KR20220140700A - 염증-반응성의 항-염증성 하이드로겔 - Google Patents

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트리 당 응우옌
신-유에 응
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난양 테크놀러지컬 유니버시티
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Abstract

본 발명은 프로테아제-반응성 약물 전달 하이드로겔의 분야, 이의 용도, 및 이의 관련된 생산 방법에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 염증-관련된 프로테아제와의 반응시 항염증성 약물을 방출하는 하이드로겔에 관한 것이다.

Description

염증-반응성의 항-염증성 하이드로겔
발명의 분야
본 발명은 프로테아제-반응성 약물 전달 하이드로겔(protease-responsive drug delivery system)의 분야, 이의 용도, 및 관련된 이의 생산 방법에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 염증-관련 프로테아제와의 반응시 항염증제(anti-inflammatory agent)를 방출하는 하이드로겔에 관한 것이다.
발명의 배경
염증은 유해한 자극을 제거하고 손상된 조직을 이의 손상 전 상태로 회복시키는 숙주 면역계에 의해 시작된(mounted) 생물학적 반응의 순서이다[Serhan, C. N. et al. Fundamentals of Inflammation, Cambridge University Press, Cambridge, (2010)]. 급성 염증 반응은 유해한 자극을 제거하고 조직 손상 후 세포 항상성을 회복하는데 필수적이다[Serhan, C. N. et al. Fundamentals of Inflammation, Cambridge University Press, Cambridge, (2010)]. 대조적으로, 백혈구 활성의 바람직하지 않은 지속성은 만성 조직 손상과 관련된 과도한 염증을 야기한다[Serhan, C. N. et al. Fundamentals of Inflammation, Cambridge University Press, Cambridge, (2010)]. 이러한 만성 상태는 흔히 많은 병리학적 상태, 예를 들면, 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 만성 당뇨병성 궤양(chronic diabetic ulcer), 염증성 창자 질환(inflammatory bowel disease)(IBD) 및 만성 폐쇄성 폐 질환(chronic obstructive pulmonary disease)에서 흔히 직면한다[Serhan, C. N. et al. Fundamentals of Inflammation, Cambridge University Press, Cambridge, (2010)].
항염증 치료제의 전신계 투여는 만성 질환에서 과도한 염증을 완화시키기 위해 임상적으로 허용된 치료 패러다임이다. 소 분자 약물, 예를 들어, 비스테로이드성 항염증 약물(nonsteroidal anti-inflammatory drug; NSAID) 및 스테로이드성 면역-억제제(steroidal immuno-suppressant)는 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis) 및 IBD 환자에게 이의 임상 증상을 기반으로 경험적으로 처방된다. 그러나, 이러한 약물의 전신계 투여는 또한 잘 공지된 부작용의 발생과 관련되어 있으며, 이는 제어된 약물 방출의 결여로부터 야기되는 과도한 투여량과 관련되어 있다. 예를 들면, 전신계 투여된 NSAID는 심근 경색(myocardial infarction), 뇌혈관 장애(cerebrovascular accident), 및 위 궤양(gastric ulceration)의 위험을 상승시킨다. 또한, 코르티코스테로이드는 중증 약물-유도된 합병증, 예를 들면, 골괴사(osteonecrosis), 녹내장(glaucoma), 및 연장된 기간에 걸쳐 처방되는 경우 기회 감염(opportunistic infection)을 야기한다.
약물 방출 역학의 시공간적 제어를 증진시키고 전신계 독성을 최소화하기 위해, 수개의 약물 전달 플랫폼(platform)이 항염증 치료제의 투여용으로 설계되어 왔다[
Figure pct00001
112(5) 296-301 (2013)]. 예를 들면, 소포 시스템(vesicular system) 속에 글루코코르티코이드를 캡슐화(encapsulating)하는 것은 약물 반감기를 연장시키고 치료학적 약물의 느린 방출을 달성하였다[Maestrelli, F. et al. Journal of Drug Delivery Science and Technology 32 192-205 (2016)]. 대안적으로, 나노규모 중합체성 필름에 대한 작은 분자 NSAID의 공유결합성 접합은 치료학적 페이로드(therapeutic payload)를 실질적으로 증가시키고 약물-중합체 에스테르 연결의 가수분해에 의한 점진적인 장기간 방출을 달성하기 위한 대안의 접근법으로서 보고되었다[Hsu, B. B. Proceedings of the National Academy of Sciences 111(33) 12175 (2014)]. 그러나, 이러한 시스템은 이의 염증 특성이 항염증 치료제의 투여를 필요하게 만드는 질환이 있는 조직의 특정 병리학적 상태를 고려하지 않는다. 따라서, 이의 약물 방출 프로파일은 방출이 주로 중합체 조성 및 약물 로딩 용량(drug loading capacity)과 같은 전달 플랫폼의 물리화학적 특성에 의해 주로 나타내어지므로 생물학적 요건과 일치하지 않는다.
질환이 있는 조직에서 생물학적 미세환경의 염증 특성은 면역학적 신호(immunological cue)에 의해 개시(trigger)될 수 있는 스마트한 약물 전달 시스템을 설계하는데 영향을 줄 수 있다. 특히, 공지된 연구는 만성 염증(chronic inflammation)에서 프로테아제, 특히 세린 프로테아제 및 매트릭스 메탈로프로테아제(matrix metalloprotease)(MMP)의 상향조절(upregulation)을 확립하였으며, 이는 염증 캐스케이드(inflammation cascade)를 조절하기 위한 치료학적 투여용의 생화학적 신호로서 이의 잠재능을 시사한다[Pham, C. T. N. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 40(6) 1317-1333 (2008)]. pH, 온도, 또는 산화환원반응(redox)과 같은 다른 자극과 비교하여, 프로테아제는 주로 프로테아제의 조절장애와 병리학적 상태 사이의 밀접합 관계에 주로 기인하여, 다른 자극과 비교하여 보다 특이적인 생물학적 신호로서 여전히 나타난다. 더욱이, 다른 자극은 환경 조건으로 인하여 영향받을 수 있다. 예를 들면, 체온은 습한 기후 조건에 기인하고 질환 상태에는 기인하지 않으면서 스파이크(spike)될 수 있다. 프로테아제가 보다 우수한 생물학적 신호임에도 불구하고, 염증을 조절하기 위한 생물학적으로 개시된 약물 전달 시스템에 대한 면역학적 신호로서 프로테아제의 잠재능은 크게 탐구되지 않은채로 남아있다. 최근에, 조쉬(Joshi) 등은 작은 분자 양친매성 물질, 트리글리세롤 모노스테아레이트(TG-18)의 자가-조립(self-assembly)을 활용하여, 증가된 관절염 플래어 활성(arthritic flare activity)에 대한 노출시 이러한 약물을 방출하는 것을 개시할 수 있는 하이드로겔 플랫폼 내에 코르티코스테로이드를 물리적으로 인트랩(entrap)시켰다[Joshi, N. et al. Nature Communications 9(1) 1275 (2018)]. 그럼에도 불구하고, 이는 약물-부하된 하이드로겔 플랫폼이 일반화가능한 설계 프레임워크를 결여함으로써, 이의 구성성분을 대체하여 대안의 생물학적 개시인자(trigger)를 이용할 가능성을 제한한다. 구체적으로, 이러한 플랫폼으로부터 약물 방출은 주로 에스테라제에 의해 TG-18 골격에서 에스테르 결합의 절단에 의존하며, 이는 염증성 관절염(inflammatory arthritis)에서 상향조절되지만[Ravaud, P. et al. Rheumatology 41(7) 815-818 (2002)] 다른 염증 질환에서는 중요한 생물학적 신호일 수 없다. 염증 상태와 관련된 낮은 pH 환경에서 이러한 에스테르 결합의 비-효소적 가수분해[Bellocq, A., et al. Journal of Biological Chemistry 273(9) 5086-5092 (1998); Riemann, A. et al. Molecular Basis of Disease 1862(1) 72-81 (2016)]는 또한 목적하지 않은 비-특이적인 약물 방출을 야기할 수 있다.
따라서, (1) 설계시 모듈러(modular), (2) 면역-적합성(immuno-compatible) 및 (3) 실온에서 주사가능하고 국소 투여용으로 다목적의 프로테아제-개시된 약물 전달 플랫폼은 여전히 기존의 전달 시스템의 한계에 초점을 맞추기 위한 충족도지 않은 필요성을 나타낸다. 우선, 프로테아제-개시된 전달 시스템 속에 봉매된(embedded) 미립자 도메인(particulate domain), 예를 들면, 리포좀 또는 중합체성 마이크로입자(microparticle)의 물리적 인트랩화(physical entrapment)는 확산-유도된 기본 약물 방출과 관련될 수 있다. 이러한 기본적인 방출은 상태가 감염 발생 또는 관절염 플래어(arthritic flare)로 인하여 급작스럽게 악화된 경우 프로테아제-개시된 증가된 투여량을 요구하는 만성 염증 상태의 관리에 바람직할 수 있다. 그러나, 이러한 기본 방출은 모든 염증-관련 상태, 특히, 면역-억제된 환자(immuno-compromised patient) 또는 면역-억제성 약물을 복용중인 환자에서 또는 일부 염증 정도가 정상적인 치유에 요구되는 급성 손상(acute injury)의 관리를 위해 항상 바람직하지는 않을 수 있다. 이러한 기본적인 약물 방출을 제거하거나 최소화하는 프로테아제-개시된 전달 시스템의 대안적 설계는 또한 약물-투여된 부위가 약물을 필요로 하지 않는 생리학적 상태로부터 고 염증성 병리학적 상태, 예를 들면, 급성 상처(acute wound)에서 세균 감염의 급작스러운 발병 또는 지루성 피부염(seborrheic dermatitis)의 플래어 증가(flare-up)로의 전이를 겪는 상태의 경우 요구된다.
둘째로, 염증-관련된 병리학의 관리시 약물 방출을 개시하기 위한 생화학적 자극으로서 단일 프로테아제를 활용하는 것(leveraging)은 부분적으로 질환의 염증 상태에 대해 투여량을 조절하는 것을 도울 수 있다. 그러나, 다수의 프로테아제는 병리학적 염증 상태에서 상향조절될 수 있다. 따라서, 단일 프로테아제 대신에 프로테아제의 서브세트를 활용하는 것은 프로테아제의 활성과 질환-특이적인 상태의 특이적인 연합을 증가시켜 목적한 염증-관련된 질환에 대해 구체적으로 조절된 약물 방출 역학을 달성할 수 있다. 따라서, 이의 약물 방출이 2개 이상의 프로테아제 자극(또는 다수의 프로테아제 반응성)에 의해 개시되어 향상된 특이성을 달성하는 약물 전달 시스템의 개발에 대한 실질적인 요구가 남아있다.
발명의 요약
본 발명은 (1) 조절된 기본 약물 방출 프로파일을 지닌 약물-로딩된 도메인(drug-loaded domain)(항염증 약물 또는 접합된(conjugated) 항염증 약물을 캡슐화하는 입자) 및/또는 (2) 프로테아제-절단가능한 하이드로겔 도메인을 포함하는 염증-반응성 약물 전달 플랫폼을 제공한다. 본 발명은 이의 약물-로딩된 도메인의 구조를 변화시키고/시키거나 이의 프로테아제-개시된 도메인의 다수의 민감성(sensitivity)을 조정하여 목적한 질환에 대한 이의 반응성 및 특이성(specificity)을 조절함으로써 염증 질환에 대처하도록 주문제작될 수 있는 약물 전달 플랫폼을 제공한다.
본 발명의 제1 양태에 따라서,
a) 입자 속에 캡슐화된 약물;
b) 작용성 모이어티(functional moiety)를 지닌 다중-아암-폴리에틸렌 글리콜(multi-arm-polyethylene glycol)(PEG)을 포함하는 중합체 빌딩 블록(polymer building block); 및
c) 작용성 모이어티를 함유하는 2개의 스페이서 서열(spacer sequence)에 의해 플랭킹된(flanked) 프로테아제-절단가능한 기질을 포함하는 비스-작용성 프로테아제-민감성 가교결합제를 포함하는, 약물-로딩된 프로테아제-반응성 하이드로겔이 제공되며;
여기서 상기 b)의 중합체 빌딩 블록은 c)의 프로테아제-절단가능한 가교결합제의 존재하에서 겔을 형성하여 a)의 입자를 트랩핑한다(entrapping).
일부 구현예에서, 약물-로딩된 프로테아제-반응성 하이드로겔은:
a) 작용성 모이어티를 함유하는 스페이서 서열에 의해 플랭킹된, 상기 c)의 가교결합제의 것에 대해 상이한 프로테아제에 대해 민감성인, 프로테아제-절단가능한 기질을 포함하는 적어도 제2의 비스-작용성 프로테아제-민감성 가교결합제; 및/또는
b) 프로테아제-내성 기질을 포함하는 추가의 비스-작용성 프로테아제-내성 가교결합제를 추가로 포함한다.
입자는 약물을 운반하고 방출할 수 있는 임의의 적합한 물질(예를 들면, 작은 분자, 치료학적 펩타이드, 단백질, mRNA 등)로 구성될 수 있고 중합체 빌딩 블록 및 가교결합제에 의해 형성된 겔에 의해 트랩핑될 수 있다. 예를 들면, 입자는 실리카, 리포좀, siRNA 복합체 또는 중합체성 물질일 수 있다. 입자는 잘-공지된 선행 기술의 방법, 예를 들면, 에멀젼(emulsion), 전기분무(electrospraying), 정전기 복합화(electrostatic complexation), 유동-포커싱 방법(flow-focusing method) 등을 사용하여 제조할 수 있다[Abdelaziza, Hadeer M. et al., Journal of Controlled Release 269 374-392 (2018)].
일부 구현예에서, 약물은 폴리카프로락톤, 폴리(메타크릴산), 폴리락트산, 폴리비닐피롤리돈, 폴리(락틱-코-글리콜산)(PLGA) 및 젤라틴을 포함하는 그룹으로부터 선택된 중합체성 물질을 포함하는 입자 내에 캡슐화된다. 바람직하게는, 입자는 바람직하게는 직경이 약 10 nm 내지 약 100 μm인 마이크로입자 및/또는 나노입자이다.
일부 구현예에서 중합체 빌딩 블록은 다중-아암-PEG-비닐 설폰 또는 다중-아암-PEG 말레이미드 또는 다중-아암-PEG-아지드 또는 다중-아암-PEG-알킨을 포함한다. 유리하게는, 설폰 모이어티는 가교결합제의 아암에서 시스테인 모이어티와 상호작용한다.
본 발명은 또한, 상기 프로테아제에 의해 방출될 때까지 용기(containment)용 입자 속에 약물의 캡슐화를 요구하지 않는 약물-로딩된 프로테아제-반응성 하이드로겔을 구현한다.
본 발명의 제2 양태에 따라서,
a) 작용성 모이어티를 갖는 프로테아제-절단가능한 펩타이드 앵커(protease-cleavable peptide anchor)에 공유결합으로 접합된 약물;
b) 적어도 하나의 작용성 모이어티를 갖는 다중-아암-PEG 중합체를 포함하는 중합체 빌딩 블록; 및
c) 작용성 모이어티를 함유하는 스페이서 서열에 의해 플랭킹된 펩타이드 기질을 포함하는 비스-작용성 가교결합제를 포함하는 약물-로딩된 프로테아제-반응성 하이드로겔이 제공되며;
여기서 펩타이드 앵커의 작용성 모이어티는 다중-아암 PEG 중합체의 아암에 약물을 공유결합으로 연결시키고, 여기서 상기 중합체 빌딩 블록의 작용성 모이어티는 상기 비스-작용성 가교결합제의 상기 모이어티에 공유결합으로 연결되어 겔을 형성한다.
펩타이드 앵커(peptide anchor)와 가교결합제의 배열은 약물-로딩된 하이드로겔의 방출 프로파일의 가요성(flexibility) 및 조율(tuning)을 제공함으로써, 약물의 방출이 하나 이상의 상이한 프로테아제에 대해 민감성일 수 있다.
유리하게는, 약물-접합된 도메인은 약물의 기본 방출을 최소화한다.
일부 구현예에서:
a) 상기 가교결합제는 프로테아제에 대해 절단 가능하지 않거나;
b) 상기 펩타이드 앵커는 프로테아제에 대해 절단가능하고 상기 가교결합제는 동일하거나 상이한 프로테아제에 대해 절단가능하고/하거나;
c) 상기 약물-로딩된 하이드로겔은 다수의 가교결합제를 포함하고, 이들 중 하나 이상은 상이한 프로테아제에 대해 절단가능하다.
유리하게는, 목적한 펩타이드 앵커는 작용성 모이어티를 함유하는 프로테아제-절단가능한 스페이서 서열로 이루어지고, 이는 적어도 4개의 아미노산을 포함한다.
유리하게는, 가교결합제는 작용성 모이어티를 함유하는 스페이서 서열에 의해 플랭킹된 프로테아제-절단가능한 기질 서열로 이루어지고, 이들 각각은 적어도 4개의 아미노산을 포함한다.
비-절단가능한 가교결합제를 사용하여 효소를 겔 네트워크내로의 학산을 제어하며 따라서 방출 프로파일을 조율하는 것을 돕는다.
일부 구현예에서 약물은 작은 분자, siRNA, 압타머(aptamer) 또는 치료학적 펩타이드 또는 단백질일 수 있다.
유리하게는, 프로테아제-개시된 도메인의 주요 구성성분인, 펩타이드 서열의 조합은 하나 이상의 질환-특이적인 프로테아제에 대한 노출 시 신속한 수-계 겔화(fast water-based gelation) 및 보다 우수한 특이적으로 개시된 방출을 제공한다.
일부 구현예에서 중합체 빌딩 블록은 다중-아암-PEG-비닐 말레이미드(multi-arm-PEG-vinyl Maleimide)를 포함한다. 프로테아제-반응성 하이드로겔 상으로 로딩된 약물의 양은 사용된 다중-아암-PEG 중합체의 양 또는 농도에 의해 제어될 수 있다.
일부 구현예에서 약물-로딩된 프로테아제-반응성 하이드로겔의 중량 비는 약 2 w/v% 내지 약 12 w/v%, 바람직하게는 약 3 w/v% 내지 약 10 w/v%이다. 바람직하게는 하이드로겔은 다중-아암-PEG-비닐 설폰 또는 다중-아암-PEG-비닐 말레이미드 또는 다중-아암-PEG-알킨 또는 다중-아암-PEG-아지드이다.
다중-아암-PEG 중합체 상의 아암의 수는 접합될 수 있는 약물의 양 및 또한 가교결합도 및 겔 형성도에 대해 영향을 미칠 것이다.
본 발명의 임의의 양태의 약물-로딩된 프로테아제-반응성 하이드로겔의 일부 구현예에서, 다중-아암 PEG 중합체는 3 내지 8개의 아암을 갖는다.
본 발명의 임의의 양태의 약물-로딩된 프로테아제-반응성 하이드로겔의 일부 구현예에서, 약물은 항염증성이다.
본 발명의 임의의 양태의 약물-로딩된 프로테아제-반응성 하이드로겔의 일부 구현예에서, 프로테아제는 염증 동안 상향조절되고 매트릭스 메탈로프로테이나제 및 세린 프로테아제를 포함하는 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 임의의 양태의 약물-로딩된 프로테아제-반응성 하이드로겔의 일부 구현예에서, 약물은 스테로이드성 항염증 약물 또는 비-스테로이드성 항염증 약물(non-steroidal anti-inflammatory drug; NSAID), 또는 이의 유도체이다. 약물은 스테로이드성 항염증 약물, 예를 들면, 덱사메타손, 플루드로코르티손, 메틸프레드니솔론, 프레드니솔론, 프레드니손 또는 하이드로코르티손, 또는 이의 유도체일 수 있다. 글루코코르티코이드는 산화시켜 이러한 약물이 본 발명의 펩타이드 앵커에 접합되도록 허용하는 카복실성 작용 그룹을 가할 수 있다. 바람직하게는 약물은 NSAID, 예를 들면, 이부프로펜, 케토프로펜, 디클로로페낙, 선늘린닥(Sunlindac), 피록시캄, 또는 셀레콕십(Celecoxib), 또는 이의 유도체이다.
본 발명의 임의의 양태의 약물-로딩된 프로테아제-반응성 하이드로겔의 일부 구현예에서, 상기 플랭킹 스페이서 서열은 적어도 하나의 시스테인 및/또는 라이신 잔기 및/또는 다중-아암 PEG의 작용성 모이어티와 반응하여 겔화를 유도하는데 요구되는 아지드- 또는 알킨-함유 비천연 아미노산을 포함한다. 스페이서는 1 내지 6개의 아미노산을 가질 수 있다. 나머지 잔기는 임의의 아미노산, 바람직하게는 하전된 측 그룹(charged sude group)을 지닌 아미노산일 수 있다. 구체적으로, 시스테인의 티올 모이어티에 근접한 양(성)으로 하전된 아미노산(예컨대, 아르기닌, R)는 가교결합 속도를 증가시키지만 음(성) 전하(예컨대, 아스파르트산, D)은 이러한 반응을 둔화시켰다. 스페이서는 1 내지 6개의아미노산을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 플랭킹 스페이서 서열("SPACER")은 화학식 GX1X2X3(서열 번호: 33)의 것일 수 있고, X1, X2 및 X3 각각은 독립적으로 글리신, 시스테인, 아스파르트산, 또는 아르기닌 및/또는 이의 역 서열(reverse sequence)이다. 일부 구현예에서, 상기 플랭킹 스페이서 서열은 GRCR(서열 번호; 1), GCRG(서열 번호: 2), GRCD(서열 번호: 3), GCDR(서열 번호: 4), GCDG(서열 번호: 5), GDCD(서열 번호: 6), GCDD(서열 번호: 7), GCRD(서열 번호: 8) 및 GCRR(서열 번호: 9)를 포함하는 그룹으로부터 선택된다.
제1 및 제2의 스페이서가 사용된 경우, 펩타이드 기질의 각각의 말단에서 하나인, 제2의 스페이서 서열은 제1의 스페이서 서열의 역일 수 있고 화학식 X3 X2 X1G (서열 번호: 34)의 것일 수 있다. 이러한 역전된 스페이서 서열은 "RECAPS"로서 지칭될 수 있고, 예를 들면, 서열 번호: 1, 서열 번호: 2, 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5, 서열 번호: 6, 서열 번호: 7, ID NO: 8 및 서열 번호: 9를 포함하는 그룹으로부터 선택된 스페이서의 역 서열일 수 있다.
본 발명의 임의의 양태의 약물-로딩된 프로테아제-반응성 하이드로겔의 일부 구현예에서, 프로테아제-절단가능한 기질은 매트릭스 메탈로프로테이나제, 예를 들면, 메탈로프로테이나제-9(MMP-9), MMP-2, MMP-7, MMP-12 등, 카텝신, 예를 들면, 카텝신 K, 카텝신 B, 카텝신 S 등, 사람 호중구 엘라스타제(HNE), 카스파제 및 우로키나제를 포함하는 그룹으로부터 선택된 프로테아제에 대해 민감성이다.
일부 구현예에서, 프로테아제-절단가능한 기질은 KGPRSLSGK(서열 번호: 30), GPRSLSG(서열 번호: 10), LGRMGLPGK(서열 번호: 11), AVRWLLTA(서열 번호: 12) 또는 GPQGIWGQ(서열 번호: 13)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 MMP-9 기질; APEEIMDRQ(서열 번호: 14) 또는 PMAVVQSVP(서열 번호: 15)를 포함하는 HNE 기질; GRRGLG(서열 번호: 16) 또는 DGFLGDD(서열 번호: 17)를 포함하는 카텝신 B 기질 또는 이의 조합을 포함하는 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 제3의 양태에 따라서, 주사 또는 국소 투여용으로 제형화된 본 발명의 임의의 양태의 약물-로딩된 프로테아제-반응성 하이드로겔을 포함하는 조성물이 제공된다.
약물-로딩된 염증-반응성 하이드로겔은 중합체성 드레싱(polymeric dressing) 상에 혼입되어 상처 관리용 복합 드레싱(composite dressing)을 형성할 수 있다.
본 발명의 제4 양태에 따라서, 본 발명의 임의의 양태의 약물-로딩된 프로테아제-반응성 하이드로겔을 포함하는 드레싱이 제공된다.
본 발명의 제5 양태에 따라서, 이를 필요로 하는 대상체를 치료하기 위한 주사가능한 또는 국소 드레싱으로서 본 발명의 임의의 양태의 약물-로딩된 프로테아제-반응성 하이드로겔 또는 본 발명의 조성물이 제공된다.
본 발명의 제6 양태에 따라서, 본 발명의 임의의 양태의 약물-로딩된 프로테아제-반응성 하이드로겔 또는 본 발명의 조성물의 유효량을 이러한 치료가 요구되는 대상체(subject)에게 투여함을 포함하는 치료 방법이 제공된다. 일부 구현예에서 투여는 대상체에게 주사 또는 국소 적용에 의한다. 일부 구현예에서, 치료는 염증-관련된 질환, 예를 들면, 만성 상처(chronic wounds), 염증성 창자 질환(inflammatory bowel disease), 관절염(arthritis) 및 잠재적으로 염증 관리가 요구되는 감염-관련된 상태(infection-related condition)이다.
본 발명의 제7 양태에 따라서,
a) 입자 속에 캡슐화된 약물;
b) 작용성 모이어티를 갖는 다중-아암-폴리에틸렌 글리콜(PEG)를 포함하는 중합체 빌딩 블록; 및
c) 작용성 모이어티를 함유하는 2개의 스페이서 서열에 의해 플랭킹된 프로테아제-절단가능한 기질을 포함하는 비스-작용성 프로테아제-민감성 가교결합제를 포함하고,
여기서 a) 내지 c)는 앞서의 양태 중 임의의 하나에서 정의된 바와 같거나;
a) 작용성 모이어티를 갖는 프로테아제-절단가능한 펩타이드 앵커에 공유결합으로 접합된 약물;
b) 적어도 하나의 작용성 모이어티를 갖는 다중-아암-PEG 중합체를 포함하는 중합체 빌딩 블록; 및
c) 작용성 모이어티를 함유하는 스페이서 서열에 의해 플랭킹된 펩타이드 기질을 포함하는 비스-작용성 가교결합제를 포함하고,
여기서 a) 내지 c)는 앞서의 양태 중 어느 하나에서 정의된 바와 같은, 키트(kit)가 제공된다.
일부 구현예에서, 키트는 본 발명의 임의의 양태의 약물-로딩된 프로테아제-반응성 하이드로겔 또는 본 발명의 임의의 양태의 조성물을 포함한다.
본 발명의 제8 양태에 따라서,
a) 작용성 모이어티를 갖는 다중-아암-폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함하는 중합체 빌딩 블록을 약물-로딩된 입자와 혼합하는 단계;
b) 작용성 모이어티를 함유하는 스페이서 서열에 의해 플랭킹된 프로테아제-절단가능한 기질을 포함하는 비스-작용성 프로테아제-민감성 가교결합제를 약물-로딩된 중합체성 입자와 혼합하는 단계;
c) a)와 b)의 혼합물을 함께 혼합하는 단계를 포함하는, 약물-로딩된 프로테아제-반응성 하이드로겔을 제조하는 방법이 제공되고;
여기서 상기 a)의 중합체 빌딩 블록은 b)의 프로테아제-절단가능한 가교결합제의 존재하에서 겔을 형성하여 약물-로딩된 입자를 트랩핑한다.
입자는 약물을 운반하여 방출할 수 있는 임의의 적합한 물질(예를 들면, 작은 분자, 치료학적 펩타이드, 단백질, mRNA 등)으로 구성되고 중합체 빌딩 블록 및 가교결합제에 의해 형성된 겔에 의해 트랩핑될 수 있다. 예를 들면, 입자는 실리카, 리포솜, siRNA 복합체 또는 중합체성 물질일 수 있다. 입자는 잘 공지된 선행 기술 방법, 예를 들면, 에멀젼(emulsion), 전기분무, 정전기 복합화(complexation), 유동-포커싱 방법 등을 사용하여 제조할 수 있다[Abdelaziza, Hadeer M. et al., Journal of Controlled Release 269 374-392 (2018)].
일부 구현예에서, 약물은 폴리카프로락톤, 폴리(메타크릴산), 폴리락트산, 폴리비닐피롤리돈, 폴리(락틱-코-글리콜산)(PLGA) 및 젤라틴을 포함하는 그룹으로부터 선택된 중합체성 물질을 포함하는 입자 내에 캡슐화된다. 바람직하게는, 입자는 바람직하게는 직경이 약 10 nm 내지 약 100 μm의 범위인 마이크로입자 및/또는 나노입자이다.
본 발명의 제9 양태에 따라서,
a) 작용성 모이어티를 갖는 펩타이드 앵커에 공유결합으로 접합되는 약물을 적어도 하나의 작용성 모이어티를 갖는 다중-아암-PEG 중합체를 포함하는 중합체 빌딩 블록과 혼합하는 단계로서, 여기서 펩타이드 앵커 및 다중-아암-PEG 중합체의 각각의 작용성 모이어티는 공유 결합하여 약물을 다중-아암 PEG 중합체의 아암에 접합시키는 단계;
b) a)의 약물-중합체 접합체를 작용성 모이어티를 함유하는 스페이서 서열에 의해 플랭킹된 펩타이드 기질을 포함하는 비스-작용성 가교결합제와 혼합시키는 단계를 포함하는, 약물-로딩된 프로테아제-반응성 하이드로겔을 제조하는 방법이 제공되며;
여기서 상기 중합체 빌딩 블록의 작용성 모이어티는 상기 비스-작용성 가교결합제에 공유결합으로 연결되어 겔을 형성한다.
제9 양태의 일부 구현예에서:
a) 상기 펩타이드 앵커는 프로테아제로 절단가능하고 상기 가교결합제는 프로테아제로 절단가능하지 않거나;
b) 상기 펩타이드 앵커는 프로테아제로 절단가능하고 상기 가교결합제는 동일하거나 상이한 프로테아제로 절단가능하고/하거나;
c) 상기 약물-로딩된 하이드로겔은 다수의 가교결합제를 포함하고, 이들 중 하나 이상은 상이한 프로테아제로 절단가능하다.
일부 구현예에서, 약물, 가교결합제, 절단가능한 앵커 및/또는 중합체 빌딩 블록은 본 발명의 임의의 양태에서 정의된 바와 같다.
본 발명의 제10의 양태에 따라서,
a) 입자 속에 캡슐화된 약물과, 작용성 모이어티를 함유하는 2개의 스페이서 서열에 의해 플랭킹된 프로테아제-절단가능한 기질을 포함하는 비스-작용성 프로테아제-민감성 가교결합제의 혼합물을 제조하는 단계;
b) 입자 속에 캡슐화된 약물과, 작용성 모이어티를 갖는 다중-아암-폴리에틸렌 글리콜(PEG)로 구성된 중합체 빌딩 블록의 혼합물을 제조하는 단계;
c) a) 및 b)를 함께 혼합시키고, 혼합물을 드레싱 위에 침착(depositing)시켜 겔화를 허용하는 단계를 포함하는, 본 발명의 임의의 양태의 약물-로딩된 프로테아제-반응성 하이드로겔을 포함하는 복합 드레싱을 제조하는 방법이 제공된다.
일부 구현예에서, 드레싱은 알기네이트 상처 드레싱이다.
일부 구현예에서, 방법은 단계 d)를 추가로 포함하고,여기서 복합 드레싱은 액체 질소 속에서 섬광-동결(flash-frozen)되고 동결건조된다.
제조 방법의 일부 구현예에서, 약물은 NSAID이고; 입자는 폴리(락틱-코-글리콜산)(PLGA)을 포함하고; 가교결합제 및/또는 앵커는 매트릭스 메틸프로테이아제 및 세린 프로테아제 또는 이의 조합을 포함하는 그룹으로부터 선택된 프로테아제에 대해 절단가능하고; 중합체 빌딩 블록은 4- 또는 8-아암-PEG-비닐 설폰 또는 4- 또는 8-아암-PEG-비닐 말레이미드 또는 4 또는 8-아암-PEG-아지드 또는 4 또는 8-아암-PEG-알킨을 포함한다.
유리하게는, 일반화가능한 설계 골격은 이의 구조적 및 기능성 통합성(integrity)을 유지하면서 약물의 선택 및 로딩 용량에서의 변화를 가능하도록 한다.
유리하게는, 면역-적합성(immuno-compatible) 물질을 이러한 전달 플랫폼의 설계에서 활용하여 생체 내(in vivo)에서 이의 투여시 숙주 부작용 반응을 잠재적으로 최소화시킨다.
유리하게는, 이러한 플랫폼은 실온에서 주사가능한 및 국소 투여용 둘 다의 다목적이다.
도 1은 모듈러 미립자(modular particulate)-기반 하이드로겔 GEL-iP의 형성 및 단일 프로테아제 활성에 대한 반응시 약물-로딩된 입자의 개시된 방출을 나타낸다.
도 2는 이부프로펜-로딩된 입자(ibu-PLGA 입자)의 성공적인 겔화 및 MMP-9 개시된 방출을 나타내는 하이브리드 미립자-기반 하이드로겔의 예를 나타낸다. 펩타이드 가교결합제로서 비스-시스테인 펩타이드의 첨가는 겔화를 유도하였다(바이알(vial) A1). 가교결합제의 부재하에서, 겔화는 일어나지 않았다(바이알 A2). MMP-9 활성으로 인한 겔 용해(바이알 B1)는 이의 광학 현미경 사진(C1)에서 관찰된 바와 같이 주변 매질 내로 약물-로딩된 입자의 방출을 유발하였다. 200 μL의 하이드리드 하이드로겔의 완전한 분해(digestion)는 5일 후 달성되었다. MMP-9 활성의 부재하에서, 겔은 완전하게 남았고(바이알 B2) 약물-로딩된 입자는 주변 매질에서 관찰되지 않았다(C2). (기준 자(Scale bar): 50 μm).
도 3은 MMP-9가 하이브리드 하이드로겔 GEL-iP로부터 이부프로펜의 시험관 내 방출을 개시하였음을 나타낸다. GEL-iP를 MMP-9에 노출시키는 것(
Figure pct00002
)은 대조군(
Figure pct00003
)과 비교하여 누적된 약물 방출을 유의적으로 증강시켰다. MMP-9 억제제의 첨가는 이부프로펜(
Figure pct00004
)의 방출을 억제하였다. 느린 방출 역학은 비-절단가능한 하이브리드 하이드로겔(scrGEL-iP,
Figure pct00005
)로부터 관찰되었다. 오차 바(error bar)는 n=4개의 반복물의 s.e.m을 나타낸다.
도 4A-B는 대식구 증식에 대한 하이브리드 하이드로겔 GEL-iP로부터 MMP-9-개시된 약물 방출의 효과를 나타낸다. A) 방출물질 생성, 수집, 및 씨딩된 세포(seeded cell)의 처리의 개략도. B) MMP-9 및 이의 억제제의 존재 또는 부재하에서 배양 배지 단독, 자유로이 용해된 약물, 이부프로펜이 없는 하이브리드 하이드로겔 GEL-P, GEL-iP, 또는 scrGEL-iP로부터 생성된 분비물질에 노출된 지 72시간 후 대식구의 상대적인 물질대사 활성. 오차 바는 n=4개의 반복물의 s.e.m을 나타낸다. p-값은 Fisher LSD 사후 분석(Fisher LSD post-hoc analysis)을 사용하여 일-원 ANOVA(one-way ANOVA)로 측정하였다. (***), (****), 및 (ns)는 각각 p<0.001, p<0.0001, 및 p≥0.05(유의적이지 않음)를 나타낸다. Ibu: 이부프로펜; 블랭크(Blank) PLGA 입자: 이부프로펜이 없는 PLGA 입자; ibu-PLGA 입자: 이부프로펜-로딩된 PLGA 입자; GEL-P: 절단가능한 펩타이드(도 14; GCRR-KGPRSLSGK-RRCG; 서열 번호: 18)로 가교결합되고 블랭크 PLGA 입자와 함께 봉매된 PEG 하이드로겔(1); GEL-iP: 절단가능한 펩타이드(도 14; GCRR-KGPRSLSGK-RRCG; 서열 번호: 18)로 가교결합되고 ibu-PLGA 입자와 함께 봉매된 PEG 하이드로겔(1); scrGEL-iP: 스크램블드 펩타이드(scrambled peptide)(GCRR-KSSRGGPLK-RRCG; 서열 번호: 29)로 가교결합되고 ibu-PLGA 입자와 함께 봉매된 PEG 하이드로겔.
도 5A-C는 면역-적격성(immuno-competent) SKH-1E 마우스에서 하이브리드 하이드로겔 GEL-iP 및 이의 구성 물질에 의해 유도된 반응성 산소 종(ROS) 활성의 생체내 평가를 나타낸다. A) 마우스의 등 측면에 6개의 물질 제형의 피하 주사 및 생물발광성 영상을 통한 ROS 활성의 후속적인 정량화를 나타내는 실험 설계. B) 3일째에 대표적인 마우스의 생물발광성 영상. C) 5일 후 배경 수준에 대한 이의 감소를 나타내는 ROS 활성의 정량화. 오차 바는 n=6회 주사의 s.e.m을 나타낸다. p-값은 Fisher LSD 사후 검정을 사용한 일-원 ANOVA로 측정하였다. (*) 및 (ns)는 각각 p<0.05 및 p≥0.05(유의적이지 않음)를 나타낸다. 알기네이트 겔: 염화칼슘에 의해 가교결합된 알기네이트 하이드로겔; PEG 겔: 절단가능한 펩타이드에 의해 가교결합된 PEG 하이드로겔; GEL-P: 절단가능한 펩타이드로 가교결합되고 PLGA 입자와 함께 봉매된 PEG 하이드로겔; GEL-iP: 절단가능한 펩타이드에 의해 가교결합되고 ibu-PLGA 입자와 함께 봉매된 PEG 하이드로겔.
도 6A-C는 이중 프로테아제가 다수의 프로테아제-절단가능한 하이드로겔로부터 PLGA 입자의 방출을 개시하였음을 나타낸다. A) 이중 프로테아제-반응성 조합 하이드로겔 시스템의 메카니즘의 개략도. B) 사진은 24시간에 걸쳐 H2-M2 조합 하이드로겔의 절단가능성을 나타낸다(n = 3). (i) 대조군, (ii) HNE 프로테아제와 함께; (iii) MMP-9 프로테아제와 함께; 및 (iv) HNE 및 MMP-9 프로테아제 둘 다와 함께. C) 24시간에 걸쳐 0, 1 또는 2개의 프로테아제의 존재하에서 조합 하이드로겔로부터 방출된 PLGA 입자의 평균 수의 정량화(n = 3). 오차 바는 n=3 반복물의 s.e.m을 나타낸다. p-값은 터키 사후 분석(Tukey post-hoc analysis)을 사용한 일-원 ANOVA로 측정하였다. (***) 및 (ns)는 각각 p ≤ 0.001 및 p≥0.05(유의적이지 않음)을 나타낸다.
도 7A-C는 GEL-iP를 혼입하는 복합 드레싱의 제작 및 이로부터 이부프로펜의 프로테아제-개시된 시험관 내 방출을 나타낸다. A) GEL-iP로부터의 복합 드레싱 및 Kaltostat® 드레싱의 제작의 개략도. B) 복합 드레싱으로부터 MMP-9-개시된 이부프로펜 방출의 개략도. C) MMP-9에 대한 방출시 복합 드레싱으로부터 방출된 이부프로펜의 정량화. 오차 바는 n=4의 반복물의 s.e.m을 나타낸다. p-값은 웰크 수정(Welch's correction)을 사용한 스튜던츠 t-시험(Student's t-test)으로 측정하였다. (**)는 p<0.01을 나타낸다.
도 8A-C는 이부프로펜-접합된 MMP-9-절단가능한 하이드로겔의 설계를 나타낸다. A) ChemDraw®로 나타낸 ibu-펩타이드 접합의 접합 및 화학 구조의 개략도. B) ibu-GPQGIWGQ-DRCG(서열 번호: 19)의 MS 스펙트럼. C) 이부프로펜-접합된 MMP-9-절단가능한 하이드로겔의 겔화의 화학적 및 대표적인 예.
도 9a 및 9b는 이부프로겐-접합된 MMP-9-개시된 PEG 하이드로겔의 절단가능성을 나타낸다. A) 하이드로겔 시스템의 MMP-9-유도된 분해. B) MMP-9에 의해 유발된 유리된 이부프로펜의 개략도 및 MS 스펙트럼.
도 10A-B는 염증성 프로테아제 자극에 대한 반응성 방출을 나타낸다. A) 이부프로펜(LIbu)의 누적된 유리는 MMP-9 농도에서의 증가에 상응하게 증가하였다. MMP9 프로테아제의 부재하에서 확산-유도된 기본 방출의 부재(하단 선). B) 카텝신 B 및 HNE와 비교하여 MMP-9에 대한 GPRSLSGRRCG(서열 번호: 20) 민감성의 특이성. 오차 바는 n=4 반복물의 평균의 표준 오차를 나타낸다.
도 11A-C는 조절가능한 약물 로딩 및 방출 속도를 나타낸다. 방출 속도는 (A) 가교결합제(즉, 동일한 앵커 H를 사용하지만 가교결합제를 xH로부터 xM 및 대조군 스크램블드(scrambled) xM(즉, xM(xcr)까지 변화시킴: GCRR-SSRGGPL-RRCG, 서열 번호: 39) 또는 (B) 앵커(즉, 동일한 가교결합제 xH를 사용하지만 앵커를 H로부터 M, 및 대조군 스크램블드 M(M(scr)으로 변화시킴: SSRGGPL-RRCG, 서열 번호: 40)를 변화시킴으로써 조율시킬 수 있다. C) 로딩된 약물의 양은 PEG 아암의 수 또는 PEG wt%를 변화시킴으로써 증진시킬 수 있었다. 화살표는 급작스런 플래어(sudden flare)를 모사(mimicking)하는 MMP-9 스파이크를 나타낸다. 오차 바는 n=4의 반복물의 평균의 표준 오차를 나타낸다. 범례 라벨은 ibu -앵커 _가교결합제의 양식에 따르는데, 즉, ibu-H_xH는 앵커 H 및 가교결합제 xH를 지닌 이부프로펜-접합된 하이드로겔을 나타낸다.
도 12A-B는 피하 공간내 상이한 염증 중증도를 지닌 마우스 모델을 나타낸다. A) 시각표의 개략적인 다이아그램. A 사진 B) 및 형광성 영상 C)은 3개의 중증도 수준을 지닌 마우스의 대표적인 세트를 나타낸다. D)는 MMP 활성의 상향조절을 나타내는 형광성 신호의 정량화를 나타내지만 E)는 ELISA를 사용한 MMP-9의 정량화를 나타낸다.
도 13A-C는 SKH1-E 마우스의 피하 공간 내 염증-개시된 약물 방출을 나타낸다. A) 마우스의 등 측면에서 약물-접합된 하이드로겔의 피하 주사 후 피하 염증 생성 및 하이드로겔 주사 후 12시간째에 겔 블롭(gel blob)의 후속적인 회수를 나타내는 실험 설계. B) 3일째에 3개의 중증도 수준에 상응하는 겔 블롭를 사용한 3개의 대표적인 마우스 피부 조직의 사진. C) 약물 방출의 퍼센트의 평가. 오차 바는 n = 8마리의 마우스의 s.e.m을 나타낸다.
도 14A-B는 각각 기질 및 표 3에 나타낸 SPACER-SUBSTRATE-SPACER의 형태의 2개의 유사한 스페이서를 포함하는, 다수의 펩타이드 가교결합제의 정량적 스크리닝을 나타낸다. A) PEG-VS, 펩타이드 가교결합제 및 이부프로펜-로딩된 입자의 혼합물이 중력에도 불구하고 유동을 중지하여 바이알의 바닥에 백색의 하이브리드 하이드로겔을 형성하는 경우 겔화가 확인되었다. B) 상대적인 겔화 속도는 유동을 정지시키기 위한 액체 혼합물에 대해 취한 기간을 비교함으로써 평가하였다. 5분 내 겔화는 신속한 것으로 고려되었지만 30분 이상을 요구하는 겔화는 느린 것으로 고려되었다. C) 각각의 하이브리드 하이드로겔의 절단가능성은 MMP-9 노출 후 광학 현미경 하에 상응하는 매질 내로 방출된 약물-로딩된 입자의 양을 관찰함으로써 점검하였다. (예(YSE))는 MMP-9의 존재하에서 방출된 유의적으로 보다 높은 입자의 수를 나타내며, 이는 하이드로겔 절단가능성을 나타내는 반면, (아니오(NO))는 이의 반대를 나타낸다. (n.e)는 평가되지 않았던 상태를 나타낸다.
도 15A-E는 상이한 직경의 이부프로펜-로딩된 PLGA 입자의 주사 전자 현미경 영상을 나타낸다. 상이한 균질화 속도는 46 μm (A), 14 μm (B), 11 μm (C), 6μm (D), 및 4 μm (E)의 대략적인 평균 직경을 지닌 입자를 생성하였다. (모든 기준자는 20μm를 나타낸다).
도 16은 상이한 크기를 지닌 이부프로펜-로딩된 PLGA 입자로부터 누적된 약물 방출을 나타낸다. 보다 큰 입자 직경은 보다 느린 약물 방출 역학을 생성하였다. 모든 오차 바는 n=4 반복물의 s.e.m을 나타낸다.
도 17A-B는 MMP-9 절단가능한 펩타이드(1)(도 14; GCRR-KGPRSLSGK-RRCG; 서열 번호: 18)에 의해 가교결합된 PEG 겔의 반응계 내(in situ) 형성을 나타낸다. A) PEG 겔의 전구체 용액의 피하 주사로부터 생성된 2개의 덩어리를 갖는 마우스의 등 측면의 영상. B) 피하 공간내 PEG 겔의 원위치(in-situ) 형성을 입증하는, 주사 후 15분째에 2개의 주사 부위에서 가교결합된 PEG 겔을 사용한 절개된 피부 조직의 사진.
도 18A-B는 대표적인 마우스에서 주사된 물질의 주사 후 외형을 나타낸다. A) 6개 물질 제형(알기네이트 겔, PEG 겔, ibu-PLGA 입자, PLGA 입자, GEL-P, 및 GEL-iP)의 파히 주사 후 마우스 우측의 영상. B) 주사 후 5일째에 6개 물질 제형을 함유하는 절개된 피부의 피하 조직 측면의 영상. PEG 겔의 소실(disappearance)은 이의 시험관 내 분해능(degradability)을 나타내었다.
도 19는 이중-반응성 이부프로펜-접합된 PEG 하이드로겔의 단백질분해 기능성을 나타낸다. 겔을 MMP-9 및 HNE에 노출시키는 것은 겔을 MMP-9 또는 HNE에 노출시키는 것으로부터 생성된 것과 비교하여 누적된 약물 방출을 유의적으로 증강시켰다. 최저 방출 역학을 프로테아제가 없는 완충제 속에 침지된 겔로부터 관찰하였다. 오차 바는 n=4 반복물의 s.e.m을 나타낸다.
본 명세서에 언급된 참고문헌 참고(bibliographic reference)는 편의를 위해 실시예의 말미에 나타낸다. 이러한 참고문헌 참고의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다.
발명의 상세한 설명
정의
명세서, 실시예 및 첨부된 청구범위에 사용된 특정의 용어는 편의상 본원에 수집되어 있다.
명세서 및 첨부된 청부범위에 사용된 바와 같은, 단수 형("a", "an" 및 "the")은 문맥이 달리 명확하게 나타내지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, 범위는 "약" 하나의 특수한 값으로부터 또다른 특수한 값으로 나타낼 수 있다. 이러한 범위를 나타낸 경우, 다른 구현예는 하나의 특수한 값으로부터 및/또는 다른 특수한 값을 포함한다. 유사하게, 값을 접두사 "약"을 사용하여, 근사치로 나타내는 경우, 특수한 값은 또다른 구현예를 형성하는 것으로 이해될 것이다. 각각의 범위의 종점은 다른 종점, 및 독립적으로 다른 종점과 관련하여 둘 다 유의적인 것으로 추가로 이해될 것이다. 본원에 개시된 다수의 값이 존재하며 각각의 값은 또한 본원에서 값 자체 외에 "약" 이러한 특수한 값으로 본원에 개시되어 있음이 또한 이해된다. 예를 들면, 값 "10"이 개시된 경우, "약 10"이 또한 개시된 것이다. 값이 개시된 경우, 숙련가에 의해 적절하게 이해되는 바와 같이, 이러한 값 "이하", "이러한 값 이상" 및 값들 사이의 가능한 범위가 또한 개시된 것으로 또한 이해된다. 예를 들면, 값 "10"이 개시된 경우 "10 이하" 뿐만 아니라 "10 이상" 또한 개시된다. 2개의 특수한 단위 사이의 각각의 단위가 또한 개시되어 있는 것으로 또한 이해된다. 예를 들어, 3 및 10이 개시된 경우, 4, 5, 6, 7, 8, 및 9가 또한 개시된다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "아미노산" 또는 "아미노산 서열"은 올리고뉴클레오타이드, 펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 단백질 서열, 또는 이들 중 임의의 단편, 및 천연적으로 존재하는 또는 복합 분자를 지칭한다. "아미노산 서열이 본원에서 천연적으로 존재하는 단백질 분자의 아미노산 서열을 지칭하는 것으로 인용된 경우, "아미노산 서열" 등의 용어는 아미노산 서열을 인용된 단백질 분자와 관련된 완전한 천연 아미노산 서열로 한정하는 것을 의미하지 않는다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "폴리펩타이드", "펩타이드" 또는 "단백질"은 아미노산의 하나 이상의 쇄를 지칭하고, 여기서 각각의 쇄는 펩타이드 결합에 의해 공유결합으로 연결된 아미노산을 포함하고, 여기서 상기 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 천연의 단백질, 즉 천연적으로 존재하고 구체적으로 비-재조합인 세포, 또는 유전적으로 가공되거나 재조합 세포에 의해 생산된 단백질의 서열을 갖는, 펩타이드 결합에 의해 함께 비-공유결합으로 및/또는 공유결합으로 연결된 다수의 쇄를 포함할 수 있고, 천연 단백질의 아미노산 서열을 갖는 분자, 또는 천연의 서열의 하나 이상의 아미노산으로부터 결실, 이에 대한 첨가, 및/또는 이의 치환을 갖는 분자를 포함한다. "폴리펩타이드", "펩타이드" 또는 "단백질"은 1개("단량체"로 명명됨) 또는 다수("다량체"로 명명됨)의 아미노산 쇄를 포함할 수 있다.
용어 "입자"는 약물을 캡슐화하고 약물(예를 들면, 작은 분자, 치료학적 펩타이드, 단백질, mRNA 등)을 수반하여 방출할 수 있는 임의의 적합한 물질로 구성될 수 있고 중합체 빌딩 블록 및 가교결합제에 의해 형성된 겔에 의해 트랩핑될 수 있는 물질을 광범위하게 기술하기 위해 본원에서 사용된다. 예를 들면, 입자는 실리카, 리포좀, siRNA 복합체 또는 중합체성 물질일 수 있다. 입자는 잘 공지된 선행 기술 분야의 방법, 예를 들면, 에멀젼(emulsion), 전기분무(electrospraying), 정전기 복합화(electrostatic complexation), 유동-포커싱 방법(flow-focusing method) 등을 사용하여 제조할 수 있다[Abdelaziza, Hadeer M. et al., Journal of Controlled Release 269 374-392 (2018)]. 중합체 입자는 도 15에 나타낸 바와 같이 형태에 있어서 일반적으로 회전타원체이다. 본 발명에서 사용하기에 바람직한 입자 크기는 직경이 nm 및 ㎛ 범위인 마이크로입자 및/또는 나노입자이다. 바람직하게는 입자는 직경이 10 nm 내지 100 ㎛의 범위이다.
용어 "중합체" 또는 "바이오중합체"는 중합체성이 되는 반복된 분자 단위를 지닌 물질로서 정의된다. 중합체는 폴리사카라이드(예컨대, 아가로스, 덱스트란), 폴리포스파젠, 폴리(아크릴산), 폴리(메타크릴산), 아크릴산과 메타크릴산의 공중합체, 폴리(알킬렌 옥시다제), 폴리(비닐 아세테이트), 폴리비닐피롤리돈(PVP), 이의 유도체 및 이의 공중합체 및 배합물을 포함하는 그룹으로부터 선택된 생체적합성 중합체일 수 있다. 약물-캡슐화된 중합체 입자와 관련하여, 중합체는 예를 들면, 폴리카프로락톤, 폴리(메타크릴산), 폴리락트산, 폴리비닐피롤리돈, 폴리(락틱-코-글리콜산)(PLGA) 및 젤라틴을 포함하는 그룹으로부터 선택될 수 있다. 중합체는 또한 기계적으로 및 구조적으로 안정하고 주사, 이식(transplantation) 또는 주입(implantation)(예컨대, 피하 이식 또는 주입)에 적합한 가요성 중합체일 수 있다. 중합체는 생체분해성일 수 있거나 아닐 수 있다. 본 발명의 중합체 빌딩 블록은 일반적으로 가교결합제 상의 작용성 모이어티와 상호작용하여 겔을 형성할 수 있는 작용성 모이어티를 갖는 다수의 아암을 포함한다. 바람직한 다중-아암 빌딩 블록은 다중-아암-PEG-비닐 설폰, 다중-아암-PEG-비닐 말레이미드, 다중-아암-PEG-아지드 및 다중-아암-PEG-알킨, 보다 특히 4 또는 8개의 아암을 갖는 것을 포함한다.
용어 "대상체(subject)"는 본원에서 척추동물, 특히 포유동물, 보다 특히 사람으로 정의된다. 연구 목적을 위해, 대상체는 특히 적어도 하나의 포유동물 모델, 예컨대, 마우스, 랫트 등일 수 있다. 특히, 질환, 예를 들면, 염증 질환의 치료 또는 예방의 경우, 대상체는 사람일 수 있다.
본 발명의 문맥에서 사용된 바와 같은, 용어 '치료'는 예방적, 경감적, 치료학적 또는 치유적 치료를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "포함하는(comprising)" 또는 "포괄하는(including)"은 언급된 바와 같은 기술된 특징, 정수, 단계 또는 구성성분의 존재를 명시하는 것으로 해석되어야 하나, 하나 이상의 특징, 정수, 단계 또는 구성성분, 또는 이의 그룹의 존재 또는 첨가를 배제하지는 않는다. 그러나, 본 개시내용의 문맥에서, 용어 "포함하는" 또는 "포괄하는"은 또한 "로 이루어진"을 포함한다. 단어 "포함하는", 예를 들면, "포함하다(comprise 또는 comprises)", 예를 들면, "포괄하다(include 및 includes)"의 변이는 상응하게 변화된 의미를 갖는다.
본 발명의 양태를 본원에 제공된 양태와 함께 기술할 것이지만, 이는 본 발명을 이러한 구현예로 한정하는 것을 의도하지 않음이 이해될 것이다. 대조적으로, 본 발명은 본원에 기술된 구현예의 대안, 변형 및 등가물을 포함하는 것으로 의도되며, 이는 본 발명의 영역 내에서 첨부된 청구범위에 의해 정의된 바와 같이 포함된다. 또한, 다음의 상세한 설명에서, 구체적인 세부사항은 본 발명의 완전한 이해를 제공하기 위해 설정된다. 그러나, 당해 분야의 통상의 기술을 가진 개인, 즉, 숙련가에 의해 본 발명이 특정의 세부사항없이, 및/또는 특수한 구현예의 양태의 조합으로부터 발생한 다수의 세부사항을 사용하여 실시될 수 있음이 인식될 것이다. 다수의 예, 공지된 시스템, 방법, 과정, 및 구성성분은 본 발명의 구현예의 양태를 불필요하게 파악하기 어렵도록 하지 않기 위해 상세히 기술되지 않았다.
실시예
당해 분야의 숙련가는 본 발명이 본원에 제공된 방법에 따라서 과도한 실험없이 실시될 수 있음을 인식할 것이다. 방법, 기술 및 화학물질은 제공된 참고 문헌에 기술된 바와 같거나 표준 생명공학 및 분자 생물학 교재의 프로토콜(protocol)로부터 유래한다. 당해 분야에 공지되었지만 구체적으로 기술되지 않은 표준 분자 생물학 기술은 일반적으로 문헌: Sambrook and Russel, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New York (2001)에 기술된 바에 따랐다.
실시예 1: 프로테아제-반응성 미립자-기반 약물-캡슐화된 하이브리드 하이드로겔의 제작을 위한 물질 및 방법
1.1 PLGA 입자의 제작 및 특성화
이부프로펜이 존재 또는 부재하는 입자를 수중유(oil-in-water) 에멀젼화 방법(emulsification method)을 통해 Lactel(앨라바마주 펠햄(Pelham) 소재)로부터의 폴리(락틱-코-글리콜산)(PLGA) 50/50(0.95 내지 1.20 dl/g의 고유 점도)를 사용하여 제작하였다[Dang, T. T. et al. Biomaterials 34 (23), 5792-5801 (2013)]. 전형적으로, 각각 40 mg/ml 및 6 mg/ml의 농도에서, 디클로로메탄 속에 용해된 PLGA 및 이부프로펜의 5 mL의 용액을 1%(w/v) 폴리비닐 알코올(Sigma Aldrich, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)의 25 mL의 용액에 신속하게 가하고 60초 동안 상이한 속도(L5M-A, Silverson)에서 균질화하였다. 수득되는 현탁액을 75 mL의 탈이온수 내로 신속하게 경사분리(decanting)하고 60초 동안 교반한 후, 15분 동안 회전 증발시켰다. 현탁액을 3000 rpm에서 30초 동안 원심분리함으로써 3회 세척하였다. 입자를 수집하고, 액체 질소 속에서 섬광-동결(flash-freezing)시키고, 동결 건조시켰다. 입자 크기 분포 및 형태학을 주사 전자 현미경(JSM 6390LA, JEOL) 하에 실험하였다. 각각의 미립자 제형의 이부프로펜 로딩 용량(loading capacity)은 2 mg의 입자를 1 mL의 아세토니트릴 속에 용해하고 240 nm에서 수득되는 UV 흡광도를 아세토니트릴 중 공지된 농도의 아부프로펜의 표준 곡선과 비교함으로써 측정하였다. 약물-로딩된 서브도메인(subdomain)으로부터의 방출 역학(release kinetics)을 ibu-PLGA 입자의 크기를 변화시킴으로써 독립적으로 시험하였다(표 1 및 도 15 및 16). 평균 직경이 14 μm이고 실험 약물 로딩이 대략 6 wt%인 입자를 GEL-iP의 제작을 위해 궁극적으로 선택하여 약물-로딩된 입자로부터 돌발 방출(burst release)을 약화시켰다.
[표 1]
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1.2 미립자-기반 약물-캡슐화된 하이브리드 하이드로겔의 제작
본 발명자는 프로테아제-절단가능한 하이드로겔 내부에 봉매된 약물-로딩된 중합체 입자로 이루어진 모듈러 약물 전달 플랫폼을 개발하였다(도 1). 프로테아제 활성에 노출 시, 하이드로겔 매트릭스는 단백질분해적으로 분해되어 봉매된 입자를 유리시킬 수 있었고 후속적으로 목적한 치료학적 페이로드(therapeutic payload)를 전달할 수 있었다. 이러한 플랫폼의 모듈러 설계로 인하여, 약물-로딩된 및 프로테아제-절단가능한 서브도메인을 독립적으로 최적화하여 목적한 페이로드 방출을 달성할 수 있었다. 구체적으로, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 폴리(락틱-코-글리콜산)(PLGA)을 임상적으로 허용된 의학 제품 속에서 이러한 중합체의 기존 용도로 인하여 프로테아제-절단가능한 및 약물-로딩된 서브도메인 각각에 대한 주요 중합체성 구성성분으로서 선택하였다. PLGA는 이의 생체분해능 및 세포적합성(cytocompatibility)으로 인하여 치료제, 예를 들면, 약물 및 단백질을 캡슐화하는데 광범위하게 사용된 합성 중합체이다[Han, F. Y. et al. Frontiers in pharmacology 7, 185-185 (2016)]. 유사하게, PEG는 췌장 섬(islet)의 면역-보호를 위한 보호 코팅(conformal coating)으로서[Tomei, A. A. et al. Proceedings of the National Academy of Sciences 111 (29), 10514 (2014)] 또는 수술용 실란트(surgical sealant)의 구성성분으로서[Zoia, C. et al. Journal of Applied Biomaterials & Functional Materials 13 (4), 372-375 (2015)] 사용되었다. 또한, PEG는 다양한 다중-아암 구조 및 작용 그룹을 지닌 광범위한 분자량으로 이용가능한, 합성 중합체이므로, 이는 전신계, 국소 내지 주사가능한 적용 범위의 다양한 약물 전달 플랫폼에서 활용되었다[Li, J. and Mooney, D. J. Nature Reviews Materials 1, 16071 (2016)]. 최근에, 다중 약물 및 세포-기반 치료제의 자극-반응성 전달을 위한 세포적합성 플랫폼으로서 PEG-기반 하이드로겔의 다양성이 또한 입증되었다[Badeau, B. A. Nature Chemistry 10, 251 (2018)].
펩타이드-가교결합된 하이드로겔은 4-아암 폴리(에틸렌 글리콜)-비닐-설폰 (PEG-VS)(20kDa, Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 비스-시스테인 펩타이드(Genscript, 홍콩 소재)와 화학량론적 비로 반응시켜 제조하였다. 각각의 전구체를 트리에탄올아민(TEOA) 완충제(0.3M) 또는 PBS/NaOH 완충제(pH=10) 속에 용해하였다. 전형적으로, PEG 함량이 4.2%(w/v)인 117 μL의 펩타이드-가교결합된 하이드로겔을 제조하기 위해, 5 mg의 PEG-VS를 유리 바이알 속에서 100 μL의 완충제 용액 속에 용해하고 17 μL의 동일한 완충제 용액 속에 용해된 화학량론적 양의 펩타이드 가교결합제와 혼합하였다. PEG 함량이 4.2%(w/v)인 하이드로겔을 펩타이드 가교결합제의 예비 스크리닝(preliminary screening) 시 평가하였다. PEG 함량이 1.7%(w/v)인 하이드로겔을 모든 후속적인 시험관 내 및 생체 내 실험에서 사용하였다. 펩타이드-가교결합된 하이드로겔 속에 봉매된 PLGA 입자(이부프로펜의 존재 또는 부재하에)로 이루어진 하이브리드 하이드로겔을 형성시키기 위해, 상술한 전구체를 별도로 현탁된 PLGA 입자를 5%(w/v)의 농도에서 함유하는 완충제 용액 속에 용해하였다. PEG-VS, 펩타이드 가교결합제, 및 PLGA 입자의 액체 혼합물을 함유하는 유리 바이알을 일정한 간격으로 뒤집어서, 이러한 액체가 중력에도 불구하고 유동하지 않는 경우 게로하를 확인하였다. 펩타이드 스페이서 서열, 펩타이드 기질 서열 및 프로테아제 민감성의 예를 표 2에 나타낸다.
[표 2]
Figure pct00007
1.3 최적의 겔화 및 단백질분해적 절단을 위한 펩타이드 가교결합제의 스크리닝
본 연구에서, 펩타이드 가교결합제를 PEG-VS를 지닌 하이드로겔을 형성하고 MMP-9 활성에 대한 노출시 이의 절단능력을 보유하는 궁극적인 목표를 지니도록 설계하였다. 하이브리드 하이드로겔의 모듈러 설계로 인하여, MMP-9 절단능을 결정하는 서브도메인의 주요 구성성분인, 펩타이드 가교결합제를 독립적으로 설계할 수 있었다. 전형적으로, 목적한 펩타이드 가교결합제는 이의 각각이 4개의 아미노산을 포함하는, 2개의 시스테인-함유 스페이서 서열에 의해 플랭킹된 MMP-9-절단가능한 기질 서열로 이루어졌다. 기질을 보고된 펩타이드 서열로부터 선택하였으며, 이는 MMP-9 검출용 바이오센서에서 MMP-9-민감성 구성성분으로서 또는 화학치료요법을 위한 약물-로딩된 나노-담체에서 MMP-9-절단가능한 링커로서 활용되었다[Biela, A. et al. Biosensors and Bioelectronics 68, 660-667 (2015); Samuelson, L. E. et al. Molecular Pharmaceutics 10 (8), 3164-3174 (2013)]. 각각의 말단 스페이서의 시스테인에서 티올 모이어티를 탈양성자화하여 티올레이트를 형성시킬 수 있으며[Friedman, M. et al. Journal of the American Chemical Society 87 (16), 3672-3682 (1965)] 이는 PEG-VS의 비닐-설폰 모이어티와 미카엘 부가 반응(Michael addition reaction)을 통해 반응하여 겔화를 유도한다[Lutolf, M. P. and Hubbell., J. A. Biomacromolecules 4 (3), 713-722 (2003)].
GEL-iP에 대한 최적의 펩타이드 가교결합제를 확인하기 위하여, 본 발명자는 겔화에서 기질 및 스페이서 선택의 영향 및 하이브리드 하이드로겔의 절단능을 평가함으로써 8개 펩타이드 서열의 정량적 스크리닝을 수행하였다(표 3 및 도 14). 또한, 겔화가 발생한 완충제의 환경 pH가 티올의 탈양성자화에 영향을 미칠 수 있고 후속적으로 가교결합 공정에 영향을 미칠 수 있으므로 이를 또한 시험하였다. 기질, 스페이서 및 완충제의 각각의 조합에 대해, 겔화의 실현가능성을 튜브-역위 방법(tube-inversion method)을 통해 가시적으로 점검하였다. 화학량론적 양의 펩타이드 가교결합제를 PEG-VS 용액 및 현탁된 ibu-PLGA 입자의 혼합물을 함유하는 유리 바이알에 가하였다. 병행 실험에서, 동일한 혼합물 조성물 지니지만, 목적한 펩타이드 가교결합제가 없는 다른 바이알을 대조군으로 사용하였다. 2개의 바이알을 하나의 바이알 속의 혼합물이 성공적인 겔화를 나타내는 중력에도 불구하고 유동을 중지할 때까지 일정한 간격으로 역위시켰다. 대표적인 하이브리드 하이드로겔의 성공적인 겔화의 예는 유리 바이알 A1 및 A2의 사진에서 포착하였다(도 2). 펩타이드 가교결합제의 존재하에서, 백색 하이브리드 하이드로겔이 유리 바이알 A1의 바닥에 형성되었지만 중력에도 불구하고, 아래로 유동하지 않아, 성공적인 가교결합을 입증하였다. 이러한 고체 백색 외형은 백색 ibu-PLGA 입자로부터 생성되었다. 임의의 펩타이드 가교결합제의 부재하에서, 대조군 바이알 A2 속의 전구체 혼합물은 겔화의 부재를 나타내는, 자유로운 유동으로 남았다.
[표 3]
Figure pct00008
500 μL의 에펜도르프 튜브(Eppendorf tube) 내 20 μL의 용적의 각각의 하이브리드 하이드로겔을 37℃에서 3 μg/ml의 MMP-9(83 kDa, Merck)와 함께 PBS 완충제(DPBS/변형되어, 칼슘 및 마그네슘이 부재함, HyCloneTM) 속에서 항온처리하du였다. 대조군 실험에서, 동일한 조성을 지닌 다른 하이브리드 하이드로겔을 MMP-9가 들어있지 않은 PBS 완충제 속에 침지시켰다. 20시간의 항온처리(incubation) 후, 하이브리드 하이드로겔을 둘러싸고 있는 매질을 커버 슬립(cover slip) 위로 샘플링하여 광학 현미경(Olympus CKX53SF, 일본) 하에 관찰함으로써 방출된 입자의 존재에 대해 점검하였다.
MMP-9의 선택된 농도는 류마티스 관절염 및 골관절염을 지닌 환자의 임상 상처 유액 및 윤활액 속의 MMP-9 발현의 범위 내이다[Ladwig, G. P. et al. Wound Repair and Regeneration 10(1) 26-37 (2002); Li, Z. et al. Journal of Diabetes and its Complications 27(4) 380-382 (2013)]. MMP-9에 의한 전형적으로 성공적인 절단 시, 도 2에서 바이알 B1 및 B2의 사진은 각각 MMP-9가 들어있거나 들어있지 않은 완충제에 연장된 노출 후에도, 바이알 A1에서의 것과 동일한 조성을 갖는 하이브리드 하이드로겔의 외형을 나타낸다. MMP-9의 존재하에서, 백색 가교결합된 하이브리드 하이드로겔은 바이알 A1에서 사라진 것으로 이미 관찰되었고 균질환 혼탁 현택액 만이 바이알 B1에서 관찰되었다. 광학 현미경 영상 C1은 바이알 B1의 수득되는 액체 혼합물 속에서 ibu-PLGA 입자의 존재를 입증하였고, 이는 MMP-9에 의한 이러한 하이브리드 하이드로겔의 성공적인 분해를 입증한다. 대조적으로, 겔화 후 첨가된 MMP-9가 없는 PBS 완충제는 바이알 B2에서 선명한 액체 상으로 관찰되었다. 광학 현미경 영상 C2는 또한 바이알 B2에서 임의의 방출된 Ibu-PLGA 입자의 부재를 입증하였다.
도 14는 후보물 가교결합제의 정량적 스크리닝으로부터의 결과를 요약한다. 도 14의 컬럼 (A) 및 (B)에서의 스크리닝 데이타는 펩타이드 가교결합제 내 아미노산의 조합이 펩타이드 서열의 특성을 지시하였고, 이는 결과적으로 젤화 역학에 영향을 미쳤음을 입증하였다. 대부분의 스크리닝된 기질은 5 내지 30분 이내에 성공적인 겔화를 생성하였다. 놀랍게도, 펩타이드(3; 서열 번호: 24) 및 (8; 서열 번호: 28)가 설계된 기질 AVRWLLTA(서열 번호: 12) 만이 이의 상응하는 펩타이드 가교결합제와 PEG-VS의 목적한 반응성을 제공할 수 없었다. 구체적으로, 펩타이드(3)은 PBS/NaOH 속에서 PEG-VS와 가교결합하여 겔화를 유도할 수 있었지만 TOEA 완충제 속에서는 유도할 수 없었다. 본 발명자는 TOEA가 표면활성제로서 작용하여 수용액 속에서 펩타이드(3)의 구조 또는 정렬을 변경시켜 겔화를 지연시킬 수 있다고 추측하였다[Jones, B. H. et al. Soft Matter 11 (18), 3572-3580 (2015)]. 흥미롭게도, PEG-VS 첨가 전에, 펩타이드(8)는 PBS/NaOH 완충제 속에 용해되거나 펩타이드-자가 조립의 가능한 지표인 우유빛 용액(milky solution)을 형성한 경우 TOEA 완충제 속에서 겔-유사 상(gel-like phase)으로 자가-조립되었다[Zhou, Q. et al. Progress in Natural Science 19 (11), 1529-1536 (2009)]. 이러한 거동은 이러한 펩타이드 상의 시스테인의 티올과 PEG-VS의 비닐-설폰 사이의 후속적인 반응을 가능하게는 방해하여 겔화를 방지하였다.
기질 선택 외에도, 스페이서 설계(GCRR (서열 번호: 9) 또는 GCRD(서열 번호: 8))는 또한 가교결합 공정에서 중요한 역활을 한다. 예를 들면, 완충제 둘 다에서, 스페이서 GCRR(서열 번호: 9)은 동일한 기질로 그러나 상이한 스페이서 GCRD (서열 번호: 8)로 설계된 펩타이드(6)보다 PEG-VS와 유의적으로 보다 신속하게 펩타이드(2)가 가교결합하는 것을 도왔다. 유사하게, PBS/NaOH에서, 스페이서 GCRR(서열 번호: 9)을 함유하는 펩타이드(4)는 스페이서 GCRD(서열 번호: 8)를 함유한 펩타이드(5)보다 더 신속하게 비닐-설폰과 반응하였다. 본 발명자의 데이타는 시스테인의 티올 모이어티와 근접한 양성 전하(예컨대, 아르기닌, R)가 가교결합 속도를 증가시킨 반면 음성 전하(예컨대, 아스파르트산, D)는 이러한 반응을 둔화시켰음을 보고하는 공지된 문헌와 일치하였으며[Lutolf, M. P. et al. Bioconjugate Chemistry 12 (6), 1051-1056 (2001)], 이는 가능하게는 전자가 중간체 티올레이트를 안정화시키기 때문이다[Roos, G. et al. Antioxidants & Redox Signaling 18 (1), 94-127 (2012)].
완충제 선택은 또한 이의 환경 pH가 티올의 탈양성자화(deprotonation)에 영향을 미쳐서 중간체 티올레이트의 농도에서의 변화를 초래하므로 가교결합 속도에 영향을 미칠 수 있다[Lutolf, M. P. and Hubbell, J.A. Biomacromolecules 4 (3), 713-722 (2003)]. 미카엘 첨가(Michael addition)에 일반적으로 사용된 강력한 염기성 완충제이지만 또한 세포독성 문제를 야기시키는 TEOA 완충제 외에, 본 발명자는 잠재적으로 세포적합성 대안으로서 PBS/NaOH 완충제를 시험하였다. 도 14에 나타낸 바와 같이, 기질 AVRWLLTA(서열 번호: 12)을 함유하는 서열을 제외하고, 모든 다른 펩타이드는 다양한 역학에도 불구하고 완충제 둘 다에서 PEG-VS와 가교결합할 수 있었다. 흥미롭게도, 펩타이드(5)를 사용하여, PBS/NaOH 완충제는 TEOA 완충제의 것보다 더 느린 가교결합 역학을 초래하였다. 본 발명자는 완충제가 TEOA 완충제에서보다 더 느린 가교결합 역학을 초래한다고 추측하였다. 본 발명자는 보다 약한 염기성 완충제 PBS/NaOH가 TOEA 완충제보다 덜 효율적으로 티올을 탈양성자화시킴으로써, 겔화 속도를 감소시킨다고 추측하였다. 겔화 역학에 있어서 본 발명자의 데이타는, 심지어 동일한 가교결합제 설계의 경우에도, 반응 완충제의 적절한 선택이 또한 성공적인 하이드로겔 형성을 보증하는데 중요함을 제시하였다.
다음에, 도 14의 컬럼 (C)에서의 결과는 MMP-9의 용액 속에서 각각의 성공적으로 가교결합된 하이브리드 하이드로겔의 절단가능성을 요약한다. 구체적으로, 펩타이드 (1), (4), (5) 및 (7)와 가교결합된 하이브리드 하이드로겔은, 하이드로겔을 MMP-9를 함유하는 완충제 속에 침지시킨 경우 주변 매질 속에서 방출된 PLGA 입자의 존재에 의해 입증되는 바와 같이, MMP-9에 의해 분해될 수 있다. 흥미롭게도, 펩타이드 (2), (3), 및 (6)로 형성된 하이드로겔은 MMP-9의 존재 및 부재 둘 다에서 하이브리드 하이드로겔로부터 방출된 동일하게 무시할 정도의 수의 입자로 입증되는 바와 같이, MMP-9에 대한 노출시 절단되지 않았다(나타내지 않음). 이러한 발견은 이러한 3개의 서열의 기질이 항-종양 약물의 프로테아제-활성가능한 나노-담체[Samuelson, L. E. et al. Molecular Pharmaceutics 10 (8), 3164-3174 (2013)], 또는 전기화학적 임피던스 센서(electrochemical impedance sensor)[Biela, A. et al. Biosensors and Bioelectronics 68, 660-667 (2015)] 속에서 MMP-9-민감성 모이어티인 것으로 보고되었다는 사실을 고려할 때 놀라운 것이었다. 가능한 설명은 기질의 말단 둘 다에 플랭킹된 스페이서가 펩타이드 서열의 구조를 변경시켜, 프로테아제가 기질 상의 절단 부위에 접근하는 것을 방지하는 입체적 장애를 생성하는 것이다.
효과적인 프로테아제-개시된 약물 전달 플랫폼을 설계하기 위하여, 최적의 펩타이드 가교결합제는 신속한 겔화를 유도하고 이러한 프로테아제에 대한 반응시 이의 절단가능성을 보유하여야 한다. 8개의 스크리닝된 펩타이드 중에서, 3개의 서열(펩타이드 (1), (4), 및 (7); 도 14)는 신속한 겔화를 보고하였고 시험한 완충제 둘 다에서 MMP-9에 의한 성공적인 하이드로겔 절단을 생성하였다. 본 발명자는 서열 GCRR-KGPRSLSGK-RRCG(서열 번호: 18)의 17개 아미노산을 포함하는 펩타이드(1), 및 PBS/NaOH 완충제의 조합을 선택하여 후속적인 시험을 위한 목적한 하이브리드 하이드로겔 GEL-iP를 제조하였다.
1.4 입자-기반 약물-캡슐화된 하이브리드 하이드로겔로부터 약물 방출 역학의 시험관 내 연구
2개 유형의 하이브리드 하이드로겔을 본 시험관 내 방출 연구에서 비교하였다. GEL-iP는 절단가능한 펩타이드(1) GCRR-KGPRSLSGK-RRCG (서열 번호: 18)로 가교결합된 이부프로펜-로딩된 PLGA 입자(ibu-PLGA 입자)와 함께 봉매된 하이드로겔이었다. ScrGEL-iP는 ibu-PLGA 입자와 봉매되고 비-절단가능한 스크램블드 펩타이드 GCRR-KSSRGGPLK-RRCG(서열 번호: 29)와 가교결합된 하이드로겔이었다. 요약하면, 40 μL의 GEL-iP를 1.5 mL의 튜브 속에서 3 μg/ml의 MMP-9가 들어있거나 들어있지 않은 500 μL의 PBS 용액 속에 침지시켰지만, 40 μL의 scrGEL-iP는 단지 MMP-9-함유 PBS 용액에 노출시켰다. GEL-iP를 사용한 대조군 실험에서, MMP-9 억제제 I(Merck)은 MMP-9와 함께 가하였다. 각각의 튜브를 37℃의 온도 및 30 rpm의 진탕 속도에서 Multi Bio RS-24 회전기(rotator)(BioSan) 상에 유지시켰다. 예정된 간격에서, 각각의 튜브로부터 액체 혼합물의 10 μL의 분취량을 수집하고 90 μL의 아세토니트릴에 가하였다. 수득되는 샘플을 0.22 μm의 주사기 여과기에 통과시키고 4℃에서 저장하였다. 3 μg/ml의 MMP-9가 들어있거나 들어있지 않은 10 μL의 용적의 신선한 PBS 용액을 각각의 튜브에 가하여 분취된 용적을 대체하였다. 24시간 후, 각각의 하이브리드 하이드로겔을 이의 나머지 약체 혼합물과 함께 아세토니트릴 속에 완전히 용해시켰다. 모든 수집된 샘플 속의 이부프로펜의 농도를 RP-HPLC로 정량하였다. 각각의 시점에서 약물 방출의 퍼센트는 각각의 튜브 속에서 초기 양의 약물을 사용하여 각각의 시점에서 수집된 약물의 누적된 양을 표준화함으로써 계산하였다[Dang, T. T. et al. Biomaterials 32 (19), 4464-4470 (2011)]. 각각의 하이브리드 하이드로겔에 대해 보고된 방출 역학을 4회 실험의 평균으로부터 수득하였다.
도 3에 나타낸 바와 같이, MMP-9에 GEL-iP를 4시간 동안 노출시키는 것은 MMP-9의 부재하에서 단지 25%와 비교하여 누적된 약물 방출을 100%까지 유의적으로 증강시켰다. MMP-9 억제제를 MMP-9와 함께 가하는 경우, 방출된 이부프로펜의 양은 유의적으로 억제되었다. 이는 MMP-9의 단백질분해 활성이 작은 분자 억제제에 의해 선택적으로 차단될 수 있기 때문이었다. 따라서, MMP-9는 펩타이드 가교결합제를 절단하여 하이드로겔 매트릭스를 파괴시킴으로써, 이부프로펜의 개시된 방출을 방지할 수 없었다. 또한, GEL-iP는 처음 4시간 내에 MM-9의 존재시 완전히 분해되어 100%의 이부프로펜을 방출하였지만, 동일한 조건 하에서 스크랩블드 펩타이드(scrGEL-iP)로 가교결합된 하이브리드 하이드로겔로부터는 40% 만이 방출되었다. MMP-9의 존재하에서, 보다 많은 양의 이부프로펜이 scrGEL-iP의 것과 비교하여 GEL-ip로부터 방출되었고 이는 GEL-iP의 MMP-9 유도된 분해를 가능하도록하여 증가된 약물 방출을 개시하는 절단가능한 펩타이드(1)의 역활을 입증하였다. 전반적으로, 도 3에서의 데이타는 개시된 방출이 이의 관련된 펩타이드 기질에서 MMP-9의 절단 활성에 기인하였음을 입증하였다.
대식구에서 미립자-기반 약물-캡슐화된 하이브리드 하이드로겔의 시험관 내 억제 효과의 평가
MMP-9 개시인자(trigger)에 대한 노출시 GEL-iP로부터 방출된 약물을 RAW 264.7 뮤린(murine) 대식구의 증식에서 이의 시험관 내 억제 효과를 시험함으로써 평가하였다. 발표된 연구는 단핵구 순환 외에, 국소 대식구 증식이 염증-관련된 질환, 예를 들면, 죽상경화증(atherosclerosis) 및 비만-관련된 지방 조직 염증(obesity-associated adipose tissue inflammation)에서 이러한 세포 유형의 병변적 축적을 지배함을 이미 입증하였다[Amano, S. U. et al. (2014)]. 따라서, 대식구 자가-분열을 염증의 치료학적 조율을 위한 잠재적인 표적으로서 추정하였다.
RAW 264.7 뮤린 대식구를 10% FBS(Gibco Laboratories), 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(Gibco Laboratories)이 보충된 고 글루코스 DMEM(Gibco Laboratories) 속에서 37℃에서 5% CO2 대기 속에서 배양하였다. 20 내지 30회 계대배양에서 RAW 264.7 대식구를 96-웰 플레이트(96-well plate)(Corning®)에 2x104개의 세포/웰의 초기 씨딩 밀도(initial seeding density)에서 씨딩하고 37℃에서 24시간 동안 항온처리하였다. 1.7%(w/v)의 PEG 및 5%(w/v)의 이부프로펜-로딩된 PLGA 마이크로입자로 봉매된 100 μL 용적의 각각의 하이브리드 하이드로겔(GEL-iP 및 scrGEL-iP)을 500 μL의 페놀 레드가 없는 DMEM(Gibco Laboratories) 배양 배지 속에서 2시간 동안 3 μg/ml의 MMP-9의 존재 및 부재하에 항온처리하였다(도 4의 A). 이부프로펜-유리된 PLGA 입자(GEL-P)로 봉매된 MMP-9-절단가능한 하이드로겔을 또한 대조군 하이브리드 하이드로겔로서 포함시켰다. GEL-iP 샘플의 하나의 그룹에서, MMP-9 억제제 I을 항온처리 동안 MMP-9와 함께 가하였다. 항온처리 후, 200 μl의 배양 배지를 각각의 하이브리드 하이드로겔 제형으로부터 분비물질로서 수집하여 씨딩된 RAW 264.7 대식구를 72시간 동안 처리하였다. 200 μL의 용적의 새로운 배양 배지 및 0.6 mg/mL의 새로이 용해된 이부프로펜을 또한 사용하여 대식구를 음성 및 양성 대조군으로서 각각 처리하였다. 자유로이 용해된 이부프로펜의 이러한 투여량을 각각의 하이브리드 하이드로겔 속에 로딩된 약물의 양을 기반으로 표준화하였다. 이후에, 분비물질을 처리된 대식구로부터 제거하고; 처리된 세포의 시험관 내 물질대사 활성을 WST-1 세포 증식 검정(Abcam)을 사용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 평가하였다. 구체적으로, WST-1 시약을 10:1 용적 비로 함유하는 200 μL의 배양 배지를 각각의 웰에 가하고 37℃에서 3시간 동안 항온처리하였다. 이후에, 100 μL의 용적의 당해 배지를 새로운 96-웰 플레이트로 이전시키고; 450 nm 및 690 nm에서 이의 흡광도를 미세플레이트 판독기(SpectraMax M5)를 사용하여 기록하였다. 상대적인 물질대사 활성을 계산하기 위하여, 450 nm에서 모든 흡광도 값을 690 nm 및 배경 흡광도의 참고 파장에서의 값을 갑하여 수정된 흡광도 값을 달성시켰다. 이후에, 상대적인 물질대사 활성을 다음과 같이 계산하였다:
상대적인 물질대사 활성 = A 시험/A 대조군 *100%
여기서 A 시험 및 A 대조군은 분비물질 및 새로운 배양 배지 각각으로 처리한 세포로부터 수집도니 용액의 수정된 흡광도 값이었다.
도 4의 B에 나타낸 바와 같이, GEL-iP의 MMP-9 분해에 의해 수득된 분비물질은 대식구 증식을 완전히 억제시켰지만(~0%) MMP-9의 부재하에서 GEL-iP로부터 수득된 것은 처리된 세포로부터 보다 높은 물질대사 활성(~40%)을 생성하였다. 이러한 데이타는 GEL-iP가 보다 많은 양의 이부프로펜을 방출시켜, 만성 질환에서 증가된 염증으로 인하여 상향조절된 프로테아제 발현을 시뮬레이트하는, 3 μg/ml의 MMP-9 농도에 의해 개시된 경우 대식구 증식을 추가로 감소시켰음을 나타내었다[Ladwig, G. P. et al. Wound Repair and Regeneration 10(1) 26-37 (2002); Li, Z. et al. (2013)]. 또한, MMP-9의 부재하에서, GEL-iP로부터 수득된 분비물질로 처리한 대식구의 물질대사 활성(~40%)은 전신계 투여에 의한 제어되지 않는 약물 전달을 모사하는, 자유로이 용해된 약물의 동일한 투여량으로 처리한 세포의 것(~0%)보다 유의적으로 더 높았다. 따라서, 항염증성의 생리학적 조건을 시뮬레이션한 MMP-9의 부재하에서[Roomi, M. W. et al. (2009)], GEL-iP는 자유로이 용해된 약물보다 이부프로펜을 거의 방출하지 않음으로써 대식구에서 약물의 효과를 후속적으로 최소화시킬 수 있었다. Gel-iP의 이러한 특징은 전신계 약물 투여 동안 제어되지 않은 방출 역학으로부터 생성된 과도한 약물 투여량을 감소시킴으로써 항염증 조건에서 약물-유도된 부작용을 완화시키는 이의 잠재능을 시사하였다[Youssef, J. et al. Rheumatic diseases clinics of North America 42(1) 157-176 (2016)].
또한, MMP-9 억제제를 MMP-9와 함께 가하는 경우, 대식구의 물질대사 활성은 이러한 억제제의 부재하에서 관찰된 완전한 억제(~0%)로부터 20%까지 회복되었고, 이는 활성 MMP-9가 대식구에서 분비물질의 목적한 억제 효과를 달성하는데 필수적임을 입증한다. MMP-9의 존재하에서, GEL-iP로부터 방출된 이부프로펜은 대식구 증식을 완전히 억제할 수 있지만, 이러한 활성은 세포를 절단불가능한 scrGEL-iP로부터의 분비물질로 처리하는 경우 여전히 55%에서 남았다. MMP-9 억제제 및 scrGEL-iP를 사용한 대조군 실험으로부터의 발견은 Gel-iP로부터 이부프로펜 방출을 개시하여 대식구 증식을 조절하는데 있어서 활성 MMP-9 및 이의 관련된 절단가능한 펩타이드의 중요한 역활을 확립하였다. 전반적으로, GEL-iP는 프로테아제 활성에 의해 개시되어 항염증 약물을 방출하고 면역 세포의 활성을 잠재적으로 조절할 수 있는 촉망되는 약물 전달 플랫폼이다.
본 발명자의 주요 목적은 이러한 자극의 부재하에서 최소 방출로 프로테아제 활성에 의해 개시되는 경우 약물을 방출하는 전달 플랫폼을 개발하기 위한 것이지만, MMP-9의 부재하에서 GEL-iP로부터 방출된 이부프로펜의 기본적인 양과 관련한 관심은 논쟁의 소지가 있다. 이는 ibu-PLGA 미립자의 표면으로부터 수동적 약물 확산으로부터 기인할 수 있고 MMP-9 및 이의 억제제의 부재하에서 Gel-iP로부터의 분비물질로 처리한 대식구의 부분적인 억제(~40%)를 설명할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 항염증 약물의 투여를 요구하는 대부분의 실제 임상 적용시, 일부 수준의 염증이 존재한다. 따라서, 이러한 기본적인 약물 방출은 낮은 수준의 염증 및 관련된 증상, 예를 들면, 통증(pain) 및 팽윤(swelling)을 관리하여[Steinmeyer, J. (2000)] 염증 반응의 악화를 최소화하는데 유용할 수 있다[Sutherland, E. R. et al. (2003)]. 염증이 관절염 플래어(arthritic flare) 또는 만성 상처(chronic wound)의 감염의 경우에서와 같이 MMP-9 활성에서의 수득되는 증가가 급격하게 악화된 경우, GEL-iP를 개시하여 이부프로펜을 더 방출함으로써 염증의 증가된 중증도에 대처할 것이다.
실시예 2: 프로테아제-반응성 미립자-기반 약물-캡슐화된 하이브리드 하이드로겔의 생체 내 평가
2.1 면역-적격성(immuno-competent) SKH-1 마우스의 동물 보호
피하 적용을 위한 주사가능한 약물 전달 플랫폼으로서 GEL-iP의 잠재적인 사용을 추가로 평가하기 위하여, 본 발명자는 생체 내에서 GEL-iP 및 이의 구성 물질의 면역-적합성을 평가하였다. 면역적격성 마우스 모델 SKH-1E를 활용하여 피하 숙주 반응에서 이의 물질의 효과를 5일까지 시험하였다(도 5). 본 연구를 싱가포르의 난양 기술 대학(Nanyang Technological University; NTU)의 동물 실험 윤리 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)에 의해 승인된 동물 프로토콜(프로토콜 번호 A0343)에 따라 수행하였다. 모든 동물 실험은 국립 실험실 동물 연구 자문 위원회(National Advisory Committee for the Laboratory Aminal Research; NACLAR)에 따르며, 이는 실험 동물의 보호 및 사용을 위한 국립 보건원(National Institutes of Health guide for the care and use of laboratory animals)(NIH 발표 번호 8023, 1978년에 개정됨)에 부합한다. 10주령의 암컷 SKH-1E 마우스(F1)는 Charles River Laboratories(Wilmington, 미국 매사츄세츠주 소재)로부터 구입한 임신한 마우스로부터 출산되었다. 마우스를 표준 조건 하에서 12시간의 명/암 주기로 리홍콩 티앙 의과대학(Lee Kong Chian School of Medicine, NTU)의 동물 시설에서 가두었다. 물 및 사료 둘 다는 자유로이(ad libitum) 제공하였다.
2.2 중합체성 마이크로입자의 피하 주사
물질의 피하 주사 전에, 마우스를 산소 중 3% 이소플루란을 사용하여 흡입된 마취 하에 유지시켰다. 6개의 상이한 물질 제형을 각각의 마우스의 등 측면에 배열 양식으로 피하 주사하였다. 구체적으로, ibu-PLGA 입자(50 mg/ml), 이부프로펜이 없는 블랭크(ibuprofen-free blank) PLGA 입자(50 mg/ml), 또는 1%(w/v) 알기네이트 하이드로겔(PRONOVATM SLG20, FMC BioPolymer)을 함유하는 50 μL의 용적의 PBS 완충제를 주사하였다. 각각의 하이드로겔 제형, 예를 들면, GEL-iP, GEL-P, 또는 PLGA 입자(PEG 겔)의 부재하에서 펩타이드 (1)(GCRR-KGPRSLSGK-RRCG; 서열 번호: 18)로 가교결합시킨 PEG 하이드로겔의 경우, 상응하는 전구체를 함유하는 50 μL의 용액을 주사하였다. 예를 들면, GEL-iP의 원위치 형성을 PEG-VS, 펩타이드 가교결합제, 및 ibu-PLGA 입자를 함유하는 50 μL의 PBS/NaOH 완충제를 마우스의 등 측면에 피하 주사함으로써 유도하였다.
2.3 SKH-1E 마우스의 비-침입성 생체발광성 영상
ROS 활성을 ROS에 의해 산화시켜 다른 연구에서 보고된 바와 같이 생체발광성 신호를 방출하는 루미놀을 사용하여 정량화하였다[Liu, W. F. et al. Biomaterials 32 (7), 1796-1801 (2011)]. 요약하면, 영상화 전에, 마우스에게 100 μL의 PBS 속에 용해된 5 mg의 나트륨 루미놀(Sigma Aldrich, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)을 복강 내로 주사하였다. 이러한 주사 후 20분 째에, 마우스를 IVIS Spectrum CT 시스템(Caliper Life Sciences)을 사용하여 180초 노출로 영상화하였다. 총 플럭스(flux)(양성자/s)를 주사 부위 주변의 목적한 영역(ROI)(cm2)에 걸쳐 Living Image 3.1 소프트웨어를 사용하여 측정하였다.
별도의 예비 실험에서, 동일계내 겔화(in situ gelation)를 가교결합된 하이드로겔의 존재에 의해 주사 후 15분 째에 절개된 피부의 피하 공간에서 확인하였다(도 17). GEL-iP, ibu-PLGA 입자 및 이부프로펜이 없는 PLGA 입자의 구성 물질의 효과를 평가하기 위하여, 입자를 또한 시험하였다. 또한, 이의 피하 면역-적합성이 이미 보고되었으므로 마우스에서 칼슘-가교결합된 알기네이트 하이드로겔(알기네이트 겔)을 음성 대조군으로서 사용하였다[Liu, W. F. et al. Biomaterials 32 (7), 1796-1801 (2011)].
다수의 시험관 내 및 생체 내 연구로 활성화된 대식구에 의해 생성된 반응성 산소 종(ROS)을 정량화함으로써 물질-유도된 숙주 반응을 특성화하였다[Dang, T. T. et al. Biomaterials 34 (23), 5792-5801 (2013); Dang, T. T. et al. Biomaterials 2011, 32 (19), 4464-4470 (2011)]. 본 실험에서, 본 발명자는 비-침입성 영상 기술을 사용하여 주사 후 1, 3, 및 5일째에 물질 주사 부위에서 ROS에 의한 루미놀 영상 프로브의 산화로 기인하여 방출된 생체발광성 신호를 정량하였다(도 5의 A)[Dang, T. T. et al. Biomaterials 34 (23), 5792-5801 (2013); Dang, T. T. et al. Biomaterials 32 (19), 4464-4470 (2011); Liu, W. F. et al. Biomaterials 32 (7), 1796-1801 (2011)]. 도 5의 B는 3일째에 대표적인 마우스의 생체발광성 영상을 나타내지만 도 5의 C는 5일의 기간에 걸쳐 상이한 물질 제형에 의해 유도된 정량화된 ROS 활성을 나타낸다. 1일째에, PLGA 입자가 없는 펩타이드-가교결합된 PEG 겔은 알기네이트 겔의 것에 대해 비교가능한 ROS 활성을 유도하였고, 이는 피하 공간 내에서 PEG 겔의 면역-적합성을 입증한다. 이러한 데이타는 또한 PEG 겔의 제조시 전구체 용액용 완충제로서 PBS/NaOH를 선택하는 것이 면역 세포에 의한 ROS 생산에서 부작용을 유도하지 않았음을 입증하였다. 더욱이, 5일째에, 절개된 피부의 피하 공간에서 가교결합된 PEG 겔의 외형은 PEG 겔이 완전히 분해되었음을 제시하였다(도 18). 흥미롭게도, 모든 PLGA-함유 제형은 둘다 PLGA를 함유하지 않는, PEG 겔 및 알기네이트 겔에 의해 유발된 것보다 더 높은 수준의 ROS 생산을 야기하였다. PLGA가 수개의 약물 전달 적용에서 사용하기 위해 FDA에 의해 승인되었음에도 불구하고[Han, F. Y. et al. Frontiers in pharmacology 7, 185-185 (2016)], 이의 소수성은 본 연구에서 관찰된 바와 같이 가능하게는 급성 염증(acute inflammation)[Seong, S.-Y. and Matzinger, P. (2004)] 및 ROS 활성에서 관련된 증가[Dang, T. T. et al. Biomaterials 34 (23), 5792-5801 (2013)]를 초래하였다. 그러나, 1일째에 이러한 PLGA-관련된 ROS 활성은 궁극적으로 5일째에 대조군 피부의 것에서와 동일한 배경 수준으로 감소하였고, 이는 ROS 활성의 이러한 PLGA-유도된 상승이 일시적이었음을 입증한다. 따라서, PLGA는 SKH-1E 마우스의 피하 공간 내에서 여전히 면역-적합성인 것으로 고려될 수 있었다. 전반적으로, 본 발명자의 발견은 GEL-iP의 구성 물질, 즉, PEG 하이드로겔 및 PLGA 입자가 하이브리드 하이드로겔의 설계의 적절한 면역-적합성 물질이었음을 제시하였다. 또한, 본 발명자의 생체-직교성(bio-orthogonal) 화학 겔화 전략 및 완충제 선택은 ROS 활성에서 부정적인 증가를 유도하지 않았다.
실시예 3: 다수의 반응성을 지닌 미립자-기반 프로테아제-절단가능한 하이드로겔
본 발명자는 다수의 반응성을 지닌 미립자-기반 프로테아제-절단가능한 하이드로겔이 하나 이상의 질환-특이적인 프로테아제의 공존재시 가장 신속하게 분해되었고, 표적 염증 질환에 대한 특이성을 향상시켰음을 입증하였다. 전형적으로, HNE 펩타이드 기질(H2) 및 MMP-9 펩타이드 기질(M2)의 조합으로 가교결합된, H2-M2 조합 하이드로겔(표 4)은 단일 프로테아제, HNE 또는 MMP-9에 대한 노출로 완벽하게 남았다. 그러나, 프로테아제 둘 다를 가하는 경우 하이드로겔은 완전히 분해되었다(도. 6a). 상층액 속에서 정량된 평균 수의 PLGA 입자에서 수행된 일-원 ANOVA 통계적 분석은 프로테아제 둘 다의 존재하에서 방출된 입자의 수가 단일 프로테아제 및 대조군을 지닌 하이드로겔에 대해 비교하는 경우 유의적으로 보다 더 많음을 나타내었다(p ≤ 0.001)(도 6의 B). 또한, 결과는 또한 H2 및 M2 펩타이드 기질이 HNE 및 MMP-9 프로테아제 각각에 의해 우선적으로 절단되었음을 나타내었다.
[표 4]
Figure pct00009
실시예 4: 프로테아제-반응성 미립자-기반 캡슐화된 하이브리드 하이드로겔을 포함하는 복합 드레싱의 제작
3.1 복합 드레싱으로부터 약물 방출 역학의 시험관 내 연구
국소 적용을 위한 이러한 약물 전달 플랫폼의 다양성을 나타내기 위하여, 본 발명자는 하이브리드 하이드로겔 GEL-iP와 Kaltostat® 상처 드레싱을 혼입시켜 복합 드레싱을 형성시켰다(도 7의 A). 이러한 복합 드레싱의 궁극적인 목적은 염증 및 통증 관리를 위한 만성 상처의 삼출물 속에서 상승된 MMP-9 수준에 대한 노출시 이부프로펜을 방출시키는 것이다[Ladwig, G. P. et al. Wound Repair and Regeneration 10(1) 26-37 (2002); Li, Z. et al. Journal of Diabetes and its Complications 27(4) 380-382 (2013)](도 7의 B). 복합 드레싱을 제작하기 위하여, 펩타이드(1)(GCRR-KGPRSLSGK-RRCG; 서열 번호: 18) 및 PEG-VS를 현탁된 ibu-PLGA 입자를 5%(w/v)의 농도에서 함유하는 PBS/NaOH 완충제 속에 별도로 용해하였다. 이러한 2개의 전구체를 20 μL의 전구체 혼합물이 직경이 6 mm인 Kaltostat® 알기네이트 상처 드레싱의 원형 쉬이트 상에 신속하게 침착되기 전헤 함께 혼합하였다(도 7의 A). 겔화 후, 복합 드레싱을 액체 질소 속에서 섬광-동결시키고 동결 건조시켰다. 2개의 복합 드레싱을 이러한 시험관 내 방출 연구에서 비교하였다. 요약하면, 20 μL의 GEL-iP를 함유하는 복합 드레싱을 1.5 mL의 튜브 속에서 3 μg/ml의 MMP-9가 들어있는 500 μL의 PBS 용액 속에 침지시키지만 다른 드레싱은 단지 MMP-9가 없는 PBS 용액에 노출시켰다.
새로이 형성된 복합 드레싱은 전구체 혼합물로부터의 물로 포화되었으므로, 본 발명자는 액체를 흡수하는 이의 능력이 유의적으로 감소하였음을 관찰하였다. 따라서, 복합 드레싱을 동결건조시켜 이의 흡수능을 회복시켰다. 이후에, 이러한 드레싱은 이를 MMP-9가 들어있거나 들어있지 않은 완충제 용액 속에 침지시킴으로써 MMP-9에 대한 노출시 이부프로펜을 방출하는 이의 능력에 대해 시험하였다. 24시간 항온처리 후, 복합 드레싱은 완충제를 신속하게 흡수하고 MMP-9의 부재하에서 단지 56와 비교하여 MMP-9의 존재하에서 로딩된 이부프로펜의 거의 100%를 방출하였다(도 7의 C). 전반적으로, 하이브리드 하이드로겔 GEL-iP는 주사가능한 제형(도 5) 뿐만 아니라 국소 적용(도 7)에 잠재적으로 적합한 다양한 개시된 약물 방출 플랫폼을 제공하였다.
실시예 5: 단일 또는 다수의 프로테아제 반응성을 지닌 모듈러 접합체-기반 하이드로겔
5.1 프로테아제-민감성 펩타이드 앵커에 대한 약물의 접합
본 발명자는 신규 이부프로펜-펩타이드 접합체를 합성하고 정제하는 강력한 공정을 개발하였다. 이러한 공정 흐름도는 도 8의 A에 나타낸다. 방법은 간단하게는 다음과 같다.
첫째로, 비-스테로이드성 항염증 약물(NSAID)인, 이부프로펜을 펩타이드 서열, GPQGIWGQ-DRCG(서열 번호: 19)의 N-말단에 접합시켜, 고체 상 펩타이드 합성(SPPS)을 사용하여 ibu-GPQGIWGQ-DRCG(서열 번호: 19)를 형성시켰다. Fmoc-보호된 펩타이드를 우선 0.3 mmol/g 규모로 Rink 아미드 수지 상에서 표준 매뉴얼 고체 상 펩타이드 합성을 사용하여 합성하였다. 이부프로펜 접합 전에, Fmoc 보호 그룹을 20% 피페리딘으로 제거하였다. 이후에 50 mg의 양의 Fmoc가 없는 수지를 500 μL의 DMF 속에 9.28 mg의 이부프로펜과 함께 분산시켰다. 34.2 μL의 DMF 중 1M PyBOP 용액 및 6 μL의 DIPEA를 수지 분산액에 가한 경우 반응이 일어났다. 18시간 후, 수지를 DMF에 이어서 디클로로메탄(DCM)으로 수회 세척하였다. 다음에, ibu-GPQGIWGQ-DRCG(서열 번호: 19)를 95% 트리플루오로아세트산, 2.5% 물 및 2.5% 트리이소프로필실란(TIPS)을 함유하는 절단 칵테일(cleavage cocktail)을 사용하여 60분 동안 실온에서 수지를 절단하였다. 생성물을 냉(cold) 에테르 속에 침전시킨 다음, 진공 건조 하에 유지시켰다. 펩타이드-약물 접합의 실체를 MS, MS m/z: 731.35 [M +2H]2+로 확인하였다. LC-MS 데이타는 약물이 ChemDraw®로부터 이론적으로 예측된 값에 일치한 ibu-GPQGIWGQ-DRCG(서열 번호: 19)의 관찰된 분자량과 같이, 펩타이드 서열, GPQGIWGQ-DRCG(서열 번호: 19)의 N-말단에 성공적으로 접합되었음을 나타내었다(도 8의 B).
둘째로, ibu-GPQGIWGQ-DRCG(서열 번호: 19)를 하이드로겔에 다음의 과정을 사용하여 연결시켰다. 4-아암 폴리(에틸렌 글리콜)-말레이미드(4-PEG-Mal)(20kDa, Sigma Aldrich, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)를 우선 ibu-GPQGIWGQ-DRCG(서열 번호: 19)과 1/1의 몰 비로 반응시켰다. 이후에, 4-PEG-Mal에 대해 화학량론적 비(ibu-GPQGIWGQ-DRCG(서열 번호: 19)에 의해 점유된 말레이미드 그룹의 양에도 불구하고)의 비스-시스테인 펩타이드(Genscript, 홍콩)를 반응 혼합물에 가하였다. 각각의 전구체를 PBS 완충제 속에 용해시켰다. 전형적으로, PEG 함량이 4.2%(w/v)인 117 μL의 펩타이드-가교결합된 하이드로겔을 제조하기 위하여, 5 mg의 4-PEG-Mal을 100 μL의 PBS 속에 0.40 mg의 ibu-GPQGIWGQ-DRCG(서열 번호: 19)과 함께 유리 바이알 속에 용해하였다. 다음에, 17 μL의 PBS 속에 용해된 화학량론적 양의 펩타이드 가교결합제를 용액에 가하였다.
도 8의 C에서의 개략도에 의해 입증된 바와 같이, 비스-시스테인 MMP9-민감성 펩타이드 가교결합제(GCRDGPQGIWGQDRCG; 서열 번호: 22)를 4-아암 PEG-말레이미드 및 ibu-GPQGIWGQ-DRCG(서열 번호: 19)의 완충된 혼합물에 첨가하는 것은 중력에도 불구하고 하향으로 유동하지 않은 가교결합된 하이드로겔의 형성을 야기하였다.
도 9는 1ug/ml의 임상적으로 관련된 프로테아제 농도에 대한 노출시 이부프로펜-접합된 PEG 하이드로겔로부터 달성될 수 있다는 가설을 뒷받침한다. 도 9의 A는 3일 후에 가교결합된 하이드로겔의 완전한 분해를 나타낸다. LC-MS 분석은 MMP9 용액에 하이드로겔 노출 2일 후 수집된 상층액 속에서 유리된 이부프로펜 생성 단편(ibu-GPQG, 14.6분의 용출 시간에서 LC 피크, m/z=546.20에서 MS 피크)의 존재를 입증하였다(도 9의 B). 대조적으로, 이러한 피크는 하이드로겔을 MMP9가 들어있지 않은 대조군 완충제에 노출시키는 경우 수집된 상층액으로부터는 부재한다. 사람 상처 유액 속에서 활성 MMP9의 농도는 0.3 내지 4.8 μg/ml의 범위 내에 속하므로[29-31], 도 10의 A에서 본 발명자의 데이타는 임상적으로 관련된 프로테아제 농도에서 약물 방출의 용이성을 뒷받침한다. 또한, 스페이서로서 펩타이드 서열, GPRSLSGRRCG 서열 번호: 20)은 도 10의 B에 나타낸 바와 같이, 카텝신 B 및 사람 호중구 엘라스타제(HNE)와 비교하여 MMP-9에 대해 양호한 특이성을 나타내었다.
셋째로, 다수의 프로테아제-절단가능한 하이드로겔은 4-PEG-Mal 상에서 티올-함유 펩타이드의 미카엘-유형 첨가 반응을 통해 제조하였다. 4.2%(w/v)의 4-PEG-Mal을 함유하는 117 μL의 용적의 겔은 5 mg의 4-PEG-Mal을 100 μL의 PBS 완충제 속에 용해시키고 당해 용액을 17 μL의 펩타이드 서열의 조합, 예를 들면, 0.005 mg의 GRCR-PMAVVQSVP-RCRG(서열 번호: 31) 및 0.0045mg의 GRCR-GPRSLSG-RCRG(서열 번호: 32)와 반응시킴으로써 형성시켰다.
5.2 접합체-기반 하이드로겔로부터 조율가능한 시험관 내 약물 방출
도 11의 A 내지 11의 B에 나타낸 바와 같은 고 성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로부터 측정된 정량적 데이타는, 비스-시스테인 가교결합제 또는 액커의 선택을 변화시킴으로써, 약물-접합된 하이드로겔로부터의 조율가능한 약물 방출이 달성될 수 있었음을 제시한다. 구체적으로 도 11의 A에서, 동일한 앵커(anchor) H를 사용할 때, 가교결합제를 펩타이드 xM(GCRR-GPRSLSG-RRCG, 서열 번호: 21)으로부터 펩타이드 xH(GCRD-GPQGIWGQ-DRCG, 서열 번호: 22)로 변화시킨 경우 누적된 약물 방출이 감소되었다. 또한, 도 11의 B에서, 동일한 가교결합제 xH(GCRD-GPQGIWGQ-DRCG, 서열 번호: 22)가 사용되면, 앵커를 펩타이드 H(GPQGIWGQ-DRCG, 서열 번호: 19)로부터 펩타이드 M(GPRSLSG-RRCG, 서열 번호: 20)으로 변화시킨 경우 누적된 약물 방출이 감소되었다. 도 11의 C에 나타낸 바와 같이, 3w/v%로부터 10w/v%로 하이드로겔의 중량 비를 증가시키면 로딩 용량이 증가하였고 이는 총 로딩된 투여량(total loaded dosage)의 조율가능성을 입증한다. 또한, 8-아암-PEG-말레이미드는 4-아암-PEG-말레이미드가 한 것보다 더 많은 이부프로펜을 로딩할 수 있었다.
5.3 접합된-기반 하이드로겔로부터 염증-유도된 생체 내 약물 방출
본 발명자는 또한 약물-접합된 플랫폼으로부터 약물 방출이 생체 내에서 증가된 염증에 대한 반응시 더 많은 약물 용량을 방출할 수 있음을 시사하는 예비 데이타를 수득하였다. 본 발명자는 MMP센스 프로브(MMPSense probe)에 의해 포착된 MMP의 상향조절을 유도할 수 있는 자극인자로서 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA)를 사용하여 피부 염증의 마우스 모델을 확립하였다(도 12의 A). PMA 주사 후 24시간 째에 PMA 주사 부위에서, 본 발명자는 이의 정도가 주사된 PMA 양과 관련된 적색 부위를 관찰하였다(도 12의 B). 구체적으로, 4ug의 PMA는 0.4 μg의 PMA로 유도된 것과 비교하여 보다 크고 보다 선명한 적색 부위를 유도한 반면, PMA가 없는 PBS 완충제는 피부 외형에서 어떠한 변화도 유발하지 않았다. MMP 활성은 PMA 주사 24시간 후 모니터링하였으며 형광성 신호의 정량은 유의적으로 보다 높은 MMP 활성이 0.4 μg의 PMA로 유발된 것과 비교하여, 1.9배 차이로 4 μg의 PMA까지 유도하였음을 나타내었다(도 12의 C, 12의 D). 또한, PMA가 없는 PBS 완충제 주사 부위에서 최저의 형광성 신호를 생성한 기본 양의 MMP가 존재하였다. 따라서, 피하 주사된 PMA가 많을 수록, 형광성 강도가 상승하였고; 보다 중요하게는 신호 강도에 있어서 이러한 증가는 마우스의 등 측면 상의 적색 부위의 정도와 관련되었다. PMA 주사 부위에서 피부 조직으로서 또한 연구된 단백질 발현을 ELISA 키트를 사용하여 MMP-9 정량화를 위해 회수하였다(도 12의 E). MMP-9 상향조절의 경향성을 관찰하여 주사된 상이한 농도의 PMA에 의해 유도된 염증 중증도의 변화하는 수준과 관련시켰다. 구체적으로, 4 μg의 PMA는 0.4 μg 및 0 μg의 PMA에 의해 유발된 것보다 각각 5 및 10배 차이로 유의적으로 보다 높은 양의 MMP-9를 유도하였다. 전반적으로, 증가하는 양의 PMA 피하 주사는 중증도의 수준이 증가하는 피하 염증을 유도할 수 있었고, 보다 많은 MMP-9 분비를 생성하였다.
이부프로펜-접합된 PEG 하이드로겔로부터 약물의 생체 내 염증-개시된 방출을 시험하기 위하여, ibu-M_xM 하이드로겔을 SKH-1E 마우스의 등 측면에서 염증이 있는 부위의 피하 공간 내에 이의 전구체 용액을 주사함으로써 원위치에서 형성시켰다(도 13의 A). 1일 전에 생성시킨 3개 수준의 염증 중 하나를 사용하여 약물 방출을 개시한 다음, 약물 방출의 퍼센트를 하이드로겔 주사 후 12시간 째에 겔 블롭(gel blob) 내부에 남아있는 양의 ibu-Mf를 기반으로 계산하였다. 도 13의 B는 4ug의 PMA에 노출된 부위에서 명확하지 않은 경계부를 지닌 황색 외형과는 대조적으로 PMA가 없는 주사 부위에서 하이드로겔의 무색의 투명한 외형을 나타낸다. 도 13의 C는 0.4 μg PMA 및 PMA가 없는 PBS 각각에 노출된 것으로부터 방출된 60% 및 45%의 약물과 비교하여 70%의 ibu-Mf가 4 μg의 PMA에 겔로부터 방출되었음을 나타낸다. 따라서, ibu-Mf 방출은 다양한 수준의 염증 중증도와 양으로 관련된 것으로 관찰되었으며, 이는 생체 내 프로테아제-개시된 방출 메카니즘을 입증한다. 또한, PMA의 부재하에서 방출된 약물의 45%는 가능하게는 상향조절된 MMP-9 분비와 관련된 경증 염증을 유도하여, ibu-Mf의 방출을 야기하는 PMA 및 하이드로겔 투여 동안의 주사 과정에 기인할 수 있었다. 따라서, 이러한 하이드로겔 구조는 심지어 약간의 중증도를 지닌 염증에 대해서도 민감성이었다. 하이드로겔의 프로테아제-민감성은 펩타이드 앵커 및/또는 가교결합제 구성성분을 변화시킴으로써 잠재적으로 조절할 수 있었다. 전반적으로, 보다 중증의 염증 동안 보다 많은 약물을 방출하기 위한 약물-접합된 PEG 하이드로겔의 능력은 상이한 수준의 염증 중증도를 대처하는 이의 잠재능을 시사하였다.
통계적 분석
모든 통계적 분석 및 그룹화를 OriginPro 2017로 가공하였다. 2개의 실험 그룹 사이의 모든 비교는 2 테일드 웰치스 t-시험(two tailed Welch's t-test)을 사용하여 가공하였지만, 2개 이상의 그룹 사이의 것은 Fisher LSD 사후 검정을 사용한 일원 ANOVA 분석을 사용하여 수행하였다. 0.05 미만의 P-값을 유의적인 것으로 고려하였다.
실시예 6: 모듈러 접합체-기반 하이드로겔로부터 방출된 다수의 프로테아제-개시된 시험관 내 약물
전형적으로, 본 발명자는 다음의 과정을 사용하여 20 μL의 이중-프로테아제-개시된 모듈러 접합체-기반 하이드로겔을 제조하였다. 첫째로, 10 mg의 8-아암 PEG-말레이미드(8-PEG-MAL, 40kDa)를 98.33 μL의 PBS 완충제 용액 속에서 0.5 ml의 에펜도르프 튜브 속에서 용해시켰다. 0.17 mg의 MMP-9 민감성 펩타이드(GPRSLSG-RRCG; 서열 번호: 20) 연결된 이부프로펜(Mibu, 1332.7 mmol/mg)을 1.67 μL의 디메틸 설폭사이드(DMSO) 속에 용해시키고 8-PEG-MAL 용액과 1:2의 화학량론적 비로 혼합하였다. 이후에, 1.62 mg의 MMP-9 분해가능한 펩타이드 링커(GCRR-GPRSLSG-RRCG; 서열 번호: 21) 및 1.87 mg의 HNE 분해가능한 펩타이드 링커(GRCR-PMAVVQSVP-RCRG; 서열 번호: 31)를 17 μL의 PBS 완충제 용액에 별도로 용해하고 1:1의 화학량론적 비로 혼합하였다. 최종 PEG-펩타이드 하이드로겔은 8-PEG-MAL 및 Mibu의 혼합물을 2개의 펩타이드 링커와 4;1의 화학량론적 비로 반응시켜 제조하였다. 최종 하이드로겔 용액을 각각 와동 및 3초 동안 원심분리하여 균질화하였다. 가교결합 시간은 초기 혼합 시간으로부터 출발하여 자유 유동 용액이 관찰되지 않을 때까지 관찰하여 계수하였다. 하이드로겔을 또한 가볍게 쳐서 실내 광 하에 관찰하였다. 투명하고 완전한 하이드로겔이 튜브의 바닥에서 점성이고 하이드로겔 튜브를 격렬하게 가볍게 칠때 내부에 어떠한 버블(bubble)도 형성하지 않는 경우 하이드로겔의 형성을 확인하였다. 이후에, 하이드로겔을 모든 후속적인 시험관 내 겔 분해 및 약물 방출 실험에서 사용하였다.
요약하면, 20 μl의 PEG-펩타이드 하이드로겔을 효소 혼합물 MMP-9(2μg/ml) 및 HNE(1μg/ml)의 존재 또는 부재하에서 각각 1.5 mL의 튜브 속에서 200 μl의 PBS 용액 속에 침지시켰지만, 다른 2개의 20 μl의 PEG-펩타이드 하이드로겔은 MMP-9-함유 HEPES 용액(2 μg/ml) 또는 HNE-함유 HEPES 용액(1μg/ml) 각각에 노출시켰다. 각각의 튜브를 37℃에서 항온처리하였다. 예정된 시간 간격(4, 8, 12, 24, 36, 48 시간)에서, 각각의 튜브로부터 액체 샘플의 5 μl의 분취량(aliquot)을 수집하고 15 μl의 완충제 용액에 가하여 이를 2 ml의 유리 바이알 속에서 4회 희석시켰다. 5 μl의 용적의 상응하는 완충제 용액을 각각의 튜브에 가하여 분취된 용적을 대체하였다. 모든 수집된 샘플 속에서 소화된 펩타이드 단편의 농도를 HPLC로 정량화하였다. HPLC 분석은 실온에서 수행하였다. HPLC에 사용된 이동 상은 1.0 mL/min의 유동 속도에서 35/65의 용적 비의 초순수(ultra-pure water) 및 아세토니트릴과 0.1% 트리플루오로아세트 산이었다. 검출된 스펙트럼을 약물 농도로 전환시켰고, 이를 사용하여 예정된 시점에서 약물 방출의 누적된 퍼센트를 계산하였다. 계산은 약물 방출의 누적된 양(즉각적인 약물 방출 및 예정된 시점에서 약물 손실의 합)을 각각의 하이드로겔에 사용된 펩타이드의 초기 양으로 나누어 수행하였다. 방출 프로파일은 약물 방출의 누적된 퍼센트를 방출 시간에 대해 플롯팅함으로써 생성하였다. 각각의 시점에서 데이타를 3회 실험의 평균으로부터 표준 편차와 함께 수득하였다.
하이드로겔로부터의 항염증 약물의 방출 역학을 MMP-9 또는 HNE 또는 MMP-9/HNE 혼합물을 함유하는 효소 용액의 존재에 대한 반응에서 시험관 내 시험하였다. 대조군 실험을 효소가 들어있지 않은 순수한 완충제 용액 속에서 수행하였다. 방출 프로파일은 도 19에 나타낸 바와 같이, 예정된 시점(효소 용액에 노출 후 4, 8, 12, 24, 36, 48시간째)에서 누적된 방출을 플롯팅함으로써 수득하였다. 도 19에 나타낸 바와 같이, GEP-펩타이드 하이드로겔을 MMP-9 및 HNE를 함유하는 완충제 용액에 48시간 동안 노출시켜 80% 까지의 최고의 누적된 약물 방출을 달성하였고, 이는 임의의 효소가 들어있는 않은 새로운 완충제 용액에서의 누적된 방출(7%)보다 훨씬 더 높았다. 하이드로겔을 단일 효소, MMP-9를 함유하는 완충제 용액에 노출시킨 경우, 궁극적인 누적된 방출은 71%를 달성하였고, 이는 보다 낮지만 MMP-9 및 HNE의 혼합물 속에서 최대 누적된 약물 방출에 근접하였다. 겔을 프로테아제가 없는 HEPES 완충제에 노출시키면, 48시간 째에 최대 약물 방출 양은, 완전한 하이드로겔이 하이드로겔로부터의 확산 현상에서 저항하여 수행하고 일부 약물 분자는 불충분한 확산으로 인하여 하이드로겔 매트릭스의 내부에 스턱(stuck)으로 남았으므로 MN 효소 혼합물 용액에서의 궁극적인 방출 양보다 9% 더 낮았다. 동일한 문제는 하이드로겔을 효소 HNE에 노출시키는 경우 관찰되었고, 여기서 최대 누적 약물 방출은 24%에 도달하였고, 이는 효소 HNE가 효소 MMP-9와 같은 약물 접합체을 절단할 수 없었으므로 주로 효소 MMP-9 용액 속의 방출보다 훨씬 더 낮았다. 그러나, 약물 방출 프로파일을 기준으로 하여, 소량의 약물 분자는 여전히 절단되어 하이드로겔로부터 분산될 수 있었다. 이는 주로 하이드로겔 구조를 변경시키고 용해없이 펩타이드 가교결합제를 절단시킨 수성 환경 속에서의 하이드로겔 팽윤에 기인하였다.
요약
항염증 치료제의 투여를 위해, 다수의 전략을 시도하여 중합체 골격에 물리적으로 캡슐화되는 약물 또는 영구적으로 접합하는 약물을 포함하는 약물 방출 역학의 중합체 골격에 대한 시공간적 제어를 개선시켰다[14-17]. 그러나, 이러한 시스템의 방출 역학은 염증 질환의 중증도를 변화시키도록 조절될 수 없었다. 효소를 이용하는 것은 약물 방출을 활성화시키기 위한 생물학적 실마리로서 관절염 플래어(arthritic flare) 동안 상향조절되었고, 조쉬(Joshi) 등은 트리글리세롤 모노스테아레이트(TG-18)의 자가-조립을 활용하여 하이드로겔 플랫폼 내에 코르티코스테로이드를 물리적으로 트랩핑시켰다 [20]. 그러나, 이러한 플랫폼으로부터의 약물 방출은 에스테라제에 의해 주로 TG-18 골격 상의 에스테르 결합의 절단에 의존한다. 염증 상태와 관련된 낮은 pH 환경에서 이러한 에스테르 결합의 비-효소적 가수분해[24-26]는 또한 목적하지 않은 비-특이적인 약물 방출을 야기할 수 있었다.
본 발명자의 발명은 기본적인 방출 속도에 걸쳐 개선된 제어 및/또는 염증-관련된 상태에 대한 향상된 선택성 및 특이성을 지닌 보다 우수한-성능의 약물 전달 플랫폼을 설계하는데 초점을 두었다. 전반적으로, 본 발명자는 이러한 플랫폼의 몇가지 유리한 특성을 입증하였다: (1) 다수의 통합 서브도메인으로 이루어지고, 이들 각각은 명백한 기능을 지니며 생성되고 개별적으로 대체되어 구성 물질의 화학적 조성을 변화시킴으로서 특이적인 염증-관련된 상태/질환에 대해 약물 로딩 및 약물 방출 역학을 조율할 수 있는 모듈러 시스템 설계; (2) 프로테아제-절단가능한 펩타이드를 통해 염증-반응성 하이드로겔에 대한 약물/변형된 약물의 공유결합성 접합을 통한 약물의 기본적인 방출을 유의적으로 최소화하거나 약물-함유 도메인으로서 약물-로딩된 중합체 입자를 사용하여 일부 중간의 기본 방출을 유지함으로써 기본 방출 속도를 조율하는 능력; (3) 하나 이상의 질환-특이적인 프로테아제(들)에 대한 노출시 플랫폼이 로딩된 카고(cargo)를 방출할 수 있도록 하여, 질한의 염증 중증도와 관련하여 조절된 투여량을 방출하는 이의 특이성을 잠재적으로 향상시키는 펩타이드 서열의 조합. 이러한 장점은 하기 수개의 예에서 입증된다.
단일 또는 다수의 프로테아제 반응성을 지닌 모듈러 미립자-기반 하이드로겔
본 발명자는 염증 질환과 관련된 상승된 프로테아제 활성에 대한 노출시 항염증 약물을 방출하도록 개시될 수 있는 모듈러 하이브리드 하이드로겔을 개발하였다. 프로테아제 활성에 대한 노출시, 하이드로겔 매트릭스는 단백질분해적으로 분해되어 봉매된 입자를 유리시키고 후속적으로 목적한 치료학적 페이로드를 전달할 수 있었다. 하이브리드 하이드로겔의 모듈러 설계는 이의 프로테아제-절단가능하고 약물-로딩된 서브도메인의 독립된 최적화를 가능하도록 함으로써, 하이드로겔 형성, 조율가능한 방출 속도에서 목적한 페이로드를 궁극적으로 전달하기 위한 매트릭스-메탈로프로테아제-9(MMP-9)에 의한 절단가능성. 시험관 내 연구는 항염증성 대식구에 의한 TNF-α 생산의 효과적인 억제를 위한 하이브리드 겔 시스템으로부터 약물 방출의 프로테아제-개시된 향상을 입증하였고 약물-유도된 세포독성을 완화시키는 이의 잠재능을 제시하였다. 비-침입성 영상화를 사용하여 생체물질-유도된 숙주 반응에서 반응성 산소 종의 활성을 모니터링함으로써, 본 발명자는 하이브리드 하이드로겔 및 이의 구성 물질이 면역-억제된 마우스에서 이의 피하 주사 후 5일 째에 부정적인 면역 반응을 유도하지 않았음을 입증하였다. 본 발명자는 후속적으로 이러한 하이드로겔을 MMP-9에 대한 노출시 약물을 방출할 수 있는 시판 상처 드레싱에 혼입시켰다. 이와 함께, 본 발명자의 발견은 이러한 하이브리드 하이드로겔이 주사가능한 또는 국소 적용을 통해 주문형 약물을 전달하여 만성 질환에서 염증을 조절하기 위한 다양한 플랫폼일 수 있음을 제시하였다.
단일 또는 다수의 프로테아제 반응성을 지닌 모듈러 접합체-기반의 하이드로겔
항염증 약물과 접합된 모듈러 하이드로겔 시스템을 또한 개발하였다. 본 발명자는 치료학적 약물의 개시된 방출을 단일 또는 이중 프로테아제 자극으로 달성할 수 있다. 일부 구현예에서, 약물-접합된 하이드로겔 시스템의 약물 로딩 용량은 하이드로겔 골격인 폴리에틸렌 글리콜의 구조를 조작함으로써 증가시킬 수 있었다. 약물 방출 속도는 프로테아제-절단가능한 펩타이드 앵커 및 펩타이드를 변화시킴으로써 조율하였다. 또한, 생체 내 프로테아제-개시된 약물 방출은 상이한 중증도 수준을 지닌 화학적으로 유도된 피하 염증의 모델을 사용하여 입증되었다.
참고 문헌
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Arginine. <400> 34 Xaa Xaa Xaa Gly 1 <210> 35 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GRCR-APEEIMDRQ-RCRG <400> 35 Gly Arg Cys Arg Ala Pro Glu Glu Ile Met Asp Arg Gln Arg Cys Arg 1 5 10 15 Gly <210> 36 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GRCR-GPQGIWGQ-RCRG <400> 36 Gly Arg Cys Arg Gly Pro Gln Gly Ile Trp Gly Gln Arg Cys Arg Gly 1 5 10 15 <210> 37 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GRCR-GRRGLG-RCRG <400> 37 Gly Arg Cys Arg Gly Arg Arg Gly Leu Gly Arg Cys Arg Gly 1 5 10 <210> 38 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GRCR- DGFLGDD-RCRG <400> 38 Gly Arg Cys Arg Asp Gly Phe Leu Gly Asp Asp Arg Cys Arg Gly 1 5 10 15 <210> 39 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> xM scrambled <400> 39 Gly Cys Arg Arg Ser Ser Arg Gly Gly Pro Leu Arg Arg Cys Gly 1 5 10 15 <210> 40 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M scrambled <400> 40 Ser Ser Arg Gly Gly Pro Leu Arg Arg Cys Gly 1 5 10

Claims (29)

  1. a) 입자 속에 캡슐화된(encapsulated) 약물;
    b) 작용성 모이어티(unctional moiety)를 지닌 다중-아암-폴리에틸렌 글리콜(multi-arm-polyethylene glycol)(PEG)을 포함하는 중합체 빌딩 블록(polymer building block); 및
    c) 작용성 모이어티를 함유하는 2개의 스페이서 서열(spacer sequence)에 의해 플랭킹된(flanked) 프로테아제-절단가능한 기질을 포함하는 비스-작용성 프로테아제-민감성 가교결합제를 포함하는, 약물-로딩된 프로테아제-반응성 하이드로겔(drug-loaded protease-responsive hydrogel)로서;
    여기서 상기 b)의 중합체 빌딩 블록이 c)의 프로테아제-절단가능한 가교결합제의 존재하에서 겔을 형성하여 a)의 입자를 트랩핑하는(entrapping), 약물-로딩된 프로테아제-반응성 하이드로겔.
  2. 제1항에 있어서,
    a) 작용성 모이어티를 함유하는 스페이서 서열에 의해 플랭킹된, 상기 c)의 가교결합제의 것에 대한 상이한 프로테아제에 대해 민감성인, 프로테아제-절단가능한 기질을 포함하는 적어도 제2의 비스-작용성 프로테아제-민감성 가교결합제; 및/또는
    b) 프로테아제-내성 기질을 포함하는 추가의 비스-작용성 프로테아제-내성 가교결합제를 추가로 포함하는, 약물-로딩된 프로테아제-반응성 하이드로겔.
  3. 제1항 또는 제2에 있어서, 약물이 실리카, 리포좀, siRNA 복합체 또는 중합체성 물질, 예를 들면, 폴리카프로락톤, 폴리(메타크릴산), 폴리락트산, 폴리비닐피롤리돈, 폴리(락틱-코-글리콜산)(PLGA), 및 젤라틴을 포함하는 그룹으로부터 선택된 물질을 포함하는 입자 내에 캡슐화되는, 약물-로딩된 프로테아제-반응성 하이드로겔.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 중합체 빌딩 블록이 다중-아암-PEG-비닐 설폰 또는 다중-아암-PEG 말레이미드 또는 다중-아암-PEG-아지드 또는 다중-아암-PEG-알킨을 포함하는, 약물-로딩된 프로테아제-반응성 하이드로겔.
  5. a) 작용성 모이어티를 갖는 프로테아제-절단가능한 펩타이드 앵커(protease-cleavable peptide anchor)에 공유결합으로 접합된 약물;
    b) 적어도 하나의 작용성 모이어티를 갖는 다중-아암-PEG 중합체를 포함하는 중합체 빌딩 블록; 및
    c) 작용성 모이어티를 함유하는 스페이서 서열에 의해 플랭킹된 펩타이드 기질을 포함하는 비스-작용성 가교결합제를 포함하는 약물-로딩된 프로테아제-반응성 하이드로겔로서;
    여기서 펩타이드 앵커의 작용성 모이어티는 다중-아암 PEG 중합체의 아암에 약물을 공유결합으로 연결시키고, 여기서 상기 중합체 빌딩 블록의 작용성 모이어티가 상기 비스-작용성 가교결합제의 상기 모이어티에 공유결합으로 연결되어 겔을 형성하는, 약물-로딩된 프로테아제-반응성 하이드로겔.
  6. 제5항에 있어서,
    a) 상기 가교결합제가 프로테아제에 대해 절단가능하지 않거나;
    b) 상기 펩타이드 앵커가 프로테아제에 대해 절단가능하고 상기 가교결합제는 동일하거나 상이한 프로테아제에 대해 절단가능하고/하거나;
    c) 상기 약물-로딩된 하이드로겔이 다수의 가교결합제를 포함하고, 이들 중 하나 이상은 상이한 프로테아제에 대해 절단가능한, 약물-로딩된 프로테아제-반응성 하이드로겔.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 중합체 빌딩 블록이 다중-아암-PEG-비닐 설폰 또는 다중-아암-PEG-비닐 말레이미드 또는 다중-아암-PEG-아지드 또는 다중-아암-PEG-알킨을 포함하는, 약물-로딩된 프로테아제-반응성 하이드로겔.
  8. 제7항에 있어서, 2 내지 12 wt%의 다중-아암-PEG-비닐 말레이미드를 포함하는, 약물-로딩된 프로테아제-반응성 하이드로겔.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 다중-아암-PEG 중합체가 3 내지 8개의 아암을 갖는, 약물-로딩된 프로테아제-반응성 하이드로겔.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 약물이 항염증성(anti-inflammatory)인, 약물-로딩된 프로테아제-반응성 하이드로겔.
  11. 제10항에 있어서, 약물이 비-스테로이드성 항염증 약물(non-steroidal anti-inflammatory drug; NSAID)인, 약물-로딩된 프로테아제-반응성 하이드로겔.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 프로테아제가 염증 동안 상향조절(upregulating)되고 매트릭스 메탈로프로테이나제, 세린 프로테아제, 시스테인 프로테아제 및 아스파르틱 프로테아제를 포함하는 그룹으로부터 선택되는, 약물-로딩된 프로테아제-반응성 하이드로겔.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플랭킹 스페이서 서열이 적어도 하나의 시스테인 및/또는 라이신 잔기 및/또는 아지드- 또는 알킨-함유 비천연 아미노산을 포함하는, 약물-로딩된 프로테아제-반응성 하이드로겔.
  14. 제13항에 있어서, 상기 플랭킹 스페이서 서열이 1 내지 6개 아미노산의 서열을 포함하는, 약물-로딩된 프로테아제-반응성 하이드로겔.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 프로테아제-절단가능한 기질이 매트릭스 메탈로프로테이나제, 예를 들면, 메탈로프로테이나제-9(MMP-9), MMP-2, MMP-7, MMP-12 등, 카텝신, 예를 들면, 카텝신 K, 카텝신 B, 카텝신 S 등, 사람 호중구 엘라스타제(HNE), 카스파제 및 우로키나제를 포함하는 그룹으로부터 선택된 프로테아제에 대해 민감성인, 약물-로딩된 프로테아제-반응성 하이드로겔.
  16. 제15항에 있어서, 프로테아제-절단가능한 기질이 KGPRSLSGK(서열 번호: 30), GPRSLSG(서열 번호: 10), LGRMGLPGK(서열 번호: 11), AVRWLLTA(서열 번호: 12) 또는 GPQGIWGQ(서열 번호: 13)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 MMP-9 기질; APEEIMDRQ(서열 번호: 14) 또는 PMAVVQSVP(서열 번호: 15)를 포함하는 HNE 기질; GRRGLG(서열 번호: 16) 또는 DGFLGDD(서열 번호: 17)를 포함하는 카텝신 B 기질 또는 이의 조합을 포함하는 그룹으로부터 선택되는, 약물-로딩된 프로테아제-반응성 하이드로겔.
  17. 주사 또는 국소 투여용으로 제형화된, 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 약물-로딩된 프로테아제-반응성 하이드로겔을 포함하는 조성물.
  18. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 약물-로딩된 프로테아제-반응성 하이드로겔을 포함하는 드레싱(dressing).
  19. 이를 필요로 하는 대상체(subject)를 치료하기 위한 주사가능한 또는 국소 드레싱으로서 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 약물-로딩된 프로테아제-반응성 하이드로겔 또는 제17항에 따른 조성물의 용도.
  20. 유효량의 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 약물-로딩된 프로테아제-반응성 하이드로겔 또는 제17항에 따른 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함을 포함하는 치료 방법.
  21. a) 입자 속에 캡슐화된 약물;
    b) 작용성 모이어티를 갖는 다중-아암-폴리에틸렌 글리콜(PEG)를 포함하는 중합체 빌딩 블록; 및
    c) 작용성 모이어티를 함유하는 2개의 스페이서 서열에 의해 플랭킹된 프로테아제-절단가능한 기질을 포함하는 비스-작용성 프로테아제-민감성 가교결합제를 포함하는 키트(kit)로서,
    여기서 a) 내지 c)는 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 키트; 떤,ㄴ
    a) 작용성 모이어티를 갖는 프로테아제-절단가능한 펩타이드 앵커에 공유결합으로 접합된 약물;
    b) 적어도 하나의 작용성 모이어티를 갖는 다중-아암-PEG 중합체를 포함하는 중합체 빌딩 블록; 및
    c) 작용성 모이어티를 함유하는 스페이서 서열에 의해 플랭킹된 펩타이드 기질을 포함하는 비스-작용성 가교결합제를 포함하는 키트로서,
    여기서 a) 내지 c)는 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 키트.
  22. a) 작용성 모이어티를 갖는 다중-아암-폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함하는 중합체 빌딩 블록을 약물-로딩된 입자와 혼합하는 단계;
    b) 작용성 모이어티를 함유하는 스페이서 서열에 의해 플랭킹된 프로테아제-절단가능한 기질을 포함하는 비스-작용성 프로테아제-민감성 가교결합제를 약물-로딩된 중합체성 입자와 혼합하는 단계;
    c) a) 및 b)의 혼합물을 함께 혼합하는 단계를 포함하는, 약물-로딩된 프로테아제-반응성 하이드로겔을 제조하는 방법으로서;
    여기서 상기 a)의 중합체 빌딩 블록은 b)의 프로테아제-절단가능한 가교결합제의 존재하에서 겔을 형성하여 약물-로딩된 입자를 트랩핑하는, 방법.
  23. a) 작용성 모이어티를 갖는 펩타이드 앵커에 공유결합으로 접합된 약물을 적어도 하나의 작용성 모이어티를 갖는 다중-아암-PEG 중합체를 포함하는 중합체 빌딩 블록과 혼합하는 단계로서, 여기서 펩타이드 앵커의 각각의 작용성 모이어티와 다중-아암-PEG 중합체는 공유 결합하여 약물을 다중-아암 PEG 중합체의 아암에 접합시키는 단계;
    b) a)의 약물-중합체 접합체를 작용성 모이어티를 함유하는 스페이서 서열에 의해 플랭킹된 펩타이드 기질을 포함하는 비스-작용성 가교결합제와 혼합시키는 단계를 포함하는, 약물-로딩된 프로테아제-반응성 하이드로겔을 제조하는 방법으로서;
    여기서 상기 중합체 빌딩 블록의 작용성 모이어티는 상기 비스-작용성 가교결합제에 공유결합으로 연결되어 겔을 형성하는, 방법.
  24. 제23항에 있어서,
    a) 상기 펩타이드 앵커가 프로테아제로 절단가능하고 상기 가교결합제는 프로테아제로 절단가능하지 않거나;
    b) 상기 펩타이드 앵커가 프로테아제로 절단가능하고 상기 가교결합제는 동일하거나 상이한 프로테아제로 절단가능하고/하거나;
    c) 상기 약물-로딩된 하이드로겔이 다수의 가교결합제를 포함하고, 이들 중 하나 이상은 상이한 프로테아제로 절단가능한, 방법.
  25. 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 약물, 중합체성 입자, 가교결합제, 절단가능한 앵커 및/또는 중합체 빌딜 블록이 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은, 방법.
  26. a) 입자 속에 캡슐화된 약물과, 작용성 모이어티를 함유하는 2개의 스페이서 서열에 의해 플랭킹된 프로테아제-절단가능한 기질을 포함하는 비스-작용성 프로테아제-민감성 가교결합제의 혼합물을 제조하는 단계;
    b) 입자 속에 캡슐화된 약물과 작용성 모이어티를 갖는 다중-아암-폴리에틸렌 글리콜(PEG)로 구성된 중합체 빌딩 블록의 혼합물을 제조하는 단계;
    c) a) 및 b)를 함께 혼합하고, 혼합물을 드레싱 위에 침착시켜 겔화를 허용하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 약물-로딩된 프로테아제-반응성 하이드로겔을 포함하는 복합 드레싱(composite dressing)을 제조하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 드레싱이 알기네이트 상처 드레싱인, 방법.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 단계 d)를 추가로 포함하고, 여기서 복합 드레싱은 액체 질소 속에서 섬광-동결(flash-freezing)되고 동결건조되는, 방법.
  29. 제22항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 약물이 NSAID이고; 입자가 폴리(락틱-코-글리콜산)(PLGA)을 포함하고; 가교결합제 및/또는 앵커가 매트릭스 메틸프로테이아제 및 세린 프로테아제 또는 이의 조합을 포함하는 그룹으로부터 선택된 프로테아제에 대해 절단가능하고; 중합체 빌딩 블록이 4- 또는 8-아암-PEG-비닐 설폰 또는 4- 또는 8-아암-PEG-비닐 말레이미드 또는 4 또는 8-아암-PEG-아지드 또는 4 또는 8-아암-PEG-알킨을 포함하는, 방법.
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