HRP990036A2 - Pharmaceutical composition of hedgehog proteins and the use thereof - Google Patents

Description

Izum se odnosi na farmaceutski sastav hedgehog proteina i njegovu upotrebu posebno za lokalno oslobađanje ovih proteina na kostima i hrskavici.

Pod hedgehog (hh) proteinima podrazumijeva se porodica izlučenih signalnih proteina koji su odgovorni za tvorbu brojnih struktura u embriogenezi (J.C. Smith, Celi 76 (1994) 193-196, N. Perrimon, Celi 80 (1995) 517-520, C. Chiang et al., Nature 83 (1996) 407, M. J. Bitgood et al., Curr. Biol. 6 (1996) 296, A. Vortkamp et al., Science 273 (1996) 613, C.J. Lai et al., Development 121 (1995) 2349). Tijekom biosinteze 20 kD N-terminalna domena i 25 kD C-terminalna domena dobiju se nakon odcjepljenje signalne sekvence i autokatalitičkog cijepanja. N-terminalna domena se modificira u svom prirodnom obliku s kolesterolom (J.A.Porter et al., Science 274 (1996) '255-259). U višim oblicima života porodica hh sastavljena je od najmanje tri člana tj . sunčanog, indijskog i pustinjskog hh (Shh, Ihh, Dhh; M. Fietz et al., Development (Suppl.) (1994) 43-51). Razlike u aktivnosti rekombinantno proizvedenih hedgehog proteina opažene su nakon produkcije u prokariotima i eukariotima (M. Hynes et al., Neuron 15 (1995) 35-44 i T. Nakamura et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 237 (1997).465-469.

Hynes et al usporedili su aktivnost hh proteina u supernatantu transformiranih humanih embrionskih bubrežnih 293 stanica (eukariotski hh) s hh proteinom kojeg je proizvela E. coli i našli su četverostruko višu aktivnost hh iz supernatanta bubrežne stanične linije. Kao razlog za tu povišenu aktivnost razmatran je mogući dodatni dopunski faktor koji se umnaža samo u eukariotskim stanicama, post-translacijska modifikacija, različit N-kraj, budući da hh izoliran iz E. coli sadrži 50% hh koji nosi dvije dodatne N-terminalne amino kiseline (Gly-Ser) ili je skraćen za 5 -6 amino kiseline, ili više stanje agregacije (npr. vezanjem nikal agaroznih zrnaca).

Nakamura et al. usporedili su aktivnost shh u supernatantu transfomiranih fibroplasta iz pilećeg embrija s shh fuzijskim proteinom izoliranim iz E. coli koji još uvijek ima N-terminalni polihistidinski dio. Shh u supernatantu fibroplasta ima sedmerostruko višu aktivnost u usporedbi s očišćenim E. coli proteinom s obzirom na stimulaciju alkalijske fosfataze (AP) u C3H10T 1/2 stanicama. Kao razlog za povišenu aktivnost prisutnu samo u supernatantu eukariotskih stanica i uzrok jače indukcije AP-a, razmatrane su molekule kao što su koštani morfogenetički proteini (BMPs).

Kinto et al., FEBS Letters, 404 (1997) 319-323 opisali su da fibroplasti koji izlučuju hh induciraju ektopijsku tvorbu kosti kod i.m. implatacije na koleganu. Zbog toga hedgehog proteini djeluju osteoinduktivno.

Postupak za proizvodnju sistema koji isporučuje proteine s usporenim oslobađanjem upotrebom alginata poznat je iz WO 90/08551. Po tom postupku oblikuje se dvofazni sistem, pri čemu prva faza sadrži visoku koncentraciju proteina (zasićena otopina), a druga faza sadrži alginat. Međutim, takovo odvajanje faza je teško i komplicirano za provedbu pri proizvodnji farmaceutskih sastava u velikim količinama.

Ritmičko oslobađanje dekstrana iz kompleksa kalcijevog alginata poznato je iz Kikuchi, A. et al., J. Controlled Release 47 (1997) 21-29. Međutim, povezivanje hedgehog proteina na takove komplekse Kikuchi nije opisao.

Robinson, C. J. et al. u Trends in Biotechnology 14 (1996) 451-452 opisali su intraventrikularnu implantaciju alginatnih mikro kuglica kao metodu za lokalnu aplikaciju NGF-a ili stanica koje izlučuju NGF. Međutim, aplikacija hedgehog proteina nije opisana.

Downs, E.C. et al u J. Celi. Physiol. 152 (1992) 422-429 opisali su primjenu kalcijevih alginatnih kuglica kao sistema isporuke faktora angiogeneze. Međutim, primjena tog postupka ili tog sistema isporuke za hedgehog proteine nije opisana.

Crey, C. J. i J. Dowsett u Biotechnol. Bioeng. 31 (1988) 607-612 opisuju upotrebu kalcij/cink alginatnih kuglica kao sistema isporuke za inzulin. Međutim, iz toga nije poznata primjena ovog postupka za proizvodnju sistema isporuke hedgehog proteina.

Od Yang et al., Development 124 (1997) 4393-4404 poznato je da se za farmaceutski učinkovito djelovanje in vivo visoke lokalne koncentracije hedgehog proteina na strani djelovanja u tijelu moraju održavati tijekom perioda od najmanje 16 sati. Sistem nosača kao kromatografski medij Affigel CM napunjen s hedgehog proteinom, kojeg su opisali Yang et al., Ni-agaroza koju su opisali Marti et al. u Nature 375 (1995) 322-325 ili Affigel Blue kojeg su upotrijebili Lopez-Martinez et al. u Curr. Biol 5 (1995) 791-796, ili čestice heparin-agaroze, koje su tamo upotrijebljene, nisu prikladne za farmaceutsku primjenu, jer su one imunogene i mogu uzrokovati upalne reakcije.

Izumitelji su pronašli da je biološki kompatibilan i biološki razgradijiv kolagenski nosač, kojeg su opisali Kinto et al. za stanice koje umnažaju hh, također neprikladan za optimalnu lokalnu farmaceutsku aplikaciju hedgehog proteina sve dok se ti hedgehog proteini vežu na nosač samo putem ionskih interakcija. Nađeno je da kolagenski nosači opterećeni s hedgehog proteinima pod fiziološkim uvjetima (pH pribl. 7 i u slabim kiselinama (sve do pH 4,5)) glavninu apliciranog hedgehog proteina oslobađaju s matrice za par minuta. Prema otkriću izumitelja, uzrok tog nedovoljnog vezanje je nedostatak dovoljnih ionskih interakcija između hedgehog proteina i nosača. U tom slučaju stavljanja hh pod kiselim uvjetima (ispod pH 4,5), velika količina stavljenog hedgehog proteina se denaturira i ireverzibilno se veže na nosač.

Stoga je predmet izuma osigurati farmaceutski sastav hedgehog proteina s biološki kompatibilnim nosačem pri čemu nosač veže hedgehog protein u njegovoj aktivnoj, složenoj strukturi i može ga usporeno osloboditi in vivo u njegovom aktivnom obliku. Takove formulacije su posebno prikladne za ispravljanje defekata kosti i hrskavice, ali one se također mogu upotrijebiti i za ispravljanje defekata neurona ili za sistemsko oslobađanje.

Taj cilj postignut je s farmaceutskim sastavom hedgehog proteina koji je karakteriziran time da je hedgehog protein vezan na hidrofilnom nosaču koji je biološki kompatibilan, pri čemu nosač je polimer koji

- veže hedgehog protein kao nosač negativnog naboja što je posljedica ionskih interakcija,

- ne denaturira hedgehog protein kad je on vezan na nosaču,

- pod neutralnim uvjetima nosač sadrži najmanje 0,1 do 1, ponajprije 0,1 do 2 ostatka negativnog naboja po monomeru,

- naboj je dobiven u obliku kiselinskih skupina kao npr. sulfatnih, kabroksilriih ili fosfatnih skupina, i

- prosječna molekulsa masa nosača je najmanje 50.000 Da.

Iznenađujuće se je pokazalo da se hedgehog proteini mogu osloboditi reverzibilno iz nosača in vivo u aktivnom obliku i usporeno bez uzrokovanja homogenih i/ili upalnih reakcija in vivo ako su oni vezani na topivu ili netopivu polimernu matricu negativnog naboja.

Upotrebljava se ponajprije hidrofilna noseća matrica, a posebno prednosno topiva ili netopiva organska hidrofilna noseća matrica. Noseća matrica sastoji se posebno prednosno od anionskog poli-saharida kao ponajprije hijaluronske kiseline (kao i njenih kemijski umreženih oblika), kondroitoin sulfata, polivinil sulfata, keratin sulfata, dekstran sulfata, pektina, karaginana i drugih hidrokoloida, sulfatiranog alginata, dermatan sulfata, alginata, ponajprije kalcijevog alginata ili kombinacije od najmanje dva takova anionska polisaharida ili kombinacije od tih polisaharida s nabojem i drugih polimera, kao što je posebno kolagen, u kojem maseni postotak polisaharida s nabojem iznosi 10-50%. Netopiva matrica u smislu izuma znači da se matrica uglavnom ne razgrađuje ili da se ne otapa vidljivo u puferiranoj otopini in vitro za 10 - 20 sati pri sobnoj temperaturi. S tim u svezi posebno prednosno je da nosač upotrijebljen prema izumu sadrži manje od 50%, ponajprije manje od 20%, a posebno prednosno da ne sadrži nikakvu količinu neutralnog polisaharida. Kao noseća matrica posebno prikladna je hijaluronska kiselina s molekulskom masom od najmanje 10 Daltona, posebno s molekulskom masom od 4 x 106 Daltona.

U daljnjoj izvedbi pokazalo se je da su hidrofilni nosači na osnovi anorganskih netopivih sulfata, kao što je hidroksilapatit ili trikalcijev fosfat, također prikladni kao netopive noseće matrice prema izumu.

Kao usporeno oslobađanje prema izumu podrazumijeva se oslobađanje farmakološki učinkovite doze hedgehog proteina tijekom definiranog perioda od najmanje 14 sati. Kao farmakološki učinak podrazumijeva se neurološki učinak na nervne stanice, kondrogenezu i/ili indukciju kondrogeneze, a ponajprije osteogenezu i/ili osteoindukciju kako su opisali Kinto et al., FEBS Letters, 404 (1997) 319-232 za koštanu indukciju, Miao et al. u J. Neurosci. 17 (1997) 5891-5899 za učinak na nervnim stanicama i Stott et al. u J. Celi. Sci. 110 (1997) 2691-2701 za indukciju stanica hrskavice.

Enzimski razgradljiv nosač upotrebljava se ponajprije kao nosač koji se može razgraditi s enzimima (npr. s proteinazom) izlučenim iz stanica na kojima se vrši lokalna aplikacija in vivo. Međutim, vrijeme poluraspadanja nosača mora biti najmanje 12 sati, ali ono također može biti i nekoliko tjedana. Ako se nosač sastoji od polisaharida, taj se nosač razgrađuje ponajprije s glikozidazom i hidrolazom koje su prisutne u stanici i izlučene. Međutim, takav biološki razgradljiv nosač nije nužan u svakom slučaju. Ako se oslobađanje provodi zbog liječenja osteoporoze ili bolesti neurona, biološka razgradijivost nije potrebna. Međutim, takovi nosači imaju ponajprije skromnu topivost pod fiziološkim uvjetima i zbog toga se apsorbiraju u tijelu tijekom relativno dugog perioda (nekoliko tjedana do nekoliko mjeseci).

Da bi se dobile noseće matrice prevučene s hedgehog proteinima na takav način da one kod lokalne aplikacije pokazuju adekvatnu farmaceutsku učinkovitost, potrebne su otopine hedgehog proteina visoke koncentracije. Pokazalo se je da nosači prevučeni s hedgehog proteinom, a koji se mogu upotrijebiti u farmaciji, moraju sadržavati ponajprije hedgehog protein koncentracijom od l do 5 mg/ml, ponajprije 3 mg/ml nosača, ili višom. Posebno su prednosni nosači koji sadrže hedgehog proteine koncentracijom od 10 mg/ml ili višom. Hedgehog proteini su strukturno slabo topivi. Međutim, iznenađujuće je nađeno da se topivost hedgehog proteina jako povisuje u otopinama koje sadrže arginin ili argininijeve ione (ponajprije argininijev sulfat). Stoga daljnji predmet izuma su vodene otopine hedgehog proteina koncentracije od 3 mg/ml i više koje sadrže arginin i argininijeve ione i koje su puferirane. Daljnji predmet izuma je postupak za proizvodnju noseće matrice prevučene s hedgehog proteinom, koji je karakteriziran time da se noseća matrica inkubira s otopinom hedgehog proteina koncentracije 3 mg/ml, koja otopina sadrži arginin ili argininijeve ione i na taj način prevučena noseća matrica se izolira.

Takove otopine prikladne su za proizvodnju matrica koje sadrže hedgehog proteine u farmaceutski učinkovitim koncentracijama i one su prikladne za farmaceutsku primjenu. Stoga je daljnji predmet izuma noseća matrica koja po ml noseće matrice sadrži 3 mg hedgehog proteina ili više, ponajprije 10 mg ili više, te arginin ili argininijeve ione. Koncentracija arginina je ponajprije između 10 i 500 mmolova/l, ponajprije u pH području između 6 i 8.

Kao aktivnost u smislu izuma podrazumijeva se aktivnost alkalijske fosfataze (stimulacija ekspresije alkalijske fosfataze) koja može inducirati polipeptid u stanicama sisavca (aktivnost u pokusu s alkalijskom fosfatazom). U tu svrhu mišja mezenhimalna stanična linija uzgaja se u mediju koji sadrži fetalni goveđi serum. Zatim se doda sterilno filtrirani uzorak, stanice liziraju nakon pribl. 5 dana i u stanici lizata utvrdi se alkalijsku fosfatazu cijepanjem kromogenog supstrata (pNP, p-nitro-fenol) (J. Asahina, Exp. Celi. Res. 222 (1996) 38-47 i T. Nakamura (1997)).

Prema izumu kao hedgehog protein podrazumijeva se izlučeni signalni protein koji je odgovoran za tvorbu brojnih struktura u embriogenezi. Posebno prednosno se upotrebljavaju sunčani, indijski ili pustinjski hh (Fietz M. et al., Development (Suppl.) (1994) 43-51). Upotrebljava se ponajprije hh protein sa sekvencom kako je opisana u banci podataka EMBL pod brojem L38518. Proteini hedgehog porodice pokazuju izrazitu homologiju u njihovim sekvencama amino kiselina, što je razlog da oni ponajprije umnažaju one nukleinske kiseline koje kodiraju za hedgehog proteine koji su 80% ili više homologni s gore spomenutom sekvencom sunčanog hedgehog proteina.

Humani sunčani hedgehog prekurzorski protein sastavljen je od sekvence amino kiselina 1-462 opisane u banci podataka EMBL pod brojem L38518. Amino kiseline 1-23 predstavljaju signalni peptid, amino kiseline 24-197 predstavljaju zrelu signalnu domenu, amino kiseline 32-197 predstavljaju signalnu domenu skraćenu za 8 amino kiselina i amino kiseline 198-462 predstavljaju samo-preradivačku domenu nakon autoproteolitskog cijepanja.

Farmaceutski sastav prema izumu sadrži ponajprije dodatni polimer koji djeluje uglavnom kao potporna strukturna tvar i koji prednosno također ima adhezijsku funkciju za stanice, ali se ne veže na hedgehog proteine na osnovi ionskih interakcija. Prednosno ta tvar je biološki razgradijivi protein ili proizvod hidrolitičke razgradnje koji se može upotrijebiti, na primjer, u obliku intaktnih proteinskih vlakana kao solubilizirani protein ili kao djelomično hidrolizirani protein. Takova potporna strukturna tvar je ponajprije kolagen, želatina, elastin, ili fibrin. Potporna strukturna tvar prisutna je ponajprije manjom količinom od opisanog hidrofilnog biološki razgradijivog nosača prema izumu. Udio potporne strukturne tvari je stoga ponajprije 30% ili manje, ponajprije 10% ili manje. Međutim, potporna strukturna tvar može također biti prisutna u suvišku u odnosu prema hidrofilnom nosaču. U toj svezi potrebno je samo osigurati da količina hidrofilnog nosača u farmaceutskom sastavu prema izumu bude dovoljno visoka da osigura da je terapeutski učinkovita količina hedgehog proteina vezana na hidrofilni nosač. Zbog toga je prednosno upotrijebiti najmanje peterostruki višak hidrofilnog nosača u odnosu prema hedgehog proteinu. K tome, vezanje hedgehog proteina na nosač za pripravljanje farmaceutskog sastava treba izvršiti pri pH vrijednosti 4,5 ili višoj. Kako je gore istaknuto, nađeno je da se hedgehog proteini pri pH vrijednosti ispod 4,5 denaturiraju i ireverzibilno vežu na proteinski nosač sličan kolagenu. Zbog toga se vezanje hedgehog proteina mora izvršiti u neutralnom području pH vrijednosti.

Nosači koji neovisno o hidrofilnom nosaču sadrže i druge potporne strukturne spojeve jesu, na primjer, kompleksi protein/polisaharida. Prednosni kompleksi opisani su u U.S. patentnu 4,614,794.

Farmaceutski sastav proizveden je inkubacijom hedgehog proteina s hidrofilnim nosačem pri pH 4,5 ili višoj pH vrijednosti, ponajprije pri pH u granicama neutralnog područja (pH 6 do 8), čime se vrši vezanje hedgehog proteina na nosač. Inkubacija se provodi ponajprije u puferiranoj otopini. Ako se kao nosač upotrebljava matrica koja dodatno sadrži biološki razgradljiv protein kao što je kolagen, inkubacija pri pH 4,5 ili višoj pH vrijednosti osigurat će sprečavanje irevezibilnog vezanja hedgehog proteina (koji se denaturira pri nižim pH vrijednostima) na biološki razgradljiv protein.

Nađeno je da pod tim uvjetima ne dolazi do vezanja ili dolazi samo do zanemarivog vezanja, hedgehog proteina na biološki razgradijiv protein sve dok hedgehog protein ne sadrži hidrofobnu modifikaciju i stoga biološki razgradljiv protein značajno djeluje kao potporna strukturna tvar.

Hidrofobno modificirani (lipofilizirani) hedgehog proteini su hedgehog proteini koji u odnosu prema nemodificiranim hh proteinima (npr. proizvedenim rekombinantno u prokariotima) pokazuju povišenu površinsku hidrofobnost. Stupanj lipofilizacije proteina izmjeren je integracijom u lipidni sloj prema Haque, Z. et al., J. Agric. Food Chem. 30 (1982) 481. Takovi lipofilizirani hh proteini vežu se prema izumu na hidrofilni nosač na isti način kao i ne-lipofilizirani hh protein, ali oni se hidrofobnim interakcijama dodatno vežu na biološki razgradljiv protein.

Za proizvonju farmaceutskog sastava dodatno je prednosno dodati pomoćne tvari kao šećere (manitol, saharozu, laktozu, glukozu, trehalozu, ponajprije 20-100 mg/ml) ili amino kiseline kao glicin ili arginin, kao i antioksidante kao EDTA, citrat, polietilen glikol (1-10 mas. %) , površinski aktivne tvari, ponajprije ne-ionske površinski aktivne tvari (ponajprije 0,005-1 mas. %) kao što su polisorbati (Tween® 20 ili Tween® 80) ili polioksietileni, anti-upalne sastojke, lokalne anestetike, antibiotike i/ili stabilizatore kao lipide, masne kiseline i glicerol.

U drugoj prednosnoj izvedbi, prednost se daje farmaceutskom sastavu hedgehog proteina prema izumu zajedno sa sumarinom i on se može upotrijebiti kao prednostan.

Farmaceutski sastavi mogu sadržavati dodatne farmaceutske pomoćne tvari.

U prednosnoj izvedbi farmaceutski sastav sadrži hedgehog protein koncentracijom od 0,1-100 mg/ml.

U prednosnoj izvedbi farmaceutski sastav dodatno sadrži farmaceutski prihvatljiv pufer, koji je biološki kompatibilan ponajprije u području od pH 4 do pH 10, posebno prednosno u području između pH 6 i pH 8, a naročito pri pH vrijednosti pribl. 7. Da se spriječi denaturiranje i otkidanje cinkovog kompleksa u hedgehog proteinu, pH vrijednost farmaceutskog sastava mora biti primjereno viša od pH 4. Koncentracija pufera je ponajprije 1-500 mmolova/l, prednosno 5-150 mmolova/l, a naročito prednosno 10-100 mmolova/l. U prikladnoj izvedbi upotrijebljen je pufer od 20 mmolova/l kalijevog fosfata, pH 7,2 ili je kao pufer upotrijebljeno 100 mmolova/l arginin klorida pH 7,2.

Slijedeći primjeri, literatura i slike dalje rasvjeljavaju izum, čija svrha zaštite proizlazi iz patentnih zahtjeva.

Podrazumijeva se da opisane metode kao i primjeri također opisuju glavni predmet izuma čak i nakon modifikacija.

Opis slika

Slika 1: In vitro oslobađanje shh iz kolagenske matrice.

Slika 2: In vitro oslobađanje shh iz kapsule kalcijevog

alginata.

Slika 3: In vitro oslobađanje shh iz gela hijaluronske kiseline.

Slika 4: In vitro oslobađanje shh iz alginat/kolagenske matrice.

PRIMJERI

Primjer 1

Pripravljanje alginatnog gela koji sadrži hh protein

Alikvot otopine hh proteina (1 mg/ml otopine shh u 50 mg/ml saharoze, 50 mM kalijevog fosfata, pH 7,2) miješa se s osnovnom otopinom Na-alginata (Pronova, Biopolymer, NO) (u vodi, više od 0,1%) na takav način da se dobije želatinoznu mješavinu alginatnog proteina. Taj gel se može upotrijebiti izravno kao matrica koja se može ubrizgati ili se dalje prerađuje u kapsule kaićijevog alginata ili se pohranjuje kao liofilizat.

Primjer 2

Pripravljanje kolagenske mješavine koja sadrži hh protein (usporedbeni primjer)

100 μl hh otopine (1 mg/ml hh) u

a) 20 mM kalijevog fosfata, pH 7,4 ili

b) u 50 mM natrijevog acetata, pH 4,5, ili

c) u 0,1%-tnoj trifluoroctenoj kiselini, pH 2

doda se kap po kap na kolagenske spužve (Helisat, Integra Life Science, USA) veličine 10 x 10 x 3 mm. Zatim se tako opterećeni nosači smrznu (-70°C), liofiliziraju i analiziraju. U tu svrhu te se opterećene spužve inkubiraju pri 37°C u prikladnom volumenu pufera (10 mmolova/l kalijevog fosfata, 150 mmolova/l NaCl, pH 7,2). Količina oslobođenog hh određuje se pomoću RP-HPLC.

Primjer 3

3.1 Pripravljanje kapsula Ca-alginata

Alginatni gel opisan u primjeru 1, koji sadrži hh protein doda se kap po kap k otopini CaCl2 (pribl. 1,5%) uz neprekidno miješanje. Spontano nastaju kompleksi Ca-alginata koji sadrže protein. Veličina nastalih kapsula ovisi o veličini kapi i može se po želji mijenjati. Nakon 5 do 10 minuta inkubacije u otopini CaCl2, kapsule se odfiltriraju i isperu u puferu (20 mmolova/l kalijevog fosfata, pH 7,2). Te se kapsule mogu upotrijebiti izravno kao implantati ili se dalje prerađuju liofilizacijom.

3.2 Liofilizacija

Kapsule C-alginata se smrznu pri -70°C i zatim se liofiliziraju. Liofilizacija omogućuje postojano skladištenje kapsula i dodatno olakšava implantaciju, jer je s kapsulama lakše rukovati u suhom stanju.

Primjer 4

Oslobađanje shh in vitro

Analiza kinetike oslobađanja in vitro pokazuje da je shh usporeno oslobođen iz kapsula Ca-alginata tijekom perioda od najmanje 70 sati (slika 2) , dok je shh iz kolagenske matrice oslobođen za nekoliko do najviše pribl. 20 minuta (slika 1). Liofilizirane alginatne kuglice koje sadrže shh inkubirane su pri 37°C u 10 mM kalijevom fosfatu, 150 mM NaCl, pH 7,2 (Rotatherm). Uzorci su uzeti i pomoću SDS poliakrilamidne elektroforeze (slika 2) analizirani su što se tiče njihovog sadržaja shh nakon 5 minuta, 1 sata, 5 sati, 10 sati, 1 dana, 34 sata, 2 dana, 3 dana i 6 dana. Ukupni sadržaj shh oslobođenog iz alginatnih kapsula grafički je prikazan kao funkcija vremena.

Ispitivanje kinetike oslobađanja shh iz 2,5%-tnog gela hijaluronske kiseline, upotrebom tipova hijaluronske kiseline niske molekulske mase (LMW; molekulska masa pribl. 1,3 x 106 Da) ili visoke molekulske mase (HMW; molekulska masa pribl. 4 x 106 Da) prikazano je na slici 3. U tu svrhu gelovi hijaluronske kiseline, opterećeni sa shh, stavljeni su u cjevčice za dijalizu (odvajanje veličine 300.000 Da) i cjevčice su inkubirane u PBS-u pri 37°C. Nakon utvrđenog vremena uzeti su uzorci medija za oslobađanje i analizirani u pogledu njihovog sadržaja shh pomoću HPLC reverznih faza. Vidi se da je udio stavijenog hedgehog proteina oslobođen usporeno. Drugi dio proteina ostaje vezan na hijaluronsku kiselinu i može se osloboditi in vivo razgradnjom hijaluronske kiseline.

Ispitivanje kinetike oslobađanja shh iz kolagen-alginatne matrice (Fibracol™, vidi U.S. patent 4,614,794) prikazano je na slici 4. U tu svrhu Fibracol spužva (1x1 x 0,3 cm) opterećena je s 0,2 mg shh u PBS-u. Opterećene spužve su smrznute (-70°C), liofilizirane i inkubirane u odgovarajućem volumenu PBS-a pri 37°C. Nakon utvrđenog vremena uzeti su uzorci medija za oslobađanje i analizirani pomoću HPLC reverznih faza u pogledu njihovog sadržaja shh. Vidi se je da samo pribl. 10 do 20% stavljenog hedgehog proteina oslobođeno u medij, a da je glavni dio ostao vezan na kolagen-alginatnu matricu. Taj udio se može osloboditi in vivo razgradnjom matrice.

Claims (16)

1. Farmaceutski sastav hedgehog proteina, naznačen time, da je hedgehog protein vezan na hidrofilnom nosaču koji je biološki kompatibilan, pri čemu nosač je polimer koji - - veže hedgehog protein kao nosač negativnog naboja što je posljedica ionskih interakcija, - ne denaturira hedgehog protein kad je on vezan na nosaču, - pod neutralnim uvjetima sadrži najmanje 0,1 do 2 ostatka negativnog naboja po monomeru, - sadrži naboj u obliku kiselinskih skupina, - ima prosječnu molekulsku masu od najmanje 50.000 Da i - ne sadrži agarozu.

2. Farmaceutski sastav prema zahtjevu 1, naznačen time, da se nosač sastoji od organske hidrofilne noseće matrice ili anorganskog netopivog fosfata.

3. Farmaceutski sastav prema zahtjevima 1 ili 2, naznačen time, da se nosač sastoji od anionskog polisaharida ili anorganskog netopivog fosfata.

4. Farmaceutski sastav prema zahtjevima 1-3, naznačen time, da je hidrofilni nosač hijaluronska kiselina.

5. Farmaceutski sastav prema zahtjevima 1-4, naznačen time, da sadrži hedgehog protein koncentracijom od 0,1-100 mg/ml.

6. Farmaceutski sastav prema zahtjevima 1-5, naznačen time, da je sastav puferiran u području između pH 4 i pH 10.

7. Farmaceutski sastav prema zahtjevima 1-6, naznačen time, da sastav sadrži arginin ili argininijeve ione.

8. Postupak za proizvodnju farmaceutskog sastava koji sadrži hedgehog protein vezan na hidrofilnom nosaču koji je biološki kompatibilan, pri čemu je nosač polimer koji - veže hedgehog protein kao nosač negativnog naboja što je posljedica ionskih interakcija, - ne denaturira hedgehog protein kad je vezan na nosaču, - pod neutralnim uvjetima sadrži najmanje 0,1 do 2 ostatka negativnog naboja po monomeru, - sadrži naboj u obliku kiselinskih skupina, - ima prosječnu molekulsku masu od najmanje 50.000 Da, i - ne sadrži agarozu, naznačen time, da se hedgehog protein u farmaceutski učinkovitoj količini upotrebljava kao bitna komponenta tog sredstva.

9. Postupak prema zahtjevu 8, naznačen time, da se hedgehog protein upotrebljava koncentracijom od 0,1-100 mg/ml.

10. Postupak za usporeno oslobađanje hedgehog proteina u ljudskom tijelu, naznačen time, da se hedgehog protein aplicira lokalno u ljudskom tijelu u farmaceutskom sastavu prema zahtjevima 1-6.

11. Postupak prema zahtjevu 10, naznačen time, da se hedgehog protein aplicira pri koncentraciji od 0,1-100 mg/ml.

12. Postupak prema zahtjevima 8-11, naznačen time, da je hidrofilni nosač hijaluronska kiselina.

13. Postupak prema zahtjevima 8-12, naznačen time, da se vezanje hedgehog proteina na hidrofilni nosač vrši inkubacijom pri pH 4,5 ili višoj pH vrijednosti.

14. Netopiva noseća matrica, naznačena time, da sadrži najmanje 3 mg hedgehog proteina i najmanje 10 mmolova/l arginina ili argininijevih iona po ml noseće matrice.

15. Postupak za proizvodnju netopive noseće matrice koja sadrži hedgehog protein, naznačen time, da se noseća matrica inkubira s otopinom koja sadrži hedgehog protein koncentracijom od 3 mg/ml ili više i arginin ili argininijeve ione koncentracijom od 10 mmolova/l ili više i na taj način prevučena noseća matrica se izolira.

16. Postupak prema zahtjevu 15, naznačen time, da se vezanje hedgehog proteina na hidrofilni nosač vrši inkubacijom pri pH 4,5 ili višoj pH vrijednosti.