HU183110B - Process for producing materials utilisable for tissue replacement from biological tissues - Google Patents

Abstract

A találmány értelmében a kívánt méretre — adott esetben porításig — darabolt, tartósított biológiai szövetet hermetikusan lezárt, oxigéntartalmú gázt - célszerűen levegőt - tartalmazó csomagolásba helyezzük, és a sterilizálást a csomagolás lezárása után végezzük. A találmány szerinti eljárás lehetővé teszi, hogy nem különleges körülmények között tartott, illetve feldolgozott állatok szöveteiből is a gyógyítás szempontjából előnyös szövetpótló anyagokat állítsunk elő. Az eljárás során az anyag immunogenitásának szükséges mértékű csökkentésén túlmenően elérjük azt is, hogy a kapott anyag gátolja a baktériumok osztódását, és elősegíti a beültetés helyének gyors regenerációját, ugyanakkor fizikailag megfelel a szövetpótlás követelményeinek. ·0« 5 yj j| 'Lű v -* !»---* bnMTe- bér 2 ► —-· miyhjtsn bi 3 · - - -a Ιιο+ίΐιζάιι ai t,O- O mélyhűtőit besogar02011 ti $*- « WjárássQ' oi 2 .. 6 intajboíáii idő (órai -1-

Description

A találmány tárgya új eljárás szövetpótlásra felhasználható anyagok előállítására biológiai szövetekből.

Ismeretes, hogy biológiai szövetekből, főleg levágott állatok bőréből, inaiból vagy csontjaiból szövetpótlásra, különösen emberi szövetek pótlására alkalmas anyagok állíthatók elő. Ezeket az anyagokat ismert módon úgy állítják elő, hogy a levágott állat (főleg sertés) megfelelő szöveteit elkülönítik, megtisztítják, zsírtalanítják, majd a kívánt méretre darabolják, végül sterilizálják és csomagolják.

Az ismert eljárásnál a sterilizálást hőhatással, vegyszerekkel vagy radioaktív sugárzással végzik. A hőhatással történő vagy vegyszeres sterilizálás egyrészt körülményes, másrészt nem elég hatékony. Ugyanakkor károsítja a szövet fehérjestruktúráját, ezáltal a szövet előnytelen fizikai tulajdonságúvá válik (csontszövet szilárdsága például csökken), és előnytelen biológiai tulajdonságokat vesz fel, például toxikussá válik, gátolja a sejtek osztódását, tehát a beültetés helyén a környező szövetekre kedvezőtlen biológiai hatást gyakorol.

A radioaktív sugárzással való sterilizálást ismert módon úgy végzik, hogy a megtisztított, zsírtalanított és kívánt méretre darabolt állati szövetet közömbös gáz atmoszférába zárják (például nitrogéngázzal töltött polietilénzacskóba helyezik, és a zacskót hegesztéssel lezárják), majd ezt követően sugározzák be.

Ennek a sterilizálási módnak az a hiányossága, hogy az így kezelt szövet a befogadó szövet számára többé-kevésbé „idegen” marad, nem segíti kellőképpen a beültetés helyének regenerációját, és nem gátolja megfelelően a baktériumok osztódását.

A találmány célja a fenti ismert eljárás ezen hiányosságainak kiküszöbölése.

A találmány feladata az eljárás olyan értelmű tökéletesítése, hogy a kapott anyag gátolja a baktériumok osztódását, segítse elő a beültetés helyének gyors regenerációját, ugyanakkor ne váltson ki intenzív immunreakciót.

A találmány alapja az a felismerés, hogy ha a megtisztított, zsírtalanított és kívánt méretre darabolt állati szövetet nem közömbös gázt, hanem levegőt tartalmazó térben vetjük alá a radioaktív sugárzással való sterilizálásnak, a kapott anyag biológiai szempontból előnyös tulajdonságokat vesz fel, immunreakciót kiváltó hatása csökken, gátolja a baktériumok osztódását, és elősegíti a regenerációt.

Ezen felismerés alapján a kitűzött feladat megoldása olyan eljárás szövetpótlásra felhasználható anyagok előállítására biológiai szövetekből, amelynek során a - főleg levágott állatból, célszerűen sertésből származó — biológiai szövetet, különösen bőr-, ín- vagy csontszövetet megtisztítjuk, zsírtalanítjuk, majd a kívánt méretre daraboljuk, ezután tartósítjuk - célszerűen liofilizáljuk vagy mélyhűtjük - továbbá ionizáló sugárzással sterilizáljuk és csomagoljuk, és amelynél a találmány értelmében a kívánt méretre - adott esetben porításig — darabolt, tartósított biológiai szövetet hermetikusan lezárt, oxigéntartalmú gázt - célszerűen levegőt — tartalmazó csomagolásba helyezzük, és a sterilizálást a csomagolás lezárása után végezzük.

A találmány szerinti eljárás egy előnyös foganatosítási módjánál a liofilizálásos tartósítás során a biológiai szövet hőmérsékletét 0 és 40 ’C, célszerűen 20 és 30 ’C között, a liofilizáló kondenzor hőmérsékletét pedig —40 és — 70 ’C között tartjuk, és a liofilizálást 2—12, célszerűen 5 —7%-os nedvességtartalomig végezzük.

Egy másik előnyös foganatosítási módnál a sterilizálást gammasugárzással — célszerűen Co⁶⁰ sugárforrással - végezzük, a dózisteljesítményt 0,1 és 10 kGy/óra, célszerűen 0,1 és 1 kGy/őra közötti, a dózist 10 és 35 kGy közötti, a biológiai szövet hőmérsékletét pedig 0 és 30 ’C közötti értéken tartjuk.

A találmány szerinti eljárás lehetővé teszi, hogy nem különleges körülmények között tartott, illetve feldolgozott állatok szöveteiből is a gyógyítás szempontjából előnyös szövetpótló anyagokat állítsunk elő. Az eljárás során az anyag immunogenitásának szükséges mértékű csökkentésén túlmenően elérjük azt is, hogy a kapott anyag gátolja a baktériumok osztódását, és elősegíti a beültetés helyének gyors regenerációját, ugyanakkor fizikailag megfelel a szövetpótlás követelményeinek. Az oxigéntartalmú atmoszférában végzett sugársterilizálás következtében ugyanis olyan anyagi változások lépnek fel a szövetben, amelyek bakteriosztatikus és regenerációt serkentő tulajdonságúvá teszik a kapott szövetpótló anyagot. Az eljárás költséges csíraszegény vagy csíramentes környezetet nem igényel.

A találmányt az elábbiakban példák kapcsán ismertetjük.

1. példa

Frissen vágott sertés bőrét a húsiparban szokásos módon 80 °C-os vízzel szőrtelenítjük és tisztítjuk, majd leválasztjuk a bőr alatti szövetekről. Amennyiben a feldolgozás nem közvetlenül a vágás után történik, a bőrt legfeljebb 48 órán át + 4 és - 10 ’C közötti hőmérsékleten tároljuk.

További feldolgozás előtt a bőr epythel réteg felé eső oldalát a zsír és egyéb szennyeződések eltávolítása céljából zsíroldószerrel szükség szerint lemossuk. Erre a célra pl. izopropilalkoholt, etilalkoholt vagy kloroformot használhatunk. A zsírtartalmat mintegy 2%-ig csökkentjük. Az ezt követő metszésig a tisztított bőrt úgy tároljuk, hogy a felszíni rétegek ne száradjanak ki.

Az így előkészített bőrből - például célszerűen átalakított cipőipari metszőgéppel - első lépésben lemetsszük a zsírréteget, hogy a kb. 3 mm vastag bőr a stratum granulosum réteg mellett az irharéteget tartalmazza.

További lépésekként a bőr külső, tehát stratum granulosum rétege felől kiindulva 20-40· 10 ⁶ m vastagságú bőrlebenyeket metszünk le az előbbi készüléken. A bőr minőségétől függően általában 2 — 3 metszés végezhető. A bőr mélyebb, irha rétegében a kollagén rosthálózat lazává válik, ami rontja a készítmény minőségét. A legjobb biológiai hatású készítmény a legfelső rétegből nyerhető.

A metszést szobahőmérsékleten, tiszta körülmé-21

183 110 nyék között végezzük, miközben a bőr és a lemetszett bőrrétegek kiszáradását megakadályozzuk.

A 20-40· 10 ⁶ m vastagságú bőrlebenyeket 7%os nedvességtartalomig liofilizáljuk, miközben a bőrlebenyek hőmérsékletét +20°C alatti, a liofilizáló kondenzor hőmérsékletét — 40 °C alatti hőmérsékleten tartjuk. A liofilizálás alatt a bőrt kisimított állapotban tartjuk.

A liofilizált bőrt a kívánt méretre végjük, és tiszta körülmények között kettősfalú polietilén zacskóba csomagoljuk, a csomagolást rétegenként hőhatással egyesítjük (lehegesztjük). A csomagolás során a levegőt nem távolítjuk el, és nem cseréljük ki közömbös gázzal, pl. nitrogénnel, mint azt korábban tették, ill. szükségesnek tartották.

A becsomagolt termék sterilizálását Co⁶⁰ izotóp gammasugárzása segítségével végezzük 1 kGy/óra dózisteljesítménnyel és 35 kGy besugárzási dózissal, miközben a termék hőmérsékletét + 30°C-ot meg nem haladó értéken tartjuk.

Az ily módon sterilizált készítmény szobahőmérsékleten tárolható, és 2 évig felhasználható.

Az eljárást ínszövetek esetén - értelemszerű változtatásokkal - hasonló módon hajtjuk végre.

Bizonyos esetekben célszerű lehet a biológiai szövetet porított állapotba hozni és így felhasználni.

2. példa

A példa sertés- vagy borjúcsontból készült, emberi csontszövet pótlására alkalmas anyag előállítására vonatkozik. Frissen vágott, fiatal (két évnél nem idősebb) állatból csöves és szivacsos állományú csontokat tiszta körülmények között húsipari módszerekkel elválasztunk a környező szövetektől.

A kapott csontokat fiziológiás konyhasó-oldatban megmossuk, a csonthártyát és a szövetmaradványokat eltávolítjuk, fehér velőt tartalmazó csontokból eltávolítjuk a velőt is, és a velőürt is átöblítjük a fiziológiás konyhasó-oldattal.

Amennyiben a feldolgozás nem közvetlenül a vágás után történik, úgy 24 órán át +4 és - 10 °C közötti hőmérsékleten tárolhatjuk a csontokat.

Ezután a szükségletnek megfelelően daraboljuk a csontokat (például fűrésszel). Legtöbbször 20 — 30 cm³-es darabokra van szükség, de lehet igény 0,5 cm³-es darabkákra, sőt porított csontszövetre is.

Az így előkészített csontszövetet zsíroldószerrel kezeljük, a zsírtartalmat szükség szerint (például 2%-ig) csökkentjük. Megjegyezzük, hogy porccal fedett csontrészeket nem használunk fel.

Következő lépésben a csontdarabokat az 1. példában leírt módon liofilizáljuk. A liofiljzálásos tartósítás helyett mélyhűtést is alkalmazhatunk. Ebben az esetben az anyagot a felhasználásig - 70 °C hőmérsékleten tartjuk. Ilyen tárolás mellett 2 évig felhasználható az anyag.

A liofilizálással tartósított készítményeket a felhasználás előtt 0,9 %-os steril NaCl oldatban rehidráljuk, bőr esetében 5-10 percig, csont- és inszövet esetén 2 — 5 óráig.

Mélyhütéssel tartósított készítmények esetében felhasználás előtt - 70 °C-ról + 20 °C-ra emeljük az anyag hőmérsékletét. A melegedés ütemét nem kell szabályozni.

A csontokat a szükséges 7 %-os nedvességtartalom elérése után kettősfalú polietilén zacskóba vagy gumidugóval lezárható üvegedénybe helyezzük, a felhasználói igénynek megfelelő mennyiségben. A zacskó hőhatással történő rétegenkénti egyesítését, illetve az üveg lezárását szobalevegőn végezzük, tehát a lezárás után levegő marad a csomagoláson belül.

A becsomagolt, hermetikusan lezárt termék sterilizálását az 1. példa szerinti módon, de 15 kGy besugárzási dózissal végezzük.

A találmány szerinti eljárással előállított szövegpótló anyagok előnyös biológiai tulajdonságait az alábbiakban kísérleti eredményekkel szemléltetjük.

Az idegen bőr a szervezetbe vagy (bőrátültetési eljárást alkalmazva) sebfelszínre helyezve a szervezet immun-reakcióját váltja ki, amely a testidegen bőr lelökődését eredményezi. A testidegen szövet által kiváltott reakció mérésének egyik lehetősége a transzplantációs területet ellátó nyirokcsomók sejtjei ún. „blasztos” reakciójának mérése. A találmány szerinti eljárás hatásának vizsgálata céljából patkányba ültettünk az eljárás egyes elemeivel, illetve a teljes eljárással kezelt sertésbőrt (1. ábra). Kimutattuk, hogy 3 El izotóppal jelzett timidin nyirokcsomó sejtekbe való felvétele alapján amely a „blasztos” reakció mértékét jelzi - a bőr beültetését megelőzően végzett liofilizálással való kezelés a kiváltott reakciót jelentősen csökkenti (2. oszlop: mélyhűtött, 3. oszlop: liofilizált bőr által kiváltott reakció). Amennyiben a testidegen bőrt az eljárásunk egészének megfelelően kezeltük (4. oszlop), a kiváltott reakció a kontroll szintet (1. oszlop) - mikor beültetés nem történt - alig haladta meg. Az eredmény arra utal, hogy eljárásunkkal a bőrszövet igen kifejezett testidegenségét jelentős mértékben csökkenteni lehet. Ez a változás a kezelést megelőző állapothoz képest a készítmény célszerű alkalmazásánál jelentős előnyt eredményez.

Az eljárásunk alkalmazásával bőrszövetből előállított, az égéskezelésben időleges biológiai kötözőanyagként felhasználható preparátum lehetőséget ad arra, hogy az égett sebet - akár heteken át is - a szükségletnek megfelelően a készítménnyel fedjük anélkül, hogy a szervezet nemkívánatos reakcióját váltanánk ki.

Staphylococcus aureus baktérium kultúrák felhasználásával kimutattuk, hogy a találmány szerinti eljárással kezelt bőrszövet új tulajdonsággal bír a kezeletlenhez képest, mivel a találmány szerinti eljárással előállított preparátummal kezelve a baktérium kultúrát az gátolja a baktériumok osztódását (2. ábra, 5 sz. görbe).

A szövetpótlás azon eseteiben — például csontnál — amikor a beültetett szövetrészlet az anatómiai és funkcionális egység helyreállítását is szolgálja, véglegesen részévé válik a szervezetnek, igen fontos kérdés, hogy a szervezetbe való beépülés mennyi időt vesz igénybe.

Patkánykisérletben összehasonlítottuk, hogy az egyik szokásos módon, mélyhütéssel tartósított csontpreparátum, és a találmány szerinti eljárással tartósított csont beépülése mennyi időt vesz igény-31

183 110 be. Röntgenvizsgálattal megállapítottuk, hogy az eljárásunk szerint kezelt csont a beültetést követő 17. héten a befogadó csonttól már nem különíthető el vizsgálattal (3. ábra), ugyanakkor az említett szokásos módon tartósított csont-graft — annak ellenére, hogy szilárdan rögzül - a befogadó csontvégektől még jól elkülöníthető (4. ábra).

A két csontpreparátum beépülési ideje közötti különbség a gyógyítás szempontjából - a gyógyulási idő rövidülése miatt -- igen jelentős. 1

Az égett seb általában hegek kialakulásával gyógyul. Ez — esztétikai hibák mellett — funkcionális hibát eredményez, különösen a kéz égési sérülése esetén.

Klinikai vizsgálatainkban kimutattuk, hogy a ¹ találmány szerinti eljárás alkalmazásával előállított bőrkészítményt alkalmazva kielégítő kozmetikai eredmény mellett kifogástalan funkcionális gyógyulás érhető el (5., 6. és 7. ábra). Nagy felszínű égések esetén hasonló gyógyulási eredményeket ² kaptunk (8., 9. és 10. ábra).

Claims (3)

1. Szabadalmi igénypontok

   1. Eljárás szövetpótlásra felhasználható anyagok ² előállítására biológiai szövetekből, amelynek során a — főleg levágott állatból, célszerűen sertésből származó - biológiai szövetet, különösen bőr-, ínvagy csontszövetet megtiszitjuk, zsírtalanítjuk, majd a kívánt méretre daraboljuk, ezután tartósít5 juk — célszerűen liofilizáljuk vagy mélyhűtjük továbbá ionizáló sugárzással sterilizáljuk és csomagoljuk, azzal jellemezve, hogy a kívánt méretre adott esetben porításig - darabolt, tartósított biológiai szövetet hermetikusan lezárt, oxigéntartalmú

   0 gázt - célszerűen levegőt - tartalmazó csomagolásba helyezzük, és a sterilizálást a csomagolás lezárása után végezzük.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a liofilizálásos tartó⁵ sítás során a biológiai szövet hőmérsékletét 0 és 40 °C, célszerűen 20 és 30 °C között, a liofilizáló kondenzor hőmérsékletét pedig - 40 és - 70 °C között tartjuk, és a liofilizálást 2-12, célszerűen 5-7%-os nedvességtartalomig végezzük.
3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a sterilizálást gammasugárzással - célszerűen Co⁶⁰ sugárforrással - végezzük, a dózisteljesítményt 0,1 és 10 kGy/ óra, célszerűen 0,1 és 1 kGy/óra közötti, a dózist 10 és 35 kGy közötti, a biológiai szövet hőmérsékletét pedig 0 és 35 °C közötti értéken tartjuk.