HU179360B

HU179360B - Process for preparing thymidine-phosphorylase

Info

Publication number: HU179360B
Application number: HU78WE578A
Authority: HU
Inventors: Thomas A Krenitsky
Original assignee: Wellcome Found
Priority date: 1977-06-14
Filing date: 1978-06-13
Publication date: 1982-10-28
Also published as: ES470728A1; DK264878A; ZA783394B; IT1106103B; CA1112193A; IL54898A; AU3706178A; DE2860890D1; US4219621A; EP0000071B1; FI60031B; AU516545B2; IL54898A0; IT7849852A0; FI781887A; FI60031C; JPS6156998B2; JPS548791A; EP0000071A1

Description

A találmány tárgya eljárás stabil timidin-foszforiláz-készítmény előállítására. A találmány értelmében előállított timidin-foszforiláz-készítmény az antifolát típusú mikroba-ellenes szerekre, így szulfametoxazolra (S MX) és/vagy timetoprimra (TMP) érzékeny baktériumok vizsgálatánál, a táptalajban kerül felhasználásra.

Régóta ismert, hogy az általában használt táptalajok sokszor nem megfelelőek a baktériumok szulfon- ] amid- vagy trimetoprim-érzékenységének vizsgálatára. Az említett szerek közös jellemzője, hogy a folát szintézisét gátolják. Ha szokásos táptalajon végzik a vizsgálatot, akkor a sorozathigítás módszerét alkalmazva hosszú, elnyúló végpontot kapnak, a ; diffúziós módszert alkalmazva pedig a gátlási zónán belül is megfigyelhető részleges növekedés. Bushby (Med. J. Aust. Special Supplement, 1, 10 (1973)], valamint Kock és Burchall [Applied Microbidogy, 22, 812 (1971)] kimutatták, hogy a timidin igen hatásos ellenszere a szulfonamidok és trimetroprim gátló aktivitásának.

Harper és Cawston [J. Path. Bact. 57, 59 (1945)] azt tapasztalták, hogy egy kevésbé érzékeny vizsgálati közeg érzékenysége megnőtt, ha lízisnek alávetett ló-szérumot adtak hozzá. Ezt a felismerést több munka is megerősítette, és ettől kezdve az antibakteriális érzékenység vizsgálatánál a táptalajhoz lízisnek alávetett ló-szérumot is adtak, hogy a szulfonamidok hatására keletkezett gátlási zónában megakadályozzák a részleges növekedést. Újabban a trimetoprim vizsgálatánál is hasonló hatást mutatóit a ló-szérum alkalmazása [Bushby, Postgraduate Med.

J. 45, 10 (1969), Darrel és munkatársai, J. Clin. Path. 21, 202 (1968)].

Harper és Cawston megállapították, hogy a lízisnek alávetett ló-szérum egy faktort tartalmaz, amely a szulfonamidantagonista anyagokat közömbösíti, és 0 ez a Harper-Cawstonfaktornak nevezett anyag csak olyan közegben hatásos, amely bizonyos mennyiségű - 0,1-15 pg/ml töménységben - timidint tartalmaz. 0,1 pg/rrd töménység alatt a timidin nem gátolja a gyógyszerek aktivitását, és így ilyen kis 5 mennyiségű timidin eltávolítása nem változtat a gyógyszer hatásán. Igen nagy, 15pg/ml-nél nagyobb timidin-koncentrációnál a Harper-Cawston-faktor nem képes a szulfonamidok és trimetoprim aktivitását megvédem. Valószínűleg a timidin hasításának θ eredményeként nagy mennyiségben keletkező timín eléri a sokkal aktívabb timidin hatását.

A Harper-Cawston-faktorról megállapítottuk, hogy a tímidin-foszforiláz [Bushby, Trimetho5 prim/Sulphamethoxazole in Bacterial Infections, A Wellcome Foundation Symposium, Ed. Bemstein and Salter, Churchill Livingston, Edinburgh and London, 1, 10—18 (1973), Ferone és munkatársai, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 7, 91 3 (1975)]. Az előbbi munkában kimutatták, hogy „bár in vitro a timidin akadályozza a trimetoprim/szulfametoxazol aktivitását, de in vivő a tri· metoprim/szulfametoxazol aktivitásának befolyásolásához az állati szervezetekben általában nem elég nagy a timidin töménysége”.

Lízisnek alávetett ló-szérum hozzáadása a táptalajhoz hátrányos, mert egyrészt pirosas-barna szint kölcsönöz a közegnek, másrészt meghatározhatatlanná teszi tulajdonképpen a közeget. További nehézséget okoz, hogy sterilizált lószérum igen kis 1 mennyiségben áll rendelkezésre, az egész világon csak kevés helyen kapható.

Ismeretes, hoggy a baktériumoknak antifolát hatású gyógyszerekkel szemben mutatott érzékenysége 1 jobban vizsgálható olyan, egyébként hagyományos táptalajon, amely bakteriális eredetű, tisztított timidin-foszforilázt is tartalmaz (3445/75 számú, nagy britanniai szabadalmi bejelentés). Az enzim használatát korlátozza az a tény, hogy csak bizonyos fór- 2 mában stabil. Ismeretes, hogy a bakteriális eredetű timidin-foszforiláz —20 °C-on stabil, de 4 C-on gyorsan csökken az aktivitása [Schwartz, Eur. J. Biochem. 21, 191 (1971)]. A 2 602 996 számú, Német Szövetségi Köztársaság-beli szabadalmi leírás szerint 2 az enzim ammónium-szulfát szuszpenzióban vagy 5 mg/ml-nél nagyobb fehérje-koncentráció esetén 10%-os ammónium-szulfát oldatban stabil. Az ilyen tárolási formáknak is azonban több hátránya van. A szuszpenzió gyorsan leülepszik, nehezen mérhető ki 3 belőle aliquot rész és nehezen sterilizálható az enzim denaturációja nélkül, mivel a szűrés módszere nem alkalmazható. A 10%-os ammónium-szulfát oldatban levő tömény enzim-oldat drága, egy adag a többszörös használat miatt könnyen fertőződhet, és a megfelelő 3 stabilitás eléréséhez szükséges töménységben az oldat 1 ml-e 2000 nemzetközi egység (I. U.) mennyiségű enzimet tartalmaz, amely 100 liter közegben elegendő.

Szükség volt ezért olyan körülményeket keresni, amelyek között az enzim mind híg mind tömény formában stabil.

Az Escherichia coli-ból kinyert timidin-foszforiláz kinetikai analízise azt mutatta, hogy az enzim timin- 4 nel és foszfáttal bizonyos körülmények között olyan komplexet képez, amely inaktív Ciead-end komplex), de megbontható, mielőtt az enzim katalitikusán aktív komplexet képez. A megfigyelésekből arra lehetett következtetni, hog> a dead-end komp- 5 lex stabilabb a szabad enzimnél. Mivel a timin jelenléte nem előnyös a táptalajban, keresni kellett helyette valami mást.

Találmányunk alapja az a felismerés, hogy uracil 5 és szervetlen foszfát, igy kálium-foszfát, kombinációja igen hatásosan stabilizálja a timidin-foszforilázt mind tömény, mind hígított formában.

Fentiek alapján találmányunk tárgya eljárás stabil timidin-foszforiláz előállítására uracil és szervetlen g foszfát hozzáadásával.

A timidin-foszforilázt baktériumokból, így Salmonella typhimurium-ból, Bacillus cereus-ból, Bacillus stearothermophilus-ból, Haemophilus influ- ₆ enzae-ből és különösen olyan Escherichia coli törzsből állítjuk elő, amely növekedéséhez timin és metionin szükséges. A tisztítást Schwartz [Eur. J. Biochem. 21, 191-198 (1971)] módszerével is végezhetjük, amely kicsapásból, frakcionálásból, kromatográfiás eljárásból és dialízisből áll, de ez hosszadalmas eljárás. Előnyösebb a 2 602 996 számú Német Szövetségi Köztársaság-beli szabadalmi leírásban leírt módszer. Eszerint olyan Escherichia coli törzset alkalmazunk, amely megfelelő növekedési körülmények között rendkívül nagy mennyiségű timidin-foszforilázt termel, és az enzimet speciális adszorbens alkalmazásával kinyerjük a sejt-kivonatból, majd az adszorbensről eluáljuk az enzimet. Az eluálás után nyert enzim tisztább a Schwartz-féle módszerrel kapott enzimnél, és a kitermelés ugyancsak jobb, mint a Schwartz-féle módszerrel.

A tisztítási eljárás során az eluátum abszorpcióját adott hullámhosszon folyamatosan mérjük abból a célból, hogy az enzim aktivitását nemzetközi egységben (I.U.) tudjuk meghatározni. Egy nemzetközi egység (I.UJ az az enzim mennyiség, amely a meghatározás körülményei között 1 μτηοΐ timidínt alakít át timinné (lásd 1. példa). A legnagyobb töménységű és aktivitású csúcsokat választjuk ki.

Az előbbiekben leírt módon tisztított enzimet uracil és szervetlen foszfát hozzáadásával stabilizáljuk. Bár igen sokféle só alkalmazható, előnyösen kálium- és ammónium-foszfátot alkalmazunk.

A táptalajban a timidin- foszforiláz töménysége előnyösen 0,01-1000, még előnyösebben 0,02-10 nemzetközi egység (I.U.)/ml közé esik.

Stabil timidin-foszforiláz-készítményhez jutunk, ha az uracil töménységét 0,5 mM és a telítettség, előnyösen 1-20 mM között, a szervetlen foszfát töménységét pedig 0,1 mM és a telítettség, előnyösen 0,1—1,0 M között választjuk meg.

Bizonyos esetekben megfigyeltük, hogy az enzim-készítmény átszűrése aktivitás-veszteséget okoz. Azt találtuk, hogy szérum-albumin, így marha eredetű szérum-albumin hozzáadásával kivédhető az aktivitás-veszteség.

Fentiek alapján úgy készítünk stabil timidin-foszforilázt, hogy az uracilt és szervetlen foszfátot tartalmazó oldathoz még szérum-albumint is adunk az aktivitás-veszteség megakadályozásának céljából.

Az albumin töménysége előnyösen 0,2—5%.

Igen lényeges, hogy a fentiekben leírt készítmény steril legyen, különösen abban az esetben, ha a készítményt baktériumoknak antifolátokkal szemben mutatott érzékenységének vizsgálatánál alkalmazzuk.

A sterilitás biztosításának érdekében a készítményhez mikroba-ellenes szert is kell adni. Igen fontos, hogy a készítmény sterilitását biztosító mikroba-ellenes szer ne befolyásolja az enzim aktivitását. Azt találtuk, hogy az alkálifémek azidjai, így a nátrium- és kálium-azid, igen alkalmas mikroba-ellenes szerek, mert nem befolyásolják az enzim aktivitását és a készítmény felhasználásakor olyan nagy mértékben felhígulnak, hogy hatástalanná válnakFentiek alapján úgy állítunk elő stabil és steril timidin-foszforiláz-készítményt, hogy az enzim-oldat2 hoz uracilon és szervetlen foszfáton kívül olyan mikroba-ellenes szert is adunk, amely az enzim aktivitásának befolyásolása nélkül sterilizálja az oldatot.

A mikroba-ellenes szer töménysége 0,001-0,4% között, előnyösen 0,002—0,2% között mozoghat. 5

Megfigyeltük, hogy a fentiekben leírt timidin-foszforiláz-készítmény stabilitása a pH-tól is függ. Az enzim stabilitása 6—8 pH-értékű, előnyösen 7 pH-értékű közegben a legnagyobb. 10

A találmány szerint előállított timidin-foszforiláz-készítményből olyan steril kiszerelési egységek készíthetők, amelyeknek tartalma közvetlenül felhasználható diagnosztikai laboratóriumokban.

A találmány tárgyát a következő példák világítják meg anélkül, hogy a találmány tárgya ezekre korlátozódna.

1. példa

Escherichia coli-ból elkülönített és ammónium-szulfáttal stabilizált timidin-foszforiláz-készítmények stabilitását vizsgáltuk különböző kezdeti enzim- 25 -koncentráció esetén. Az enzim-oldatok 700 mM anunónium-szulfátot, 83 mM kálium-foszfátot, és 2,5% marha szérum-albumint tartalmaztak, pH-értékük 6,8 volt. Az enzim-aktivitást 25 C-on és 290nm-nél mértük (ΔΕ= 1000Μ^_1 cin'¹), ahol a 30 reakcióelegy 200 mM 7,4 pH-értékű kálium-foszfátot és 1 mM timidint tartalmazott. A következő eredményeket kaptuk:

	Maradék aktivitás
Timidin-foszforiláz	a kezdeti aktivitás
kezdeti aktivitása	százalékában, 110 napig
(nemzetközi egység	5 °C-on való
I.U./ml)	tárolás után
1300	98
400	90
40	79
4	40
0,4	3

Az eredményekből látható, hogy ez a 2 602 996 számú, Német Szövetségi Köztársaság-beli szabadalmi leírás szerint előállított készítmény csak vi- 50 szonylag nagy enzim-koncentráció esetén stabil.

2. példa

Escherichia coli-ból előállított timidin-foszforiláz stabilitását vizsgáltuk híg oldatban (1,5 nemzetközi egység (I.U.)/ml) úgy, hogy nem adtunk hozzá semmit, vagy uracilt és foszfátot adtunk hozzá különböző mennyiségben, vagy uracilt, illetve foszfátot adtunk hozzá különböző pH-értékeknél. Mindegyik oldat 2,5% marha szérum-albumint és 0,2% nátrium-azidot is tartalmazott. Az enzim aktivitását az 1. példában leírt módon mértük. A következő eredményeket kaptuk:

Maradék aktivitás a kezdeti aktivitás* Stabilizátor százalékában, 37 °C-on napig való tárolás után pH6 pH 7 pH 8

_	0	0	0,6
500 mM foszfát	43	72	70
17,5 mM üracil	19	1	0,9
17,5 mM uracil és
500 mM foszfát	100	100	93
0.5 mM uracil és
500 mM foszfát	-	85	-

*=1,5 nemzetközi egység (l.U.)/ml

Az eredményekből látható, hogy az uracil vagy a káliumfoszfát egymagában nem képes stabilizálni az enzimet, csak a kettő együtt képes erre. Az is látható, hogy a két stabilizáltor az 1. példában alkalmazott enzim-koncentrációnál jóval kisebb enzim-koncentrációnál hatásos.

Szabadalmi igénypontok:

Claims

Szabadalmi igénypontok:

1. Stabil timidin-foszforiláz-készítmény, azzal jellemezve, hogy az enzimen kívül uracilt és szervetlen foszfátot, valamint adott esetben szérum-albumint és/vagy mikroba-ellenes szert tartalmaz.
2. Az 1. igénypont szerinti készítmény kiviteli alakja, azzal jellemezve, hogy a szervetlen foszfátot 0,1 mM koncentrációtól a telítettségig terjedő menynyiségben tartalmazza.
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti készítmény kiviteli alakja, azzal jellemezve, hogy a szervetlen foszfátot 0,1 M-tól l,0M-ig terjedő töménységben tartalmazza.
4. Az 1., 2. vagy 3. igénypont szerinti készítmény kiviteli alakja, azzal jellemezve, hogy szervetlen foszfátként kálium-foszfátot tartalmaz.
5. Az 1., 2. vagy 3. igénypont szerinti készítmény kiviteli alakja, azzal jellemezve, hogy szervetlen foszfátként ammónium-foszfátot tartalmaz.
6. Az 15. igénypontok bármelyike szerinti készítmény kiviteli alakja, azzal jellemezve, hogy 0,5 mM koncentrációtól a telítettségig terjedő menynyiségben uracilt tartalmaz.
7. A 6. igénypont szerinti készítmény kiviteli alakja, azzal jellemezve, hogy 1 mM-tól 20 mM-ig terjedő töménységben tartalmaz uracilt.
8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti készítmény kiviteli alakja, azzal jellemezve, hogy szérum-albumint is tartalmaz.
9. A 8. igénypont szerinti készítmény kiviteli alakja, azzal jellemezve, hogy marha eredetű szérum-albumint tartalmaz.
10. A 8. vagy 9. igénypont szerinti készítmény kiviteli alakja, azzal jellemezve, hogy 0,2%-tól 5%-ig terjedő mennyiségben tartalmaz szérum-albumint.
11. Az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti készítmény kiviteli alakja, azzal jellemezve, hogy mikroba-ellenes szert tartalmaz.
12. A 11. igénypont szerinti készítmény kiviteli alakja, azzal jellemezve, hogy mikroba-ellenes szerként alkálifémazidot tartalmaz.
13. A 12. igénypont szerinti készítmény kiviteli alakja, azzal jellemezve, hogy az alkálifém-azidot 0,001%-tól 0,4%-ig terjedő mennyiségben tartalmazza.
14. A 13. igénypont szerinti készítmény kiviteli alakja, azzal jellemezve, hogy az alkálifém-azidot 0,002-0,2% mennyiségben tartalmazza.
15. A 11—14. igénypontok bármelyike szerinti készítmény kiviteli alakja, azzal jellemezve, hogy a mikroba-ellenes szer nátrium-azid.
16. A 11—14. igénypontok bármelyike szerinti 5 készítmény kiviteli alakja, azzal jellemezve, hogy a mikroba-ellenes szer kálium-azid.
17. Az 1-16. igénypontok közül bármelyik szerinti készítmény kiviteli alakja, azzal jellemezve, hogy pH-értéke 6—8 közé esik.

10 18. A 17. igénypont szerinti készítmény kiviteli alakja, azzal jellemezve, hogy pH-értéke 7.

A kiadásért felel: a Közgazdasági és Jogi Könyvkiadó igazgatója

83.4060 - Zrínyi Nyomda, Budapest