FI60031C - Stabiliserat tymidinfosforylaspreparat foer anvaendning vid bestaemning av kaensligheten hos bakterier - Google Patents

Description

Ρΰϊδ^Π γβΊ kuulutusjulka.su

Ma LJ (11) utläggningsskrift 600 31 c (4s) (51) Ky.ik.3/int.ci.3 C 12 N 9/10 // e 07 G 7/00 SUOMI—FINLAND (21) p*t»nttlh*k«mu*-p»*nt*Möknme 781887 (22) H*k«ml«pUvi — AittBknlngadag 13.06.78 ^ ^ (23) Alkupftlvl—Glltlghutadag 13.06.78 (41) Tullut luikituksi — Mlvlt ofhmllg 15.12.78

Patentti- ja rekisterihallitus .... ......... , . , _ (44) NShUvIktlptneo |« kuuL|ulkaltun pvm. — -

Patent- oeh registerstyrelsen Ansökan uttagd och utl-skrtfun publkarad 31 - 07.81 (32)(33)(31) Pyydetty ·βιο»Ι»υι—Begird prlorltet 1^.06.77

Englanti-England(GB) 2U665/77 (71) The Wellcome Foundation Limited, 183-193 Euston Road, London N.W.I., ‘ Englanti-England(GB) (72) Thomas Anthony Krenitsky, Chapel Hill, North Carolina, USA(US) (7*0 Oy Kolster Ab (5M Bakteerien herkkyyden määrittämisessä käytettävä stabiloitu tyrni diini-fosforylaasivalmiste - Stabiliserat tymidinfosforylaspreparat för an-vändning vid bestämning av känsligheten hos bakterier Tämän keksinnön kohteena on tymidiinifosforylaasivalmiste, joka voidaan sisällyttää antimikrobisten antifolaattiaineiden, kuten sulfametoksatsolin (SMX) ja/tai trimetopriimin (TMP) bakteerien herk-kyyskokeiluissa käytettyihin viljelyväliaineisiin, erityisesti keksinnön kohteena on parannettu stabiloitu tymidiinifosforylaasivalmiste.

Jo kauan on tiedetty, että yleisesti käytetyt viljelyväli-aineet ovat usein sopimattomia bakteerien herkkyyden määrittämiseen sulfonamidien tai trimetopriimin suhteen, so. sellaisten aineiden suhteen, jotka häiritsevät näiden organismien folaattisynteesiä. Tämä sopimattomuus ilmenee käytetyssä sarjalaimennusmenetelmässä saatuina pitkähäntäisinä loppupisteinä ja diffuusiomenetelmässä osittaiskasvuna estovyöhykkeissä. Bushby, Med. J. Aust. Special Supplement, 1973, 1, 10, ja Kock ja Burchall, Applied Microbiology, 1971, 22, 812 ovat osoittaneet, että tymidiini on erittäin vahva sulfonamidien ja trimetopriimin aktiiviteetteja kumoava aine.

2 60031 V. 1945 Harper ja Cawston, J. Path. Bact. , _57, 59 osoittivat, että lisättäessä lysoitua hevosen verta heikosti toimivaan herkkyyskoeväliaineeseen, se pystyi muuttamaan sen tyydyttäväksi.

Tämän aikaisen tutkimuksen ja useiden muiden tutkijoiden tutkimusten vuoksi on tullut yleisesti tavaksi sisällyttää antibakteerisen herkkyyden määrittämiseen tarkoitettuihin koeväliaineisiin lysoitua hevosen verta usein havaitun osittaisen kasvun estämiseksi sulfon-amidin aiheuttamissa estovyöhykkeissä. Myöhemmin tämän menetelmän on osoitettu olevan yhtä tehokas trimetopriimillä suoritetuissa kokeissa (Bushby, Postgraduate Med. J. , 1969, 45 , 10; ja Darrell et ai,, J. Clin. Path. 1968, 21_, 202). >

Harper ja Cawston osoittivat, että lysoitu hevosen veri sisälsi sellaista tekijää, joka kumoaa sulfonamidiantagonistisia aineita, ja että tämä ns. Harper-Cawston-tekijä on tehokas ainoastaan väliaineissa, jotka sisältävät kohtuullisen määrän tymidiiniä, nimittäin noin 0,1 - 15 pg/ml. Alle noin 0,1 pg/ml lääkeaineen aktiivisuus ei ole estetty, ja siten sellaisen pienen tymidiinimäärän poistamisella ei ole vaikutusta havaittuun lääkeaineen inhibiitioon. Erittäin korkeilla tymidiinitasoilla, nimittäin yli 15 pg/ml olevilla tasoilla, Harper-Cawston-tekijä ei riitä voittamaan sulfonamidien ja trime-topriimin aktiivisuuksien kumoutumista, luultavasti siitä syystä, että tymidiinin pilkkoutumisen tuloksena muodostuu siksi suuri pitoisuus tymiiniä, että se voi korvata kumoajana paljon aktiivisemman tymidiinin.

Harper-Cawston-tekijän on ilmoitettu olevan tymidiinifosfo-rylaasi (Bushby, Trimethoprim/Sulphamethoxazole on Bacterial Infections A Wellcome Foundation Symposium: Ed. Bernstein & Salter, Churcill Livingston, Edinburgh & London, 1973, _1, 10-18; Ferone et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, (1975) , T_, 91) . Ensin mainitussa viitejulkaisussa on korostettu, että vaikka tymidiini häiritsee trimetopriimi/sulfametoksatsolin aktiivisuutta in vitro, niin sitä ei yleensä ole riittävän suurina pitoisuuksina läsnä eläimissä, jotta se vaikuttaisi in vivo aktiivisuuteen".

Haittana lysoidun hevosen veren sisällyttämisessä viljelyväli-aineeseen on, että väliaine saa siitä punertavan ruskean värin ja että sen lisääminen viljelyväliaineeseen tekee väliaineen määrittelemisen käytännöllisesti katsoen mahdottomaksi. Vielä eräänä haittana steriilin hevosen veren lisäämisellä on, että sitä on saatavana erit- 3 60031 täin rajoitetusti ja sangen harvoilta tuottajilta koko maailmassa.

On osoitettu, että eristetyn ja puhdistetun bakteerialku-perää olevan tymidiinifosforylaasin lisääminen moniin erilaisiin, tavallisesti käytettyihin kasvuväliaineisiin parantaa näitä bakteeri-herkkyyskokeissa antifolaattilääkkeiden suhteen käytettäviä väliaineita, kuten on esitetty FI-patenttijulkaisussa n:o 56 856. Entsyymin käyttöä rajoittaa kuitenkin se, että se on pysyvä vain määrätyissä muodoissa. Tiedetään, että bakteerialkuperää olevat tymidiinifosfory-laasiliuokset ovat pysyviä -20°C:ssa, mutta 4°C:ssa niiden aktiivisuus alenee huomattavan nopeasti (Schwartz. Eur.J. Biochem, 1971,_21, 191). Tämän vaikeuden voittamiseksi edellä mainittu patenttihakemus kuvaa pysyviä entsyymikoostumuksia, jotka koostuvat joko ammoniumsul-faattisuspeneieitsfc* Aai väkevistä-ei siis laimeista-entsyymiliuoksista ( 7 5 mg proteiinia/ml) 10-%:isessa ammoniumsulfaattiliuoksessa.

Tämän tyyppisiin koostumuksiin liittyy kuitenkin joukko epäkohtia. Suspensiot esimerkiksi laskeutuvat nopeasti, niistä on vaikeata mitata tasaosia, ne ovat vaikeasti steriloitavia ilman,että entsyymi denaturoituu , koska suodatusta ei voida käyttää. Entsyymin väkevät liuokset 10-%:isessa ammoniumsulfaatissa eivä ole edullisia hintansa vuoksi eivätkä myöskään useampikertaiseen käyttöön liittyvän mikro-bitartuntavaaran vuoksi, lisäksi hankaluutena on, että sellaisina väkevyyksinä, joilla saadaan riittävä pysyvyys (--^2000 ky/ml) , 1 ml:lla entsyymivalmistetta voidaan käsitellä noin 100 litraa väliainetta. Näistä syistä pidettiin toivottavana sellaisten olosuhteiden löytämistä, joissa tämä entsyymi olisi pysyvä sekä laimeina että väkevinä liuoksina.

Escherichia coli'sta puhdistetun tymidiinifosforylaasin kineettistä analyysista voidaan päätellä, että tietyissä olosuhteissa tyrniini, fosfaatti ja tymidiinifosforylaasi saattavat muodostaa "dead-end-kompleksin", so. kompleksin joka sinänsä ei ole katalyyttisesta aktiivinen, vaan jonka muotoa on muutettava ennenkuin entsyymi voi muodostaa katalyyttisesti aktiivisia komplekseja. Tästä havainnosta tehtiin johtopäätös, että "dead-end-kompleksi" saattaisi olla pysyvämpi kuin vapaa entsyymi. Koska tyrniini ei ole toivottu lisäaine väliaineessa, kuten edellä selvitettiin, alettiin etsiä sen korviketta.

60031 4

Nyt on havaittu, että urasiilin ja epäorgaanisen fosfaatin, esim. kaliumfosfaatin, yhdistelmä on erittäin tehokas tymidiinifosfo-rylaasin sekä väkevien että laimeiden liuosten stabiloija.

Keksinnön kohteena on tymidiinifosforylaasivalmiste sisällytettäväksi viljelyväliaineeseen, jota käytetään bakteerien herkkyyden kokeilemiseen mikrobienvastaisten antifolaattiaineiden suhteen.

Keksinnön mukaiselle tymidiinivalmisteelle on tunnusomaista, että se sisältää epäorgaanista fosfaattia pitoisuutena 0,1 mrnolaa-risesta kyllästyspitoisuuteen ja urasiilia 0,5 mmolaarisesta kylläs-tyspitoisuuteen ja että valmisteen pH on 6-8.

Tässä keksinnössä käytettävä tymidiinifosforylaasi voidaan saada puhdistamalla monista eri bakteereista, esim. seuraavista: Salmonella typhimurium, Bacillus cereus, Bacillus stearothermophilus, Haemophilus influenzae ja varsinkin Escherichia coli-kannasta, joka vaatii kasvaakseen tymiiniä ja metioniinia. Puhdistus voidaan suorittaa menetelmällä, jonka Schwartz, Eur. J. Biochem., 1971, 21, 191-198, on kuvannut, joka menetelmä käsittää jossain määrin pitkällisiä saostus-, fraktiointi-, kromatografia- ja dialyysivaiheita. Edullisempi menetelmä on hakijan aikaisemmassa FI-patenttijulkaisussa n:o 56 856 kuvattu menetelmä, jossa käytetään E. coli B 96 kantaa, joka sopivissa kasvuolosuhteissa tuottaa epätavallisen suuria määriä tymidiinifosforylaasia, joka voidaan eristää ja puhdistaa viemällä solu-uute määrätyille adsorbenteille ja eluoimalla entsyymi niistä. Tällä menetelmällä saadaan tymidiinifosforylaasia puhtaampana ja huomattavasti paremmalla saannolla kuin Schwartz'in menetelmällä.

Käytetyn puhdistusmenetelmän kaikissa vaiheissa eluaatin ent-syymiaktiviteettia voidaan seurata spektrofotometrianalyyseillä sopivalla aaltopituudella määrätyn entsyymiaktiivisuuden varmistamiseksi, joka ilmaistaan kansainvälisinä yksikköinä (k.y.), jolloin yksi kansainvälinen yksikkö vastaa entsyymimääiää, joka fosforyloi yhden mikromoolin tymidiiniä tymiiniksi käytetyissä koeolosuhteissa (ks. esimerkki 1). Korkeimman väkevyyden ja puhtauden osoittavat piikit valitaan.

Näin puhdistettu entsyymi saatetaan sitten pysyvään muotoon, kuten edellä esitettiin, lisäämällä urasiilin ja epäorgaanisen fosfaatin yhdistelmää. Vaikka monia eri fosfaattisuoloja voidaankin käyttää, niin edullisia ovat kalium- ja ammoniumfosfaatti.

5 60031

Viljelyväliaineisiin lisätyn tymidiinifosforylaasin määrä on edullisesti noin 0,01-100 kansainvälistä yksikköä/ml, ja edullisemmin 2,02-10 kansainvälistä yksikköä/ml.

Stabiloitu tymidiinifosforylaasi sisältää 0,5 mmolaari-sesta kyllästettyyn pitoisuuteen urasiilia, edullisesti 1-20 mM urasiilia, ja 0,1 mmolaarisesta kyllästettyyn pitoisuuteen, edullisesti 0,1-1,0 M epäorgaanista fosfaattia.

Joissakin tapauksissa entsyymivalmisteen suodatuksessa entsyymiaktiivisuus alenee. On kuitenkin havaittu, että lisäämällä see-rumialbumiinia, esim. häränseerumialbumiinia, tämä vaikeus voitetaan.

Seerumialbumiinia lisätään edullisesti 0,2-5 %.

Edellä kuvattujen koostumusten steriiliys on erittäin tärkeä, kun otetaan huomioon niiden käyttö bakteerien herkkyyden kokeilussa antifolaattien suhteen, Senvuoksi on usein edullista lisätä koostumukseen steriiliyden takaamiseksi antimikrobista ainetta. On kuitenkin tärkeätä, että käytetyt antimikrobiset aineet steriloivat koostumuksen vaikuttamatta entsyymin pysyvyyteen. Tämän keksinnön tarkoituksiin sopiviksi mikrobinvastaisiksi aineiksi on havaittu atsidit, kuten natriumatsidi tai kaliumatsidi, koska ne eivät vaikuta entsyymin aktiivisuuteen ja koska ne keksinnön mukaisten koostumusten käytössä laimenevat antimikrobisina aineina tehottomiksi.

Edellä määriteltyä antimikrobista ainetta voidaan sisällyttää valmisteeseen 0,001-0,4 %, edullisesti 0,002-0,2 %.

Lisäksi on havaittu, että tymidiinifosforylaasin pysyvyys edellä kuvatussa valmisteessa on riippuvainen pH:sta, jolloin paras pysyvyys saavutetaan pH-alueella 6-8, edullisimmin pH 7:ssä.

Vertailukoe tunnetulla valmisteella

Tymidiinifosforylaasivalmisteiden pysyvyyden tutkimiseksi suoritettiin vertailukoe tunnetuilla valmisteilla, jotka sisälsivät erilaisina alkupitoisuuksina E. coli B 96-kannasta (ATCC 13473) FI-patentissa 56 856 kuvatulla menetelmällä puhdistettua ja ammoniumsulfaatilla stabiloitua entsyymiä. Jokainen entsyymiliuos sisälsi ammoniumsulfaattia (700 mM) , kaliumfosfaattipuskuria (83 mil) ja härän seerumialbumiinia (2,5 %), ja liuosten pH oli 6,8. Entsyymiaktiivisuus mitattiin 25°C:ssa aaltopituudella 290 nm (aE = 1 000 M ^cm ^) ja liuoksissa, jotka sisälsivät 200 mM kaliumfosfaattia, pH 7,4, ja 1 mM tymidiiniä.

6 60031

Taulukko

Tymidiinifosforylaasi Alkuperäisestä aktiivisuudesta (pitoisuus alussa, k.y./ml) jäljellä 110 vrk:n jälkeen 5°C:ssa, % 1 300 98 400 90 40 79 4 40 0,4 3

Kuten voidaan havaita, niin tämä FI-patenttijulkaisun n:o 56 856 mukainen koostumus stabiloi tehokkaasti tymidiinifosforylaasi-valmisteen vain suhteellisen suurissa entsyymipitoisuuksissa.

Esimerkki

Keksinnön mukaisen tymidiinifosforylaasivalmisteen pysyvyyden tutkimiseen käytetty valmiste sisälsi entsyymiä, joka oli puhdistettu E. coli B 96-kannasta (ATCC 13473) FI-patentissa 56 856 kuvatulla menetelmällä, laimeana vesiliuoksena (1,5 k.y./ml). Se stabiloitiin keksinnön mukaisesti erilaisilla urasiilin ja kaliumfosfaatin yhdistelmillä tai vertailun vuoksi urasiililla ja kaliumfosfaatilla yksinään erilaisissa pH-arvoissa tai jätettiin kokonaan stabiloimatta. Jokainen liuos sisälsi myös härän seerumialbumiinia (2,5 %) ja natriumatsidia (0,02 %). Entsyymiaktiivisuudet mitattiin samoin kuin edellä esitetyssä vertailu-kokeessa. Saatiin seuraavat tulokset: χ

Alkuperäisestä aktiivisuudesta Lisätty stabiloija jäljellä 32 vrk:n jälkeen 37°C:ssa, % _pH 6_pH 7_pH 8_

Ei lisäystä 0 0 0,6 500 mM kaliumfosfaattia 43 72 70 17.5 mM urasiilia 19 1 0,9 17.5 mM urasiilia + 500 mM kalium- fosfaattia 100 100 93 0,5 mM urasiilia + 500 mM kalium- fosfaattia 85 * 1,5 k.y./ml

Kuten edellä olevasta nähdään, ei urasiili yksinään eikä kalium-fosfaatti yksinään ole yhtä tehokas entsyymin stabilointiaine kuin niiden yhdistelmä. Lisäksi tämä yhdistelmä on huomattavasti tehokkaampi alhaisilla entsyymipitoisuuksilla kuin vertailukokeessa käytetty koostumus, joka oli stabiloitu ammoniumsulfaatilla.