FI60031C - Stabiliserat tymidinfosforylaspreparat foer anvaendning vid bestaemning av kaensligheten hos bakterier - Google Patents
Stabiliserat tymidinfosforylaspreparat foer anvaendning vid bestaemning av kaensligheten hos bakterier Download PDFInfo
- Publication number
- FI60031C FI60031C FI781887A FI781887A FI60031C FI 60031 C FI60031 C FI 60031C FI 781887 A FI781887 A FI 781887A FI 781887 A FI781887 A FI 781887A FI 60031 C FI60031 C FI 60031C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- enzyme
- preparation
- stabilized
- bacteria
- thymidine
- Prior art date
Links
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 16
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title description 5
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 title 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 25
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 25
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 101710132082 Pyrimidine/purine nucleoside phosphorylase Proteins 0.000 description 19
- 102000013537 Thymidine Phosphorylase Human genes 0.000 description 19
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 18
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 12
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 description 10
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 9
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 9
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 7
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 5
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- IEDVJHCEMCRBQM-UHFFFAOYSA-N trimethoprim Chemical compound COC1=C(OC)C(OC)=CC(CC=2C(=NC(N)=NC=2)N)=C1 IEDVJHCEMCRBQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 229910052816 inorganic phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- 229940124530 sulfonamide Drugs 0.000 description 4
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960001082 trimethoprim Drugs 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000004052 folic acid antagonist Substances 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 3
- 150000003456 sulfonamides Chemical class 0.000 description 3
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- -1 above 15 pg / ml Chemical compound 0.000 description 2
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 2
- 230000003432 anti-folate effect Effects 0.000 description 2
- 229940127074 antifolate Drugs 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 2
- WZRJTRPJURQBRM-UHFFFAOYSA-N 4-amino-n-(5-methyl-1,2-oxazol-3-yl)benzenesulfonamide;5-[(3,4,5-trimethoxyphenyl)methyl]pyrimidine-2,4-diamine Chemical compound O1C(C)=CC(NS(=O)(=O)C=2C=CC(N)=CC=2)=N1.COC1=C(OC)C(OC)=CC(CC=2C(=NC(N)=NC=2)N)=C1 WZRJTRPJURQBRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 1
- 241000193755 Bacillus cereus Species 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 241001522878 Escherichia coli B Species 0.000 description 1
- 241000193385 Geobacillus stearothermophilus Species 0.000 description 1
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 241000277284 Salvelinus fontinalis Species 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 229910052787 antimony Inorganic materials 0.000 description 1
- WATWJIUSRGPENY-UHFFFAOYSA-N antimony atom Chemical compound [Sb] WATWJIUSRGPENY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 229940047766 co-trimoxazole Drugs 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 229940014144 folate Drugs 0.000 description 1
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 229940047650 haemophilus influenzae Drugs 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000012933 kinetic analysis Methods 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- TZLVRPLSVNESQC-UHFFFAOYSA-N potassium azide Chemical compound [K+].[N-]=[N+]=[N-] TZLVRPLSVNESQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 229960005404 sulfamethoxazole Drugs 0.000 description 1
- FDDDEECHVMSUSB-UHFFFAOYSA-N sulfanilamide Chemical compound NC1=CC=C(S(N)(=O)=O)C=C1 FDDDEECHVMSUSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940072176 sulfonamides and trimethoprim antibacterials for systemic use Drugs 0.000 description 1
- JLKIGFTWXXRPMT-UHFFFAOYSA-N sulphamethoxazole Chemical compound O1C(C)=CC(NS(=O)(=O)C=2C=CC(N)=CC=2)=N1 JLKIGFTWXXRPMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000003239 susceptibility assay Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
- C12N9/1077—Pentosyltransferases (2.4.2)
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Ρΰϊδ^Π γβΊ kuulutusjulka.su
Ma LJ (11) utläggningsskrift 600 31 c (4s) (51) Ky.ik.3/int.ci.3 C 12 N 9/10 // e 07 G 7/00 SUOMI—FINLAND (21) p*t»nttlh*k«mu*-p»*nt*Möknme 781887 (22) H*k«ml«pUvi — AittBknlngadag 13.06.78 ^ ^ (23) Alkupftlvl—Glltlghutadag 13.06.78 (41) Tullut luikituksi — Mlvlt ofhmllg 15.12.78
Patentti- ja rekisterihallitus .... ......... , . , _ (44) NShUvIktlptneo |« kuuL|ulkaltun pvm. — -
Patent- oeh registerstyrelsen Ansökan uttagd och utl-skrtfun publkarad 31 - 07.81 (32)(33)(31) Pyydetty ·βιο»Ι»υι—Begird prlorltet 1^.06.77
Englanti-England(GB) 2U665/77 (71) The Wellcome Foundation Limited, 183-193 Euston Road, London N.W.I., ‘ Englanti-England(GB) (72) Thomas Anthony Krenitsky, Chapel Hill, North Carolina, USA(US) (7*0 Oy Kolster Ab (5M Bakteerien herkkyyden määrittämisessä käytettävä stabiloitu tyrni diini-fosforylaasivalmiste - Stabiliserat tymidinfosforylaspreparat för an-vändning vid bestämning av känsligheten hos bakterier Tämän keksinnön kohteena on tymidiinifosforylaasivalmiste, joka voidaan sisällyttää antimikrobisten antifolaattiaineiden, kuten sulfametoksatsolin (SMX) ja/tai trimetopriimin (TMP) bakteerien herk-kyyskokeiluissa käytettyihin viljelyväliaineisiin, erityisesti keksinnön kohteena on parannettu stabiloitu tymidiinifosforylaasivalmiste.
Jo kauan on tiedetty, että yleisesti käytetyt viljelyväli-aineet ovat usein sopimattomia bakteerien herkkyyden määrittämiseen sulfonamidien tai trimetopriimin suhteen, so. sellaisten aineiden suhteen, jotka häiritsevät näiden organismien folaattisynteesiä. Tämä sopimattomuus ilmenee käytetyssä sarjalaimennusmenetelmässä saatuina pitkähäntäisinä loppupisteinä ja diffuusiomenetelmässä osittaiskasvuna estovyöhykkeissä. Bushby, Med. J. Aust. Special Supplement, 1973, 1, 10, ja Kock ja Burchall, Applied Microbiology, 1971, 22, 812 ovat osoittaneet, että tymidiini on erittäin vahva sulfonamidien ja trimetopriimin aktiiviteetteja kumoava aine.
2 60031 V. 1945 Harper ja Cawston, J. Path. Bact. , _57, 59 osoittivat, että lisättäessä lysoitua hevosen verta heikosti toimivaan herkkyyskoeväliaineeseen, se pystyi muuttamaan sen tyydyttäväksi.
Tämän aikaisen tutkimuksen ja useiden muiden tutkijoiden tutkimusten vuoksi on tullut yleisesti tavaksi sisällyttää antibakteerisen herkkyyden määrittämiseen tarkoitettuihin koeväliaineisiin lysoitua hevosen verta usein havaitun osittaisen kasvun estämiseksi sulfon-amidin aiheuttamissa estovyöhykkeissä. Myöhemmin tämän menetelmän on osoitettu olevan yhtä tehokas trimetopriimillä suoritetuissa kokeissa (Bushby, Postgraduate Med. J. , 1969, 45 , 10; ja Darrell et ai,, J. Clin. Path. 1968, 21_, 202). >
Harper ja Cawston osoittivat, että lysoitu hevosen veri sisälsi sellaista tekijää, joka kumoaa sulfonamidiantagonistisia aineita, ja että tämä ns. Harper-Cawston-tekijä on tehokas ainoastaan väliaineissa, jotka sisältävät kohtuullisen määrän tymidiiniä, nimittäin noin 0,1 - 15 pg/ml. Alle noin 0,1 pg/ml lääkeaineen aktiivisuus ei ole estetty, ja siten sellaisen pienen tymidiinimäärän poistamisella ei ole vaikutusta havaittuun lääkeaineen inhibiitioon. Erittäin korkeilla tymidiinitasoilla, nimittäin yli 15 pg/ml olevilla tasoilla, Harper-Cawston-tekijä ei riitä voittamaan sulfonamidien ja trime-topriimin aktiivisuuksien kumoutumista, luultavasti siitä syystä, että tymidiinin pilkkoutumisen tuloksena muodostuu siksi suuri pitoisuus tymiiniä, että se voi korvata kumoajana paljon aktiivisemman tymidiinin.
Harper-Cawston-tekijän on ilmoitettu olevan tymidiinifosfo-rylaasi (Bushby, Trimethoprim/Sulphamethoxazole on Bacterial Infections A Wellcome Foundation Symposium: Ed. Bernstein & Salter, Churcill Livingston, Edinburgh & London, 1973, _1, 10-18; Ferone et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, (1975) , T_, 91) . Ensin mainitussa viitejulkaisussa on korostettu, että vaikka tymidiini häiritsee trimetopriimi/sulfametoksatsolin aktiivisuutta in vitro, niin sitä ei yleensä ole riittävän suurina pitoisuuksina läsnä eläimissä, jotta se vaikuttaisi in vivo aktiivisuuteen".
Haittana lysoidun hevosen veren sisällyttämisessä viljelyväli-aineeseen on, että väliaine saa siitä punertavan ruskean värin ja että sen lisääminen viljelyväliaineeseen tekee väliaineen määrittelemisen käytännöllisesti katsoen mahdottomaksi. Vielä eräänä haittana steriilin hevosen veren lisäämisellä on, että sitä on saatavana erit- 3 60031 täin rajoitetusti ja sangen harvoilta tuottajilta koko maailmassa.
On osoitettu, että eristetyn ja puhdistetun bakteerialku-perää olevan tymidiinifosforylaasin lisääminen moniin erilaisiin, tavallisesti käytettyihin kasvuväliaineisiin parantaa näitä bakteeri-herkkyyskokeissa antifolaattilääkkeiden suhteen käytettäviä väliaineita, kuten on esitetty FI-patenttijulkaisussa n:o 56 856. Entsyymin käyttöä rajoittaa kuitenkin se, että se on pysyvä vain määrätyissä muodoissa. Tiedetään, että bakteerialkuperää olevat tymidiinifosfory-laasiliuokset ovat pysyviä -20°C:ssa, mutta 4°C:ssa niiden aktiivisuus alenee huomattavan nopeasti (Schwartz. Eur.J. Biochem, 1971,_21, 191). Tämän vaikeuden voittamiseksi edellä mainittu patenttihakemus kuvaa pysyviä entsyymikoostumuksia, jotka koostuvat joko ammoniumsul-faattisuspeneieitsfc* Aai väkevistä-ei siis laimeista-entsyymiliuoksista ( 7 5 mg proteiinia/ml) 10-%:isessa ammoniumsulfaattiliuoksessa.
Tämän tyyppisiin koostumuksiin liittyy kuitenkin joukko epäkohtia. Suspensiot esimerkiksi laskeutuvat nopeasti, niistä on vaikeata mitata tasaosia, ne ovat vaikeasti steriloitavia ilman,että entsyymi denaturoituu , koska suodatusta ei voida käyttää. Entsyymin väkevät liuokset 10-%:isessa ammoniumsulfaatissa eivä ole edullisia hintansa vuoksi eivätkä myöskään useampikertaiseen käyttöön liittyvän mikro-bitartuntavaaran vuoksi, lisäksi hankaluutena on, että sellaisina väkevyyksinä, joilla saadaan riittävä pysyvyys (--^2000 ky/ml) , 1 ml:lla entsyymivalmistetta voidaan käsitellä noin 100 litraa väliainetta. Näistä syistä pidettiin toivottavana sellaisten olosuhteiden löytämistä, joissa tämä entsyymi olisi pysyvä sekä laimeina että väkevinä liuoksina.
Escherichia coli'sta puhdistetun tymidiinifosforylaasin kineettistä analyysista voidaan päätellä, että tietyissä olosuhteissa tyrniini, fosfaatti ja tymidiinifosforylaasi saattavat muodostaa "dead-end-kompleksin", so. kompleksin joka sinänsä ei ole katalyyttisesta aktiivinen, vaan jonka muotoa on muutettava ennenkuin entsyymi voi muodostaa katalyyttisesti aktiivisia komplekseja. Tästä havainnosta tehtiin johtopäätös, että "dead-end-kompleksi" saattaisi olla pysyvämpi kuin vapaa entsyymi. Koska tyrniini ei ole toivottu lisäaine väliaineessa, kuten edellä selvitettiin, alettiin etsiä sen korviketta.
60031 4
Nyt on havaittu, että urasiilin ja epäorgaanisen fosfaatin, esim. kaliumfosfaatin, yhdistelmä on erittäin tehokas tymidiinifosfo-rylaasin sekä väkevien että laimeiden liuosten stabiloija.
Keksinnön kohteena on tymidiinifosforylaasivalmiste sisällytettäväksi viljelyväliaineeseen, jota käytetään bakteerien herkkyyden kokeilemiseen mikrobienvastaisten antifolaattiaineiden suhteen.
Keksinnön mukaiselle tymidiinivalmisteelle on tunnusomaista, että se sisältää epäorgaanista fosfaattia pitoisuutena 0,1 mrnolaa-risesta kyllästyspitoisuuteen ja urasiilia 0,5 mmolaarisesta kylläs-tyspitoisuuteen ja että valmisteen pH on 6-8.
Tässä keksinnössä käytettävä tymidiinifosforylaasi voidaan saada puhdistamalla monista eri bakteereista, esim. seuraavista: Salmonella typhimurium, Bacillus cereus, Bacillus stearothermophilus, Haemophilus influenzae ja varsinkin Escherichia coli-kannasta, joka vaatii kasvaakseen tymiiniä ja metioniinia. Puhdistus voidaan suorittaa menetelmällä, jonka Schwartz, Eur. J. Biochem., 1971, 21, 191-198, on kuvannut, joka menetelmä käsittää jossain määrin pitkällisiä saostus-, fraktiointi-, kromatografia- ja dialyysivaiheita. Edullisempi menetelmä on hakijan aikaisemmassa FI-patenttijulkaisussa n:o 56 856 kuvattu menetelmä, jossa käytetään E. coli B 96 kantaa, joka sopivissa kasvuolosuhteissa tuottaa epätavallisen suuria määriä tymidiinifosforylaasia, joka voidaan eristää ja puhdistaa viemällä solu-uute määrätyille adsorbenteille ja eluoimalla entsyymi niistä. Tällä menetelmällä saadaan tymidiinifosforylaasia puhtaampana ja huomattavasti paremmalla saannolla kuin Schwartz'in menetelmällä.
Käytetyn puhdistusmenetelmän kaikissa vaiheissa eluaatin ent-syymiaktiviteettia voidaan seurata spektrofotometrianalyyseillä sopivalla aaltopituudella määrätyn entsyymiaktiivisuuden varmistamiseksi, joka ilmaistaan kansainvälisinä yksikköinä (k.y.), jolloin yksi kansainvälinen yksikkö vastaa entsyymimääiää, joka fosforyloi yhden mikromoolin tymidiiniä tymiiniksi käytetyissä koeolosuhteissa (ks. esimerkki 1). Korkeimman väkevyyden ja puhtauden osoittavat piikit valitaan.
Näin puhdistettu entsyymi saatetaan sitten pysyvään muotoon, kuten edellä esitettiin, lisäämällä urasiilin ja epäorgaanisen fosfaatin yhdistelmää. Vaikka monia eri fosfaattisuoloja voidaankin käyttää, niin edullisia ovat kalium- ja ammoniumfosfaatti.
5 60031
Viljelyväliaineisiin lisätyn tymidiinifosforylaasin määrä on edullisesti noin 0,01-100 kansainvälistä yksikköä/ml, ja edullisemmin 2,02-10 kansainvälistä yksikköä/ml.
Stabiloitu tymidiinifosforylaasi sisältää 0,5 mmolaari-sesta kyllästettyyn pitoisuuteen urasiilia, edullisesti 1-20 mM urasiilia, ja 0,1 mmolaarisesta kyllästettyyn pitoisuuteen, edullisesti 0,1-1,0 M epäorgaanista fosfaattia.
Joissakin tapauksissa entsyymivalmisteen suodatuksessa entsyymiaktiivisuus alenee. On kuitenkin havaittu, että lisäämällä see-rumialbumiinia, esim. häränseerumialbumiinia, tämä vaikeus voitetaan.
Seerumialbumiinia lisätään edullisesti 0,2-5 %.
Edellä kuvattujen koostumusten steriiliys on erittäin tärkeä, kun otetaan huomioon niiden käyttö bakteerien herkkyyden kokeilussa antifolaattien suhteen, Senvuoksi on usein edullista lisätä koostumukseen steriiliyden takaamiseksi antimikrobista ainetta. On kuitenkin tärkeätä, että käytetyt antimikrobiset aineet steriloivat koostumuksen vaikuttamatta entsyymin pysyvyyteen. Tämän keksinnön tarkoituksiin sopiviksi mikrobinvastaisiksi aineiksi on havaittu atsidit, kuten natriumatsidi tai kaliumatsidi, koska ne eivät vaikuta entsyymin aktiivisuuteen ja koska ne keksinnön mukaisten koostumusten käytössä laimenevat antimikrobisina aineina tehottomiksi.
Edellä määriteltyä antimikrobista ainetta voidaan sisällyttää valmisteeseen 0,001-0,4 %, edullisesti 0,002-0,2 %.
Lisäksi on havaittu, että tymidiinifosforylaasin pysyvyys edellä kuvatussa valmisteessa on riippuvainen pH:sta, jolloin paras pysyvyys saavutetaan pH-alueella 6-8, edullisimmin pH 7:ssä.
Vertailukoe tunnetulla valmisteella
Tymidiinifosforylaasivalmisteiden pysyvyyden tutkimiseksi suoritettiin vertailukoe tunnetuilla valmisteilla, jotka sisälsivät erilaisina alkupitoisuuksina E. coli B 96-kannasta (ATCC 13473) FI-patentissa 56 856 kuvatulla menetelmällä puhdistettua ja ammoniumsulfaatilla stabiloitua entsyymiä. Jokainen entsyymiliuos sisälsi ammoniumsulfaattia (700 mM) , kaliumfosfaattipuskuria (83 mil) ja härän seerumialbumiinia (2,5 %), ja liuosten pH oli 6,8. Entsyymiaktiivisuus mitattiin 25°C:ssa aaltopituudella 290 nm (aE = 1 000 M ^cm ^) ja liuoksissa, jotka sisälsivät 200 mM kaliumfosfaattia, pH 7,4, ja 1 mM tymidiiniä.
6 60031
Taulukko
Tymidiinifosforylaasi Alkuperäisestä aktiivisuudesta (pitoisuus alussa, k.y./ml) jäljellä 110 vrk:n jälkeen 5°C:ssa, % 1 300 98 400 90 40 79 4 40 0,4 3
Kuten voidaan havaita, niin tämä FI-patenttijulkaisun n:o 56 856 mukainen koostumus stabiloi tehokkaasti tymidiinifosforylaasi-valmisteen vain suhteellisen suurissa entsyymipitoisuuksissa.
Esimerkki
Keksinnön mukaisen tymidiinifosforylaasivalmisteen pysyvyyden tutkimiseen käytetty valmiste sisälsi entsyymiä, joka oli puhdistettu E. coli B 96-kannasta (ATCC 13473) FI-patentissa 56 856 kuvatulla menetelmällä, laimeana vesiliuoksena (1,5 k.y./ml). Se stabiloitiin keksinnön mukaisesti erilaisilla urasiilin ja kaliumfosfaatin yhdistelmillä tai vertailun vuoksi urasiililla ja kaliumfosfaatilla yksinään erilaisissa pH-arvoissa tai jätettiin kokonaan stabiloimatta. Jokainen liuos sisälsi myös härän seerumialbumiinia (2,5 %) ja natriumatsidia (0,02 %). Entsyymiaktiivisuudet mitattiin samoin kuin edellä esitetyssä vertailu-kokeessa. Saatiin seuraavat tulokset: χ
Alkuperäisestä aktiivisuudesta Lisätty stabiloija jäljellä 32 vrk:n jälkeen 37°C:ssa, % _pH 6_pH 7_pH 8_
Ei lisäystä 0 0 0,6 500 mM kaliumfosfaattia 43 72 70 17.5 mM urasiilia 19 1 0,9 17.5 mM urasiilia + 500 mM kalium- fosfaattia 100 100 93 0,5 mM urasiilia + 500 mM kalium- fosfaattia 85 * 1,5 k.y./ml
Kuten edellä olevasta nähdään, ei urasiili yksinään eikä kalium-fosfaatti yksinään ole yhtä tehokas entsyymin stabilointiaine kuin niiden yhdistelmä. Lisäksi tämä yhdistelmä on huomattavasti tehokkaampi alhaisilla entsyymipitoisuuksilla kuin vertailukokeessa käytetty koostumus, joka oli stabiloitu ammoniumsulfaatilla.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB2466577 | 1977-06-14 | ||
| GB2466577 | 1977-06-14 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI781887A7 FI781887A7 (fi) | 1978-12-15 |
| FI60031B FI60031B (fi) | 1981-07-31 |
| FI60031C true FI60031C (fi) | 1981-11-10 |
Family
ID=10215321
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI781887A FI60031C (fi) | 1977-06-14 | 1978-06-13 | Stabiliserat tymidinfosforylaspreparat foer anvaendning vid bestaemning av kaensligheten hos bakterier |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4219621A (fi) |
| EP (1) | EP0000071B1 (fi) |
| JP (1) | JPS548791A (fi) |
| AU (1) | AU516545B2 (fi) |
| CA (1) | CA1112193A (fi) |
| DE (1) | DE2860890D1 (fi) |
| DK (1) | DK264878A (fi) |
| ES (1) | ES470728A1 (fi) |
| FI (1) | FI60031C (fi) |
| HU (1) | HU179360B (fi) |
| IL (1) | IL54898A (fi) |
| IT (1) | IT1106103B (fi) |
| ZA (1) | ZA783394B (fi) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| HUT67913A (en) * | 1993-02-11 | 1995-05-29 | Gist Brocades Nv | Unit and method for the detection of residues of antibacterial compaunds in liquids |
| JP2011136911A (ja) * | 2009-12-25 | 2011-07-14 | Tosoh Corp | 甲状腺刺激ホルモンレセプターの安定化方法 |
| CN103305487B (zh) * | 2012-11-20 | 2014-11-05 | 上海理工大学 | 一种利用短乳杆菌发酵生产胸苷磷酸化酶的方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1513461A (en) * | 1975-01-27 | 1978-06-07 | Wellcome Found | Bacterial culture medium |
-
1978
- 1978-06-09 DE DE7878100132T patent/DE2860890D1/de not_active Expired
- 1978-06-09 EP EP78100132A patent/EP0000071B1/en not_active Expired
- 1978-06-13 JP JP7142278A patent/JPS548791A/ja active Granted
- 1978-06-13 AU AU37061/78A patent/AU516545B2/en not_active Expired
- 1978-06-13 IT IT49852/78A patent/IT1106103B/it active
- 1978-06-13 FI FI781887A patent/FI60031C/fi not_active IP Right Cessation
- 1978-06-13 IL IL54898A patent/IL54898A/xx unknown
- 1978-06-13 ES ES470728A patent/ES470728A1/es not_active Expired
- 1978-06-13 CA CA305,302A patent/CA1112193A/en not_active Expired
- 1978-06-13 ZA ZA783394A patent/ZA783394B/xx unknown
- 1978-06-13 DK DK264878A patent/DK264878A/da not_active Application Discontinuation
- 1978-06-13 HU HU78WE578A patent/HU179360B/hu unknown
- 1978-06-13 US US05/915,153 patent/US4219621A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IL54898A (en) | 1981-03-31 |
| FI781887A7 (fi) | 1978-12-15 |
| JPS6156998B2 (fi) | 1986-12-04 |
| IT1106103B (it) | 1985-11-11 |
| AU3706178A (en) | 1979-12-20 |
| AU516545B2 (en) | 1981-06-11 |
| ES470728A1 (es) | 1979-02-01 |
| EP0000071B1 (en) | 1981-08-05 |
| ZA783394B (en) | 1980-02-27 |
| DK264878A (da) | 1978-12-15 |
| CA1112193A (en) | 1981-11-10 |
| JPS548791A (en) | 1979-01-23 |
| IL54898A0 (en) | 1978-08-31 |
| IT7849852A0 (it) | 1978-06-13 |
| EP0000071A1 (en) | 1978-12-20 |
| FI60031B (fi) | 1981-07-31 |
| US4219621A (en) | 1980-08-26 |
| HU179360B (en) | 1982-10-28 |
| DE2860890D1 (en) | 1981-11-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Mazzei et al. | Polymyxin B is a more selective inhibitor for phospholipid-sensitive Ca2+-dependent protein kinase than for calmodulin-sensitive Ca2+-dependent protein kinase | |
| WO1992002133A1 (en) | Improved diagnostic and therapeutic compositions | |
| EP1291362A4 (en) | COMPLEX OF FOLIC ACID AND POLYSACCHARIDES, THE PRODUCTION THEREOF AND THE COMPLEX COMPRISING THE COMPOSITION COMPRISING THE ACTIVE INGREDIENT COMPOSITION | |
| Shapiro et al. | Glutamine synthetase deadenylylating enzyme | |
| BR9907967A (pt) | Composto de polipeptideo, processo para sua preparação, composição farmacêutica compreendendo dito composto, e seu uso. | |
| Fait et al. | Biocatalytic synthesis, antimicrobial properties and toxicity studies of arginine derivative surfactants | |
| US20160022832A1 (en) | Proteas stabilized antibacterial peptides for s. aureus | |
| FI60031C (fi) | Stabiliserat tymidinfosforylaspreparat foer anvaendning vid bestaemning av kaensligheten hos bakterier | |
| DE69315388D1 (de) | Aus bakteriellen Proteinen bestehender Extrakt, Verfahren zur dessen Herstellung und diesen Extrakt enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung | |
| Bailey et al. | The reversal of antibiotic action | |
| US4366249A (en) | Storage stable cholesterol oxidase compositions | |
| US5658948A (en) | Enhancement of benzalkonium chloride preservative activity in formulations containing an incompatible drug using amino acids having net positive charge | |
| IT1216104B (it) | Peptidi ad attivita' farmaceutica. | |
| JP3510308B2 (ja) | 抗菌性化合物結合リゾチーム | |
| AGRAWAL et al. | Secretion of Acid Phosphatase by x4xenic Entamoeba histolytica NIH‐200 and Properties of the Extracellular Enzyme | |
| Clark et al. | Active transport of D-alanine and related amino acids by whole cells of Bacillus subtilis | |
| WO2007147372B1 (en) | Pharmaceutical composition for administration by injection | |
| RU95100178A (ru) | Способы предотвращения разложения протеина с, фармацевтическая композиция, содержащая активированный протеин с | |
| EP0065800B1 (en) | Enzyme solutions and method for the preparation thereof | |
| US5164312A (en) | Method for stabilizing the enzyme lactoperoxidase in products | |
| He et al. | L-NMMA and 1400W, inhibitors of iNOS, attenuate the induction of iNOS and NO in primary rabbit costal chondrocytes by fluoride | |
| BR0211535A (pt) | Derivados de imidazolidina, sua preparação e seu uso como antagonistas de vla-4 | |
| JP3502420B2 (ja) | 動物細胞培養用培地 | |
| CN115487181B (zh) | 异噻唑啉酮作为抗菌药物的增效剂的应用 | |
| JPH0822229B2 (ja) | 安定化された酵素水溶液 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM | Patent lapsed |
Owner name: THE WELLCOME FOUNDATION LIMITED |