HK40112971A - Egfr和lag3双靶向的双特异性抗体及其用途 - Google Patents

Description

EGFR和LAG3双靶向的双特异性抗体及其用途

发明领域

本申请涉及靶向EGFR和LAG3的双特异性抗体，以及此类抗体的用途，特别是它们在癌症治疗中的用途。

背景技术

表皮生长因子受体(EGFR)是由c-erbB1原癌基因编码的170kDa的跨膜糖蛋白。它由具有激酶活性的C端胞内区、N端胞外受体结合位点和疏水跨膜结构域组成。EGFR是酪氨酸激酶(RTK)的受体。RTK在控制细胞循环、细胞迁移、细胞代谢和生存以及细胞增殖和分化等最基本的细胞过程中起到重要作用。经由酪氨酸激酶调节的信号转导通路，EGFR可以调节大量细胞过程。此外，EGFR的激活导致多个信号传导级联同时激活，包括MAPK通路、蛋白激酶C(PKC)通路和PI(3)K激活的AKT通路。

EGFR在人肿瘤中经常过表达或突变，并且有助于人肿瘤生长。约30％的实体瘤显示出EGFR的功能获得性基因改变，包括膀胱、脑、头颈、胰腺、肺、乳腺、卵巢、结肠、前列腺和肾的癌症。一些细胞展示出“原癌基因成瘾”，一个由Weinstein在2002年引入的概念，因为它们依赖于EGFR信号传导通路来生存和生长。因此，靶向EGFR可能是一个具有很大成效的很好的治疗方法。已经报道了靶向EGFR并阻断EGFR信号传导通路的各种策略，包括西妥昔单抗和帕尼单抗。所有这些策略都确认靶向EGFR是有效的抗肿瘤疗法。

淋巴细胞活化基因-3(LAG3或CD223)最初是在一项设计用来选择性分离在IL-2依赖的NK细胞系中表达的分子的实验中发现的。它是一种与CD4具有结构同源性的且具有四个胞外糖基化位点的70kDa的跨膜蛋白。LAG3在静息外周血淋巴细胞中不表达，但是在激活的T细胞、NK细胞、一些B细胞和DC细胞中表达。与CD4一样，LAG3蛋白以较高亲和力与MHC II类分子结合。但与CD4不一样的是，LAG3不与人免疫缺陷病毒gp120蛋白相互作用。使用可溶性LAG3免疫球蛋白融合蛋白(sLAG3Ig)进行的研究表明LAG3与细胞表面的MHC II类分子直接且特异性的结合。

LAG3的细胞质尾由三个保守基序组成，其中一个基序是高度独特并保守的六个氨基酸序列(KIEELE,SEQ ID NO:20)，已显示其是LAG3下调T细胞功能所必需的。LAG3与其配体(表达在抗原呈递细胞，如巨噬细胞和DC细胞上的MHC II类分子)的相互作用，抑制T细胞和NK细胞的活化，抑制T细胞和NK细胞识别并杀伤癌症细胞的能力。此外，已显示CD4⁺CD25⁺调节T细胞(T_reg)在活化后表达LAG3，并且针对LAG3的抗体在体外和体内均抑制由经诱导的T_reg细胞引起的抑制，表明LAG3有助于T_reg细胞的抑制子活性。

EGFR和LAG3在癌症中各自的作用已得到充分证实，而靶向EGFR或LAG3的单一疗法最初在癌症治疗中可能是高效的，但耐药性往往随之而来。因此，存在对EGFR×LAG3双靶向的双特异性抗体的需要，该抗体预测通过同时识别两种抗原来实现有效地癌症治疗。

发明概述

本公开提供了设计用于同时与靶细胞上的表面抗原和某些免疫细胞，例如T细胞结合的EGFR×LAG3重组双特异性抗体。大量功能测定已经表明以EGFR×LAG3双特异性抗体形式工程化的抗体在多种癌症(尤其是EGFR阳性癌症，例如结肠癌、肾癌、结直肠癌、肺癌、胃癌、卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、头颈癌、脑癌、膀胱癌和肝癌)上的强有力的抗肿瘤效果。

在一个方面，本公开提供双特异性抗体或其抗原结合片段，其包含与EGFR结合的第一抗原结合区，该第一抗原结合区包含第一轻链可变区(VL1)和第一重链可变区(VH1)，和与LAG3结合的第二抗原结合区，该第二抗原结合区包含第二轻链可变区(VL2)和第二重链可变区(VH2)，其中VL1包含分别具有如SEQ ID NO:1-3所示的氨基酸序列的LCDR1-3；该VH1包含分别具有如SEQ ID NO:5-7所示的氨基酸序列的HCDR1-3；该VL2包含分别具有如SEQ ID NO:9-11所示的氨基酸序列的LCDR1-3；并且该VH2包含分别具有如SEQ ID NO:13-15所示的氨基酸序列的HCDR1-3。

在一些本文公开的双特异性抗体或其抗原结合片段的实施方式中，VL1包含与SEQID NO:4具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列；VH1包含与SEQ ID NO:8具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列；VL2包含与SEQ ID NO:12具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列；并且VH2包含与SEQ ID NO:16具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方式中，VL1包含如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；VH1包含如SEQ IDNO:8所示的氨基酸序列；VL2包含如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列；并且VH2包含如SEQID NO:16所示的氨基酸序列。

在一些实施方式中，该双特异性抗体包含：第一多肽链，其从N端至C端包含：VH2-CH1-CH2-CH3-L1-VH1-L2-VL1；和第二多肽链，其从N端至C端包含：VL2-CL；其中CH1表示免疫球蛋白重链的恒定区的第一结构域；CH2表示免疫球蛋白重链的恒定区的第二结构域；CH3表示免疫球蛋白重链的恒定区的第三结构域；CL表示免疫球蛋白轻链的恒定区；且L1和L2各自独立地表示任选的接头。

在一些实施方式中，该双特异性抗体包含第一多肽链的两个拷贝和第二多肽链的两个拷贝。

在一些实施方式中，CH1、CH2和CH3中的每一个独立地衍生自免疫球蛋白同种型IgG(例如，人IgG)，优选地衍生自选自IgG1、IgG2和IgG4(例如，人IgG1、IgG2和IgG4)的IgG亚型。

在一些实施方式中，CL衍生自λ轻链或κ轻链。

在一些实施方式中，接头包含(G4S)n的氨基酸序列，其中n是选自1-5的整数，优选地该接头包含如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列。

在一些实施方式中，第一多肽链包含与SEQ ID NO:17具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列；并且第二多肽链包含与SEQ ID NO:18具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方式中，第一多肽链包含如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列；并且该第二多肽链包含如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。

在另一个方面，本公开提供了核酸，其包含编码本文公开的双特异性抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。

在又一方面，本公开提供了载体，其包含本文公开的核酸。

在又一方面，本公开提供了宿主细胞，其包含本文公开的核酸或本文公开的载体。

在另一方面，本公开提供了药物组合物，其包含本文公开的双特异性抗体或其抗原结合片段，和药学上可接受的载体或赋形剂。

在本文公开的药物组合物的一些实施方式中，该药物组合物进一步包含第二治疗剂。在一些实施方式中，该第二治疗剂选自抗体、化疗剂和小分子药物。在一些实施方式中，该第二治疗剂选自布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)抑制剂、PI3K抑制剂、HDAC抑制剂、ERK抑制剂、MAPK抑制剂、PD-1/PD-L1抑制剂、CTLA-4抑制剂、TIGIT抑制剂、TIM3抑制剂、VEGF抑制剂和糖皮质激素。

在另一方面，本公开提供了缀合物，其包含本文公开的双特异性抗体或其抗原结合片段，以及与其缀合的化学部分。

在本文公开的缀合物的一些实施方式中，该化学部分选自治疗剂、可检测部分和免疫刺激分子。

在又一方面，本公开提供了治疗受试者的癌症的方法,包括向受试者施用有效量的本文公开的双特异性抗体或其抗原结合片段、本文公开的药物组合物或本文公开的缀合物。

在本文公开的方法的一些实施方式中，该癌症是EGFR阳性癌症。在一些实施方式中，该癌症选自结肠癌、肾癌、结直肠癌、肺癌、胃癌、卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、头颈癌、脑癌、膀胱癌和肝癌。在优选的实施方式中，该癌症选自结直肠癌、头颈癌、肾癌和皮肤癌。

在一些实施方式中，该方法进一步包括向受试者施用第二治疗剂。在一些实施方式中，该第二治疗剂选自抗体、化疗剂和小分子药物。在一些实施方式中，该第二治疗剂选自布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)抑制剂、PI3K抑制剂、HDAC抑制剂、ERK抑制剂、MAPK抑制剂、PD-1/PD-L1抑制剂、CTLA-4抑制剂、TIGIT抑制剂、TIM3抑制剂、VEGF抑制剂和糖皮质激素。

在另一方面，本公开提供本文公开的双特异性抗体或其抗原结合片段、本文公开的药物组合物或本文公开的缀合物在制备用于治疗受试者的癌症的药物中的用途。

在又一方面，本公开提供本文公开的双特异性抗体或其抗原结合片段、本文公开的药物组合物或本文公开的缀合物用于治疗受试者的癌症。

在本文公开的用途的一些实施方式中，该癌症是EGFR阳性癌症。在一些实施方式中，该癌症选自结肠癌、肾癌、结直肠癌、肺癌、胃癌、卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、头颈癌、脑癌、膀胱癌和肝癌。在优选的实施方式中，该癌症选自结直肠癌、头颈癌、肾癌和皮肤癌。

在一些实施方式中，本文公开的双特异性抗体或其抗原结合片段、本文公开的药物组合物或本文公开的缀合物与第二治疗剂联合。在一些实施方式中，该第二治疗剂选自抗体、化疗剂和小分子药物。在一些实施方式中，该第二治疗剂选自布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)抑制剂、PI3K抑制剂、HDAC抑制剂、ERK抑制剂、MAPK抑制剂、PD-1/PD-L1抑制剂、CTLA-4抑制剂、TIGIT抑制剂、TIM3抑制剂、VEGF抑制剂和糖皮质激素。

附图说明

可通过参考描述了利用本发明原理的示例性实施方式的以下详细描述和附图来获得对本发明的特征和优点的理解。在附图中：

图1示意性显示了EGFR×LAG3双特异性抗体(BsAb)CMD005的结构。

图2A显示了通过ELISA测量的EGFR×LAG3 BsAb CMD005针对重组人EGFR的结合。

图2B显示了通过ELISA测量的EGFR×LAG3 BsAb CMD005针对重组人LAG3的结合。

图3A显示了通过流式细胞术测量的EGFR×LAG3 BsAb CMD005针对表达EGFR的细胞系Caco-2的结合。

图3B显示了通过流式细胞术测量的EGFR×LAG3 BsAb CMD005针对活化的T细胞表面的LAG3的结合。

图4A显示了通过ELISA测量的EGFR×LAG3 BsAb CMD005在阻断EGFR和EGF之间相互作用的能力。

图4B显示了通过ELISA测量的EGFR×LAG3 BsAb CMD005在阻断LAG3和FGL1之间相互作用的能力。

图5显示了通过流式细胞术测量的EGFR×LAG3 BsAb CMD005在阻断LAG3和Raji细胞表达的MHC II类分子之间相互作用的能力。

图6A显示了EGFR×LAG3 BsAb CMD005在体外对A431细胞的生长抑制。

图6B显示了EGFR×LAG3 BsAb CMD005在体外对Caco-2细胞的生长抑制。

图6C显示了EGFR×LAG3 BsAb CMD005在体外对Achn细胞的生长抑制。

图7显示了用CMD005治疗的小鼠在治疗后15hr、39hr、63hr和87hr血浆内EGFR×LAG3 BsAb CMD005的浓度。

图8A显示了通过肿瘤体积测量的hLAG3-c57 BL/6小鼠中EGFR×LAG3BsAb CMD005对MC38-hEGFR肿瘤生长的抑制。

图8B显示了肿瘤生长抑制测定中所有组的hLAG3-c57 BL/6小鼠的体重。

发明详述

通过结合附图和以下实施方式的详细描述，本发明的上述特征和优点及其附加特征和其优点将在下文中得到更清楚的理解。

此处参照附图描述的实施方式是解释性的、说明性的，并用于普遍理解本发明。实施方式不应解释为限制本发明的范围。相同或相似的要素和具有相同或相似功能的要素在整个说明书中使用相似的附图标记表示。

除非另有说明或定义，否则所使用的所有术语具有技术人员所清楚的本领域通常的含义。例如参考标准手册，例如Leuenberger,HGW,Nagel,B.和Klbl,H.编辑,“Amultilingual glossary of biotechnological terms:(IUPAC Recommendations)”，Helvetica Chimica Acta(1995)，CH-4010Basel，瑞士；Sambrook等人，“MolecularCloning:A Laboratory Manual”(第2版)，卷1-3，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)；F.Ausubel等人编辑，“Current protocols in molecular biology”，GreenPublishing and Wiley InterScience，纽约(1987)；Roitt等人，“Immunology”(第6版)，Mosby/Elsevier，爱丁堡(2001)；和Janeway等人“，Immunology”(第6版)，Garland SciencePublishing/Churchill Livingstone，纽约(2005)，以及上文引用的通常背景技术。

定义

如本文所用，单数形式“一种”、“一个”和“该”包括复数对象，除非上下文另有明确表示。因此，例如，提及“一种抗体”包括多种抗体以及在一些实施方式中提及“一个抗体”包括多个抗体，诸如此类。

除非另有说明或定义，否则术语“包含”及其变体诸如“包括”和“含有”应理解为意味着包含所述的元素或步骤或元素组或步骤组，但不排除任何其他元素或步骤或元素或步骤的组。

如本文所用，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子，其具有特异性结合特定抗原的能力。抗体通常在每条重链和轻链中包含可变区和恒定区。抗体重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(如效应细胞)和补体系统的组分如C1q(补体激活经典路径中的第一组分)。因此，大多数抗体具有共同形成与抗原结合的抗体部分的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。

“轻链可变区(VL)”或“重链可变区(VH)”由间插三个“互补决定区”或“CDR”的“框架”区组成。框架区用于调整CDR，以特异性结合抗原表位。CDR包括抗体中主要负责抗原结合的氨基酸残基。VL结构域和VH结构域从氨基端到羧基端都包含以下框架区(FR)和CDR区：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。VL结构域的CDR1、CDR2和CDR3在本文中也分别称为LCDR1、LCDR2和LCDR3；VH结构域的CDR1、CDR2和CDR3在本文中也分别称为HCDR1、HCDR2和HCDR3。

每个VL结构域和VH结构域的氨基酸排列与CDR的任何常规定义一致。常规定义包括Kabat定义(Kabat,Sequences of Proteins of Immunological Interest(NationalInstitutes of Health,Bethesda,MD,1987和1991))、Chothia定义(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917,1987；Chothia等人，Nature342:878-883,1989)；Chothia KabatCDR的复合，其中CDR-H1是Chothia CDR和Kabat CDR的复合；Oxford Molecular的抗体建模软件所使用的AbM定义；以及Martin等人的CONTACT定义(万维网bioinfo.org.uk/abs)。Kabat提供了广泛使用的编号惯例(Kabat编号系统)，其中不同重链之间或不同轻链之间的对应残基被赋予相同的编号。本公开可以使用根据这些编号系统中的任一项定义的CDR，但是优选的实施方式使用Kabat定义的CDR。

基于抗体的重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白分子可以分为五个类型(同种型)：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且可被进一步分为不同的亚型，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2等。基于轻链的氨基酸序列，抗体的轻链可分类为lambda(λ)链或kappa(κ)链。

如本文所用的术语“抗体”应以其最广泛的含义理解，并且包括单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、抗体片段和含有至少两个不同抗原结合区的多特异性抗体(例如双特异性抗体)。抗体可含有额外的修饰，如非天然存在的氨基酸、Fc区中的突变、以及糖基化位点的突变。抗体还包括翻译后修饰的抗体、含有抗体的抗原决定簇的融合蛋白、以及含有对抗原识别位点的任何其他修饰的免疫球蛋白分子，只要这些抗体显示出期望的生物活性即可。

本发明的上下文中的术语“双特异性抗体”应该被理解为具有由不同抗体序列限定得两个不同的抗原结合区的抗体。这可以被理解为与不同的靶标结合，但也包括与一个靶标的不同表位结合。本文使用的术语“双特异性抗体”应以其最广泛的含义理解，并且包括全长双特异性抗体及其抗原结合片段。双特异性抗体可含有额外的修饰，如非天然存在的氨基酸、Fc区中的突变、以及糖基化位点的突变。双特异性抗体还包括翻译后修饰的抗体、含有抗体的抗原决定簇的融合蛋白、以及含有对抗原识别位点的任何其他修饰的免疫球蛋白分子，只要这些抗体显示出期望的生物活性即可。

如本文所用，术语抗体的“抗原结合片段”是指保留特异性结合抗原能力的一个或多个抗体的片段。已显示抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段执行。

术语抗体的“抗原结合部分”所涵盖的抗原结合片段的实例包括：(i)Fab片段，其是由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)₂片段，其是包含两个在铰链区通过二硫键连接的Fab片段的二价片段；(iii)Fab’片段，其本质上是具有部分铰链区的Fab；(iv)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(v)Fd’片段，其具有VH和CH1结构域以及在CH1结构域C端的一个或多个半胱氨酸残基；(vi)Fv片段，其由抗体的单臂的VL和VH结构域组成；(vii)dAb片段，其由VH结构域组成；(viii)分离的互补决定区(CDR)；和(ix)纳米抗体，其是含有单个可变结构域和两个恒定结构域的重链可变区。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由不同的基因编码，但它们可以使用重组方法通过能够使它们制造成单一蛋白链的合成接头连接，其中在该单一蛋白链中VL和VH区配对以形成单价分子(称为单链Fv(scFv))。此类单链抗体也应该被涵盖于术语抗体的“抗原结合片段”中。此外，该术语也包括“线性抗体”，其包含与互补轻链多肽共同形成抗原结合区的一对串联的Fd片段(VH-CH1-VH-CH1)，和保留了抗原结合活性的任何上述片段的修饰版本。

这些抗原结合片段可以使用本领域技术人员已知的常规技术获得，并以与完整抗体相同的方式筛选片段的效用。

如本文所用，术语“结合”或“特异性结合”是指两种分子之间的非随机结合反应，如抗体和其靶抗原之间的非随机结合反应。抗体的结合特异性可基于亲和力(Affinity)和/或亲合力(Avidity)确定。亲和力由抗体与抗原解离的平衡常数(KD)表示，是抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间的结合强度的衡量：KD值越小，抗原决定簇与抗体之间的结合强度越强。或者，亲和力也可以表示为亲和力常数(KA)，其是1/KD。

亲合力是抗体与相关抗原之间的结合强度的衡量。亲合力涉及抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间的亲和力以及抗体上存在的相关结合位点的数量。通常，抗体将以10^-5至10^-12M或更小的解离常数(KD)，优选以10^-7至10^-12M或更小，更优选以10^-8至10^-12M的解离常数(KD)与抗原结合，和/或以至少10⁷M^-1，优选至少10⁸M^-1，更优选至少10⁹M^-1，如至少10¹²M^-1的结合亲和力与抗原结合。通常认为任何大于10^-4M的K_D值指示非特异性结合。抗体与抗原或抗原决定簇的特异性结合可以通过本身已知的任何合适的方式测定，包括例如斯卡查德分析和/或竞争性结合测定，如放射免疫测定(RIA)、酶免疫测定(EIA)和三明治竞争测定和本领域中本身已知的不同变型。

术语“表位”是指抗原上抗体结合的位点。表位可以由连续氨基酸或通过一种或多种蛋白质的三级折叠而并置的非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位(也称为线性表位)通常在暴露于变性溶剂后保留，而通过三级折叠形成的表位(也称为构象表位)通常在变性溶剂的处理中丢失。表位通常包括处于独特空间构象的至少3个，更通常地至少5个或8-10个氨基酸。表位限定了抗体的最小结合位点，因此是抗体或其抗原结合片段的特异性靶标。

如本文所用，术语“序列同一性”是指两条序列(氨基酸)对齐后在相同位置具有相同残基的程度。例如，“氨基酸序列与SEQ ID NO：Y是X％相同的”是指该氨基酸序列与SEQID NO：Y的同一性百分比，并被阐述为该氨基酸序列中X％的残基与SEQ ID NO：Y中公开的序列残基相同。通常，使用计算机程序进行此类计算。比较和对齐序列对的示例性程序包括ALIGN(Myers和Miller,1988)、FASTA(Pearson和Lipman,1988；Pearson,1990)以及gappedBLAST(Altschul等人,1997)、BLASTP、BLASTN或者GCG(Devereux等人,1984)。

此外，在确定两条氨基酸序列之间的序列同一性的程度时，技术人员可以考虑所谓的“保守性”氨基酸取代，其通常可以描述为氨基酸残基被替换为具有类似化学结构的另一种氨基酸残基的氨基酸取代，其对多肽的功能、活性或其他生物学性质影响很小或基本上没有影响。此类保守性氨基酸取代在本领域中是众所周知的。

此类保守取代优选地是以下组(a)到(e)中的一个氨基酸被同组中的另一个氨基酸残基取代的取代：(a)小的脂肪族、非极性或弱极性残基：Ala、Ser、Thr、Pro和Gly；(b)极性、带负电的残基及其(不带电的)酰胺：Asp、Asn、Glu和Gln；(c)极性、带正电的残基：His、Arg和Lys；(d)大的脂肪族、非极性残基：Met、Leu、Ile、Val和Cys；以及(e)芳香族残基：Phe、Tyr和Trp。

特别优选的保守取代如下：Ala到Gly或到Ser；Arg到Lys；Asn到Gln或到His；Asp到Glu；Cys到Ser；Gln到Asn；Glu到Asp；Gly到Ala或到Pro；His到Asn或到Gln；Ile到Leu或到Val；Leu到Ile或到Val；Lys到Arg、到Gln或到Glu；Met到Leu、到Tyr或到Ile；Phe到Met、到Leu或到Tyr；Ser到Thr；Thr到Ser；Trp到Tyr；Tyr到Trp；和/或Phe到Val、到Ile或到Leu。

如本文所用，术语“载体”是指能够运送与其连接的另一种核酸的核酸分子。

如本文所用，术语“宿主细胞”是指已引入表达载体的细胞。

术语“药学上可接受”是指载体或赋形剂与组合物的其他成分相容并且对其接受者没有大量毒害，和/或此类载体或赋形剂被批准或可被批准包含在对人肠胃外施用的药物组合物中。

如本文所用，术语“治疗”、“处理”等，指施用药剂或进行程序，以便获得效果。这些效果可以就完全或部分地预防疾病或其症状而言是预防性的，和/或可以就影响疾病和/或疾病症状的部分或完全治愈而言是治疗性的。如本文所用，“治疗”可包括治疗哺乳动物，特别是人的疾病或病症(例如,癌症)，并且包括：(a)在对疾病易感而尚未被诊断为患病的受试者中预防该疾病或疾病症状的发生(例如，包括可能与原代疾病相关或由其引起的疾病)；(b)抑制疾病，即阻止其发展；和(c)缓解疾病，即导致疾病的消退。治疗可指在治疗或改善或预防癌症方面取得成功的任何指示，包括任何客观或主观参数，如消除；缓解；减少症状或使疾病病况对患者而言更容易忍受；减慢恶化或衰退速率；或使恶化的终点没那么使人虚弱。症状的治疗或改善基于一个或多个客观或主观参数；包括医生检查的结果。因此，术语“治疗”包括施用本文公开的抗体或组合物或缀合物，以预防或延迟、缓解或阻止或抑制与疾病(例如，癌症)相关的症状或病况的发展。术语“治疗效果”是指受试者中疾病、疾病症状或疾病副作用的减少、消除或预防。

如本文所用，术语“有效量”是指当施用至受试者以治疗疾病时足以实现这种疾病的治疗的量。

如本文所用，术语“受试者”是指期望诊断、治疗或疗法的任何哺乳动物受试者。用于治疗目的的“哺乳动物”是指任何归类为哺乳动物的动物，包括人、家畜和农场动物、以及实验室动物、动物园动物、运动动物或宠物动物，如狗、马、猫、牛、绵羊、山羊、猪、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猴子等。

双特异性抗体

本公开提供了双特异性抗体及其抗原结合片段，其包含与EGFR结合的第一抗原结合区，该第一抗原结合区包含第一轻链可变区(VL1)和第一重链可变区(VH1)，和与LAG3结合的第二抗原结合区，该第二抗原结合区包含第二轻链可变区(VL2)和第二重链可变区(VH2)，其中VL1包含分别具有如SEQ ID NO:1-3所示的氨基酸序列的LCDR1-3；该VH1包含分别具有如SEQ ID NO:5-7所示的氨基酸序列的HCDR1-3；该VL2包含分别具有如SEQ ID NO:9-11所示的氨基酸序列的LCDR1-3；并且该VH2包含分别具有如SEQ ID NO:13-15所示的氨基酸序列的HCDR1-3。

在一些实施方式中，CDR序列根据Kabat编号系统定义。

当根据Kabat编号系统定义CDR序列时，本文公开的抗体的VL1包含分别具有如SEQID NO：1(QASQDISNYLN)、SEQ ID NO：2(DASNLET)和SEQ ID NO：3(QHFDHLPLA)所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3，本文公开的抗体的VH1包含分别具有如SEQ ID NO：5(SGDYYWT)、SEQ ID NO：6(HIYYSGNTNYNPSLKS)和SEQ ID NO：7(DRVTGAFDI)所示的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3；本文公开的抗体的VL2包含分别具有如SEQ ID NO：9(SGSSSNIGSNAVS)、SEQ ID NO：10(YDDLLPS)和SEQ ID NO：11(AAWDDSLNAFV)所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3，本文公开的抗体的VH2包含分别具有如SEQ ID NO：13(SYGIS)、SEQ ID NO：14(WISAYNGNTNYAQKLQG)和SEQ ID NO：15(DSSSWWVDAFDI)所示的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3。

在一些本文公开的双特异性抗体或其抗原结合片段的实施方式中，VL1包含与SEQID NO:4具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列；VH1包含与SEQ ID NO:8具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列；VL2包含与SEQ ID NO:12具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列；并且VH2包含与SEQ ID NO:16具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方式中，VL1包含如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列通过插入、缺失和/或取代其中的一个或多个氨基酸而形成的功能变体，前提是该功能变体保留与EGFR结合的能力。在一些实施方式中，VH1包含如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列通过插入、缺失和/或取代其中的一个或多个氨基酸而形成的功能变体，前提是该功能变体保留与EGFR结合的能力。在一些实施方式中，VL2包含如SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列通过插入、缺失和/或取代其中的一个或多个氨基酸而形成的功能变体，前提是该功能变体保留与LAG3结合的能力。在一些实施方式中，VH2包含如SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列通过插入、缺失和/或取代其中的一个或多个氨基酸而形成的功能变体，前提是该功能变体保留与LAG3结合的能力。

功能变体包含与亲本多肽的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。

在功能变体的上下文中，插入、缺失和/或取代的氨基酸的数量优选不超过亲本氨基酸序列中氨基酸总数的40％，更优选不超过35％，更优选是亲本氨基酸序列中氨基酸总数的1％到33％，更优选是5％到30％，更优选是10％到25％，更优选是15％到20％。例如，插入、缺失和/或取代的氨基酸的数量可以是1到20，优选是1到10，更优选是1到7，还更优选是1到5，最优选是1到2。在优选的实施方式中，插入、缺失和/或取代的氨基酸的数量为1、2、3、4、5、6或7。

在一些实施方式中，插入、缺失和/或取代可以在框架(FR)区，例如FR1、FR2、FR3和/或FR4处进行。

在一些实施方式中，一个或多个氨基酸的取代可以是一个或多个氨基酸的保守取代。此类保守取代优选地是以下组(a)到(e)中的一个氨基酸被同组中的另一个氨基酸残基取代的取代：(a)小的脂肪族、非极性或弱极性残基：Ala、Ser、Thr、Pro和Gly；(b)极性、带负电的残基及其(不带电的)酰胺：Asp、Asn、Glu和Gln；(c)极性、带正电的残基：His、Arg和Lys；(d)大的脂肪族、非极性残基：Met、Leu、Ile、Val和Cys；以及(e)芳香族残基：Phe、Tyr和Trp。

特别优选的保守取代如下：Ala到Gly或到Ser；Arg到Lys；Asn到Gln或到His；Asp到Glu；Cys到Ser；Gln到Asn；Glu到Asp；Gly到Ala或到Pro；His到Asn或到Gln；Ile到Leu或到Val；Leu到Ile或到Val；Lys到Arg、到Gln或到Glu；Met到Leu、到Tyr或到Ile；Phe到Met、到Leu或到Tyr；Ser到Thr；Thr到Ser；Trp到Tyr；Tyr到Trp；和/或Phe到Val、到Ile或到Leu。

在优选的实施方式中，VL1包含如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；VH1包含如SEQID NO:8所示的氨基酸序列；VL2包含如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列；并且VH2包含如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。

本文公开的双特异性抗体可包含Fc区，该Fc区包含抗体的CH2和CH3。

Fc区可以是任何同种型，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，并且可包含一种或多种突变或修饰。在一个实施方式中，Fc区是IgG1同种型或由其衍生的，任选地具有一个或多个突变或修饰。在一个实施方式中，Fc区是人IgG1 Fc。

在一个实施方式中，Fc区是效应功能缺陷的。例如，Fc区可以是IgG1同种型，或非IgG1型，例如IgG2、IgG3或IgG4，其已发生突变，使得其介导如ADCC的效应功能的能力降低甚至消除。此类突变在Dall'Acqua WF等人，J Immunol.177(2)：1129-1138(2006)和Hezareh M,J Virol.；75(24)：12161-12168(2001)中已有描述。

在一个实施方式中，Fc区包含去除用于Asn连接的糖基化的受体位点的突变或以其他方式被操纵以改变糖基化特性。例如，在IgG1 Fc区中，可以使用N297Q突变以去除Asn连接的糖基化位点。因此，在一个具体实施方式中，Fc区包含具有N297Q突变的IgG1序列。

在进一步的实施方式中，Fc区被糖工程化以减少岩藻糖并因此增强ADCC，例如通过在抗体产生过程中向培养基中添加化合物来实现，如US2009317869中所述或者如vanBerkel等人(2010)Biotechnol.Bioeng.105:350中所述，或者通过使用FUT8敲除细胞来实现,例如Yamane-Ohnuki等人(2004)Biotechnol.Bioeng 87:614中所述。或者，可以使用等人(1999)Nature Biotech 17:176描述的方法来优化ADCC。在进一步的实施方式中，Fc区被工程化以增强补体激活，例如在Natsume等人(2009)Cancer Sci.100：2411中所述。

在一些实施方式中，双特异性抗体包含：第一多肽链，其从N端至C端包含：VH2-CH1-CH2-CH3-L1-VH1-L2-VL1；和第二多肽链，其从N端至C端包含：VL2-CL；其中CH1表示免疫球蛋白重链的恒定区的第一结构域；CH2表示免疫球蛋白重链的恒定区的第二结构域；CH3表示免疫球蛋白重链的恒定区的第三结构域；CL表示免疫球蛋白轻链的恒定区；且L1和L2各自独立地表示任选的接头。

在一些实施方式中，双特异性抗体包含第一多肽链的两个拷贝和第二多肽链的两个拷贝。

在一些实施方式中，CH1、CH2和CH3中的每一个独立地衍生自免疫球蛋白同种型IgG(例如，人IgG)，优选地衍生自选自IgG1、IgG2和IgG4(例如，人IgG1、IgG2和IgG4)的IgG亚型。在优选的实施方式中，CH1、CH2和CH3中的每一个独立地衍生自IgG1。

在一些实施方式中，CH1-CH2-CH3包含如SEQ ID NO:21-23中任一项所示的氨基酸序列。在优选的实施方式中，CH1-CH2-CH3包含如SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列。

在一些实施方式中，CL衍生自λ轻链或κ轻链。在优选的实施方式中，CL衍生自κ轻链。

在一些实施方式中，CL包含如SEQ ID NO:24-25中任一项所示的氨基酸序列。在优选的实施方式中，CL包含如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列。

在一些实施方式中，接头包含(G4S)n的氨基酸序列，其中n是选自1-5的整数。在一些实施方式中，接头可包含如GGGGS(SEQ ID NO:26)所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，接头可包含如GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:27)所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，接头可包含如GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:28)所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，接头可包含如GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:19)所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，接头可包含如GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:29)所示的氨基酸序列。在优选的实施方式中，接头包含如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列。

在一些实施方式中，第一多肽链包含与SEQ ID NO:17具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列；并且第二多肽链包含与SEQ ID NO:18具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方式中，第一多肽链包含如SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列通过插入、缺失和/或取代其中的一个或多个氨基酸而形成的功能变体，前提是该功能变体保留与EGFR和/或LAG3结合的能力。在一些实施方式中，第二多肽链包含如SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列通过插入、缺失和/或取代其中的一个或多个氨基酸而形成的功能变体，前提是该功能变体保留与LAG3结合的能力。

功能变体包含与亲本多肽的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方式中，插入、缺失和/或取代的氨基酸的数量优选不超过亲本氨基酸序列中氨基酸总数的40％，更优选不超过35％，更优选是亲本氨基酸序列中氨基酸总数的1％到33％，更优选是5％到30％，更优选是10％到25％，更优选是15％到20％。例如，插入、缺失和/或取代的氨基酸的数量可以是1到50，优选是1到20，更优选是1到10，还更优选是1到5，最优选是1到5。在优选的实施方式中，插入、缺失和/或取代的氨基酸的数量为1、2、3、4、5、6或7。在一些实施方式中，插入、缺失和/或取代可以在框架(FR)区，例如FR1、FR2、FR3和/或FR4；和/或恒定区，例如CL、CH1、CH2和/或CH3进行。

在一些实施方式中，一个或多个氨基酸的取代可以是一个或多个氨基酸的保守取代。上文中已描述了保守取代的实例。

在优选的实施方式中，第一多肽链包含如SEQ ID NO.17所示的氨基酸序列；且第二多肽链包含如SEQ ID NO.18所示的氨基酸序列。

核酸

本公开提供了核酸，其包含编码本文公开的双特异性抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。

术语“核酸”包含单链和双链核苷酸聚合物。核酸可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或任何一种核苷酸的修饰形式。所述修饰包括碱基修饰，如溴化尿苷和肌苷衍生物，核糖修饰，如2'，3'-二脱氧核糖，以及核苷酸间连接的修饰，如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸脂、二硒代磷酸脂、苯硫代磷酸酯、苯胺磷酸酯和氨基磷酸酯。

例如，本发明提供编码本文公开的任何一个重链可变区序列的核酸分子。本发明还提供了核酸分子，其与编码本文公开的任何一个重链可变区序列的核酸分子至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同。

例如，本发明提供编码本文公开的任何一个轻链可变区序列的核酸分子。本发明还提供了核酸分子，其与编码本文公开的任何一个轻链可变区序列的核酸分子至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同。

例如，本发明提供核酸分子，其编码：(i)本文公开的任何一个重链可变区序列和(ii)本文公开的任何一个轻链可变区序列。本发明还提供了核酸分子，其与核酸至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同，该核酸编码：(i)本文公开的任何一个重链可变区序列和(ii)本文公开的任何一个轻链可变区序列。

例如，本发明提供核酸分子，其编码包含本文公开的任何一个重链可变区序列的CDR序列的重链可变区序列。本发明还提供了核酸分子，其编码包含CDR序列的重链可变区序列，该CDR序列与本文公开的任何一个重链可变区序列的CDR序列至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的相同。

例如，本发明提供核酸分子，其编码包含本文公开的任何一个轻链可变区序列的CDR序列的轻链可变区序列。本发明还提供了核酸分子，其编码包含CDR序列的轻链可变区序列，该CDR序列与本文公开的任何一个轻链可变区序列的CDR序列至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同。

例如，本发明提供核酸分子，其编码：(i)包含本文公开的任何一个重链可变区序列的CDR序列的重链可变区序列和(ii)包含本文公开的任何一个轻链可变区序列的CDR序列的轻链可变区序列。本发明还提供核酸分子，其编码：(i)包含CDR序列的重链可变区序列，该CDR序列与本文公开的任何一个重链可变区序列的CDR序列至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同和(ii)包含CDR序列的轻链可变区序列，该CDR序列与本文公开的任何一个轻链可变区序列的CDR序列至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同。

在一些实施方式中，核酸是核糖核苷酸(RNA)或脱氧核糖核苷酸(DNA)。在一些实施方式中，本发明提供了包含编码本文公开的双特异性抗体的核苷酸序列的核糖核苷酸(RNA)。在一些实施方式中，本发明提供了包含编码本文公开的双特异性抗体的脱氧核苷酸序列的脱氧核糖核苷酸。

在一些实施方式中，脱氧核糖核苷酸(DNA)可被引入体内人体细胞中。在一些实施方式中，本发明的脱氧核糖核苷酸(DNA)被包含在载体或递送剂中。在一些实施方式中，本发明的脱氧核糖核苷酸(DNA)被整合进细胞的基因组中。

在一些实施方式中，核糖核苷酸(RNA)可被引入体内人体细胞中。在一些实施方式中，本发明的核糖核苷酸(RNA)被包含在载体或递送剂中。

载体

本公开提供了包含本文公开的核酸的载体。

在一些实施方式中，载体是能表达多肽的表达载体，该多肽包含双特异性抗体的重链或轻链可变区。例如，本发明提供包含上述任一个核酸分子的表达载体。

任何载体都可能适用于本公开。在一些实施方式中，载体是病毒载体。在一些实施方式中，载体是逆转录病毒载体、DNA载体、鼠白血病病毒载体、SFG载体、质粒、RNA载体、腺病毒载体、杆状病毒载体、Epstein Barr病毒载体、乳头多瘤空泡病毒载体、痘苗病毒载体、单纯疱疹病毒载体、腺病毒相关载体(AAV)、慢病毒载体或其任意组合。合适的示例性载体包括例如pGAR、pBABE-puro、pBABE-neo largeTcDNA、pBABE-hygro-hTERT、pMKO.1GFP、MSCV-IRES-GFP、pMSCV PIG(Puro IRES GFP空质粒)、pMSCV-loxp-dsRed-loxp-eGFP-Puro-WPRE、MSCV IRES萤光素酶、pMIG、MDH1-PGK-GFP_2.0、TtRMPVIR、pMSCV-IRES-mCherry FP、pRetroX GFP T2A Cre、pRXTN、pLncEXP和pLXIN-Luc。

表达载体可以是任何合适的重组表达载体。合适的载体包括被设计用于繁殖和扩增或用于表达或两者的载体，如质粒和病毒。例如，载体可以选自pUC系列(Fermentas LifeSciences,Glen Burnie,Md.)、pBluescript系列(Stratagene,LaJolla,Calif)、pET系列(Novagen,Madison,Wis.)、pGEX系列(Pharmacia Biotech,Uppsala，瑞典)和pEX系列(Clontech,Palo Alto,Calif.)。也可以使用噬菌体载体，如λGT10、λGT11、λZapII(Stratagene)、λEMBL4和λNM1149。可用于本公开上下文中的植物表达载体的实例包括pBI01、pBI101.2、pBI101.3、pBI121和pBIN19(Clontech)。可用于本公开上下文中的动物表达载体的实例包括pcDNA、pEUK-Cl、pMAM和pMAMneo(Clontech)。

重组表达载体可以使用标准重组DNA技术制备，例如Sambrook等人,MolecularCloning：A Laboratory Manual，第三版，Cold Spring Harbor Press,Cold SpringHarbor,N.Y.2001；以及Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,GreenePublishing Associates and John Wiley&Sons,NY,1994中所述。可以制备环形或线性的表达载体构建体以含有在原核或真核宿主细胞中具有功能的复制系统。复制系统可以衍生自例如ColEl、2μ质粒、λ、SV40、牛乳头瘤病毒等。

例如，载体可以是包含编码本文公开的双特异性抗体的核苷酸序列的腺病毒载体。该载体可以施用于受试者的体内，之后进入受试者体内的细胞，从而编码本文公开的双特异性抗体的核苷酸序列被整合进细胞的基因组中，并随后该细胞表达本文公开的双特异性抗体。

宿主细胞

本公开提供了包含本文公开的核酸或本文公开的载体的宿主细胞。

任何细胞都可以用作本公开的核酸或载体的宿主细胞。在一些实施方式中，细胞可以是原核细胞、真菌细胞、酵母细胞或高等真核细胞，如哺乳动物细胞。合适的原核细胞包括但不限于真细菌，如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如肠杆菌科(Enterobactehaceae)，如埃希氏杆菌属(Escherichia)，例如大肠杆菌(E.coli)；肠杆菌属(Enterobacter)；欧文氏菌属(Erwinia)；克雷伯氏菌属(Klebsiella)；变形杆菌属(Proteus)；沙门氏菌属(Salmonella)，例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)；沙雷氏菌属(Serratia)，例如粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescans)；和志贺氏菌属(Shigella)；芽孢杆菌属(Bacilli)，如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)；假单胞菌属(Pseudomonas)，如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)；和链霉菌属(Streptomyces)。在一些实施方式中，细胞是人细胞。在一些实施方式中，细胞是免疫细胞。在一些实施方式中，宿主细胞包括例如CHO细胞，如CHOS细胞和CHO-K1细胞，或HEK293细胞，如HEK293A、HEK293T和HEK293FS。

本发明的宿主细胞通过在体外或活体外引入本文公开的载体或本文公开的核酸来制备。本发明的宿主细胞可施用于受试者的体内，并且该宿主细胞在体内表达本文公开的双特异性抗体。

本发明提供其中已引入上述任何载体的宿主细胞。该发明进一步提供制备本发明的双特异性抗体的方法，其中该方法包括a)在适合生产双特异性抗体的条件下培养本发明第四方面的宿主细胞；和b)从培养物中获得该双特异性抗体。

药物组合物

本公开提供包含本文公开的双特异性抗体或其抗原结合片段的药物组合物，和药学上可接受的载体或赋形剂。

双特异性抗体或其抗原结合片段或本发明的药剂(在本文中也指“活性成分”)和其衍生物、其片段、其类似物和其同源物，可以掺入药物组合物便于施用。此类组合物通常包含双特异性抗体或其抗原结合片段或药剂和药学上可接受的载体。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”旨在包括与药物使用兼容的任何和所有的溶剂、分散介质、涂料、抗菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。此类载体或赋形剂的优选的实例包括但不限于水、盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液和5％的人血清白蛋白。还可以使用脂质体和无水媒介物(如固定油)。将此类介质和药剂用于药物活性物质的用途是本领域公知的。除了任何常规媒介或药剂与活性化合物不兼容的情况下，考虑其在组合物中的用途。补充活性化合物也可以掺入组合物中。

在一些实施方式中，药物组合物进一步包含第二治疗剂。在一些实施方式中，第二治疗剂选自抗体、化疗剂和小分子药物。在一些实施方式中，第二治疗剂选自布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)抑制剂、PI3K抑制剂、HDAC抑制剂、ERK抑制剂、MAPK抑制剂、PD-1/PD-L1抑制剂、CTLA-4抑制剂、TIGIT抑制剂、TIM3抑制剂、VEGF抑制剂和糖皮质激素。

在一些实施方式中，治疗剂是化疗剂。化疗剂可包括例如细胞毒剂、抗代谢剂(例如，叶酸拮抗剂、嘌呤类似物、嘧啶类似物等)、拓扑异构酶抑制剂(例如，喜树碱衍生物、蒽二酮、蒽环类、鬼臼毒素、喹啉生物碱等)、抗微管剂(例如，紫杉烷类、长春花生物碱)、蛋白质合成抑制剂(例如，头孢紫杉醇、喜树碱衍生物、喹啉生物碱)、烷化剂(例如，烷基磺酸盐、乙烯亚胺、氮芥、亚硝基脲、铂衍生物、三氮烯等)、生物碱、萜类化合物和激酶抑制剂。

本发明的药用组合物可以被配制为与其预期的施用途径相容。施用途径的实例包括肠胃外施用，例如静脉内、皮内、皮下、口服(例如，吸入)、经皮(即，局部(topical))、经粘膜和直肠施用。用于肠胃外、皮内或皮下应用的溶液或悬浮液可包括以下组分：无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗坏血酸或亚硫酸氢钠等抗氧化剂；螯合剂如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲液，如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及用于调节涨度的试剂，如氯化钠或葡萄糖。pH值可以用酸或碱调节，如盐酸或氢氧化钠。肠胃外制剂可以封装在由玻璃或塑料制成的安瓿瓶、一次性注射器或多剂量小瓶中。

适用于可注射用途的药物组合物包括无菌水溶液(其中是水溶性的)或分散体和用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor EL^TM(BASF，Parsippany，N.J.)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，该组合物必须是无菌的并且应该是易于注射的流体。它在制造和储存条件下必须是稳定的，并且必须防止微生物，如细菌和真菌的污染作用。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)，及其合适的混合物。适当的流动性可以通过例如使用如卵磷脂等的涂层、通过在分散的情况下保持所需的粒度以及通过使用表面活性剂来保持。可通过各种抗菌剂和抗真菌剂来预防微生物的作用，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等。在许多情况下，优选在组合物中包括等渗剂，例如，糖、多元醇，如甘露糖醇、山梨糖醇、氯化钠。通过在组合物中包括延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可以延长可注射组合物的吸收。

无菌可注射溶液可通过将所需量的活性化合物与上文列举的一种成分或成分的组合根据需要掺入适当的溶剂中，然后过滤灭菌来制备。通常，通过将活性化合物掺入无菌媒介物中来制备分散体，该无菌媒介物含有基本分散介质和来自上面列举的那些所需的其他成分。在制备用于无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其产生活性成分加上来自先前其无菌过滤溶液的任何额外所需成分的粉末。

口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用载体。它们可以封装在明胶胶囊中或压制成片剂。为了口服治疗施用的目的，活性化合物可以与赋形剂混合并以片剂、锭剂或胶囊的形式使用。还可以使用用作漱口水的流体载体来制备口服组合物，其中将流体载体中的化合物口服应用并漱口并吐出或吞服。药学上相容的粘合剂和/或佐剂材料可以作为组合物的一部分包括在内。片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可含有任何以下成分或类似性质的化合物：粘合剂，如微晶纤维素、黄芪胶或明胶；赋形剂，如淀粉或乳糖，崩解剂，如海藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂，如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂，如胶体二氧化硅；甜味剂，如蔗糖或糖精；或调味剂，如薄荷、水杨酸甲酯或橙味调味剂。

对于吸入施用，化合物以气溶胶喷雾的形式从压力容器或分配器中递送，该压力容器或分配器含有合适的推进剂，例如气体如二氧化碳，或喷雾器。

全身施用也可以通过经粘膜或经皮方式进行。对于经粘膜或经皮施用，在制剂中使用适合待渗透屏障的渗透剂。此类渗透剂在本领域中通常是已知的，并且包括例如用于经粘膜施用的去污剂、胆汁盐和夫西地酸衍生物。经粘膜施用可通过使用鼻腔喷雾剂或栓剂来完成。对于经皮施用，活性化合物被配制成本领域公知的软膏、药膏、凝胶或乳膏。

活性化合物也可以制成栓剂形式(例如，使用常规栓剂基质，如可可脂和其他甘油酯)或用于直肠递送的保留灌肠剂。

在一个实施方式中，活性化合物与将保护化合物免于从体内快速消除的载体，如控释制剂，包括植入物和微囊化递送系统一起制备，。可使用可生物降解的、生物相容的聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。制备此类制剂的方法对本领域技术人员来说是显而易见的。

本发明提供包含本发明的双特异性抗体或其抗原结合片段的治疗组合物。根据本发明的治疗组合物将与合适的载体、赋形剂和掺入制剂中的其他试剂一起施用以提供改善的转移、递送、耐受等。许多合适的制剂可以在所有药物化学家已知的处方中找到：Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,PA。这些制剂包括，例如，粉末、糊剂、软膏、果冻、蜡、油、脂质、包含囊泡(例如LIPOFECTIN^TM)的脂质(阳离子或阴离子)、DNA缀合物、无水吸收糊剂、水包油和油包水乳液、聚乙二醇乳液(各种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶和含有聚乙二醇的半固体混合物。还参见Powell等人“Compendium of excipients for parenteral formulations”PDA(1998)J Pharm SciTechnol 52:238-311。

缀合物

本公开提供了缀合物，其包含本文公开的双特异性抗体或其抗原结合片段，以及与其缀合的化学部分。

在本公开的上下文中，“缀合物”是共价连接至化学部分的抗体或抗体片段(如抗原结合片段)。化学部分可以是例如药物、毒素、治疗剂、可检测标记、蛋白质、核酸、脂质、纳米颗粒、碳水化合物或重组病毒。抗体缀合物通常称为“免疫缀合物”。当缀合物包含连接至药物(例如，细胞毒剂)的抗体时，缀合物通常被称为“抗体-药物缀合物”或“ADC”。

术语“缀合”或“连接”可指使两个多肽成为一个连续的多肽分子。在一个实施方式中，抗体连接到化学部分。在另一个实施方式中，连接至化学部分的抗体进一步连接至脂质或其他分子至蛋白质或肽以增加其在体内的半衰期。连接可以通过化学或重组方式进行。在一个实施方式中，连接是化学的，其中抗体部分和化学部分之间的反应产生了在两个分子之间形成的共价键以形成一个分子。肽接头(短肽序列)可以任选地包括在抗体和化学部分之间。

可以使用本领域技术人员已知的任何数量的方法将化学部分连接至本发明的抗体。可以使用共价和非共价连接方式。将化学部分连接到抗体的程序根据化学部分的化学结构而变化。多肽通常含有多种官能团；如羧酸(COOH)、游离胺(-NH2)或巯基(-SH)基团，它们可用于与抗体上合适的官能团反应以产生化学部分的结合。或者，抗体被衍生化以暴露或连接额外的反应性官能团。衍生化可能涉及连接许多已知接头分子中的任何一种。接头可以是用于将抗体连接到化学部分的任何分子。接头能够与抗体和化学部分形成共价键。合适的接头是本领域技术人员众所周知的，包括但不限于直链或支链碳接头、杂环碳接头或肽接头。在抗体和化学部分是多肽的情况下，接头可以通过它们的侧基连接至组成氨基酸(如通过与半胱氨酸的二硫键)或连接至末端氨基酸的α碳氨基和羧基。

在一些情况下，当免疫缀合物到达其靶位点时，希望从抗体中释放化学部分。因此，在这些情况下，免疫缀合物将包含在靶位点附近可切割的连接。

酶促活性或免疫缀合物在靶细胞内或靶位点附近所经受的条件可能促使接头裂解以从抗体释放化学部分。

鉴于已报道了用于将各种放射诊断化合物、放射治疗化合物、标记(如酶或荧光分子)、药物、毒素和其他试剂连接至抗体的大量方法，本领域技术人员将能够确定将给定试剂连接到抗体或其他多肽的合适方法。

本文公开的抗体可以衍生化或连接到另一个分子(如另一个肽或蛋白质)。通常，抗体或其部分被衍生化，使得与靶抗原的结合不受衍生化或标记的不利影响。例如，抗体可以功能性连接(通过化学偶联、基因融合、非共价结合或其他方式)到一个或多个其他分子实体，如另一种抗体(例如，双特异性抗体或双体抗体)、检测剂、药剂和/或可介导抗体或抗体部分与另一分子(如链霉亲和素核心区或多组氨酸标签)结合的蛋白质或肽。

一种类型的衍生抗体是通过交联两种或更多种抗体(相同类型或不同类型)产生的。合适的交联剂包括那些异双功能交联剂，其具有两个被合适的间隔物隔开的明显反应性基团(如间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)或同双功能交联剂(如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)。此类接头是可商购的。

在本文公开的缀合物的一些实施方式中，化学部分选自治疗剂、可检测部分和免疫刺激分子。

在一些实施方式中，治疗剂包括但不限于免疫调节剂、放射性化合物、酶(例如穿孔素)、化疗剂(例如顺铂)或毒素。在一些实施方式中，治疗剂可以是如美登素、格尔德霉素、微管蛋白抑制剂如微管蛋白结合剂(例如奥瑞他汀)，或小沟结合剂如卡奇霉素。

其他合适的治疗剂包括如小分子细胞毒剂，即能够杀死哺乳动物细胞的分子量小于700道尔顿的化合物。此类化合物还可能含有能够产生细胞毒性作用的有毒金属。此外，应理解这些小分子细胞毒剂还包括前药，即在生理条件下衰变或转化以释放细胞毒剂的化合物。此类药剂的实例包括顺铂、美登素衍生物、拉奇霉素(rachelmycin)、卡奇霉素、多西他赛、依托泊苷、吉西他滨、异环磷醯胺、伊立替康、美法仑、米托蒽醌、卟吩姆钠光敏素II、替莫唑胺、托泊替康、葡糖醛酸曲美沙特、奥瑞他汀E、长春新碱和多柔比星；肽细胞毒素，即，具有杀伤哺乳动物细胞能力的蛋白质或其片段。例如，蓖麻毒素、白喉毒素、假单胞菌细菌外毒素A、Dnase和RNase；放射性核素，即元素的不稳定同位素，其在衰减的同时发出一种或多种的α或β粒子或γ射线。例如，碘-131、铼-186、铟-111、钇-90、铋-210和-213、锕-225和砹-213；螯合剂可用于促进这些放射性核素与分子或其多聚体的结合。

在一些实施方式中，可检测部分可选自生物素、链霉亲和素、酶或其催化活性片段、放射性核素、纳米颗粒、顺磁性金属离子或荧光、磷光或化学发光分子。用于诊断目的的可检测部分包括，例如荧光标记、放射性标记、酶、核酸探针和造影剂。

双特异性抗体可以与可检测标记物缀合；例如，能够通过ELISA、分光光度法、流式细胞术、显微镜或诊断成像技术(如计算机断层扫描(CT)、计算机轴向断层扫描(CAT)扫描、磁共振成像(MRI)、核磁共振成像(NMRI)、磁共振断层扫描(MTR)、超声波、纤维光学检查和腹腔镜检查)检测的可检测标记物。具体地，可检测标记物的非限制性实例包括荧光团、化学发光剂、酶促连接、放射性同位素和重金属或化合物(例如，用于通过MRI检测的超顺磁性氧化铁纳米晶体)。例如，有用的可检测标记物包括荧光化合物，包括荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、5-二甲胺-1-萘磺酰氯、藻红蛋白、镧系磷光体等。也可使用生物发光标记物，如萤光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)和黄色荧光蛋白(YFP)。

双特异性抗体或抗原结合片段还可以与可用于检测的酶缀合，如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等。当双特异性抗体或抗原结合片段与可检测的酶缀合时，可以通过添加酶通常会产生可识别的反应产物的额外试剂来检测。例如，当存在辣根过氧化物酶试剂时，过氧化氢和二氨基联苯胺的加入会导致有色反应产物，这可以通过视觉检测到。双特异性抗体或抗原结合片段也可以与生物素缀合，并通过亲和素或链霉亲和素结合的间接测量来检测。应该注意的是，亲和素本身可以与酶或荧光标记结合。

双特异性抗体可以与自标记蛋白标签(例如HaloTag)融合。例如，蛋白质标签可以克隆到恒定区的末端。HaloTag是自标记蛋白标签，其衍生自细菌酶(卤代烷烃脱卤酶)，旨在与合成配体共价结合。在一些情况下，合成配体包含连接至荧光团如近红外荧光团的氯代烷烃接头(Los等人(2008)ACS Chem Biol.3(6):373-82)。

双特异性抗体可以用如钆的磁性试剂标记。抗体也可以用镧系元素(如铕和镝)和锰标记。

顺磁性颗粒如超顺磁性氧化铁也可用作标记。双特异性抗体也可以用第二报道分子(如亮氨酸拉链对序列、第二抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签)识别的预定多肽表位标记。在一些实施方式中，标签由各种长度的间隔臂附接以减少潜在的空间位阻。

双特异性抗体也可以用放射性标记的氨基酸标记。放射性标记可用于诊断和治疗目的。例如，放射性标记可用于通过X射线、发射光谱或其他诊断技术检测靶抗原的表达。多肽标记的实例包括但不限于以下放射性同位素或放射性核苷酸：3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I。

在一些实施方式中，免疫刺激分子是刺激免疫反应的免疫效应分子。例如，免疫刺激分子可以是细胞因子，如IL-2和IFN-γ、趋化因子，如IL-8、血小板因子4、黑色素瘤生长刺激蛋白、补体激活剂；病毒/细菌蛋白结构域，或病毒/细菌肽。

治疗方法

本公开提供了治疗受试者癌症的方法，其包括向受试者施用有效量的本文公开的双特异性抗体或其抗原结合片段、本文公开的药物组合物或本文公开的缀合物。

在本文公开的方法的一些实施方式中，癌症是实体瘤或血液恶性肿瘤。在一些实施方式中，癌症是EGFR阳性癌症。

癌症的实例包括：白血病，例如但不限于急性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病(如成髓细胞性、早幼粒细胞性、髓单核细胞性、单核细胞性、红白血病白血病和骨髓发育异常综合征)、慢性白血病，例如但不限于慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病、慢性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病；真性红细胞增多；淋巴瘤，例如但不限于霍奇金病(Hodgkin's disease)、非霍奇金病；多发性骨髓瘤，例如但不限于冒烟型多发性骨髓瘤、非分泌性骨髓瘤、骨硬化性骨髓瘤、浆细胞白血病、孤立性浆细胞瘤和髓外浆细胞瘤；华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)；未明的单克隆丙种球蛋白病；良性单克隆丙种球蛋白病；重链病；骨骼和结缔组织肉瘤，例如但不限于骨骼肉瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、尤因肉瘤(Ewing's sarcoma)、恶性巨细胞瘤、骨纤维肉瘤、脊索瘤、骨膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤、(血管内皮瘤)、纤维肉瘤、卡波西肉瘤(Kaposi's sarcoma)、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管肉瘤、转移性癌症、神经鞘瘤、横纹肌肉瘤、滑膜肉瘤；脑肿瘤，例如但不限于胶质瘤、成胶质细胞瘤、星细胞瘤、脑干胶质瘤、室管膜瘤、少突神经胶质瘤、非胶质瘤(nonglial tumor)、听神经瘤、颅咽管瘤、成神经管细胞瘤、脑膜瘤、松果体细胞瘤、松果体母细胞瘤、原发性脑淋巴瘤；乳腺癌，包括但不限于腺癌、小叶(小细胞)癌、管内癌、乳房髓样癌、粘液性乳腺癌、管状乳腺癌、乳头状乳腺癌、原发癌、佩吉特病(Paget's disease)和炎症性乳腺癌；肾上腺癌，例如但不限于嗜铬细胞瘤和肾上腺皮质癌；甲状腺癌例如但不限于乳头状或滤泡性甲状腺癌、甲状腺髓样瘤、甲状腺髓样癌和间变性甲状腺癌；GIST-胃肠道间质瘤；胰腺癌，例如但不限于胰岛瘤、胃泌素瘤、高血糖素瘤、舒血管肠肽瘤、生长抑素分泌瘤和类癌瘤或胰岛细胞瘤；垂体癌，例如但不限于库兴氏病(Cushing's disease)、催乳素分泌瘤、肢端肥大症、尿崩症；眼癌，例如但不限于眼黑素瘤如虹膜黑素瘤、脉络膜黑素瘤和睫状体黑素瘤，及视网膜母细胞瘤；阴道癌如鳞状细胞癌、腺癌和黑素瘤；外阴癌如鳞状细胞癌、黑素瘤、腺癌、基底细胞癌、肉瘤和佩吉特病；宫颈癌，例如但不限于鳞状细胞癌和腺癌；子宫癌，例如但不限于子宫内膜癌和子宫肉瘤；卵巢癌，例如但不限于卵巢上皮癌、交界性肿瘤、生殖细胞瘤和间质瘤；食道癌，例如但不限于鳞癌、腺癌、腺样囊性癌、粘液表皮样癌、腺鳞癌、肉瘤、黑素瘤、浆细胞瘤、疣状癌和燕麦细胞(小细胞)癌；胃癌，例如但不限于腺癌、蕈样(息肉状)、溃疡性、表浅扩散型、广泛扩散型、恶性淋巴瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤和癌肉瘤；结肠癌；直肠癌；肝癌，例如但不限于肝细胞癌和肝母细胞癌；胆囊癌，例如但不限于腺癌；胆管癌，例如但不限于乳头状、结节状和弥漫性胆管癌；肺癌，如非小细胞肺癌(NSCLC)、鳞状细胞癌(表皮样癌)、腺癌、大细胞癌和小细胞肺癌(SCLC)；睾丸癌，例如但不限于生殖细胞瘤、精原细胞瘤、间变性、经典(典型)、精母细胞性细胞瘤、非精原细胞瘤、胚胎癌、畸胎瘤癌、绒膜癌(卵黄囊瘤)；前列腺癌，例如但不限于腺癌、平滑肌肉瘤和横纹肌肉瘤；生殖器癌，如阴茎癌；口腔癌，例如但不限于鳞状细胞癌；基底癌；唾液腺癌，例如但不限于腺癌、粘液表皮样癌和腺样囊性癌；咽癌，例如但不限于鳞状细胞癌和疣；皮肤癌，例如但不限于基底细胞癌、鳞状细胞癌和黑素瘤、表浅扩散型黑素瘤、结节性黑素瘤、恶性雀斑样痣黑素瘤、肢端雀斑样痣黑素瘤；肾癌，例如但不限于肾细胞癌、透明细胞肾细胞癌、腺癌、肾上腺样瘤、纤维肉瘤、移行细胞癌(肾盂和/或输尿管)；维尔姆斯瘤(Wilms'tumor)；膀胱癌，例如但不限于移行细胞癌、鳞状细胞癌、腺癌、癌肉瘤。另外，癌症包括粘液肉瘤、骨原性肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管瘤内皮肉瘤、间皮瘤、滑膜瘤、血管母细胞瘤、上皮癌、囊腺癌、支气管癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌和乳头状腺癌。优选地，该癌症选自乳腺癌、黑素瘤、前列腺癌、卵巢癌、结直肠癌、肺癌或胶质瘤癌。

在一些实施方式中，癌症选自结肠癌、肾癌、结直肠癌、肺癌、胃癌、卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、头颈癌、脑癌、膀胱癌和肝癌。在优选的实施方式中，该癌症选自结直肠癌、头颈癌、肾癌和皮肤癌。

在一些实施方式中，施用于受试者的剂量可随实施方式、所用药物、给药方法以及被治疗的位点和受试者而变化。然而，剂量应足以提供治疗反应。临床医生可以确定施用于人或其他受试者以治疗医学病况的有效量。治疗有效所需的精确量可取决于许多因素，如抗体的活性和施用途径。

可将一剂本文所述的抗体、组合物或缀合物一次或以一系列亚剂量在合适的时间段内施用给哺乳动物，例如根据需要每天、每半周、每周、每两周、每半月、每两个月、每半年或每年施用一次。包含有效量的抗体、组合物或缀合物的剂量单位可以以单日剂量施用，或者总日剂量可以根据需要以每天施用的两个、三个、四个或更多个分剂量施用。

合适的施用方式可以由医生选择。施用途径可以是肠胃外施用，例如通过注射施用、经鼻施用、经肺施用或经皮施用。可以通过静脉内注射、肌内注射、腹膜内注射、皮下注射进行全身或局部施用。在一些实施方式中，选择抗体、组合物或缀合物用于肠胃外递送、吸入或通过消化道递送，如口服。施用剂量和方法可以根据受试者的重量、年龄、状态等而变化，并且可以适当地选择。

在一些实施方式中，该方法进一步包括向受试者施用第二治疗剂。在某些实施方式中，本文公开的抗体、组合物或缀合物在第二治疗剂施用之前、基本上同时或之后施用。

在一些实施方式中，第二治疗剂选自抗体、化疗剂和小分子药物。在一些实施方式中，第二治疗剂选自布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)抑制剂、PI3K抑制剂、HDAC抑制剂、ERK抑制剂、MAPK抑制剂、PD-1/PD-L1抑制剂、CTLA-4抑制剂、TIGIT抑制剂、TIM3抑制剂、VEGF抑制剂和糖皮质激素。

在一些实施方式中，第二治疗剂是化疗剂。化疗剂可包括例如细胞毒剂、抗代谢剂(例如，叶酸拮抗剂、嘌呤类似物、嘧啶类似物等)、拓扑异构酶抑制剂(例如，喜树碱衍生物、蒽二酮、蒽环类、鬼臼毒素、喹啉生物碱等)、抗微管剂(例如，紫杉烷、长春花生物碱)、蛋白质合成抑制剂(例如，头孢紫杉醇、喜树碱衍生物、喹啉生物碱)、烷化剂(例如，烷基磺酸盐、乙烯亚胺、氮芥、亚硝基脲、铂衍生物、三氮烯等)、生物碱、萜类化合物和激酶抑制剂。

医药用途

本公开提供本文公开的双特异性抗体或其抗原结合片段、本文公开的药物组合物或本文公开的缀合物在制备用于治疗受试者癌症的药物中的用途。

本公开还提供了用于治疗受试者的癌症的本文公开的双特异性抗体或其抗原结合片段、本文公开的药物组合物或本文公开的缀合物。

在本文公开的用途的一些实施方式中，癌症是实体瘤或血液恶性肿瘤。在一些实施方式中，癌症是EGFR阳性癌症。在一些实施方式中，癌症选自结肠癌、肾癌、结直肠癌、肺癌、胃癌、卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、头颈癌、脑癌、膀胱癌和肝癌。在优选的实施方式中，该癌症选自结直肠癌、头颈癌、肾癌和皮肤癌。

在一些实施方式中，本文公开的双特异性抗体或其抗原结合片段、本文公开的药物组合物或本文公开的缀合物与第二治疗剂组合。在一些实施方式中，第二治疗剂选自抗体、化疗剂和小分子药物。在一些实施方式中，第二治疗剂选自布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)抑制剂、PI3K抑制剂、HDAC抑制剂、ERK抑制剂、MAPK抑制剂、PD-1/PD-L1抑制剂、CTLA-4抑制剂、TIGIT抑制剂、TIM3抑制剂、VEGF抑制剂和糖皮质激素。

试剂盒

本公开提供了药物套装或试剂盒，其包含一个或多个容器，该容器装有本文描述的药物组合物的一种或多种成分，如本文公开的双特异性抗体或抗原结合片段。任选地，与此类容器相关联的可以是规范药品或生物制品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式的通知，该通知反映了该机构批准用于人体施用的制造、使用或销售。

在一个具体实施方式中，该试剂盒包含本文公开的双特异性抗体的第一容器。在一个具体的实施方式中，该试剂盒包含第一容器，其是含有在真空下作为冻干无菌粉末的双特异性抗体的小瓶，并且该试剂盒进一步包含第二容器，该第二容器包含药学上可接受的流体。

在一个具体实施方式中，本文提供包含双特异性抗体的注射装置。在一个具体实施方式中，注射装置包含无菌溶液中的双特异性抗体。在具体实施方式中，注射装置是注射器。

实施例

以下实施例是为了说明本发明的各种实施方式的目的而给出的，并不意味着以任何方式限制本发明。本实施例连同本文描述的方法目前是优选的实施方式的代表，是示例性的，并不意在限制本发明的范围。本领域技术人员将想到在由权利要求范围限定的涵盖在本发明的精神内的变化和其他用途。

MC38-hEGFR癌细胞购自Kyinno Biotechnology CO.,LTD。通过用人CD3/CD28 T细胞激活剂激活冷冻的PBMC来获得激活的T细胞。其他肿瘤细胞系包括人表皮癌细胞系A431、人淋巴癌细胞系Raji、人结肠癌细胞系Caco-2和肾癌细胞系Achn都购自ATCC。

人EGF蛋白和人FGL1蛋白购自ACROBiosystems。人EGFR/HER1/ErbB1蛋白和人LAG3蛋白购自Sino Biological。抗人IgG(γ链特异性)-R-PE抗体、抗人IgG(Fc特异性)-过氧化物酶抗体和单克隆抗-过氧化物酶购自Sigma。PE抗His标签抗体购自BioLegend。自制抗EGFR mAb和抗LAG3 mAb。

Anti-EGFR mAb和anti-LAG3 mAb的全轻链和重链序列如下所示。

Anti-EGFR mAb

重链：

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSVSSGDYYWTWIRQSPGKGLEWIGHIYYSGNTNYNPSLKSRLTISIDTSKTQFSLKLSSVTAADTAIYYCVRDRVTGAFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:34)轻链：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYFCQHFDHLPLAFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:35)

Anti-LAG3 mAb

重链：

EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISAYNGNTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDSSSWWVDAFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKKVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:36)

轻链：

SYELTQPPSVSEAPRQRVTISCSGSSSNIGSNAVSWYQQVPRKAPKLLVYYDDLLPSGVSDRFSGSKSGTSASLAIRGLQSEDEADYYCAAWDDSLNAFVFGTGTKVTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS(SEQID NO:37)

实施例1.EGFR×LAG3双特异性抗体的构建和初步表征

EGFR×LAG3双特异性抗体(BsAb)的克隆

EGFR×LAG3 BsAb的轻链由抗LAG-3VL和CL结构域组成。重链从N端到C端包含抗LAG-3VH、CH1结构域、野生型人IgG1 Fc和抗EGFR单链可变区片段(ScFv)。EGFR×LAG3 BsAb(本文也称为CMD005)的结构如图1所示。抗EGFR ScFv和EGFR×LAG3 BsAb的轻链由GENEWIZ直接合成。为了生成EGFR×LAG3 BsAb的构建体，使用了由GENEWIZ合成的以下引物：

载体-HC-FP:5’TAATTCTAGAGTCGACAATCAACCTCTGG 3’(正义)(SEQ ID NO:30)；

载体-HC-RP:5’TGATCCACCACCTCCACTACCG 3’(反义)(SEQ ID NO:31)；

EGFR-HB-pa-VH-FP:

5’GTGGTGGATCACAGGTGCAGCTGCAGGAGAG 3’(正义)(SEQ ID NO:32)；

EGFR-HB-pa-VL-RP:

5’GATTGTCGACTCTAGAATTATTTGATTTCCACCTTGGTTCCG3’(反义)(SEQ ID NO:33)。

为了产生EGFR×LAG3 BsAb，抗EGFR ScFv经由(G4S)4接头被融合到LAG-3单克隆抗体的C末端。轻链和重链被分别构建入单一载体pcDNA3.4用于哺乳动物细胞表达。

蛋白表达、纯化和初步表征

通过使用ExpiFectamine CHO转染试剂盒在CHO-S细胞中表达EGFR×LAG3 BsAb。转染后细胞继续生长5-7天。通过以8000rpm离心20分钟收获细胞培养物。将含有靶蛋白的培养物上清液加载到带有EshmunoA(Merck)的重力柱上。根据制造商的说明进行后续纯化。

EGFR×LAG3 BsAb在瞬时转染的CHO-S细胞中表达良好，并分泌到培养物上清液中。在非还原性SDS-PAGE上，CMD005的表观分子量(aMW)大约为76.3kDa。在还原的SDS-PAGE上，重链和轻链彼此靠近，表观分子量大约为23.1kDa(数据未显示)。

根据Kabat编号系统的CMD005的CDR序列如表1所示。CMD005的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)的氨基酸序列如表2所示。CMD005的整个轻链和重链序列如表3所示。

表1.CMD005的CDR序列

表2.CMD005的VL和VH序列

表3.CMD005的重链和轻链序列

实施例2.EGFR×LAG3 BsAb CMD005与重组EGFR和LAG3的结合

根据标准方案进行ELISA以确定CMD005与重组EGFR和LAG3的结合亲和力。简而言之，将人抗原EGFR或LAG3以100ng每孔在4℃下包被在Corning EIA/RIA高结合96孔板(Corning Inc.)上过夜，并分别用含3％脱脂牛奶的PBS(pH7.4，MPBS)、3％牛血清白蛋白和1‰Tween 20的PBS溶液封闭。相应地加入5倍梯度稀释的抗体，室温孵育2h。用含有0.05％Tween 20的PBS洗板。结合的抗体通过使用HRP缀合的链霉亲和素(Sino Biological)检测。该测定是在室温下使用TMB底物(Solarbio)开发的，并使用酶标仪在450nm处进行监测。通过将数据拟合到Langmuir吸附等温线来计算半数最大结合(EC₅₀)。人IgG1 kappa(IgG1κ)同种型对照作为阴性对照。结果如图2A-2B所示。

结果表明，CMD005可以结合人重组EGFR，EC50为0.43nM，并结合人重组LAG3，EC50为0.09nM。此外，EGFR×LAG3双特异性抗体CMD005与抗-EGFR或抗-LAG3 mAb之间的结合活性没有显著差异。

实施例3EGFR×LAG3 BsAb CMD005与细胞表面相关EGFR和LAG3的结合

为了测量EGFR×LAG3 BsAb CMD005与细胞表面相关LAG3的结合能力，使用活化的T细胞进行流式细胞术，并使用人结肠癌细胞系Caco-2通过流式细胞术测量CMD005与细胞表面相关的EGFR结合能力。将约5×10⁵个细胞与五倍连续稀释的抗体在冰上孵育1小时。用含有0.5％牛血清白蛋白(PBSA)的PBS洗涤细胞一次，并重悬于100μL的PBSA中。然后加入在山羊中产生的1μL的抗人IgG(γ链特异性)-R-藻红蛋白抗体((Sigma))并孵育30分钟。细胞用PBSA洗涤一次，然后用于流式细胞术分析。人IgG1κ同种型对照作为阴性对照。结果如图3A-3B所示。

结果表明EGFR×LAG3 BsAb CMD005能很好地与Caco-2和T细胞结合，并且结合亲和力与抗EGFR mAb或抗LAG3 mAb相似。

实施例4.EGFR×LAG3 BsAb CMD005介导的EGFR与EGF、LAG3与FGL1和LAG3与MHCII的结合的阻断

进行ELISA测定以确定EGFR×LAG3 BsAb CMD005阻断EGFR/EGF和LAG3/FGL1受体-配体对结合的能力。

人抗原EGFR以500ng每孔在4℃下包被在Corning EIA/RIA高结合96孔板(CorningInc.)上过夜，并用3％ MPBS(pH7.4)封闭。将五倍连续稀释的抗体与人抗原EGF(14μg/mL)等体积比例混合。将混合物加入板中并在室温下孵育2小时。用含有0.05％ Tween20的PBS洗板。结合的抗体通过HRP抗6X抗体(Abcam)检测。该测定是在室温下使用TMB底物(Solarbio)开发的，并使用酶标仪在450nm处进行监测。通过将数据拟合到Langmuir吸附等温线来计算半数最大结合(EC₅₀)。人IgG1κ同种型对照作为阴性对照。结果如图4A所示。

人抗原FGL1以100ng每孔在4℃下包被在平板上过夜，并用含3％牛血清白蛋白和1‰Tween 20的PBS封闭。将五倍连续稀释的抗体与人抗原LAG3(4μg/mL)等体积比例混合。将混合物加入板中并在室温下孵育2小时。其余步骤同上。人IgG1κ同种型对照作为阴性对照。结果如图4B所示。

使用基于细胞的竞争性流式细胞术测定来测量CMD005对LAG3/MHCⅡ受体-配体对的阻断能力。将约5×10⁵个在细胞表面表达MHCⅡ的Raji细胞与梯度稀释的抗体溶液和生物素标记的人抗原LAG3(400ng)在冰上孵育1小时。细胞用0.5％ PBSA洗涤一次，然后重悬于100μL的PBSA中。然后加入0.1％链霉亲和素R-PE缀合物(Invitrogen)并在冰上孵育30分钟。细胞用PBSA洗涤一次，然后用于流式细胞术分析。人IgG1κ同种型对照作为阴性对照。结果如图5所示。

结果表明，EGFR×LAG3 BsAb CMD005对EGFR/EGF和LAG3/FGL1受体-配体相互作用均有很强的阻断作用，EC50分别为1.86nM和32.85nM(图4A-4B)，并且CMD005抑制MHCⅡ与LAG3的结合或与之竞争，EC50为6.88nM(图5)。

实施例5.EGFR×LAG3 BsAb CMD005介导的针对人癌细胞系的杀伤

使用包括A431、Caco-2和Achn在内的几种癌细胞系，通过CCK8测定评估了EGFR×LAG3 BsAb CMD005的体外功效。将这三种细胞系离心并重悬于RPMI 1640完全培养基中，然后分别以1000、4000和1500个细胞/100μL的密度加入96孔圆底板中。细胞在37℃、补充有5％ CO₂的培养箱中孵育24小时。第二天，将100μL的抗体溶液(从100nM连续稀释10倍)相应地添加到每个孔中。孵育4-10天后(细胞汇合度为80-90％)，从靶细胞中去除培养基，加入100μL含10％ CCK-8的RPMI 1640完全培养基，在CO₂培养箱中孵育30分钟。根据制造商的说明，使用酶标仪测量细胞抑制活性。人IgG1κ同种型对照作为阴性对照。结果如图6A-6C所示。

结果表明，EGFR×LAG3 BsAb CMD005以剂量依赖性方式显示出对肿瘤细胞生长的强有力的抑制。EGFR×LAG3 BsAb CMD005与抗EGFR mAb对肿瘤细胞生长的抑制作用无显著差异。

实施例6.抗AXL双特异性抗体介导的小鼠内肿瘤生长的抑制

小鼠内药代动力学的测量

在第0天给两只BALB/c小鼠静脉内施用200μg的EGFR×LAG3 BsAb CMD005。在治疗后15小时、39小时、63小时、87小时的时间点收集血浆样本，用于通过ELISA测量抗体血清浓度，并使用原始抗体储备生成标准曲线。结果如图7所示。

结果表明，CMD005的血清浓度逐渐下降，但在终点时仍维持在较高水平。

体内肿瘤生长抑制

使用hLAG3-c57 BL/6小鼠评估EGFR×LAG3 BsAb CMD005的体内功效。将3×10⁶个MC38-hEGFR肿瘤细胞皮下接种到hLAG3-c57 BL/6小鼠的右侧腹部。确定可触及的肿瘤后，根据肿瘤体积和体重进行随机化。阴性对照组小鼠静脉内给药10mg/kg的人IgG1κ同种型对照。实验组包括抗EGFR mAb组(10mg/kg)、抗LAG3 mAb组(10mg/kg)、抗EGFR mAb+抗LAG3mAb组(10+10mg/kg)、CMD005组(10mg/kg)。这些小鼠每周给药两次。治疗三周后，处死小鼠并测量肿瘤体积。使用以下公式计算肿瘤生长抑制(TGI)率：TGI(％)＝[1-(T-T₀)/(C-C₀)]×100(T和T₀：分别为特定实验日和随机化实验日的肿瘤体积；C和C₀：对照组相应的平均肿瘤体积)。值>100％表示肿瘤缩小。结果如图8A-8B所示。

结果表明，EGFR×LAG3 BsAb CMD005对肿瘤生长具有强有力的抑制，抑制作用强于抗-EGFR mAb、抗-LAG3 mAb和抗-EGFR mAb+抗-LAG3mAb(图8A)。CMD005组(10mg/kg)肿瘤生长抑制率为137.1％，抗EGFR mAb组(10mg/kg)肿瘤生长抑制率为27.1％，抗LAG3 mAb组(10mg/kg)肿瘤生长抑制率为86.2％，抗EGFR mAb+LAG3 mAb组(10+10mg/kg)肿瘤生长抑制率为60.2％。所有组小鼠的体重只有微小的变化(图8B)。

综上所述，体内研究表明EGFR×LAG3 BsAb CMD005具有较长的血清半衰期，并且可以特异有效地抑制肿瘤生长。因此，这种双特异性抗体治疗药物EGFR×LAG3 BsAbCMD005具有很大的临床开发前景。

虽然此处已经示出和描述了本发明的优选实施方式，但是对于本领域技术人员而言，此类实施方式仅作为实例提供是显而易见的。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员将想到许多变化、改变和替换。应当理解，可以采用本文描述的实施方式的各种替代方案。所附权利要求旨在限定本发明的范围，并且覆盖这些权利要求及其等同物范围内的方法和结构。

Claims (25)

1.双特异性抗体或其抗原结合片段，所述双特异性抗体或其抗原结合片段包含与EGFR结合的第一抗原结合区和与LAG3结合的第二抗原结合区，所述第一抗原结合区包含第一轻链可变区(VL1)和第一重链可变区(VH1)，所述第二抗原结合区包含第二轻链可变区(VL2)和第二重链可变区(VH2)，其中

所述VL1包含分别具有如SEQ ID NO:1-3所示的氨基酸序列的LCDR1-3；

所述VH1包含分别具有如SEQ ID NO:5-7所示的氨基酸序列的HCDR1-3；

所述VL2包含分别具有如SEQ ID NO:9-11所示的氨基酸序列的LCDR1-3；并且

所述VH2包含分别具有如SEQ ID NO:13-15所示的氨基酸序列的HCDR1-3。

2.根据权利要求1所述的双特异性抗体或其抗体结合片段，其中

所述VL1包含与SEQ ID NO:4具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列；

所述VH1包含与SEQ ID NO:8具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列；

所述VL2包含与SEQ ID NO:12具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列；并且

所述VH2包含与SEQ ID NO:16具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

3.根据权利要求2所述的双特异性抗体或其抗体结合片段，其中

所述VL1包含如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；

所述VH1包含如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；

所述VL2包含如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列；并且

所述VH2包含如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述双特异性抗体包含：

第一多肽链，其从N端至C端包含：VH2-CH1-CH2-CH3-L1-VH1-L2-VL1；和

第二多肽链，其从N端至C端包含：VL2-CL；

其中CH1表示免疫球蛋白重链的恒定区的第一结构域；CH2表示免疫球蛋白重链的恒定区的第二结构域；CH3表示免疫球蛋白重链的恒定区的第三结构域；CL表示免疫球蛋白轻链的恒定区；且L1和L2各自独立地表示任选的接头。

5.根据权利要求4所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述双特异性抗体包含所述第一多肽链的两个拷贝和所述第二多肽链的两个拷贝。

6.根据权利要求4或5所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述CH1、CH2和CH3中的每一个独立地衍生自免疫球蛋白同种型IgG(例如，人IgG)，优选地衍生自选自IgG1、IgG2和IgG4(例如，人IgG1、IgG2和IgG4)的IgG亚型。

7.根据权利要求4-6中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述CL衍生自λ轻链或κ轻链。

8.根据权利要求4-7中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述接头包含(G4S)n的氨基酸序列，其中n是选自1-5的整数，优选地所述接头包含如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列。

9.根据权利要求4-8中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中

所述第一多肽链包含与SEQ ID NO:17具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列；并且

所述第二多肽链包含与SEQ ID NO:18具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

10.根据权利要求9所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中

所述第一多肽链包含如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列；并且

所述第二多肽链包含如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。

11.核酸，其包含编码根据权利要求1-10中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。

12.载体，其包含根据权利要求11所述的核酸。

13.宿主细胞，其包含根据权利要求11所述的核酸或根据权利要求12所述的载体。

14.药物组合物，其包含根据权利要求1-10中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，和药学上可接受的载体或赋形剂。

15.根据权利要求14所述的药物组合物，其进一步包含第二治疗剂。

16.根据权利要求15所述的药物组合物，其中所述第二治疗剂选自抗体、化疗剂和小分子药物。

17.根据权利要求15或16所述的药物组合物，其中所述第二治疗剂选自布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)抑制剂、PI3K抑制剂、HDAC抑制剂、ERK抑制剂、MAPK抑制剂、PD-1/PD-L1抑制剂、CTLA-4抑制剂、TIGIT抑制剂、TIM3抑制剂、VEGF抑制剂和糖皮质激素。

18.缀合物，其包含根据权利要求1-10中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，以及与其缀合的化学部分。

19.根据权利要求18所述的缀合物，其中所述化学部分选自治疗剂、可检测部分和免疫刺激分子。

20.治疗受试者的癌症的方法，其包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1-10中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段、根据权利要求14-17中任一项所述的药物组合物或根据权利要求18或19所述的缀合物。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述癌症是EGFR阳性癌症。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述癌症选自结肠癌、肾癌、结直肠癌、肺癌、胃癌、卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、头颈癌、脑癌、膀胱癌和肝癌，优选结直肠癌、头颈癌、肾癌或皮肤癌。

23.根据权利要求20-22中任一项所述的方法，其进一步包括向所述受试者施用第二治疗剂。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述第二治疗剂选自抗体、化疗剂和小分子药物。

25.根据权利要求23或24所述的方法，其中所述第二治疗剂选自布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)抑制剂、PI3K抑制剂、HDAC抑制剂、ERK抑制剂、MAPK抑制剂、PD-1/PD-L1抑制剂、CTLA-4抑制剂、TIGIT抑制剂、TIM3抑制剂、VEGF抑制剂和糖皮质激素。