HU181949B

HU181949B - High-speed diagnosticum with improved parameters and method for producing thereof

Info

Publication number: HU181949B
Authority: HU
Inventors: Dieter Kraemer; Klaus Lehmann; Roland Hartl
Original assignee: Roehm Gmbh
Priority date: 1978-12-09
Filing date: 1979-12-07
Publication date: 1983-11-28
Also published as: DE2853300B2; EP0017661B1; YU299179A; EP0017661A1; DE2853300A1; YU43612B; DE2853300C3; DD152632A5

Description

Az egyszerű, gyors és egyidejűleg biztos diagnózis-eljárás iránti igény az orvostudományban többek között a tesztcsíkmódszer kifejlesztéséhez vezetett.

A módszer alapgondolata az, hogy szilárd hordozóra olyan reagenseket kell felvinni, amelyek a megnedvesítés után a kimutatandó anyagok hatására közvetve vagy közvetlenül vizuálisan észlelhető változással, rendszerint valamilyen színezék képződésével vagy színátcsapással reagálnak.

Nagy gyakorlati jelentőségre tettek szert az okkult vér exkrétumokban, így székletben, illetve vizeletben és testfolyadékokban való kimutatására kifejlesztett tesztcsíkok. A teszt a peroxidáz-hatású véralkotórész, a hemoglobin kimutatásán alapul. Peroxid jelenlétében a hemoglobin hatására egy sor alkalmas indikátornál (kromogéneknél) észreve- 15 hető színeződés, illetve színváltozás lép fel. Kromogénként egyrészt gvajakgyanta, másrészt a fenil-aminovegyületek osztályába tartozó kromogének, így például o-toluidin, mtoluidin és ezek savaddíciós sói, benzidin, 3,3',5,5'-tetrametil-benzidin, difenil-amin, 4-difenil-szulfonsav és 2,6-diklór-indofenol-nátriumsó használható.

A 26 52 545 sz. német szövetségi köztársaságbeli nyilvánosságra hozatali iratban bizonyos tiazol-vegyületek együttes alkalmazását ajánlják szenzibilizátorokként a kromogénekhez. 25

Székletben, illetve vizeletben lévő okkult vér kimutatására eszerint egy alkalmas hordozóra, így például egy szűrőpapírcsíkra van szükség, amely a kromogén anyaggal át van itatva (tesztcsík), és amelyre a vizsgálandó széklet, illetve vizelet mintáját felvisszük. Az „előhívás” azután például peroxidoldattal történik. A tesztcsík (tesztláp) kialakításánál egyenként különböző oldatokat javasolnak, a 3 996 006 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban például egy többlyukas tesztlapot írnak le.

Az eközben szerzett gyakorlati tapasztalatból kiindulva az okkult vér székletben való kimutatására szolgáló tesztcsíkmódszerrel szemben különös fontossággal merül fel a következő igény: A módszer ne legyen túl érzékeny, hogy elkerüljük a hamis pozitív eredményeket ezek pszichológiai és anya10 gi következményei miatt. Viszont a módszernek nem szabad *úl kevéssé érzékenynek sem lenni, hogy minden körülmények között elkerüljük a hamis negatív eredményt.

Ebben az összefüggésben különösen zavaróan hat, ha a kromogén már a peroxidáz-hatású hemoglobin hatása nélkül hasonló vagy azonos színváltozást mutat, mint az, amit a hemoglobin kimutatására szolgáló kvalitatív tesztben értékelünk. Ilyen zavarok a fenil-amino-vegyületek fentnevezett csoportjába tartozó indikátorszínezékek (kromogének) alkalmazásánál ismertek. A kromogének ezen osztályának képviselőinél továbbá gyakran észlelhetjük a színintenzitás nemkívánatosán gyors csökkenését egészen a teljes elhalványodásig.

Mindezek miatt ezek az önmagukban könnyen és kielégítő tisztasággal hozzáférhető indikátorszínezékek csak nagyon feltételesen elfogadhatók kromogénként okkult vér székletben, illetve vizeletben való kimutatására. Azt találtuk, hogy az okkult vér exkrétumokban és testfolyadékokban való kimutatására szolgáló tesztben kromogénként alkalmazott indikátorok használhatósága, azaz mind a gvajakgyanta30 színezék, mind az itt használható fenil-amino-vegyületek használhatósága döntően javítható, ha a kromogén hordozóanyagát — rendszerint szűrőpapírt — valamilyen műgyantadiszperzióval, különösen valamilyen vizes (met)akrilsav-gyanta-diszperzióval kezeljük.

A kromogénként használható fenil-amino-vegyületek általában az I általános képlettel ábrázolhatok — ahol

R_f valamilyen hidrofil csoportot, így egy MO— vagy egy MSO₃— általános képletű csoportot jelent, amelyben

M jelentése hidrogénatom vagy valamilyen fémkation, vagy (a) általános képletű csoport;

R₂, R₃ és R4 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom vagy rövidszénláncú alkilcsoport, előnyösen metilcsoport;

R, jelentése hidrogénatom, vagy A-val együtt kinonimin; és A jelentése hidrogénatom vagy (b) általános képletű csoport, azzal a fenntartással, hogy a molekulában legfeljebb két fenilcsoport van, és az egy fenilcsoporton lévő Rí, R₂, Rj és R* szubsztituensek esetében az indexszámok numerikus értékének összege nem több 6-nál.

A találmány szerinti eljáráshoz más kromogének is alkalmazhatók. Megemlítendő az orto- és a meta-toluidin, valamint ezek savaddiciós sói, benzidin, 3,3',5,5'-tetrametil-benzidin, difenil-amin, 4-difenil-szulfonsav és sói és 2,6-diklór-indofenol-nátriumsó.

A találmány szerinti eljáráshoz különösen fontos a gvajakgyanta (Resina Guajaci). Ez a gvajakfák, Dél- és KözépAmerikában gyakran előforduló fafajták (Guajacum officináié L. és Guajacum sanctum L.) gyantája. A Lignum Guajaci-ról és a gvajakgyanta különböző minőségi fokozatokban való kinyeréséről a „Hagers Handbuch dér pharmaceutischen Praxisából (I. kötet, második helyesbített újranyomás, Springer Verlag, Berlin, Göttingen, Heidelberg, 1949; 1397-től következő oldalak) tájékozódhatunk.

Általában az ott Resina Guajaci depurata-ként leírt minőség megfelelő vér székletben és vizeletben való kimutatására szolgáló papírcsíkok készítésére, ebből kromatográfiával nyerhetők azonban olyan gyantaanyagok, amelyek kromogén hatással rendelkeznek, és együtt vagy egyenként is alkalmasak tesztpapír impregnálására.

A gyakorlatban a kromogén oldhatósága, különösen a vízben való oldhatóság meghatározza az alkalmazási módot.

Vízoldható kromogéneknél a találmány szerinti eljárás kivitelezése célszerűen úgy foganatosítható, hogy a vizes (met)akrilsav-gyanta-diszperziót adott esetben hígítva, a kromogénekkel, különösen az előbbi I általános képletekkel együtt elegyítjük, és a hordozót, speciálisan a szűrőpapírt, az így kapott vizes oldattal impregnáljuk. Vízben oldhatatlan kromogéneket, így gvajakgyantát, alkalmas szerves oldószerekben oldunk, és ezzel impregnáljuk a papírt. Végül ezt követően kezeljük a vizes diszperzióval. A fordított sorrend is lehetséges az eljárás során.

A hordozó, különösen a szűrőpapírok, a koncentráció és az indikátor-színezék felviteli módjának kiválasztásakor a technika állása szerinti tapasztalatokat figyelembe kell venni.

lA (met)akrilgyanta-diszperzió koncentrációjára az impregnálásra szánt vizes közegben irányszámként 1—10súly%, előnyösen 5 súly%, különösen 3 súly% adható meg. Az eredeti vizes (met)akrilgyanta-diszperzió adott esetben alkalmas szerves hígítószerrel, így például etanollal hígítható.

Az eljárás sikere szempontjából döntő, hogy a hordozó folt-, illetve területegységét elegendő mennyiségű kromogénnel impregnáljuk. Az egyes kromogénenként szükséges mennyiségek messzemenően ismerteknek tekinthetők.

A szűrőpapírra felhordandó film (met)akrilgyantatartalmára irányszámként a szűrőpapír felületegységére 0,1—10 mg gyanta/cm² felület veendő tekintetbe.

A különösen előnyös, körülbelül 250 000 molekulasúlyú metakrilsav/etil-akrilát 1:1 arányú diszperzió alkalmazásakor előnyösen 0,2 és 0,8 mg gyanta/cm² felület közötti, előnyösen 0,3 mg gyanta/cm² felület mennyiség jön számításba.

A kromogének koncentrációját előnyösen úgy kell számítani, hogy az illető színezék adataitól függően 0,001—10 mg közötti indikátor-színezék jusson egy cm² hordozófelületre. Úgy számolunk például, hogy egy tesztcsík egy cm² szűrőpapír-felületének impregnálásához 0,2—200 pg, előnyösen 1—10 pg o-toluidint, illetve m-toluidint, illetve ezek savaddíciós sóinak megfelelő mennyiségét,

1—100 pg, előnyösen 10 pg benzidint,

1— 200 pg, előnyösen 20 pg 3,3',5,5'-tetrametil-benzidint,

20—2000 pg, előnyösen 500 pg difenil-amint,

50—5000 pg, előnyösen 1000 pg 4-difenil-amin-szulfonsavat,

20—1000 pg, előnyösen 100 pg gvajakgyantát,

2— 100 pg, előnyösen 10 pg tisztított gvajakgyantát használunk.

Az impregnálást önmagában ismert módon, például bepermetezéssel vagy bemártásos technikával végezhetjük.

Az említett akrilgyantákkal végzett impregnálással a találmány szerint a vér székletben és vizeletben való kimutatásának mind az érzékenysége, mind a leolvashatósága jelentősen megjavítható. A találmány szerinti eljárás alkalmazásakor a hemoglobin vizeletben való kimutatásánál a biztos kimutatási határok o-toluidinium-klorid indikátorként való felhasználásával 250—1000 mg/1 hemoglobinról 100— 5000 mg/1 hemoglobinra tágultak.

A felismerés szempontjából mértékadó színezékfoltok kontúrjai a találmány szerinti eljárásnál élesebbek, és a teljes háttér gyengébb elszíneződést mutat.

Az eljárás szempontjából kedvezően hat az is, hogy a színfoltok a kezeletlen mintákkal összehasonlítva lényegesen lassabban halványodnak el. Különösen kiemelendő, hogy a zavaró színkeletkezések a tulajdonképpeni „előhívásból” kimaradnak, így a nulla-értékek tisztán negatívak maradnak. A kromogén egyedi érzékenysége, mennyisége, valamint a polimerre felvitt mennyisége szerint is fokozott érzékenységet és mindenekelőtt lényegesen jobb biztonságot érünk el alacsonyabb vérkoncentrációk kimutatásánál.

Különösen előnyös olyan gyanták alkalmazása, amelyeket 1—5 szénatomos alkoholok, előnyösen metanol vagy etanol, akril-, illetve metakrilsav-észtereinek 1:4-től 2:1-ig terjedő súlyarányban végzett kopolimerizációjával állítottak elő. Különösen az olyan gyanták vizes diszperzióival való impregnálás említendő meg, amelyet metakrilsav etil-akriláttal, előnyösen 1:1 súlyarányban való kopolimerizálásával állítanak elő.

összehasonlító kísérletek

A) Kimutatási sorozat o-toluidinium-klorid indikátorral.

a) Az akrilgyanta-impregnálás nélküli tesztpapirok előkészítése:

Kerek szűrőpapírokat (0= 12,5 cm; Edéről Nr. 1) o-toluidinium-klorid vizes oldatába (0,1 g/100 ml desztillált víz) mártunk, és ezt követően meleg levegőárammal megszárítjuk.

b) Az akrilgyanta-impregnálású tesztpapírok előkészítése;

Kerek szűrőpapírokat, amelyeket előzőleg az a) pontban leírtak szerint kezeltünk, etil-akrilát: metil-metakrilát: metakrilsav 70:30:1 arányú kopolimerizátumának 3%-os vizes

-2181949 diszperziójába mártjuk, és ugyanúgy meleg levegőárammal megszárítjuk.

c) Az előkészítés a b) pontéhoz hasonló, de egy másik polimer-diszperziót, nevezetesen etil-akrilát: metakrilsav 1:1 arányú kopolimerizátumának 3%-os vizes diszperzióját használjuk.

B) Kimutatási sorozat gvajakgyanta indikátorral a') Akrilgyanta-impregnálás nélküli tesztpapírok előkészítése:

Kerek szűrőpapírokat (0= 12,5 cm, Edéről Nr. 1) gvajakgyanta oldatba (0,5g/100ml izopropanol) mártunk, és meleg levegőárammal megszárítjuk.

b') Szűrőpapírokat, amelyeket az a') pontban leírtak szerint kezeltünk, a b) pontban leírtak szerint 3%-os vizes akrilát-diszperzióba mártunk, és meleg levegőárammal megszárítjuk.

C) Hemoglobin oldatok felvitele,

Az A., illetve B. pontok szerint impregnált minden egyes szűrőpapírt az 1. ábra szerinti módon ceruzával beosztunk.

A számozott helyekre vakpróbával (50 μΐ desztillált víz) 20 kezdve növekvő mennyiségű ismert koncentrációjú hemoglobinoldatot viszünk fel. (Törzsoldat=4%-os hemoglobinoldat desztillált vízzel 0,004%-ra hígítva.)

Az egyes számozott helyekre a következő mennyiségeket visszük fel:

1. sz. vakpróba:

2. sz. 1 μΐ:

3. sz. 5 μΐ:

4. sz. 10 μΐ:

5. sz. 20 μΐ:

6. sz. 50 μΐ:

D) Előhívás

A hemoglobin oldatok teljes felszívódása után egy csepp előhivófolyadékkal (4% peroxid-tartalmú alkoholos-vizes peroxidoldat) hívunk elő. 35 másodperc, 2 perc, 5 perc és 15 perc elteltével kiértékelést végzünk.

E) Az eredmények kiértékelése

A technika mai állását reprezentáló kezeletlen Aa és B;i' sorozatelemek a találmány szerint preparált, Ab és Acés Bb' sorozatokkal való összehasonlításakor első pillanatra sze50 μΐ desztillált víz, ng hemoglobin,

200 ng hemoglobin, 400 ng hemoglobin 800 ng hemoglobin, 2000 ng hemoglobin.

műnkbe tűnik a találmány szerinti sorozatokban a megfeleld színfoltok nagyobb színintenzitása és élesebb elhatárolódása.

Beható összehasonlítás azt mutatja, hogy kezeletlen Aa és 5 Ba' sorozatokban a hemoglobin a 3. sz. helyen, azaz 200 ng alatti koncentrációban már nem értékelhető pozitívan, míg a találmány szerint preparált Ab és Bb' sorozatokban kétségkívül pozitív eredmény kapható. A találmány szerint preparált sorozatoknál a szakember részére 2 perc elteltéig még 10 a legalacsonyabb koncentráció (2. helyzet) is pozitív eredményt ad.

Az Aa és Ba' szűrőpapíroknál, amelyek a technika mai állását reprezentálják, az előhívás után 2 percnél több idő elteltével már egyáltalán nem kaphatók egyértelműen pozitív 15 eredmények. Egészen más a helyzet a találmány szerint preparált Ab, Ac és Bb' szűrőpapíroknál.

Claims

Szabadalmi igénypontok

1. Javított gyorsdiagnosztikumok vér exkrétumokban és testfolyadékokban való diagnosztikai kimutatására, amelyek legalább egy olyan tesztcsíkból állnak, amely polimereket és peroxidokkal előhívható kromogén fenil-amino-

25 vegyületeket vagy gvajakgyantát tartalmaz, azzal jellemezve, hogy a tesztcsík 1 cm² felületre számítva 0,1—10 mg anionos jellegű akril- és/vagy metakrilgyantával, előnyösen 1—5 szénatomos alkoholokkal képezett akril-, illetve metakrilsavészterek és (met)akrilsav 1:4—2:1 súlyarányú kopoii30 merizátumát tartalmazza.
2. Eljárás az 1. igénypont szerinti, javított gyorsdiagnosztikumok előállítására, azzal jellemezve, hogy a kromogént már tartalmazó tesztcsíkot impregnáljuk 1 cm² felületre számítva 0,1—10 mg, anionos jellegű akril- és/vagy metakrilgyanta vizes diszperziójával.
3. A 2. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy az impregnálást 1—5 szénatomos alkoholokkal képzett akril-, illetve metakrilsavészterek és

40 (met)akrílsav 1: 4—2 : 1 súlyarányú kopolimerizátumának a vizes diszperziójával végezzük.