nátrium-hidrogén-karbonát oldatban felvett oldatát 0 °C hőmérsékleten intenzív keverés közben 5 g (32,3 mmól) N-metoxi-karbonil-maleinimiddel kezeljük. Egy óra elteltével az oldatot 256 ml vízzel hígítjuk és szobahőmérsékleten egy órán keresztül keverjük. Az oldatot (pH = 8,2) koncentrált kénsavval pH = 6,4 értékre állítjuk. Ezután 100 ml térfogatra bepároljuk és 1 mól/liter kénsawal pH = 2 értékre állítjuk. Etil-acetáttal háromszor extrabáljuk, az egyesített szerves fázisokat vízmentes nátriumszulfáton szárítjuk és vákuumban szárazra pároljuk.
-4Ί
198 075
A maradékot szilikagélen kloroform/ecetsav 95:5 eleggyel kromatográfiásan tisztítjuk. így 4,7 g5-(2,5dioxo-3-pírrólin-141)-1 -pentánkarbonsavat kapunk.
Kitermelés: 51%.
IR spektrum (KBr) cm-1): 3,090; 2,940; 2,880; 1,770; 1,710; 1,470; 1,450; 1,380; 1,370; 1,340; 1,315; 1,260; 1,210; 1,135; 1,110; 1,140; 1,100; 1,015; 1,000; 815; 840; 735; 700.
4. példa
1Y 2,5-dioxo-3-pirrolin-l -il)-3-mctoxi-karbonilI-propánkarbonsav g (6,2 mmól) L-glutaminsav-gamma-metilészter
31,2 ml telített nátrium-hidrogén-karbonát oldatban felvett oldatát 0 °C hőmérsékleten intenzív keverés közben 961 mg (6,2 mmól) N-nietoxi-karbonil-maleinimiddel kezeljük. Egy óra elteltével az oldatot 126 ml vízzel hígítjuk és 40 °C hőmérsékleten egy órán keresztül keverjük. Az oldatot (pH = 8,2) koncentrált kénsavval pH = 6,4 értékre állítjuk,majd 50 ml térfogatra bepároljuk és 1 mól/liter kénsavval pH=2-értékre állítjuk. Etil-acetáttal háromszor extraháljuk, az egyesített fázisokat vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk és vákuumban szárazra pároljuk. A maradékot szilikagélen kloroform/ecetsav 95 :5 eleggyel kromatográfiásan tisztítjuk. így 956 mg tiszta terméket kapunk.
Kitermelés: 49%.
NMR spektrum 60: 7.9 (s, H); 6.5 (s, maleinimid);
4.6 (m, CH); 3.5 (s, 0CH3); 2.3 (m, glu CHJ.
IR spektrum (KBr) cm-1: 3,470, 3,110, 2,960, 2,600, 1,775, 1,750-1,690, 1,440, 1,410, 1,2651,150,1,090, 1,015,830,700.
5. példa
1-(2,5 -dioxo-3-pirrolin -1 -il)-2-metil-l-bu tánkarbonsav
A 2. példában leírt módon 1-(2,5-dioxo-3-pirrolinl-il)-2-nietil-l-butánkarbonsavat kapunk 424 mg (3,22 mmól) L-izoleucinból 500 mg (3(2 mmól) Nmetoxi-karbonil-maleinimid segítségével.
Kitermelés: 20%.
Tömegspektrum (CDI, izobután): 423 (2M +1), 352,270,212 (M+-l), 188,166,132,123.
NMR spektrum (CDC13, δ): 8,55 (váll, OH); 6.85 (2, s, maleinimid, kettős kötés); 4.65 (t, d, C*I1);
2.6 (tn, 1, CII); 1.28 (d,CHJ, 1.1 (tn.CIIJ.
6. példa
2-( 2,5 -dioxo-3-pirrolin-l -il)-2-benzil-oxi-karbonil1-etánkarbonsav g (4,48 mmól) L-aszparaginsav-alfa-benzilészter 22,5 ml telített nátrium-hidrogén-karbonát oldatban felvett oldatát 0 °C hőmérsékleten intenzív keverés közben 694 mg (4,48 mmól) N-metoxi-karbonilmalcinimiddel kezeljük. Egy óra elteltével az oldatot 91 ml vízzel hígítjuk és 40 °C hőmérsékleten egy órán keresztül keverjük. Az oldatot (pH = 8,2) koncentrált kénsavval pH = 6,4 értékre állítjuk, 50 ml térfogatra bcpároljuk és 1 ínól/litcr kénsavval pH = 2 értékre állítjuk. Etü-acetáttal háromszor extraháljuk, az egyesített szerves fázisokat vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk és vákuumban szárazra pároljuk. A maradékot szilikagélen kloroform/ecetsav 95:5 eleggyel kromatográfiásan tisztítjuk. így 267 mg tiszta terméket kapunk.
Kitermelés: 20%.
NMR spektrum (CD30D, 60 Mllz, ppm): 7.1 (511. in, benzil H); 6.6 (2H, s, maleinimid sb), 5 (2H, s, benzil CH2); 3.1 (2H, m, CHJ.
IR spektrum (KBr) cm-1): 3060, 1765, 1745, 1720,1410,1270,830,740, 750.
7. példa
10-(2,5-dioxo-3-pirroliti-l-il)-l-dekánkarbonsav
2,4 g (24,8 mmól) malein-anhidrid 10,1 ml ecetsavban felvett oldatát 5 g (24,8 mmól) 10-amino-ldekánkarbonsav 30 ml ecetsavban felvett oldalához adagoljuk és az elegyet intenzív keverés közben 3 órán keresztül szobahőmérsékleten tartjuk. A fehér csapadékot kiszűrjük, hideg ecetsavval mossuk és szárítjuk (6,3 g, 21,1 mmól, 85 %). 3 g (10,0 mmól) csapadékot 300 ml száraz toluolban oldunk és 2 g (22,2 mmól) trietil-aminnal kezeljük. Az oldatot Dean-Stark berendezésen intenzív keverés közben a toluol teljes bepárlásáig refluxáljuk. A terméket szilikagélen kloroform/ecetsav 95 :5 eleggyel kromatográfiásan tisztítjuk. így 1,06 g 10-(2,5-dioxo-3-pirrolin-l-il)-l-dekánkarbonsavat kapunk.
Kitermelés: 37%.
NMR spektrum (60 MHz, CDC13, ppm): 8.8 (bp, COOH); 6.5 (2H, s, maleinimid, db); 3.4 (2H, m, CHJ; 2.3 (2H, m, CHJ; 1.2 (16H,bp, 8CHJ.
IR spektrum (KBr) cm J: 3450, 3100, 2910, 2850, 1770, 1700, 1610, 1590, 1470, 1450, 1420, 1375, 1340, 1310, 1280, 1240, 1180, 1125, 840, 700.
8. példa ll-(2,5-dioxo-3-pirrolin-l-il)-l-undckánkarbonsav
2,28 g (23,22 mmól) malein-anhidrid 9,6 ml ccctsavban felvett oldatát 5 g (23,22 mmól) 11-aniino-lundekánkarbonsav 28 ml ecetsavban felvett oldatához adagoljuk és az elegyet intenzív keverés közben 3 órán keresztül szobahőmérsékleten tartjuk. A fehér csapadékot kiszűrjük, hideg ecetsavval mossuk és szárítjuk (6,2 g, 20,9 mmól, 86%). 4,9 g (15,9 mmól) csapadékot 500 ml száraz toluolban oldunk és 4,9 ml (35 nunól) trietil-aminnal kezeljük. Az oldatot DeanStark berendezésen intenzív keverés közben a toluol teljes lepárlásáig refluxáljuk. A terméket szilikagélen kloroform/ecetsav 95 :5 eleggyel kromatográfiásan 5
198 075 tisztítjuk. így 1,38 g 1 l-(2,5-dioxo-3-prrrolin-l-il)-lundekánkarbonsavat kapunk.
Kitermelés: 29%.
NMR spektrum (60 MHz, CDC13, ppm): 6.52 (2H, s, maleinimid db); 3.42 (211, m, C1I2); 2.3 (211, m, CH2); 1.25 (18H, széles csúcs, 9-CH2-).
IR spektrum (KBr) cm-1): 3450, 3080, 2920, 2825, 1770, 1470, 1450, 1440, 1415, 1380, 1340, 1300,1260, 1250,1205,1120,920,840,700.
9. példa
4-[l Y 2,5-dioxo-3-pirrolin-l -i!}-etil-karbo/iil-oxi]vinblasztin
1,17 ml (0,009 mól) klórhangyasav-izobutilészter ml etil-acetátban felvett oldatát 1,52 g (0,009 mól) l-(2,5-dioxo-3-pirrolin-l-il)-l-etánkarbonsav és 1,25 ml (0,009 mól) trietil-amin 10 ml etil-acetátban felvett oldatához csepegtetjük 0 °C hó'mérsékleten. Az elegyet 1,5 órán keresztül 0 °C hőmérsékleten keverjük, majd ezen a hőmérsékleten 2,3 g (0,003 mól) O4-dezacetil-vinblasztin 20 ml etil-acetátban felvett oldatát adjuk hozzá. Az elegyet hagyjuk szobahőmérsékletre melegedni, majd 10 órán keresztül keverjük. Hozzáadunk 50 ml etil-acetátot és 50 ml 10 tömeg%-ös, vizes nátrium-karbonát oldatot. Az elegyet keverjük, a szerves fázist dekantáljuk és elválasztjuk. A vizes fázist etil-acetáttal háromszor extraháljuk. Az egyesített szerves fázisokat vizes oldattal mossuk, magnézium-szulfáton szárítjuk és vákuumban szárazra pároljuk. A maradékot szilikagélen diklór-metán/metanol 92:8 eleggyel kromatográfiásan tisztítjuk. így 1,86 g tiszta terméket kapunk, kitermelés: 67,6%,
Tömegspektrum (DC1, izobután). 935 (M + 14), 922 (M + l), 921 (M), 751,693,519,445,371, 133.
NMR spektrum (CDC13, 360 MHz, ppm): 8 (NH, IH); 7.5-7 (4H, H-9', Π-Ι0', H-l l’, H -12'); 6.7 (211, anhidrid); 6.55 (ill, U—14); 6.05 (111, H-17); 5.85 (IH, H-7); 5.45 (IH, H-4); 5.15 (IH, H-6); 4.8 (IH CH); 3.95 (IH, H-17'); 3.85 (3H, -OMe); 3.78 (3H, -OMe); 3.7 (IH, H-2); 3.6 (3H, -OMe);
2.7 (3H, NMe); 1.72 (311, etil-, CH3); 0,9-0,8 (6H, CH3—21, Cll3 —21').
10. példa
4-[5-(2,5-dioxo-3-pirrolin-l-il)-pentil-karboniloxi]vinblasztin
371 mikroliter (2,861 mmól) klórhangyasav-izobutilészter 1 ml ctil-acetálban felvett oldatát 604 mg (2,861 mmól) 5-(2,5-dioxo-3-pirrolin-l-il)-l -pentánkarbonsav és 514 mikroliter (4,65 mmól) N-metilmorfolin 4 ml etil-acetátban felvett oldatához csepegtetjük 0 °C hőmérsékleten. Az elegyet 3 órán keresztül 0 C hőmérsékleten keverjük, majd ezen a hőmérsékleten 550 mg (0,715 mmól) O4-dezacetil-vínblasztin 1 ml etil-acetátban felvett oldatát adjuk hozzá. Az elegyet hagyjuk szobahőmérsékletre melegedni, majd 10 órán keresztül keverjük. Az oldatot szűrjük és az etil-acetát fázist vákuumban szárazra pároljuk. A maradékot szilikagélen diklór-metán/me6 tanol 96:4 eleggyel kromatográfiásan tisztítjuk. így 263 mg tiszta terméket kapunk.
Kitermelés: 23%.
Tömegspektrum (DC1, izobután): 993; 979; 965 (M+ + 4); 963 (M*+2);961 (M4); 946; 933; 920; 906; 812;754;693.
IR spektrum (KBr) cm *): 3,400; 3,050; 2,940; 1,740; 1,700; 1,615; 1,500; 1,460; 1,440; 1,410; 1,370; 1,220; 1,170; 1,040.
NMR spektrum (CDClj, 360 MHz, ppm): 7.47— 7,12 (4H, m, Η11', Η12', Η13' H14'); 6.65 (2H, s, maleinimid db::); 6.55 (14, s, H14); 6.05 (IH, s, H17); 5.82 (Ili, m, II7); 5.42 (111, s, II4); 5.25 (III, nr, Hó); 3.92 (IH, m, H17'); 3.77 (6H, s, OCH3, C23OOCH3); 3.70 (IH, s, H2); 3.6 (3H, s, C18' OOCH3); 2.7 (3H, s, NCH3); 2.32 (m, pentilcsoport CH2); 1.62 (m, pentilcsoport CH2); 0.9—0.8 (6H, t, CH3—21 + CH3—21 )..
11. példa
4-{ 1 j2,5-dioxo-3-pirrolin-l -il)-3-mctoxi-karbonilpropil-karbonil-oxii-vinblasztin
152 mikroliter (1,170 mmól) klórhangyasav-izobutilészter 1 mi ctil-acctálbau felvett oldatát 282 mg (1,170 mól) l-(2,5-dioxo-3-pirrolin-l-il)-3-metoxÍ· karbonil-l-propánkarbonsav és 163 mikroliter (1,170 mmól) trietil-amin 1,4 ml etil-acetátban felvett oldatához csepegtetjük 0 °C hőmérsékleten. Az elegyet 4 percen keresztül 0 °C hőmérsékleten keverjük, majd ezen a hőmérsékleten 300 mg (0,390 mmól) O4-dezacetií-vinblasztin 1 ml etil-acetátban felvett oldatát adjuk hozzá. Az elegyet hagyjuk szobahőmérsékletre melegedni és 10 órán keresztül keverjük. Az oldatot szűrjük, a szerves fázist vákuumban bepároljuk. A maradékot szilikagélen etanol/etil-acetát 30:90 eleggyel kromatográfiásan tisztítjuk. így 222 mg tiszta terméket kapunk.
Kitermelés: 38%.
Tömegspektrum (DC1, izobután): 1,036, 1,022, 1,009, 995 (M++4), 992 (M4+í), 937, 885, 811, 751,694,635,541.
NMR spektrum (CDCi3, 360 MHz, ppm): 9.4 (III, nr, OH); 8 (IH, s, ind. NH); 7.5-7.20 (4H, m, H11', Η12', Η13', H14'); 6.7 (2H, s. maleinimid db); 6.58 (IH, s, H14); 6.05 (IH, s, H17); 5.80 (1H, nr, H7); 5.48 (IH, s, H4); 5.25 (IH, nr, H6); 4.73 (IH m, GIu CH*); 3.95 (IH, nr, H!7');3.85 (3H, s, ar OCH3): 3.75 (3H, s, C23OOCH3); 3.63 (3H, s, C18'OOCH3): 3.58 (3H, s, Glu OCH3); 2.80 (3H, s, NCH3);'2.38 (ni, Glu CII2); 0.9-0.8 (6Π, t, CH-,21 + ClI321').
ÍR spektrum (KBr) cin-1: 3,430, 1,740, 1,715, 1,615, 1,500, 1,460, 1,430, 1,405, 1,385, 1,250, 1,225, 1,030, 1,005,825.
12. példa
4-[l-(2,5-dioxo-3-pirrolin-l-il)-2-metil'butilkarbonil-oxi\-vinblasztm mikroliter (0,7109 mmól) klórhangyasav-izobutilészter 1 ml etil-acetátban felvett oldatát 150 mg
-611
198 075 (0,7109 mmól) 1-(2,5-dioxo-3-pirrolin-l.-il)-2-metil1-butánkarbonsav és 99 mikroliter (0,7109 mmól) trietil-amin 1 ml etil-acetátban felvett oldatához csepegtetjük 0 °C hőmérsékleten. Az elegyet 3 percen keresztül 0 °C hőmérsékleten keverjük,'· majd ezen a hőmérsékleten 182 mg (0,237 mmól) O4-dezacetilvinblasztin 1 ml etil-acetátban felvett oldatát adjuk hozzá. Az elegyet hagyjuk szobahőmérsékletre melegedni és 10 órán keresztül keverjük. Az oldatot szűrjük és az etil-acetát fázist vákuumban szárazra pároljuk. A maradékot szilikagélen etanol/etil-acetát 30:90 eleggyel kromatográfiásan tisztítjuk. így 133 mg tiszta terméket kapunk.
Kitermelés: 40%.
Törnegspektrum (DC1, aceton): 1,039; 963 (M++2); 904; 812; 769; 728; 637; 593; 549.
IR spektrum (KBr) cm-1): 3,480-3,400; 2,960; 2,920; 2,880; 1,775; 1,740; 1,710; 1,610; 1,500; 1,460; 1,430; 1,380; 1,250; 1,220; 1,040; 1,000; 830;740.
NMR-spektrum (CDC13, 360 mHz, ppm): 9.4 (m, OI1); 7.5-7.1 (411, m, arom.CIl, 11'-12'-13-14');
6.65 (2H, s, d, maleinimid, db); 6.6 (111, s, C14-H); 6.05 (1H, s, C17-H); 5.8 (111, s, C7-H);5.45 (lH,s, C4-H); 5.25 (1H, m, C6-H); 4.5 (1H, d, C-H); 3.95 (1H, m, H17'); 3.8 (3H, s, 0CH3 ar). 3.75 (3H, s, C23OOCH3); 3.7 (1H, s, H2); 3.6 (3H, s, C18'OOCH3);
2.65 (3H, s, NCH3); 1.1 (d, 311, izoleucin CH3); 0.90.8 (9H, m, izoleucin CII3 + C1I3-2Í+ CH3-21).
13. példa
4-[2-(2,5-dioxo-3-pirrolin-l -il)-2-benziI-oxikarbonil-oxi]-vinblasztin
114 mikroliter (0,88 mmól) klórhangyasav-izobutilészter 1 ml etilacetátban felvett oldatát 267 mg (0,88 mmól) 2-(2,5-dioxo-3-pirrolin-l-il)-2-benzil-oxlkarbonil-l-etánkarbonsav és 118 mikroliter (0,88 mmól) trietil-amin 1 ml etil-acetátban felvett oldatához csepegtetjük, 0 C hőmérsékleten. Az elegyet 4 percen keresztül 0 °C hőmérsékleten keverjük, majd ezen a hőmérsékleten 227 mg (0,29 mmól) O4-dezacetil-vinblasztin 1 ml etil-acetátban felvett oldatát adjuk hozzá. Az elegyet hagyjuk szobahőmérsékletre melegedni és egy éjszakán keresztül keverjük. Az oldatot szűrjük és a szerves fázist vákuumban hepároijuk. A maradékot szilikagélen etanol/etil-acetát 30:90 eleggyel kromatográfiásan tisztítjuk. így 105 mg tiszta terméket kapunk.
Kitermelés: 34%.
NMR spektrum (CDC13, 360 MHz, ppm): 8.05 (1H, s, ind. 16', NH); 7.5-7.17 (4H, m, Η^Ή^Ή^Ή14'); 7.37—7.3 (5H, m, benzil H); 6.75 (2H, s, maleinimid db); 6.60 (1H, s, H14); 6.10 (1H, s, H17); 5.87 (1H, m, H7); 5.45 (1H, s, H4); 5.30 (1H, m, H6); 5.20 (2H, m, benzil CH2); 3.95 (1H, m, H17'); 3.83-3.75 (6H, s, 0CH3 + COOCH3 23); 3.70 (1H, s, H2); 3.62 (3H, s, C18'OOCn3); 2.60 (311, s, NCH3); 0.9 -0.8 (611, t, CH3-21 + CH3-2l').
IR spektrum (KBr) cm 2: 3460, 3030, 2960, 2880, 1770, 1740, 1715, 1610, 1500, 1460, 1430,
1410, 1380, 1260, 1220, 1175, 1110, 1025, 910,
800,730,700.
Töincgspcklrum (DC1, izobután): 1085, 1071, 1057, 1054,1039, 1023,1013,768,708,542, 158.
14. példa
4-[l0-(2,5-dioxo-3-pirrolin-l-il)-dckanil-karlmmloxi)-vinblasztin
218 mikroliter (1,69 mmól) klórhangyasav-izobutilészter 1 ml etil-acetátban felvett oldatát 476 mg (1,69 mmól) 10-(2,5-dioxo-3-pirrolin-l-il>l-dekánkarbonsav és 326 mikroliter (2,8 mmól) N-metilmorfolin 3 ml etil-acetátban felvett oldatához csepegtetjük 0 °C hőmérsékleten. Az elegyet 3 percen keresztül 0 °C hőmérsékleten keverjük, majd ezen a hőmérsékleten 433 mg (0,56 mmól) 04-dezacetilvinblasztin 1 ml etil-acetátban felvett oldatát adjuk hozzá. Az elegyet hagyjuk szobahőmérsékletre melegedni és egy éjszakán kérésziül keverjük. Az oldatot szűrjük és az etil-acetát fázist vákuumban szárazra pároljuk. A maradékot szilikagélen etanol/etil-acetát 30:90 eleggyel kromatográfiásan tisztítjuk. így 240 mg tiszta terméket kapunk.
Kitermelés: 41%.
NMR spektrum (CDC13, 360 MHz ppm):
RMN (CDC1-», 360 MHz, ppm): 8 Ilii, s, ind16' N1I); 7.5-7.13 (411, m, Hn’ll12 n13 !!1^'); 6.68 (211, s, maleinimid, db); 6.63 (1H, s, H14); 6.10 (1H, s, H17); 5.83 (1H, m,H7);5.48 (1H, s,H4); 5.25 (lH,m,H6); 3.95 (1H, m, H17'); 3.80 (6H, s, 0CH3 + C23OOCH3); 3.73 (1H, s, H2); 3.6 (3H, s, C18OOCII3); 2.7 (3H, s, NCH3); 1.28 (16Π. széles csúcs, Cll2 ); 0.88 0.8 (6H,t, CH3-21 + δ CH3-2l').
IR spektrum (KBr) cm 1: 3430, 3040, 2930, 2860, 1770, 1735, 1710, 1615, 1505, 1460, 1410, 1370,1230-1250,1000-1100.
Törnegspektrum (DC1, izobután): 1089, 1064, 1048,1034,1000,990,976,960.
75. példa
4-{ll-{2,5-dioxo -3-pirrolin -1 -il)-undekaml-karbomloxi\-vinblasztin
307 mikroliter (2,37 mmól) kiórhangyasav-izobutilészter 1 ml etil-acetátban felvett oldatát 699 mg (2,37 mmól) 11-(2,5-dioxo-3-pirrolin-l-il)-l-undekánkarbonsav és 433 mikroliter (3,95 mmól) N-metilmorfolin 4,2 ml etil-acetátban felvett oldatához csepegtetjük 0 °C hőmérsékleten. Az elegyet 3 percen keresztül 0 °C hőmérsékleten keverjük, majd ezen a hőmérsékleten 607 mg (0,79 mmól) O4-dezacetilvinblasztin 1 ml etil-acetátban felvett oldatát adjuk hozzá. Az elegyet hagyjuk szobahőmérsékletre melegedni és egy éjszakán keresztül keverjük. Az oldatot szűrjük és az etil-acetát fázist vákuumban szárazra pároljuk. A maradékot szilikagélen ctiinol/etil-acetát 30:90 eleggyel kromatográfiásan tisztítjuk. így 271 mg tiszta terméket kapunk.
-713
198 075
Kitermelés: 33%.
NMR spektrum (CDC13, 360 MHz, ppm): 8 (IH, s, ind16’ N11); 7.5-7.10 (411, m, H1I>H,2'H13'H14');
6.65 (211, s, malainimid, db); 6.60 (III, s, II14); 6.08 (IH, s, H17); 5.83 (IH, m, H7); 5.48 (ILI, s, H4); 5.25 (IH, d, H6); 3.95 (IH, in, H17'); 3.78 (6H, s, -OCH3+ C23OOCH3); 3.73 (IH, s, H2); 3.6 (3H, s, C18'OOCH3); 2.7 (3H, s, NCH3); 1.25 (20H, ni, ~CII2-); 0.9 0.8 (611, 5, Cllj-21 + CII3 21').
ÍR spektrum (KBr) cm-1: 3460, 3040, 2930, 2860, 1735, 1700, 1610, 1500, 1460, 1430, 1410, 1365, 1245,1220.
Tömegspektrum (DC1, izobután): 1063, 1046 (M++ 1),1037,1028,1016,312,117.
16. példa
4-[l-(2,5-dioxo-3-pirrolin-l -il)-etil-karbonil-oxi}vinblasztin és lizin-etil-észter kapcsolása
150 mg (0,163 mmól) 4-(1-(2,5-dioxo-3-pirrolinl-il)-etil-karboni!-oxi]-vinblasztin 1 ml etanolban felvett oldatát 40,26 mg (0,163 mmól) lizin-etil-észter XHC1 és 150 mikroliter (0,978 mmól) trietilamin
7,5 ml abszolút etanolban felvett oldatához csepegtetjük. Az elegyet egy éjszakán keresztül szobahőmérsékleten keverjük, majd az oldatot bepároljuk. A maradékot sziiikagélen 14 töineg%-os MeOH/NH3 éteres elcgyével kromatográfiásan tisztítjuk. így
101,2 mg tiszta terméket kapunk..
Kitermelés: 67%.
Tömegspektrum (DC1, izobután): 1,095 (M++2); 1,094 (M++1); 1,037; 921; 839; 769;'693; 615; 574;532.
IR spektrum (KBr) cm-1: 3,460; 2,940; 1,740; 1,710; 1,615; 1,500; 1,460; 1,430; 1,590; 1,250, 1,225; 1,120; 1,010; 735.
NMR spektrum (CDC13, 360 MHz, ppm): 8 (IH, NH, 16'); 7.5-7.1 (4H, Η11' Η12', Η13 , H14'); 66 (IH, s, H14); 6.08 (IH, s, H17); 5.8 (IH, m, H7); 5,45 (IH, s, H4); 5,3 (IH, m, H6); 4.8 (1H, m, CH::); 4,18 (2H, q, -OCHj); 3,83 (3H,s, 0CH3); 3,78 (311, s, 0CH3); 3,6 (3H, s, OMe), 2,68 (3H s, NCH3);
1.65 (3H, d, etil CH3); 1,43 (2H, s), 1.28 (CH3, 0CHjCH3); 0.9-0.8 (6H, CH3-21 +CH3-2Í).
17. példa
4-[l Y 2,5-dioxo-3-pirrolin-l-il)-etil-karbonil-oxi]vinblasztin és galaktoziláít humán albumin (HAgal) kapcsolása mg 4-(1-(2,5-dioxo-3-pirrolin-l-il)-etil-karboniloxi]-vinblasztint 1 ml dioxánban oldunk. Ettől külön 50 mg HAgal-t 5 ml 0,2 mól/liter foszfát-pufferben (pH = 8,5) oldunk. A 4-(1-(2,5-dioxo-3-pirrolin-l-il)etil-karbonil-oxi]-vinblasztin oldatát a HAgal oldatához adjuk. Az elegyet egy éjszakán keresztül szobahőmérsékleten keverjük, majd 0,9 tömeg%-os nátriumklorid oldatra (pH = 7,5) kiegyensúlyozott SephadexG25 (2,6X96 cm) segítségével gélszűréssel tisztítjuk. 8
A kihajtott csúcsot összegyűjtjük, ultraszűréssel koncentráljuk és sterilizáljuk.
A fehérjetartalmat Lowry módszerével és az alkaloidtartalmat radioaktivitás mérésével határozzuk meg. A kapott konjugátum 13,5 mól alkaloidot tartalmaz 1 mól galaktoziláít humán albuminra számítva.
13. példa
4-[5-(2,5-dioxo-3-pirrolin-l-il)-pentil-karbonil-oxi]vinblasztin és galaktoziláít humán albumin (HAgal) kapcsolása
234 mg 4-(5-(2,5-dioxo-3-pirrolin-l-il)-pentil-karbonil-oxi]-vinblasztint 1 ml dioxánban oldunk. Ettől külön 50 mg HAgal-t 5 ml 0,2 mól/litcr foszfátpufferben (pH = 8,5) oldunk. A 4-(5-(2,5-dioxo-3-pirrolin-lil)-pentil-karbonil-oxi]-vinbJasztin oldatát a HAgal oldatához adjuk. Az elegyet egy éjszakán keresztül szobahőmérsékleten keverjük, majd 0,9 tömeg%-os nátrium-klorid oldatra (pH = 7,5) beállított Scpliadex-G25 (2,6X96 cm) segítségével gélszűréssel tisztítjuk. A kihajtott csúcsot összegyűjtjük (100 ml), ultraszűréssel koncentráljuk és sterilizáljuk. A fehérjetartalmat Lowry módszerével és az alkaloidtartalmat radioaktivitás mérésével határozzuk meg. A kapott konjugátum 12,7 mól alkaloidot tartalmaz 1 mól galaktoziláít humán albuminra számolva.
19. példa
4-[l (2,5-dioxo-3-pirrolin-l-i!)-3-metoxi-karbonilpropil-karboiiil-oxi\-t’itiblasztin galaktoziláít humán albumin (HAgal) kapcsolása mg 4-(1-(2,5-dioxo-3-pirrolin-l-il)-3-metoxi-karbonil-propil-karboml-oxi]-vinblasztint 1 ml dioxánban oldunk. Ettől külön 50 mg HAgal-t 5 ml 0,2 mól/liter foszfát-pufferben (pH = 8,5) oldunk. A 4-(l-(2,5-dioxo-S-pirroiin-l-iiyO-mctoxi-karbonil-propil-karboni!oxij-vinblasztiii oldatát a HAgal oldatához adjuk. Az elegyet egy éjszakán keresztül szobahőmérsékleten keveijük, majd 0,9 tömeg%-os nátrium-klorid oldatra (pH = 7,5) beállított Sephadex-G25 (2,6X96 cm) segítségéve! gélszűrésscl tisztítjuk. A kihajtott csúcsot összegyűjtjük (100 ml), ullraszűréssel koncentráljuk és sterilizáljuk. A fehérjetartalmat Lowry módszerével és az alkaloidtartalmat radioaktivitás mérésével határozzuk meg. A kapott konjugátum 11,8 mól alkaloidot tartalmaz 1 mól galaktoziláít albuminra számítva.
20. példa
4-[l-(2,5 -dioxo-3-pirrolin -1 -il)-2-metil-butil-karbo nil-oxi]-vinblasztin és galaktoziláít humán albumin (HAgal) kapcsolása
250 mg 4-(1-(2,5-dioxo-3-pirrolin-l-il)-2-mctil-butil-karbonil-oxi] vinbiasztint 20 ml dioxánban oldunk. Ettől külön 591 mg HAgal-t 16,5 ml 0,4 mól/liter
-815
198 075 foszfát-pufferben (pH = 8,5) oldunk, Λ 4-(1-(2,5-dioxo-3-pirrolin-l-il)-2-metil-butil-karbonil-oxi]-vinblasztin oldatát a HAgal oldatához adjuk. Az elegyet egy éjszakán keresztül szobahőmérsékleten keveijük és 0,9 tömeg%-os nátrium-klorid oldatra (pH = 7,5) beállított Sephadex-G25 (2,6X96 cm) segítségével gélszűréssel tisztítjuk. A kihajtott csúcsot összegyűjtjük (180 ml), ultraszűrésscl koncentráljuk és sterilizáljuk. A fehérjetartalmat Lowry módszerével és az alkaloidtartalmat radioaktivitás mérésével határozzuk meg. A kapott konjugátum 8,8 mól alkaloidot tartalmaz 1 mól galaktozilált humán albuminra számolva.
21. példa
4-[2-( 2,5-dioxo-3-pirrolin-l -il)-2-benzil-oxi-karbonil-oxij-vinblasztin és galaktozilált humán albumin (HAgal) kapcsolása
105 mg 4-(2-(2,5-dioxo-3-pirrolin-l-il)-2-benzil-oxikarbonil-etil-karbonil-oxi]-vinblasztint 7 9 ml dioxánban oldunk. Ettől külön 226 mg HAgal-t 6,3 ml 0,4 mól/liter foszfát-pufferben (pH = 8,5) oldunk.’A 4-(2-(2,5-dioxo-3-pirrolin-l -il)-2-benzil-oxi-karboniletil-karbonil-oxi]-vinblasztin oldatát a HAgal oldatához adjuk. Az elegyet egy éjszakán keresztül szobahőmérsékleten keverjük, majd 0,9 tömeg%-os nátriumklorid oldatra (pH =7,5) beállított Sephadex-G25 (2,6X96 cm) segítségével gélszűréssel tisztítjuk. A kihajtott csúcsot összegyűjtjük (60 ml), ultraszűréssel koncentráljuk és sterilizáljuk. A fehérjetartalmat Lowry módszerével és az alkaloidtartalmat radioaktivitás mérésével határozzuk meg. A kapott konjugátum 5,7 mól alkaloidot tartalmaz 1 mól galaktozilált humán albuminra számítva.
22. példa
4-[l Of 2,5-dioxo-3-pirrolin -1 -il)-dekanil-karboniloxi]-vinblasztin és galaktozilált humán albumin (HAgal) kapcsolása
440 mg 4-(10-(2,5-dioxo-3-pirrolin-l-il)-dekanilkarbonil-oxi]-vinblasztint 46 ml dioxánban oldunk. Ettől külön 969 mg HAgal-t 27 ml 0,4 mól/liter foszfát-pufferben (pll = 8,5) oldunk. A 4-(10-(2,5-dioxo3-pírroIin-l -il)-dekaníl-karbonil-oxi]-vinbíasztin oldatát a HAgal oldatához adjuk. Az elegyet 5 órán keresztül 40 °C hőmérsékleten keverjük, majd 0,9 tömegű-ős nátrium-klorid oldatra (pH = 7,5) beállított Triszakril (5,6X50 cm) segítségével gélszűréssel tisztítjuk. A kihajtott csúcsot összegyűjtjük (250 ml), ultraszűréssel koncentráljuk és sterilizáljuk. A fehérjetartalmat Lowry módszerével és az alkaloidtartalmat radioaktivitás mérésével határozzuk meg. A kapott konjugátum 10,2 mól alkaloidot tartalmaz 1 mól galaktozilált humán albuminra számítva.
23. példa
4-[ll Y2,5-dioxo-3-pirrolin-l -il)-undekanil-karboniloxi]-vinblasztin és galaktozilált humán albumin (HAgal) kapcsolása
120 mg 4 (1 l-(2,5-dioxo-3-pirro!in-l-il)-undekanilkarbonil-oxij-vinbiasztint 16 ml dioxánban oldunk. Ettől külön 339 ml HAgal-t 9,4 ml 0,4 mól/liter foszfát-pufferben (pH = 8,5) oldunk. A4-[ll-(2,5-dioxo3-pirrolin-l-il)-undekanil-karbonil-oxij-vinblasztin oldatát a HAgal oldatához adjuk. Az elegyet 6 órán keresztül 40 °C hőmérsékleten keverjük, majd 0,9 tömeg%-os nátrium-klorid oldatra (pll = 7,5) beállított Triszakril (5,6X50 cm) segítségével gélszűréssel tisztítjuk. A kihajtott csúcsot (240 ml) összegyűjtjük, ultraszűréssel koncentráljuk és sterilizáljuk. A fehérjetartalmat Lowry módszerével és az alkaloidtartalmat radioaktivitás mérésével határozzuk meg. A kapott konjugátum 9 mól alkaloidot tartalmazó 1 mól galaktozilált humán albuminra számolva.
24. példa
4-[lf2,ő-dioxo-3-pirrolin-l-il}-etil-karbonil-oxi}vinblasztin és nemspecifikus immunoglobulin (IgG) kapcsolása ing 4-(1-(2,5-dioxo-3-pirrolin-í-il)-etil-karboniloxi]-vinblasztint 193 mikroliter etanolban oldunk. Ettől külön 10 mg IgG-t (626 mikroliter) 357 mikroliter 0,4 mól/liter foszfát-pufferben (pH = 8,5) és 447 mikroliter vízben oldunk (koncentráció 7 mg fehérje (ml). A 4-[ 1 -(2,5-dioxo-3-pirrolin-l-il)-etil-karboniloxi]-vinblasztin oldatát az IgG oldatához adjuk. Az elegyet 35 °C hőmérsékleten egy éjszakán keresztül keverjük, majd 0,2 mól/liter foszfát-pufferre (pH = = 7,5) beállított Dupont de Nemours GF 450 T 250 oszlopon HPLC segítségével (gélszűrés) tisztítjuk. A kihajtott csúcsot összegyűjtjük és a mennyiségét meghatározzuk. A fehérjetartalmat Low'ry módszerével és az alkaloidtartalmat radioaktivitás mérésével határozzuk nteg. A kapott konjugátum 6,6 mól alkaloidot tartalmaz 1 mól immunoglubilinra számolva.
A 17-24. példákban előállított konjugátumok összetételét s kitermelését az 1. táblázatban adjuk meg. Az Összetételt a retenciós idő és a móltömeg alábbi összefüggése alapján nagynyomású folyadékkromatográfiás (MPLC) segítségével határozzuk meg.
Retenciós idő és a móltömeg összefüggése
Standard Retenciós idő (perc) Móltömeg
IgM dimer 14,764 2X106
IgM pentamer 15,227 90X104
(THYRO) Tliyroglobulin 15,944 66X104
(APÓ) Apoferritin 17,580 44X104
IgG 18,687 15X104
BSA (borjú szérum
(albumin) 19,557 7X104
-917
198 075
1. táblázat
Példa- szám Összetétel Retenciós idő (perc) Kitermelés (%)
17. BSA 75% APÓ 15% THYRO 1% IgMdi. 9% 18,687 17,594 14,810 13,370 71
18. BSA APÓ 70% 30% 18,917 17,664 92
19. BSA IgG 78% 22% 21,170 18,147 85
20. BSA APÓ 69% 31% 18,940 17,657 100
21. BSA APÓ IgM di 72% 26% 2% 18,664 17,354 13,927 74
22. BSA 56% APÓ 26% THYRO 18% 18,777 17,500 16,837 92
23. BSA APÓ IgM di 63% 15% 22% 20,014 18,410 14,274 85
24. IgG 100% 18,087 81
25. példa
4-\l 1 -(2,5-dioxo-3-pirrolin-l -il)-undekanil-karboniloxi]-vinblasztin kapcsolása CTMOl monoklón antitesttel (FgG típus) g 4-[l l-(2,5-dioxo-3-pirrolin-l-il)-undekanilkarbonil-oxi]-vinblasz.tint 8,3 g abszolút etanolban oldunk, és 332 mg FgG 47,4 ml 0,1 mól/1 foszfát pufferben (pH = 8,5^ felvett oldatához csepegtetjük. A reakcióelegyet 40 °C hőmérsékleten 2 óra 20 percen keresztül keverjük, 9% NaCl oldatra (pH = 7,5) kiegyensúlyozott Scphadcx G25-ön (11,6X100 cm) gélszűréssel tisztítjuk. A kihajtott csúcsot (800 ml) összegyűjtjük, ultraszűréssel koncentráljuk és sterilizáljuk.
A fehérjetartalmat Lowry módszerével és az alkaloidtartalmat radioaktivitás mérésével határozzuk meg. A kapott konjugátum 4,6 mól alkaloidot tartalmaz 1 mól monoklón antitestre számolva. A fehérje kitermelés 61%, a retenciós idő Zorba oszlopon (DuPont GF 250 + GF 450) 17 perc 990/1000.
26. példa
4-[ll-(2,5-dioxo-3-pirrolin-l-il)-undckanilkarbonil-oxi]-vinkrisztin
199 pl (1,53 mmól) klórhangyasav-izobutilészter 2 ml etil-acetátban felvett oldatát 453 mg (1,53 mmól) 11-(2,5-dioxo-3-pirrolin-l-il)-l-undekánkarbonsav és 169 pl (1,53 mmól) N-metil-morfolin 47 ml etil-ace10 tatban felvett oldatához csepegtetjük 0 °C hőmérsékleten. A reakcióelegyet környezeti hőmérsékleten keverjük, majd 400 mg (0,511 mmól) 0-4-dezacetilvinkrisztin 5 ml etil-acetátban felvett oldatával elegyítjük. Az elegyet egy éjszakán keresztül keverjük, majd szűrjük és az acetátos fázist vákuumban szárazra pároljuk. A maradékot szilikagélen metanol/diklórmetán 5:95 eleggyel eluálva oszlopkromatográfiásan tisztítjuk. Így 136 mg tiszta terméket kapunk.
Kitermelés: 25%.
NMR spektrum (CDClj, 300 MHz, δ): 9,4, 8,75, 8,15, 8,05, 7,7, 7,55-7,2, 6,9, 6,8, 6,7, 5,9, 5,3, 5,2, 3,9,3,7, 3,65, 3,5, 2,3, 1,3, 0,9.
Tömcgspekrum (FAB*, glicerol): molekulaion 1060, megfelel a C6oH27N5Oi2 összegképletnek.
IR spektrum (KBr) cm-1: 3700—3240, 2930, 2860, 1740, 1700, 1680, 1615, 1600, 1495, 1460, 1410, 1365, 1330, 1290, 1250, 1225, 1170, 1030,
1010,830,740,700.
27. példa
4-[T(2,5-dioxo-3-pirrolm-l-ilj-2-metil-butil-karbonil-oxi]-vinblasztin és N-a-acctil-L-lizin-metilészter kapcsolása
100 mg (0,104 mmól) 4-[l-(2,5-dioxo-3-pirrolin-lil)-2-metil-butil-karbonil-oxi]-vinblasztin 1 ml CH2C12ben felvett oldatát 25 mg (0,104 mmól) N-a-acetilL-lizi'n-mctilésztcr és 43 pl (0,104 mmól) trietil-amin 1 ml CH2Cl2-ben felvett oldatához, csepegtetjük. A reakcióelegyet egy éjszakán keresztül környezeti hőmérsékleten keverjük, majd bepároljuk. A maradékot szilikagélen metanol/CH2CI2 5 :95 eleggyel eluálva oszlopkromatográfiásan tisztítjuk.
NMR spektrum (CDClj, 300 MHz): 9,85, 8,02, 7,6-7,1,6,6, 6,1, 5,8, 5,5,5,25,4,6,4,5,3,95,3,85, 3,78, 3,6,2,8, 2,7, 2,6, 2,05, J ,1,0,8-0,7.
Tömegspektrum (FAB*, glicerol), 1164 (M*+l), 962,751,542,355.
IR spektrum (KBr) cm-1: 3460, 3040, 2940, 2870, 1775, 1740, 1720, 1660, 1610, 1500, 1460, 1430,1380,1250,1220,730.
28. példa
4-[H-( 2,5-dioxo-3-pirrolin-l -il)-undekanil-karboniloxi]-vinkrisztin és galaktolizált humán albumin (HAgal) kapcsolása
150 ml 4-[ 11-(2,5-dioxo-3-pirrolin-l-il)-undekanilkarbonil-oxi]-vinkrisztint 48 ml dioxánban oldunk és 1000 mg HAgal lll ml 0,4 mól/1 foszfát pufferben (pH = 8,5) felvett oldatához csepegtetjük. A reakcióelegyet 4 órán keresztül 45 °C hőmérsékleten keverjük, majd 0,9 tömcg%-os NaCl oldatra (pH = 7,5) kiegyensúlyozott Sephadex-G25-ön (11,3X100 cm) gélszűréssel tisztítjuk. A kihajtott csúcsot (50 ml) összegyűjtjük, ultraszűréssel koncentráljuk és sterilizáljuk.
A fehérjetartalmat Lowry módszerével és az alka-1019
198 075 loidtartalmat radioaktivitás mérésével határozzuk meg. A kapott konjugátum 7 mól alkaloidot tartalmaz J mól galaktozilált humán albuminra számolva.
Kitermelés'. 75%.
HPLC BSA 49% 19,034
APÓ 38% 17,677
IgMdi 5% 14,794
IgM di 8% 13,860
Az új vegyületek farmakológiai hatását az alábbi vizsgálatokkal teszteltük:
1. Lizozóm enzimekkel szembeni érzékenység
A konjugátumok lizozóm enzimekkel szembeni érzékenységét úgy vizsgáltuk, hogy a konjugátumot 48 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten 5 mmól/liter acetát-puffer és lizozóm enzim jelenlétében inkubáltuk. 48 órás inkubálás után a sértetlen fehérjét 5 mg szérum albumin és 2 térfo|atrész acetonitril segítségével kicsapjuk. A mintát 4 °C hőmérsékleten 40 percig inkubáljuk, majd 3000 fordulatszámon 40 percen keresztül centrifugáljuk. A felülúszó radioaktivitását folyadék-skintillációs számlálóval határoztuk meg egy alikvot részben. Az oldott radioaktivitás a konjugátum emésztési fokára utal.
A vizsgálatok során a következő emésztési százalékokat kaptuk:
Példaszám: 17. 92%
18. 100%
20. 75%
22. 79%
23. 92%.
2. Szérumstabilitás
A konjugátumok szérum jelenlétében mutatott stabilitását úgy mértük, hogy a konjugátumot 62 tömeg%-os borjúmagzat-szjérum jelenlétében 37 °C hőmérsékleten 48 órán keresztül inkubáltuk. 48 órás inkubálás után a sértetlen fehérjét 1 térfogatrész triklór-ecetsav (40 tömeg %-os TCA) hozzáadásával kicsapjuk. A mintát 4 °C hőmérsékleten 1 órán keresztül inkubáljuk, majd centrifugáljuk és a felülúszó radioaktivitását folyadékszkintillációs számláló segítségével egy alikvot részben meghatározzuk. Az oldott radioaktivitás a konjugátum emésztési fokára utal.
A vizsgálati eredmények szerint a konjugátumok 48 órán keresztül stabilak.
3. Savas stabilitás
A konjugátumok savas pH-η mutatott stabilitását úgy vizsgáltuk, hogy a konjugátumot 40 mmól/liter acetát-puffer (pH = 4,5)jelenlétében 37 °C hőmérsékleten 48 órán keresztül inkubáltuk. Az emésztés mértékét TCA kicsapásos módszerrel határoztuk meg.
A mérési eredmények szerint a konjugátumok a fenti körülmények között stabilak.
4. Kemoterápiás aktivitás Leukémia P 388 esetében
A kiindulási anyagként alkalmazott származékok és a konjugátumok kemoterápiás aktivitását Leukémia P 388 esetén vizsgáltuk BDFj nőstény egereknek intraperitoneálisan adagolva. 106 tumorsejtet inokuláltuk i. p. a 0-dik napon. A konjugátumot i. p. adagoltuk az első napon.
Az ILS érték a kezelt egerek százalékos túlélési arányát mutatja a kezeletlen egerekhez viszonyítva. A mólarány az alkaloid mólarányát mutatja a galaktozilált humán albuminra számítva a vizsgált konjugátuinon belül.
A táblázatok a fentiek mellett tartalmazzák a 60-dik napon túlélt egerek számát, valamint a milligramm/kilogramm/nap egységben kifejezett dózist a konjugátum esetén külön az alkaloidra és külön a fehérjére számítva.
A kiindulási anyagok hatékonysága
Vizsgált anyag Példa- száma Dózis mg/kg/nap ILS (%) Túlélés 60 nap után
-----------------— ---------...... ----------- —
VBL (vin-
blasztin) 3 77 0/10
VCR (vin-
krisztin) 2,7 64 0/11
9. példa 25 100 0/7
50 127 0/7
75 -70 0/6
11. példa 50 88 0/10
100 111 0/10
12. példa 50 148 0/7
100 -79 0/7
10. példa 25 102 0/8
50 218 H7
100 - 83 0/7
14. példa 50 37 1/7
100 -19 1/5
15. példa 25 185 1/5
50 >633 6/8
100 7 1/7
A konjugátumok hatékonysága
Vizs- gált anyag példa- száma Dózis mg/kg/nap Mólarány ILS (%) Túlélés 60 nap után
Vinka alka- loid Fehérje
VBL 3 77 0/10
VCR 2,7 64 0/11
60 374-466 13,5-10,7 69 0/5
17. 80 450 15 133 1/5
100 562 15 201 0/5
130 2766 6.6 175 1/3
150 3035 4.1 138 0/7
150 1276 9.8 >552 3/5
150 913 13.7 >574 3/5
21. 60 768 5.7 47 0/5
-1121
198 075
Vizs- gált anyag példa- szánra Dózis mg/kg/nap Mólarány ILS (%) Túlélés 60 nap után
Vinka alka- loid Fehérje
19. 60 987 4.7 67 0/5
100 1645 4.7 75 0/5
150 2468 4.7 88 0/5
60 545 8.8 51 0/5
20. 100 908 8.8 48 0/5
150 1362 8.8 79 0/5
60 400 12 95 0/5
18. 150 995 12 137 1/5
60 378 11.8 147 1/5
22. 80 504 11.8 153 1/5
753 7.9
90 658 10.2 227
100 630 11.8 >606 3/5
100 646 7.9 186 3/10
150 945 11.8 -45 0/5
23. 90 741 9 >769 5/5
SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims (8)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás vinka-alkaloidok és fehérje (I) általános képletű konjugátumainak előállítására, a képletben R2 jelentése metoxi-karbonilcsoport,
    R3 jelentése metilcsoport vagy -CHO csoport,
    R4 jelentése hidroxilcsoport,
    Rs jelentése etilcsoport,
    A jelentése (a) vagy (b) általános képletű csoport, álról
    X jelentése 1 — 12 szénatomos egyenes szénláncú alkil éniá ne, 2—5 szénatoinos egyenes vagy elágazó szénláncú alkilidénlánc, benzil-oxi-karbonil-csoporttal szubsztituált 2—3 szénatomos alkilénlánc vagy nietoxi-karbonil-csoporttal szubsztituált 2-3 szénatomos alkilidénlánc,
    Rí jelentése immunoglobulin vagy adott esetben galaktozilált humán albumin, azzal jellemezve, hogy valamely (A) általános képletű (2,5-dioxo-3-pírrolin-l-il)-származékot, a képletben X jelentése a tárgyi körben megadott, valamely (II) általános képletű C4-hidroxiI-vegy ület tel kondenzálunk, a képletben
    R2, R3, R4 és Rs jelentése a tárgyi körben megadott, és a kapott köztiterméket kívánt esetben immunoglobulinnal vagy - adott esetben galaktozilált humán albuminnal kondenzáljuk.
    (Elsőbbsége: 1986.07. 16.)
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az első kondenzálási lépést klórhangyasav-alkilészter vagy előnyösen k.lórhangyasav-izobutilészter segítségével amin bázis, így trietil-amin, N-metil-piperidin vagy N-metil-morfolin jelenlétében szer12 vés oldószerben, így etil-acetátban, tetrahidrofuránban, vagy metilén-kloridban végezzük, a kapott köztiterméket a rcakcióclcgyből izoláljuk és tisztítjuk, tnajd a második kondenzációs lépést vizes közegben és 4-25 °C közötti hőmérsékleten és pH = 7,5-9,5 értéken végezzük.
    (Elsőbbsége: 1986.07. 16.)
  3. 3. Az 1—2. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy fehérjeként galaktozilált humán albumint alkalmazunk.
    (Elsőbbsége: 1986.07. 16.)
  4. 4. Eljárás vinka-alkaloidok és fehérje (I) általános képletű konjugátumainak előállítására, a képletben R2 jelentése metoxi-karbonil-csoport,
    R3 jelentése metilcsoport vagy -CHO csoport,
    R4 jelentése hidroxilcsoport,
    Rs jelentése etilcsoport,
    A jelentése (a) vagy (b) általános képletű csoport, álról
    X jelentése 1—6 szénatomos egyenes szénláncú alkilénlánc, 2-5 szénatomos egyenes vagy elágazó szénláncú alkilidénlánc, benzil-oxi-karbonil-csoporttal szubsztituált 2—3 szénatomos alkilénlánc vagy metoxikarbonil-csoporttal szubsztituált 2-3 szénatomos alkilidénlánc,
    Rj jelentése immunoglobulin vagy adott esetben galaktozilált humán albumin.
    azzal jellemezve, hogy valamely (A) általános képletű (2,5-dioxo-3-pirro!in-l-il)-származékot, a képletben X jelentése a tárgyi körben megadott, valamely (II) általános képletű C4-hldroxil-vegyülettel kondenzálunk, a képletben
    R2, R3, R4 és R5 jelentése a tárgyi körben megadott, és a kapott köztiterméket kívánt esetben imnrunoglobulinnal vagy — adott esetben galaktozilált — humán albuminnal kondenzáljuk.
    (Elsőbbsége: 1985. 12. 16.)
  5. 5. A 4, igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az első kondenzálási lépést klórhangyasav alkilészter vagy előnyösen klórhangyasav-izobutilészter segítségével amin bázis, így trietil-amin, N-metilpiperidin vagy N-metil-morfolin jelenlétében szerves oldószerben, így etil-acetátban, tetrahidrofuránban, vagy metilén-kloridban végezzük, a kapott köztiterméket a reakcióelegyből izoláljuk és tisztítjuk, majd a második kondenzációs lépést vizes közegben és 4 25 °C közötti hőmérsékleten és pH = 7,5-9,5 értéken végezzük.
    (Elsőbbsége: 1985. 12. 16.)
  6. 6. A 4-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy fehérjeként galaktozilált humán albumint alkalmazunk.
    (Elsőbbsége: 1985. 12. 16.)
  7. 7. Eljárás gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely, 1. igénypont szerint előállított (I) általános képletű vegyületet, a képletben R2, R3, R4, R5 és A jelentése az 1. igénypontban megadott, gyógyszerészeti célra alkalmas vivőanyaggal és/vagy segédanyaggal keverünk össze, és a keveréket adagolásra alkalmas gyógyszerkészítménnyé alakítjuk.
    (Elsőbbsége. 1986.07. 16.)
    -1223
    198 075
  8. 8. Eljárás gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely, 4. igénypont szerint előállított (I) általános képletű vegyületet, a képletben R2, R3, R4, Rs és A jelentése a 4. igénypontban megadott, gyógyszerészeti célra alkalmas vívőanyaggal és/vagy segédanyaggal keverünk össze, és a keveréket adagolásra alkalmas gyógyszerkészítménnyé alakítjuk.
    (Elsőbbsége: 1985. 12.16.)
HU865216A 1985-12-16 1986-12-15 Process for producing new vinblastine conjugates and pharmaceutical compositions comprising same HU198075B (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
LU86212A LU86212A1 (fr) 1985-12-16 1985-12-16 Nouveaux conjugues de la vinblastine et de ses derives,procede pour leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant
LU86515A LU86515A1 (hu) 1986-07-16 1986-07-16

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT45264A HUT45264A (en) 1988-06-28
HU198075B true HU198075B (en) 1989-07-28

Family

ID=26640313

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU865216A HU198075B (en) 1985-12-16 1986-12-15 Process for producing new vinblastine conjugates and pharmaceutical compositions comprising same

Country Status (8)

Country Link
US (2) US4828831A (hu)
EP (1) EP0232693A3 (hu)
DK (1) DK587986A (hu)
HU (1) HU198075B (hu)
IE (1) IE863266L (hu)
IL (1) IL80914A (hu)
NZ (1) NZ218619A (hu)
PT (1) PT83896B (hu)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0232693A3 (fr) * 1985-12-16 1988-04-06 La Region Wallonne Conjugués de la vinblastine et de ses dérivés, procédé pour leur préparation et compositions pharmaceutiques les contenant
FR2626882B1 (fr) * 1988-02-08 1991-11-08 Ire Celltarg Sa Conjugues de derives de vinca comportant une chaine detergente en position c-3
US5006652A (en) * 1988-08-08 1991-04-09 Eli Lilly And Company Intermediates for antibody-vinca drug conjugates
US5094849A (en) * 1988-08-08 1992-03-10 Eli Lilly And Company Cytotoxic antibody conjugates of hydrazide derivatized vinca analogs via simple organic linkers
US5556623A (en) * 1993-03-30 1996-09-17 Eli Lilly And Company Antibody-drug conjugates
US7097839B1 (en) * 1993-10-26 2006-08-29 Thomas Jefferson University ST receptor binding compounds and methods of using the same
US5879656A (en) * 1993-10-26 1999-03-09 Thomas Jefferson University Methods of treating metastatic colorectal cancer with ST receptor binding compounds
US6143864A (en) * 1994-06-28 2000-11-07 Merck & Co., Inc. Peptides
US5599686A (en) * 1994-06-28 1997-02-04 Merck & Co., Inc. Peptides
US5866679A (en) * 1994-06-28 1999-02-02 Merck & Co., Inc. Peptides
DE19636889A1 (de) 1996-09-11 1998-03-12 Felix Dr Kratz Antineoplastisch wirkende Transferrin- und Albuminkonjugate zytostatischer Verbindungen aus der Gruppe der Anthrazykline, Alkylantien, Antimetabolite und Cisplatin-Analoga und diese enthaltende Arzneimittel
US5948750A (en) * 1996-10-30 1999-09-07 Merck & Co., Inc. Conjugates useful in the treatment of prostate cancer
US6319894B1 (en) * 1997-01-08 2001-11-20 The Picower Institute For Medical Research Complexes and combinations of fetuin with therapeutic agents
US6127333A (en) * 1997-07-10 2000-10-03 Merck & Co., Inc. Conjugates useful in the treatment of prostate cancer
AU5240999A (en) * 1998-07-31 2000-02-21 Goldsmith Seeds Inc. Trimeric and polymeric alkaloids
AU775373B2 (en) 1999-10-01 2004-07-29 Immunogen, Inc. Compositions and methods for treating cancer using immunoconjugates and chemotherapeutic agents
EP1235598A2 (en) * 1999-11-12 2002-09-04 Angiotech Pharmaceuticals, Inc. Compositions of a combination of radioactive therapy and cell-cycle inhibitors
US20030232760A1 (en) * 2001-09-21 2003-12-18 Merck & Co., Inc. Conjugates useful in the treatment of prostate cancer
US20030216758A1 (en) * 2001-12-28 2003-11-20 Angiotech Pharmaceuticals, Inc. Coated surgical patches
JP2006516548A (ja) 2002-12-30 2006-07-06 アンジオテック インターナショナル アクツィエン ゲゼルシャフト 迅速ゲル化ポリマー組成物からの薬物送達法
US20050148534A1 (en) * 2003-09-22 2005-07-07 Castellino Angelo J. Small molecule compositions and methods for increasing drug efficiency using compositions thereof

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3387001A (en) * 1964-10-19 1968-06-04 Lilly Co Eli Novel aminoacyl esters of desacetyl vincaleukoblastine
OA06421A (fr) * 1980-06-10 1981-09-30 Omnium Chimique Sa Procédé de préparation de dérivés N-(vinblastinoyl-23) d'acides aminés et de peptides.
US4639456A (en) * 1980-06-10 1987-01-27 Omnichem S.A. Vinblastin-23-oyl amino acid derivatives
FI820020L (fi) * 1981-01-12 1982-07-13 Lilly Industries Ltd Immunoglobulinkonjugater
CA1203164A (en) * 1982-03-09 1986-04-15 Thomas J. Mckearn Antibody conjugates
JPS59116229A (ja) * 1982-12-24 1984-07-05 Teijin Ltd 細胞毒性複合体を活性成分とする癌治療用剤およびその製造法
DK167984A (da) * 1983-03-30 1984-10-01 Lilly Industries Ltd Alkaloidderivater
DE3482444D1 (de) * 1983-03-30 1990-07-19 Lilly Industries Ltd Immunoglobulinkonjugate.
GR81790B (hu) * 1983-04-29 1984-12-12 Omnichem Sa
US4522750A (en) * 1984-02-21 1985-06-11 Eli Lilly And Company Cytotoxic compositions of transferrin coupled to vinca alkaloids
US4659839A (en) * 1984-10-10 1987-04-21 Mallinckrodt, Inc. Coupling agents for radiolabeled antibody fragments
US4667030A (en) * 1985-06-17 1987-05-19 Eli Lilly And Company Hydrazide succinimide derivatives of antineoplastic indole-dihydroindole alkaloids
US4675400A (en) * 1985-06-17 1987-06-23 Eli Lilly And Company Bifunctional derivatives of 4-desacetyl indole-dihydroindole alkaloids
EP0232693A3 (fr) * 1985-12-16 1988-04-06 La Region Wallonne Conjugués de la vinblastine et de ses dérivés, procédé pour leur préparation et compositions pharmaceutiques les contenant
CA1335686C (fr) * 1986-01-13 1995-05-23 Rao K. S. P. Bhushana Vinblastine et composition pharmaceutique les contenant

Also Published As

Publication number Publication date
HUT45264A (en) 1988-06-28
PT83896B (pt) 1989-01-17
EP0232693A2 (fr) 1987-08-19
US5030620A (en) 1991-07-09
DK587986A (da) 1987-06-17
US4828831A (en) 1989-05-09
EP0232693A3 (fr) 1988-04-06
IE863266L (en) 1987-06-16
IL80914A (en) 1991-08-16
NZ218619A (en) 1989-09-27
DK587986D0 (da) 1986-12-08
IL80914A0 (en) 1987-03-31
AU592136B2 (en) 1990-01-04
PT83896A (fr) 1987-01-01
AU6653786A (en) 1987-06-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU198075B (en) Process for producing new vinblastine conjugates and pharmaceutical compositions comprising same
US4870162A (en) Conjugates of vinblastine, a process for their preparation and their use in therapy
US5024835A (en) Conjugates of a vinca derivative carrying a detergent chain in the C-3 position
FI80383C (fi) Foerfarande foer framstaellning av ett terapeutiskt anvaendbart immunoglobulinkonjugat.
JPH08509499A (ja) ラパマイシン結合体及び抗体
US4760142A (en) Divalent hapten derivatives
EP0635019A1 (en) Novel opiate derivatives and protein and polypeptide opiate derivative conjugates and labels
EP0272891A2 (en) Immunoglobulin conjugates
HU206377B (en) Process for producing cytotoxic vinc-dimer conjugates and pharmaceutical compositions comprising same
EP0247792A2 (en) Immunoglobulin conjugates
Kralovec et al. Synthesis of methotrexate-antibody conjugates by regiospecific coupling and assessment of drug and antitumor activities
CA1073898A (en) Radioimmunoassay of cortisol and novel cortisol derivatives useful therefor
US4814438A (en) Immunoglobulin conjugates of 2&#39;,2&#39;-difluronucleosides
US4994558A (en) Immunoglobulin conjugates
JP2004305218A (ja) 生物体液中のバンコマイシンの検出および定量化用試薬および方法
JPS62195387A (ja) ビンブラスチンおよびその誘導体の新規結合体、その製造方法、並びにそれを含む製剤組成物
CA1265135A (en) Hydrazide imide derivatives of indole-dihydroindole alkaloids
US5525474A (en) Piperidine analogs and conjugates of procainamide and NAPA
HU196217B (en) Process for production of new vinblastin-ensime-conjugates and their derivatives and medical compounds containing such substances
EP0222722B1 (fr) Nouveaux conjugués de la vinblastine et de ses dérivés, procédé pour leur préparation et compositions pharmaceutiques contenant ces conjugués
US5432288A (en) Derivatives of ryanodine and dehydroryanodine
WO1992018499A1 (en) Novel ester derivatives of ryanodine and dehydroryanodine
US5679701A (en) Derivatives of ryanodine and dehydroryanodine
US5510500A (en) Derivatives of ryanodine and dehydroryanodine
PH26447A (en) New conjugates or vinblastine and its derivatives a process for their preparation and pharmaceutical compositions containing the same

Legal Events

Date Code Title Description
HU90 Patent valid on 900628
HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee