HU185321B

HU185321B - Process for preparing pharmacologically active ancephaline analogues

Info

Publication number: HU185321B
Application number: HU813038A
Authority: HU
Inventors: Paul D Gesellchen; Robert T Shuman
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1980-10-20
Filing date: 1981-10-19
Publication date: 1985-01-28
Also published as: GB2085892A; DE3164594D1; IL64084A0; EP0050503B1; KR830007517A; US4322339A; AU7657581A; PT73840A; GB2085892B; CA1187872A; FI813199L; GR75824B; RO83297B; YU249181A; PL233499A1; ES8301203A1; JPS57108051A; PL131156B1; ES506315A0; EP0050503A1

Description

A jelen találmány új enkefalin analógok előállítására szolgáló eljárásra vonatkozik, ezek az új vegyületek fájdalomcsillapító hatással rendelkeznek.

A közelmúltban a morfinhoz hasonló tulajdonságokkal rendelkező endogén anyagokat extraháltak emlősök agyszövetéből vagy agy- és gerincvelő folyadékából (csf.) Ezeket az anyagokat énkefalinnak nevezik. Azonosításukat Hughes és munkatársai végezték el [Natúré, 258, 577 (1975)] és ezek az anyagok az alábbi összetételű pentapeptideknek bizonyultak:

H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-OH,

H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-OH.

A fenti vegyületeket metionin-enkefalinnak, illetve leucin-enkefalinnak nevezik.

Jóllehet a metionin- és a leucin-enkefalin analgetikus hatást mutattak egéren intracerebroventrikuláris (agykamrában történő) alkalmazás esetén [Buscher és munkatársai: Natúré, 261, 423 (1976)], a szóbanforgo vegyületeknek nincs gyakorlatilag hasznosítható analgetikus hatásuk, ha azokat parenterálisan alkalmazzák.

Ennélfogva az enkefalinok felfedezése óta eltelt idő alatt komoly erőfeszítések történtek annak érdekében, hogy enkefalin-analógokat állítsanak elő, abban reménykedve, hogy majd találnak fokozott aktivitással rendelkező és a gyakorlatban is alkalmazható vegyületeket, melyek parenterális vagy orális beadás esetén is hatásosak.

Dutta és munkatársai [Life Sciences, 21, 559-562 (1977)] bizonyos szerkezeti módosításokról számoltak be, melyek - véleményük szerint - a hatásosság növekedését eredményezik. Javaslatuk szerint a szóbanforgo vegyületek aktivitását növelni lehet az ahíbbi műveletekkel, akár külön-külön, akár együttesen:

(a) a 2-helyzetben levő Gly helyettesítése bizonyos D- vagy a-aza-aminosavakkal;

(b) a terminális karboxilcsoport átalakítása metilészterré vagy amiddé;

(c) a 4-helyzetben levő Phe módosítása a-aza-helyettesítéssel, N-metilezéssel vagy az aromás gyűrű hidrogénezésével.

A fentieken túlmenően Roenter és munkatársai [Natúré, 268, 547—549(1977)] hasznos módosításként a Met⁵-nek a megfelelő karbinoílá történő átalakítását, illetve a Met kénatomjának szulfoxiddá való oxidációját ajánlották.

További és jelentős szerkezeti módosításokat ismertetnek a 859,026 számú belga szabadalmi leírásban. Az említett leírásban az enkefalin-analógok aktivitásának növelésére és az alkalmazási lehetőségek bővítésére a molekula 2-helyzetébe egy D-aminosavgyök (maradék) bevezetését, a terminális karboxilcsoport amiddé történő átalakítását és az 5-helyzetű aminosavrész N-alkilezését javasolják.

Kutatásaink során az enkefalinanalógok olyan csoportját fedeztük fel, amelyek nagyfokú analgetikus aktivitással rendelkeznek. Ezek az analógok az említett analgetikus hatásukon túlmenően a morfin (μ) receptorhoz való kötődési tulajdonságok jellemzőivel összehasonlítva még az enkefalin (δ) receptorhoz való nagyfokú kötődési képességükkel is kitűnnek. Az analóg vegyületek ezen csoportjánál ezért a morfinjellegű mellékhatások kisebb mértékűek. A fokozott enkefalinreceptor aktivitás miatt a szóbanforgo vegyületek igen hasznosak a skizofrénia kezelésében. Ezek az enkefalin2 analógok gyűrűben helyettesített fenil-alanint tartalmaznak és a helyettesítés mind a helyettesítő, mind annak kapcsolódási helyzete szempontjából nagymértékben specifikus. Nevezetesen: a szóbanforgo analóg származékok pentapeptidek, melyek a peptidmolekula 4-helyzetében egy meta-szubsztituált-L-fenil-alaningyököt tartalmaznak.

A szakirodalomból még további, gyűrűben helyettesített 4-fenil-alanil-enkefalin analógok is ismertek, de ezek közül egyik sem meta-helyettesített-fenil-alanil-enkefalinszármazék. így Day A. R. és munkatársai [Rés. Comm. in Chem. Pátit and Pharmacol. 14 (4), 597-603 (1976)] a H-Tyr-Gly-Gly-p-CIPhe-Nle-OH képletű vegyületet ismertetik. Miller R. J. és munkatársai [Vitamins and Hormones 36, 297-382, Academic Press (1978)] a H-Tyr-D-Ala-Gly-pCIPhe-D-Leu-OH a H-Tyr-D-Ala-GlypClPhe-D-Leu-OMe és a H-Tyr-D-Ala-Gly-pClPhe-D-LeuNHEt képletű vegyületeket említik. Pless és munkatársai a 15. Európai Peptidszimpózium alkalmából [1978. szeptember 4-9., Gdansk, Lengyelország] tartott „Opioid Activity of Enkephalin” című előadásukban a H-Tyr-D-Ala-Gly-pClPhe-Met(0)-olröl számoltak be.

Coy D. H. és munkatársai [BBRC 83 (3), 977-983 (1978)] a H-Tyr-D-Ala-Gly-FjPhe-Met-NHj képletű vegyületet említik. A 77/0579 számú dél-afrikai szabadalmi leírás általánosságban olyan enkefalin-analóg \ pentapeptideket ismertet, melyekben a fenil-alanin-rész gyűrűje sokféle helyettesítőt tartalmaz. A 886,677 számú belga szabadalmi leírásban ismertetés és szabadalmi oltalomra irányuló igény is található olyan pentapeptid enkefalin-analógok vonatkozásában, melyek para-helyzetű fluoratommal helyettesített fenil-alanin-részt tartalmaznak. Miller R. a 176. Amer. Chem. Soc. Nat’l. Mtg. [1978. szeptember 11-14., Miami Beach, Florida, Amerikai Egyesült Államok] alkalmából tartott „Structural Pharmacology and Neurobiology of the Enkephalins and Endorphins” című előadásában bizonyos enkefalin-analógokat ismertetett, melyek a peptid 4-helyzetében egy para-helyzetű helyettesítőt hordozó fenilalanint tartalmaznak; különösen kiemelte ezek közül a p-klór- és a p-bróm-helyettesítővel helyettesített fenilalanint tartalmazó vegyületeket. Meltzer és munkatársai [Life Sciences 22, 1931-1938 (1978)] néhány enkefalinanalógot, így különösen kétféle ρ-klór- és egy p-metoxihelyettesítővel helyettesített fenil-alanint tartalmazó analóg származékot ismertetnek.

A fentiekben felsorolt közleményekben és előadásokban azonban egyáltalán nem ismertetik az I általános képletű vegyületeket. Azt találtuk, hogy az enkefalin analógok fájdalomcsillapító hatásának mértéke és egyéb tulajdonságai tekintetében mind az L-fenil-alanin gyűrűjében lévő helyettesítő milyenségének, mind az említett helyettesítő helyzetének szignifikáns szerepe van.

A jelen találmány tárgya ennélfogva eljárás új enkefalin analógok, közelebbről az I általános képletű új vegyületek és gyógyászatban alkalmazható savaddiciós sóik előállítására. Az 1 általános képletben A jelentése D-alanilcsoport,

X jelentése klór-, bróm- vagy jódatom, 1—3 szénatomos alkilcsoport, trifluor-metil-csoport vagy 1-2 szénatomos alkoxicsoport;

B és Z együttesen N-metil-metionin-amid- vagy fenílglicin-amid-csoportot jelentenek.

Az eljárást az jellemzi, hogy a megfelelően védett

I általános képletű vegyületről a védőcsoportokat erre

185 321 alkalmas reagensekkel (úgynevezett „deblokkoló szerekkel”) lehasítjuk.

Ezek a védőcsoportok bármelyik aminosavon jelen lehetnek és a szilárd fázisú szintézishez használt műgyantaágy is ilyennek tekintendő. A védett peptidekben jelen lévő védőcsoportok a peptidek szintézisénél a kapcsolási művelet során aminosavak védelmére szolgáló szokásos védőcsoportok lehetnek, és még a szilárd fázisú szintézis [SPPS] néven ismert technológiában használatos műgyanták is e védőcsoportok közé tartoznak.

A jelen találmány szerinti gyógyszerkészítmények valamilyen hordozóanyagból és hatóanyagként valamilyen I általános képletü vegyüíetből'állnak.

A fentiekben már meghatározott I általános képletü vegyületek gyógyászatban alkalmazható savaddíciós sóinak előállítása is a találmány körébe tartoznak. A gyógyászatban alkalmazható savaddíciós sók szerves vagy szervetlen savakkal, így például sósavval, kénsavval, szulfonsawal, borkősavval, fumársawal, hidrogén-bromiddal, glikolsawal, citromsavval, maleinsawal, foszforsavval, borostyánkősawal, hangyasavval, ecetsawal, salétromsavval, benzoesawal, aszkoibinsawal, p-toluolszulfonsawal, benzolszulfonsawal, naftalinszulfonsawal, propionsawal és más hasonló savakkal képezett savaddíciós sók lehetnek. Előnyösek a sósavval, ecetsavval vagy borostyánkősavval képezett sók. A fentiekben említett sókat a szokásos módszerekkel állítjuk elő.

Miként azt az I általános képletü vegyületek helyettesítőinek jelentésénél már megadtuk, az említett képletnek megfelelő vegyületek pentapeptidek, melyek C-terminális része egy primer amid.

Az I általános képletü vegyületeknek igen lényeges jellemzőjük a térbeli konfiguráció. Az egyszerűség kedvéért az I általános képletü pentapeptideket felépítő aminosav-részeket szekvenciálisán számozzuk, amit az N-terminális maradékánál kezdünk -el. Az aminosavgyökök kiralitása az 1-es helytől a 4-es helyig: L, D, nincs kiralitás és L. A 3-as helyen lévő aminosavrész a glicin gyöke, így ennél nincs kiralitás. Ami az 5-ös helyet (vagyis a C-terminálist) illeti, ennek kiralitása az L-aminosavgyöknek felel meg.

Az X helyettesítők jelentései között szerepel az 1-3 szénatomos alkilcsoport meghatározás. Ez a kifejezés a metil-, az etil-, a n-propil- és az izopropilcsoportot jelenti.

Az X helyettesítő jelentései között szereplő 1-2 szénatomos alkoxiesoport meghatározással a metoxiesoportot és az etoxiesoportot kívánjuk kifejezni.

Az 1 általános képletü pentapeptidekben, az egyes anrinosavrészek pozíciója tekintetében a következő szempontok érvényesülnek:

(A) . 1-es hely

Ez a hely a peptid amino-terminálka és ez a gyök az L-tirozinból származik. A gyök nitrogénatomján helyettesítetlen.

(B) . 2-es hely

Az I általános képletü peptidek 2-es helyén lévő aminosav-rész (A) mindenképpen egy D-sztereoizomer és jelentése D-alanin.

(C). 3-as hely

Az ebben a helyzetben lévő aminosavgyököt a glicinből lehet levezetni.

(D). 4-es hely

Az az aminosavrész, amely ezen a helyen van, a méta- szubsztituált L-fenil-alaninból [Phe(X)] származik. Az X helyettesítő jelentése meta-helyzetű bróm-, klórvagy jódatom, 1-3 szénatomos alkilcsoport, trifluormetil-csoport vagy 1-2 szénatomos alkoxiesoport. Előnyösen X klór-, bróm- vagy jódatomot, legelőnyösebben klór- vagy brómatomot jelent.

A szóbanforgó aminosavrész az aminocsoport nitrogénatomján helyettesítenem (E). 5-ös hely

Az I általános képletü vegyületek C-terminális helyzetében lévő -B-Z általános képletü csoport egy olyan aminosav, amely a megfelelő amiddá van alakítva, és együttes jelentése L-(N-metil)-metionin-amid vagy Lfenil-glicin-amid-csoport, ahol Z jelenti az amidcsoportot.

Miként azt már említettük, az 5-ös helyben lévő aminosavrész primer amid.

A jelen szabadalmi leírásban az alábbiakban felsorolt rövidítéseket alkalmazzuk, ezek közül a legtöbb közismert és azokat a szakmában általánosan használják:

Alá = alanin

Gly = glicin

Leu = leucin

Mvt = nretionin

Pgl = fenil-glicin

Phe = fenil-alanin

Tyr = tirozin

Ac = acetilcsoport

Me ~ metiiesoport

Et = etilcsoport

Pr = n-propilcsoport

MeO — metoxiesoport

EtO - etoxiesoport

Boc = terc-butil-oxi-karbonil-csoport

Bzl = benzilcsoport

DCC = Ν,Ν'-diciklohexil-karbodiimid

IIBT = 1-hidroxi-benztriazol

DMF = N,N-dimetil-formanrid

TEA = trifluor-ecetsav

THF = tetrahidrofurán

DEAE = dietil-amino-etil-csoport

IBCF = klórhangyasav-izobutilészter (izobutil-klór-formiát)

NMM = N-metil-morfolin

18-crown-6 = 1,4,7,10,13,16-hexaoxa-ciklooktadekám

Az I általános képletü vegyületekre jellegzetes példaként az alábbiakat soroljuk fel, ezek valamennyien a feníl-alanin-rész gyűrűjén egy méta helyzetű helyettesítőt hordoznak és közülük bármelyik valamilyen gyógyászatban alkalmazható savaddíciós só formájában is lehet:

-3185 321

H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe(I)-L<N-Me)Met-NH₂;

H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe(Cl)-L-(N-Et)Met-NH₂;

H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe(Br)-L-(N-Me)Met-NH₂ és a fentiekhez hasonló vegyületek.

Az I általános képletü vegyületeket a peptidek szintézisére szokásosan használt módszerekkel állítjuk elő. Előfordulhat, hogy bizonyos I általános képletü vegyületek szintézise során részleges racemizálódás következik be. A racemizálódás mértéke azonban nem jelentős és amennyiben ez bekövetkezne, ügy az I általános képletü vegyületek fájdalomcsillapító hatása emiatt nem fog szignifikánsan megváltozni.

Az I általános képletü vegyületeket szilárd fázisban végzett peptidszintézissel és a folyékony fázisban végzett klasszikus peptidszintézissel egyaránt elő lehet állítani. A szilárd fázisú peptidszintézis során a peptidláncot szekvenciálisán építjük fel, amihez egy műgyantát, benzhidril-amin-gyantát vagy klór-metilezett polisztirol-gyantát használunk. A terméket a gyantáról 0 °C hőmérsékleten hidrogén-íluoriddal vagy pedig ecetsavval hasítjuk le és általában kromatográfiásan tisztítjuk. A folyékony fázisban végzett szintézis során a peptidláncot úgy alakítjuk ki, hogy a különféle aktivált és védett aminosavakat - a legtöbb esetben tetszőleges sorrendben egymással reagáltatjuk, majd a védőcsoportokat erre alkalmas reagensekkel, mint például egy savval, így példának okáért trifluor-ecetsavval (TFA), p-toluolszulfonsavval (TSA), benzolszulfonsavval (BSA), metánszulfonsavval (MSA), naftalinszulfonsavval, ecetsavban oldott sósavgázzal vagy hangyasavval, eltávolítjuk. Ennél a reakciónál rendszerint még valamilyen karbónium-iontól mentesítő, úgynevezett kationfogó szert is alkalmazunk, ilyen például az anizoí, a tioanizol vagy a trietilszilán; az anizol használata előnyös. A reakciókörülmények a szokásosak és azok a peptidkémiában jártas szakemberek előtt jól ismertek. így például a trifluor-ecetsavval (TFA) végzett reakciót körülbelül -10 °C-tól körülbelül + 30 °C-ig terjedő hőmérsékleten hajtjuk végre.

Bármelyik módszert alkalmazzuk az I általános képletül vegyületek előállítására, az eljárás során aminosavakat vagy pentid-fragmenseket kell összekapcsolni oly módon, hogy az egyiknek a karboxilcsoportját a másiknak az aininocsopoitjával reagáltatjuk, miközben smid-kötest hozunk létre. A kapcsolási reakció jó hatásfokkal való megvalósításához követelmény, hogy 1) minden reakcióképes funkciós csoport, amely nem vesz részt követlcnül a reakcióban, valamilyen alkalmas védőcsoporttal inaktivált legyen: 2) az a karboxilcsoport. melyet kapcsolni szándékozunk, megfelelő módon aktivált legyen, ami a kapcsolási reakció megvalósulását lehetővé teszi. Mindezekhez hozzátartozik még a reakciók sorrendjének és a reakciók körülményeinek gondos megválasztása, valamint a speciális védőcsoportok alkalmazása annak érdekében, hogy a kívánt peptid-terméket állítsuk elő. Az I általános képletü vegyületek szintézise során használt aminósavakat, melyek különös gonddal megválasztott vcdőcsoportokkal védettek, és/vagy a megfelelő funkciós csoportjuk aktiválva van. a peptidkémiában jól ismert eljárások alkalmazásával állítjuk elő.

Az I általános képletü vegyületek teljes szintézisének minden egyes lépésénél a védőcsoportok speciálisan megválasztott kombinációit kell alkalmazni, ilyen kombinációk alkalmazása esetén a reakciók enyhe reakciókörülmények között, igen simán végbemennek. Az I általános 4 képletű vegyületek szintézisénél természetesen másfajta kombinációk is alkalmazhatók, de a reakciók hatásfoka ez esetben feltehetően kisebb lesz. így például a benziloxi-karbonii-, a terc-butil-oxi-karbonil-, a terc-amil-oxikarbonil-, a p-metoxi-benzil-oxi-karbonil-, az adamantiloxi-karbonil- és az izobornil-oxi-karbonil-csoportot különféle variációkban jól fel lehet használni aminocsoportok megvédésére, az I általános képletü vegyületek szintézise során. Ezen túlmenően a benzilcsoport (Bzl) a tirozilgyök hidroxilcsoportjának védelmére általában véve jól alkalmazható, de más csoportokat, így például p-nitro-benzil- (PNB) vagy p-metoxi-benzil- (PMB) csoportot, illetve ezekhez hasonlókat is jó eredménnyel használhatunk.

Karboxilcsoportot védő csoportként az I általános képletü vegyületek előállítása során bármilyen jellegzetes észterképző csoportot alkalmazhatunk, ilyenek például a metilcsoport, az etilcsoport, a benzilcsoport, a p-nitrobenzil-csoport, a p-metoxi-benzil-csoport, a 2,2,2-triklóretil-csoport és más hasonlók.

Az 1 általános képletü vegyületek előállítása során az alkalmas módon N-védett aminosav vagy peptidfragmens és a karboxilcsoportján megfelelően védett másik aminosav vagy peptid-fragmens kapcsolási reakciójához hozzátartozik, hogy az aminosav vagy a peptidfragmens szabad karboxilcsoportját aktiváljuk, miáltal az a kapcsolási reakcióra alkalmassá válik. Ezt a rendelkezésünkre álló és jól ismert eljárások, fogások közül bármelyikkel megvalósíthatjuk. Egy ilyen aktiválási eljárás lényege az, hogy a karboxilcsoportot vegyes anhidriddé alakítjuk át. Ezt úgy végezzük, hogy a karboxilcsoportot egy másik savval végzett reakció útján aktiváljuk; a reakciót jellegzetes módon egy karbonsavszármazékkal — a szénsav származékait is ideértve — mint például a karbonsavnak megfelelő savkloriddal hajtjuk végre. A vegyes anhidridek képzésére használt savkloridok közül példaképpen a klórhangyasav-etilésztert, a klórhangyasav-fenilésztert, a klórhangyasavszek-butil-észtert, a klórhangyasav-izobutilésztert (más nevükön etil-klór-formiát stb.), valamint a pivaloilkloridot és hasonlókat említjük meg, előnyös az izobutilklór-formiát.

Egy másik módszer szerint a karboxilcsoportot a kapcsolási reakcióhoz úgy is aktiválhatjuk, hogy az említett csoportot valamilyen aktív észterszármazékká alakítjuk át. Ilyen aktív észterek például a 2,4,5-triklórfenil-észter, a pentaklór-fenil-észter, a p-nitro-fenil-észter és hasonlók. Egy további és igen alkalmas 'kapcsolási módszer a jól ismert azidos kapcsolási eljárás.

Az I általános képletü vegyületek előállításánál használt kapcsolási módszerek között előnyös az az eljárás, melynek során a szabad karboxilcsoport aktiválására Ν,Ν'-diciklohexil-karbodiimidet (DCC) használunk és így segítjük elő a kapcsolást. Ezt az aktiválást illetve kapcsolást úgy valósítjuk meg, hogy az aminosavra vagy a peptid-fragmensre számítva ekvimoláris mennyiségű DCC-et használunk és a reakciót ugyancsak ekvimoláris mennyiségű 1-lüdroxi-benztriazol (HBT) jelenlétében valósítjuk meg. A HBT jelenléte visszaszorítja a nem kívánt mellékreakciókat, az esetleges racemizációt is beleértve.

Az 1 általános képletü vegyületek előállításánál a szintézis folyamán, pontosabban annak meghatározott fázisaiban, a megfelelően kiválasztott védőcsoportok lehasítása szükségessé válik. A védőcsoportok eltávolí-41

185 321 tását az ilyen célra szokásos (úgynevezett (leblokkoló) szerek segítségével valósítjuk meg. A peptidek szintézisében átlagos szakmai jártassággal rendelkező vegyész könnyen ki tudja választani a rendelkezésére álló védőcsoportok közül azokat, melyek kompatibilisek a szó olyan értelmében, hogy azokat a termékről szelektíven le lehet hasítani. Ez más szavakkal kifejezve azt jelenti, hogy az aminosav vagy a peptid-fragmens védőcsoportjai közül csak egyet vagy többet távolítunk el, de nem hasítjuk le valamennyit. Ezek az eljárások a peptidkémiában jól ismertek. A védőcsoportok szelektív lehasitására szolgáló módszerek részletesebb ismertetését a szakirodalomban megtalálhatjuk, lásd például Schröder és Lübke: The Peptides, Volume I. Academic Press, New York (1965) című munkáját és különösen a mű 72—75. oldalán található táblázatot.

A karboxil-védőcsoportok lehasítását alkálikus körülmények között végzett elszappanosítással valósíthatjuk meg. Az észterek hidrolíziséhez viszonylag erősen alkálikus reakciókörülményeket alkalmazunk, így alkálifémhidroxidot, mint például nátrium-hidroxidot, káliumhidroxidot, lítium-hidroxidot és ezekhez hasonló vegyületeket használunk. Szakmai körökben jól ismertek azok a reakciókörülmények, melyek között ez az elszappanosítási reakció végbemegy. A karboxilcsoportot védő sokféle csoport közül többet katalitikus hidrogenolízissel is el lehet távolítani, ilyen módszer például a szénre felvitt palládium katalizátor jelenlétében végzett hidrogenolízis. Azokban az esetekben, amikor a karboxilcsoport védöcsoportja p-nitrobenzil- vagy 2,2,2-triklóretil-csoport, ezek lehasítását cinkkel és sósavval végzett redukció útján is elvégezhetjük.

Számos amino-védöcsoportot le lehet hasítani oly módon, hogy a védett aminosavat vagy pepiidet valamilyen savval, így például hangyasawal, trífluor-ecetsawal (TFA), p-toluolszulfonsawal (TSA), benzolszulfonsawal (BSA), naftalinszulfonsawal és hasonlókkal kezeljük, amikor is termékül a megfelelő savaddíciós sót kapjuk. Más csoportok, így például a benzil-oxikarbonil-csoport lehasítását a védett aminosav vagy peptid hidrogén-bromid - ecetsav eleggyel végzett kezelésével lehet megvalósítani és ennek során a megfelelő hidrogén-bromid savaddíciós sót kapjuk. A védőcsoportok eltávolítására irányuló reakciók során az alkalmazásra kerülő egyes módszereket vagy reagenseket ezen speciális reakciókban résztvevő anyagok kémiai és fizikai tulajdonságaitól függően választjuk meg. A kapott savaddíciós sót úgy lehet átalakítani valamilyen farmakológiai szempontból előnyösebb és jobban elfogadható sóvá, hogy az előbbit egy alkalmas ioncserélő gyantával, mint például DEAE Sephadex A25-tcl vagy Amberlyst A27-tel, illetve ezekhez hasonlókkal kezeljük.

A hidroxilcsoport védőcsoportját meg lehet tartani a peptidmolekulán a szintézis folyamatán; ilyen esetben annak lehasítását az aminocsoportot védő csoport lehasításával együtt, a szintézis utolsó lépésében végezzük. Azonban a karboxilcsoportot blokkoló csoport eltávolításánál alkalmazott körülményektől függően a hidroxilcsoport védőcsoportját az előállítási folyamat korábbi szakaszában is el lehet távolítani. A hidroxilcsoportot védő csoport változatlanul megmarad, ha a karboxilcsoportot alkálikus elszappanosítással tesszük szabaddá, de ha a karboxilcsoport védőcsoportjának eltávolítása céljából katalitikus lűdrogénezési reakciót alkalmazunk, úgy a hidroxilcsoport védőcsoportja is le fog hasadni.

Ez utóbbi azonban nem jelent komoly problémát, mivel az I általános képletű vegyületek előállítását szabad hidroxilcsoportot tartalmazó tirozin-rész (így például a tirozilgyök) jelenléte esetén is el tudjuk végezni.

Az 1 általános képletű vegyületek előállítására szolgáló klasszikus módszerek — vagyis a folyadékfázisban megvalósított módszerek — közül az egyik előnyös eljárásváltozat abból áll, hogy a külön előállított N-terminális tripeptidet az ugyancsak külön előállított C-terminális dipeptiddel kapcsoljuk, majd a még meglévő védett csoportokról a védőcsoportokat alkalmas módon lehasítjuk. A külön előállított C-terminális dipeptidet, melyet az N-terminális tripeptiddel reakcióba viszünk, úgy alakítjuk ki, hogy az egy amidcsoportot tartalmazzon. Egy másik változat szerint ez egy olyan csoportot hordozhat, amely a kívánt C-terminális csoport prekurzora. Az eljárást és a lépések sorrendjét az 1 általános képletű pentapeptidek tekintetében az I. Folyamatábrán szemléltetjük, ahol Z a C-terminális csoportot jelenti, mégpedig akár végleges formában, akár prekurzor alakjában, míg AA egy aminosavgyököt jelent és az AA szimbólum mellei t lévő szám az aminosav pozíciószámát jelenti a peptid végtermék aminosav-sorrendjének megfelelően.

Az I. Folyamatábrán az 1 általános képletű vegyületek előállításának csak az egyik lehetséges reakciósorozatát mutattuk be és más reakciósorozatot is alkalmazhatunk. így például a folyadékfázisú módszert lépésenként is megvalósíthatjuk, amikor is a peptidlánc felépítését a C-terminális aminosavnál kezdjük el, és ehhez az egyes aminosavakat a szekvenciának megfelelően egymás után kapcsoljuk. A módszert illetően használhatjuk az előbbiekben leírtakat, de a kívánt célnak megfelelő más módszerek is alkalmazhatók.

A peptidek kémiájában és szintézisük módszerei területén jártas szakemberek előtt nyilvánvaló, hogy erősen alkálikus reakciókörülmények között, mint például a fenti f ikilezési lépés során, az α-szénatomon racemizálódás léphet fel. A racemizálódás a reakcióban alkalmazott aminosavtól függően kisebb vagy nagyobb mértékű lehet. A racemizációt úgy lehet visszaszorítani, illetve a minimumra csökkenteni, hogy az alkilezőszert feleslegben használjuk és a reakciót a lehető legrövidebb idő alatt véghezvísszük. Mégis, ha nagyfokú racemizálódás lépne fel, úgy a terméket egy alkalmas kiralitású aminnal, mint például d(+)-a-fenil-etil-aminnal képezett sója alakjában, átkristályosítási művelettel tisztítani lehet.

Az I általános képletű peptidek C-terminális része szabad karboxilcsoport, de ezt át kell alakítani primer amiddé. Az I általános képletű amidált pentapeptidekben az amidcsoport helyettesítetlen. Az amiddá történő átalaki'ást úgy valósítjuk meg. hogy az aminosav karboxilcsoportját N.N'-diciklohexil-karbodiimiddel (DCC) aktiváljuk l-hidroxi-benztriazol (HBT) jelenlétében, amikor is HBT-észtert kapunk. Ezt az észtert azután vízmentes ammóniával vagy a megfelelő primer aminnal reagáltatjuk, és így a helyettesítetlen amidokhoz jutunk. Az I általános képletű pentapeptidek előállításához alkalmas primer aminok a következők: metil-amin, etilamin, n-propil-amin és izopropil-amin.

Az 1 általános képletű vegyületek értékes gyógyszerhatóanyagok, melyek fájdalomcsillapító és neuroleptikus hatással rendelkeznek. Különösen alkalmasak a fájdalmak és az emocionális zavarok enyhítésére illetve csökkentésére, amennyiben ezeket emlősökön (az embert is beleértve) parenterálisan vagy orálisan alkalmazzuk.

-5185 321

A találmány tárgya az I általános képletü vegyületeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására is vonatkozik, a gyógyszerkészítmények az I általános képletü vegyületet egyedül vagy a gyógyszertechnológiában szokásosan alkalmazott segédanyagokkal össze- 5 keverve tartalmazzák. Az utóbbi esetben a segédanyagok mennyiségét a hatóanyagként használt vegyület oldhatósága és kémiai tulajdonságai, a gyógyszerbeadás módja és a szokásos gyógyszerészeti gyakorlat fogja meghatározni. 10

Előnyösek a parenterálisan alkalmazható gyógyszerkészítmények, vagyis melyeket intramuszkulárisan, szubkután vagy intravénásán adunk be. Ilyenek a steril, injiciálható oldatok vagy szuszpenziók, továbbá a steril, injiciálható depot-készítmények vagy a hatóanyag lassú 15 felszabadulását biztosító egyéb készítmények. Különösen alkalmasak az izotóniás sóoldattal vagy izotóniás dextróz-oldattal készített steril, injiciálható oldatok. Ezeket a steril, injiciálliató gyógyszerkészítményeket előállíthatjuk és tárolhatjuk az előbbi alakban, de elő- 2C állíthatunk olyan készítményeket is, melyeket közvetlenül a felhasználás előtt, valamilyen steril oldószer, mint például víz hozzáadásával lehet injekció útján történő beadásra alkalmassá tenni. Ez utóbbiak a steril hatóanyag ismert mennyiségét tartalmazzák például 25 gumidugóval lezárt üvegben vagy leforrasztott ampullában és így a hatóanyag sterilitása biztosítva van. Az ismert mennyiségű steril hatóanyagon kívül ezek a készítmények még az izotóniás oldatok vagy szuszpenziók előállításához szükséges mennyiségű steril dextrózt 30 vagy nátrium-kloridot is tartalmazhatnak és így a steril oldószer hozzáadása után a már izotóniás oldathoz jutunk.

Ugyancsak előnyösek az orális beadásra készült gyógyszerkészítmények. Ezeket előállíthatjuk egyszeri alkal- 35 mazásra szánt készítmények, mint például kapszulák, tabletták vagy ezekhez hasonlók alakjában; az egyszeri adagok a hatóanyagból előre meghatározott mennyiséget tartalmaznak. Ezen túlmenően előállíthatunk még port, granulátumot, valamint vizes vagy nem-vizes olda- 40 tokát, szuszpenziókat vagy emulziókat.

A tablettákat sajtolással készíthetjük, amihez általában egy vagy több segédanyagot is használunk. A tablettákat elő lehet állítani oly módon, hogy a hatóanyagot egymagában, például por vagy szemcsék alakjában sajtol- 45 juk, de a hatóanyagot általában egy- vagy többféle más anyaggal is összekeverjük. Ilyenek például a kötőanyagok, a kenőanyagok, az inért töltőanyagok, a csúsztatószerek, a felületaktív anyagok, a pufferek, az ízesítő és illatosító szerek, hígítószerek, a konzerválószerek, a 53 diszpergálószerek és az ezekhez hasonlók.

Az I általános képletü vegyületek alkalmas dózisát a kezelőorvos határozza meg, Az említett dózis — az alkalmazás módjától, az alkalmazni kívánt vegyülettől, a kezelendő betegtől és a kezelés módjától függően - változó. 55 Általában véve azonban a dózis körülbelül 10 pg2 mg/testsúly kg, előnyösen körülbelül 100 pg--500 pg/testsúly kg intramuszkuláris vagy szubkután alkalmazás esetén és körülbelül· 1 pg-200 pg/testsúly kg, előnyösen körülbelül 3 jUg-50 /rg/testsúly kg intravénás alkal- θθ mazásnál. Orális alkalmazás esetén a dózis általában körülbelül 1 mg 500 mg/testsúly kg, előnyösen körülbelül 50 mg 200 mg/testsúly kg, és még előnyösebben körülbelül 50 mg 100 mg/testsúly kg.

A következő példákban az I általános képletü vegyü- 55 letek előállítását és farmakológiai aktivitását kívánjuk bemutatni anélkül, hogy ezzel a találmányt ezen példákra korlátoznánk. A következő példákban szereplő rövidítések jelentését a korábbiakban már megadtuk.

1. példa

L-Tirozil-D-alanil-glicil-L-m-bróm-fenil-alanilL-(N “ -me til)-metio nin- amid-acetát előállítása

A. L-Tirozil-D-alanil-glicil-DL-m-bróm-fenil-alanilL-(N^a-metil)-metionil-benzhidril-amin-gyanta trifluorecetsavas sója

A gyantához kötött pepiidet automatizált szilárd fázisú szintézissel egy „Beckman 990 Peptide Synthetizer”-ben állítjuk elő és 3,5 g úgynevezett benzhidrilamin-gyantát (Beckman, 0,47 mmól-N/g) használunk. A gyantát metilén-dikloridos oldatban lévő 4% diizopropil-etil-aminnal (DIEA) semlegesítjük, majd ugyancsak metilén-dikloridban lévő Boc-(N-Me)Met-OH-nal, DCC jelenlétében kapcsoljuk. Ily módon Boc-(N-Me)Met-nal helyettesített gyantát kapunk. A Boc-DL-(m-Br)Phe-OH-t, a Boc-Gly-OH-t, a Boc-D-Ala-OH-t és a BocTyr-OH-t egymás után kapcsoljuk a gyantán kötött pepiidre előbb az 1. kapcsolási program szerinti műveletsorozattal és ezt követően ugyanazt az aminosavat újból kapcsoljuk, de a 2. kapcsolási program szerint. A 2. programot mindegyik aminosav vonatkozásában egyszer végezzük el, kivéve a DIXm-Br)-Phe-OH-t, melyet három ízben kapcsolunk. A kapott Boc-pentapeptid-gyantáról a védőcsoportokat az 1. program 1-8, lépései szerint távolítjuk el és így 4,04 g cím szerinti vegyületet kapunk. Az 1. és 2. programban szereplő mosásokat 1 g gyantára számítva 8 ml térfogatú oldószerrel, illetve oldószereleggyel végezzük.

1. program

1. Háromszori mosás metilén-dikloriddal.

2. 5 perces kezelés térfogat szerint 30:5:65 arányú TFA : Et₃SiH : metilén-diklorid eleggyel.

3. A 2. lépés szerinti kezelés, ezúttal 30 percig.

4. Kétszeri mosás metilén-dikloriddal.

5. Mosás metanol: metilén-diklorid (1:1) eleggyel.

6. Kétszeri mosás metanollal.

7. Mosás metanol: metilén-diklorid (1:1) eleggyel.

8. Kétszeri mosás metilén-dikloriddal.

9. Négyszeri, alkalmanként 2 percig tartó kezelés metilén-dikloridos oldatban lévő 4% DIEA-nal.

10. A 4-8. lépéssorozat megismétlése.

11. 120 perces kezelés a kívánt aminosavszármazék 2,5 ekvivalens mennyiségét tartalmazó metiléndikloridos oldattal és 1,25 ekvivalens DCC-et tartalmazó metilén-dikloridos oldattal.

12. Négyszeri mosás metilén-dikloriddal.

13. Az 5—7. lépések megismétlése.

14. Háromszori mosás metilén-dikloriddal.

2. program

1. Négyszeri, alkalmanként 2 percig tartó kezelés metilén-dikloridos oldatban lévő 4% DIEA-nal.

185 321

2. Kétszeri mosás metilén-dikloriddal.

3. Mosás metanol .-metilén-diklorid (1 .Ί) eleggyel.

4. Kétszeri mosás metanollal.

5. Mosás metanol :metilén-diklorid (1 :1) eleggyel.

6. Kétszeri mosás metilén-dikloriddal.

7. Háromszori mosás DMF : metilén-diklorid (1:1) eleggyel.

8. 120 perces kezelés a kívánt aminosavszármazék 2,5 ekvivalens mennyiségét tartalmazó és DMF : : metilén-diklorid (1 :1) eleggyel készült oldattal, továbbá 1,25 ekvivalens DCC-et tartalmazó metilén-dikloridos oldattal.

9. Négyszeri mosás DMF: metilén-diklorid (1:1) eleggyel.

10. A 4-6. lépések megismétlése.

B. L-Tirozil-D-alanil-glicil-DL-m-bróm-fenil-alanilL-(N“-metil)-metionin-amid hidrogénfluoridja

Az A. pont szerint kapott peptid-gyantát (vagyis a gyantán kötött pentapeptidet) vízmentes, cseppfolyós hidrogén-fluoriddal és „kationfogó”-ként (scavenger) anizollal vákuumban 60 percig 0 °C hőmérsékleten reagáltatjuk. A reakcióelegyböl az illékony komponenseket vákuumban eltávolítjuk, majd a peptid-gyantát éterrel trituráljuk és szűrjük a hidrogén-fluorid valamint az anizol maradványainak eltávolítása céljából. A pepiidet a gyantáról 10 %-os ecetsavval végzett triturálással extraháljuk. A 10 %-os ecetsavval kapott kivonatot liofilizáljuk és így 533 ing cím szerinti nyers vegyületet kapunk.

C. A végtermék kinyerése kromatográfiás tisztítási művelettel

A peptid-diasztereomerek nyers elegyét 5X72 cm-es oszlopon, fordított fázisban (Cj₈) szilikagélen, alacsony nyomást (6,3 kg/cm^{2 * *}) alkalmazva kromatografáljuk, amihez 28% acetonitrilt tartalmazó 0,1 n ammóniumacetát-oldatot használunk. 2000 ml eluátum után másfél percenként 17,1 ml-es frakciókat veszünk, majd a 78115. frakciókat egyesítjük és liofilizáljuk. A liofilizált terméket 0,2 n ecetsavas oldatban Sephadex G-10-et tartalmazó 2,5X100 cm-es oszlopon kromatografáljuk az ammónium-acetát maradványainak eltávolítása céljából. A frakciókat liofilizáljuk és így amorf, fehér, szilárd anyag formájában 198,7 mg cím szerinti vegyületet kapunk.

Az anyag fizikai állandói:

[a]g =+20,4° (c = 0,5. In HC1),

M²3⁵65 =+75,4° (c-0,5, InHCl).

Analízis a C₃₁H₄₃BrN₆O₈S (739,697) képlet alapján: számított: C = 50,34%, H = 5,86%, N= 11,36%,

Br = 10,80%;

talált: C = 50,11%, H = 5,56%, N= 11,07%,

Br = 11,03%.

Aminosav-analízis:

	Tyr	Alá	Gly	m-BrPhe	nh₃	Peptid %
(1)	1,00	0,99	0,99	1,01	0,91	103
(2)	1,00	0,99	1,00	1,01	0,93	99

2. példa

L-Tirozil-D-alanil-glicil-L-m-metoxi-fenil-alanilL-(N“-metil)-metionin-amid-acetát előállítása

A. N“-terc-Butil-oxi-karbonil-DL-m-metoxi-fenilalanil-L-(N“-metil)-metionin-amid

1,29 g (6,47 mmól·) N“-metil-metionin-amid-hidroklorid 7,0 ml hideg (0 C) DMF-dal készült szuszpenziójához hozzáadunk 1,11 ml (6,47 mmól)DIEA-t. Ezután az elegyhez 5,0 ml DMF-ban oldott 1,91 g(6,47 mmól) Boc-DL-(m-MeO)-Phe-OH-t, majd 1,75 g (12,9 mmól) HBT-t és 13 ml DMF-ban oldott 1,33 g (6,47 mmól) DCC-et adunk. A kapott reakcióelegyet kalcium-szulfátot tartalmazó (CaSÖ₄) száiítócső alkalmazása mellett 0 °C-on 4 órán át, majd szobahőmérsékleten 16 órán át keverjük. A diciklohexil-karbamid eltávolítása céljából az elegyet szüljük, majd a szűrletet vákuumban bepároljuk és így egy narancsszínű maradékot kapunk. Ezt a maradékot 100 ml etíl-acetátban oldjuk. Az etil-acetátos oldatot sorrendben először háromszor 100—100 ml vízzel, majd háromszor 100-100 ml 10-es pH-jú pufferoldattal, ezután háromszor 100-100 ml 0,1 n sósavoldattal, végül ismét háromszor 100—100 ml vízzel mossuk. Az etil-acetátos fázist vízmentes magnéziumszukát felett szárítjuk, szűrjük és az oldószert vákuumban eltávolítjuk. Ily módon 2,23 g (81%) cím szerinti vegyületet kapunk. Az anyagban vékonyréteg-kromatográf ás módszerrel (tlc) DCU jelenlétét lehet kimutatni.

B. DL-m-Metoxi-fenil-alanil-L-(N^a-metil)-metioninamid-hidroklorid

Az A. pont szerint előállított 2,23 g (5,24 mmól) vegyület 10 ml ecetsavval készült oldatához hozzáadunk 1,6 ml anizolt és 16,2 ml 1,62 n ecetsavas hidrogén-klorid-oldatot. A kapott oldatot kalcium-szulfátos szár'tócső alkalmazása mellett, szobahőmérsékleten egy óráig keverjük, majd 470 ml éterrel hígítjuk. A.kapott csapadékot kiszűrjük, háromszor 15-15 ml éterrel mossuk és 25 °C hőmérsékleten vákuumban szárítjuk, így a cím szerinti vegyületből 1,53 g-ot (81%) kapunk.

C. N“-terc-Butil-oxi-karbonil-L-tirozil-D-alanil-glicilDL-m-metoxi-fenil-alanil-L-(N^a-metil)-metioninamid

Boc-L-Tyr-D-Ala-Gly-OH diciklohexil-amin sójából 2,48 g-ot (4,2 mmól) hozzáadunk 7,0 ml dimetil-formamidhoz (DMF). A reakcióelegyet acetonos-jeges hűtőfürdővel -10 °C-ra lehűtjük. Ezután az elegyhez 0,09 ml (0,84 mmól) N-metil-morfolint és 0,55 ml (4,2 mmól) klórhangyasav-izobutilésztert adunk, majd az elegyet 2 percig keveijük. Ezután a reakcióelegyhez hozzáadjuk a B. pont szerinti termék (1,51 g, 4,2 mmól) és 0,47 ml (4,2 mmól) N-metil-morfolin elegyének 16,5 ml DMFdal készített és -10 °C-ra lehűtött oldatát. Az így kapott reakcióelegyet kalcium-szulfátos szárítócső alkalmazása mellett, olvadó jeges-acctonos hűtőfürdőben 16 órán át keveijük.

Az elegyet az oldhatatlan anyagok eltávolítása céljából szűrjük és a szűrletet vákuumban bepároljuk. így sárga színű maradékot kapunk, ezt 50 ml etil-acetát és 50 ni víz között megosztjuk és a fázisokat egymástól elválasztjuk. A vizes fázist három ízben, alkalmanként 50- 50 ml etil-acetáttal mossuk, és az egyesített etilacetátos oldatokat előbb háromszor 50-50 ml 5 %-os nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, majd háromszor 50-50 ml 1,5 n citromsavoldattal, végül háromszor 7

-7185 321

50-50 ml vízzel mossuk. Az etil-acetátos fázist ezután magnézium-szulfát felett szárítjuk, szilijük, majd az oldószert vákuumban eltávolítjuk. Ily módon 2,84 g (93 %) cím szerinti vegyülethez jutunk.

D. L Tirozil-D-alanil-glicil-DL-m-metoxi-fenilalanil-L-(N^a-metil)-metionin-amid-trifluor-acetát

A C. pont szerint kapott 2,84 g (3,89 mmól) vegyülethez hozzáadunk 3,5 ml anizolt és 35 ml trifluor-ecetsavat. Az így kapott oldatot kalcium-szulfátos szárítócső alkalmazása mellett szobahőmérsékleten 1,25 órán át keveijük, majd a reakcióelegyet vákuumban bepároljuk, így egy sárga színű olajos anyagot kapunk, melyhez 900 ml étert adunk. A kivált csapadékot szűréssel elkülönítjük és 25 °C-on vákuumban szárítjuk. Ily módon 2,61 g (90%) cím szerinti nyers vegyületet kapunk.

E. A végtermék előállítására végzett kromatografálásos tisztítási művelet

A D. pont szerint előállított terméket az 1. példa C. pontjában leírt módon kezeljük a két diasztereomer elválasztása céljából. így 758 mg cím szerinti vegyületet kapunk, melynek fizikai állandóit az alábbiakban adjuk meg.

[a&⁵ =4-25,6° (c = 0,5, 1 n HC1).

= 492,9° (c = 0,5, 1 n 1IC1).

Analízis a C₃₂H4₆N₆O₉S (690,822) képlet alapján: számított: C = 55,64%, H = 6,71%, N=12,17%;

talált: C = 55,50%, H = 6,60%, N= 12,32%.

Aminosav-analízis:

Tyr Alá Gly m-MeOPhe NH₃ Peptid%

1,00 1,00 1,01 1,12 1,02 96

Az 1. példában leírt eljárással további vegyületeket állítunk elő. Ezeket a vegyületeket és fizikai állandóikat az alábbiakban ismertetjük.

3. példa

L-Tirozil-D-aianil-glicil-L-m-trifluor-metil-fenÍlal anil-L-(N “ -metil)-met ionin-amid-acetát [cdD = + 15,29° (c = 0,5, 1 n HC1), [αβ|₅ =+56,47° (c = 0,5, 1 n HC1).

Analízis a C₃₂FÍ4₃F₃N₆O₈S (728,794) képlet alapján:

számított: C = 52,74%, H = 5,95%, N= 11,53%,

F = 7,82%;

talált: C = 53,03%. 11 = 5,70%, N= 11,72%,

F-=7,61%.

Aminosav-analízis:	Gly	m-CF₃Phe	nh₃	Peptid %
	Tyr	Alá
(1)	0,99	1,00	1,02	0,99	1,01	98,5
(2)	0,99	1,00	1,01	1,00	0,95	97,1

4. példa

L-Tirozil-D-alanil-glicil-L-m-kJór-fenil-alanilL-(N“-metil)-melionin-amid-acetát

Mn =4-19,67° (c = 0,5, 1 n HC1), [“]365 =+69,64° (c = 0,5, 1 n HC1).

Analízis a C₃iH₄₃C1N₆O₈S (695, 241) képlet alapján: számított: C = 53,56%, H = 6,23%, N = 12,09%; talált: C = 53,84%, H = 6,17%, N = 12,31%.

Aminosav-analízis:

	Tyr	Alá	Gly	m-CIPhe	nh₃	Peptid %
(1)	1,01	1,00	0,96	1,04	1,01	97,4
(2)	1,00	1,01	0,99	1,01	1,02	98,1

5. példa

L-Tirozil-D-alanil-glicil-L-m-metil-fenil-alanilL-(N^Q-metil)-metionin-amid-acetát [a]g = + 15,01° (c = 0,5, 1nHCl).

[aJltí = + 53,35° (c = 0,5, 1 n HC1).

Analízis a C₃₂H4^N₆O_BS (674,823) képlet alapján: számított: C = 56,96%, H = 6,87%, N = 12,45%; talált: C = 57,18%. H = 6,58%, N = 12,36%.

Aminosav-analízis:

Tyr Alá Gly m-MePhe NH₃ Peptid% (1) 0,99 0,98 0,97 1,03 1,01 95 (2) 0,99 0,99 0,99 1,01 0,91 94

A 2. példában leírt eljárással további vegyületeket állítunk elő. Ezeket a vegyületeket és fizikai állandóikat az alábbiakban ismertetjük.

6. példa

L-Tirozil-D-alanil-glicil-L-m-jód-fenil-alanilL-(N ^a -metil)-metionin-amid-acetát [allf = + 12,6° (c = 0,5, 1 n HC1), [a]₃65 =+50,6° (c = 0,5, InHCl).

Analízis a C₃iH₄₃IN₆O₈S (786,692) képlet alapján·.

számított: C = 47,33%, H = 5,51%, N = 10,68%, = 16,13%;

talált: C = 47,14%, H = 5,53%, N = 10,57%,

1= 16,31%.

Aminosav-analízis:

Tyr Alá Gly m-IPhe NH₃ Peptid%

1,01 1,00 1,01 0,92 1,08 93

7. példa

L-Tirozil-D-alanil-glicil-L-m-bróm-fenil-alanilLfenil-glicin-amid-acetát [a]²o⁵ =+78,90° (c = 0,5, InHCl), [α]²« = +299,2° (c = 0,5, 1 n HC1).

Analízis a C₃₃H₃₉BrN₆O₈ (727,618) képlet alapján: számított: C = 54,47%, H = 5,40%, N = 11,55%,

Br= 10,98%;

talált: C = 54,29%, H = 5,12%, N = 11,32%,

Br = 11,18%.

Aminosav-analízis:

Tyr Alá Gly m-BrPhe Pgl NH₃ Pepiid % 1,00 1,01 1,00 0,99 0,94 1,02 91

Az 1 általános képletű vegyüíetek fájdalomcsillapító hatását egereken az úgynevezett „forró lemez”-teszt segítségével lehet kimutatni. Ebben a tesztben egy akrilgyantából készült és függőlegesen álló hengert haszná-81

185 321 lünk, amely egy 52 °C-ra fűtött lemezfelületre van elhelyezve. A kísérletnél használt egérnek (Cox Standard) szubkután injekciót adunk be, amely a vizsgálandó vegyületből egy előre meghatározott mennyiséget tartalmaz valamely alkalmas hordozóanyagban oldva vagy szuszpendálva. A vizsgálandó vegyület beadása után 15 perccel az egeret a fűtött lapra tesszük. Azt a reakció időt mérjük másodpercekben, amely az állat elhelyezése és a forró lemezről való felugrása között eltelik. Egy fájdalomcsillapító hatással rendelkező hatóanyag az említett reakcióidőt megnyújtja a kizárólag hordozóanyaggal kezelt kontroli-állatéhoz képest. Ezt a tesztet azon dózistartományon belül kell véghezvinni, melynél motoros inkoordináció vagy inkapacitáció (vagyis a mozgató izmok rendezetlen működése, illetve a teljes mozgásképtelenség) még nem lép fel. A következő táblázatban a fenti teszt során kapott ED₅₀ értékeket tüntetjük fel. Az ED₅o kifejezés azt a dózist jelenti, amely a vizsgált egerek 50%-ánál analgéziát eredményez. Az analgézia meghatározása jelen esetben a vizsgált vegyület jelenlétében észlelt válaszreakció ideje, amelynek egyenlőnek vagy nagyobbnak kell lennie, mint a kontroli-állaté, emellett a kontroli-állat reakcióidejéhez hozzá kell adni a standard eltérés kétszeresét. A százalékban kifejezett analgézia-adatot át kell alakítani „probit”-ekké és az ED₅₀ értéket a dózisra adott válaszok regresszív analízisével számítjuk ki. Az egyes dózisokra adott válaszokat kifejező görbéknek legalább 4 meghatározott ponttal kell rendelkezniük és minden egyes pontot legalább 10 kezelt egér és legalább 10 kezeletlen kontroliegér adatainak felhasználásával kell meghatározni.

Az I általános képletü vegyületek fájdalomcsillapító hatásával kapcsolatban feltétlenül meg kell említeni, hogy azok az enkefalin (5) receptorhoz meglepően magas szintű kötődési tulajdonságokkal rendelkeznek a morfin (μ) receptorhoz viszonyítva^ ha a szóban forgó vegyületeket e tulajdonságok vonatkozásában a technika állásából ismert vegyületekkel hasonlítjuk össze. Ezt az enkefalin (δ) receptor aktivitást az ismert vas deferens (ondóvezeték)-teszttel lehet kimutatni.

Az egéren végzett vas deferens-teszt lényege az, hogy 30-40 g testsúlyú kifejlett egerek (Cox) izolált ondóvezetékét (vas deferens) felfüggesztjük 3 ml módosított Krebs-féle oldatban; az oldatot 37 °C on tartjuk és azon 95% oxigénből és 5% szén-dioxidból álló elegyet buborékoltatunk keresztül. A villanyárammal (0,15 Hz, 1 msec, 40 V) végzett ingerlés hatására bekövetkező összerándulást egy izometriás transducer útján Polygraph-on regisztráljuk. A vizsgálandó vegyületet 20-30 μΐ-nyi alikvot részletekben adjuk hozzá a fürdőhöz. A dóz.ishatásgörbét a fürdőhöz adagolt vegyület megfelelő mennyiségeinek kumulatív összeadása útján szerkesztjük meg. A viszonylagos agonista potenciál összehasonlítását a δ-receptor tekintetében az IC₅₀ értékek alapján végezzük (az a koncentráció, amely az elektromos árammal kiváltott kontrakciókat 50%-kal csökkenti).

A következő táblázat az 1 általános képletü vegyületekkel az egéren végzett vas deferens-tesztek eredményeit is tartalmazza. Az I általános képletü vegyületek nagyfokú kötődése az enkefalin (δ) receptorokon szignifikáns és meglepő, ha azt a gyűrűben helyettesítetlen vegyületekével (R = H) hasonlítjuk össze.

Táblázat

H-L-Ty r-D-Ala-G ly-L-(m-X) Phe- L-B-NH₂

X	Vegyület B	Az egér felugrása (forró lemezteszt) ED₅₀ mg/kg	Vas deferensteszt egéren (δ receptor) IC50, nM
Br	(N-Me)Met	0,36	0,49
Cl	(N-Me)Met	0,11	0,71
i	(N-Me)Met	_a	2,10
CF₃	(N-Me)Met	0,33	1,78
ch₃	(N-Me)Met	0,33	2,73
OMe	(N-Me)Met	0,15^b	2,92
I	(N-Me)Met	_a	2,10
Br	PgL	_a	0,35
H* *	(N-Me)Met	0,36	12,2

Megjegyzések: ^a nem vizsgáltuk, ^bHarlanND₄ egér, *a technika állásához tartozó vegyület.

Claims

1 Eljárás az I általános képletü enkefalin analógok és gyógyászatban alkalmazható savaddíciós sói előállítására — ebben a képletben

A jelentése D-alanilcsoport;

X jelentése klór-, bróm-, jódatom, 1-3 szénatomos alkilcsoport, trifluor-metil-csoport vagy 1—2 szénatomos alkoxicsoport;

-B-Z együttesen L-(N-metil)-metionin-amid- vagy Lfenil-glicin-amid-csoportot jelentenek — azzal jellemezve, hogy valamely megfelelően védett I általános képletü vegyületből - ahol A, X és B-Z jelentése a fenti - a védőcsoportokat egy arra alkalmas reagenssel lehasítjuk, majd kívánt esetben a gyógyászatban alkalmazható savaddíciós sóvá alakítjuk.

2 Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítást módja L-*.irozil-D-alanil-glicil-L-m-bróm-fenil-alanil-L-(N^a-metil)-metionin-ainid előállítására, azzal jellemezve, hogy az L-tirozil-D-alanil-glicil-L-m-bróm-fenil-alanil-L-(N“-metil)-metionil-bcnzhidril-amin-gyanta trifluor-acetátját vízmentes, cseppfolyósított hidrogén-fluoriddal, majd ecetsawal reagáltatjuk.

3. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja L-tirozil-D-alanil-glicil-L-m-metoxi-fenil-alanil-L(N°-pclil)-nictionin-amid előállítására, azzal jellemezve, hogy N“-terc-butil-oxi-karbonil-L-tirozil-D-alanil-glicil-Lm-ni3toxi-fenil-alanil-L-(N“-metil)-metionin-amidot trifluoi-ecetsawal reagáltatunk.

4 Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja L-tirozíI-D-alanil-glicil-m-trifluor-metil-fenil-alanilL-(N“-metiI)-metionin-amid előállítására, azzal jellemezve, hogy az L-tirozil-D-alanil-glicil-L-m-trifluor-metilfenil alanil-L-(N^a-metil)-metionil-benzIiidril-amin-gyanta trifluor-acetátját vízmentes, cseppfolyósított hidrogénfluoiiddal, majd ecetsavval reagáltatjuk.

5. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási

-9185 321 módja L-tirozil-D-alanil-glicil-L-m-klór-fenil-alanil-L-(N^ömetil)-metionin-amid előállítására, azzal jellemezve, hogy az Ε-ίίΓΟζίΙ-Ο-αΙαηίΙ^ΙίώΙ-υηι-ΗόΓ-ίεηίΙ-ΗΗηίΙ-Ε(N“-metil)-metionil-benzhidril-amin-gyanta trifluor-acetátját vízmentes, cseppfolyósított hidrogén-fluoriddal, majd ecetsavval reagáltatjuk.

6. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja L-tirozil-D-alanil-glicil-L-m-metil-fenil-alanil-L-(N“-metil)-metionin-amid előállítására, azzal jellemezve, hogy az L-tirozil-D-alanil-glicil-L-m-metil- fenil- alanil- L-(N “ metil)-metionil-benzhidril-amin-gyanta trifluor-acetátját vízmentes, cseppfolyósított hidrogén-fluoriddal, majd ecetsavval reagáltatjuk.

7. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja L-tirozil-D-alanil-glicil-L-m-jód-fenil-alanil-L-(N“metil)-metionin-amid előállítására, azzal jellemezve, hogy N“-terc-butil-oxi-karbonil-L-tirozil-D-alanil-glicilL-m-jód-fenil-alanil-L-(N^a'-metil)-metionin-amidot trifluor-ecetsavval reagáltatunk.

8. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási

5 módja L-tirozil-D-alanil-glicil-L-m-bróm-fenil-alanil-L-fenil-glicin-amid előállítására, azzal jellemezve, hogy N“terc - butil-oxi-karbonil- L-tirozil-D-alanil- glicil -L-m-brómfenil-alanil-L-fenil-glicin-amidot trifluor-ecetsawal reagáltatunk.

10 9. Eljárás fájdalomcsillapító hatású gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1—8. igénypont bármelyike szerint előállított I általános képletű vegyületet - ahol A, X, B-Z jelentése az 1. igénypont szerinti - a gyógyszertechnológiában szokásosan

15 használt segédanyagokkal összekeverve gyógyszerkészítménnyé alakítjuk.