HU181748B - Új eljárás neomicin-szulfát előállítására - Google Patents

Description

A találmány tárgya új eljárás neomicin-szulfát előállítására szűrt fermentlevekből tisztítással.

Mint ismeretes a neomicint, az aminogJikozid típusú antibiotikumok egyik legfontosabb képviselőjét, fermentációs eljárással állítják elő és általában kénsavval képzett sója formájában alkalmazzák mind a humán, mind a veteriner terápiában.

A neomicinnek fermentléből való kivonására és tisztítására több különféle módszer ismeretes, úgy mint az ioncserélős, extrakciós, kicsapásos illetve ezek esetenkénti kombinációi, amelyeket a Process Biochemisty 13 (1978) 11 foglal össze részletesen.

Az alkalmazott módszerek közül leggyakrabban a szűrt fermentlében levő hatóanyagot ioncserélő gyantán történő megkötéssel, majd eluálással vonják ki és tiszítják. A kivonáshoz használt ioncserélő gyanta lehet karboxil-típusú gyengén savas kationcserélő, mint például az AMBERLITE IRC—50 (2 667 441 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás), VARION KCO (169 452 számú magyar szabadalmi leírás), vagy szulfonsav-típusú, erősen savas kationcserélő gyanta, például DUOLITE C-25 (3 005 815 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás). Az eluálás legcélszerűbben híg ammónia oldattal történhet, ahogyan azt a 150 474 számú magyar szabadalmi leírás is alkalmazza, amelynek előnye, hogy a gyantán megkötődő szervetlen ionok az ammónia oldattal nem eluálhatók, így egy kalorikus művelet, például bepárlás közbeiktatásával az oldat ammónia mentesíthető. Az ioncserélő módszerek, bár alapjaiban alkalmasak neomicinnek a fermentléből történő kinyerésére, azonban a hatóanyag mellett jelenlevő egyéb szennyeződések miatt nem biztosítják a gyógyászati célra megfelelő tisztaságú termék előállítását, mivel mint ismeretes, a neomicint bioszintetizáló Streptomyces fradiae törzs a fermentáció folyamán az antibiotikum mellett jelentős mennyiségű színanyagot is termel. (S. A. Waksman: The Actinomycetes,

Rónáid Press Co. New York, 1967, p. 168—177).

Ezen színanyagok - kémiai tulajdonságaikból adódóan — a neomicint végig kísérik a kinyerésnél, így a kationcserélő gyantáról a hatóanyaggal együtt 15 eluálódnak, és annak ellenére, hogy számos adalékanyagot alkalmaztak a hatóanyag szelektívebb megkötésére és eluálására - például nátrium-fluoridot — (1 36Ó 928 számú francia szabadalmi leírás), nem ionos detergenset (116 561 számú csehszlovák 20 szabadalmi leírás), oxálsavat [Med. Prom. SSSR. 16/1962) 18], ammónium-molibdenátot (3 313 693. számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás), EDTA-t (3 313 694 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás), ecetsavas mosást 25 (169 452 számú magyar szabadalmi leírás( stb.. - a probléma továbbra sem mondható megoldottnak, részben az alkalmazott szerek költséges, nem egyszer nehezen beszerezhető volta miatt, részben azért, mert alkalmazásukkal a hatóanyag — színanyag sze30 lektív szétválasztása továbbra sem teljes.

-1181748

Az eluátumok tisztítására különféle módszerek ismeretesek, melyek célja a benne levő színanyag mennyiségének további csökkentése, A 2 667 441 számú és 2 944 939 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírások egy erősen bázisos anioncserélő gyantán történő átvezetést alkalmaznak erre a célra, míg a 79 366 számú lengyel szabadalmi leírás egy szulfonsav-típusú erősen savas kationcserélő gyantát használ folyamatosan.

Egyes esetekben az eluátumot még további ioncserének vetik alá egy nagy pórusú kationcserélőn és szulfonsav típusú gyantán (2 827 417 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás), míg mások ioncserélő kapacitással nem rendelkező kondenzációs típusú, a nagy aktív felületükön a színanyagot adszorpció útján megkötő szintelenítő gyanta, például ASMIT 173 N vagy DUOLITE S-30, WOFATIT EZ (162.943 számú magyar szabadalmi leírás) alkalmazásával próbálnak célt elérni.

önmagukban azonban a fenti eljárások sem biztosítják a megfelelő eredményt gyógyszerkönyvi tisztaságú termék előállításához, mert minden esetben szükségessé válik a vizes neomicin oldatoknak nagymennyiségű aktív szénnel történő derítése is. Ezen derítést részletekben végzik, például a 169 452 számú magyar szabadalmi leírás szerint hét részletben derítenek, az aktív hatóanyag mennyiségére számított 20 százaléknyi aktív szénnel, amely a műveletek nagy számát és a derítő anyag mennyiségét is figyelembe véve, jelentős többletmunkát és neomicin veszteséget jelent, nem is említve az aktív szén költségét. Az alkalmazott aktív szén mennyiségének csökkentése érdekében ezért még egyéb szintelenítő hatású anyagokat is alkalmaznak a tisztítások során, például brómos vizet vagy Rongalitot (56 365 számú lengyel szabadalmi leírás).

A találmány célja legalább gyógyszerkönyvi tisztaságú neomicin-szulfát előállítására szolgáló eljárás kidolgozása az eddig ismert eljárásoknál egyszerűbben, jobb kitermeléssel.

A gyógyszerkönyvi tisztaságú neomicin-szulfát előállításával kapcsolatos kísérleteink során arra a meglepő felismerésre jutottunk, hogy a neomicin fermentációja során képződő és a feldolgozási műveletek során jelentkező színanyagok túlnyomó része hidrogén-peioxid alkalmazásával elroncsolható anélkül, hogy a neomicinnek legkisebb része is bomlást szenvedne.

A hidrogén-peroxidnak az előtisztítás utáni neomicintartalmú levek esetén megfelelő töménységben és körülmények közötti alkalmazása során a színanyagok jelentős része elbomlik és mint színtelen anyag a vizes oldatban marad úgy, hogy a feldolgozás során semmilyen fajta egyéb művelet például szűrés, szeparálás stb. végzése nem szükséges.

A színanyagok jellegüknél fogva pontosan nem definiálható, különböző molekulasúlyú anyagok, s mivel legnagyobb részük a neomicin molekulával kb. egyező méretű, de egy kis részük a iieomicinnél jóval nagyobb molekulasúlyú, esetenként kolloid anyag, ezen utóbbiak eltávolítására egy ismert előtisztító lépést alkalmazunk, amikor is az eluátumot egy nagypórusú, erősen bázisos anioncserélő gyantán vezetjük át.

A találmány lényege, hogy a szűrt fermentlevekből gyengén savas ammónium-ciklusú gyantán való megkötés, majd eluálás után nyert neomicin-bázist tartalmazó eluátumot bázisos anioncserélő gyantán való átvezetéssel végzett előtisztítás után vákuumban 30-50%, célszerűen 40%-osra töményítjük, kénsav adagolásával a neomicin-bázist szulfáttá alakítjuk, hidroxílionokkal rendelkező gyantával, vagy dietilamin adagolásával a rendszer pH-ját 5—7 célszerűen pH = 6,0 értékre állítjuk, majd hidrogén-peroxid oldattal reagáltatjuk, szükség szerint aktív szénnel derítjük és ismert módon a terméket kinyerjük.

Kísérleteink során azt tapasztaltuk, hogy a szűrt fermentleveknek egy gyengén savas, karboxil-típusú gyantán történő átvezetésével a hatóanyagnak mintegy 98%-a megköthető és arról kb. 92%-a eluálható 5%-os ammónia oldattal úgy, hogy előtte a könnyen eluálható szennyezéseket egy egészen híg ammónia oldattal még lemossuk az oszlopról. így egy magas hatóanyagtartalmú és viszonylag nagy mennyiségű színanyagot tartalmazó eluátumhoz jutunk.

Ezt egy erősen bázisos anioncserélő gyantán előtisztítjuk, ahol is annak ellenére, hogy az ilyen típusú gyanta nem specifikus a színanyagok megkötésére - mint az egyéb, nem ionos karakterű derítőgyanták (WOFATIT EZ, DUOLITE 530, ASMITH 173 N) - azok nagy molekulasúlyú része megkötődik. Azonban a gyanta neomicin megkötő képessége sem elhanyagolható. Ezért az optimális cél elérése érdekében csak másfél-kétszeres térfogatú anioncserélő gyantát alkalmazunk. Ily módon az eluátum színanyagtartalmát úgy tudjuk lecsökkenteni — minimális mennyiségű neomicin megkötődésével — hogy abból a további műveletek során még jó minőségű terméket tudjunk előállítani.

Az előtisztított eluátum ammónia mentesítése után, amelyet úgy végzünk, hogy az oldatot vákuumban 40%-osra betöményítjük, az eddig bázis formájában! levő neomicint szulfáttá alakítjuk át szobahőmérsékleten, tömény kénsav alkalmazásával. Az oldatban még jelenlevő jelentős mennyiségű színanyagot hidegen adagolt hidrogén-peroxid oldattal szobahőmérsékleten állni hagyjuk, miközben az oldatban található színanyagok elbomlanak.

Az így nyert színtelenített oldat már csak minimális mennyiségben tartalmaz színanyagot, ezen oldatból néhány százaléknyi aktív szén alkalmazásával és szűréssel, majd ismert úton történő feldolgozással jó kitermeléssel kapjuk a készterméket, melynek minőségére jellemző, hogy a VI. Magyar Gyógyszerkönyv, illetve á BP-73 minőségi követelményeinek megfelelő tisztaságú.

Megjegyezni kívánjuk, hogy ha eljárásunkat úgy vezetjük, hogy az erősen bázisos anioncserélő gyantán történő előtisztítást elhagyjuk, úgy olyan minőségű terméket állíthatunk elő, amely az állattakarmányozási célra megfelelő tisztaságú.

Eljárásunk előnyeként említjük meg, hogy minimális anyagfelhasználással a szűrt fermentlére vonatkoztatva 85% feletti kitermeléssel tudjuk a neomicin-szulfátot előállítani úgy, hogy mellőzzük a nagymennyiségű, drága aktív szén felhasználását.

A találmány szerinti eljárást, illetve annak gyakorlati kiviteli módját az alábbi példaként ismertetett

-2181748 leírásban mutatjuk be, amelyet azonban nem tekin-

Claims (5)

1. leírásban mutatjuk be, amelyet azonban nem tekintünk korlátozó tényezőnek.

   1. Példa

   500 liter neomicintartalmú fermentlevet (hatóanyagtartalom 10220 gamma/ml) 5,6 kg oxálsawal és 21,4 kg 25%-os kénsawal pH = 2-re savanyítunk Előréteges vákuum dobszűrőn, 28 kg perlit és 9,4 kg faliszt alkalmazása mellett szüljük, a réteget vízzel mossuk. 680 liter savanyú szűitlevet (hatóanyag^-. 7206 gamma/ml) nyerünk, amelynek pH-ját tömény ammónium-hidroxid oldattal 8,5-re állítjuk. A neutralizálás során kiváló csapadékot 0,7 kg perlit alkalmazása mellett szűréssel eltávolítjuk az oldatból. A 700 liter neutrális szűrtléből (hatóanyag: 6930 gamma/ml), a neomicint ioncserés technikával, 45 liter NH₄ ⁺ ciklusban levő gyengénsavas kationcserélő gyantával (pl. VARION KCO, WOFATIT CP-300, AMBERLITE IRC-50, stb.) töltött oszlopon kötjük meg úgy, hogy az oldatot 70 liter/óra sebességgel, álló ágyban engedjük át az oszlopon.

   Ezután az oszlopot először ionmentes vízzel, majd 0,2%-os ammónium-hidroxiddal mossuk át. A kimosott oszlopról a hatóanyagot 5%-os ammónium-hidroxiddal eluáljuk, amikor is 57,5 liter ammóniás eluátum keletkezik (hatóanyag: 8%).

   Az eluátumot előtisztítás céljából 7 liter erősen bázisos anioncserélő gyantát (pl. VARION ATM, VARION AT-400, AMBERLITE IRA 900, stb.) tartalmazó oszlopon vezetjük át 9 liter/óra sebességgel, majd az oszlopot 18 liter ionmentes vízzel kimossuk. Az anioncserélőt használat előtt aktiváljuk úgy, hogy egymás után ötszörös ágytérfogat n kénsavat, 1% aktiv klórt tartalmazó nátrium-hipokloritot és n nátrium-hidroxidot vezetünk át és az egyes ciklusok után vízzel kimossuk az oszlopot.

   A 85 liter előtisztított eluátumot (hatóanyag: 5,2%), ammónia mentesítés és töményítés céljából vákuumban 50—55 °C-on 40% hatóanyagtartalom eléréséig bepároljuk. 8,5 liter neomicin-bázist tartalmazó sűrítményt nyerünk. A neomicin-szulfát képzését úgy végezzük, hogy a sűrítmény pH-ját 20 n kénsawal 2-re savanyítjuk hűtés mellett, 30 °C alatti hőmérsékleten, majd a kénsav felesleget dietilaminnal semlegesítjük pH 6-ig. Ezután az oldathoz keverés és hűtés közben lassan 2,2 liter 30%-os hidrogén-peroxid (1,93 M) oldatot adagolunk úgy, hogy a hőmérséklet 30 °C alatt maradjon, majd 10 órát állni hagyjuk, mialatt a színanyagok oxidációja teljesen végbemegy.

   Az így kapott majdnem színtelen oldatot még 220 gramm aktív szénnel derítjük. Az oldatból a neomicin-szulfát hatóanyagot 50 liter metanollal kicsapjuk, szűrjük, a csapadékot metanollal átmossuk. A nedves anyagot vákuumban 50 C-on megszárítjuk, amikor is 4,3 kg késztermék neomicin-szulfátot kapunk a fermentlére számított 84,2% kitermeléssel.

   A kapott termék minősége megfelel a VI. Magyar Gyógyszerkönyv és BP-73 előírásának azaz — Oldódás: megfelelő: 1 g készítmény 10 ml vízben maradék nélkül, tisztán oldódik,

   5 - Küllem: fehér

   - pH: 5,25 — Szulfáthamu: 0,03%,

   - Toxicitás: 0 — Szín: Zj

   10 - Biológiai NE/mg: 682

   - Szárítási veszteség: 5,27% — Kémiai hatóanyagtartalom; 99,1%, — Nehézfém tartalom: megfelel: 20 gg/g érték alatt

   - Neomin tartalom: megfelel: 2% alatt

   15 — Specifikus forgatóképesség: 55,1 — Ammónium-szulfát tartalma: 0,2%.
2. 2. példa

   20 Az 1. példa szerint kapott 680 liter savas szűrtlé (hatóanyag: 7206 gamma/ml neomicin-szulfát pH-ját cc. NH₄OH-dal 4,4-re állítjuk. Az oldatot 60 liter NH₄ -ciklusban levő gyengén savas kationcserélő gyantával (pl. Varion KCO, Wofatit CP 300, Amber25 lite IRC-50, Lewatit CNP 80 stb.) töltött oszlopon, álló ágyban, 70 liter/óra sebességgel átvezetjük. Ezután az oszlopot először ionmentes vizzel, majd 360 liter 0,2 n NH₄0H-dal mossuk át.

   A kimosott oszlopról a hatóanyagot 5%-os

   30 NH₄OH-dal eluáljuk, amikor is 83 liter eluátumot (hatóanyag: 5,1%) kapunk. Ammóniamentesítés és töményítés céljából 50—55 °C-on vákuumban 30% hatóanyagtartalom eléréséig bepároljuk. A sűrítmény pH-ját 30 °C alatti hőmérséldeten 20 n kénsawal

   35 6-ra állítjuk és az oldathoz keverés és hűtés közben, 30 °C alatti hőmérsékleten 450 ml
3. 3%-os H₂O₂-ot (0,
4. 4 mól) adagolunk, majd 3 órát állni hagyjuk, mialatt a színanyagok oxidációja teljesen végbemegy.

   Az oldatból a neomicin-szulfát hatóanyagot az 1.

   40 példa szerint kicsapjuk: 4,3 kg neomicinszulfátot kapunk, melynek minősége megegyezik az 1. példában kapott termék minőségével.

   Szabadalmi igénypont:

   Uj eljárás neomicin-szulfát előállítására szűrt fermentlevekből gyengén savas, ammónium-ciklusú gyantán való megkötéssel eluálással, adott esetben az eluátum előtisztításával, majd töményítésével és

   50 kénsawal történő reagáltatásával azzal jellemezve, hogy a neomicin-szulfátot tartalmazó oldat pH-ját
5. 5—7 célszerűen pH=6 értékre állítjuk, majd állandó keverés mellett J0-30 °C hőmérsékleten, előnyösen 20°C-on a hatóanyag egy kilogramjára számított

   55 0,1-10 mól hidrogén-peroxidot adagolunk vizes oldatban, a reakcióelegyet 0,5—10 órán át, előnyösen 3 órán át állni hagyjuk és az oldatból a neomicin-szulfátot önmagában ismert módon metanollal kicsapjuk, a csapadékot szűrjük, mossuk, szárítjuk.

   A kiadásért felel: a Közgazdasági és Jogi Könyvkiadó igazgatója

   84.4440 - Zrínyi Nyomda, Budapest