GR20190100504A - Μεθοδος για την αναπτυξη μιας πλατφορμας για την παραγωγη δυναμενων για μεταφορα μεσω πεπτιδιου μεταγωγης (ptd), in vitro μεταγραφομενων (ivt) mrna θεραπευτικων - Google Patents
Μεθοδος για την αναπτυξη μιας πλατφορμας για την παραγωγη δυναμενων για μεταφορα μεσω πεπτιδιου μεταγωγης (ptd), in vitro μεταγραφομενων (ivt) mrna θεραπευτικων Download PDFInfo
- Publication number
- GR20190100504A GR20190100504A GR20190100504A GR20190100504A GR20190100504A GR 20190100504 A GR20190100504 A GR 20190100504A GR 20190100504 A GR20190100504 A GR 20190100504A GR 20190100504 A GR20190100504 A GR 20190100504A GR 20190100504 A GR20190100504 A GR 20190100504A
- Authority
- GR
- Greece
- Prior art keywords
- ivt
- ptd
- mrna
- peptide
- puromycin
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 33
- 239000003814 drug Substances 0.000 title claims abstract description 12
- 238000011161 development Methods 0.000 title claims abstract description 9
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 88
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims abstract description 32
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 238000010361 transduction Methods 0.000 claims abstract description 20
- 230000026683 transduction Effects 0.000 claims abstract description 20
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 19
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims abstract description 17
- KCCDSHMVQWPFBC-QQUOXUDESA-N (2s,3s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-3-(4-hydroxyphenyl)-2-[[(2s)-3-methyl-2-[[(2s)-3-phenyl-2-[[(2s)-pyrrolidine-2-carbonyl]amino]propanoyl]amino]butanoyl]amino]propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-methylpentanoic acid Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H]1NCCC1)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 KCCDSHMVQWPFBC-QQUOXUDESA-N 0.000 claims abstract description 15
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 14
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims abstract description 13
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 11
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 claims abstract description 9
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 claims abstract description 4
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 51
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 claims description 34
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 24
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 claims description 18
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 claims description 18
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 18
- 108010079346 prolyl-phenylalanyl-valyl-tyrosyl-leucyl-isoleucine Proteins 0.000 claims description 15
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 claims description 15
- 101710086015 RNA ligase Proteins 0.000 claims description 13
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- FFYPMLJYZAEMQB-UHFFFAOYSA-N diethyl pyrocarbonate Chemical compound CCOC(=O)OC(=O)OCC FFYPMLJYZAEMQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 11
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 11
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 claims description 11
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 10
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 10
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 10
- 239000000499 gel Substances 0.000 claims description 9
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 claims description 8
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 claims description 8
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 claims description 8
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 claims description 8
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 7
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 6
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 6
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 claims description 6
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 6
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 5
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 5
- FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylacetamide Chemical compound CN(C)C(C)=O FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 101710141795 Ribonuclease inhibitor Proteins 0.000 claims description 4
- 229940122208 Ribonuclease inhibitor Drugs 0.000 claims description 4
- 102100037968 Ribonuclease inhibitor Human genes 0.000 claims description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 claims description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 4
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 4
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 claims description 4
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 4
- LEQAOMBKQFMDFZ-UHFFFAOYSA-N glyoxal Chemical compound O=CC=O LEQAOMBKQFMDFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims description 4
- 230000010189 intracellular transport Effects 0.000 claims description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 4
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 claims description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 claims description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 3
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 claims description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 claims description 2
- 229940015043 glyoxal Drugs 0.000 claims description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 2
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 claims description 2
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 claims description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims description 2
- 108091036407 Polyadenylation Proteins 0.000 claims 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims 1
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 claims 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 5
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 3
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 2
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 2
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 2
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 2
- 238000009256 replacement therapy Methods 0.000 description 2
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 2
- KSXTUUUQYQYKCR-LQDDAWAPSA-M 2,3-bis[[(z)-octadec-9-enoyl]oxy]propyl-trimethylazanium;chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(C[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC KSXTUUUQYQYKCR-LQDDAWAPSA-M 0.000 description 1
- 108091032955 Bacterial small RNA Proteins 0.000 description 1
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 1
- 102000009193 Caveolin Human genes 0.000 description 1
- 108050000084 Caveolin Proteins 0.000 description 1
- 102000005853 Clathrin Human genes 0.000 description 1
- 108010019874 Clathrin Proteins 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 201000011001 Ebola Hemorrhagic Fever Diseases 0.000 description 1
- 241001115402 Ebolavirus Species 0.000 description 1
- 241000711557 Hepacivirus Species 0.000 description 1
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 1
- 101000701363 Homo sapiens Phospholipid-transporting ATPase IC Proteins 0.000 description 1
- 108700021430 Kruppel-Like Factor 4 Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 1
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 1
- 101710126211 POU domain, class 5, transcription factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100030448 Phospholipid-transporting ATPase IC Human genes 0.000 description 1
- 102000007327 Protamines Human genes 0.000 description 1
- 108010007568 Protamines Proteins 0.000 description 1
- 101100247004 Rattus norvegicus Qsox1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 238000010459 TALEN Methods 0.000 description 1
- 102100037357 Thymidylate kinase Human genes 0.000 description 1
- 108010043645 Transcription Activator-Like Effector Nucleases Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 1
- 241000907316 Zika virus Species 0.000 description 1
- 208000020329 Zika virus infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000002619 cancer immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- -1 cationic lipid Chemical class 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008668 cellular reprogramming Effects 0.000 description 1
- 239000002800 charge carrier Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 229930193282 clathrin Natural products 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000021040 cytoplasmic transport Effects 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 108010000742 dTMP kinase Proteins 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 210000000107 myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 230000003076 paracrine Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 229940038309 personalized vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000009522 phase III clinical trial Methods 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 229940021993 prophylactic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229940048914 protamine Drugs 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 210000001988 somatic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
- A61K48/0025—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/0091—Purification or manufacturing processes for gene therapy compositions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Manufacturing & Machinery (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
Η εφεύρεση αυτή σχετίζεται με μια μέθοδο για την ανάπτυξη μιας πλατφόρμας για την παραγωγή δυνάμενων για μεταφορά μέσω πεπτιδίου μεταγωγής (PTD), in vitro μεταγραφόμενων (IVT) mRNA θεραπευτικών, όπου η Τεχνολογία Πεπτιδίων Μεταγωγής (Protein Transduction DomainsPTDs) χρησιμοποιείται ως πλατφόρμα μεταγωγής για θεραπευτικά in vitro μεταγραφόμενα (IVT) mRNAs και η ανάπτυξη της εν λόγω πλατφόρμας μεταγωγής επιτυγχάνεται με ομοιοπολική χημική αντίδραση μεταξύ των εν λόγω μορίων IVT-mRNA και ενός επιλεγμένου πεπτιδίου μεταγωγής, το PFVYLI. Είναι αξιοσημείωτος ο συνδυασμός της τεχνολογίας PTD με IVT-mRNA, μέσω ομοιοπολικής χημικής σύνδεσης-σύζευξης, όπου το εν λόγω IVT-mRNA συζεύγνυται με ένα πεπτίδιο μεταγωγής (PTD) μέσω του οποίου επιτυγχάνεται η σταθερότητα της σύνδεσης μεταξύ του μεταφορέαPTD και του θεραπευτικού IVT- mRNA μορίου και έτσι προκύπτει το σύμπλοκο PTD-I VT-niRNA, το οποίο είναι πολύ σταθερό και όπου τα ανωτέρω IVT-mRNAs, τα οποία αποτελούν τα θεραπευτικά μόρια, υποβάλλονται σε ενδοκυττάρια μεταγωγή μέσω της προαναφερθείσας ομοιοπολικής σύζευξης με το κατάλληλο πεπτίδιο μεταγωγής, ενώ μετά την μεταγωγή τα εν λόγω IVT-mRNAs κατευθύνονται στα ριβοσώματα και μεταφράζονταιστις αντίστοιχες πρωτεΐνες-στόχους για να εκδηλώσουν το θεραπευτικό τους αποτέλεσμα.
Description
Μέθοδος για την ανάπτυξη μιας πλατφόρμας για την παραγωγή, δυνάμενων για μεταφορά μέσω πεπτιδίου μεταγωγής (PTD), in vitro μεταγραφόμενων (IVT) mRNA θεραπευτικών
Πεδίο της εφεύρεσης
Η παρούσα εφεύρεση αναφέρεται σε μια μέθοδο για την ανάπτυξη μιας ασφαλούς πλατφόρμας ενδοκυττάριας μεταφοράς για τη βελτίωση της υγείας, συμπεριλαμβανομένης της τροφής.
Υπόβαθρο της εφεύρεσης
Η παρούσα εφεύρεση σχετίζεται σε μια μέθοδο για την ανάπτυξη μιας ασφαλούς καινοτόμου πλατφόρμας ενδοκυττάριας μεταφοράς, μέσω της αξιοποίησης της τεχνολογίας των πεπτιδίων μεταγωγής (PTD), για την ενδοκυττάρια μεταγωγή θεραπευτικών in vitro μεταγραφόμενων mRNAs (IVT-mRNAs) και την ακόλουθη έκφραση της επιθυμητής πρωτεΐνης.
Το επιλεγόμενο πεπτίδιο μεταγωγής είναι ένα πεπτίδιο 6 αμινοξέων (6αα), όπως αποκαλείται PFVYLI, το οποίο συνδέεται ομοιοπολικά με το IVT-mRNA.
Το ανωτέρω θεραπευτικό IVT-mRNA που χρησιμοποιείται σε αυτή την πλατφόρμα μπορεί να είναι ένα οποιοδήποτε IVT-mRNA του ενδιαφέροντος, ανάλογα με το γονιδιακό μεταφραστικό προϊόν που πρέπει να μεταφερθεί ενδοκυτταρικά.
Η πλατφόρμα είναι σχεδιασμένη για να προσφέρει πολυάριθμες βελτιστοποιήσεις αναφορικά με προγενέστερες πλατφόρμες ενδοκυττάριας μεταφοράς, καθώς αντιμετωπίζει επιτυχώς προβλήματα σταθερότητας, μεταγωγής και μετάφρασης στο πεδίο των θεραπευτικών mRNA.
Η κύρια δυσκολία όλων των IVT-mRNA θεραπευτικών - που εμπεριέχει την in vivo μεταφορά τους - είναι η ενδοκυττάρια μεταφορά τους.
To IVT-mRNA, για να μεταφραστεί σε πρωτεΐνη, πρέπει: (1) να επιβιώσει στον εξωκυττάριο χώρο, που περιέχει υψηλά επίπεδα μοναδικών ριβονουκλεασών (RNασων), (2) να φτάσει στα κύτταρα του ενδιαφέροντος και, τέλος, (3) να διαπεράσει την κυτταρική μεμβράνη.
Το ιδανικό σύστημα μεταφοράς IVT-mRNA θα πρέπει να εκπληρώνει αρκετές λειτουργίες, όπως η ικανότητα: α) να σχηματίζει σύμπλοκα με το IVT-mRNA, β) να προάγει την ενδοκυττάρια πρόσληψη, γ) να προστατεύει το mRNA από την αποικοδόμηση από ενδοκυττάριες και εξωκυττάριες νουκλεάσες και δ) να επιτρέπει την απελευθέρωση του mRNA στο κυτταρόπλασμα.
Στο πεδίο αυτό της εφεύρεσης, το IVT-mRNA είναι ένα συνθετικό mRNA που προσομοιάζει με το ενδογενές mRNA και μετά την επιτυχή του μεταφορά εντός του κυττάρου μπορεί να μεταφραστεί στην επιθυμητή αντίστοιχη πρωτεΐνη.
Το ισχυρότερο πλεονέκτημα της τεχνολογίαςτου IVT-mRNA είναι ότι τα μόρια mRNA δεν παρεμβαίνουν στο γονιδίωμα του ξενιστή, επομένως δεν προκαλούνται ογκογόνες μεταλλάξεις. Επιπλέον, αυτή η τεχνολογία πλεονεκτεί σε σύγκριση με την πρωτεϊνική θεραπεία αντικατάστασης, με την παραγωγή βιοτεχνολογικά των επιθυμητών ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών, ειδικά λόγω των χρονοβόρων και κοστοβόρων σταδίων καθαρισμού.
To IVT-mRNA αποικοδομείται μετά από λίγες ημέρες στο κυτταρόπλασμα μέσω φυσιολογικών μονοπατιών και ως εκ τούτου δεν απαιτεί ούτε αδρανοποίηση ούτε απομάκρυνση του IVT-mRNA, σε περιπτώσεις μη αναμενόμενης παρατηρούμενης τοξικότητας σε σύγκριση με στρατηγικές μέσω ιϊκών φορέων.
Μπορεί να χαρακτηριστεί ως ένα σύστημα «χτύπα και τρέξε» ή hit-and-run ), το οποίο δεν αφήνει τελικό γενετικό υπόλειμμα στα κύτταρα-δέκτες. Επί της αρχής, οι θεραπείες στηριζόμενες στο IVT-mRNA φαίνεται να είναι πολύ πιο ασφαλείς από τις θεραπείες στηριζόμενες σε DNA ή σε ιούς και είναι εφαρμόσιμες σε ένα ευρύ φάσμα ασθενειών, τόσο σε οξείες όσο και σε χρόνιες.
Θεωρητικά, δεν υπάρχει όριο μεγέθους για τη δημιουργία της επιθυμητής αλληλουχίας mRNA μέσω της in vitro μεταγραφής και η παραγωγή του IVT-mRNA μπορεί να πραγματοποιηθεί στις επιθυμητές κλίμακες με εμπορικά διαθέσιμα υλικά. Επιπλέον, η χρήση των IVT-mRNAs ως θεραπευτικών είναι «ευεργετική», λόγω της βιολογικής τους προέλευσης.
Επομένως, αυτό που χρειάζεται είναι μια βελτιωμένη μέθοδος για την ασφαλή ενδοκυττάρια μεταφορά των θεραπευτικών IVT-mRNAs, προκειμένου να μεταφραστούν στην επιθυμητή πρωτεΐνη.
Προγενέστερη τεχνική
Οι συμβατικές μέθοδοι για την ενδοκυττάρια μεταφορά των IVT-mRNAs περιλαμβάνουν την παραγωγή συμπλοκών χρησιμοποιώντας κατιονικά λιπίδια-φορείς όπως για παράδειγμα λιποφεκταμίνη ή DOTAP (Ν-[1-(2,3-διολεοϋλοξυ)προπυλ]-Ν,Ν,Ν-τριμεθυλαμμώνιο) συνδεδεμένα με τα αρνητικά φορτισμένα μόρια IVT-mRNA, σχηματίζοντας τα λιποσυμπλέγματα. Επιπρόσθετα, διάφορα βιοϋλικά χρησιμοποιούνται, όπως νανοσωματίδια, ιοσωμάτια, σύμπλοκα πρωταμίνης/IVT-mRNAs, μικροσωματίδια, πολυμερικά νανοσωματίδια, αυτοσυναρμολογούμενα υλικά και ικριώματα βιοϋλικών.
Μια ελπιδοφόρα πλατφόρμα ενδοκυττάριας μεταφοράς του IVT-mRNA αποτελείται από λιπιδικά νανοσωματίδια (LNPs) και πρόσφατα είχε επιτυχία στη μεταφορά μικρών μορίων ενδοπαρεμβολής RNAs (siRNAs) in vivo και υποσχόμενες κλινικές δοκιμές φάσης III, IVT-mRNAs μέσω των λιπιδικών νανοσωματιδίων (LNPs) αναπτύσσονται ως μια θεραπευτική προσέγγιση για μια σειρά ασθενειών, συμπεριλαμβανομένων πολλαπλών τύπων καρκίνου, καθώς και των ιών Zika, Ebola, της ηπατίτιδας C και της γρίπης. Τα LNPs αυξάνουν τον χρόνο κατακράτησης του φορτίου IVT-mRNA in vivo και ενισχύουν την κυτταροπλασματική μεταφορά του IVT-mRNA. Ωστόσο, τα LNPs αντιμετωπίζουν το πρόβλημα της διαφυγής-απελευθέρωσης του IVT-mRNA, μετά από την ενδοκυττάρωση, καθώς και το ότι συνηθίζουν να συσσωρεύονται σε όργανα εκτός στόχου, όπως το ήπαρ, ενώ παρατηρήθηκαν περιπτώσεις αλλεργικών αντιδράσεων σε ανθρώπους.
Συνολικά, η παρουσία ορού έχει τεκμηριωθεί καλά, ότι ρυθμίζει την αποτελεσματικότητα διαμόλυνσης των συμπλοκών με λιποσυμπλέγματα και των συμπλόκων με πολυμερή. Επιπρόσθετα, το μέγεθος των συμπλοκών με λιπίδια, η πυκνότητα του επιφανειακού φορτίου, η κολλοειδής σταθερότητα και οι τροποποιημένοι μηχανισμοί πρόσληψης (συνήθως η ενδοκυττάρωση, που μεσολαβείται μέσω κλαθρίνης και καβεολίνης) έχουν προταθεί ότι παίζουν σημαντικό ρόλο και θέτουν πρακτικά ζητήματα για την in vivo εφαρμογή τους.
Υπάρχει ανάγκη να αναπτυχθεί ένας νέος ουδέτερος φορέας χωρίς τους προαναφερθέντες περιορισμούς για τη μεταφορά του θεραπευτικού IVT-mRNA στη θέση-στόχο του.
Σκοπός της εφεύρεσης
Τα IVT-mRNAs, τα οποία αποτελούν μια νέα γενιά θεραπευτικών μορίων, μετά την επιτυχή ενδοκυττάρια χορήγησή τους, μέσω της προτεινόμενης ανακάλυψης, την ομοιοπολική συνένωση με το κατάλληλο πεπτίδιο μεταγωγής PTD, ειδικότερα το ανωτέρω πεπτίδιο PFVYLI, κατευθύνονται στα ριβοσώματα και μεταφράζονται προς τις αντίστοιχες επιθυμητές πρωτεΐνες, εγείροντας το αναμενόμενο θεραπευτικό αποτέλεσμα.
Συνοπτική περιγραφή της εφεύρεσης
Η PTD τεχνολογία χρησιμοποιεί μικρά πεπτίδια, ικανά να διαπερνούν σχεδόν όλες τις βιολογικές μεμβράνες, μεταφέροντας ενδοκυττάρια μια ποικιλία «φορτίων» από μικρομόρια, μικρά παρεμβατικά RNA, μέχρι μακρομόρια (πρωτεΐνες, RNA, πλασμιδιακό DNA, νανοσωματίδια).
Αυτή η εφεύρεση σχετίζεται με την ομοιοπολική σύνδεση ενός επιλεγμένου πεπτιδίου μεταγωγής, ήτοι το πεπτίδιο PFVYLI [Προλίνη (Ρ) - Φαινυλαλανίνη (F) - Βαλίνη (V) - Τυροσίνη (Υ) - Λεύκινη (L) - Ισολευκίνη (I)], το οποίο χρησιμοποιείται ως φορέας ουδέτερου επιφανειακού φορτίου για οποιοδήποτε θεραπευτικό IVT-mRNA ενδιαφέροντος, οδηγώντας σε μεγαλύτερη σταθερότητα παρουσία ορού, αυξάνοντας έτσι τη λειτουργικότητά του, αυξάνοντας την αντοχή του στον ορό και μειώνοντας τη μεταβλητότητα της διαμόλυνσης ανάμεσα στους διαφορετικούς τύπους κυττάρων.
Στην πραγματικότητα, η εφεύρεση PTD-IVT-mRNA (IVT-mRNA: PTD) εμφανίζει χαμηλότερη κυτταροτοξικότητα από άλλες μεθόδους διαμόλυνσης, όπως η λιποφεκταμίνη (Lpf2k), ένας κοινώς χρησιμοποιούμενος εμπορικός παράγοντας διαμόλυνσης για τα IVT-mRNAs.
Τα σύμπλοκα PTD-IVT-mRNA επιδεικνύουν υψηλή σταθερότητα σε χαμηλές και υψηλές συνθήκες ορού και πλάσματος σε σύγκριση με το γυμνό IVT-mRNA.
Αυτή η εφεύρεση επιτυγχάνει υψηλά ποσοστά διαμόλυνσης σε κυτταρικά μοντέλα, ακόμη και διπλασιασμό των επιπέδων μετάφρασης της επιθυμητής πρωτεΐνης, αυξάνοντας την Μέση Φθορίζουσα Ένταση (MFI . -Mean Fluorescent Intensity ) τρεις φορές (3Χ) σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου.
Επιπλέον, η υποκυτταρική στοχευμένη μεταφορά της προς παραγωγή πρωτεΐνης, φαίνεται να επιτυγχάνεται ακόμη και σε οργανίδια, όπως τα μιτοχόνδρια του κυτταρικού μοντέλου που χρησιμοποιήθηκε.
Εν κατακλείδι, η προτεινόμενη τεχνολογία είναι γρήγορη και χαμηλού κόστους, ενώ επίσης έχει τα ακόλουθα πλεονεκτήματα :
• ασφάλεια, καθώς δεν υπάρχει ενσωμάτωση στο γονιδίωμα του ξενιστή, καθώς και την παροδική φύση του IVT-mRNA.
• ενίσχυση της σταθερότητας των θεραπευτικών IVT-mRNAs.
· αποτελεσματικότητα της ενδοκυττάριας μεταγωγής και
• αύξηση των επιπέδων έκφρασης της αντίστοιχης θεραπευτικής πρωτεΐνης.
Τα PTD-IVT-mRNA σύμπλοκα, που προτείνονται σύμφωνα με την εφεύρεση, έχουν τη δυνατότητα να μεταφραστούν σε πρωτεΐνες, οι οποίες μπορούν:
α) να αντικαταστήσουν (1) τις αντίστοιχες απούσες ενδοκυττάριες πρωτεΐνες, ακόμα και αυτές που εντοπίζονται σε οργανίδια, σε μονογονιδιακές-μεταβολικές ασθένειες, ως θεραπεία πρωτεϊνικής αντικατάστασης, καθώς και (2) τα συστημικά εκκρινόμενα θεραπευτικά μόρια,
β) να μεταφερθούν στις μεμβράνες, στο πλαίσιο κυτταρικών θεραπειών, όπως η
ανοσοθεραπεία του καρκίνου με χιμαιρικούς αντιγονικούς υποδοχείς (CAR). Μια άλλη
προσέγγιση της στοχευόμενης θεραπείας του καρκίνου είναι επίσης η συστημική
χορήγηση του IVT-mRNA, που κωδικοποιεί ένα γονίδιο αυτοκτονίας (suicide gene)
[όπως η θυμιδυλική κινάση 1 του ιού του απλού έρπητα (HSV 1 -tk) ή άλλων σχετικών
με τον καρκίνο ιών],
γ) να εκκρίνονται στο πλαίσιο της ανάπτυξης εξατομικευμένων εμβολίων κατά ειδικών τύπων καρκίνου, έναντι των ταυτοποιημενών νεο-αντιγόνων, στο πλαίσιο της εξατομικευμένης ιατρικής,
δ) να κωδικοποιούν αντισώματα που εκκρίνονται για να εξουδετερώσουν τις κυτοκίνες, οι οποίες παίζουν καθοριστικό ρόλο στις φλεγμονώδεις - αλλεργικές αντιδράσεις του σώματος στο πλαίσιο προφυλακτικών εμβολίων,
ε) να κωδικοποιούν κυτοκίνες και αυξητικούς παράγοντες σε αρκετά σωματικά κύτταρα και βλαστοκύτταρα,
στ) να συνεισφέρουν και στην ενδοκυττάρια μεταφορά μη κωδικοποιού μενών - σε πρωτεΐνη - μορίων RNA, όπως τα μικρής φουρκέτας RNAs (shRNAs), μικρά RNAs (miRNAs) για αποσιώπηση γονιδίων για θεραπευτικούς ή διαγνωστικούς σκοπούς,
(η) να οδηγήσουν σε κυτταρικό επαναπρογραμματισμό, για την άμεση επαγωγή της κυτταρικής διαφοροποίησης, στον επαναπρογραμματισμό σωματικών κυττάρων σε επαγόμενα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα για παράδειγμα με τη χρήση του IVT-mRNA διαφόρων μεταγραφικών παραγόντων, όπως Oct4, Sox2, Klf4 and c-Myc, στην ανακατεύθυνση της διαφοροποίησης των κυττάρων σε επιθυμητούς κυτταρικούς τύπους (π.χ. από ινοβλάστες σε μυοκύτταρα ή ηπατοκύτταρα) ή και για την υπερέκφραση υποδοχέων ή παρακρινών παραγόντων π.χ. ο αγγειακός ενδοθηλιακός αυξητικός παράγοντας (VEGFA) σε μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα για τη βελτίωση της συμπεριφοράς επιστροφής τους στο φυσικό τους χώρο {homing),
θ) να τροποποιήσουν γονιδιώματα σε θεραπείες γονιδιακής επεξεργασίας για την ενδοκυττάρια μεταφορά προγραμματιζόμενών νουκλεασών (ZFN, TALEN, και Cas9) στον ιστό ή στο κύτταρο στόχο. Ενδοκυττάρια μεταφορά των νουκλεασών αυτών, ως PTD-IVT-mRNA (IVT-mRNA :PTD) συμπλόκων, θα έχει αρκετά πλεονεκτήματα, όπως η παροδική έκφραση με αποδοτιική-αποτελεσματική in vivo και in vitro μετατόπιση, μη γεν ωμική ενσωμάτωση, δυνητικά χαμηλό ποσοστό εκτός-στόχου φαινομένων και υψηλή αποτελεσματικότητα γονιδιακής επεξεργασίας.
Σύντομη περιγραφή των σχεδίων
Το σχήμα 1 που επισυνάπτεται, απεικονίζει τον κύριο τρόπο ενσωμάτωσης της εφεύρεσης, ο οποίος είναι η χημική αντίδραση της ομοιοπολικής σύνδεσης-σύζευξης του πεπτιδίου μεταγωγής (PTD), όπως το πεπτίδιο PFVYLI με ένα θεραπευτικό in vitro μεταγραφόμενο (IVT) mRNA.
Τα γενικά στάδια της μεθόδου που προτείνεται σύμφωνα με την παρούσα εφεύρεση περιλαμβάνουν:
1. Επιλογή ενός υδρόφοβου PTD, όπου το πεπτίδιο PFVYLI είναι ένα υδρόφοβο πεπτίδιο έξι (6) αμινοξέων, με καθαρότητα > 95% και ακετυλιωμένο στο άμινο-τελικό άκρο (Ac-Pro-Phe-Val-Tyr-Leu-Ile-COOH). Αυτό το πεπτίδιο μπορεί να έχει πολύ χαμηλή υδατοδιαλυτότητα, ώστε να διατηρείται σε μορφή σκόνης στους -20°C και διαλύεται σε διμεθυλοφορμαμίδιο (DMF, dimethylformamide), λίγο πριν από τη χρήση.
2. Διάλυση του πεπτιδίου μεταγωγής (PTD), όπου δείχνει την πουρομυκίνη ως το συνδέτη του πεπτιδίου με το νουκλεϊκό οξύ, δηλαδή το IVT-mRNA. Η πουρομυκίνη, ειδικότερα μια διυδροχλωρική πουρομυκίνη, θα συνδεθεί στο Ν-τελικό άκρο του PFVYLI με EDC.HC1 [υδροχλωρικό Ν-(3-διμεθυλαμινοπροπυλ)-Ν'-αιθυλοκαρβοδιιμίδιο].
3. Φωσφορυλίωση του προϊόντος πουρομυκίνη-PFVYLI, με την Τ4 πολυνουκλεοτιδική κινάση (Τ4 ΡΝΚ).
4. Συνένωση της φωσφορυλιωμένης πουρομυκίνης-PFVYLI με το επιλεγμένο θεραπευτικό IVT-mRNA, με την Τ4 RNA λιγάση.
Περιγραφή της εφεύρεσης
Ένα από τα σημαντικότερα σημεία της πρωτοτυπίας της παρούσας εφεύρεσης είναι η χρήση της τεχνολογίας των πεπτιδίων μεταγωγής (PTDs) ως πλατφόρμα δυνάμενων για μεταφορά IVT-mRNA θεραπευτικών, η οποία αποτελεί ένα κύριο χαρακτηριστικό που παρέχεται χάρη στην παρούσα εφεύρεση και πρέπει να θεωρείται ως μη προφανής επιλογή από τη γνωστή προηγούμενη τεχνική.
Πράγματι, η ανάπτυξη αυτής της πλατφόρμας μεταφοράς επιτυγχάνεται με μια νέα ομοιοπολική χημική αντίδραση μεταξύ των μορίων IVT-mRNA και του επιλεγμένου πεπτιδίου μεταγωγής, ήτοι ενός πεπτιδίου PFVYLI, δίνοντας σοβαρά πλεονεκτήματα σε αντίθεση με τις ήδη γνωστές μεθόδους διαμόλυνσης.
Εκτός αυτού, σύμφωνα με τη γνωστή μέχρι σήμερα βιβλιογραφία, ο συνδυασμός της τεχνολογίας PTD με το IVT-mRNA, μέσω ομοιοπολικής χημικής συνένωσης -σύζευξης δεν έχει αναφερθεί.
Η σύζευξη του IVT-mRNA σε ένα PTD έχει επιτευχθεί χάρη στην παρούσα εφεύρεση και έχει επιβεβαιωθεί με διάφορες μεθόδους, καθώς επίσης και με τα υψηλά ποσοστά διαμόλυνσης σε κύτταρα,
II καινοτομία έγκειται στη σταθερότητα της σύνδεσης μεταξύ του πεπτιδίου μεταγωγής PTD και του θεραπευτικού μορίου IVT-mRNA, εφόσον ο ομοιοπολικός δεσμός παρέχει το πλεονέκτημα: α) της μείωσης απώλειας φορτίου και β) της προστασία του σε δυσμενείς συνθήκες κατά τη διάρκεια της in vivo μεταφοράς ή στο ενδοκυττάριο περιβάλλον, λόγω της ύπαρξης των ριβονουκλεασών.
Σύμφωνα με τα αποτελέσματα που επιτυγχάνονται χάρη στην παρούσα εφεύρεση, το σύμπλοκο PTD-IVT-mRNA φαίνεται να είναι πολύ σταθερό ακόμη και στο ανθρώπινο πλάσμα για μακρές περιόδους, καθώς αναμένεται να εγχυθεί ενδοφλέβια κατά τη διάρκεια της θεραπευτικής χορήγησης.
Η εφεύρεση αναφέρεται σε μια μέθοδο που περιλαμβάνει τα ακόλουθα στάδια με συγκεκριμένη και καθορισμένη σειρά.
Τα αναλυτικά ειδικά στάδια της ομοιοπολικής σύζευξης του IVT-mRNA με το πεπτίδιο μεταγωγής PFVYLI είναι :
1. EDC.HC1 (0,242 mg EDC.HC1 διαλυμένο σε 200 μl Η2O = 6,3 mM) 4 μl αναμειγνύονται με 2 μl πουρομυκίνης [6,92 mg, διαλυμένα σε 1 ml DMF = 12,68 mM] και 1 mg PFVYLI σε 2 μl DMF και αφήνονται σε θερμοκρασία δωματίου για 2 ώρες.
2. Φωσφορυλίωση του συμπλόκου πουρομυκίνης-PFVYLI ακολούθως λαμβάνει χώρα, χρησιμοποιώντας 1 μl της Τ4 πολυνουκλεοτιδικής κινάσης (ΡΝK), 4 μl του ρυθμιστικού διαλύματος της Τ4 ΡΝΚ, 17 μl απεσταγμένου Η2O, κατεργασμένου με πυροκαρβονικό διαιθυλεστέρα (DEPC, Diethylpyrocarbonate) και 10 μl DMF. Η αντίδραση της φωσφορυλίωσης διεξάγεται σε θερμοκρασία 37° C, για 1 ώρα και 40 λεπτά, ακολουθούμενη από απενεργοποίηση του ενζύμου για 20 λεπτά στους 65°C.
3. Επώαση του συμπλόκου με 1,5 μl αναστολέα ριβονουκλεασών για διάρκεια 15 λεπτών σε θερμοκρασία 37°C.
4. Για 1 mg του πεπτιδίου PFVYLI υπολογίζεται να απαιτούνται 18 nM του αντίστοιχου θεραπευτικού in vitro μεταγραφόμενου mRNA. Το μοριακό βάρος αυτού του IVT-mRNA μπορεί να υπολογιστεί χρησιμοποιώντας εργαλεία βιοπληροφορικής. Για αυτό, εισάγεται η αλληλουχία του επιθυμητού IVT-mRNA, και με το μοριακό βάρος να υπολογίζεται, ανευρίσκεται η συγκέντρωση που θα προστεθεί στην αντίδραση.
Ένα παράδειγμα παρουσιάζεται παρακάτω, βάζοντας ως υπόθεση την X αλληλουχία.
Σύμφωνα με ένα εργαλείο:
1 Molar αντιστοιχεί σε 291,056 g
Άρα, 18 nmolar αντιστοιχούν σε 5,24 μg
Έτσι, για την αντίδραση με 1 mg του πεπτιδίου PFVYLI, απαιτούνται 5,24 μg του IVT-mRNA.
5. Τέλος, προστίθενται 1,5 μl Τ4 RNA λιγάσης, 6 μl ρυθμιστικού διαλύματος της Τ4 RNA λιγάσης, 18 nM IVT-mRNA και μέχρι τα 60 μl, με απεσταγμένο Η2O, κατεργασμένο με DEPC . Η αντίδραση συνένωσης διεξάγεται στους 16°C κατά τη διάρκεια της νύχτας και το ένζυμο απενεργοποιείται στους 70°C για 10 λεπτά.
6. Η επιτυχής χημική ομοιοπολική σύζευξη του PFVYLI με το IVT-mRNA μπορεί να αξιολογηθεί με ηλεκτροφόρηση σε 8Μ ουρία / 6% πηκτή πολυακρυλαμιδίου μετά από χρώση με βρωμιούχο αιθίδιο (Miyamoto -Sato et al., 2003). Αυτή η μέθοδος μπορεί επίσης να ονομάζεται «δοκιμασία καθυστερημένης μετατόπισης», όπου η σύνδεση στο PFVYLI με το PTD επιδεικνύει σαφώς την καθυστερημένη μετατόπιση του IVT-mRNA στην πηκτή πολυακρυλαμιδίου σε σύγκριση με το γυμνό IVT-mRNA.
Ορισμένοι προτιμώμενοι τρόποι πραγμάτωσης της εφεύρεσης αναφέρονται παρακάτω με περισσότερες λεπτομέρειες, με βάση τον επισυναπτόμενο σχεδίασμά της ανωτέρω νέας μεθόδου για την παραγωγή μεταγώγιμων PTD-IVT-mRNA θεραπευτικών, παρουσιάζοντας τα διάφορα διαδοχικά στάδια της με τον ακόλουθο τρόπο :
1. Ως προς το βήμα Επιλογής ενός πεπτιδίου μεταγωγής (PTD).
Ένα οποιοδήποτε πεπτίδιο μεταγωγής, κατά προτίμηση υδρόφοβο, χωρίς ελεύθερη αμινομάδα, μπορεί να επιλεγεί.
Το επιλεγμένο αυτό PTD έχει, κατά προτίμηση, καθαρότητα > 95% και είναι ακετυλιωμένο στο αμινο-τελικό άκρο.
Το επιλεγμένο PTD συντίθεται, κατά προτίμηση, κατόπιν παραγγελίας.
Ειδικά, το PFVYLI επιλέγεται ως πεπτίδιο μεταγωγής, το οποίο αποτελείται από έξι (6) αμινοξέα (Ac-Pro-Phe-Val-Tyr-Leu-Ile-COOH).
2. Ως προς το βήμα Διάλυσης του PTD.
To PTD διαλύεται στον κατάλληλο διαλύτη, ανάλογα με τα χημικά χαρακτηριστικά του.
Το επιλεγμένο ειδικά πεπτίδιο PFVYLI, συντίθεται κατόπιν παραγγελίας. Αυτό παρουσιάζει πολύ χαμηλή υδατοδιαλυτότητα και επομένως διατηρείται σε μορφή σκόνης στους -20°C και, ακριβώς πριν από τη χρήση, διαλύεται σε DMF. Οποιοσδήποτε οργανικός διαλύτης, όπως διμεθυλοακεταμίδιο (DMA) ή διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO), μπορεί να χρησιμοποιηθεί αντί του DMF.
3. Ως προς το βήμα Σύζευξης του PTD με τη Πουρομυκίνη με EDC.HC1.
Ως συνδέτης μπορεί να χρησιμοποιηθεί η πουρομυκίνη, κατά προτίμηση, διυδροχλωρική πουρομυκίνη, η οποία διαλύεται, κατά προτίμηση σε DMF. Αντί της πουρομυκίνης, άλλοι νουκλεοζίτες μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως συνδέτες.
To EDC.HC1 διαλύεται, κατά προτίμηση με απεσταγμένο Η2O, κατεργασμένο με DEPC.
1 mg του συγκεκριμένου πεπτιδίου μεταγωγής PTD, ήτοι διαλυμένου με 2 μl DMF, επωάζεται σε θερμοκρασία δωματίου, για 2 ώρες με
• 2 μl από το ανωτέρω διάλυμα πουρομυκίνης [12,68 raM] και
· 4 μl από το ανωτέρω διάλυμα EDC.FIC1 [6,3 mM]
με αποτέλεσμα να παράγεται μια πουρομυκίνη-PTD ( όπως αποκαλείται στο εξής puro-PTD) προϊόν.
Η πουρομυκίνη είναι ο συνδέτης μεταξύ του πεπτιδίου μεταγωγής και του IVT-mRNA, τα οποία προστίθενται στο βήμα 6.
4. Ως προς το βήμα Φωσφορυλίωσης του προϊόντος πουρομυκίνης-PTD.
Η πουρομυκίνη-PTD φωσφορυλιώνεται από το ένζυμο Τ4 πολυνουκλεοτιδική κινάση (ΡΝΚ).
Ειδικότερα, αυτή η πουρομυκίνη-PTD φωσφορυλιώνεται, κατά προτίμηση, με τη χρήση 10 μονάδων από την Τ4 PΝΚ, IX του ρυθμιστικού διαλύματος της Τ4 ΡΝΚ, 10 μΐ από το διαλυτό PTD και με απεσταγμένο Η2O, κατεργασμένο με DEPC μέχρι τα 40 μl.
Η αντίδραση της φωσφορυλίωσης πραγματοποιείται στους 37°C, για 1 ώρα και 40 λεπτά, ακολουθούμενη από την απενεργοποίηση του ενζύμου Τ4 ΡΝΚ, κατά προτίμηση για 20 λεπτά, στους 65°C, όπου παράγεται το φωσφορυλιωμένο προϊόν πουρομυκίνης-PTD.
5. Ως προς το βήμα Αναστολής των ριβονουκλεασών.
Το φωσφορυλιωμένο προϊόν πουρομυκίνης-PTD επωάζεται με αναστολέα ριβονουκλεασών, κατά προτίμηση 60 μονάδες, για 15 λεπτά στους 37°C, για να απομακρυνθούν οποιεσδήποτε ριβονουκλεάσες από το μίγμα της παραπάνω αντίδρασης, προστατεύοντας έτσι το IVT-mRNA, το οποίο προστίθεται στο επόμενο στάδιο.
6. Ως προς το βήμα Συνένωσης του φωσφορυλιωμένου πουρομυκίνη-PTD προϊόντος με το IVT-mRNA,
Το παραπάνω φωσφορυλιωμένο προϊόν πουρομυκίνης-PTD (από 1 mg του PTD) συνδέεται με το επιλεγμένο - παραγόμενο θεραπευτικό IVT-mRNA χρησιμοποιώντας το ένζυμο Τ4 ΕΝΑ λιγάση.
Ιδιαίτερα, για την αντίδραση συνένωσης, το φωσφορυλιωμένο πουρομυκίμνη-PTD προϊόν επωάζεται με 15 μονάδες της Τ4 RNA λιγάσης, 1X του ρυθμιστικού διαλύματος της Τ4 RNA λιγάσης, 18 nM IVT-mRNA και έως τα 60 μl με απεσταγμένο Η2O,κατεργασμένο με DEPC .
Η αντίδραση αυτή της συνένωσης πραγματοποιείται στους 16°C, κατά τη διάρκεια της νύχτας και κατόπιν, το ένζυμο Τ4 RΝA λιγάση απενεργοποιείται, κατά προτίμηση στους 70°C για 10 λεπτά.
7. Ως προς το βήμα Αξιολόγησης της επιτυχούς έκβασης της προτεινόμενης καινοτόμου μεθόδου.
Η επιτυχής χημική ομοιοπολική σύζευξη του PTD με το IVT-mRNA μπορεί να αξιολογηθεί με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή. Η μέθοδος αυτή μπορεί να χαρακτηριστεί ως «δοκιμασία καθυστερημένης μετατόπισης», αφού η δέσμευση με το πεπτίδιο PTD δείχνει καθαρά την καθυστερημένη μετατόπιση του IVT-mRNA στην πηκτή σε σύγκριση με το γυμνό IVT-mRNA αναφοράς.
Η ηλεκτροφόρηση πραγματοποιείται σε αποδιατακτική πηκτή 8Μ ουρίας / 6% πηκτή πολυακρυλαμιδίου (PAGE), μετά από χρώση βρωμιούχου αιθιδίου (Miyamoto-Sato et al, 2003).
Εναλλακτικά, πηκτή αγαρόζης χρησιμοποιείται για την αξιολόγηση της επιτυχούς παραγωγής PTD-IVT-mRNA συμπλοκών (απλή ηλεκτροφόρηση πηκτής ή απο διατακτικές πηκτές αγαρόζης, που περιέχουν φορμαλδεΰδη ή γλυοξάλη/DMSO).
Claims (15)
1. Μέθοδος για την ανάπτυξη μιας πλατφόρμας μεταφοράς για την παραγωγή δυνάμενων για μεταφορά, μέσω πεπτιδίου μεταγωγής (PTD), in vitro μεταγραφόμενων (IVT) mRNA θεραπευτικών (PTD-IVT-mRNA), όπου η Τεχνολογία Πεπτιδίων Μεταγωγής χρησιμοποιείται ως πλατφόρμα μεταγωγής για θεραπευτικά in vitro μεταγραφόμενα (IVT) mRNAs, όπου η ανάπτυξη της εν λόγω πλατφόρμας μεταγωγής επιτυγχάνεται με ομοιοπολική χημική αντίδραση μεταξύ των εν λόγω IVT-mRNA μορίων και ενός επιλεγόμενου πεπτιδίου μεταγωγής, ειδικά ένα πεπτίδιο PFVYLI [Ac-PFVYLI-COOH. Προλίνη (Ρ) -Φαινυλαλανίνη (F) - Βαλίνη (V) -Τυροσίνη (Υ) - Λεύκινη (L) - Ισολευκίνη (I)], η οποία μέθοδος χαρακτηρίζεται από το συνδυασμό της τεχνολογίας PTD με IVT-mRNA, μέσω ομοιοπολικής χημικής σύνδεσης - σύζευξης, όπου το ανωτέρω IVT-mRNA συζεύγνυται με ένα πεπτίδιο μεταγωγής, μέσω του οποίου επιτυγχάνεται η σταθερότητα της σύνδεσης μεταξύ του πεπτιδίου μεταγωγής PTD και του θεραπευτικού IVT-mRNA και προκύπτει έτσι ένα PTD-IVT-mRNA (IVT-mRNA:PTD) σύμπλοκο, το οποίο είναι πολύ σταθερό, όπου τα ανωτέρω IVT-mRNAs, τα οποία αποτελούν τα θεραπευτικά μόρια, υποβάλλονται σε ενδοκυττάρια μεταγωγή μέσω της ανωτέρω ομοιοπολικής σύνδεσης με το κατάλληλο PTD, ειδικότερα το εν λόγω PFVYLI πεπτίδιο, μετά την οποία τα ανωτέρω IVT-mRNAs κατευθύνονται στα ριβοσώματα και μεταφράζονται στις αντίστοιχες πρωτεΐνες-στόχους για να εκδηλώσουν το θεραπευτικό τους αποτέλεσμα, και όπου η εν λόγω ομοιοπολική σύνδεση-δεσμός μειώνει την απώλεια φορτίου και ενισχύει την προστασία σε δυσμενείς συνθήκες κατά τη διάρκεια της in vivo μεταγωγής ή στο ενδοκυτταρικό περιβάλλον, λόγω της ύπαρξης των ριβονουκλεασών.
2. Μέθοδος για την ανάπτυξη μιας πλατφόρμας για την παραγωγή, δυνάμενων για μέσω PTD, IVT-mRNA θεραπευτικών (PTD-IVT-mRNA), ειδικότερα σύμφωνα με την αξίωση 1, η οποία χαρακτηρίζεται από το ότι η εν λόγω μέθοδος συνίσταται σε μια χημική αντίδραση ομοιοπολικής σύζευξης του PTD, όπως το πεπτίδιο PFVYLI (Ac-PFVYLI-COOH), σε ένα θεραπευτικό IVT-mRNA, μετά την πολυ-(Α) ουρά του, η οποία περιλαμβάνει τα γενικά στάδια:
1. Επιλογή ενός πεπτιδίου μεταγωγής,
2. Πουρομυκίνη ως συνδέτης του πεπτιδίου με το νουκλεϊκό οξύ, δηλαδή το in vitro μεταγραφόμενο (IVT) mRNA.
3. Φωσφορυλίωση, και
4. Συνένωση
3. Μέθοδος σύμφωνα με την αξίωση 2, η οποία χαρακτηρίζεται από το ότι στο ανωτέρω πρώτο βήμα της Επιλογής, το ανωτέρω PFVYLI είναι ένα υδρόφοβο πεπτίδιο από έξι (6) αμινοξέα, καθαρότητας > 95% και ακετυλιωμένο στο αμινο-τελικό άκρο (Ac-Pro-Phe-Val-Tyr-Leu-Ile-COOH), το οποίο συντίθεται κατόπιν παραγγελίας όπου αυτό το πεπτίδιο έχει πολύ χαμηλή υδατοδιαλυτότητα, και διατηρείται σε μορφή σκόνης στους -20°C και κατόπιν διαλύεται σε διμεθυλοφορμαμίδιο (DMF), λίγο πριν από τη χρήση.
4. Μέθοδος σύμφωνα με την αξίωση 2 ή 3, η οποία χαρακτηρίζεται από το ότι στο ανωτέρω δεύτερο βήμα Πουρομυιάνης ως συνδέτη του πεπτιδίου με το νουκλεϊκό οξύ, δηλαδή το in vitro μεταγραφόμενο (IVT) mRNA, η πουρομυκίνη, ειδικότερα μια διυδροχλωρική πουρομυκίνη, συνδέεται στο αμινο-τελικό άκρο του ανωτέρω PFVYLI με υδροχλωρικό Ν-(3-διμεθυλαμινοπροπυλ)-Ν'-αιθυλο-καρβοδιιμίδιο (EDC.HC1), και/ή από το ότι στο ανωτέρω τρίτο στάδιο Φωσφορυλίωσης του προϊόντος πουρομυκίνη-PFVYLI, πραγματοποιείται με Τ4 πολυνουκλεοτιδική κινάση (Τ4 ΡΝΚ), ή/και απο το ότι στο ανωτέρω τέταρτο βήμα Συνένωσης του φωσφορυλιωμένου προϊόντος πουρομυιάνη-PFVYLI πραγματοποιείται με το επιλεγμένο θεραπευτικό IVT-mRNA, με την Τ4 RNA λιγάση.
5. Μέθοδος σύμφωνα με μία από τις προηγούμενες αξιώσεις η οποία χαρακτηρίζεται από το ότι η ανωτέρω μέθοδος περιλαμβάνει τα ακόλουθα στάδια σε μια ειδική και καθορισμένη σειρά όπως περιγράφονται για τα ακόλουθα αναλυτικά στάδια ομοιοπολικής σύζευξης του IVT-mRNA στο πεπτίδιο μεταγωγής PFVYLI:
1- 4 μl EDC.HC1 [0,242 mg EDC.HC1 διαλυμένο σε 200 μl Η2O = 6,3 mM] αναμειγνύονται με 2 μl της Πουρομυκίνης [6,92 mg, διαλυμένα σε 1ml DMF - 12,68 mM] και 1 mg PFVYLI σε 2 μl DMF και επωάζονται σε θερμοκρασία δωματίου για 2 ώρες,
2- Η φωσφορυλίωση του συμπλόκου πουρομυκίνης-PFVYLI πραγματοποιείται με τη χρήση 1 μl Τ4 πολυνουκλεοτιδική κινάση, 4 μl ρυθμιστικού διαλύματος Τ4 πολυνουκλεοτιδικής κινάσης, 17 μl απεσταγμένου Η2O, κατεργασμένου με πυροκαρβονικό διαιθυλεστέρα (DEPC, Diethylpyrocarbonate), και 10 μl DMF, όπου η αντίδραση φωσφορυλίωσης πραγματοποιείται στους 37°C, για 1 ώρα και 40 λεπτά, ακολουθούμενη από την απενεργοποίηση του ενζύμου για 20 λεπτά, στους 65°C, 3- Το ανωτέρω σύμπλοκο επωάζεται με 1,5 μl αναστολέα ριβονουκλεασών, για 15 λεπτά, στους 37°C,
4- Για 1 mg από το πεπτίδιο PFVYLI υπολογίζεται ότι απαιτούνται 18 nΜ από το αντίστοιχο θεραπευτικό in vitro μεταγραφόμενο mRNA, όπου το μοριακό βάρος του in vitro μεταγραφόμενου mRNA μπορεί να υπολογιστεί με τη χρήση ενός εργαλείου βιοπληροφορικής όπως προσδιορίζεται, όπου η αλληλουχία του επιθυμητού in vitro μεταγραφόμενου mRNA εισάγεται και η συγκέντρωση που θα προστεθεί στην αντίδραση καθορίζεται από το μοριακό βάρος που υπολογίζεται, και τέλος,
5- 1,5 μl από την Τ4 RNA λιγάση, 6 μl από το ρυθμιστικό διάλυμα της Τ4 RNA λιγάσης, 18 nΜ από το in vitro μεταγραφόμενο mRNA και μέχρι τα 60 μl προσθήκη απεσταγμένου Η2O, κατεργασμένου με DEPC, όπου η αντίδραση συνένωσης πραγματοποιείται στους 16°C κατά τη διάρκεια της νύχτας και το ένζυμο στη συνέχεια απενεργοποιείται στους 70°C για 10 λεπτά.
6. Μέθοδος σύμφωνα με την προηγούμενη αξίωση, χαρακτηρίζεται από το ότι η εν λόγω χημική ομοιοπολική σύζευξη του PFVYLI με το IVT-mRNA αξιολογείται με ηλεκτροφόρηση σε 8 Μ ουρία / 6% πηκτή πολυακρυλαμιδίου (PAGE) μετά από χρώση με βρωμιούχο αιθίδιο, όπου αυτή η μέθοδος δρα ως δοκιμασία καθυστερημένης μετατόπισης, όπου η σύνδεση στο πεπτίδιο PFVYLI επιδεικνύει καθυστερημένη μετατόπιση του in vitro μεταγραφόμενου mRNA στην πηκτή πολυακρυλαμιδίου σε σύγκριση με μια προκαθορισμένη αναφορά.
7. Μέθοδος σύμφωνα με μία από τις προηγούμενες αξιώσεις, ιδιαιτέρως την αξίωση 3 ή 6, η οποία χαρακτηρίζεται από το ότι στο ανωτέρω στάδιο Επιλογής ενός PTD, ένα πεπτίδιο μεταγωγής (PTD), κατά προτίμηση υδρόφοβο, επιλέγεται χωρίς ελεύθερη αμινομάδα, κατά προτίμηση όπου το επιλεγμένο PTD έχει καθαρότητα >95% και είναι ακετυλιωμένο στο αμινο-τελικό άκρο, ακόμη ειδικότερα, όπου το επιλεγόμενο πεπτίδιο μεταγωγής συντίθεται κατόπιν παραγγελίας, ειδικά όπου το πεπτίδιο PFVYLI, ήτοι έξι (6) αμινοξέων (Ac-Pro-Phe-Val-Tyr-Leu-Ile-COOH), επιλέγεται ως PTD.
8. Μέθοδος σύμφωνα με μία από τις προηγούμενες αξιώσεις, ειδικότερα την αξίωση 2 ή 7, η οποία χαρακτηρίζεται από το ότι στο ανωτέρω στάδιο Διάλυσης, το εν λόγω PTD διαλύεται σε κατάλληλο διαλύτη, ανάλογα με τα χημικά χαρακτηριστικά του PTD, ιδιαίτερα όπου το ανωτέρω PFVYLI επιλέγεται ως PTD και συντίθεται, όπου έχει πολύ χαμηλή υδατοδιαλυτότητα και επομένως διατηρείται σε μορφή σκόνης στους -20°C και, ακριβώς πριν από τη χρήση, διαλύεται σε έναν οργανικό διαλύτη, όπως διμεθυλοακεταμίδιο (DMA) ή διμεθυλοσουλφ οξείδιο (DMSO), κατά προτίμηση DMF.
9. Μέθοδος σύμφωνα με μία από τις προηγούμενες αξιώσεις, ειδικά την αξίωση 2 ή 8, η οποία χαρακτηρίζεται από το ότι στο ανωτέρω στάδιο Σύζευξης του πεπτιδίου μεταγωγής και σε αυτό της πουρομυκίνης με EDC.HCI, η πουρομυκίνη, ειδικότερα διυδροχλωρική πουρομυκίνη, χρησιμοποιείται ως συνδέτης, η οποία διαλύεται κατά προτίμηση σε DMF, ενώ και άλλοι νουκλεοζίτες μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως συνδέτες, όπου το EDC.HC1 διαλύεται κατά προτίμηση σε, κατεργασμένο με DEPC, απεσταγμένο Η2O; όπου 1 mg του συγκεκριμένου πεπτιδίου μεταγωγής (διαλυμένου με 2 μl DMF) επωάζεται σε θερμοκρασία δωματίου, για 2 ώρες με:
· 2 μl από το ανωτέρω διάλυμα πουρομυκίνης [12,68 mM] και
• 4 μl από το ανωτέρω διάλυμα EDC.HC1 [6,3 mM]
παράγοντας έτσι το προϊόν πουρομυκίνη-PTD (puro-PTD), όπου η πουρομυκίνη είναι ο συνδέτης μεταξύ του πεπτιδίου μεταγωγής και του in vitro μεταγραφόμενου mRNA, το οποίο προστίθεται στο επόμενο βήμα παρακάτω.
10. Μέθοδος σύμφωνα με μία από τις προηγούμενες αξιώσεις, ιδιαιτέρως την αξίωση 2 ή 9, που χαρακτηρίζεται από το ότι για το εν λόγω στάδιο Φωσφορυλίωσης του προϊόντος πουρομυκίνη-PTD, το πουρομυκίνη-PTD προϊόν φωσφορυλιώνεται από το ένζυμο Τ4 πολυνουκλεοτιδική κινάση (ΡΝΚ),
ιδιαίτερα όπου το προϊόν πουρομυκίνη-PTD φωσφορυλιώνεται κατά προτίμηση με τη χρήση 10 μονάδων από την Τ4 PΝΚ, IX του Τ4 ΡΝΚ ρυθμιστικού διαλύματος, 10 μl από το διαλυτό PTD και απεσταγμένο Η2O, κατεργασμένο με DEPC, μέχρι τα 40 μl, ακόμη ειδικότερα όπου η αντίδραση της φωσφορυλίωσης πραγματοποιείται στους 37°C, για 1 ώρα και 40 λεπτά, ακολουθούμενη από την απενεργοποίηση του ένζυμου Τ4 ΡΝK, κατά προτίμηση για 20 λεπτά, στους 65°C, όπου παράγεται το φωσφορυλιωμένο προϊόν πουρομυκίνη-PTD.
11. Μέθοδος σύμφωνα με μία από τις προηγούμενες αξιώσεις, ειδικά την αξίωση 2 ή 10, η οποία χαρακτηρίζεται από το ότι στο στάδιο Αναστολής των RΝασών, το φωσφορυλιωμένο προϊόν πουρομυκίνη-PTD επωάζεται με αναστολέα ριβονουκλεασών, κατά προτίμηση 60 μονάδες, για 15 λεπτά στους 37°C, με αποτέλεσμα να απομακρύνονται οποιεσδήποτε ριβονουκλεάσες από το μίγμα της παραπάνω αντίδρασης, προστατεύοντας έτσι το in vitro μεταγραφόμενο mRNA, το οποίο προστίθεται στο επόμενο στάδιο.
12. Μέθοδος σύμφωνα με μία από τις προηγούμενες αξιώσεις, ειδικά την αξίωση 2 ή 11 , η οποία χαρακτηρίζεται από το ότι στο στάδιο Συνένωσης του φωσφορυλιωμένου προϊόντος πουρομυκίνης-PTD με το IVT-mRNA, το ανωτέρω φωσφορυλιωμένο προϊόν πουρομυκίνης-PTD (από 1 mg του PTD) συνδέεται με το επιλεγμένο παραγόμενο θεραπευτικό IVT-mRNA χρησιμοποιώντας το ένζυμο Τ4 RNA λιγάση, όπου ειδικότερα για την αντίδραση συνένωσης, το φωσφορυλιωμένο προϊόν πουρομυκίνης-PTD επωάζεται με 15 μονάδες της Τ4 RNA λιγάσης, IX του ρυθμιστικού διαλύματος της Τ4 RNA λιγάσης, 18 nM IVT-mRNA και έως 60 μl με απεσταγμένο Η2O, κατεργασμένο με DEPC, κατά προτίμηση όπου η αντίδραση συνένωσης πραγματοποιείται στους 16°C, κατά τη διάρκεια της νύχτας και κατόπιν, το ένζυμο Τ4 RNA λιγάση απενεργοποιείται, κατά προτίμηση στους 70°C για 10 λεπτά.
13. Μέθοδος σύμφωνα με μία από τις προηγούμενες αξιώσεις, ειδικά την αξίωση 2 ή 12, η οποία χαρακτηρίζεται από το ότι στο στάδιο Αξιολόγησης της έκβασης αυτής της μεθόδου παραγωγής, η χημική ομοιοπολική σύζευξη του PTD με το IVT-mRNA αξιολογείται με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή, ειδικά όπου η μέθοδος αυτή αξιολογείται ως δοκιμασία καθυστερημένης μετατόπισης, στο ότι η δέσμευση με το πεπτίδιο PTD δείχνει καθυστερημένη μετατόπιση του IVT-mRNA στην πηκτή σε σύγκριση με το γυμνό IVT-mRNA αναφοράς, κατά προτίμηση όπου η ηλεκτροφόρηση πραγματοποιείται με αποδιατακτική πηκτή 8 Μ ουρίας / 6% πηκτή πολυακρυλαμιδίου (PAGE), μετά από χρώση βρωμιούχου αιθιδίου, ή όπου εναλλακτικά, πηκτή αγαρόζης χρησιμοποιείται για την αξιολόγηση της δημιουργίας PTD-IVT-mRNA συμπλοκών, όπως απλή ηλεκτροφόρηση πηκτής ή απο διατακτικές πηκτές αγαρόζης, που περιέχουν φορμαλδεΰδη ή γλυοξάλη/DMSO.
14. Μέθοδος σύμφωνα με μία από τις προηγούμενες αξιώσεις, ειδικά την αξίωση 2 ή 13, η οποία χαρακτηρίζεται από το ότι έχει επικυρωθεί ειδικά από τους υψηλούς ρυθμούς διαμόλυνσης σε κύτταρα.
15. Χρήση της τεχνολογίας των πεπτιδίων μεταγωγής (Protein Transduction Domains - PTDs) για την ανάπτυξη μιάς πλατφόρμας για την παραγωγή δυνάμενων για μεταφορά, PTD-IVT-mRNA όπως ορίζεται στη μέθοδο σύμφωνα με οποιαδήποτε από τις αξιώσεις 1 έως 14, όπου η ανωτέρω πλατφόρμα επιτυγχάνεται με ομοιοπολική χημική αντίδραση μεταξύ των εν λόγω IVT-mRNA μορίων και του επιλεγμένου πεπτιδίου μεταγωγής (PTD), ειδικά ενός πεπτιδίου PFVYLI, περιλαμβάνοντας το συνδυασμό της PTD τεχνολογίας με το IVT-mRNA, μέσω ομοιοπολικής χημικής σύνδεσης-σύζευξης, όπου το εν λόγω IVT-mRNA είναι συζευγμένο με PTD, μέσω του οποίου η σταθερότητα της σύνδεσης μεταξύ του πεπτιδίου μεταγωγής και του θεραπευτικού IVT-mRNA μορίου ενισχύεται, έτσι παρέχοντας ένα σύμπλοκο PTD-IVT-mRNA το οποίο είναι πολύ σταθερό, όπου τα ανωτέρω in vitro μεταγραφόμενα mRNAs, τα οποία συνιστούν μία επιλεγμένη γενιά θεραπευτικών μορίων, δυνάμενων για ενδοκυτταρική μεταφορά μέσω της αναφερθείσας ομοιοπολικής σύζευξης στο κατάλληλο PTD, ειδικότερα το εν λόγω πεπτίδιο PFVYLI, μετά το οποίο, τα ανωτέρω IVT-mRNAs κατευθύνονται στα ριβοσώματα και μεταφράζονται στις αντίστοιχες πρωτεΐνες-στόχους, επιτυγχάνοντας με αυτό τον τρόπο ένα θεραπευτικό αποτέλεσμα.
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GR20190100504A GR1010063B (el) | 2019-11-11 | 2019-11-11 | Μεθοδος για την αναπτυξη μιας πλατφορμας για την παραγωγη δυναμενων για μεταφορα μεσω πεπτιδιου μεταγωγης (ptd), in vitro μεταγραφομενων (ivt) mrna θεραπευτικων |
| EP20823912.9A EP4061393A1 (en) | 2019-11-11 | 2020-11-11 | Method for the development of a delivery platform to produce deliverable ptd-ivt-mrna therapeutics |
| PCT/GR2020/000059 WO2021094792A1 (en) | 2019-11-11 | 2020-11-11 | METHOD FOR THE DEVELOPMENT OF A DELIVERY PLATFORM TO PRODUCE DELIVERABLE PTD-IVT-mRNA THERAPEUTICS |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GR20190100504A GR1010063B (el) | 2019-11-11 | 2019-11-11 | Μεθοδος για την αναπτυξη μιας πλατφορμας για την παραγωγη δυναμενων για μεταφορα μεσω πεπτιδιου μεταγωγης (ptd), in vitro μεταγραφομενων (ivt) mrna θεραπευτικων |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| GR20190100504A true GR20190100504A (el) | 2021-06-14 |
| GR1010063B GR1010063B (el) | 2021-08-20 |
Family
ID=73793542
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| GR20190100504A GR1010063B (el) | 2019-11-11 | 2019-11-11 | Μεθοδος για την αναπτυξη μιας πλατφορμας για την παραγωγη δυναμενων για μεταφορα μεσω πεπτιδιου μεταγωγης (ptd), in vitro μεταγραφομενων (ivt) mrna θεραπευτικων |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP4061393A1 (el) |
| GR (1) | GR1010063B (el) |
| WO (1) | WO2021094792A1 (el) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001004265A2 (en) * | 1999-07-12 | 2001-01-18 | Phylos, Inc. | C-terminal protein tagging |
| WO2018011153A1 (en) * | 2016-07-11 | 2018-01-18 | Evox Therapeutics Ltd | Cell penetrating peptide (cpp)-mediated ev loading |
| WO2019079215A1 (en) * | 2017-10-16 | 2019-04-25 | Aadigen, Llc | PEPTIDES AND NANOPARTICLES FOR INTRACELLULAR MRRNA DELIVERY |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7125669B2 (en) * | 2001-11-27 | 2006-10-24 | Compound Therapeutics, Inc. | Solid-phase immobilization of proteins and peptides |
| EP1816192B1 (en) * | 2004-10-15 | 2012-12-12 | National Institute of Advanced Industrial Science and Technology | LINKER FOR CONSTRUCTING mRNA-PUROMYCIN-PROTEIN CONJUGATE |
| US7981446B2 (en) * | 2007-11-26 | 2011-07-19 | Forhumantech. Co., Ltd. | Pharmaceutical compositions and methods for delivering nucleic acids into cells |
| US20170035914A1 (en) * | 2015-08-05 | 2017-02-09 | General Electric Company | Functionalized peptide transporters for cellular uptake |
| US10660860B2 (en) * | 2017-02-08 | 2020-05-26 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Therapeutic cationic peptides and unimolecular nanoparticles for efficient delivery thereof |
-
2019
- 2019-11-11 GR GR20190100504A patent/GR1010063B/el active IP Right Grant
-
2020
- 2020-11-11 WO PCT/GR2020/000059 patent/WO2021094792A1/en unknown
- 2020-11-11 EP EP20823912.9A patent/EP4061393A1/en active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001004265A2 (en) * | 1999-07-12 | 2001-01-18 | Phylos, Inc. | C-terminal protein tagging |
| WO2018011153A1 (en) * | 2016-07-11 | 2018-01-18 | Evox Therapeutics Ltd | Cell penetrating peptide (cpp)-mediated ev loading |
| WO2019079215A1 (en) * | 2017-10-16 | 2019-04-25 | Aadigen, Llc | PEPTIDES AND NANOPARTICLES FOR INTRACELLULAR MRRNA DELIVERY |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2021094792A1 (en) | 2021-05-20 |
| GR1010063B (el) | 2021-08-20 |
| EP4061393A1 (en) | 2022-09-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4974890B2 (ja) | ペプチドが結合された、イノシン置換アンチセンスオリゴマー化合物および方法 | |
| Jans et al. | Signals mediating nuclear targeting and their regulation: application in drug delivery | |
| Meade et al. | Exogenous siRNA delivery using peptide transduction domains/cell penetrating peptides | |
| Zuris et al. | Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo | |
| Zatsepin et al. | Conjugates of oligonucleotides and analogues with cell penetrating peptides as gene silencing agents | |
| Venkatesan et al. | Peptide conjugates of oligonucleotides: synthesis and applications | |
| JP5818237B2 (ja) | Ｎ−メチルアミノ酸およびその他の特殊アミノ酸を含む特殊ペプチド化合物ライブラリーの翻訳構築と活性種探索法 | |
| KR102623311B1 (ko) | 감소된 신장 청소율을 갖는 다중결합 올리고뉴클레오티드 | |
| BR112021013934A2 (pt) | Composições de trem e seus usos | |
| Zuris et al. | Efficient delivery of genome-editing proteins in vitro and in vivo | |
| US20210139892A1 (en) | Compositions and methods for delivery of rna to a cell | |
| JP2020525462A (ja) | 改善された薬物送達のためのステープル又はステッチペプチドを含む化合物 | |
| CN114096674A (zh) | 环状多核糖核苷酸的给药方法 | |
| AU2002334142B2 (en) | Control of gene expression using a complex of an oligonucleotide and a regulatory peptide | |
| Kovaliov et al. | Grafting strategies for the synthesis of active DNase I polymer biohybrids | |
| AU2009208646A1 (en) | Cationic siRNAs, synthesis and use for interfering RNA | |
| GR20190100504A (el) | Μεθοδος για την αναπτυξη μιας πλατφορμας για την παραγωγη δυναμενων για μεταφορα μεσω πεπτιδιου μεταγωγης (ptd), in vitro μεταγραφομενων (ivt) mrna θεραπευτικων | |
| US7745596B2 (en) | Nuclear transport nucleic acid delivery vector | |
| WO2023031856A1 (en) | Compositions and methods for rna affinity purification | |
| JP7013626B2 (ja) | 細胞膜透過ペプチド、構築物、及び、カーゴ分子を細胞内に輸送する方法 | |
| KR20080041037A (ko) | 단백질 수송 펩타이드와 짧은 간섭 ｒｎａ와의 복합체 및그 용도 | |
| Wilce et al. | RNA‐binding proteins that target the androgen receptor mRNA | |
| US20220241426A1 (en) | Peptide for use in the reduction of side effects in the form of immunostimulatory reactions/effects | |
| KR20220117091A (ko) | 생체내 세포에서 합성 및 분비되고 세포로 투과하는 관심 폴리펩타이드를 코딩하는 발현카세트 및 이의 용도 | |
| JP7153033B2 (ja) | 真核生物におけるｒｎａ分子の細胞型特異的な翻訳に関する系及び方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PG | Patent granted |
Effective date: 20210915 |