FR3109584A1 - Microcompartiment pour la culture de cellules de cnidaires - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne un microcompartiment comprenant une couche externe (1) au moins partielle en hydrogel, et un cœur au moins partiellement liquide comprenant au moins une cellule de cnidaire (3) et éventuellement une lumière (2). L’invention concerne également procédé de préparation d’un microcompartiment selon l’invention, un procédé de culture in vitro de cellules et/ou tissus de cnidaire, un procédé de clonage haut débit de cnidaires, et un procédé de dispersion de cellules et/ou de tissus de cnidaire dans un milieu naturel.Figure pour l’abrégé : Fig. 1
Description
La présente invention concerne le domaine du développement et de la dispersion en milieu naturel des cnidaires, en particulier des coraux.
Arrière-plan technologique
Les cnidaires sont un groupe d’animaux aquatiques regroupant notamment les anémones de mer, les méduses et les coraux. Appartenant à la famille des radiaires, ils sont diploblastiques et présentent une symétrie radiaire. Les colonies de coraux forment des récifs coralliens accueillant un écosystème capital pour la biodiversité et la vitalité des océans. Les coraux sont des éléments clés de ces écosystèmes. Du fait des modifications répétées et persistantes de leur environnement, les coraux dépérissent massivement : réchauffement climatique, acidification des océans, et pollutions d’origine humaine menacent coraux, récifs et écosystèmes. La préservation des coraux et des récifs coralliens est un enjeu écologique, économique et sanitaire majeur pour l’ensemble de la planète.
Aujourd’hui, les initiatives de restauration corallienne dépendent principalement de la collecte des gamètes coralliens, la reproduction sexuée et maturation en laboratoire, puis l'essaimage de larves. Cette stratégie est limitée directement par l'accès très restreint aux gamètes coralliens. La collecte de ces gamètes est excessivement difficile et effectuée en mer, une fois par an seulement. Il existe un réel besoin de changement d’échelle pour répondre à un problème mondial. Des approches de fragmentation ou micro-fragmentation - reproduction asexuée - permettent également le bouturage et l’amplification des coraux. Malheureusement, cette coraliculture se fait à la main et ne permet pas de répondre à l’ampleur du problème.
En laboratoire, la culturein vitrocellulaire et tissulaire corallienne est extrêmement difficile et le maintien prolongé des coraux en culture n’est pas possible. L’étude d'agrégats cellulaires cnidaires tridimensionnels à permis d’identifier la possibilité de re-morphogenèse in vitro. Toutefois, le taux de réussite de ce procédé est faible et n’est pas suffisant pour envisager des cultures en grande quantité.
Ainsi, la demande de brevet WO 2009/037698 décrit un procédé de culture et de propagation de tissus coralliens. Selon ce procédé, des fragments de tissus mous de coraux sont cultivés dans un milieu à base d’eau de mer, conduisant à la formation de sphéroïdes qui sont viables en culture pendant plusieurs mois. Ces sphéroïdes peuvent induire le développement de polypes de coraux fonctionnels par re-morphogénèse. Le procédé décrit dans cette demande identifie la possibilité de re-morphogénèse in vitro, mais le nombre de sphéroïdes produits et le taux de réussite du procédé sont faibles et ne sont pas suffisants pour envisager des cultures en grande quantité.
Il existe donc un besoin de méthodes alternatives permettant le développement efficace et en grande quantité de tissus coralliens, notamment par le biais de culturesin vitro.
Dans ce cadre, la Demanderesse a développé des microcompartiments permettant d’initier le développement de tissus de cnidaires, de les cultiver et de les disperser en milieu naturel. De par leur structure, les microcompartiments permettent une initiation et un développement efficaces des tissus de cnidaires, et une protection desdits tissus lors de leur culture et de leur dispersion en milieu naturel.
Les microcompartiments selon l’invention présentent un grand nombre d’avantages, notamment ils permettent :
- d’obtenir un haut pourcentage de re-morphogénèse cnidairein capsulo,
- de créer des boutures coralliennes résistantes aux changements climatiques par couplage avec des zooxanthelles sélectionnées,
- de disperser les boutures coralliennes en milieu naturel,
- de cultiver les boutures coralliennes en bioréacteur ou directement en milieu naturel,
- de protéger les tissus coralliens encapsulés des chocs et des manipulations, notamment lors de leur culture en bioréacteur et/ou de leur dispersion en milieu naturel,
- d’augmenter la qualité de la cryoconservation corallienne.
- d’obtenir un haut pourcentage de re-morphogénèse cnidairein capsulo,
- de créer des boutures coralliennes résistantes aux changements climatiques par couplage avec des zooxanthelles sélectionnées,
- de disperser les boutures coralliennes en milieu naturel,
- de cultiver les boutures coralliennes en bioréacteur ou directement en milieu naturel,
- de protéger les tissus coralliens encapsulés des chocs et des manipulations, notamment lors de leur culture en bioréacteur et/ou de leur dispersion en milieu naturel,
- d’augmenter la qualité de la cryoconservation corallienne.
La présente invention concerne ainsi un microcompartiment comprenant :
- une couche externe au moins partielle en hydrogel, et
- un cœur au moins partiellement liquide comprenant au moins une cellule de cnidaire.
- une couche externe au moins partielle en hydrogel, et
- un cœur au moins partiellement liquide comprenant au moins une cellule de cnidaire.
L’invention concerne également un procédé de préparation d’un microcompartiment selon l’invention, comprenant les étapes consistant à :
(a) fournir au moins une cellule de cnidaire, et
(b) encapsuler la au moins une cellule fournie à l’étape (a) dans une couche d’hydrogel pour obtenir un microcompartiment.
(a) fournir au moins une cellule de cnidaire, et
(b) encapsuler la au moins une cellule fournie à l’étape (a) dans une couche d’hydrogel pour obtenir un microcompartiment.
L’invention concerne également un procédé de culturein vitrode cellules et/ou tissus de cnidaire, comprenant la culture dans un milieu adapté d’au moins un microcompartiment selon l’invention ou obtenu par un procédé de préparation selon l’invention.
L’invention concerne également un procédé de clonage haut débit de cnidaires, comprenant la culture dans un milieu adapté d’au moins deux microcompartiments selon l’invention ou obtenus par un procédé de préparation selon l’invention.
L’invention concerne enfin un procédé de dispersion de cellules et/ou de tissus de cnidaire dans un milieu naturel, comprenant les étapes consistant à :
(a’) disperser dans ledit milieu naturel au moins un microcompartiment selon l’invention ou obtenu par un procédé selon l’invention,
(b’) éliminer au moins partiellement la couche d’hydrogel du au moins un microcompartiment pour libérer tout ou partie des cellules et/ou tissus de cnidaire.
(a’) disperser dans ledit milieu naturel au moins un microcompartiment selon l’invention ou obtenu par un procédé selon l’invention,
(b’) éliminer au moins partiellement la couche d’hydrogel du au moins un microcompartiment pour libérer tout ou partie des cellules et/ou tissus de cnidaire.
Bien entendu, les différentes caractéristiques, variantes et formes de réalisation de l'invention peuvent être associées les unes avec les autres selon diverses combinaisons dans la mesure où elles ne sont pas incompatibles ou exclusives les unes des autres.
De plus, diverses autres caractéristiques de l'invention ressortent de la description annexée effectuée en référence aux dessins qui illustrent des formes, non limitatives, de réalisation de l'invention et où :
Description détaillée
Microcompartiment
Un premier objet de l’invention est un microcompartiment comprenant :
- une couche externe au moins partielle en hydrogel, et
- un cœur au moins partiellement liquide comprenant au moins une cellule de cnidaire.
- une couche externe au moins partielle en hydrogel, et
- un cœur au moins partiellement liquide comprenant au moins une cellule de cnidaire.
Le microcompartiment peut être de toute forme compatible avec une encapsulation de cellules. Le microcompartiment peut par exemple être de forme sphérique ou quasi-sphérique, ou allongée, par exemple ovoïde ou tubulaire. De préférence, le microcompartiment a une forme sphérique ou quasi-sphérique. Par « quasi-sphérique », on désigne notamment une forme dont la dimension caractéristique ne diffère que faiblement, par exemple reste dans une gamme de plus ou moins 10%, de préférence plus ou moins 5%, par rapport à la valeur moyenne de cette dimension caractéristique sur l’ensemble du microcompartiment. Un microcompartiment quasi-sphérique peut également être un microcompartiment sphérique dont la surface comprend des imperfections ponctuelles affectant sa sphéricité, la surface des imperfections pouvant représenter moins de 10%, de préférence moins de 5%, en particulier moins de 1%, de la surface du microcompartiment.
La taille du microcompartiment peut varier dans une large mesure tant qu’elle reste compatible avec l’encapsulation de cellules, la culturein vitroet/ou la dispersion en milieu naturel. La taille du microcompartiment dépend notamment, par biomimétisme, des stades de développement des espèces dont les cellules sont encapsulées, et/ou de la taille des stades embryonnaires correspondants. Une dimension caractéristique du microcompartiment est classiquement comprise entre 0,1 mm et 1 cm, de préférence entre 0,2 mm et 5 mm. La dimension désignée par « dimension caractéristique » dépend de la forme du microcompartiment. Par exemple, lorsque le microcompartiment est sphérique ou quasi-sphérique, la dimension caractéristique est le diamètre du microcompartiment. Lorsque le microcompartiment a une forme allongée, ovoïde ou tubulaire, la dimension caractéristique est la plus petite dimension du microcompartiment, moyennée le cas échéant sur l’ensemble du microcompartiment.
Par « milieu naturel », on désigne un milieu naturel dans lequel les cnidaires sont naturellement présents, ou adapté à la présence et/ou au développement des cnidaires. Il s’agit généralement du milieu marin, et peut se situer plus ou moins proche d’au moins un récif de corail lorsque le cnidaire est un corail, ou de tout élément susceptible de servir de support au développement des cnidaires, notamment des coraux.
Dans le contexte de l'invention, la « couche en hydrogel » désigne une structure tridimensionnelle formée à partir d'une matrice de chaînes de polymères gonflée par un liquide, préférentiellement de l'eau. Avantageusement, l'hydrogel utilisé est biocompatible, en ce sens qu'il n'est pas toxique pour les cellules. En outre, la couche en hydrogel doit permettre la diffusion d'oxygène, d’eau et/ou de nutriments pour alimenter les cellules contenues dans le microcompartiment et permettre leur survie. Par exemple, la couche externe en hydrogel contient de l'alginate. Préférentiellement, la couche externe ne comprend que de l'alginate (et le liquide gonflant). Dans le contexte de l'invention, on entend par « alginate » des polysaccharides linéaires formés à partir de β-D-mannuronate (M) et α-L-guluronate (G), des sels et dérivés de ceux-ci. Avantageusement, l'alginate est un alginate de sodium, composé à plus de 80% de G et moins de 20% de M, avec une masse moléculaire moyenne de 100 à 400 KDa (par exemple : PRONOVA® SLG100) et à une concentration totale comprise entre 0,5% et 5% en masse. Selon l'invention, la couche en hydrogel est de préférence dépourvue de cellules.
Dans un mode de réalisation, l’hydrogel est au moins en partie réticulé. En particulier, lorsque l’hydrogel est l’alginate, celui-ci est au moins en partie réticulé. De préférence, la surface externe – c’est-à-dire en contact avec l’extérieur du microcompartiment – de la couche externe en hydrogel, notamment en alginate, est réticulée.
De préférence, le microcompartiment est clos, c’est-à-dire que la couche externe en hydrogel couvre l’intégralité de la surface du cœur. Dans un mode de réalisation, la couche externe est seulement partielle et peut comporter, par exemple, au moins une brèche. Une telle interruption de la couche d’hydrogel peut notamment faciliter la rupture de la capsule dans des conditions adaptées, par exemple lorsque la pression interne de la capsule augmente. Dans un mode de réalisation, le microcompartiment est de forme tubulaire et la périphérie du tube est couverte de la couche en hydrogel, tandis que les extrémités du tube en sont au moins partiellement dépourvues. Ceci peut faciliter la libération des cellules et/ou tissus notamment lors de la dispersion du microcompartiment en milieu naturel.
Dans un mode de réalisation, la couche externe en hydrogel, ou au moins une partie de celle-ci, de préférence au moins 50%, au moins 70%, au moins 80%, au moins 90%, au moins 95%, de celle-ci est translucide. Cela favorise notamment le passage de la lumière au travers de la couche externe ou d’une partie de celle-ci pour permettre la photosynthèse du cnidaire et/ou de l’organisme pouvant vivre en symbiose avec le cnidaire, lequel peut être notamment une zooxanthelle ou une algue, s’il est présent dans le microcompartiment.
Dans un mode de réalisation particulier, l'épaisseur de la couche externe en hydrogel représente 5 à 40% du rayon (ou de la moitié de la dimension caractéristique) du microcompartiment.
La couche externe en hydrogel peut comprendre en outre des éléments fonctionnels supplémentaires tels que des molécules intégrées pour un gain de fonction. Parmi les éléments fonctionnels supplémentaires pouvant être compris dans la couche externe en hydrogel, on peut citer notamment du carbonate de calcium, un élément plus dense que l’eau de mer, un anti-appétant pour poissons, une molécule fixant l’oxygène, une molécule bio-luminescente, un colorant, un anti-bactérien, un anti-fongique, un anti-parasitaire et/ou une alginate liase.
De préférence, l’incorporation des éléments fonctionnels supplémentaires dans la couche externe en hydrogel n’affecte pas la translucidité de tout ou partie de celle-ci.
Le carbonate de calcium peut être intégré dans la couche externe en hydrogel pour faciliter notamment la calcification des coraux et/ou initier l’adhésion du bourgeon cnidaire.
Les éléments plus denses que l’eau de mer peuvent être intégrés dans la couche externe en hydrogel pour lester le microcompartiment pour qu’il tombe plus facilement ou plus rapidement notamment en milieu naturel, par exemple sur le fond marin et/ou sur un récif.
L’anti-appétant pour poissons peut être intégré dans la couche externe en hydrogel pour limiter l’appétence des poissons pour les microcompartiments lors d’une dispersion en milieu naturel.
Les molécules fixant l’oxygène peuvent être intégrées dans la couche externe en hydrogel pour réguler la diffusion de l’oxygène vers le contenu cellulaire et/ou tissulaire du microcompartiment. Par exemple, on peut citer l’hémoglobine extraite du ver marin arénicole telle que celle développée par la société Hemarina.
La molécule bio-luminescente et/ou le colorant peuvent être intégrés dans la couche externe en hydrogel pour faciliter notamment la détection, la localisation et/ou la manipulation des microcompartiments.
L’anti-bactérien, l’anti-fongique et/ou l’anti-parasitaire peuvent être intégrés dans la couche externe en hydrogel pour éviter ou limiter une contamination bactérienne, fongique, et/ou parasitaire des cellules et/ou tissus compris dans le microcompartiment.
L’alginate liase peut être intégrée dans la couche externe en hydrogel pour faciliter la décapsulation, notamment la décapsulation spontanée, du microcompartiment lors de sa dispersion en milieu naturel. L’alginate liase peut être intégrée en très faible concentration, ou en combinaison avec un élément retardant l’action de l’alginate liase, pour que la décapsulation puisse avoir lieu de façon différée, par exemple une fois que le développement des cellules et/ou tissus de cnidaire dans le microcompartiment a atteint un certain stade.
Le cœur du microcompartiment est au moins partiellement liquide, et comprend au moins une cellule de cnidaire. De préférence, les seuls constituants du cœur qui ne sont pas liquides sont les cellules de cnidaires, les tissus de cnidaires et/ou structures plus ou moins organisées formées par celles-ci ou ceux-ci.
Par « cnidaires » on désigne dans la présente invention un groupe d’animaux aquatiques regroupant notamment les anémones de mer, les méduses et les coraux. Les cnidaires appartiennent à la famille des radiaires, sont diploblastiques et présentent une symétrie radiaire. De préférence, un cnidaire selon l’invention est un corail ou une anémone de mer, en particulier il s’agit d’un corail. Par cellule de cnidaire, on désigne n’importe quel type de cellule de cnidaire. Par « au moins une cellule de cnidaire », on désigne de préférence un nombre compris entre 1 et 200 cellules de cnidaires. Dans un mode de réalisation, la au moins une cellule de cnidaire comprend au moins une cellule d’endoderme de cnidaire (bouche) ou au moins une cellule d’ectoderme de cnidaire (tentacule ou équivalent). De préférence, la au moins une cellule de cnidaire comprend au moins une cellule d’endoderme de cnidaire et au moins une cellule d’ectoderme de cnidaire. Les cellules d’endoderme peuvent être choisies parmi les cellules myoépithéliales, les cellules glandulaires, les cellules sensorielles, les cellules interstitielles et les cellules nerveuses. Les cellules d’ectoderme peuvent être choisies parmi les cellules myoépithéliales, les cellules sensorielles, les cellules interstitielles, les cellules cnidocytes et les cellules nerveuses.
Dans un mode de réalisation, le cœur comprend en outre au moins un élément nutritif.
Par « élément nutritif », on désigne tout élément susceptible de favoriser la survie et/ou la croissance des cellules de cnidaires présentes dans le microcompartiment, et/ou de l’organisme pouvant vivre en symbiose avec le cnidaire lorsqu’il est présent dans le compartiment. Les éléments nutritifs peuvent notamment être choisis dans le groupe constitué par des lipides, des glucides, des protéines et l’un quelconque de leurs mélanges. En particulier, il peut s’agir d’un sérum animal tel que le sérum de veau fœtal (FBS), le sérum de cheval ou le Remplacement de sérum KnockOut™, d’un milieu de culture cellulaire tel que le milieu DMEM (milieu minimum essentiel de Eagle modifié de Dulbecco), le milieu MTsR1 ou le milieu Essentiel 8 E8, d’une combinaison d’acides aminés et/ou de vitamines telle que le mélange PolypLAb mix, le mélange aquaforest AMinoMix, la taurine, le folate ou le mélange prodibio coral vits, de poissons ou d’invertébrés mixés tels que les crevettes mixées ou d’autres éléments nutritifs tels qu’un mélange de planctons marins, notamment celui connu sous la dénomination polyplab reef roids, ou le mélange connu sous la dénomination Aquaforest Ips food.
Le cœur du microcompartiment peut comprendre en outre des éléments fonctionnels supplémentaires tels que des molécules intégrées pour un gain de fonction. Parmi les éléments fonctionnels supplémentaires pouvant être compris dans le cœur du microcompartiment, on peut citer notamment du carbonate de calcium, un élément plus dense que l’eau de mer, un anti-appétant pour poissons, une molécule fixant l’oxygène, une molécule bio-luminescente, un colorant, un anti-bactérien, un anti-fongique, un anti-parasitaire et/ou une alginate liase. Les éléments fonctionnels supplémentaires peuvent être présents dans le cœur du microcompartiment, mais ils sont de préférence compris dans la couche externe en hydrogel comme détaillé ci-avant.
Le cœur du microcompartiment peut comprendre en outre des éléments d’une matrice provenant d’une source autre qu’un cnidaire, par exemple le mélange de protéines gélatineuses dit Matrigel®, de la nanocellulose, de l’agarose ou de l’hydrogel Mebiol®, et/ou des gouttelettes lipidiques.
Le cœur du microcompartiment peut comprendre, à sa périphérie, éventuellement en contact avec la face interne de la couche d’hydrogel, une couche de matrice adaptée aux cellules de cnidaires. Cette couche peut comprendre au moins un composant de matrice extracellulaire tel que défini ci-après.
De préférence, le cœur du microcompartiment comprend une lumière, ou espace creux exempt de cellules de cnidaires, en son centre. La lumière peut être générée, au moment de la formation du microcompartiment, par les cellules qui se multiplient et se développent sur la couche de matrice adaptée aux cellules de cnidaires. Avantageusement, la lumière contient un liquide et plus particulièrement du milieu de culture notamment adapté aux cellules de cnidaires.
Dans un mode de réalisation, le cœur comprend une suspension de cellules et/ou tissus de cnidaires dans un milieu liquide tel qu’un milieu de culture adapté à la culture des cellules et/ou tissus de cnidaires. Les cellules et/ou tissus de cnidaires peuvent éventuellement être sous forme de structures plus ou moins organisées.
Le cœur peut également comprendre au moins un composant de matrice extracellulaire, au moins un organisme pouvant vivre en symbiose avec le cnidaire, et/ou au moins un facteur de croissance.
Par composant de matrice extracellulaire, on désigne des protéines ou des composés extracellulaires nécessaires à la culture cellulaire, ou un mélange de tels composés. De préférence, le composant de matrice extracellulaire est adapté aux cellules de cnidaires présentes dans le microcompartiment. On peut citer par exemple la mésoglée, notamment la mésoglée de méduse, le collagène de méduse commercialisé par la société Jellagen, le mélange de protéines gélatineuses dit Matrigel®, la nanocellulose, l’hydrogel Mebiol®, un hydrogel tel que l’alginate ou l’agarose éventuellement fonctionnalisé avec au moins un peptide RGD.
Parmi les organismes pouvant vivre en symbiose avec le cnidaire, on peut citer notamment les zooxanthelles, les bactéries et les algues. La co-encapsulation de coraux avec des zooxanthelles ou bactéries sélectionnées peut permettre d’orienter l’intégration de ces organismes dans une combinaison corail/symbiote. Ainsi, elle peut notamment permettre d’augmenter la résistance de la lignée corallienne à des modifications environnementales telles que l’augmentation de la température de l’eau de mer ou son acidification.
Le cœur peut comprendre en outre des fragments d’acides nucléiques, ADN et/ou ARN notamment, destinés par exemple à modifier génétiquement tout ou partie des organismes pouvant vivre en symbiose avec le cnidaire co-encapsulés.
De préférence, le cœur ne comprend pas d’hydrogel tel que celui compris dans la couche externe du microcompartiment. Ainsi, de préférence le cœur ne comprend pas, ou ne comprend substantiellement pas, d’alginate, en particulier dans le cas où la couche externe comprend de l’alginate ou est constituée d’alginate. Les termes « ne comprend substantiellement pas d’alginate » n’excluent pas la présence d’alginate à faible concentration dans le cœur, mais en tout état de cause l’alginate n’est pas présent en quantité suffisante pour former un hydrogel.
La figure 1 présente un schéma d’un microcompartiment selon un mode de réalisation de l’invention. Le microcompartiment comprend, situées de façon concentrique et en commençant de l’extérieur, une couche externe 1 d’hydrogel d’alginate, un cœur interne comprenant une lumière 2 et des cellules de cnidaires 3. La lumière 2 comprend du milieu de culture adapté aux cellules de cnidaires tel que de l’eau de mer, éventuellement associé à des éléments de matrice et/ou des éléments nutritifs. Les cellules de cnidaires 3 peuvent être isolées ou organisées en agrégats tels que des sphéroïdes.
Procédé de préparation des
microcompartiments
L’invention concerne également un procédé de préparation d’un microcompartiment comprenant une couche externe au moins partielle en hydrogel, et un cœur au moins partiellement liquide comprenant au moins une cellule de cnidaire.
Le procédé de préparation d’un microcompartiment selon l’invention comprend les étapes consistant à :
(a) fournir au moins une cellule de cnidaire,
et
(b) encapsuler la au moins une cellule de cnidaire fournie à l’étape (a) dans une couche d’hydrogel pour obtenir un microcompartiment.
(a) fournir au moins une cellule de cnidaire,
et
(b) encapsuler la au moins une cellule de cnidaire fournie à l’étape (a) dans une couche d’hydrogel pour obtenir un microcompartiment.
L’étape (a) peut être mise en œuvre par toute technique adaptée. Par exemple, la au moins une cellule de cnidaire fournie à l’étape (a) peut être obtenue par prélèvement, notamment découpe, à partir d’un corail en milieu naturel, ou par décapsulation d’un microcompartiment selon l’invention ou obtenu par un procédé de préparation selon l’invention, et éventuellement dissociation au moins partielle des cellules et/ou tissus issus de la décapsulation. Le prélèvement peut être effectué par toute technique adaptée connue dans l’art, par exemple par dissociation mécanique notamment à l’aide d’un scalpel. De préférence, le prélèvement est effectué sur une partie d’un corail vivant de sorte qu’il puisse se rétablir. Le prélèvement peut comprendre, en plus des cellules coralliennes, les zooxanthelles associées et/ou le microbiote corallien.
Le prélèvement peut être associé à une dissociation et/ou un détachement enzymatique et/ou chimique de tout ou partie des cellules coralliennes. Le détachement enzymatique peut être mis en œuvre à l’aide d’une enzyme TrypLE. Le détachement chimique peut être mis en œuvre à l’aide d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) ou d’un agent tel que le RelesR©commercialisé par la société StemCell.
Le prélèvement peut être associé à une dissociation mécanique par jet de liquide, par exemple de l’eau de mer ou de l’eau distillée, sous pression sur tout ou partie des tissus coralliens.
Les cellules de cnidaires prélevées sont récoltées dans un milieu, notamment un milieu liquide, adapté qui peut être par exemple de l’eau de mer, de l’eau de mer reconstituée, de l’eau distillée ou tout autre milieu de culture adapté. La récolte des cellules peut être facilitée par centrifugation du milieu liquide contenant les cellules avec un appareil de centrifugation adapté.
Une étape de dissociation fine en suspension des cellules peut être mise en œuvre, pour obtenir une suspension de cellules ou de petits agrégats de cellules. La dissociation peut être effectuée notamment par pipetages multiples ou par dissociation enzymatique.
Dans un mode de réalisation, le procédé de préparation d’un microcompartiment selon l’invention comprend en outre, de préférence entre l’étape (a) et l’étape (b), une étape (a1) de mélange de la au moins une cellule avec un milieu comprenant au moins un élément nutritif. Le procédé peut également comprendre une étape (a2) entre l’étape (a1) et l’étape (b) d’incubation du mélange cellule(s)/milieu comprenant au moins un élément nutritif dans un milieu de culture adapté. Dans ce mode de réalisation, l’étape (b) consiste à encapsuler le mélange cellule(s)/milieu comprenant au moins un élément nutritif obtenu à l’étape (a1) ou à l’étape (a2) dans une couche d’hydrogel pour obtenir un microcompartiment.
Le milieu de culture adapté, qui peut être utilisé à l’étape (a2), peut être tout milieu de culture adapté aux cellules de cnidaires et connu de l’homme du métier. Par exemple, il peut s’agir d’un milieu de culture tel que décrit dans le brevet français FR 2 684 686.
Les étapes (a1) et (a2) sont des étapes classiques dans le domaine qui peuvent être indépendamment mises en œuvre sans difficulté par l’homme du métier qui saura ajuster les paramètres nécessaires. Préférentiellement, l'incubation de l'étape (a2) est conduite pendant un temps compris entre quelques minutes et quelques heures, préférentiellement entre 2 minutes et 2 heures, plus préférentiellement entre 10 minutes et 1 heure.
L’étape (b) peut être mise en œuvre par toute technique adaptée connue dans le domaine. Dans un mode de réalisation, l’étape (b) est mise en œuvre par l’utilisation d’un dispositif microfluidique impliquant deux jets co-axiaux imbriqués. Classiquement, le jet interne comprend la ou les cellules de cnidaire et, le cas échéant, le milieu comprenant au moins un élément nutritif éventuellement associé à au moins un élément de matrice, et le jet externe comprend l’hydrogel et les éventuels éléments fonctionnels supplémentaires. Cette technique permet de former un jet qui se fractionne en gouttes dont la couche extérieure est la solution d'hydrogel et le cœur la solution de cellules. Le dispositif microfluidique, ou injecteur coaxial, peut être formé d’une aiguille centrale de petite taille, alignée au centre d’une aiguille plus large.
Les vitesses d’injection peuvent être choisies par l’homme de l’art d’après ses connaissances dans une large mesure, d’après la nature des solutions injectées et la taille du dispositif notamment. Par exemple, la vitesse d’injection de la solution comprenant les cellules coralliennes peut être comprise entre 10 mL/heure et 500 mL/min, notamment être égale à environ 30 mL/heure. Dans certains modes de réalisation, la vitesse d’injection de la solution peut être comprise entre 50 et 100 mL/min, notamment être égale à environ 60 mL/min. La vitesse d’injection de la solution d’hydrogel peut être comprise entre 10 mL/heure et 200 mL/min, notamment entre 100 et 200 mL/min, en particulier elle peut être égale à environ 150 mL/min.
Alternativement, l’étape (b) peut être mise en œuvre en utilisant d’autres techniques, telle que la formation en micropuits ou l’utilisation d’un dispositif microfluidique imprimé en 3D.
L’étape (b) peut comprendre, après la co-injection, une étape de mise en contact des gouttes obtenues avec une solution de réticulation. Ainsi, dans le cas où l’hydrogel est de l’alginate, les gouttes peuvent être collectées dans un bain de calcium, par exemple à 100mM, qui rigidifie la solution d'alginate pour former la couche externe.
Après l’étape (b), le procédé peut comprendre une étape (c) de récupération des microcompartiments, par exemple à l’aide d’un tamis dont la maille est inférieure à la dimension caractéristique d’au moins certains des microcompartiments formés.
Les microcompartiments obtenus peuvent être ensuite mis en culture dans un milieu adapté, notamment dans l’eau de mer. De préférence, les conditions de culture des microcompartiments reproduisent les conditions de vie des coraux dans leur environnement naturel. En particulier, les paramètres d’éclairage, de milieu de culture et/ou de température sont adaptés à la culture des coraux.
Procédé de culture
in vitro
La culture des microcompartiments selon l’invention permet le développement de petites fractions tissulaires cnidaires, dites polypes, grâce notamment aux propriétés régénératives des cnidaires.
Un objet de l’invention est un procédé de culturein vitrode cellules et/ou tissus de cnidaire, comprenant la culture dans un milieu adapté d’au moins un microcompartiment selon l’invention, ou obtenu par un procédé de préparation selon l’invention.
Les conditions de culture des microcompartiments sont telles que décrites ci-avant.
Le microcompartiment selon l’invention ou obtenu par un procédé de préparation selon l’invention représente en effet un microenvironnement favorable au développement des cellules et/ou tissus de cnidaire de par sa structure close, la présence éventuelle des éléments nutritifs nécessaires, et la protection offerte par la couche externe d’hydrogel.
Dans un mode de réalisation, le procédé de culturein vitroselon l’invention est mis en œuvre au sein d’un bioréacteur. En effet, la protection offerte par la couche externe en hydrogel permet aux cellules et tissus cnidaires compris dans les microcompartiments de moins pâtir des conditions de masse, de densité et des éventuelles sollicitations mécaniques inhérentes à la culture en bioréacteur. Par « bioréacteur », on entend dans la présente demande tout contenant permettant de retenir les microcompartiments en son intérieur et de maintenir des conditions de culture adaptées. A titre d’exemples, on peut citer un tube en plastique fermé au niveau de chacune de ses deux extrémités par un filtre ou un tamis et immergé en bonne place dans une colonne d’eau, un bioréacteur tel que ceux utilisés dans l’industrie pharmaceutique, sous réserve qu’il permette un éclairage adapté des microcompartiments, ou un aquarium d’eau de mer adapté à la coraliculture sous réserve qu’il permette de retenir les microcompartiments, par exemple par la mise en place de filtres en regard des points de circulation d’eau de mer.
L’invention concerne également un procédé de clonage haut débit de cnidaires, notamment de coraux, comprenant la culturein vitrodans un milieu adapté d’au moins 100, de préférence au moins 1000, microcompartiments selon l’invention, ou obtenus par un procédé de préparation selon l’invention. Avantageusement, le procédé de clonage haut débit de cnidaires, notamment de coraux, selon l’invention est mis en œuvre dans un bioréacteur.
Le procédé de culture et/ou de clonage selon l’invention peut comprendre en outre une étape de désencapsulation des cellules et/ou tissus produits à l’issue de la culture dans un milieu adapté d’au moins un microcompartiment selon l’invention, ou obtenu par un procédé de préparation selon l’invention.
L’étape de désencapsulation peut être suivie d’une étape de ré-encapsulation de tout ou partie des cellules et/ou tissus obtenus à l’issue de l’étape de désencapsulation, de préférence à une densité moindre, sous la forme de microcompartiments selon l’invention ou obtenus par un procédé de préparation selon l’invention.
Une étape de dissociation au moins partielle des cellules et/ou tissus obtenus à l’issue de l’étape de désencapsulation peut être mise en œuvre entre l’étape de désencapsulation et l’étape de ré-encapsulation des cellules et/ou tissus.
La ré-encapsulation est avantageusement suivie d’une étape de culture dans un milieu adapté du au moins un microcompartiment selon l’invention, ou obtenu par un procédé de préparation selon l’invention.
La ré-encaspulation des cellules et/ou tissus obtenus à l’issue de la première étape de culture permet de limiter le besoin de tissus et/ou cellules prélevés en milieu naturel.
Le procédé de culturein vitrode cellules et/ou tissus de cnidaires selon l’invention, notamment quand il est mis en œuvre dans un bioréacteur, permet l’amplificationin vitrode cellules de cnidaires et de leurs composants, notamment à des fins biomédicales. Par exemple, les cellules et/ou tissus de cnidaires obtenus par un procédé selon l’invention, en particulier après décapsulation d’au moins un microcompartiment selon l’invention, peuvent être utilisés pour du criblage biomédical.
Procédé de dispersion dans un milieu naturel
L’invention concerne également un procédé de dispersion de cellules et/ou tissus de cnidaire dans un milieu naturel, comprenant les étapes consistant à :
(a’) disperser dans ledit milieu naturel au moins un microcompartiment selon l’invention ou obtenu par un procédé de préparation selon l’invention, et
(b’) éliminer au moins partiellement la couche d’hydrogel du au moins un microcompartiment pour libérer tout ou partie des tissus et/ou cellules de cnidaires.
(a’) disperser dans ledit milieu naturel au moins un microcompartiment selon l’invention ou obtenu par un procédé de préparation selon l’invention, et
(b’) éliminer au moins partiellement la couche d’hydrogel du au moins un microcompartiment pour libérer tout ou partie des tissus et/ou cellules de cnidaires.
L’étape (b’) d’élimination au moins partielle de la couche d’hydrogel peut être mise en œuvre avant l’étape (a’) de dispersion dans le milieu naturel, après l’étape (a’) de dispersion dans le milieu naturel, et/ou pendant tout ou partie de l’étape (a’) de dispersion dans le milieu naturel.
Ainsi, l’élimination au moins partielle de la couche d’hydrogel peut être réalisée par exemple mécaniquement, par création ou amorçage d’une brèche dans la couche d’hydrogel, ou chimiquement par action d’une enzyme capable de détruire l’hydrogel. A ce titre on peut citer l’alginate liase, qui peut notamment être contenue à faible concentration ou en combinaison avec un agent retardant son action dans la couche externe du microcompartiment.
Les cellules et/ou tissus de cnidaires (polypes) qui sont obtenus par décapsulation d’au moins un microcompartiment selon l’invention ou obtenu par un procédé de préparation selon l’invention peuvent être utilisés comme des organismes modèles notamment dans le cadre d’études en écotoxicologie (études environnementales) et/ou en biologie du développement.
Dans la présente description, les intervalles s’entendent bornes incluses, sauf précision contraire.
Le présent exemple concerne un protocole d’encapsulation de cellules de cnidaires selon l’invention.
Matériel et méthodes
La solution d’alginate est préparée par dissolution de 1.5 g d’alginate dans 75 mL d’eau distillée. Le bain de calcium est préparé par dissolution de 21.9 g de calcium dans 1L d’eau distillée. Le corail utilisé est du corail Fungia vivant.
Prélèvement
Des cellules de corail ont été prélevées sur un corail du genre Fungia vivant par dissociation mécanique au scalpel. De préférence, les prélèvements ont été effectués sur une partie du corail vivant pour lui permettre de se rétablir après le prélèvement. Le prélèvement incluait de préférence des cellules de lignées ectodermique (tentacule ou équivalent) et endodermique (bouche). Les prélèvements comprenaient des cellules coralliennes, leurs zooxanthelles associées, ainsi que le microbiote corallien.
Chaque prélèvement a été éventuellement associé à une dissociation et/ou un détachement enzymatique avec du TrypLE et/ou chimique avec de l’EDTA ou du RelesR. Chaque prélèvement a été éventuellement associé à une dissociation mécanique par jet de liquide (eau de mer ou eau distillée) sous pression sur les tissus coralliens.
Préparation des cellules
Les cellules ont été récoltées dans de l’eau de mer, de l’eau distillée ou un milieu de culture adapté et chargées dans une seringue. La récolte des cellules a été éventuellement facilitée par centrifugation du liquide comprenant les cellules. Une étape de dissociation fine en suspension de cellule a pu être réalisée à ce moment pour obtenir une suspension de cellules ou de petits agrégats de cellules (dissociation mécanique par pipetage multiple ou dissociation enzymatique). Des éléments de matrice, des éléments nutritifs ou d’autres éléments utiles ont pu être mélangés à la suspension de cellules à ce moment. Il s’agit de co-encapsulation.
Encapsulation
Les cellules coralliennes éventuellement associées aux autres éléments ont été injectées au centre d’un jet d’alginate à l’aide d’un dispositif microfluidique / injecteur coaxial, formant des gouttes composées d’une couche externe d’alginate liquide non réticulé, et d’un centre liquide comportant les éléments coralliens. Les gouttes sont ensuite entrées en contact avec un bain de calcium placé en dessous de l’injecteur provoquant la réticulation de l’alginate.
Les vitesses utilisées sont les suivantes : 60 mL/min pour le corail, et 150 mL/min pour l’alginate.
Culture
Les capsules ainsi réticulées dans le bain de calcium ont été collectées à l’aide d’un tamis et transférées dans de l'eau de mer pour culture. Les conditions de cultures des capsules reproduisent les conditions de vie des coraux dans leur environnement naturel. L’éclairage utilisé est un éclairage aquatique de marque Tunze. L’eau de mer est reconstituée en utilisant le sel de marque coral salt pro red sea. La culture est réalisée dans un pot en verre, à une température de 24°C.
Résultats
Juste après encapsulation, des éléments coralliens ont été observés à l’intérieur des capsules fermées. Les cellules de corail sont soit dissociées, soit regroupées de façon non homogène. A partir de 24h de culture, des sphéroïdes coralliens, bourgeons coralliens sphériques très motiles, ont été observés. Les sphéroïdes coralliens observés étaient fluorescents, d’une part grâce à la fluorescence spontanée des cellules coralliennes, et d’autre part grâce à la fluorescence de zooxanthelles présents dans le sphéroïde. Les sphéroïdes coralliens survivent au moins 5 jours et conservent leur motilité. Les figures 2 et 3 présentent des images de microscopie des sphéroïdes et des éléments coralliens obtenus après 5 jours de culture. La figure 2 est une image de microscopie d’une portion de microcompartiment cnidaire 5 jours après encapsulation. Un contenant sphérique externe en alginate, ainsi qu’un sphéroïde corallien auto-organisé à l’intérieur du microcompartiment peuvent être distingués après 5 jours de culture en eau de mer reconstituée. La figure 3 est une image de microscopie d’un sphéroïde corallien auto-organisé à l’intérieur d’un microcompartiment cnidaire après 5 jours de culture en eau de mer reconstituée.
Bien entendu, diverses autres modifications peuvent être apportées à l’invention dans le cadre des revendications annexées.
Claims (10)
- Microcompartiment comprenant :
- une couche externe (1) au moins partielle en hydrogel, et
- un cœur au moins partiellement liquide comprenant au moins une cellule de cnidaire (3). - Microcompartiment selon la revendication 1, dans lequel le cœur comprend en outre au moins un composant de matrice extracellulaire, au moins un organisme pouvant vivre en symbiose avec le cnidaire, et/ou au moins un facteur de croissance.
- Microcompartiment selon la revendication 1 ou 2, dans lequel la cellule de cnidaire (3) est une cellule de corail, d’anémone de mer ou de méduse.
- Microcompartiment selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel la couche externe (1) en hydrogel est translucide.
- Microcompartiment selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel l’hydrogel est de l’alginate.
- Procédé de préparation d’un microcompartiment comprenant une couche externe (1) au moins partielle en hydrogel et un cœur au moins partiellement liquide comprenant au moins une cellule de cnidaire (3), comprenant les étapes consistant à :
(a) fournir au moins une cellule de cnidaire (3), et
(b) encapsuler la au moins une cellule fournie à l’étape (a) dans une couche d’hydrogel pour obtenir un microcompartiment. - Procédé de culture in vitro de cellules et/ou tissus de cnidaire, comprenant la culture dans un milieu adapté d’au moins un microcompartiment selon l’une quelconque des revendications 1 à 5 ou obtenu par un procédé de préparation selon la revendication 6.
- Procédé de culture in vitro de cellules et/ou tissus de cnidaire selon la revendication 7, comprenant en outre une étape de désencapsulation des cellules et/ou tissus produits à l’issue de la culture dans un milieu adapté d’au moins un microcompartiment selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, ou obtenu par un procédé de préparation selon la revendication 6, suivie d’une étape de ré-encapsulation de tout ou partie des cellules et/ou tissus obtenus à l’issue de l’étape de désencapsulation, de préférence à une densité moindre, sous la forme d’au moins un microcompartiment selon l’une quelconque des revendications 1 à 5 ou obtenu par un procédé de préparation selon la revendication 6.
- Procédé de clonage haut débit de cnidaires, comprenant la culture dans un milieu adapté d’au moins deux microcompartiments selon l’une quelconque des revendications 1 à 5 ou obtenus par un procédé de préparation selon la revendication 6.
- Procédé de dispersion de cellules et/ou de tissus de cnidaire dans un milieu naturel, comprenant les étapes consistant à :
(a’) disperser dans ledit milieu naturel au moins un microcompartiment selon l’une quelconque des revendications 1 à 5 ou obtenu par un procédé de préparation selon la revendication 6,
(b’) éliminer au moins partiellement la couche d’hydrogel du au moins un microcompartiment pour libérer tout ou partie des cellules et/ou tissus de cnidaire.
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