HU196228B

HU196228B - Process for production of esther derivatives of l 17046 antibioticum and medical compounds containing them

Info

Publication number: HU196228B
Application number: HU854326A
Authority: HU
Inventors: Adriano Malabarba; Bruno Cavalleri; Aldo Trani; Ambrogio Magni; Paolo Strazzolini
Original assignee: Lepetit Spa
Priority date: 1984-11-13
Filing date: 1985-11-12
Publication date: 1988-10-28
Also published as: EP0182157B1; KR860004076A; DE3586344T2; GB8428619D0; ATE78261T1; ZA858449B; JPS61122300A; DK508885D0; US4661470A; DK508885A; EP0182157A3; ES8704964A1; DE3586344D1; CA1250098A; ES548789A0; HUT41053A; IL76996A0; EP0182157A2

Description

A találmány tárgya eljárás az L 17046 antibiotikumnak nevezett antibiotikus anyagnak a karboxil-csoport észterezésével előállított új (I) általános képletű észter-származékai, valamint ezek gyógyászati szempontból elfogadható savaddíciós sói előállítására. E képletben

R jelentése 1—4 szénatomos alkil-, hidroxi-(1—4 szénatomoslalkil-, (1—3 szénatomos)-alkoxi-(l—4 szénatomosj-alkíl-, halogén-(l—4 szénatomos)-alkil-, fenil-(1—4 szénatomoslalkil-, a benzolgyűrűben 1—4 szénatomos alkilcsoporttal helyettesített fenil-(l—4 szénatomos)-alkilcsoport,

R‘ jelentése hidrogénatom vagy (2—5 szénatomos) alkanoil-oxi-karbonil-csoport,

A és M jelentése hidrogénatom, és B jelentése N-acetil-béta-D-glukózaminil-csoport, ' azzal a feltétellel, hogy alkilészterek esetében ennekaz alkiíláncnak a proximális szénatomja nem lehet tercier szénatom.

A leírásban használt „alkil” megjelölés egyenes és elágazó szénhidrogén csoportokra egyaránt vonatkozik, és például metil-, etil-, propil-, 1-metiletil-, butil-, 1-metil-propil-, vagy 1,1-dimetil-etilcsoportot jelent.

A „halogénül,4 szénatomoslalkil” megjelölés olyan monohalogénezett alkilcsoportot jelent, amelyben a halogénatom klór-, fluor- vagy bóratom.

A fenilcsoporttal helyettesített alkilcsoport például benzil-, m-metil-benzil-, p-terc-butil-benzil-, fen-etil-, 4-fenil-l-budl-, 3-fenil-l-butil stb. csoport.

Az (I) általános képletű vegyületek ismert módon gyógyászati szempontból elfogadható savaddíciós sókká alakíthatók át.

Általában előnyben részesítjük a só alakot, nagyobb stabilitása miatt, amelynek következtében könnyebben tárolható. Az (I) általános képletű vegyületek jellegzetes és megfelelő savaddíciós sói azokat a sókat jelentik, amelyeket a szokásos reakcióban szerves és szervetlen savakkal képezhetünk. Ilyen savak pl. a következők: sósav, kénsav, foszforsav, ecetsav, borostyánkősav, citromsav, tejsav, maleinsav, fumársav, palmitinsav, kólsav, pamoinsav, nyálkasav, glutaminsav, kámforsav, glutársav, glikolsav, ftálsav, borkősav, laurinsav, sztearinsav, szalicilsav, metán-szulfonsav, benzolszulfonsav, szorbinsav, pikrinsav, benzoesav, fahéjsav stb.

A találmány szerinti, szabad aminocsoportot tartalmazó vegyületeknek a megfelelő savaddíciós sókká való átalakítása és a megfordított művelet — vagyis egy találmány szerinti vegyület savaddíciós sójának a nem-só vagy szabad amino-alakká való átalakítása — a szakember tudásához tartozik és az első művelet a találmány oltalmi körének részét is képezi.

Tekintettel arra, hogy az (I) általános képletű vegyületek és sóik tulajdonságai hasonlók, a jelen leírásban az (I) általános képletű vegyületek biológiai aktivitására vonatkozóan mondottak érvényesek a gyógyászati szempontból elfogadható sókra is és viszont. A találmány szerinti vegyületek félszintetikus antibakteriális ágensekként vagy az ilyen anyagok közti termékeiként használhatók fel. Ezek a g.ukopeptid típusú L 17046 antibiotikum szál mázéi ai. Közelebbről a találmány szerinti vegyületek 'szter származékok, amelyeket az L 17046 antibiotikum, az N-védett L 17046 antibiotikum vagy az H-védett L 17046 antibiotikum észterek karboxil·.soportjának észterezésével állíthatunk elő Vala-.'.ennyi ilyen vegyület mutat antimikrobíális aktiv iást, az N-védett L 17046 antibiotikum és az N-védí t L 17046 antibiotikum észter származékok azon un főként közti termékként alkalmazhatók az an mikrobiálisan aktív L 17046 antibiotikum észtéi :k előállításához.

Az L ΓΊ46 antibiotikum az 1 195 754 sz. európai szaba.alom szerinti eljárás alkalmazásával a teikoplan-, — egy másik ismert antibiotikum — ellenőrzőn hidrolízisével állítható elő. A teikoplanint a 4 23) 751 sz. amerikai egyesült államok-beli szabadaln i leírás ismerteti. A teikoplanin a korábban teichcmieinnck nevezett antibiotikum nemzetközi szabad neve (1NN). Ez az anyag az Actionplanes teicomyceticus nov. sp. ATCC 31121 törzs tenyésztésével állítható elő olyan táptalajban, amely asszimilálható szén- és nitrogénforrást és szervetlen sókat tartalmaz (1. a 4 239 751 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírást). Az említett leírás szerinti eljárás során egy teichomicin Ai, A₂és Aj komponenseket tartalmazó antibiotikum komplex nyerhető ki az elkülönített fermentléből oly módon, hogy ezt megfelelő, vízzel nem elegyedő szerves oldószerrel extraháljuk és azt az extrahaló oldószerből ismert módon kicsapjuk az antibiotikumokat. A teichomicin A₂-t, amely az elkülönített antibiotikum komplex legnagyobb mennyiségben jelenlevő faktora, ezt követően Sephadex^Ren végzett öszlopkromatográfíával választjuk el a többi faktortól.

A 2121401 sz. közzétett brit szabadalmi bejelentcsDen leírják, hogy a teichomicin A₂ antibiotikum ténylegesen öt, egymáshoz nagyon hasonló, együtt képződő fő komponens keveréke.

Az újabb szerkezeti vizsgálatok eredményei szerint a teikoplanin A₂ (a korábbi teichomicin A₂) 1, 2, 3, 4 és 5 jelű fő komponensei az előbbi (I) szerkezeti képlettel ábrázolhatok, amelyben R és Ri jelentése hidrogénatom,

Λ jelentése N-(l—10 szénatomos)-alifás acil-béta-D-glukozaminil-csoport, jelentése N-acetil-béta-D-glukozaminilcsoport és vl jelentése alfa-D-mannozil-csoport.

Mindezek a cukor-maradékok 0-glukozid kötésekkel kapcsolódnak á teikoplanin maghoz.

Jellegzetes és kitüntetett példák az 1—10 szénatomos telített alifás acil csoportokra a következők: π-dehanoil-, 8-metil-nonanoil-, Ζ-4-decenoil-,

8-ijietil-dékanoil- és 9-metil-dekanoil-csoport.

Ezenkívül megállapították, hogy a teikoplanin, annak egy tiszta komponense vagy az említett komponens k bármely arányú elegye egy vagy két cukor maradék szelektív hidrolízise segítségével egy-egy további antibiotikummá alakítható át. Ezeknek a termékeknek a neve: L 17054 antibiotikum és L 17046 antibiotikum.

Az L 17054 antibiotikum olyan előbbi (I) általános képletű vegyületnek felel meg, amelyben A, R és F. jelentése hidrogénatom, B jelentése N-acetil-21 béta-D-glukozaminíl-csoport és M jelentése alfa-D-mannozil-csoport, és a cukor maradékok O-glukozid kötéssel kapcsolódnak a peptid-maghoz. Ezt a 119575 sz: európai szabadalmi leírásban ismertetik.

Az L 17046 antibiotikum olyan előbbi (I) általános képlettel ábrázolható, amelyben A, M, R és R’ jelentése hidrogénatom, B jelentése N-acetil-béta-D-glukozaminil-csoport és a cukor maradék 0glukozid kötéssel kapcsolódik a pepiid maghoz. Ez a vegyület az 1195754 sz. európai szabadalmi leírásból ismert.

Valamennyi említett vegyület, azaz a teikoplanin, egy teiköplanin komponens, az említett komponensek bármilyen arányú elegye, ar L 17054 antibiotikum és az L 17046 antibiotikum kiindulási anyagot képvisel a találmány szerinti észter származékok előállításához.

A tárgyalás egyszerűsítése érdekében a leíráshoz „teiköplanin szerű vegyület”-ként vagy „teikoplaninhoz hasonló anyagaként fogunk általában hivatkozni bármelyik előbbi kiindulási anyagra, azaz a teiköplanin komplexre (amelyet a 4 239 751 sz. Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leirás szerint állítottunk elő), ennek valamely tisztítási termékére, egy olyan (P) általános képletű vegyületre, amelyben R jelentése hidrogénatom, R¹ jelentése hidrogénatom vagy egy amirto-védőcsoport, így (2—5 szénatomos)alkanoiloxi-karbonil-csoport. A’ jelentése hidrogénatom vagy egy (10—11 szénatomos alifás acil)-béta-D-glukozaminil-csoport, B jelentése N-acetil-béta-D-glukozaminil-csoport és M’ jelentése hidrogénatom vagy alfa-D-mannozil-csoport (azzal a feltétellel, hogy ha A jelentése hidrogénatom, akkor M jelentése is hidrogénatom), valamint ezek bármilyen arányú eiegyére.

Az (I) általános képletű L 17046 antibiotikum észtereket úgy állítjuk elő, hogy a megfelelő teikoplaninszerű anyagot észterezzük.

Az észterezési körülmények függnek a kiindulási anyagként alkalmazott konkrét teikoplaninszerű anyag minőségétől, és bizonyos mértékig attól, hogy milyen konkrét észtert kívánunk előállítani.

Az észterezési eljárás reakciókörülményei általában olyanok, hogy elkerülhetővé váljék a teikoplanin mag módosulása, és abban az esetben, amikor a kiindulási teikoplaninszerű anyag A és M helyettesitője nem hidrogénatom, az észterezési eljárás reakciókörülményeit úgy választjuk meg, hogy a kiindulási anyagnak ezek a cukor maradékai hidrolízissel eltávolíthatók legyenek, rrfdőtt a fő reakció befejeződnék.

A találmány tárgya tehát eljárás az L 17046 antibiotikum észtereinek előállítására oly módon, hogy

a) egy teikoplaninszerű anyagot, így egy teikopianin komplexet, ennek valamely tisztítási termékét, vagy egy olyan (P) általános képletű vegyületet, melynél

R’ hidrogénatom,

R* hidrogénatom vagy egy amino-védőcsoport, így (2—5 szénatomos)alkanoiloxi-karbonÚ-csoport,

A’ hidrogénatom vagy egy N-((10—11 szénatomos)-alifás acilj-jŰ-D-giükóz-aminil-csoport,

B egy N-acetil-jö-D-glükózaminil-csoport,

M’ hidrogénatom vagy egy o-D-mannozil-csoport, azzal a feltétellel, hogy ha A jelentése hidrogénatom, akkor M-nek is hidrogénatomot kell jelentenie, amely vegyületekben valamennyi cukor-maradék O-glukozid-kötéssel kapcsolódik a peptid maghoz, egy sav, előnyösen egy ásványi sav jelenlétében, —15 °C és 80 °C közötti hőmérsékleten, ROH általános képletű alkohol — melynek képletében R jelentése az (I) általános képletnél megadott — feleslegével reagáltatjuk, vagy

b) olyan (I) általános képletű vegyületek előállítására, melyek képletében R jelentése az (I) általános képletnél megadott a halogén-(l—4 szénatomos)-aikil-csoport kivételével, R¹, A, M és B jelentése az (I) általános képletnél megadott, egy N-védett L 17046 antibiotikum-származékot egy RX általános képletű vegyülettel — melynek képletében R jelentése az (1) általános képletnél megadott, X jelentése klór-, bróm- vagy jódatom — közömbös szerves poláris aprotikus oldószerben, előnyösen egy hidrogénhalogenid akceptor jelenlétében, —5 °C és 50 °C közötti hőmérsékleten reagáltatunk.

A szakember számára magától értetődő, hogy a teikoplaninszerű anyagok szabad amíno-csoportja bekapcsolódhat a reakcióba, ezért egyes esetekben szükségessé válhat ennek védőcsoporttal való ellátása, az észterezési eljárás megkezdése előtt.

A találmány szerinti eljárásban alkalmazható N-védőcsoport a szakember által ismert N-védőcsoportok egyike lehet, amelyeket pl. a következő szakkönyvek írnak le: T. W. Greens, Protective Groups in Organic Synthesis, J. Wiley and Sons, New York, 1981, 323—326. oldalak és M. Mc Omie, Protecting Groups in Organic Chemistry, Plenum Press, New York, 1973. Ezeknek a védőcsoportoknak eleget kell tenniük az alábbi feltételeknek: olyan kötést kell képezniük a teikoplaninszerű származék amino-csoportjaival, amely a reakció körülményei között stabil; nem befolyásolhatják kedvezőtlenül az észterezési fő-reakciót, és a reakció befejeződése után könnyen lehasíthatóknak és eltávollthatónak kell lenniük a reakcióelegyből anélkül, hogy az újonnan képződött észter kötés károsodást szenvedne. Előnyösen alkalmazhatók az oxikarbonil-védőcsoportök.

Mint az a szakember számára nyilvánvaló, a konkrét N-védőesoport kiválasztása végső soron annak a konkrét észternek a jellemzőitől függ, amelyet elő kívánunk állítani. Ennek az észternek mindenekelőtt stabilnak kell lennie az N-védőcsoport eltávolítása körülményei között. Mivel a különböző N-védőcsopoftok eltávolítást körülményei ismertek, a szakember ki tudja választani a megfelelő védőcsoportot. Ha pl. benzilésztert kívánunk előállítani, el kell kerülnünk olyan védőcsoportok alkalmazását, amelyek katalitikus hidrogénezéssel távolíthatók el (amilyen pl. a benziloxikarbonil-csoport), míg megfelelően alkalmazhatók azok az N-védőcsoportok, amelyek enyhe savas körülmények között távolíthatók el (amilyen pl. a terc-bütoxi karbont) -csoport).

A találmány szerinti vegyületek előállítására irányuló eljárás ezért általában abból áll, hogy egy N-védett vagy egy szabad Amino-csoportot tartalma3

-3196228 2 zó teikoplaninszerű anyagot savas közegben egy alkohollal reagáltatunk, vagy egy N-védett L 17046 antibiotikum származékot egy alkilhalogeniddel, bromiddal, kloriddal vagy jodiddal reagáltatunk, vagy egy N-védett L 17046 antibiotikumot, amely egy aktivált karboxilcsoportot tartalmaz, a kiválasztott alkohollal reagáltatunk.

Az „aktivált karboxilcsoport” kifejezés a teikoplaninszerű szubsztrátum karboxilcsoportjának olyan átalakítását jelenti, amely ezt a karboxilcsoportot reakctóképessé teszi az alkohol reagenssel való összekapcsolódás szempontjából, olyan észter kötés kialakítása mellett, amely a találmány szerinti vegyületekre jellemző.

A karboxilcsoport „aktiváló szereire”, a találmány szerinti eljárásban, példák a következők: karbomil-diimid származékok — pl. az N,N’-diciklohexil-karbodiimid, N.N’-diizopropil-karbodiimid — és a karbonil-funkciót klórozó ágensek, amilyen a tionilklorid. Ezek az ágensek képesek olyan reakcióképes közti termékek képzésére, amelyeket instabilitásuk miatt egyes esetekben nem különítünk el, hanem célszerűen in situ reagáltatunk a kiválasztott alkohollal, a kívánt észter keletkezése mellett.

Közelebbről az L 17046 antibiotikumnak a találmány szerinti észter származékai előállítására irányuló ellenőrzött észterezési eljárások olyan észterezési reakciókat foglalnak magukban, amelyek során savas-alkoholos körülményeket létesítünk, vagy egy N-védett teikoplaninszerű származék vagy előnyösen egy szabad teikoplaninszerű származék jelenlétében; továbbá olyan észterezési reakciókat, amelyek során a teikoplaninszerű szubsztráíumot a kiválasztott alkohol savas oldatának feleslegével kezeljük (ennek a reakció hőmérsékletén cseppfolyósnak kell lennie); olyan észterezési reakciókat, amelyek során az N-védett L 17046 antibiotikum származékot egy megfelelő alkoholos szubsztráttal — így fenollal vagy egy helyettesített fenollal — reagáltatunk a karboxilcsoportot megfelelően aktiváló ágens jelenlétében; és olyan észterezési eljárásokat, amelyek során egy N-védett L 17046 antibiotikum származékot közömbös szerves oldószerben egy R-X általános képletű halogeniddel reagáltatunk —- a képletben R jelentése az előbbiekben meghatározott, a halogén-alkilcsoportok kivételével és X jelentése klór-, vagy előnyösen bróm- vagy jódatom —, előnyösen egy tercier amin, pl. trietilamin, pikolin stb. jelenlétében.

Egy általános eljárás tehát olyan (I) általános képletű észterek előállítására, amelyekben az alkohol maradék egy olyan alkohol maradéka, amely a reakció hőmérsékletén cseppfolyós és vízben alig oldható vagy gyakorlatilag vizoldhatatlan, ezért abból áll, hogy egy teikoplaninszerű vegyületet a megfelelően megválasztott alkohol oldatával reagáltatjuk egy ásványi sav, előnyösen egy hidrogénhalogenid jelenlétében. A reakció hőmérséklete előnyösen 50 °C és 80 °C között választható meg. Kitüntetett hidrogénhalogenid a hidrogénbromid és a sósav, de különösen a sósav.

A találmány szerinti eljárással előállítható (I) «általános képletű észter-származékokra jellegzetes példák a következők: L 17046 metil-, etil-, n-butil-észter, L 17046 benzilészter, L 17046 m-klór-benzilészter, L 17046 o-fluor-benzilészter, L 17046 m55

-fluor-t enzilészter, L 17046 p-fluor-benzilészter, L 17046 m-metil-benzilészter, L 17046 p-lerc.-butil-benzilészter, L 17046 2-klór-etilészter, L 17046 2-bróm-etilészter, L 17046 4-bróm-butilészter, L 17046 4-fluor-butílészter és ezek savaddíciós sói.

Egy násik általános eljárás a találmány szerinti vegyülitek előállítására — azok kivételével, amelyekben R jelentése halo-(l—12 szénatomosj-alkilcsopor: — abból áll, hogy egy N-védett L 17046 antibiotikumot, hidrogénhalogenid akceptor jelenlétéber, közömbös szerves poláris aprotikus oldószerben egy RX általános képletű halogenid származékkal reagáltatunk; e képletben

R jelentése az előbbi, a halo-(l—4 szénatomos)-alkil-csoport kivételével és

X jelentése klór- vagy előnyösen bróm- vagy jódatom.

A reakció hőmérséklete kb. (—5 °C)-50 ’C. A hőmérséklet előnyösen 15—50 °£. Az N-védett L 17046 antibiotikum észter-származékából ezt követően íz alábbiakban ismertetett vagy a szakember számára egyébként ismert eljárások szerint eltávolítjuk a védőcsoportot.

A megfelelő közömbös szerves poláris aprotikus oldószerekre példák a poláris aprotikus oldószerek, amilyen a dimetilformamid, dimetoxi-etán, mexametil-foszforamid, dimetilszulfoxid, benzol, toluol stb.

A megfelelő hidrogénhalogenid akceptorokra példák a tercier szerves aminok — pl. a trimetilamin, pikolin stb. —, valamint a szervetlen bázisok, mint az alkálifém-hidrogén-karbonátok, pl. a nátrium- vagy kálium-hídrogénkarbonát.

Eoben az esetben kitüntetett N-védőcsoport a tere butoxi-karbonilcsoport, míg kitüntetett közömbös szerves poláris aprotikus oldószer a dimetilformamid (DMF). A reakcióidő általában 24—50 óra kb. szobahőmérsékleten. Az ezzel a módszerrel előállítható (1) általános képletű észter-származékolra jellemző példák a következők: L 17046 metilészter, L 17046 etilészter, L 17046 n-butilészter, L 17046 benzilészter, L 17046 p-terc-butil-benzilészter L 17046 fenetilészter, L 17046 4-fenil-lbuiilészter, L 17046 3-fenil-l-butilészter és ezek savaddíciós sói.

Egy további eljárás a találmány szerinti vegyületek előállítására abból áll, hogy egy aktivált karboxilcsoportot tartalmazó N-védett L 17046 származékot közömbös szerves oldószerben egy megfelelő alkohollal reagáltatunk.

Ezen eljárás szerint N-védett L 17046 észterhez juthatunk, amely ismert módon védőcsoport-menteüthető. Az N-védett L 17046 származék „aktiválási” lépése is ismert eljárásokkal végezhető, amint ezt az előbbiekben leírtuk és amint ez a szakember számára ismert. Egy másik megoldás szerint az N-védett L 17046 származékot és a megfelelő alkoholt közömb ös szerves oldószerben oldjuk és az oldathoz ugyanebben, az oldószerben oldva adjuk hozzá a kondenzálószert. A reakció hőmérsékletét minden esetben általában (—15 °C) és a szobahőmérsékletet, előnyösen (—10 °C) és 20 °C és legelőnyösebben 0 °C és 15 °C között tartjuk.

Közömbös szerves oldószerek az előbbiekben meghatározott poláris aprotikus oldószerek, míg megfelelő kondenzálószereknek az L 17046 anti4 biotikum karboxil-csoportja „aktiválásával” kapcsolatban említettek tekinthetők.

A karboxilcsoport aktiválószereként az ismert karbodiimid származékon kívül a tionilklorid is alkalmazható. Ez az aktiválószer különösen előnyösen alkalmazható (I) általános képletű halo-(l—12 szénatomos)-alkilészterek előállítására.

Egyes klór-alkilészterek — például a 4-klór-butilészter — úgy is előállíthatók, hogy az L 17046 antibiotikumot oxetánnal, tetrahidrofuránnal, tetrahidropiránnal, oxepánnal, 2-metil-tetrahidrofuránnal, 3-metil-tetrahidrofuránnaI, illetőleg 3-metil-tetrahidropiránnal reagáltatjuk, sósav átbuborékoltatása közben. A reakció hőmérséklete előnyösen 30 °C—60 °C. A reakció általában 4—24 óra alatt befejeződik. A szakember számára magától értetődő, hogy az előbbiekben ismertetett észterezési eljárásban a reakcióidő változik a konkrét reakciókörülmények és az alkalmazott kiindulási anyagok függvényében. Mivel azonban a találmány szerinti vegyületek éppúgy, mint a teikoplaninszerű kiindulási anyagok autobiográfiás vizsgálatokkal könnyen kimutathatók, ill. TLC vagy HPLC segítségével megfigyelhetők, a szakember ugyancsak képes a reakció lefolyásának követésére és annak meghatározására, hogy a reakció mikor fejeződik be.

A következőkben egy példát írunk le arra, hogy a reakció lefolyása hogyan követhető HPLC-vel. A reakcióelegyböl meghatározott időközönként kb. 20 //1-es mintákat veszünk, a mintákat 50:50 (térf./térf.) 0,2 %-os vizes ammóniumformiát: acetonitril elegy hozzáadásával kb. 2 mg/ml végkoncentrációra hígítjuk és beinjektáljuk a HPLC rendszerbe.

A HPLC rendszer egy Varian 5000 kromatográf, Rheodyne 7125 típusú 20 jul-es injektor-kaccsal ellátva. A rendszer további részei: egy 254 nm-es UV detektor és egy Perisorb RP-8 Merck töltettel megtöltött elő-oszlop (30—40 μπϊ), amelyet egy LiChrosorb RP-8-cal (10 μπ\) elő-töltött Hibar Merck oszlop (25 cm) követ.

Eluálószer: lineáris grádiens 15 % B-től (A-ban) 32 % B-ig (A-ban) 20 perc alatt, kb. 2 ml/perc áramlási sebesség mellett;

A oldószer: 0,2 %-os vizes ammóniumformiát

B oldószer: acetonitril.

Néhány találmány szerinti jellegzetes vegyület relatív retenciós idejét az előbbi rendszerben az I/a táblázatban mutatjuk be.

A következőkben egy másik példát mutatunk be a HPLC elemzési eljárásra.

Meghatározott időközökben kb. 0,1 ml-es mintákat veszünk a reakcióelegyböl, a mintákat kb. 0,7 mg/ml végkoncentrációra hígítjuk 50:50 (térf./térf.) 0,2 %-os vizes NaHíPO^acetonifril elegyével és beinjektáljuk a HPLC rendszerbe.

A HPLC rendszer egy Hewlett-Packard 1084A kromatográf.

Injektált térfogat: 20 μΐ.

UV detektor: 254 nm.

Oszlop: 25 cm-es Hibar-Merck, Lichrosorb RP8-cal (7gm) átöltve.

Eluálószer:

A oldószer: NaH₂PO₄ 0,02M/CH₃CN 25/75 (térf./térf.)

B oldószer: NaH₂PO₄ 0,02M/CH₃CN 95/5 (térf./térf.)

Grádiens: t, perc 0 2 25 30 35 %B 30 30 50 60 30

Áramlási sebesség: 1,5 ml/perc.

Néhány, találmány szerinti jellegzetes vegyület relatív retenciós idejét az I/b táblázatban mutatjuk be.

A szakember számára nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti vegyületek mind lényegében tiszta teikoplaninszerű anyagokból, mind nyers teikoplaninszerű anyagokból előállíthatók.

Az előbbi esetben olyan, találmány szerinti vegyülethez juthatunk, amely nem igényli további külön tisztítási lépés végrehajtását, míg az utóbbiban egy végső tisztítási lépés válik szükségessé.

A tisztítást általában ismert eljárások szerint végezzük, amelyek közé tartozik pl. a kicsapás nemoldószerekkel, oldószeres extrakció, sóképzés és a kromatográfiás eljárások.

Egy kitüntetett tisztítási eljárás fordított fázisú oszlopkromatográfiai alkalmazását foglalja magában. Ebben az esetben a kitüntetett adszorbens a szilanizált szilikagél, 0,06—0,2 mm részecskeméret eloszlási tartománnyal.

Az eluálószer valamelyik hidrofil elegy lehet, amelyet a tisztítási eljárásokban alkalmaznak. Jellemző példák az ilyen hidrofil oldószerekre mint eluálószerekre a következők: szerves savak ammóniumsóinak híg vizes oldatai és acetonitril vagy vízoldható rővidszénláncú alkanolok különböző arányú elegyei.

A szerves savak ammóniumsóinak híg vizes oldataira jellemző példák a 0,1—6 %-os vizes ammóniumformiát oldatok, míg a megfelelő alkanolokra példa a metanol, etanol, propanol stb. Kitüntetett eluálószer a vizes ammóniumformiát és acetonitril pH 6—8 elegye vagy vizes ammóniumformiát és metanol elegye.

Egy kitüntetett eljárás a következőket foglalja magában: először fordított fázisú kromatográfiát végzünk szilanizált szilikagélen (0,06—0,2 mm), a kifejlesztés lineáris lépcsőn grádienssel (5—60 % acetonitril 0,2 %-os vizes ammóniumformiátban) végezve, majd egy második oszlopon kromatografálunk, eluálószerként 6:4 (térf./térf.) acetonitril: víz elegyet alkalmazva.

Egy másik kitüntetett eljárás a következőkből áll:

a) a nyers antibiotikumot 1:2:3 0,2%-os vizes ammóniumformiát:metanol:butanol elegyben oldjuk, szilanizált szílikagéllel hozzuk érintkezésbe és az oldószereket lehajtjuk;

b) a maradékot felvisszük egy szilanizált szilikagél oszlop (0,06—0,2 mm) tetejére, 9:1 0,6%-os vizes ammóniumformiát:acetonitril eleggyel kifejlesztést végzünk, az eluátumot elvetjük és az eluálást lineáris acetonitril/vízben grádienssel folytatjuk, amelyet úgy alakítunk ki, hogy 200 ml/óra sebességgel elegyítünk 1:9 acetonitril:víz elegyet és 7:3 acetonitrikvíz elegyet.

A „lényegében tiszta kifejezés, egy — a leírásban szereplő antibiotikum vonatkozásában — olyan anyagot jelez, amelynek HPLC litere nagyobb, mint 95% (a csúcs-területek százalékos mennyisége az előre meghatározott UV hullámhosszúságon, 254 nm-en), víz és oldószer tartalma

196 228

La) táblázat

Példa	R		R¹	lR^a(cm^_1)	K^b	pK.^c
1.	metil		H	1720	L45	6,70
2.	etil		H	1720	1,55	6,68
3.	n-butil		H	1715	1,95	6,65
4.	2-CL-etil	'4	H	1725	1,69	6,67
5.	4-Cl-n-butil		H	1720	2,12	6,66
8.	benzil		H	1735
10.	4-CHj-benzil		H	1735
12.	2-OH-etil		H	Γ40

^a az észter-CO frekvenciája (v_c=₀); nujol mullpólyában Perkin-Elmer 850 készülékkel felvéve;

^b K= t_R észter/t_R L 17046 = relatív retenciós idő az előbbiekben ismertetett HPLC rendszerben; t_R L 17046 értéke ebben a rendszerben kb. 8,5 perc;

^c a mintákat 4:1 (térf./térf.) metilcellolszolv^R:víz elegyben oldjuk, ugyanebben az oldószerben oldott 0,01 mólos sósav-felesleget adagolunk és a kapott oldatot titráljuk.

10%—15% (tömegarány) és szervetlen maradék tartalma 0,5%-nál (tömegarány) alacsonyabb.

Néhány jellegzetes, találmány szerinti vegyület fizikokémiai jellemzőit az La), l.b), II. és III. táblázatban foglaljuk össze.

Lb) táblázat

Példa	R¹	R	K⁺
6.	BOC	H	1
7.	BOC	benzil	2
8.	H	benzil	0,57
9.	BOC	4-CHa-benzil	2,2
10.	H	4-CHj-benzil	0,74
11.	BOC	2-OH-etil	1,45
12.	H	2-OH-etil	0,36

⁺K = t_R észter/tR L 17046; t_R L 17046 ebben a rendszerben kb. 10,5-del egyenlő.

ugyanebben az oldószerben oldott 0,01 M NaOH-val

II. táblázat UV (lambda max} (nm)

Péld;	Metanol	pH = 1,0	pH = 7,4	pH-- 13,
1.'	280	279	279	298
2.	280	279	279	298
3.	280	279	279	298
4.	280	279	280	299
5.	280	279	280	298

A felvételeket Unicam SP 800 spektrométer segítségével készítettük.

A találmány szerinti vegyületek antibakteriális aktivitását in vitro a szokásos agar-hígításos vizsgálatokkal határozhatjuk meg.

A Staphylococcusok, illetőleg a Streptococcusok tenyésztésére Isosensitest levest (Oxoid), illetőleg

HL táblázat Elem-analízis Számított értékek

Példa	‘ Számított képlet (mólsúly)	C%	H%	N%	Cl% összes	ionos
1.	C&7 HóoNsCLOjj .HC1 (1452,5)	55,40	4,57	7,71	7,32	2,44
2.	CMHaNgCkOa .HC1 (1466,7)	55,69	4,33	7,64	7,25	2,42
3.	C?oH66Ns Cl₂ O₂3 ,HC1 (1494,7)	56,24	4,52	7,50	7,12	2,37
4.	QsHeiNeCljOíj .HC1 (1501,1)	54,41	4,16	7,47	9,45	2,36
5.	C70 Hő5 Ν» CI3 O₂.i ,HC1 (1529,2)	55,44	4,35	7,33	9,27	2,32

III. táblázat

Elem-analízis Talált értékek

Példa	C%^a	H%^b	NW	Cl%^b	szervetlen mar., %^c	súly veszt.
összes	ionos
1.	55,08	4,63	7,30	7,35	2,46	0,2	3,7
2.	55,25	4,42	7,44	7,41	2,53	0,2	3,9
3.	56,03	4,71	7,36	7,35	2,51	0,5	5,3
4.	54,28	4,30	7,29	9,71	2,62	0,2	12,9
5.	55,46	4,45	7,12	9,45	2,47	0,2	4,8

¹ Előzetesen 140 °C-on nitrogén atmoszférában szárított mintákban meghatározva. ^b Súlyveszteségre és szervetlen maradékra korrigálva.

^c A minták oxigén atmoszférában 900 °C-ra való melegítése után meghatározva. ^d Termogravimetriás elemzéssel 140 °C-on meghatározva.

Todd-Hewitt levest (Dífco) használunk. A leves-tenyészeteket úgy hígítjuk, hogy a végső inokulum kb. 10⁴ telepképző egységet (TKE) tartalmazzon 1 ml-ben. A minimális gátló koncentrációnak (MIC) azt a legalacsonyabb koncentrációt tekintjük, amely mellett 18—24 órás inkubálás során, 37 “’Con nem lép fel látható növekedés. Az (I) általános képlet körébe tartozó jellegzetes vegyületek antibakteriális vizsgálata eredményeit a következő IV. táblázatban foglaljuk össze.

IV. táblázat

Mikroorg. MIC (pg/ml) a következő példák szerinti vegyületekre

	1.	2.	3.	4.	5.
1.	0,125	0,25	0,25	0,25	0,25
2.	0,125	0,25	0,125	0,25	0,125
3.	0,5	0,5	0,25	0,5	0,125
4.	0,25	0,5	0,5 ,	0,5	0,5
5.	0,016	0,016	0,016	0,064	0,064
6.	0,5	0,5	0,25	0,25	0,25
7.	0,5	0,5	0,5	0,5	0,125
8.	0,5	0,5	0,5	0,5	0,25
9.	128	128	128	128	128

Mikroorg.	. MIC (pg/ml) a kövelkező példák szerinti vegyületekre
8.	10.	12.
2.	0,125	0,)25	0,125
3.	0,125	0,25	0,125
4.	4	4	0,5
5.	0,063	0,063	0,063
6.	0,125	0,125	0,25
7.	0,25	0,5	1
8.	0,1.25	0,25	0,25
9.	64	64	128

Mikroorganizmusok:

1. — S. aureus ATCC 6538

2. — S. aureus TOUR (IO³ TKE/ml)

3. — S. aureus TOUR (10⁶ TKE/ml)

4. — S. aureus TOUR + 30% szarvasmarha szérum

5. — S. epidermidis ATCC 12128

6. — S. pyogenes C 203 SKF 13400

7. — S. pneumoniae UC 41

8. — S. faecalis ATCC 7080

9. — E. coli SKF 12140

A Gram-pozitív baktériumokkal szemben megnyilvánuló aktivitás mellett a találmány szerinti jellegzetes vegyületek bizonyos fokú aktivitást mutat20 rak Gram-negatív baktériumokkal szemben is.

Az előbbiekre tekintettel a találmány szerinti vegyületek hatékonyan alkalmazhatók olyan antiinikrobiális készítmények aktív komponenseiként, amelyeket az ember- és állatgyógyászatban pato²⁵ gén baktériumok állal okozott fertőző betegségek megelőzésére és kezelésére használunk, amely bakériumok érzékenyek az említett aktív komponensekre.

Az ilyen kezelések során ezek a vegyületek tet30 szőleges arányú keverékek alakjában alkalmazhatók. A találmány szerinti vegyületek orálisan, helyileg vagy parenterálisan vihetők be, mimellett előnyben részesítjük a parenterális alkalmazást. A bevitel módjától függően ezek a vegyületek külön35 böző adagolási egységek alakjában egészíthetők ki. Az orális bevitelre szánt készítmények kapszula, tabletta, oldat vagy szuszpenzió alakúak lehetnek. Mint ez a szakember számára ismert, a kapszulák és tabletták az aktív komponensen kívül a szokásos töltőanyagokat — így hígítókat (amilyen pl. a laktóz, kalciumfoszfát, szorbit stb.) —, kenőanyagokat (pl. magnéziumsztearátot, talkumot, polietilénglikolt), kötőanyagokat (amilyen pl. a polivinilpirrolidon, zselatin, szorbit, tragakanta, arabméz45 ga), ízanyagokat, valamint elfogadható szétesést elősegítő és nedvesítő anyagokat tartalmaznak. A folyékony készítmények — melyek általában vizes vagy olajos oldat vagy szuszpenzió alakúak — szokásos adalékokat, így szuszpendálószereket tartal50 mazhatnak. Helyi alkalmazás céljából a találmány szerinti vegyületek kikészithetők olyan megfelelő alakúra is, hogy lehetővé váljék abszorpciójuk az orr és a torok nyálkahártyáján és a bronchiális szöveteken keresztül. Ezek előnyösen folyékony spray vagy inhalálószerek, gyógycukor vagy torokecsetelő alakúak lehetnek.

A szem vagy a fül kezelése esetében a készítmény folyékony vagy fél-folyékony alakban állítható elő. A helyi kezelésre alkalmas készítmények hid60 rofób vagy hidrofil bázisokkal, így kenőcsökkel, krémekkel, rázókeverékkel, ecsetelőszerekkel vagy porokkal készülhetnek.

Az injekciós készítmények szuszpenziók, oldatok vagy emulziók lehetnek — olajos vagy vizes vi65 vőanyagokban — és formázószereket, igy szuszpendáló, stabilizáló és/vagy diszpergáló szereket tartalmazhatnak.

-71 ,

Egy másik megoldás szerint az aktív komponens por alakú lehet és a felhasználás időpontjában állítható elő a folyékony készítmény egy megfelelő vivőanyaggal, pl. steril vízzel.

A beviendő aktív komponens mennyisége különböző tényezőktől függ, amilyen a kezelendő beteg testsúlya és állapota, a bevitel módja és gyakorisága és a szóbanforgó kórokozó minősége.

A találmány szerinti készítmények általában kb. 0,5—kb. 30 mg aktív komponens/testsúly-kg napi dózisban hatékonyak; ezt a mennyiséget előnyösen 2—4 alkalomra osztjuk fel a nap folyamán. Különösen előnyösek az adagolási egységek alakjában előállított készítmények, amelyek egységenként kb. 20—kb. 300 mg aktív anyagot tartalmazhatnak.

A gyógyszerkészítmények előállítására néhány jellemző példát a következőkben mutatunk be:

Parenterális bevitelre alkalmas oldatot állítunk elő oly módon, hogy 100 mg L 17046 antibiotikum etilésztert — hidroklorid alakban — 2 ml steril pro inj. vízben oldunk.

Parenterális bevitelre szolgáló készítményt állítunk elő oly módon, hogy 250 mg L 17046 antibiotikum butilészter-hidrokloridot 3 ml pro inj. steril vízben oldunk.

Helyi alkalmazás céljából kenőcsöt állítunk elő oly módon, hogy 200 mg L 17046 antibiotikum 4-klór-butilészter-hidrokloridot, 3,6 g polietilénglikolt (4000 USP) és 6,2 g polietilénglikolt (400 USP) összekeverünk.

A következő példák azt mutatják be, hogy a találmány a gyakorlatban hogyan alkalmazható. Mint ilyenek azonban a példák nem tekinthetők az oltalmi kör terjedelmét korlátozóknak.

A kiindulási anyagok előállítása

a) Az L 17054 antibiotikum előállítása 5 g teikoplanint erőteljes keverés közben hozzáadunk 60 ml, 80 °C-ra előmelegített 0,5n vizes sósavhoz.

A keverést folytatjuk és a hőmérsékletet 30 percen át kb. 80 °C-on tartjuk. A keveréket ezután gyorsan szűrjük, a szűrletet 0—5 °C-ra hűtjük le és 10 ml 6n sósavat adagolunk. A kapott szuszpenziót kb. 15 percen át keverjük, miközben a hőmérsékletet 0—5 °C-on tartjuk. A csapadékot összegyűjtjük, 20 ml hideg In sósavval, majd etíléterrel mossuk és csökkentett nyomáson szobahőmérsékleten szárítjuk. 4,5 g nyers L 17054 antibiotikum-hidrokloridot kapunk.

g, az előbbiek szerint előállított nyers L 17054 antibiotikum-hidrokloridot 150 ml 95:5 (térf./ térf.) 0,2%-os vizes ammóniumformiát/acetonitril elegyben oldunk. A pH-t In NaOH-dal kb. 7,5-re állítjuk be és a terméket feloldjuk. A kapott oldatot felvisszük egy oszlopra, amely 150 g 0,06—0,2 mm-es szilanizált szilikagélt (Merck) tartalmaz, ugyanezzel az oldószerrel elkészítve. Az oszlopot lineáris gradiens elucióval fejlesztjük ki (5—21%, térf./térf., acetonitril 0,2%-os vizes ammóniumformiátban) és 20 ml-es frakciókat szedünk, amelyeket HPLC-vel követünk. Az L 17054 antibiotikumot tartalmazó frakciókat (70.—96.) egyesítjük és az acetonitrilt vákuumban eltávolítjuk. A visszamaradó vizes oldatot felvisszük egy oszlopra, amely 10 g szilanizált szilikagélt tartalmaz desztil8

Iáit vízben. Az oszlopot a sók teljes eltávolításáig desztillált vízzel mossuk, majd a terméket 1:1 (térf./térf.) acetonitrikvíz eleggyel eluáljuk.

Az összegyűjíött oldatot vákuumban kis térfogatra töményítjűk be és az antibiotikumot aceton hozzáadásával kicsapjuk.

Szobahőmérsékleten való szárítás után 0,9 lényegében tiszta L 17054 antibiotikumot kapunk.

b) Az L 17046 antibiotikum előállítása g teikoplanint keverés közben hozzáadunk 150 ml sósavhoz, amelyet 80 °C-ra előmelegítünk. Kb. 45 perc elteltével a reakcióelegyet 0—5 °C-ra hűtjük és hozzáadunk kb. 30 ml 37%-os sósavat. A keverést kb. 10 percen át folytatjuk, majd a kivált szilárd anyagot szűréssel kinyerjük, 20 ml 2n sósavval, majd etil-éterrel mossuk és egy éjjelen át káliumhidroxid pasztillák felett szobahőmérsékleten szárítjuk. így 8,3 g nyers L 17046 antibiotikum hidrokloridot kapunk.

6,2 g előbbi nyers terméket 500 ml 80%-os metanolban oldunk és hozzáadunk 30 g szilikagélt (Merck, 0,06—0,2 mm). 200 ml n-butanol hozzáadása után az oldószert vákuumban eltávolítjuk. A maradékot felvisszük egy kromatográfiás oszlopra, amely acetonitrilben 300 g szilikagélt tartalmaz. Az oszlopot úgy fejlesztjük ki, hogy egymásután a következő oldószerelegyeket alkalmazzuk, 300-300 ml mennyiségben: acetonitril; 95:5 acetonitrikvíz; 90:10 acetonitrikvíz; 85:15 acetonitrikvíz. Az eluátumokat kiöntjük és az oszlopot lineáris grádiens elucióval fejlesztjük ki, amelyet úgy érünk el, hogy 375 ml/óra sebességgel elegyítünk 3,5-3,5 liter következő oldószerelegyet: 83:17 acetonitrikvíz és 70:30 acetonitrikvíz.

ml-es frakciókat szedünk és ezeket HPLC-vel vizsgáljuk. Az L 17046 antibiotikumot tartalmazó frakciókat (170.—200.) egyesítjük. Az egyesített frakciókhoz 400 ml n-butanolt adunk és a kapott elegyet kis térfogatra töményítjűk be. A zavaros oldathoz ezután acetont adagolunk és 10 °C-ra való lehűtés után azt észleljük, hogy csapadék kezd khálni. A kicsapódás teljessé válása után a szilárd anyagot szűréssel összegyűjtjük, acetonnal, majd éterrel mossuk, szobahőmérsékleten vákuumban szárítjuk és így 1,9 g, cím szerinti vegyületet kapunk, lényegében tiszta alakban.

I. példa

At L 17046 antibiotikum-metilészter-hidroklorid előállítása

a) L 17046 antibiotikumból 3 g L 17046' antibiotikumot 90 ml 0,35 mólos,

99,9%-os metanollal elkészített, vízmentes sósavban szuszpendálunk és a szuszpenziót kb. 2 órán át visszafolyató hűtő alatt forraljuk (fürdő-hőmérséklet kb. 80 °C). A reakcióelegyet ezután 0—5 °C-ra hűljük ie és a csapadékot összegyűjtjük, 100 nil dietiléter vei mossuk és egy éjjelen át szobahőmérsékleten vákuumban szárítjuk. 2,41 g nyers, cím szerinti észtert kapunk. A nyers terméket 100 ml vízben szuszpendáljuk és a kapott szuszpenzió pH-ját 8,3-re állítjuk be 0,ln NaOH-dal, majd háromszor 200 ml n-butanollal extraháljuk. A szerves rétegeket egyesítjük és ehhez az elegyhez hozzáadunk 200 mi vizet és 100 ml etilacetátot. A szerves

-8ί réteget ezután elkülönítjük és vákuumban 40 °Con kb. 200 ml végtérfogatra töményítjük be. 200 ml dietiléter hozzáadására szilárd anyag válik ki, amelyet összegyűjtünk, 100 ml dietiléterrel mosunk és 50 ml 99,9%-os metanolban szuszpendálunk.

A kapott szuszpenziót 30 percen át visszafolyató hűtő alatt forraljuk (fürdő-hőmérséklet kb. 80 °C), majd forrón szűrjük. A szűrletet 15 °C-ra hűtjük és hozzáadunk 1,6 ml 10 mólos vízmentes sósav oldatot, amelyet 99,9%-os metanollal készítettünk. Egy éjjelen át szobahőmérsékleten való állás közben szilárd anyag válik ki, amelyet összegyűjtünk, 3:1 (térf./térf.) dietiléter:aceton elegygyel mosunk és szobahőmérsékleten vákuumban 8 órán át szárítunk. 1,93 g L 17046 antibiotikum-metilészter-hidrokloridot kapunk.

Lényegében az 1. példa szerinti eljárást követve, de kiindulási anyagként az L 17046 antibiotikumot teikoplaninnal, teikoplanin A₂ 2. komponenssel, L 17054 antibiotikummal vagy ezek valamely keverékével helyettesítve hasonló kitermeléssel kapjuk a cím szerinti vegyületet (1,7—2,1 g, a reagenseknek a példa szerintivel azonos moláris mennyiségét alkalmazva).

2. példa

Az L 17046 antibiotikum-etilészter-hidroklorid előállítása

a) L 17046 antibiotikumból g L 17046 antibiotikumot 112 ml etanolban szuszpendálunk és a szuszpenzióhoz keverés közben hozzáadunk 8 ml 4,5 mólos vízmentes sósavat. A reakcióelegyet 3 órán át visszafolyató hűtő alatt forraljuk (fürdő-hőmérséklet kb. 85 °C), majd 5 °C-ra lehűtjük, a csapadékot összegyűjtjük, 5 ml etanollal, majd 200 ml dietiléterrel mossuk és egy éjjelen át szobahőmérsékleten vákuumban szárítjuk. 1,87 g cím szerinti nyers etilésztert kapunk.

Ezt a nyers terméket 180 ml vízben oldjuk és a kapott oldat pH-ját 0,1 N NaOH-dal 8,9-re állítjuk be. Szuszpenzió keletkezik, amelyet 200 ml 2:1« (térf./térf.) etilacetátm-butanol eleggyel extrahálunk. A szerves réteget kiöntjük és a vizes réteget kétszer 200 ml n-butanollal extraháljuk. Ezt a szerves kivonatot 60 ml vízzel mossuk és <15 °C-on vákuumban kb. 200 ml végtérfogatra töméhyítjük be. Dietiléter hozzáadására szilárd anyag válik ki, amelyet összegyűjtünk, 50 ml dietiléterrel mosunk és 50 ml vízben szuszpendálunk. Ezután 0,9 ml In sósavat adunk a szuszpenzióhoz és a kapott tiszta oldatot 200 ml n-butanollal hígítjuk. Az elegyet 50 °C-on vákuumban kb. 60 ml végtérfogatra töményítjük be. 300 ml dietiléter hozzáadására szilárd anyag válik ki, amelyet összegyűjtünk, 100 ml dietiléterrel mosunk és 100 ml 0,3 mólos vízmentes sósavban szuszpendálunk, amelyet etanollal készítettünk el. A kapott szuszpenziót vákuumban 35 °C-on kb. 40 ml végtérfogatra töményítjük be. A szilárd anyagot összegyűjtjük, 10 ml etanollal mossuk, majd 200 ml dietiléterrel és így 1,18 g L 17046 antibiotikum etilészter hidrokioridot kapunk.

b) L 17054 antibiotikumból g L 17054 antibiotikumot 100 ml, absz. etanollal elkészített 0,6 mólos vízmentes sósavban szuszpendálunk és a szuszpenziót 3 órán át visszafolyató hűtő alatt forraljuk, kb. 80 °C fürdő-hőmérséklet mellett, majd kb. 5 °C-ra hűtjük le és a 2.a) példa szerinti módon mossuk. 0,58 g, cím szerinti etilésztert kapunk.

Lényegében a 2.b) példa szerinti eljárást követve. de kiindulási anyagként az L 17054 antibiotikumot teikoplaninnal vagy teikoplanin A₂ 2. komponenssel helyettesítve a cím szerinti vegyületet kapjuk, hasonló kitermeléssel (kb. 0,4 — kb. 0,45 g), ugyanolyan moláris mennyiségű reagenst alkalmszva, mint az előző példában.

3. példa

Az L 17046 antibiotikum n-butilészter-hidroklorid előállítása

a) L 17046 antibiotikumból g L 17046 antibiotikumot 85 ml n-butanolban szuszpendálunk és a szuszpenzióhoz keverés közben 6ö°C-on hozzáadunk 5,6 ml butanolos 6,5 M sósavat. A gyorsan képződő tiszta oldatot kb. 60 °C-on kb. 3 órán át keverjük, majd 5—10 °C-ra hűtjük le, a vizes réteg pH-ját In NaOH-dal 8,2-re állítjuk be és 90 ml vízzel extraháljuk az elegyet. A szerves réteget elkülönítjük és 200 ml n-butanollal hígítjuk. A kapott zavaros butanolos oldatot 200 ml vízzel mossuk, majd vákuumban 50 °C-on kb. 60 ml végtérfogatra töményítjük be. 100 ml etilacetát hozzáadására szilárd anyag válik ki, amelyet összegyűjtünk és 250 ml vízben szuszpendálunk. A szuszpenziót kb. 30 percen át szobahőmérsékleten keverjük, majd 30 ml metanolt és 2 ml In sósavat adunk hozzá, A kapott tiszta oldat pH-ját 8,1-re állítjuk be 0,ln NaOH-dal és a reakcióelegyet 400 ml etilacetáttal extraháljuk. A szerves réteget elkülönítjük és kiöntjük. A vizes réteget kétszer extraháljuk 200-200 ml n-butanollal és az összeöntött szerves réteghez 2 ml In sósavat adunk. A kapott butanolos oldatot kis térfogatra (kb. 40 ml) töményítjük be vákuumban 45 °C-on és kb. 120 ml dietiléter hozzáadásával szilárd anyagot csapunk ki, amelyet összegyűjtünk, dietiléterrel mosunk és vákuumban egy éjjelen át 45 °C-on szárítunk. 0,98 g L 17046 antibiotikum n-butilészter-hidrokloridot kapunk.

Lényegében a 3. példa szerinti eljárást követve, de kiindulási anyagként az L 17046 antibiotikumot teikoplaninnal, teikoplanin A₂ 2. komponenssel, L 17054 antibiotikummal vagy ezek valamely keverékével helyettesít ve ugyanazt a cím szerinti vegyületet kapjuk, hasonló kitermeléssel (0,7—0,9 g, ugyanolyan moláris mennyiségben alkalmazva a reagenseket, mint a példában).

4. példa

Az L 17046 antÍbiotikum-2-klór-etilészter-hidroklorid előállítása az L 17046 antibiotikumból

1,4 g L 17046 antibiotikumot 20 ml 2-klór-etanolban szuszpendálunk és a szuszpenzióhoz keverés közben 1—10 °C-on hozzáadunk 1 ml tionilkloridot. A reakcióelegyet szobahőmérsékletre melegítjük fel és egy napon át kevertetjük. Ezután lehűtjük —10 °C-ra, hozzáadunk 1 ml tionilkloridot

-91 X és az elegyet szobahőmérsékleten még egy napig keverjük. Ezután a reakcióelegyet 200 ml dietiléterbe öntjük, a kivált szilárd anyagot összegyűjtjük, dietiléterrel mossuk és vákuumban egy éjjelen át szobahőmérsékleten szárítjuk. 1,2 g nyers, cím szerinti terméket, 2-klór-etilésztert kapunk. Ezt a nyers terméket a 2.a) példa szerinti módon feldolgozva — amely 1,87 g nyers L 17046 antibiotikumetilészter-hidroklorid tisztítására vonatkozik — 0,25 g L 17046 antibiotikum 2-klór-etilészterhidrokloridot kapunk.

5. példa

Az L 17046 antibiotikum-4-klór-butilészter-hidroklorid előállítása a) teikoplaninból g teikoplanint 200 ml száraz tetrahidrofuránban szuszpendálunk és a szuszpenzión keverés közben száraz sósavat buborékoltatunk át 12 órán keresztül, miközben a hőmérsékletet 45—50 °C-on tartjuk. A keletkező tiszta oldatot 900 ml dietiléterbe öntjük és a kicsapódó szilárd anyagot szűréssel összegyűjtjük, dietiléterrel mossuk és vákuumban, szobahőmérsékleten egy éjjelen át KOH pasztillák fölött szárítjuk. 9,5 g nyers, cím szerinti 4-klór-butilésztert kapunk. Ezt a nyers terméket 1,5 liter 3:2:1 (térf./térf./térf.) n-butanol:metanol:víz elegyben oldjuk, az oldathoz hozzáadunk 20 g szilanizált szilikagélt (0,06—0,2 mm, Merck Inc.) és az oldószereket vákuumban kb. 45 °C-on sztrippeléssel eltávolítjuk. A maradékot 400 ml 9:1 (térf./térf.) acetonitrikvíz elegyben szuszpendáljuk és felvisszük egy kromatográfiás oszlop tetejére, amelyet úgy készítettünk el, hogy 1,4 kg ugyanilyen szilanizált szilikagélt 1 liter pH 4,2 I %-os ammóniumfoszfáttal előzetesen egyensúlyba hoztunk és 200 ml 1:9 (térf./térf.) acetonitrikvíz eleggyel stabilizáltunk. Az oszlopot ezután 1 liter 1:9 acetonitrikvíz eleggyel mossuk, majd lineáris grádiens alkalmazása mellett — 10—50% (térf./térf.) acetonitril vízben —, 400 ml/óra sebességgel 20 óra alatt kifejlesztjük. Kb. 20 ml-es frakciókat szedünk és ezeket HPLC-vel vizsgáljuk meg. Az L 17046 4-klór-n-butilésztert tartalmazó frakciókat (241.—320.) egyesítjük és 2,5 liter n-butanol és 4 ml 1 n sósav hozzáadása után kis térfogatra (kb. 50 ml) töményítjük be. Kb. 300 ml dietilétert adagolunk és a keletkező csapadékot összegyűjtjük, dietiléterrel mossuk és vákuumban szobahőmérsékleten egy éjjelen át szárítjuk KOH pasztillák és P2O5 fölött. 2,1 g L 17046 antibiotikum 4-klór-butilészter-hidrokloridot kapunk.

Lényegében az 5.a) példa szerinti eljárást követve, de kiindulási anyagként a teikoplanin komplexet teikoplanin A2 2. komponenssel, L 17054 antibiotikummal, L 17046 antibiotikummal vagy ezek valamely keverékével helyettesítve ugyanezt a cím szerinti vegyüietet kapjuk, lényegében azonos kitermeléssel (a reagensek ugyanolyan moláris mennyiségét alkalmazva, mint a példában).

6. példa

Az L 17046 antibiotikum N-BOC származékának előállítása

3,8 g (2,42 mmól) L 17046 antibiotikumot 60 ml desztillált DMF-ban oldunk és az oldathoz hozzáadunk 1,02 g (3,3 mmól) 2,4-5,-triklór-terc-butilkarbonátot és 2,12 ml trimetilamint. A keveréket 48 órán át szobahőmérsékleten tartjuk és a reakció lezajlását HPLC-vel követjük. A reakcióelegyet ezután 240 ml vízzel hígítjuk, a pH-t 1 n HCI hozzáadásával 4-re állítjuk be és az elegyet (összesen 300 ml) n-butanollal extraháljuk. A szerves fázist 40 ml vízzel mossuk és csökkentett nyomáson kb. 40 ml maradék-térfogatra töményítjük be. Ezt a maradékot 300 ml éterrel hígítjuk és egy éjjelen át hűtjük. A kicsapódó szilárd anyagot szűréssel összegyűjtjük, éterrel mossuk és vákuumban 50 °C-on szárítjuk. Kitermelés: 4,2 g tiszta, cím szerinti vegyület. Képlet: C77H76CI2N8O30 Molekulasúly: 1664,52 Számított: C 55,56 H 4,6 N 6,7 Cl 4,25 % Talált: 54,18 5,40 8,18 4,12 %

7. példa

Az L 17046 antibiotikum N-BOC származéka benzilészterének előállítása

500 mg (0,333 mmól) L 17046 antibiotikum NBOC származékot, 50 mg (0,49 mmól) KHCO3-ot és 80 p\ (0,66 mmól) benzilbromidot 7 ml desztillált DMF-ban oldunk és a reakcióelegyet 24 órán át keverjük. A reakcióelegyet 60 ml vízzel hígítjuk, a pH-t ecetsavval kb. 5-re állítjuk be és a reakcióterméket kétszer extraháljuk 50-50 ml 2:1 (térf./térf.) etilacetátm-butanol eleggyel. A szerves réteget elkülönítjük, 30 ml vízzel mossuk és csökkentett nyomáson 10 ml-re töményítjük be. Ezt a terméket a továbbiakban 100 ml etiléterrel hígítjuk. A kicsapódó szilárd anyagot szűréssel összegyűjtjük, etiléterrel mossuk és egy éjjelen át vákuumban szárítjuk. 450 mg tiszta, cím szerinti vegyüietet kapunk.

8. példa

Az L 17046 antibiotikum benzilészter-trifluoracetátjának előállítása

450 mg L 17046 antibiotikum—BOC származékbenzilésztert — amelyet a 7, példa szerint állítottunk elő — 2,5 ml trifluorecetsavban oldunk'és az oldatot 15 percen át szobahőmérsékleten keverjük. A reakcióelegyet 100 ml etiléterrel hígítjuk és a kicsapódó szilárd anyagot összegyűjtjük, éterrel mossuk és vákuumban egy éjjelen át 50 °C-on szárújuk. 400 mg cím szerinti tiszta vegyüietet kapunk.

Képlet: C₇₃ H_MO2₃N₈C1₂C₂HF₃O2

Molekulasúly: 1606,3

Számított: C 56,08 H 4,04 N 6,97 Cl 4,41% Talált: 54,58 4,3 7,03 4,17%

9. példa

Az L 17046 antibiotikum N-BOC származéka 4metil-benzilészterének előállítása

500 mg (0,333 mmól) L 17046 antibiotikum NBOC származékot 50 mg (0,499 m-egyenértéknyi) KOH-da! és 90 pl p-metil-benzilkioriddal együtt 7 ml desztillált DMF-ban oldunk és az oldatot egy éjjelen át szobahőmérsékleten keverjük. Ezután to-101 vábbi reagens-mennyiségeket — 90 μ[ p-metil-benzilkloridot és 20 mg KHCO₃-0t — adagolunk és a reakcióelegyet 7 órán át 50 °C-on, majd egy éjjelen át szobahőmérsékleten tartjuk. A reakcióelegyet 70 ml vízzel hígítjuk, a pH-t ecetsawal kb. 5-re állítjuk be, majd a keveréket kétszer extraháljuk 5050 ml 2:1 (térf./térf.) etil-acetát:n-butanol elegygyel. A szerves réteget elkülönítjük, 30 ml vízzel mossuk és 50 ⁰C-on kis térfogatra töményítjiik be. A szilárd maradékot 100 ml dietiléterrel eldörzsöljük, összegyűjtjük, dietiléterrel mossuk és vákuumban 50 °C-on szárítjuk. 400 mg cím szerinti vegyületet kapunk.

10. példa

Az L 17046 antibiotikum 4-metil-benzilészterének előállítása

480 mg, a 9. példa szerint előállított L 17046 antibiotikum 4-metil-benzilésztert szobahőmérsékleten 2,5 ml trifluorecetsavban oldunk és ezt az elegyet 15 percen át szobahőmérsékleten keverjük. A reakciót 100 ml dietiléterrel való hígítással leállítjuk és a szilárd anyagot összegyűjtjük, éterrel mossuk és vákuumban szárítjuk. 420 g nyers anyagot kapunk, amelyet pillanatkromatográfiával tisztítunk. Az oszlop 70 g LiChroprep RP 8-at (szilikagél Cs-alkilszármazék; 40—63 pm; Merck Co.) tartalmaz és a kifejlesztést lineáris grádienssel — 25—50% CH₃CN vízben — végezzük. A cím szerinti tiszta származékot tartalmazó frakciókat egyesítjük, n-butanolt adagolunk és az oldószereket vákuumban 45 °C-on ledesztilláljuk. A maradékot dietiléterrel eldörzsöljük, majd összegyűjtjük, éterrel mossuk és vákuumban 40 °C-on szárítjuk. Szabad bázisként 150 mg tiszta, cím szerinti vegyületet kapunk.

11. példa

Az L 17046 antibiotikum N-BOC származéka 2-hidroxi-etilészterének előállítása

500 mg (0,333 mmól) L 17046 antibiotikum N-BOC származékot, 50 mg KHCO₃-at és 50 μί 2-bróm-etanolt 7 ml desztillált DMF-ban oldunk és az oldatot szobahőmérsékleten keverjük. Ezután 98 órás időtartam alatt több részletben hozzáadunk összesen 230 μΐ 2-bróm-etanolt és 75 mg KHCOj-at. A reakció lefolyását HPLC-vel követjük. A reakcióelegyhez hozzáadunk 70 ml vizet, a pH-t ecetsav hozzáadásával kb. 5-re állítjuk be, és az elegyet kétszer extraháljuk n-butanollal (50 ml). A szerves réteget 30 ml vízzel mossuk és csökkentett nyomáson 10 ml-re töményítjük be, majd dietilétert adagolunk és a szilárd anyagot összegyűjtjük, mossuk és vákuumban szárítjuk. 450 mg cím szerinti tiszta vegyületet kapunk.

12. példa

Az L 17046 antibiotikum 2-hidroxi-etilészterének előállítása trifluoracetát só alakban

450 mg L 17046 antibiotikum-2-hídroxi-etilésztert — amelyet all. példa szerint állítottunk elő —

2,5 ml trifluorecetsavban oldutk és az oldatot 15 percen át 20 °C-on keverjük, majd hozzáadunk 100 ml dietilétert. A kicsapódó szilárd anyagot összegyűjtjük, éterrel mossuk es egy éjjelen át vákuumban 50 °C-on szárítjuk. 390 mg cím szerinti tiszta vegyületet kapunk.

Claims

Szabadalmi igénypontok

1. Eljárás az L 17046 antibiotikum (I) általános képletű észter-származékai és ezek gyógyászati szempontból elfogadható savaddíciós sói előállítására — e képletben

R jelentése 1—4 szénatomos alkil-, hidroxi-(l—4 szénatomos)-alkil-, (1—3 szénatomos)-alkoxi-(l —4 szénatomos)-alkil-, halögén-(l—4 szénatomos)-alkil-, fenil-(l—4 szénatomos)-alkil- vagy a benzolgyűrűben 1—4 szénatomos alkilcsoporttal helyettesített fenil-(l— 4 szénatomos)-alkil-csoport, és

R* jelentése hidrogénatom vagy (2—5 szénatomos)-alkanoil~oxi-karbonil-csoport,

A és M jelentése hidrogénatom,

3 jelentése N-acetil-/?-D-glukozaminil-csoport, izzal a feltétellel, hogy alkilészterek esetében ennek az alkiliáncnak a proximális szénatomja nem lehet tercier szénatom, azzal jellemezve, hogy

a) egy teikoplanin komplexet, ennek egy tiszta komponensét vagy a komponensek bármely arányú elegyét szelektív hidrolízis után, vagy egy olyan (Γ) általános képletű vegyületet, amelyben R’ jelentése hidrogénatom

R¹ jelentése a tárgyi körben megadott,

A’ jelentése hidrogénatom vagy egy

N-(10—11 szénatomos alifás acil)-/?-D-glukozaminil-csoport,

B jelentése N-acetilyS-D-glukozaminil-csoport,

M’ jelentése hidrogénatom vagy egy cr-D-mannozil-csoport, azzal a feltétellel, hogy ha A jelentése hidrogénatom, M-nek ugyancsak hidrogénatomot kell jelentenie, amely vegyületekben valamennyi cukor-maradék O-glukozid-kötésekkel kapcsolódik a peptid-maghoz, egy sav, előnyösen egy ásványi sav jelenlétében, —15 °C és 80 °C közötti hőmérsékleten, ROH általános képletű alkohol — e képletben R jelentése a tárgyi körben megadott — feleslegével reagáltatunk, vagy

b) olyan (1) általános képletű vegyületek előállítására, melyek képletében R. jelentése a tárgyi körben megadott a halogén-(l—4 szénatomos)-alkil-csoport kivételével, R¹, A, M és B jelentése a tárgyi körben megadott, egy N-védett L 17046 antibiotikum származékot egy RX általános képletű vegyülettel — e képletben R jelentése a tárgyi körben megadott és X jelentése klór-, bróm- vagy jódatom — közömbös szerves poláris aprotikus oldószerben, előnyösen egy hid-. rogénhalogenid akceptor jelenlétében, —5 °C és 50 °C közötti hőmérsékleten reagáltatunk, majd kívánt esetben a 2—5 szénatomos alkanoiloxi-karbonil-csoportot, vagy adott esetben az amino-védő11

-11¹ ' W csoportot eltávolítjuk, kívánt esetben az a) vagy b) eljárás során kapott terméket ismert módon gyógyászati szempontból elfogadható savaddiciós sóvá alakítjuk.
2. Az 1. igénypont szerinti a) eljárás, azzal jellemezve, hogy savas katalizátorként sósavat alkalmazunk és a reakció hőmérsékletét 50 °C és 80 °C közé állít juk be.
3. Az 1. igénypont szerinti a) eljárás, azzal jellemezve, hogy kiindulási anyagként olyan <!*) általá- K nos képletű vegyületet alkalmazunk, amelyben A’,

M’, R' és R¹ jelentése hidrogénatom, B jelentése az

1. igénypontban megadott, és az észterezési reakciót tionilklorid jelenlétében folytatjuk le (—15 ^eC) és a szobahőmérséklet közötti hőmérsékleten. 1!
4. Az 1. igénypont szerintj b) eljárás, azzal jellemezve, hogy közömbös szerves poláris aprotikus oldószerkát dimetilformamidot alkalmazunk.
5. Az 1. ig ΐ typont szerinti b) eljárás, azzal jellemezve, hogy kiindulási anyagként terc.-butiloxi-karbonil-cso ? trttal védett L 17046 antibiotikumot alkalmaz nk.

5
6. Az 1. igüiypont szerinti eljárás (I) általános képletű vegyülnek körébe tartozó L 17Wíjn-butilészter, L 1704Í etilészter, L 17046 benzilészter, L 17046 2-klór-e ilészter és L 17046 4-klór-1-butilészter előállítására, azzal jellemezve, hogy a meg3 felelően helyettesített kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
7. Eljárás gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti eljárással előállított (I) általános képletű vegyületet — 5 ahol R, R¹, A, M és B jelentése az 1. igénypontban megadott — gyógyászati szempontból elfogadható vivőanyagokkal és adott esetben adalékanyagokkal összekeverjük és gyógyszerkészítménnyé feldolgozzuk.