HRP20020672A2 - Pluraflavins and derivatives thereof, process for their preparation and use thereof - Google Patents

Description

Predloženi izum se odnosi na nove spojeve formule I

[image]

u kojoj su R1, R2, R3, R4, R5, R6, R8, R10 i n definirani kao dolje. Spojevi formule I inhibiraju transkriptazu, imaju citostatičko djelovanje i posebno su prikladni za liječenje tumora. Spojevi formule I mogu se dobiti uzgojem vrste Actinomycetales HAG 003959, DSM 12931, u mediju za kulturu. S tim u skladu, izum se odnosi na postupak za pripravu spojeva formule I, upotrebu spojeva za pripravu lijekova za liječenje malignih poremećaja i bolesti koje se mogu liječiti inhibicijom transkriptaze, i na farmaceutske pripravke koji sadrži najmanje jedan spoj formule I.

Rak je bolest ljudi i životinja, koja je u većini slučajeva kobna i koju općenito uzrokuje nekontrolirani rast endogenih stanica. Rak je pojam koji se koristi za tvorbu malignih tumora (malignacija), neoplazmi (tumora ili karcinoma) ili za malignu degeneraciju i loše dozrijevanje bijelih krvnih stanica (leukemija). Stanice raka ili tumora nastaju općenito transformacijom endogenih stanica. Malignacija stanica raka ekspresionira se sama autonomnim rastom, tj. ona je sposobna za rast bez inhibicije i bez integracije u sistem organa i infiltracije, s destrukcijom tkiva. Siguran znak malignacije je tvorba metastaza daleko od tumora nakon hematogenog ili limfogenog širenja tumorskih stanica. Rak je jedan od najčešćih uzroka smrti ljudi i stoga postoji velika potreba za metodama i sredstvima za liječenje raka ili za liječenje malignih degeneracija.

Osim radikalnog pristupa kirurškog odstranjivanja tumora, mogućnosti za terapiju malignih tumora uključuju radioterapiju sa X-zrakama, α-, β-, γ-zrakama, imuno-terapiju i kemoterapiju. Za sada, primjena imunoterapije je ograničena. Pod kemoterapijom tumora se podrazumijeva davanje staničnih toksina (citostatika) za liječenje od tumora i preostalih tumorskih stanica općenito nakon lokalnog kirurškog zahvata ili zračenja. Te tvari djeluju specifično u određenim procesima dijeljenja stanice, tako da tkiva, koja imaju visok udio stanica koje se dijele, reagiraju osjetljivo, kao što su tumorska tkiva koja brzo rastu. Sredstva koje se upotrebljavaju su spojevi za alkiliranje, kao što je, na primjer, ciklofosfamid (Merckov popis, 12. izd., str. 463), antimetaboliti, kao metotreksat (Merckov popis, 12. izd., str. 1025), alkaloidi, kao vinkristin (Merckov popis, 12. izd., str. 1704) i antibiotici, kao daunomicin (Merckov popis, 12. izd., str. 479), i adriamicin (Merckov popis, 12. izd., str. 581-582). Međutim, zbog velikih sporednih efekata, sva ta sredstva imaju značajne nedostatke, tako da se smrt bolesne osobe može u mnogim slučajevima samo odgoditi, ali ne i spriječiti.

Osim toga, degenerirane stanice (raka) postaju otporne prema upotrijebeljenim sredstvima; u tom slučaju, konvencionalni lijekovi nemaju više nikakvo citostatičko djelovanje, već su oni toksični zbog sporednih učinaka. Osim toga, nađeno je da kombinirana i/ili uzastopna upotreba citostatika premašuje djelovanje pojedinačnih citostatika (monoterapija), i zbog toga je moguće da se značajni sporedni efekti u polikemoterapiji ne mogu zbrajati. Zbog svih tih razloga hitno su potrebni novi kemoterapeutici i oni se istražuju širom svijeta.

Iznenađujuće je pronađeno da podvrsta mikroorganizma vrste Actinomycetales HAG 003959, DSM 12931, može proizvesti nove citostatike visoke učinkovitosti koji inhibiraju rast stanice čak pri vrlo niskim koncentracijama. Ovdje dolje, novi spojevi se navode kao pluraflavini, i oni, zajedno s pluraflavinskim derivatiima tvore dio glavnog predmeta izuma. Pluraflavini su antibiotici koji sadrže kostur p-kinoidnog prstena i razne šećerne dogradne blokove. Oni inhibiraju transkripciju unutarnjim cijepanjem dvostrukih uzvojnica nukleinske kiseline, prema potrebi dodatnim alkiliranjem. Prstenasti kostur su prvi puta opisali S. Kondo et al. u Journal of Antibiotics, sv. 30, str. 1143-1145, 1977, kao dio pluramicina. Kasnije je taj prstenasti kostur nađen u mnoštvu antibiotika; osim pluramicina i neopluramicina, spojevi saptomicini (N. Abe et al., J. Antibiotics, 46, 1536-1549, 1993), ankinomicin (Y. Sato et al., J. Antibiotics 42, 149, 1989), kidamicin (N. Kanda et al., J. Antibiotics, 24, 599, 1971), hedamicin (U. Sekin et al., Tetrahedron, 34, 761, 1978) i altromicini (G.M. Brill et al., J. Antibiotics, 43, 229-237, 1990) su opisani kao strukturno srodni spojevi. Tvari poznate iz stanja tehnike često imaju nedostatke koji se pokazuju u njihovoj nedovoljnoj učinkovitosti, visokoj toksičnosti i/ili nepoželjnim sporednim učincima.

S tim u skladu, predloženi izum se odnosi na spojeve formule (I)

[image]

u kojoj

R1 je skupina šećera;

R2 je -COOH ili -CH2-O-(R7)m, gdje

R7 je šećerna skupina; i

R3 je odabran između skupina koje sadrže epoksid, C1-C6-alkilnih skupina i C2-C6-alkenilnih skupina, pri čemu su spomenute alkilne skupine i alkenilne skupine prema potrebi supstituirane s najmanje jednom OH skupinom;

R5je odabran između vodikovog atoma, C1-C6-alkilnih skupina, C2-C6-alkenilnih skupina i C2-C6-alkinilnih skupina;

svaki od R4, R6, R8 i R10 je neovisno odabran između vodikovih atoma, C1-C6-alkilnih skupina, C2-C6-alkenilnih skupina, C2-C6-alkinilnih skupina, -X2H i -X2R12, ili

R4 i R6 zajedno i/ili R8 i R10 zajedno predstavljaju skupinu =X2,

X2 je O, -NH, -N-C1-C6-alkil, -N-C2-C6-alkenil, -N-C2-C6-alkinil ili S,

R12 je C1-C6-alkil, C2-C6-alkenil, C2-C6-alkinil, aril ili acil; i

m i n su međusobno neovisno 1 ili 2;

u svim njihovim stereokemijskim oblicima i smjesama tih oblika u bilo kojem omjeru, i njihove fiziološki prihvatljive soli.

U formuli (I)

C1-C6-alkil je alkil koji ima ravan ili razgranati lanac i koji ima od 1 do 6 ugljikovih atoma, na primjer metil, etil, izopropil, terc-butil i heksil.

C2-C6-alkenil je alkenil koji ima ravan ili razgranati lanac i koji ima od 2 do 6 ugljikovih atoma, na primjer, alil, krotil i pentenil.

C2-C6-alkinil je alkinil koji ima ravan ili razgranati lanac i koji ima od 2 do 6 ugljikovih atoma, na primjer, propinil, butinil i pentinil.

Aril je aromatska prstenasta struktura, na primjer, fenil, benzil ili 1- ili 2-naftil. Aril može biti prema potrebi supstituiran, na primjer s halogenim, kao što je klor, brom, fluor, s alkilom koji ima 1-4 ugljikova atoma, na primjer s metilom, s hidroksilom, s alkoksi koji ima 1-4 ugljikova atoma, na primjer s metoksi, i/ili s trifluormetilom.

Acil može biti alifatska ili aromatska acilna skupina. Alifatski acil ima 1-7 ugljikovih atoma, na primjer 1-4 ugljikova atoma, kao što je, formil, acetil, propionil, butiril, heksanoil, akriloil, krotonoil, propionil, koji može biti supstituiran dalje, na primjer s halogenim, kao što je klor, brom, fluor, s amino, i/ili s alkilamino koji ima 1-4 ugljikova atoma, kao što je metil- ili etilamino skupina. Aromatski acil može, na primjer, biti benzoil ili naftoil, koji može također biti supstituiran dalje, na primjer s halogenim, kao što je klor, brom, fluor, s alkilom koji ima 1-4 ugljikova atoma, na primjer s metilom, s hidroksilom, s amino skupinama, kao što je, primjer etilamino, ili s alkoksi skupinama koje imaju 1-7 ugljikovih atoma, kao 1-4 ugljikova atoma, na primjer s metoksi.

Šećer (R1/R7) je monosaharid (n = 1) ili disaharid (n = 2), pri čemu su dva monosaharida povezana glikozidno. Monosaharid može biti heksoza (C6H12O6), na primjer aldoheksoza, kao što je D-(+)-glukoza, D-(+)-manoza ili D-(+)-galaktoza. Monosaharid može biti mono-, di- ili tri-supstituiran, međusobno neovisno, sa supstituentom iz niza koji čine H, OH, NH2, NH(alkil), N(alkil)2, alkil i alkoksi, pri čemu H i/ili OH monosaharida može biti prema potrebi zamijenjen sa supstituentima. Pojam "šećer", kako se ovdje rabi, uključuje amino šećere. Amino šećer je monosaharid ili disaharid prema potrebi supstituiran kako je opisano pri čemu je najmanje jedna OH skupina ili H mono- ili disaharida je zamijenjena s amino skupinom kao što je NH2, NH(alkil) ili N(alkil)2.

U jednoj izvedbi, m je 1,

R7 može biti skupina amino šećera formule (II)

[image]

u kojoj

svaki od R13, R14, R16, R18, R20, R22, R24, R26 i R28 je neovisno odabran iz niza koji čine H, OH, NH2, NH-alkil, N(alkil)2 i alkoksi, pri čemu alkil i alkoksi imaju od 1 do 4 ugljikova atoma.

Primjeri C1-C4-alkila jesu, na primjer, metil, etil, propil, izobutil i butil, posebno metil, a primjeri C1-C4-alkoksi jesu, na primjer, metoksi, etoksi, izopropoksi ili butoksi, posebno metoksi.

R7 može biti amino šećer formule (IIA):

[image]

R1 može također biti amino šećer.

U jednoj izvedbi, n je 2.

R1 može biti skupina formule (III)

[image]

u kojoj R30 do R60, neovisno jedan o drugom predstavljaju H, OH NH2, NHalkil, N(alkil)2, ili alkoksi, pri čemu alkil je C1-C4 skupina, kao što je metil, etil, propil, izobutil i butil, posebno metil, i O-alkil je C1-C4-alkoksi, na primjer metoksi, etoksi, izopropoksi ili butoksi, posebno metoksi.

R1 u jednoj izvedbi ima formulu (IIIA)

[image]

R3 može biti skupina koja sadrži epoksid. Skupina koja sadrži epoksid može biti ravna ili razgranata alkilna ili alkenilna skupina koja ima od 2 do 12 ugljikovih atoma, kao 2 do 6 ugljikovih atoma, koja sadrži jedan ili dva epoksidna prstena (oksirani). Mogući primjeri jesu:

[image]

[image]

R3 koji je različit od skupine koja sadrže epoksid može biti alkil ravnog ili razgranatog lanca koji ima od 1 do 12 ugljikovih atoma, kao 1 do 6 ugljikovih atoma, kao što je, na primjer, metil, etil, izopropil, terc-butil, heksil, i također, na primjer, oktil, dodecil, ili alkenil ravnog ili razgranatog lanca koji ima od 2 do 12 ugljikovih atoma, kao 2 do 6 ugljikova atoma, na primjer, alil, krotil, pentenil, i također dodecenil, pri čemu te alkilne ili alkenilne skupine mogu također biti mono- ili polisupstituirane, na primjer s hidroksilom.

S tim u skladu, izum se odnosi na pluraflavin A formule (IA)

[image]

na pluraflavin B formule (IB)

[image]

i na pluraflavin E formule (IE)

[image]

u kojoj

heksoza I je 2,6-didezoksialdoheksoza;

heksoza II je 2,3,6-tridezoksi-3-dimetilaminoheksoza i

heksoza III je 2,3,6-tridezoksi-3-amino-3-metil-aldo-heksoza,

u njihovim stereokemijskim oblicima i smjese tih oblika u bilo kojem omjeru, i na njihove fiziološki prihvatljive soli.

U jednoj izvedbi, spojevi su odabrani između onih formula (IA), (IB) i (IE), u kojoj

heksoza I je olioza,

heksoza II je rodozamin i

heksoza III je 3-epi-vankozamin.

Prema izumu, spojevi formule I se mogu dobiti uzgojem, na primjer fermentacijom, vrste Actinomycetales HAG 003959, DSM 12931, ili njezine varijante ili mutanta, pod prikladnim uvjetima u mediju za kulturu, sve dok se u mediju za kulturu dobije najmanje jedan pluraflavin formule (IA), (IB) i/ili (IE). Zatim se pluraflavini mogu izolirati iz medija za kulturu i očistiti, prema potrebi prevesti u njihove derivate i/ili u njihove fiziološki prihvatljive soli.

Izum se, nadalje, odnosi na postupak za pripravu spoja formule I koji obuhvaća uzgoj, na primjer fermentacijom, mikroorganizma vrste Actinomycetales HAG 003959, DSM 12931, ili njegove varijante ili mutanata, pod prikladnim uvjetima u mediju za kulturu, sve dok se u mediju za kulturu dobije najmanje jedan pluraflavin formule (IA), (IB) i/ili (IE) , izolaciju najmanje jednog od pluraflavina iz medija za kulturu i, prema potrebi, pretvorbu u kemijske derivate i/ili fiziološki prihvatljive soli.

Podvrsta HAG 003959, DSM 12931, njezini mutanti i/ili njezine varijante se u jednoj izvedbi, uzgajaju u hranjivoj otopini (koju se također spominje kao medij za kulturu) koja sadrži najmanje jedan izvor ugljikovih atoma i najmanje jedan izvor dušikovih atoma i uobičajene anorganske soli, sve dok se u mediju za kulturu dobije najmanje jedan novi pluraflavin; pluraflavini se mogu zatim izolirati iz medija za kulturu i, prema potrebi, rastaviti na pojedinačne aktivne komponente.

Uzgajanje se može provesti pod aerobnim uvjetima. Uzgajanje se može provesti pri temperaturi u području od 18 do 35°C i pri pH u području od 6 do 8.

U literaturi je opisan velik broj reakcija za kemijsku derivatizaciju kinona. S tim u skladu derivatizacija kinonskog oblika predloženih spojeva može se provesti primjenom kemijskih reakcija koje su kao takove poznate. Redukciju spojeva u oblik hidrokinona može se provesti, na primjer, katalitički s vodikom, ili s metalnim hidridima, kao što je aluminijev hidrid ili borov hidrid. Daljnji prikladan primjer je pretvorba kinona s hidroksilaminom ili s njegovim derivatima u oksime, koji se opet sa svoje strane mogu dalje kemijski mijenjati.

S tim u skladu, izum se odnosi na spoj formule (IV) :

[image]

u kojoj su R1, R2, R3 i n definirani kao gore, u svim njegovim stereokemijskim oblicima i smjesama tih oblika u bilo kojem omjeru, i njegove fiziološki prihvatljive soli ili njegove derivate.

Derivati pluraflavina formula (IVA), (IVB) i (IVE) (dolje) su dobiveni iz pluraflavina formula (IA), (IB) i (IE), i oni također tvore dio ovog izuma.

Izum se nadalje odnosi na: spoj formule (IVA)

[image]

spoj formule (IVB)

[image]

i spoj formule (IVE)

[image]

u svim njihovim stereokemijskim oblicima i smjesama tih oblika u bilo kojem omjeru, i na njihove fiziološki prihvatljive soli.

Ovdje dolje izum je opisan u pojedinostima, na primjer u najmanje jednoj izvedbi.

Pluraflavini prema izumu su proizvedeni s vrstama Actinomycetales, u jednoj izvedbi s vrstom Actinomycetales HAG 003959, DSM 12931. Vrsta Actinomycetales HAG 003959, DSM 12931, ima bež-crveni micelij i može se identificirati s konidioforama koje su tipične za aktinomicete.

Taksonomno ispitivanje mikroorganizma vrste Actinomycetales HAG 003959, DSM 12931, dalo je slijedeće rezultate određivanja podvrste: dijagnostički važna analiza masnih kiselina s plinskom kromatografijom pokazala je visoki udio:

anteiso 15:0 masne kiseline,

izo 16:0 masne kiselina (izopalmitinska kiselina),

izo 17:0 masne kiselina (izomargarinska kiselina),

anteiso 17:0 masne kiselina (anteizomargarinska kiselina) i

cis[9] 18:1 masne kiselina (oleinska kiselina), dodatno s nižim koncentracijama drugih masnih kiselina.

Ovakav profil sastava masnih kiselina dozvoljava da se Actinomycetales HAG13 003959 (DSM 12931) taksonomno svrsta u rod Saccharothrixa.

Izolat mikroorganizma je pohranjen u "Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zelikulturen GmbH", Mascheroder Weg 1B, D 38124 Braunschweig, Njemačka (Njemačka zbirka mikroorganizama i staničnih kultura) u skladu s propisima Konvencije iz Budimpešte od 16. jula 1999. pod slijedećim brojem: Actinomγcetales vrsta HAG 003959, DSM 12931.

Umjesto podvrste Actinomycetales vrste HAG 003959, DSM 12931, također se je moglo upotrijebiti i njezine mutante i varijante koji sintesiziraju najmanje jedan od spojeva pluraflavina prema izumu. Takovi mutanti se mogu proizvesti na poznati način s fizičkim sredstvima, na primjer ozračivanjem, npr. s ultraljubičastim ili X-zrakama, ili s kemijskim mutagenima, kao što su na primjer etil metan-sulfonat (EMS), 2-hidroksi-4-metoksibenzofenon (MOB) ili N-metil-N'-nitro-N-nitrozogvanidin (MNNG).

Postupak prema izum može se primijeniti za fermentaciju u laboratorijskom mjerilu (područje od mililitre do litre) ili u industrijskom mjerilu (volumena kubičnog metra). Ako nije navedeno drugačije, svi postoci su maseni. U slučaju tekućina, omjeri miješanja se temelje na volumenu, ako nije navedeno drugačije.

U jednoj izvedbi, izvor ugljikovih atoma za aerobnu fermentaciju su ugljikohidrati koji se mogu asimilirati i šećerni alkoholi, kao što je glukoza, laktoza, saharoza ili D-manitol, i prirodni proizvodi koji sadrže ugljikohidrate, kao što je, na primjer, ekstrakt slada. Prikladan izvor dušikovih atoma za uzgoj su amino kiseline, peptidi i proteini i proizvodi njihove degradacije, kao što su peptoni ili triptoni, nadalje mesni ekstrakti, ekstrakti kvaščevih gljivica, smljevene sjemenke, na primjer kukuruza, pšenice, graha, soje ili pamuka, ostaci od destilacije pri proizvodnji alkohola, mesno brašno ili ekstrakti kvaščevih gljivica, ali također i amonijeve soli i nitrati. Anorganske soli sadržane u hranjivoj otopini mogu biti, na primjer, kloridi, .karbonati, sulfati ili fosfati alkalijskih metala ili zemno alkalijskih metala, željeza, cinka, kobalta i mangana.

Tvorba pluraflavina prema izumu odvija se u mediju za kulturu koji sadrži otprilike 0,1 do 5%, kao 0,3 do 2%, glukoze i 0,2 do 5%, kao 0,5 do 3%, sojinog brašna i 0,05 do 2%, kao 0,2 do 1,0 g/l namočenog kukuruza i 0,05 do 1,0 g/l, kao 0,1 do 0,5%, kalcijevog karbonata i 0,05 do 1,0 g/l, kao 0,1 do 1,0 g/l, natrijevog klorida. Postoci se u svakom slučaju odnose na masu ukupnog medija za kulturu.

U mediju za kulturu vrsta Actinomγcetales HAG 003959, DSM 12931, proizvodi smjesu pluraflavina. Ovisno o sastavu medija za kulturu, udio najmanje jednog od pluraflavina prema izumu može biti različit. Osim toga, sastavom medija može se kontrolirati sintezu pojedinačnih pluraflavina, tako da mikroorganizam uopće ne proizvodi jedan ili čak više pluraflavina, ili ih proizvodi količinom koja je ispod granice dokazivosti.

U jednoj izvedbi kultura sadrži jedan dokazivi pluraflavin. U drugoj izvedbi nastali su pluraflavini A, B ili E.

Osim pluraflavina A, B i E (spojevi formula (IA), (IB) i (IE)) u mediju za kulturu Actinomycetales vrste HAG 003959, DSM 12931, su također nastali i drugi srodni spojevi koji se razlikuju od spojeva prikazanih formulama (IA), (IB) i (IE) time da su oni različito glikozilirani. Tako, kao sporedni proizvod je dokazan daljnji pluraflavin (pluraflavin C) s molekulskom masom od 974 Da i proizvod degradacije pluraflavina A s molekulskom masom 692,77. C37H44N20n. U potonjem spoju nedostaje heksoza I; pod kiselim uvjetima, 2, 6-dideoksialdoheksoza se može hidrolitički odcijepiti od pluraflavina A.

Mikroorganizam je uzgojen aerobno, tj., na primjer, potopljen uz mućkanje ili miješanje u boci za miješanje ili u fermentoru, prema potrebi s uvođenjem zraka ili kisika. To se može provesti u temperaturnom području od približno 18 do 35°C, kao od približno 25 do 32°C, uključiv od 27 do 30°C. pH općenito treba biti u području od 6 do 8, kao od 6,5 do 7,5. Pod tim uvjetima, mikroorganizam se općenito uzgaja tijekom perioda od 24 do 300 sati, kao od 36 do 140 sati.

Uzgoj se povoljno provodi u nekoliko stupnjeva, tj. najprije se pripravi najmanje jednu prekulturu u tekućem hranjivom mediju, koju se zatim inokulira u pravi proizvodni medij, glavnu kulturu, na primjer u volumnom omjeru 1:10. Prekulturu se dobije, na primjer, inokulacijom micelija u hranjivu otopinu i pusti ga se da raste približno 36 do 120 sati, kao 48 do 96 sati. Micelij se može dobiti, na primjer, s tim da se rast omogući kroz približno 3 do 40 dana, kao 4 do 10 dana, na krutom ili tekućem hranjivom sredstvu, na primjer na agaru slada i kvaščevih gljivica ili na agaru zobenog brašna.

Napredovanje fermentacije može se pratiti pomoću pH vrijednosti kulture ili volumena micelija, a također i kromatograf skim metodama, kao što je, na primjer, tankoslojna kromatografija ili visokotlačna tekućinska kromatografija ili ispitivanjem biološke aktivnosti. Pluraflavini prema izumu mogu se naći kako u miceliju, tako također i u filtratu kulture. Postupak izolacije, koji je dolje opisan, služi općenito za čišćenje pluraflavina prema izumu, kao za čišćenje pluraflavina A, B i E.

Izolacija i/ili čišćenje pluraflavina prema izumu iz medija za kulturu se provodi poznatim metodama, pri čemu se uzimaju u obzir kemijska, fizička i biološka svojstva prirodnih proizvoda. Za ispitivanje koncentracije pluraflavina u mediju za kulturu ili u pojedinačnom izoliranom stanju, može se primijeniti tankoslojnu kromatografiju, na primjer na silika gelu upotrebom mješavine kloroform/metanol/ledena octena kiselina/vode (na primjer u omjeru 8:1:1:0,2) kao mobilne faze, ili HPLC. Kod razdvajanja tankoslojnom kromatografijom detekciju se može provesti, na primjer, upotrebom reagenata za obojenu reakciju, kao što je α-naftol/sumporna kiselina, pri čemu se količinu nastale tvari može lako usporediti s baždarnom otopinom.

Prema izumu, pluraflavin se može izolirati iz micelija ili iz medija za kulturu. Općenito, micelij se najprije odvoji od medija za kulturu uobičajenim metodama, i zatim se pluraflavini ekstrahiraju iz staničnog materijala prema potrebi upotrebom organskog otapala koje se miješa s vodom. Faza u organskom otapalu sadrži pluraflavine prema izumu; prema potrebi, oni se koncentriraju pod smanjenim tlakom i dalje se očiste kao što je dolje opisano.

Prema potrebi, filtrat kulture se pomiješa s koncentratom ekstrakta micelija i ekstrahira se s prikladnim organskim otapalom koje se ne miješa s vodom, na primjer s n-butanolom. Zatim se organsku fazu odvoji i, prema potrebi, koncentrira pod smanjenim tlakom. Da bi se izolirao vrijedan proizvod, koncentrat se može razrijediti s nepolarnim otapalom u kojem su pluraflavini prema izumu vrlo slabo topivi, kao što je, na primjer, heksan, petrol eter, dietil eter. Time se uzrokuje taloženje pluraflavina, a lipofilne nečistoće ostaju otopljene i odstranjuju se obično rastavljanjem na krutoj fazi. Talog, koji sadrži sve pluraflavine koje se želi izolirati, se otopi u 1/30 prvobitnog volumena vode i metanola. Talog se otopi potpuno i liofilizira. Liofilizat, koji se dolje u nastavku navodi kao sirov proizvod, sadrži 0,5 do 50% pluraflavina i upotrebljava se za daljnju izolaciju.

Daljnje čišćenje jednog ili više pluraflavina prema izumu provodi se kromatografijom na prikladnim materijalima, kao što su molekularna sita, na nosačima normalne faze, kao što je, na primjer, silika gel, aluminijev oksid, na ionskim izmjenjivačima ili na apsorpcijskim smolama i/ili na sredstvima reverzne faze (RP). Pomoću ove kromatografije, pluraflavini se rastave. Kromatografija pluraflavina se provodi upotrebom puferiranih vodenih otopina ili mješavine vodenih i organskih otopina.

Kao mješavine vodenih ili organskih otopina podrazumijevaju se sva organska otapala koja se miješaju s vodom, kao što je metanol, propanol i acetonitril, u rasponu koncentracije od 10 do 80% otapala, na primjer od 40 do 60% otapala, ili sve druge puferirane vodene otopine koje se miješaju s organskim otapalima. Puferi koji se upotrebljavaju mogu biti isti kao što su gore navedeni.

Rastavljanje pluraflavina, koje se temelji na njihovoj različitoj polarnosti, može se provesti s pomoću kromatografije reverznih faza, na primjer na MCI® (aporpcijska smola tvrtke Mitsubishi, Japan) ili na Amberlitu XAD® (TOSOHAAS), na drugim hidrofobnim materijalima, kao što su, na primjer, faze RP-8 ili RP-18. Osim toga, rastavljanje se može provesti pomoću kromatografije na normalnoj fazi, na primjer na silika gelu, aluminijevom oksidu i sličnom.

Kromatografija pluraflavina se može provesti upotrebom puferiranih ili kiselih vodenih otopina ili mješavina vodenih otopina s alkoholima ili drugim organskim otapalima koja se miješaju s vodom. Kao organsko otapalo može se upotrijebiti propanol i acetonitril.

Kao puferirane ili kisele vodene otopine podrazumijevaju se, na primjer, voda, fosfatni pufer, amonijev acetat, citratni pufer koncentracije od l mM do 0,5 M, a također i mravlja kiselina, octena kiselina, trifluoroctena kiselina ili sve komercijalne kiseline koje su stručnjaku poznate, na primjer, u području koncentracije od 0,01 do 3%, kao 0,1%.

Kromatografija se može provesti upotrebom gradijenta koji započinje sa 100%-tnim vodenim puferom i završava sa 100%-tnim otapalom; na primjer s linearnim gradijentom u rasponu od 10 do 50% upotrebom 2-propanola ili aceto-nitrila.

Alternativno, također se može provesti gel kromatografiju ili kromatografiju na hidrofobnim fazama. Gel kromatografiju se može provesti na poliakrilamidnom ili na miješanim polimernim gelovima, kao što u, na primjer, Biogel-P 2® (Biorad), Fractogel TSK HW 40® (Merck, Njemačka ili Toso Haas, SAD) ili na Sephadexu® (Pharmacia, Uppsala, Švedska).

Redoslijed gore spomenutih kromatografija može biti obrnut.

Nadalje, postupak čišćenja pluraflavina visoke učinkovitosti je kristalizacija. Pluraflavini kristaliziraju iz otopina u organskim otapalima i iz mješavine vode i organskih otapala. Kristalizaciju se može provesti na poznat način, na primjer koncentriranjem ili hlađenjem zasićenih otopina pluraflavina.

Pluraflavini prema izumu su postojani u krutom stanju i u otopinama koje imaju pH u području od 3 do 8, na primjer od pH 4 do 6, i oni se stoga mogu umiješati u uobičajene farmaceutske pripravke.

Pluraflavini formule (I) i derivati dobiveni od njih mogu se poznatim metodama prevesti u odgovarajuće fiziološki prihvatljive soli.

Kao fiziološki prihvatljive soli spojeva formule (I) podrazumijevaju se njihove organske i anorganske soli, kako što su opisane u Remington's Pharmaceutical Sciences (17. izd., str. 1418 (1985)). Zbog fizičke i kemijske postojanosti i topivosti, moguće izvedbe kiselinskih skupina jesu, između ostalih, natrijeve, kalijeve, kalcijeve i amonijeve soli; soli solne kiseline, sumporne kiseline, fosforne kiseline ili karboksilnih kiselina ili sulfonskih kiselina, kao što su, na primjer, octena kiselina, limunska kiselina, benzojeva kiselina, maleinska kiselina, fumarna kiselina, vinska kiselina i p-toluen-sulfonska kiselina, između ostalih, moguće su izvedbe bazičnih skupina.

Izum nadalje obuhvaća kemijske ekvivalente, koji se ovdje također navode i kao "derivati" spojeva formule (I) koji imaju jednako ili uglavnom jednako djelovanje ili koji se mogu prevesti u spoj prema izumu. Spomenuti ekvivalenti uključuju, na primjer, estere i etere, komplekse i također proizvode redukcije spojeva prema izumu.

Esterski i eterski derivati i proizvodi redukcije mogu se dobiti postupcima koji su opisani u literaturi, na primjer u "Advanced Organic Sγnthesis", 4. izd., J. March, John Wiley & Sons, 1992. Karboksi skupina (formule IE, IVE) i hidroksi skupine u spojevima formule (I) mogu se prevesti u ester, kao što je C1-C4 alkil ester, ili u etersku skupinu, na primjer, u acetale i ketale hidroksi skupina.

Postojani kompleksi spojeva formule (I) mogu se dobiti s fiziološki prihvatljivim anorganskim kationima, kao što je kalcij ili magnezij.

Predloženi izum obuhvaća sve stereoizomerne oblike spojeva formule (I) . Središta asimetrije spojeva formula (IA), (IB) i (IE) mogu međusobno neovisno imati u svakom slučaju S konfiguraciju ili R konfiguraciju. Oksirani skupina koje sadrže epoksid mogu biti u bilo kojem položaju; na primjer, oksirani koji obuhvaćaju ugljikove atome 2' i 3'. Izum obuhvaća sve moguće enantiomere i diastereomere, i također smjese od najmanje dva stereoizomerna oblika, na primjer smjese enantiomera i/ili diastereomera, u bilo kojem omjeru. Tako su izumom dati enantiomeri u enantiomerno čistom obliku, kao lijevo-zakrećući i kao desnozakrečući antipodi, R i S konfiguracije, u obliku racemata i u obliku smjese dvaju enantiomera u bilo kojem omjeru. Ako je prisutna cis/trans izomerija, izum obuhvaća obadva oblika, cis oblik i trans oblik, i smjese tih oblika u bilo kojem omjeru.

Zbog njihovih korisnih farmakoloških svojstava, spojevi prema izumu se mogu upotrijebiti kao lijekovi u humanoj medicini i/ili u veterini. Oni imaju antibiotsko djelovanje i, osim antibakterijskog djelovanja, oni su i antimikotici, tj. inhibiraju gljivice, uključiv fitopatogene gljivice, oni imaju antiprotozojska i antiparazitska svojstva.

Spojevi prema izumu mogu se upotrijebiti protiv kanceroznih bolesti, na primjer kao kemoterapeutici. Zbog njihovih citostatičkih svojstava, kao što je njihovo jako antitumorsko djelovanje, i antimikrobno djelovanje, oni se mogu upotrijebiti, na primjer, kao citostatici za maligne degeneracije u bilo kojoj životinji i ljudima.

U slučaju tumorskih stanica koje su razvile otpornost prema konvencionalnim sredstvima, samo nova sredstva imaju terapeutski odgovarajući učinak. Tako pluraflavini prema izumu i njihovi derivati formule (I) imaju moguće odlično djelovanje čak protiv tih problematičnih tipova stanica.

I

zum se također odnosi na farmaceutske pripravke koji sadrže najmanje jedan od pluraflavina prema izumu i/ili njihovih derivata. Plurflavini se mogu upotrijebiti u smjesama s najmanje jednim prikladnim pomoćnim ili dodatnim sredstvom. Pomoćna sredstva koja se upotrebljavaju za ljude mogu biti sva farmakološki prihvatljiva pomoćna sredstva i/ili dodaci.

Izum se također odnosi na postupak za pripravu lijeka prema izumu koji obuhvaća preradu najmanje jednog spoja prema izumu u oblik prikladan za aplikaciju upotrebom farmaceutski prikladnog i fiziološki prihvatljivog pomoćnog sredstva i, prema potrebi, drugih prikladnih aktivnih spojeva, dodataka ili pomoćnih tvari.

Lijekovi prema izumu se daju općenito oralno, lokalno ili parenteralno, a također je moguća i rektalna aplikacija. Prikladni kruti ili tekući oblici farmaceutskog pripravka jesu, na primjer, granule, puderi, tablete, prevučene tablete, (mikro)kapsule, čepići, sirupi, emulzije, suspenzije, aerosoli, kapljice ili injekcijske otopine u obliku ampula, i pripravci koji usporeno oslobađaju aktivan spoj, za čiju pripravu se obično upotrebljavaju pomoćna sredstva i dodaci i/ili dodatne tvari, kao što su dezintegranti, veziva, sredstva za prevlačenje, sredstva za kvašenje, klizna sredstva ili lubrikanti, začini, sladila ili sredstva za pospješivanje topivosti. Od pomoćnih sredstava ili dodataka, koji se često upotrebljavaju, mogu se spomenuti, na primjer, magnezijev karbonat, titanov dioksid, laktoza, manitol i drugi šećeri, talk, laktoprotein, želatin, škrob, vitamini, celuloza i njezini derivati, životinjska ili biljna ulja, polietilen glikoli i otapala kao što je, na primjer, sterilna voda, alkoholi, glicerol i polihidro alkoholi.

Prema potrebi, jedinična doza može biti mikrokapsulirana za oralno davanje s usporenim oslobađanjem ili za produljeno oslobađanje tijekom relativno dugog vremenskog perioda, kao, na primjer, prevlačenjem ili ugradnjom dotičnog aktivnog spoja u prikladne polimere, voskove ili slično.

Farmaceutski pripravci se mogu proizvesti i dati u jediničnim dozama, pri čemu svaka jedinica kao aktivan sastojak sadrži određenu dozu najmanje jednog spoja pluraflavina prema izumu i/ili njegov derivat. U slučaju krute jedinične doze kao što su tablete, kapsule i čepići, ta doza može biti sve do približno 200 mg, ali također može biti približno 0,1 do 100 mg, a u slučaju otopina za injekcije u obliku ampula sve do približno 200 mg, ali može biti približno 0,1 do 100 mg dnevno.

Dnevna doza koju se daje ovisi o tjelesnoj težini, starosti, spolu i stanju sisavca. Međutim, također se mogu pokazati indikativnim više ili niže dnevne doze. Dnevna doza se može dati ovisno o okolnostima kao jednostruka doza ili u obliku više manjih dnevnih doza, ili u nekim okolnostima u prethodno određenim intervalima, u obliku doza podijeljenih na manje količine.

Izum se dalje prikazuje u primjerima koji slijede. Postoci se odnose na masu. U slučaju tekućina, omjeri miješanja se odnose na volumen, ako nije navedeno drugačije.

Slijedeći primjeri prikazuju predloženi izum i oni ne ograničavaju njegovu svrhu.

PRIMJERI

Primjer 1

Priprava kulture u glicerolu vrste Actinomycetales HAG 003959, DSM 12931

100 ml hranjive otopine (ekstrakt slada 2,0%, ekstrakt kvaščevih gljivica 0,2%, glukoza 1,0%, (NH4)2HPO4 0,05%, pH 6,0) u sterilnoj Erlenmeyer tikvici od 300 ml se inokulira s podvrstom Actinomycetales vrste HAG 003959, DSM 12931, i inkubira se na rotacijskoj mućkalici 7 dana pri 28°C i 180 okr/min. 1,5 ml te kulture se zatim razrijedi s 1,5 ml 99%-tnog glicerola i pohrani se pri -20°C.

Primjer 2

Priprava kulture ili predkulture vrste Actinomycetales HAG 003959, DSM 12931, u Erlenmeyerovog tikvici

U sterilnu Erlenmeyer tikvicu od 300 ml koja sadrži 100 ml slijedeće hranjive otopine od 15 g glukoze/l, 15 g soj inog brašna/l, 5 g namočenog kukuruza/l, 2 g CaCOa/l i 5 g NaCl/l inokulira se kulturu za rast na kosoj cjevčici (ista hranjiva otopina, ali s 2% agara) ili s 1 ml glicerolne kulture (vidi primjer 1) i inkubira se na mućkalici pri 180 okr/min i 30°C. Maksimalnu proizvodnju najmanje jednog spoja pluraflavina prema izumu postiže se nakon približno 120 sati. Za inokulaciju fermentora od 10 i 200 l bila je dovoljna potopljena kultura stara 48 do 96 sati (količina za inokulaciju približno 10%) iz iste hranjive otopine.

Primjer 3

Priprava pluraflavina

Fermentor od 9 l radio je pod slijedećim uvjetima:

Hranjivo sredstvo:

15 g glukoze/l,

15 g sojinog brašna/l,

5 g namočenog kukuruza, krutog/l,

2 g CaCO3/l,

5 g NaCl/l,

pH 7,0 (prije sterilizacije),

trajanje postupka: 92 sata,

temperatura inkubacije: 28°C,

brzina mješalice: 300 okr/min,

uvođenje zraka: 5 7/min.

S ponovnim dodatkom otopine etanol poliola bilo je moguće, prema potrebi, potisnuti stvaranje pjene. Maksimalna proizvodnja postignuta je nakon približno 70 do 96 sati.

Primjer 4

Izolacija smjese pluraflavina iz otopine za kulturu Actinomycetales vrste HAG 003959, DSM 12931

Po završetku fermentacije vrste Actinomycetales HAG 003959, DSM 12931, juhu kulture iz fermentora, dobivenu u skladu s primjerom 3 (90 litara) se profiltrira s dodatkom približno 2% pomoćnog sredstva za filtriranje (na primjer Celite® i stanični materijal (0,6 litre) se ekstrahira s 3 litre metanola. Metanolnu otopinu koja sadrži aktivan spoj se oslobodi od micelija filtracijom i koncentrira se pod smanjenim tlakom. Koncentrat se, zajedno s filtratom kulture (7 litara) stavi na pripravljen stupac od 0,4 litre ®MCI GEL-a, CHP20P. Ispiranje se provodi upotrebom gradijenta od 0,1% octene kiseline u vodi do 0,1% octene kiseline u 2-propanolu. Protok kroz stupac (1,2 litre na sat) se skuplja u frakcije (svaka od 0,25 litre) i skupe se frakcije koje sadrže pluraflavin (20 do 23). Koncentrira se pod smanjenim tlakom i osuši smrzavanjem, čime se dobije 1,4 g smeđeg praha.

Primjer 5

Obogaćivanje komponenata pluraflavina gel kromatografijom

1,4 g proizvoda dobivenog u primjeru 4 stavi se na stupac kapaciteta od 3,9 litara (širina x visina = 10 cm x 50 cm) napunjen s Fractogelom® TSK HW-40 s. Protočnu fazu voda/acetonitril (1:1) se pumpa kroz stupac brzinom protoka od 50 ml u minuti, i protok iz stupca se skuplja u frakcije (65 ml). Pluraflavini su uglavnom u frakcijama 13 do 16. Oni se skupe i oslobode od otapala pod smanjenim tlakom. Dobiveno je 130 mg smjese pluraflavina.

Primjer 6

Rastavljanje komponenata pluraflavina na reverznoj fazi RP-18

Stupac za preparativnu HPLC kapaciteta od 122 ml (1,25 cm (ID) x 25 cm H) napuni se s ®Nucleosilom 100-7 C18 HD, i stavi se 130 mg pluraflavinske smjese dobivene u skladu s primjerom 5. Ispiranje se provodi upotrebom 10% aceto-nitrila i 0,1 M vodene otopine amonijevog acetata. Brzina protoka kroz stupac bila je 50 ml/minuti i skupljene su frakcije koje u svakom slučaju sadrže po 50 ml. Frakcija 6 sadržavala je pluraflavin E, pluraflavin C je bio u frakcijama 12-17, pluraflavin B je bio u frakcijama 25 do 27 i pluraflavin A je bio u frakcijama 35 do 37. Nakon koncentriranja pod smanjenim tlakom i sušenja smrzavanjem dobivene su slijedeće količine: pluraflavin A: 22 mg, ESI+MS: 823 Da (M+H)+, pluraflavin B: 18 mg, ESI+MS: 841 Da (M+H)+, pluraflavin C: 11 mg, ESI+MS: 974 Da (M+H)+, pluraflavin E: 5 mg, ESI+MS: 712 Da (M+H)+.

Primjer 7

Završno čišćenje pluraflavina i pretvorba u oblik trifluor-acetatne soli

Frakcije 35 do 37, dobivene u skladu s primjerom 6, nakon sušenja smrzavanjem (22 mg) se otope u 10% aceto-nitrila u vodi, namjeste se na pH 2,8 s trifluoroctenom kiselinom i stave se na stupac 250/10 LiChrospher RP-18e (5 μm)®. Ispiranje se provodi upotrebom 0,05%tne vodene trifluoroctene kiseline u 11 do 22%-tnom acetonitrilu. Koncentriranjem pod smanjenim tlakom i sušenjem smrzavanjem dobiveno je 18 mg pluraflavina A kao trifluoracetatne soli.

Primjer 8

Identifikacija pluraflavina A

Izgled: tamno žuta tvar koja je bila topiva u polarnim organskim otapalima, ali tek vrlo slabo u vodi. Dodatkom kiseline soli su topive u vodi. Spoj je postojan u neutralnoj i srednje kiseloj sredini, ali je nepostojan u lužnatom i jako kiselom području.

UV maksimumi: 214, 243, 270 (Sh), 290 (Sh), 426 nm u voda/ acetonitrilu (8:2), pH 2 i 214, 243, 270 (Sh), 290 (Sh) i 426 nm u voda/acetonitrileu (6:4), pH 7.

IR trake: 3424, 1680, 1600, 1464, 1427, 1300, 1203, 1131, 1066, 1009, 801, 721 cm-1.

S masenim spektometrom visoke rezolucije nađena je slijedeća molekulska masa za (M+H)+: 823,370631 Da, koja odgovara empirijskoj formuli za pluraflavin A C43H54N2O14. Ionizacija s elektronskim sprejom (ESI, pozitivna) dala je preko MS/MS fragmentacije slijedeće ione: 823, 693, 680, 550, 480, 390, 320, 144 i 131 Da.

NMR signali: vidi tablicu 1.

TABLICA 1. Kemijski pomaci 1H i 13C pluraflavina A u metanolu-d4 i DMSO-d6 pri 300°K.

[image] [image]

Za aldoheksozu III, opažni NOE su se slagali s relativnom SRSS ili RSR stereokemijom na kiralnim središtima 1', 3', 4', 5' (vidi H-III). To odgovara C-3 epimeru vankozamina.

Relativna stereokemija

[image]

H-III. Relativna stereokemija heksoze III.

NOE efekti opaženi za heksozu 11 pogoduju relativnoj stereokemiji RSSS ili SRR za kiralna središta 1", 3", 4", 5" (vidi H-II).

Relativna stereokemija

[image]

H-II. Relativna stereokemija heksoze II.

Ista relativna stereokemija (RSSS, SRR) za asimetrične ugljikove atome 1"', 3'", 4'", 5'" bila je dosljedna s dokazanim NOE heksoze I (vidi H-I).

Relativna stereokemija

[image]

H-I. Relativna stereokemija heksoze I.

Primjer 9

Identifikacija pluraflavina B

Izgled: tamno žuta tvar koja je bila topiva u polarnim organskim otapalima, ali tek vrlo slabo u vodi. Dodatkom kiseline, soli su topive u vodi. Spoj je postojan u neutralnoj i srednje kiseloj sredini, ali je nepostojan u lužnatom području.

UV maksimumi: 214, 243, 270 (Sh) , 290 (Sh), 426 nm u voda/ acetonitrilu (8:2), pH 2 i 214, 243, 270 (Sh), 290 (Sh) i 426 nm u voda/acetonitrilu (6:4), pH 7.

Pluraflavin B ima empirijsku formulu 043*156^015, molekulska masa bila je 840,9 Da. NMR signali: vidi tablicu 2.

TABLICA 2. Kemijski pomaci 1H i 13C pluraflavina B u metanolu-d4 i usporedba s pruraflavinom A pri 300°K.

[image] [image]

Primjer 10

Završno čišćenje pluraflavina E

Frakcija 6, dobivena u skladu s primjerom 6, nakon sušenja smrzavanjem (5 mg), otopi se u 10%-tnom aceto-nitrilu u vodi, namjesti se na pH 2,8 s trifluoroctenom kiselinom i stavi se na stupac 250/10 LiChrospher RP-18e (5 μm)®. Ispiranje se provodi upotrebom gradijenta 0,05%-tne vodene trifluoroctene kiseline od 11 do 22% acetonitrila. Koncentriranjem pod smanjenim tlakom i sušenjem smrzavanjem dobiveno je 2,7 mg pluraflavina E kao trifluoracetatna sol.

Primjer 11

Identifikacija pluraflavina E

Izgled: tamno žuta tvar koja je bila topiva u polarnim organskim otapalima, ali tek vrlo slabo u vodi. Dodatkom kiseline, soli su topive u vodi. Spoj je postojan u neutralnoj i srednje kiseloj sredini, ali je nepostojan u lužnatom i jako kiselom području.

UV maksimumi: 213, 244, 270 (Sh), 290 (Sh) , 426 nm u voda/acetonitrilu (8:2), pH 2, i 213, 244, 270 (Sh), 290 (Sh) i 426 nm u voda/acetonitrilu (6:4), pH 7.

Masenom spektometrijom nađena je slijedeća molekulska masa za (M+H)+: 712 Da, koja odgovara empirijskoj formuli za pluraflavin A C36H41NO14. NMR signali: vidi tablicu 3.

TABLICA 3. Kemijski pomaci 1H i 13C pluraflavina E u metanolu-d4 i DMSO-d6 pri 300°K.

[image] [image]

Primjer 12

(a) Ispitivanje citostatičkog djelovanja

Za određivanje citostatičkog djelovanja upotrijebljene su stanice hepatoma štakora dobivene iz zbirke American Type Culture Collection pod brojem ATCC CRL-1548, Jo br. 223 i 228. Podvrsta je držana u mediju "MEM (EAGLE) s glutamaksom" [GIBCO BRL br. 4109-028] s 10%-tnim fetalnim goveđim serumom [GIBCO BRL br. 10270-106] i 10 μl penicilin-streptomicina [GIBCO BRL br. 15140-114]/ml. Upotrijebljene su mikrotitarske pločice s 96 jamica [Greiner, br. 15140-114] . Svaka jamica je najprije napunjena sa 140 μl hranjive otopine za kulturu i u svakom slučaju inokulirana je s 215.000 stanica. Pločice su zatim inkubirane 20-24 sata pri 37°C i s 5% CO2. Odgovarajućim redoslijedom pipetirani su nizovi razređenja pluraflavina koncentracija od 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125, 1,5625, 0,7813, 0,3906, 0,195, 0,094, 0,047 i 0 μM, koji su bili ranije pripravljeni. Nakon daljnjeg perioda inkubacije od 22 sata pri 37°C u atmosferi s 5% C02, tekuće sredstvo je odsisano. Stanice, koje su ostale, su obojene sa 100 μl RPMI 1640 [GIBCO BRL br . 32404-014] po jamici i 20 μl vodenog staničnog titra 96 [PROMEGA br. G5430] po jamici. Apsorpcija svjetla mjerena je pri 590 nm naposredno nakon dodatka i nakon 2 sata inkubacije, kao gore. Citostatički učinak je izračunat iz promjene apsorpcija svjetla.

IC50 za pluraflavin A = <50 nM;

IC50za pluraflavin B = <50 nM.

Primjer 12 (b)

Antiproliferacijski učinci pluraflavina i flavopiridola na odabranim tumorskim linijama stanica

MTT, u vodi topiva tetrazolijeva sol, kad se otopi odcjepljenjem tetrazolijevog prstena s dehidrogenaznim enzimima u aktivnim mitohondrijama, prelazi u netopivi crvenkasti formazan. Mrtve stanice ne uzrokuju tu promjenu. Ta metoda je primijenjena za brojčano utvrđivanje proliferacije da bi se utvrdilo djelovanje mogućih kemoterapeutskih spojeva.

Sve stanice su držane u RPMI 1640 (Life Technologies, Gaithersburg, MD) koji je sadržavao 10% toplinski inaktiviranog Fetal Bovine Seruma, penicilin /streptomicin i bio je nadopunjeni s L-glutaminom. Stanice su stavljene u pločice s 96 jamica za kulture tkiva sa slijedećim gustoćama:

dojka 2500 stanica/jamici,

prostata 2600 stanica/jamici,

debelo crijevo 1000 stanica/jamici,

pluća 1000 stanica/jamici.

Stanice su ostavljene preko noći da se spajaju pri 37°C i 5% CO2. Pluraflavin je razrijeđen u mediju za kulturu s krajnjim koncentraacijama spoja kako slijedi: 50,0, 16,67, 5,56, 1,85, 0,617, 0,206, 0,069, 0,023 μM.

Flavopiridol je razrijeđen na: 2,0, 0,222, 0,074, 0,025, 0,008, 0,003, 0,001 μM. Obadva spoja su ispitana po tri puta sa svim koncentracijama. Stanice su isprane sa svježim medijem i spojevi su dodani stanicama u krajnjem volumenu od 100 μl. Stanice sa spojem su inkubirane približno 72 sata pri 37°C s 5% CO2. U željenom trenutku u svoju jamicu dodano je po 25 μl MTT-a (10 mg/ml u HBSS-u). Pločice su inkubirane 2-4 sata pri 37°C. MTT i medij su odstranjeni i u svaku jamicu dodano je po 200 μl DMSO. Očitanja su izvršena pri 570 nm. Dolje su dati rezultati:

Stanice Pluraflavin A IC50 Flavopiridol IC50

Dojka <23 nM 90 nM

Prostata 10 nM 80 nM

Debelo crijevo 0,35 nM 30 nM

Pluća 3,0 nM 90 nM

U pokusu na mekom agaru, pluraflavin i flavopiridol su ispitani protiv stanica leukemije. Rezultati za IC50 su bili: 60 nM (pluraflavin A) i 0,5, 0,6 μM (flavopiridol).

Claims (27)

1. Spoj formule I [image] naznačen time, da R1 je skupina šećera; R2 je -COOH ili -CH2-O-(R7)m, gdje R7 je šećerna skupina; R3je odabran između skupina koje sadrže epoksid, C1-C6-alkilnih skupina i C2-C6-alkenilnih skupina, pri čemu su spomenute alkilne skupine i alkenilne skupine prema potrebi supstituirane s najmanje jednom OH skupinom; R5 je odabran između vodikovog atoma, C1-C6-alkilnih skupina, C2-C6-alkenilnih skupina i C2-C6-alkinilnih skupina; svaki od R4, R6, R8 i R10 je neovisno odabran između vodikovih atoma, C1-C6-alkilnih skupina, C2-C6-alkenilnih skupina, C2-C6-alkinilnih skupina, skupina -X2H u kojima je H izravno povezan na prvi atom skupine X2, i -X2R12 skupina u kojoj je R12 izravno povezan na prvi atom od X2, i prema potrebi R4 i R6 zajedno tvore dvostruko povezanu skupinu -X2, i prema potrebi R8 i R10 zajedno tvore dvostruko povezanu skupinu -X2, u kojoj svaki od X2 je neovisno odabran između kisikovih atoma, -NH skupine, -N-C1-C6-alkilnih skupina, -N-C2-C6-alkenilnih skupina, -N-C2-C6-alkinilnih skupina i sumpornih atoma, pri čemu svaki R12 je neovisno odabran između C1-C6-alkilnih skupina, C2-C6-alkenilnih skupina, C2-C6-alkinilnih skupina, arilnih skupina i acilnih skupina; i svaki od m i n je neovisno odabran između 1 i 2; u svim njegovim stereokemijskim oblicima i smjesama tih oblika u bilo kojem omjeru, i njegove fiziološki prihvatljive soli ili njegovi derivati.

2. Spoj prema zahtjevu 1, naznačen time, da R7 predstavlja amino šećer.

3. Spoj prema zahtjevu 1 ili 2, naznačen time, da R7 ima formulu [image]

4. Spoj prema bilo kojem zahtjevu 1-3, naznačen time, da n je 2.

5. Spoj prema bilo kojem zahtjevu 1-4, naznačen time, da R1 predstavlja amino šećer.

6. Spoj prema bilo kojem zahtjevu 1-5, naznačen time, da R1 ima formulu [image]

7. Spoj prema bilo kojem zahtjevu 1-6, naznačen time, da je R3 odabran između skupina [image]

8. Spoj prema zahtjevu 1, naznačen time, da ima formulu (IA) [image] u svim njegovim stereokemijskim oblicima i smjesama tih oblika u bilo kojem omjeru, i njegove fiziološki prihvatljive soli ili njegovi derivati.

9. Spoj prema zahtjevu 1, naznačen time, da ima formulu (IB) [image] u svim njegovim stereokemijskim oblicima i smjesama tih oblika u bilo kojem omjeru, i njegove fiziološki prihvatljive soli. ili njegovi derivati.

10. Spoj prema zahtjevu 1, naznačen time, da ima formulu (IE) [image] u svim njegovim stereokemijskim oblicima i smjesama tih oblika u bilo kojem omjeru, i njegove fiziološki prihvatljive soli ili njegovi derivati.

11. Spoj formule (I) prema bilo kojem zahtjevu 1-10, naznačen time, da se može dobiti uzgojem vrste Actinomycetales HAG 003959, DSM 12931, ili neke od njezinih varijanti ili mutanata pod prikladnim uvjetima u mediju za kulture sve dok se u kulturi za medij dobije najmanje jedan spoj formule (I), i zatim izolacijom spoja.

12. Spoj prema zahtjevu 11, naznačen time, da se spomenuti izolirani spoj dalje prevede u barem jedan spoj odabran između njegovih derivata i fiziološki prihvatljivih soli.

13. Pripravak, naznačen time, da sadrži najmanje jedan spoj formule (I) prema bilo kojem zahtjevu 1-12, ili njegovu fiziološki prihvatljivu sol ili njegov derivativ, i prihvatljiv nosač.

14. Pripravak prema zahtjevu 13, naznačen time, da spomenuti prihvatljiv nosač je farmaceutski prihvatljiv nosač.

15. Postupak za pripravu najmanje jednog spoja formule (I) ili njegove fiziološki prihvatljive soli prema bilo kojem zahtjevu 1-10, naznačen time, da obuhvaća uzgoj mikroorganizma vrste Actinomycetales HAG 003959, DSM 12931, ili jedne od njegovih varijanti ili mutanata, pod prikladnim uvjetima u mediju za kulturu, sve dok se u mediju za kulturu dobije najmanje jedan spoj formule (I), i zatim izolaciju spoja.

16. Postupak prema zahtjevu 15, naznačen time, da se spomenuti izolirani spoj dalje prevede u barem jedan spoj odabran između njegovih derivata i fiziološki prihvatljivih soli.

17. Postupak prema zahtjevu 15, naznačen time, da se uzgoj provodi pod aerobnim uvjetima pri temperaturi između 18 i 35°C i pri pH između 618.

18. Postupak prema zahtjevu 15, naznačen time, da se spoj formule (I) prevede u njegov derivativ upotrebom redukcijskog sredstva.

19. Spoj formule (I) prema bilo kojem zahtjevu 1-12 ili njegova fiziološki prihvatljiva sol ili njegov derivat, naznačen time, da se on upotrebljava za inhibiciju transkripcije najmanje jedne dvostruko usukane nukleinske kiseline.

20. Upotreba spoja formule (I) prema bilo kojem zahtjevu 1-12 ili njegove fiziološki prihvatljive soli ili njegovog derivata, naznačena time, da se on koristi za proizvodnju citostatika.

21. Upotreba spoja formule (I) prema bilo kojem zahtjevu 1-12 ili njegove fiziološki prihvatljive soli ili njegovog derivata, naznačena time, da se on koristi za proizvodnju lijeka za liječenje tumora debelog crijeva.

22. Upotreba spoja formule (I) prema bilo kojem zahtjevu 1-12 ili njegove fiziološki prihvatljive soli ili njegovog derivata, naznačena time, da se on koristi za proizvodnju lijeka za liječenje tumora dojke.

23. Upotreba spoja formule (I) prema bilo kojem zahtjevu 1-12 ili njegove fiziološki prihvatljive soli ili njegovog derivata, naznačena time, da se on koristi za proizvodnju lijeka za liječenje tumora pluća.

24. Upotreba spoja formule (I) prema bilo kojem zahtjevu 1-12 ili njegove fiziološki prihvatljive soli ili njegovog derivata, naznačena time, da se on koristi za proizvodnju lijeka za liječenje tumora prostate.

25. Upotreba spoja formule (I) prema bilo kojem zahtjevu 1-12 ili njegove fiziološki prihvatljive soli ili njegovog derivata, naznačena time, da se on koristi za proizvodnju lijeka za liječenje leukemije.

26. Upotreba spoja formule (I) prema bilo kojem zahtjevu 1-12 ili njegove fiziološki prihvatljive soli ili njegovog derivata, naznačena time, da se on koristi za proizvodnju lijeka za liječenje mikrobnih infekcija.

27. Vrsta, naznačena time, da je to Actinomycetales vrsta HAG 003959 (DSM 12931).