FR3100819A1 - Production et fonctionnalisation de nanoparticules dérivées du phage T5 et utilisations thérapeutiques - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne des capsides de phage T5 dépourvue d’ADN génomique dudit phage et exposant, à sa surface, au moins une protéine de fusion d’intérêt. L’invention concerne en particulier une capside de phage T5 dépourvue d’ADN génomique dudit phage et exposant, à sa surface, au moins une protéine de fusion, ladite protéine de fusion comprenant : - au moins un fragment de peptide ou de protéine ayant au moins 80% d’identité avec un fragment d’une protéine de décoration pb10 ; et - au moins un fragment fonctionnel d’un antigène, ou au moins un fragment fonctionnel d’une toxine, ou au moins un fragment de récepteur, ou au moins un fragment fonctionnel d’un signal d’adressage ou de ciblage ou de transport, ou au moins un fragment fonctionnel d’une enzyme, ou au moins un fragment fonctionnel d’une hormone, ou au moins un fragment fonctionnel d’un anticorps, ou au moins un antigène, ou au moins une toxine, ou au moins un récepteur, ou au moins un signal d’adressage ou de ciblage ou de transport, ou au moins une enzyme, ou au moins une hormone, ou au moins un anticorps, ou une combinaison quelconque de ceux-ci. La présente invention porte également sur les méthodes de production d’une telle capside et sur des vecteurs permettant leur production. L’invention concerne en outre les protéines de fusion d’intérêt exposées sur la capside et les acides nucléiques les codant. L’invention concerne également des nanoparticules comprenant ces capsides fonctionnalisées, des compositions pharmaceutiques comprenant ces nanoparticules et/ou ces capsides fonctionnalisées, ainsi que leurs utilisations thérapeutiques, notamment comme médicament et/ou comme vaccin.

Description

Titre

Production et fonctionnalisation de nanoparticules dérivées du phage T5 et utilisations thérapeutiques

Domaine de l’invention

La présente invention se situe dans le domaine de la virologie bactérienne, de la biochimie et de la virothérapie. Elle concerne des capsides de phage T5 dépourvue d’ADN génomique dudit phage et exposant, à sa surface, au moins une protéine de fusion d’intérêt, notamment d’intérêt thérapeutique. La présente invention porte également sur les méthodes de production d’une telle capside et sur des vecteurs permettant leur production. L’invention concerne en outre les protéines de fusion d’intérêt exposées sur la capside et les acides nucléiques les codant. L’invention concerne également des nanoparticules comprenant ces capsides fonctionnalisées, des compositions pharmaceutiques comprenant ces nanoparticules et/ou ces capsides fonctionnalisées, ainsi que leurs utilisations thérapeutiques, notamment comme médicament et/ou comme vaccin.

Etat de la Technique

Les phages (ou bactériophages) sont des virus bactériens, omniprésents dans l'ensemble de la biosphère. La plus grande famille des virus bactériens regroupe les bactériophages caudés, constitués d’une capside icosaédrique renfermant le génome viral qui est une molécule d’ADN double brin, et d’une queue permettant l’injection du génome dans la cellule hôte. Les capsides icosaédriques de ces virus sont des assemblages macromoléculaires extrêmement stables qui, souvent, exposent à leur surface des protéines dites « de décoration ». Ces protéines peuvent être modifiées génétiquement afin de produire des virus portant des protéines chimères, formées de la protéine native fusionnée à une protéine fonctionnelle d’intérêt thérapeutique ou biotechnologique (Tao et al. 2013 ; Razazan et al. 2018). La démarche développée jusqu’à présent pour obtenir des virus ou seulement leurs capsides décorées avec des protéines chimères, consiste à modifier la protéine de décoration dans le génome du virus puis à produire des particules virales à partir de l’infection de leurs bactéries hôtes. Toutefois, le génome viral est intégré dans les particules et capsides ainsi produites, limitant ainsi leurs applications thérapeutiques et biotechnologiques. En effet, les particules ainsi produites peuvent conserver un caractère infectieux, avec un risque de mutations génétiques non négligeable (pouvant notamment conduire à une réversion à une phénotype sauvage). Outre les risques sanitaires et thérapeutique, les mutations génétiques présentent un problème pour des productions homogènes à l’échelle industrielle.

Dans ce contexte, il apparait nécessaire de pouvoir s’affranchir de la présence de l’acide nucléique viral.

Toutefois, la possibilité de produire des capsides vides d’ADN, de les purifier et de les décorer « à façon » avec une protéine fonctionnalisée reste inexplorée. Or, de telles capsides présenteraient au minimum les avantages d’être sûres et sans risques sur le plan thérapeutique et sanitaire, tout en permettant une production à grande échelle (notamment à l’échelle industrielle). En effet, l’absence du génome viral permet l’élimination de tout risque de mutation ou de réversion à un phénotype sauvage et assure un niveau de reproductivité élevé et une prolifération in vivo entièrement maitrisée et contrôlée, le potentiel d’application biotechnologiques et thérapeutiques étant apporté par la fonctionnalisation à façon de ces particules et capsides. Il existe donc un fort besoin de développer des particules et capsides de phages qui soient à la fois fonctionnalisées et dépourvues d’acide nucléique génomique.

Le bactériophage T5, qui infecte la bactérie Escherichia coli, possède une capside de 90 nm de diamètre qui s’auto-assemble en passant par différents états structuraux dont la maturation suit une séquence d’étapes bien définie (fig1). Une procapside icosaédrique est initialement assemblée à partir de la protéine majeure de capside pb8 et de la protéine portale pb7. La procapside est maturée par la protéase pb11, pour obtenir une capside vide, prête à recevoir le génome viral. L’encapsidation de l’ADN est assurée par un moteur moléculaire et cette étape s’accompagne d’une réorganisation structurale des sous-unités de la protéine de capside, provoquant l’expansion de la capside. La protéine de décoration monomérique pb10 peut alors décorer la surface de la forme mature expansée ainsi obtenue, 120 copies pouvant ainsi être exposées.

Il a été montré qu’il est possible de produire et purifier des capsides vides non décorées, qui ne contiennent pas le génome viral (Preux et al 2013). L’expansion de ces capsides peut être provoquée in vitro. Les capsides non décorées ainsi obtenues ont alors la même géométrie que les capsides de la particule infectieuse (fig1B et article Preux et al 2013).

Il a été montré que la protéine de décoration pb10 se lie à la capside du phage T5 avec une haute affinité (mesurée par une constante de dissociation K_D= 10^-12M). La structure de la protéine de décoration pb10 a révélé une protéine formée de deux domaines indépendants, un domaine N-terminal de fixation à la capside et un domaine C-terminal externe exposé au solvant (fig1C, Vernhes et al 2017). Toutefois, l’affinité de protéines de décoration chimères, formées de la fusion la protéine de décoration à une protéine fonctionnelle d’intérêt thérapeutique ou biotechnologique, à la capside, n’a pas été étudiée. Ainsi, la possibilité de produire des capsides de T5 vides d’ADN génomique viral, exposant une protéine fonctionnalisée n’a à ce jour pas été explorée.

Il existe donc un fort besoin de développer des particules et capsides de phage T5 fonctionnalisées, ne présentant pas de risque d’infection ou de réversion, ainsi que des méthodes de production à grande échelle de telles particules et capsides, adaptées à des utilisations thérapeutiques et biotechnologiques.

La présente invention permet de répondre à ces besoins. Les présents Inventeurs ont conçu des protéines chimères inédites, constituées de la protéine pb10 entière fusionnée à une protéine d’intérêt ou seulement du domaine N-terminal de pb10 fusionné à une protéine qui remplace le domaine C-terminal. Ils ont notamment démontré pour la première fois que ces protéines modifiées, appelées protéines de fusion, peuvent être correctement exposées à la surface de capsides du phage T5 entièrement dépourvues d’ADN génomique, avec une grande efficacité. Les données montrent en particulier que, de manière tout à fait inattendue, l’affinité de ces protéines modifiées pour les capsides du phage T5 est identique à celle de la protéine pb10 native. La capside vide (dépourvue de génome) de T5 constitue donc une nanoparticule d’origine biologique, sûre, pouvant exposer à sa surface 120 copies d’une protéine dont la fonction peut varier avec la nature de la molécule d’intérêt qui est fusionnée à la protéine de décoration.

Les Inventeurs ont également montré, de manière tout à fait surprenante, qu’il est possible de produire ces capsides vides fonctionnalisées sans passer par la production d’un phage mutant. Ceci est d’autant plus avantageux et surprenant que le protocole de production de capsides dépourvues d’ADN imposait jusqu’à présent une étape d’infection d’une culture bactérienne par un phage mutant. Cependant, cette étape impose la production d’un stock important de phage, en amont de la production des capsides. De plus, lors de l’infection, on observe une forte fréquence de réversion du phage au génotype sauvage, ce qui diminue le rendement en capsides vides. Pour s’affranchir de ces contraintes et dans la perspective d’augmenter l’échelle de production des capsides, les Inventeurs ont développé un système de production et de décoration des capsides totalement indépendant du bactériophage T5. Ce système est basé sur la construction de plasmides recombinants portant les gènes codant uniquement pour les protéines de capside du bactériophage T5. Grâce à ce système, il est possible de produire soit directement des capsides vides décorées et fonctionnelles, soit des capsides vides non décorées, qui peuvent être décorées dans un second temps, par simple mise en contact avec la protéine de fusion d’intérêt. Les données montrent, de façon tout à fait inattendue, que l’expression de ces plasmides chez des bactéries conduit à l’assemblage de capsides dont la morphologie est similaire à celle des capsides produites par la méthode classique utilisant un phage complet (mutant ou non), et dont les propriétés de décoration sont comparables à celles des capsides produites à partir du phage complet. En effet, les données montrent que les propriétés d’autoassemblage des capsides à partir de l’expression ectopique des gènes de capsides, en dehors du cycle viral du phage T5, sont conservées. Ainsi, les Inventeurs ont développé une méthode de production simplifiée, à grande échelle, de capsides recombinantes, dépourvues d’ADN génomique, pouvant être décorées de deux façons différentes : i) par addition in vitro de la protéine de décoration purifiée ; ii) par co-production in situ de la protéine de décoration.

Les Inventeurs ont également validé, pour la première fois, le potentiel d’applications biotechnologiques (notamment thérapeutiques), des capsides vides de phages T5 ainsi fonctionnalisées. Ainsi, les données des Inventeurs montrent que, de manière tout à fait surprenante, l’administration de ces capsides fonctionnalisées par un antigène chez des souris modèles, induit une immunisation efficace, avec l’induction significative d’une réponse par anticorps et d’une réponse cellulaire. Cette immunisation résulte en une vaccination efficace de ces souris. Ces résultats inattendus démontrent ainsi que la protéine de fusion, exposée par ces capsides, conserve l’ensemble de ses propriétés et fonctionnalités. Au regard des données obtenues par les inventeurs et présentées en substance dans la partie exemples qui suivent, il apparait que la présente invention a autant d’applications biotechnologiques et thérapeutiques que de protéines de fusion différentes susceptibles d’être construites.

Dans le cadre de la présente invention, les Inventeurs ont mis au point, de manière tout à fait surprenante, des capsides de phage T5 vides, dépourvues d’ADN génomique de phage, exposant à leur surface des protéines de fusion d’intérêt. Ces capsides fonctionnalisées peuvent être produites à grande échelle, en s’affranchissant du cycle viral du phage T5, avec une grande reproductibilité. En outre, ces capsides fonctionnalisées sont capables d’exercer,in vivo, les fonctions et activités de la protéine de fusion d’intérêt utilisée.

La présente invention concerne donc une capside de phage T5 dépourvue d’ADN génomique dudit phage et exposant, à sa surface, au moins une protéine de fusion, comprenant au moins un fragment de peptide ou de protéine ayant au moins 80% d’identité avec un fragment d’une protéine de décoration pb10, ainsi que ces méthodes de production. L’invention concerne notamment une méthode de production d’une telle capside, comprenant l’obtention d’un vecteur codant des protéines de la capside du phage T5, ainsi que ledit vecteur.

La présente invention concerne également les protéines de fusion d’intérêt exposées sur la capside et les acides nucléiques les codant. L’invention concerne en outre des nanoparticules comprenant ces capsides fonctionnalisées, des compositions pharmaceutiques comprenant ces nanoparticules et/ou ces capsides fonctionnalisées, ainsi que leurs utilisations thérapeutiques, notamment comme médicament et/ou comme vaccin.

Description des figures

La Figure 1 montre le cycle de maturation de la capside du phage T5. A) Image de microscopie électronique en coloration négative du bactériophage T5 et reconstruction de la capside du bactériophage T5 à partir de données de cryo-microscopie électronique. La protéine de décoration pb10 est colorée en rouge (120 copies fixées à la surface de la capside). B) Schéma du mécanisme d’assemblage de la capside du bactériophage T5. Le précurseur de la protéine majeure de capside, pb8p, consiste en un domaine d’échafaudage appelé domaine-Δ (résidus 1 à 159, représenté par un triangle gris) et un domaine structural mature, pb8m (résidus 160 à 458, représenté par un rectangle violet). pb8p s’auto-assemble en une procaside icosaédrique appelée prohead I qui inclut le complexe dodécamérique de la protéine portale (pb7). La protéase (pb11) effectue le clivage du domaine-Δ des sous-unités de pb8p mais aussi des 10 acides aminés N-terminaux de la portale et elle s’auto-protéolyse à ses deux extrémités pour former la prohead II. L’encapsidation du génome par la terminase à travers le complexe portal induit l’expansion de la capside et la fixation de la protéine de décoration (pb10) à la surface de la capside. La capside est finalement fermée par une protéine « bouchon » p144 qui forme avec la portale un connecteur permettant la fixation de la queue du phage qui est assemblée par séparément. C) L’infection des bactéries par un phage T5 muté dans le gène de la terminase est incapable d’encapsider l’ADN et conduit à l’accumulation des formes prohead I, qui peuvent être purifiées et expansées in vitro, puis décorées par la protéine de décoration pb10.

La Figure 2 montre l’analyse de la pureté des protéines chimères PO et PNO par SDS-PAGE - Fractions éluées après chromatographie d’exclusion par la taille sur colonne Superdex75 HR10/300 (GE Healthcare).

La Figure 3 montre les essais de décoration de capsides vides pures avec les protéines pb10, PO et PNO. Les concentrations respectives des différentes protéines de décoration et des capsides ont été ajustées pour avoir des rapports de concentration [protéine]/[sites de fixation sur la capside] = 1 +/- 0,1.

La Figure 4 montre : A. Profils d’association et de dissociation des protéines pb10, PO et PNO (resonance units, RU en fonction du temps) mesurés pour des concentrations croissantes de protéines (0, 312 ; 0,625 ; 1,25 ; 2,5). B. Les constantes d’affinité KD sont calculées à partir des constantes cinétiques ka et kd pour chacune des protéines pb10, PO et PNO.

La Figure 5 montre les profils SPR de fixation des protéines pb10 H6, pb10-mCHERRYH6 et N-Ter pb10-mCHERRYH6 sur des capsides vides du phage T5 et calcul des constantes d’affinité.

La Figure 6 montre une représentation schématique du vecteur pETcapT5 (de SEQ ID 12).

La Figure 7 montre une représentation schématique du vecteur pETcapT5∆dec (de SEQ ID 13).

La Figure 8 montre: A) Analyse par cryo-microscopie électronique des capsides produites à partir des plasmides recombinants et purifiées. De gauche à droite: capsides témoins produites à partir du phage T5 muté dans le gène de la terminase, capsides produites à partir des plasmides pETcapT5Δpb10 et pETcapT5 . B) Analyse sur gel d’agarose natif de la décoration des capsides avec la protéine pb10 (protocole décrit dans Vernhes et al.). Les capsides ont été incubées avec la protéine pb10 aux différents ratios [nombre de copies de pb10]/[nombre de site de fixation de pb10] (1/1, 2/1, ou 4/1). La saturation des capsides en pb10 est obtenue pour les ratios 1/1 et 2/1 respectivement pour les capsides « natives » produites à du phage mutant et pour les capsides assemblées à partir du plasmide pETcapT5∆dec. Les capsides produites à partir du plasmide pETcapT5 migrent à la position des capsides saturées en pb10, indiquant qu’elles sont totalement décorées lors de leur assemblage dans les bactéries.

La Figure 9 montre les résultats de western blot montrant la présence de pb10 sur les capsides, révélée avec des anticorps polyclonaux dirigés contre pb10 . 1 : capsides purifiées obtenues à partir du plasmide pETcapT5Δdec ; 2 : capsides obtenues à partir du plasmide pETcapT5.

La Figure 10 montre la cinétique de la réponse anticorps anti-Ova induite par les protéines fusion pb10. Les souris ont été immunisées par voie sous-cutanée avec une dose de protéines fusion PO ou PNO seules ou associées avec des capsides purifiées de phages ou de l’adjuvant complet de Freund. Les anticorps anti-Ova totaux (IgG) ont été quantifies par ELISA à différents temps après administration. A-E Chaque courbe représente les résultats de souris individuelles (n = 6). F Cinétique de la réponse Ac pour chaque groupe (moyenne + écart-type).

La Figure11 montre la caractérisation de la nature des anticorps induits par les protéines pb10 fusion. Les souris ont été immunisées par voie sous-cutanée avec une dose de protéines fusion PO ou PNO seules ou associées avec des capsides purifiées de phages T5 ou de l’adjuvant complet de Freund. Les anticorps anti-Ova d’isotypes IgG1, IgG2b, IgG2c et IgG3 ont été quantifiés par ELISA au jour 42. Les données correspondent aux moyennes + écart-types SEM (n = 6). Test ANOVA suivi du test de Tukey : *, p < 0,005 ; **, p < 0,01 ; ***, p < 0,001 ; ns, différence non significative.

La Figure 12 montre l’analyse des réponses cellulaires induites par les protéines pb10 fusion avec l’Ova. Les souris ont été immunisées par voie sous-cutanée avec une dose de protéines fusion PO ou PNO seules ou associées avec des capsides purifiées de phages T5. Puis, elles ont reçu au jour 196 une seconde administration des mêmes préparations vaccinales. Après 10 jours, la réponse des splénocytes à une stimulation antigénique par le peptide Ova257-264 a été mesurée en quantifiant par ELISPOT le nombre de splénocytes producteur d’IFNγ. Les barres représentent les moyennes obtenues pour chaque groupe et les cercles les résultats individuels obtenus pour chaque souris (n = 6). Test ANOVA suivi du test de Tukey : **, p < 0,01 ; ***, p < 0,001 ; ns, différence non significative.

La Figure 13 montre l’analyse des réponses cellulaires induites par la protéine PNO.

Les souris ont été immunisées par voie sous-cutanée avec une dose de protéines fusion PO seule ou associée avec des capsides purifiées de phages T5 ou de l’adjuvant complet de Freund. Puis, elles ont reçu au jour 59 une seconde administration des mêmes préparations vaccinales. Après 10 jours, la réponse des splénocytes à une stimulation antigénique par le peptide Ova257-264 a été mesurée en quantifiant le nombre de splénocytes producteurs d’IFNγ (A) ou en mesurant le taux d’IFNγ dans les surnageants de culture des splénocytes (B). Les barres représentent les moyennes obtenues pour chaque groupe et les cercles les résultats individuels obtenus pour chaque souris (n = 5). Test ANOVA suivi du test de Tukey : **, p < 0,01 ; ***, p < 0,001 ; ns, différence non significative.

Description détaillée de l’invention

Définitions

Par « phage » ou « bactériophage » ou « virus bactérien » on entend un virus infectant des bactéries.

Les phages sont omniprésents dans l'ensemble de la biosphère.

Au début des années 2000, plus de 5000 bactériophages différents avaient été observés et décrits.

Les phages les plus anciennement décrits, ceux dont la structure a été la plus étudiée, sont en général constitués d'une coque protéinique ou capside (enveloppant et protégeant la molécule centrale d'acide nucléique), et d'un appareil spécialisé à structure complexe (la queue) par lequel le phage se fixe sur la bactérie hôte pour y injecter son acide nucléique (matériel génétique, ou génome).

Mais tous les bactériophages ne répondent pas à ce modèle classique et on peut actuellement les réunir en quatre grands groupes morphologiques : les phages à ADN bicaténaire, avec queue (représentant plus de 95% des phages décrits) ; les phages sans queue, à symétrie cubique et à ADN monocaténaire ; les phages à ARN ; les phages filamenteux à ADN monocaténaire.

Des bactériophages isométriques (à ADN) contenant 12 à 14% de lipides sous forme d'une double couche située entre les coques externe et interne de la capside virale (phage PM2) ont également été décrits.

Les dimensions des phages varient de 24 à 200 nm.

Lorsque le matériel génétique est une molécule d'ADN double-brin (c’est le cas pour plus de 95 % des phages connus), la longueur de cette dernière peut varier de 5 à 650 kpb (kilobases).

Ainsi, différents critères peuvent être appliqués pour classer les phages en différents morphotypes et les répartir au sein de familles.

Sont notamment pris en compte la forme et les dimensions de la tête, la structure de la queue, l'existence ou l'absence d'un manchon caudal contractile, la structure (rudimentaire ou complexe) de la plaque terminale, les dimensions globales du virion, la nature de l'acide nucléique (ADN bicaténaire, ADN monocaténaire, ARN), etc.

Par exemple, les phages possédant une queue sont classés dans la famille desCaudovirales(appelés aussi phage caudés ou virus caudés).

La morphologie de la queue permet de subdiviser cette large famille en 3 groupes :

-LesSiphoviridae, caractérisés par une longue queue non contractile, forment la plus grande famille (60 % des virus caudés ; exemple : phage T5) ;

-LesMyoviridaeont de longues queues contractiles, composées d'un tube extérieur qui se contracte autour du tube central rigide lorsque le virus se trouve à la surface de sa bactérie hôte.

Le tube rigide perfore alors la paroi bactérienne et crée un passage pour l'ADN phagique (exemple : phage T4) ;

-LesPodoviridaeont de petites queues non contractiles, ils intègrent dans leur capside des protéines qui servent à empaqueter l'ADN dans la capside lors de la formation du virion et qui sont éjectées dans la paroi de l'hôte avant l'éjection de l'ADN (exemples : phages T7 et P22).

Les phages nécessitent une bactérie hôte pour se reproduire, dans lesquelles ils injectent leur matériel génétique.

Une fois dans la bactérie hôte, le génome viral est en général répliqué et traduit, par les enzymes et les ribosomes de l'hôte (selon les cas certaines protéines virales peuvent également être impliquées), pour former de nombreuses copies du phage qui sont libérées avec la lyse de la bactérie-hôte : on parle de cycle lytique ou cycle de production.

Pour certains bactériophages, le matériel génétique est répliqué et s'intègre au chromosome de la bactérie (ou existe sous forme de plasmide), mais n'est pas exprimé pour former des virions.

Le virus est alors désigné sous le terme de prophage, lequel est transmis à la descendance de la bactérie infectée (lignée lysogénique) et on parle de lysogénie ou de cycle lysogénique.

En réponse à une induction (ex : stress de la bactérie), l'infection lysogénique bascule vers un cycle lytique.

Ainsi, les phages peuvent également être classé en fonction de leur cycle de réplication :

-les phages dits « phages virulents » : ils sont strictement lytiques ;

-les phages dits « phages tempérés », qui peuvent générer des infections lytiques ou des infections lysogéniques ;

-les phages à infection chronique, qui ne provoquent pas la lyse de la cellule infectée, mais bourgeonnent à la membrane bactérienne, sans la rompre (infection chronique).

C'est le cas des phages filamenteux comme M13 ou f1 d'Escherichia coli.

Les phages lytiques peuvent également être caractérisés par la présence de « plages de lyse ».

L'infection d'une cellule bactérienne par un seul phage peut provoquer sa lyse au bout d'une vingtaine de minutes avec libération de quelques dizaines voire centaines de particules phagiques.

En laboratoire, chaque particule ainsi libérée va infecter une nouvelle bactérie et recommencer le cycle lytique.

Conséquence de ces lyses microscopiques en cascade, des « plages de lyse » se forment dans le tapis bactérien à la surface des géloses, permettant la lecture à l'œil nu des résultats de test.

La taille et l'aspect de ces plages de lyse constituent un phénotype contribuant à caractériser les phages.

Par « phage T5 » on entend un virus caudé appartenant à la famille des Siphoviridae.

Il possède donc une queue longue non contractile.

C'est un phage strictement lytique qui infecte notamment la bactérieEscherichia coli.

Le phage T5 est constitué d’une capside icosaédrique de 90 nm de diamètre, contenant son génome (un ADN double brin de 121 000 paires de bases (121 kbp)), ainsi que d'une queue de 250 nm lui permettant de reconnaitre la bactérie cible et d'y injecter son génome.

L'extrémité de la queue se termine en forme de cône au bout duquel se trouve un récepteur à une protéine de la membrane externe de la bactérie (FhuA).

La queue est également équipée de trois fibres longues fixées à la base du cône qui interagissent avec la partie sucrée des lipopolysaccharides à la surface de la bactérie.

Le génome du bactériophage T5 peut être divisé en trois parties :

-une partie correspondant à environ 8 % du génome total, à l'extrémité injectée en premier.

Cette partie du génome code des protéines impliquées dans l’arrêt de la réplication/transcription/traduction bactérienne ainsi que la destruction de l’ADN de l'hôte, ainsi qu’une déoxyribonucléotidase;

-une partie correspondant à environ 8 à 67 % du génome code des gènes précoces (exprimés à la fin de l'injection de l'ADN viral).

Ces gènes codent des protéines impliquées dans la réplication de l’ADN, le métabolisme des nucléotides et des facteurs de lyse de la cellule ;

-de 67 à 90 % du génome, comprenant principalement les gènes tardifs (expression à partir de 12-13 minutes post-infection).

Ce sont principalement des gènes dits « structuraux », dont les protéines codées servent à l'assemblage de nouveaux virions.

La capside du bactériophage T5 s’auto-assemble en passant par différents états structuraux dont la maturation suit une séquence d’étapes bien définie (Figure 1).

Une procapside icosaédrique est initialement assemblée, constituée de 775 copies de la protéine majeure de capside pb8, organisées en 11 pentamères formant 11 des 12 sommets de la capside, et 120 hexamères formant les faces.

La protéine pb8 (51 kDa) est synthétisée sous la forme d’un précurseur incluant un domaine-∆, correspondant aux 159 acides aminés N-terminaux de la protéine, qui sert de domaine d’échafaudage lors de l’assemblage de la capside.

Le douzième sommet de la capside est formé par un dodécamère de la protéine portale pb7 (47 kDa), qui constitue un pore d’entrée pour l’ADN.

Cette procapside contient également la protéase pb11 qui assure le clivage des 775 copies du domaine-∆ de pb8, coupe les 10 résidus N-terminaux de la protéine portale et s’auto-protéolyse pour produire une capside vide, prête à recevoir le génome viral.

L’encapsidation de l’ADN est assurée par un moteur moléculaire et cette étape s’accompagne d’une réorganisation structurale des 775 sous-unités de la protéine de capside provoquant l’expansion de la capside.

La forme mature expansée présente au centre des hexamères les sites de fixation de la protéine monomérique pb10 (17,3 kDa) dont 120 copies viennent décorer la surface de l’icosaèdre.

Par « capside » ou « capside phagique » on entend la structure qui entoure le génome (l'acide nucléique, ADN ou ARN) d’un phage, sans la queue.

Elle est constituée de très nombreuses unités protéiques qui se regroupent pour former des ensembles structurels identiques appelés capsomères.

Le nucléocapside est l'ensemble formé de la capside du phage (présente chez les phages nus ou enveloppés, l'enveloppe ou péplos n'étant pas la capside, mais une enveloppe lipoprotéique entourant la capside) et du génome viral (ARN ou ADN).

Selon les rapports géométriques que les capsomères présentent entre eux et avec le génome qu'ils recouvrent et protègent, on peut définir trois classes de nucléocapsides :

-Les nucléocapsides à symétrie hélicoïdale;

-Les nucléocapsides icosaédriques, qui présentent tout ou partie des éléments de symétrie des icosaèdres et dont la structure est donc proche de celle des géodes;

-Les nucléocapsides à symétrie mixte, qui peuvent présenter une structure à symétrie hélicoïdale associée à une structure icosaédrique.

Par « capside vide » on entend une capside ne comprenant pas de génome phagique (dépourvue d’acide nucléique phagique).

Une capside vide est donc une capside n’ayant pas encapsidé (incorporé) le génome du phage.

Dans le cas du phage T5, par exemple, une capside vide est une capside dépourvue d’ADN génomique du phage T5.

De préférence, une capside vide d’un phage est une capside dépourvue de tout acide nucléique dudit phage.

De préférence encore, une capside vide est une capside dépourvue de tout acide nucléique (par exemple dépourvue d’acide nucléique provenant de phage, de la cellule hôte et de la cellule productrice, de préférence dépourvue d’acide nucléique contaminant).

Par « dépourvu d’acide nucléique » ou « ne comprenant pas d’acide nucléique », on entend une substance comprenant moins de 5%, de préférence moins de 4%, de préférence moins de 3%, de préférence moins de 2%, de préférence moins de 1%, de préférence moins de 0,5%, de préférence moins de 0,1%, de préférence moins de 0,01%, de préférence moins de 0,001%, de préférence moins de 0,0001%, de préférence moins de 0,00001%, d’acide nucléique (en poids).

Par « protéine de capside » ou « protéine de structure de capside » on entend une protéine impliquée dans la structure de la capside du phage.

Autrement dit, on entend par protéine de structure de capside un composant qui fait partie de la capside.

Dans le cas du phage T5, ces protéines comprennent notamment la protéine majeure de capside pb8, la protéine portale pb7, la protéase pb11 et la protéine de décoration pb10.

Par « protéine de décoration de capside du phage T5 » ou « protéine de décoration pb10 » ou « protéine pb 10 » ou « pb 10 », on entend une protéine monomérique du phage T5, se fixant sur la surface externe de la capside du phage T5, de préférence sur les hexamères formant les faces de la capside du phage T5, de préférence sur des sites de fixation présents sur les hexamères formant les faces de la capside du phage T5, de préférence encore sur des sites de fixation présents au centre des hexamères formant les faces de la capside du phage T5.

La protéine de décoration pb10 comprend deux domaines indépendants, un domaine N-terminal de fixation à la capside et un domaine C-terminal externe exposé, c’est-à-dire montré au niveau de la partie extérieure de la capside.

Les termes « protéine de décoration de capside du phage T5 », « protéine de décoration pb10 », « protéine pb10 » et « pb10 », sont ici utilisés de manière interchangeable.

Par « capside décorée » on entend une capside comprenant au moins une protéine de décoration et/ou au moins une protéine de fusion exposée à sa surface.

Typiquement, la protéine de décoration est exposée sur au moins une des faces composant la capside.

Par « forme mature expansée d’une capside » ou « forme expansée » on entend une capside de bactériophage T5 de diamètre mesuré par cryo microscopie électronique de 90nm +/- 2nm comme décrit dans référence Preux et al.,2013 (DOI: 10.1016/j.jmb.2013.03.002), capable de fixer 120 copies de la protéine de décoration pb10, propriété qui est évaluée par des expériences de retard sur gel d’agarose natif montrant une diminution de la mobilité électrophorétique des capsides pour un ratio [nombre de copies de pb10]/[nombre de site de fixation de pb10] = 1 +/-0,1 comme décrit dans la référence Vernhes et al., 2017 (DOI: 10.1038/srep41662) et dans la figure 3.

Par «molécule d’acides nucléiques» ou par « acide nucléique », on entend un polymère de n'importe quelle longueur d’acide désoxyribonucléique (ADN), ou polydésoxyribonucléotides, incluant notamment les ADN complémentaires ou ADNc, les ADN génomiques, les plasmides, les vecteurs, les génomes viraux, l'ADN isolé, les sondes, les amorces et tout mélange de ceux-ci ; ou un polymère de n'importe quelle longueur d’acide ribonucléique (ARN), ou polyribonucléotides, incluant notamment les ARN messagers ou ARNm, ARN antisens ; ou des polyribo-polydésoxyribonucléotides mélangés.

Ils englobent des polynucléotides simples ou à double brins, linéaires ou circulaires, naturels ou synthétiques.

En outre, un polynucléotide peut comprendre des nucléotides non naturels et peut être interrompu par des composants non nucléotidiques.

Dans le cadre de la présente invention, les termes "acide nucléique", "molécule d'acides nucléiques", "polynucléotide" et "séquence nucléotidique" sont utilisés de manière interchangeable.

Par « génome » on entend l'ensemble du matériel génétique d'une espèce codé dans son acide désoxyribonucléique (ADN) ou son acide ribonucléique (ARN).

L’ADN ou l’ARN contient en particulier tous les gènes codant des protéines ou correspondant à des ARN structurés.

Il se décompose donc en séquences codantes (transcrites en ARN messagers et traduites en protéines) et non codantes (non transcrites, ou transcrites en ARN, mais non traduites).

Par « ADN génomique » on entend donc le génome qui se présente sous la forme d’un ADN.

Par « ADN génomique de phage » on entend l'ensemble du matériel génétique d’un phage, qui se présente sous la forme d’un ADN.

Par « capside dépourvu e d’ADN génomique de phage » on entend une capside qui comprend moins de 5% d’ADN génomique de phage (d’ADN génomique entier ou de fragments), de préférence moins de 4%, de préférence moins de 3%, de préférence moins de 2%, de préférence moins de 1%, de préférence moins de 0,5%, de préférence moins de 0,4%, de préférence moins de 0,3%, de préférence moins de 0,2%, de préférence moins de 0,1%, de préférence moins de 0,01%, de préférence moins de 0,01%, de préférence moins de 0,001%, de préférence moins de 0,0001%, en masse molaire.

Avantageusement, la capside dépourvue d’ADN génomique de phage ne comprend aucune trace d’ADN génomique de phage : autrement dit, la capside est pure d’ADN génomique de phage.

Avantageusement encore, la capside dépourvue d’ADN génomique de phage ne comprend aucun acide nucléique de phage : autrement dit, la capside est pure d’acide nucléique de phage.

Selon un mode de réalisation avantageux, la capside dépourvue d’ADN génomique de phage ne comprend pas d’ADN génomique de bactérie et/ou ne comprend pas d’ADN plasmidique de bactérie, ou ne comprend aucun ADN, ou ne comprend aucun acide nucléique.

Avantageusement, la capside dépourvue d’ADN génomique de phage comprend moins de 5% d’ADN provenant de bactérie (ADN génomique entier ou fragments, plasmides), de préférence moins de 4%, de préférence moins de 3%, de préférence moins de 2%, de préférence moins de 1%, de préférence moins de 0,5%, de préférence moins de 0,4%, de préférence moins de 0,3%, de préférence moins de 0,2%, de préférence moins de 0,1%, de préférence moins de 0,01%, de préférence moins de 0,01%, de préférence moins de 0,001%, de préférence moins de 0,0001%, en masse molaire.

Par «molécule isolée», on entend une molécule, notamment une protéine, un polypeptide, un peptide, une molécule d’acides nucléiques, un vecteur plasmidique, un vecteur viral ou une cellule hôte, qui est extrait de son environnement naturel (c'est-à-dire séparé d'au moins un autre composant auquel il est naturellement associé).

Par « polypeptide », “protéine” et “peptide”, on entend des polymères de résidus d'acides aminés qui comprennent au moins neuf acides aminés liés par des liaisons peptidiques.

Le polymère peut être linéaire, ramifié ou cyclique.

Le polymère peut comprendre des acides aminés naturels et/ou analogues d’acides aminés et il peut être interrompu par des résidus non-acides aminés.

Comme indication générale et sans y être cependant lié dans la présente demande, si le polymère d'acides aminés contient plus de 50 résidus d'acides aminés, il est de préférence appelé un polypeptide ou une protéine, alors que si le polymère est constitué de 50 acides aminés ou moins, il est de préférence appelé "peptide".

Par « vecteur », on entend un véhicule, de préférence une molécule d'acide nucléique ou une particule virale, qui contient les éléments nécessaires pour permettre l'administration, la propagation et/ou l'expression d'une ou plusieurs molécule(s) d'acides nucléiques dans une cellule hôte ou un organisme.

D’un point de vue fonctionnel, ce terme englobe des vecteurs pour la maintenance (vecteurs de clonage), des vecteurs pour l'expression dans diverses cellules ou organismes hôtes (vecteurs d'expression), des vecteurs extrachromosomiques (par exemple des plasmides multicopie) ou des vecteurs d'intégration (par exemple conçus pour s'intégrer dans le génome d’une cellule hôte et produire des copies supplémentaires de la molécule d'acides nucléiques qu’il contient lorsque la cellule hôte se réplique).

Ce terme englobe également des vecteurs navettes (par exemple, fonctionnant à la fois dans des hôtes procaryotes et/ou eucaryotes) et des vecteurs de transfert (par exemple pour le transfert de molécule(s) d'acides nucléiques dans le génome d’une cellule hôte).

D’un point de vue structurel, les vecteurs peuvent être des sources génétiques naturelles, synthétiques ou artificielles, ou une combinaison d'éléments génétiques naturels et artificiels.

Ainsi, dans le contexte de l'invention, le terme "vecteur" doit être compris de manière large en incluant des vecteurs plasmidiques (ou plasmides) et viraux.

Un "plasmide" tel qu'utilisé ici désigne une construction d'ADN réplicable.

Habituellement, les vecteurs plasmidiques contiennent des gènes marqueurs de sélection qui permettent aux cellules hôtes portant le plasmide d'être identifiées et/ou sélectionnées de manière positive ou négative en présence du composé correspondant au marqueur de sélection.

Une variété de gènes marqueurs de sélection positifs et négatifs sont connus dans la technique.

À titre d'illustration, un gène de résistance aux antibiotiques peut être utilisé comme un gène marqueur de sélection positif permettant de sélectionner une cellule hôte en présence de l'antibiotique correspondant.

Le terme "vecteur viral" tel qu'utilisé ici se réfère à un vecteur d'acide nucléique qui comprend au moins un élément d'un génome du virus et peut être conditionné dans une particule virale ou une particule virale.

Les vecteurs viraux peuvent être compétents pour la réplication ou sélectifs (par exemple, conçus pour se répliquer mieux ou sélectivement dans des cellules hôtes spécifiques), ou peuvent être génétiquement désactivés de manière à être défectueux ou déficients en réplication.

Par « cellule hôte », on entend une cellule contenant au moins une capside selon l’invention, ou au moins une capside susceptible d’être obtenue par la méthode de production selon l’invention, ou au moins un vecteur selon l’invention, ou au moins une molécule d’acides nucléiques selon l’invention, ou un mélange quelconque de ceux-ci.

Avantageusement encore, la cellule hôte est capable d’exprimer les gènes codés par le vecteur selon l’invention et/ou de produire le vecteur de l'invention.

Avantageusement encore, la cellule hôte est capable d’être infectée par un phage (de préférence un phage T5) et/ou de produire un phage T5 et/ou de produire une capside (vide ou non ; décorée ou non) de phage T5.

Avantageusement encore, la cellule hôte est capable de produire une capside vide de phage T5, décorée par la protéine fusion selon l’invention.

Avantageusement encore, la cellule hôte est capable de produire une capside vide de phage T5, sous une forme mature expansée, de préférence décorée par la protéine fusion selon l’invention.

La cellule hôte peut être constituée d'un type unique de cellules ou d'un groupe de différents types de cellules.

La cellule hôte peut également être une cellule hybride, c’est-à-dire résultant de la fusion d’au moins deux cellules de types différent.

La cellule hôte peut appartenir à des lignées cellulaires cultivées, à des cellules primaires, à des cellules souches ou à des cellules prolifératives.

Le terme "cellules hôtes" comprend des cellules procaryotes, des cellules eucaryotes inférieures telles que des cellules de levures, et d'autres cellules eucaryotes telles que des cellules de champignons, des cellules d'insectes, des cellules de plantes, des cellules d’algues, des cellules de microalgues, des cellules de parasites, des cellules animales et des cellules de mammifères (par exemple humaines ou non humaines, de préférence non humaines).

La cellule hôte peut être une cellule différenciée, une cellule pluripotente, une cellule totipotente, une cellule souche, une cellules souche pluripotente induite (CSPi ou iPS en anglais), une cellule souche totipotente induite, ou encore une cellule embryonnaire ou une cellule souche embryonnaire.

Dans le cas d’une cellule souche pluripotente induite, ou d’une cellule souche totipotente induite, la cellule est de préférence une cellule non humaine.

Dans le cas d’une cellule souche, d’une cellule pluripotente, d’une cellule totipotente, d’une cellule embryonnaire ou d’une cellule souche embryonnaire, la cellule est une cellule non humaine.

Le terme « cellule hôte » comprend plus largement des cellules qui contiennent ou ont contenu la molécule d’acides nucléiques selon l’invention, ainsi que la descendance de telles cellules.

La cellule hôte peut par exemple être isolée ou organisée en tissu, en organe ou encore être au sein d’un organisme complet.

Dans le cas où la cellule hôte est au sein d’un organisme complet, ledit organisme n’est pas humain.

La cellule hôte est avantageusement une bactérie, de préférence une bactérie de la famille desEnterobacteriaceae, de préférence encore une bactérie du genreEscherichia, de préférence encore une bactérieEscherichia coli.

Par « identité » ou « identité de séquence », on entend une correspondance exacte de séquence entre deux polypeptides ou deux molécules d’acides aminés.

Les pourcentages d’identité auxquels il est fait référence dans le cadre de l’exposé de la présente invention sont déterminés après alignement optimal des séquences à comparer, qui peuvent donc comprendre une ou plusieurs additions, délétions, troncatures et/ou substitutions.

Ce pourcentage d’identité peut être calculé par toute méthode d’analyse de séquences bien connue de l’homme du métier.

Le pourcentage d’identité peut être déterminé après alignement global des séquences à comparer prises dans leur intégralité, sur toute leur longueur.

Outre manuellement, il est possible de déterminer l’alignement global de séquences au moyen de l’algorithme de Needleman et Wunsch (1970).

Pour les séquences nucléotidiques, la comparaison des séquences peut être effectuée à l’aide de tout logiciel bien connu de l’homme du métier, comme par exemple le logiciel Needle.

Les paramètres utilisés peuvent notamment être les suivants : « Gap Open » égal à 10,0, « Gap Extend » égal à 0,5 et la matrice EDNAFULL (Version EMBOSS du NCBI NUC4.4).

Pour les séquences d’acides aminés, la comparaison des séquences peut être effectuée à l’aide de tout logiciel bien connu de l’homme du métier, comme par exemple le logiciel Needle.

Les paramètres utilisés peuvent notamment être les suivants : « Gap Open » égal à 10,0, « Gap Extend » égal à 0,5 et la matrice BLOSUM62.

De préférence, le pourcentage d’identité défini dans le cadre de la présente invention est déterminé au moyen d’un alignement global des séquences à comparer sur toute leur longueur. À titre illustratif, "au moins 80% d'identité de séquence", tel qu'utilisé ici, représente 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% d'identité de séquence.

Par « protéine de fusion » ou « protéine fusion » on entend une protéine artificielle obtenue par la combinaison d’une protéine, ou d’une ou plusieurs parties d’une protéine, avec une ou plusieurs protéine(s) différente(s) (ou une ou plusieurs parties de protéines) ou avec une ou plusieurs molécule(s) non protéique(s) (ou une partie de molécule non protéique) ou une molécule mixte (c’est-à-dire une molécule comprenant une protéine (ou une partie d’une protéine) et une molécule non protéique (ou une partie de molécule non protéique) ; ou une partie de molécule mixte).

Par « molécule non protéique », on entend avantageusement un glucide, un sucre, un oside, un lipide, un acide nucléique, un neurotransmetteur, ou une combinaison quelconque de ceux-ci.

Par « molécule mixte », on entend toute protéine (ou partie de protéine) ayant subi une modification post-traductionnelle (par exemple une acétylation, une acylation, une biotinylation, une glycosylation, une hydroxylation, une lipoylation, une phosphorylation, une amidation, une ubiquitination, une sumoylation, une déamination, etc.), ou toute protéine (ou partie de protéine) ayant été combinée avec une molécule non protéique (ou une partie de molécule non protéique), telle qu’une protéine (ou une partie de protéine) combinée avec un glucide, un sucre, un oside, un lipide, un acide nucléique, un neurotransmetteur, ou toute partie de ceux-ci ou toute combinaison de ceux-ci.

Une molécule mixte comprend par exemple une glycoprotéine.

Avantageusement, la protéine (ou partie de protéine), ou la molécule non protéique (ou une partie de molécule non protéique), ou la molécule mixte (ou la partie de molécule mixte) qui est combinée à la protéine (ou à l’une ou plusieurs parties d’une protéine) de la protéine de fusion, est choisie parmi un antigène, une toxine, un récepteur, un signal d’adressage ou de ciblage ou de transport, une enzyme, une hormone, un anticorps, tout fragment de ceux-ci (de préférence un fragment fonctionnel), et toute combinaison quelconque de ceux-ci.

Par « fragment de peptide ou de protéine » ou « partie de peptide ou de protéine » ou entend une portion d’un peptide ou d’une protéine, c’est-à-dire une portion de la séquence d’acides aminés consécutifs composant ledit peptide ou ladite protéine.

Par « fragment de molécule » ou « partie de molécule » ou entend une portion d’une molécule non protéique ou d’une molécule mixte.

Par «  fragment fonctionnel  », on entend tout fragment de peptide ou de protéine, ou tout fragment de molécule, présentant au moins une des fonctions originales du peptide, de la protéine ou de la molécule dont ledit fragment est issu.

De préférence, le fragment fonctionnel réalise ladite fonction avec une efficacité égale à au moins 30% de celle dudit peptide ou de ladite protéine ou de ladite molécule, de préférence au moins 40%, de préférence au moins 45%, de préférence au moins 50%, de préférence au moins 55%, de préférence au moins 60%, de préférence au moins 65%, de préférence au moins 70%, de préférence au moins 75%, de préférence au moins 80%, de préférence au moins 85%, de préférence au moins 90%, de préférence au moins 91%, de préférence au moins 92%, de préférence au moins 93%, de préférence au moins 94%, de préférence au moins 95%, de préférence au moins 96%, de préférence au moins 97%, de préférence au moins 98%, de préférence au moins 99%, de préférence au moins 100% de l’efficacité dudit peptide ou de ladite protéine ou de ladite molécule.

Par « nanoparticule » on entend un objet dont les trois dimensions sont à l'échelle nanométrique, c'est-à-dire une particule dont le diamètre nominal est inférieur à 100 nm environ (par exemple tel que défini par la norme ISO TS/27687).

Par « nanoparticule phagique » ou « nanoparticule de phage » on entend une nanoparticule comprenant au moins un phage ou au moins un fragment de phage ; ou constituée essentiellement d’au moins un phage ou d’au moins un fragment de phage; ou constituée d’au moins un phage ou d’au moins un fragment de phage (le terme fragment étant utilisé ici en lien avec un phage selon le même sens que le terme fragment utilisé en lien avec les peptide, protéine et molécules, tel que défini ci-dessus).

Avantageusement, la nanoparticule comprend au moins une capside ou au moins un fragment de capside ; ou est constituée essentiellement d’au moins une capside ou d’au moins un fragment de capside; ou est constituée d’au moins une capside ou d’au moins un fragment de capside.

Avantageusement, ladite capside est telle que définie ci-dessus.

Ladite capside est de préférence décorée, sous forme mature expansée, vide, ou une combinaison quelconque de ceux-ci.

Par « opéron » on entend une unité d'ADN fonctionnelle regroupant des gènes qui opèrent sous le signal d'un même promoteur.

Ces gènes sont de préférence transcrits en ARN messager ensemble et de préférence concourent à la réalisation d'une même fonction physiologique.

Avantageusement, soit tous les gènes d'un opéron sont transcrits ensemble, soit aucun n'est transcrit, puisqu'ils sont tous sous le contrôle du même promoteur.

Par « promoteur » on entend une section d'ADN qui déclenche la transcription d’une section d’ADN reconnu par une ARN polymérase.

Par « antigène » on entend une molécule naturelle ou synthétique qui, reconnue par des anticorps ou des cellules du système immunitaire d’un organisme, est capable de déclencher chez celui-ci une réponse immunitaire.

Ainsi toute substance étrangère, tout microbe, introduit dans le corps, peut se comporter en antigène, c’est-à-dire y provoquer la fabrication de protéines spéciales, les anticorps qui ont la propriété de neutraliser les effets nocifs de la substance étrangère.

Les antigènes sont généralement des peptides, des protéines, des sucres (tels que polysaccharides ou polyosides) et leurs dérivés lipidiques (lipides).

Les antigènes peuvent également être des acides nucléiques, Des fragments d'antigènes appelés haptènes peuvent aussi induire une allergie.

Les antigènes, en tant que marqueurs des agents étrangers à l'organisme, sont à la base de la réponse immunitaire adaptative.

C'est la reconnaissance de l'antigène par les cellules immunocompétentes, directement ou via les cellules présentatrices d'antigène (CPA), qui active l'immunité spécifique.

Dans le cas d'antigènes protéiques, on nomme « épitope » ou « déterminant antigénique » la partie de l'antigène reconnue par un anticorps ou un récepteur lymphocytaire.

Un même antigène peut comporter plusieurs épitopes (identiques ou différents) et ainsi induire une réponse immunitaire variée.

Il existe des épitopes séquentiels, correspondant à une séquence d'acides aminés, et des épitopes conformationnels, liés à la structure de la protéine et donc sensibles à la dénaturation.

La reconnaissance de l'antigène par les lymphocytes dépend de la nature de l'épitope.

Les lymphocytes B se lient directement aux épitopes conformationnels grâce aux immunoglobulines de leur membrane.

Les lymphocytes T reconnaissent les épitopes séquentiels présentés par les cellules présentatrices d'antigènes.

L’antigène peut être exogène, c’est-à-dire qu’il est étranger à l’individu (dans ce cas, il peut être allogénique : issus de la même espèce ; ou xénogénique : issus d’autres espèces), ou il peut être endogène, c’est-à-dire un antigène propre à l’hôte (auto-antigènes) et pouvant être considérés comme étrangers.

L’antigène est de préférence un antigène de microorganisme, de plante, d’algue, de microalgue, de bactérie, de virus, de parasite, de levure, de champignon, d’insecte, d’animal, ou de tumeur ; de préférence un antigène d’un pathogène eucaryote ou procaryote, ou d’un cancer ; de préférence un antigène protéique, un lipide ou un sucre de bactérie, de virus, de parasite, de levure, de champignon ou de tumeur.

Les différentes catégories d’antigènes sont bien connues de l’homme du métier, qui pourra notamment se référer aux ouvrages de référence dans le domaine (tels que G.

J.

V.

Nossal, G L Ada, Antigens, Lymphoid Cells and the Immune Response, Academic Press, 1971 ; Marc H.

V.

Van Regenmortel, Structure of Antigens, Volume 3 CRC Press, 20 déc. 1995 ; Edouard Drouhet, Garry T.

Cole, Louis De Repentigny, Jean Latge, Fungal Antigens: Isolation, Purification, and Detection, Springer Science & Business Media, 11 nov. 2013 ; Graziano D.F., Finn O.J. (2005) Tumor Antigens and Tumor Antigen Discovery.

In: Khleif S.N. (eds) Tumor Immunology and Cancer Vaccines.

Cancer Treatment and Research, vol 123.

Springer, Boston, MA; Wang M, Claesson MH, Methods Mol Biol. 2014;1184:309-17.

Classification of human leukocyte antigen (HLA) supertypes ; ainsi que les bases de données spécialisées telles que décrites dans Galperin, Fernández-Suárez, Rigden, The 24th annual Nucleic Acids Research database issue: a look back and upcoming changes, NAR, Volume 45, Issue D1, January 2017, Pages D1–D11; en particulier la base de données PMAPP, une base de données des autoantigènes humains (disponible notamment sur le site aagatlas.ncpsb.org)).

Par « toxine » on entend une substance toxique pour un ou plusieurs organismes vivants.

Une toxine est typiquement synthétisée par un organisme vivant (bactérie, champignon vénéneux, insecte ou serpent venimeux), auquel elle confère son pouvoir pathogène.

Les toxines produites par des bactéries sont appelées bactériotoxines, celles par les champignons sont dénommées mycotoxines, celles produites par les plantes sont appelées phytotoxines, celles produites par les algues sont appelées phycotoxines, celles par les animaux sont dénommées toxines animales.

La toxine peut être une molécule chimique, un peptide, une protéine, une glycoprotéine, un sucre, un oside, un lipide, un acide nucléique, ou une combinaison quelconque de ceux-ci Plusieurs familles de bactéries sécrètent des biotoxines (exotoxines) dans les tissus qu'elles colonisent.

D'autres bactéries (Gram négatif) conservent en elles-mêmes la plus grande partie des composés toxiques, qui ne sont libérés que lors de la lyse cellulaire, sous l'action de moyens chimiques, physiques ou mécaniques (les endotoxines).

Les végétaux toxiques produisent des toxines via leurs métabolites secondaires : ce sont des molécules qui, à l'inverse des toxines primaires (protéines, lipides, glucides, acides aminés...) sont produites en dehors des voies métaboliques nécessaires à assurer la survie (donc des primaires).

On peut classer les toxines végétales en trois groupes : les phénols, les azotés et les terpènes.

La toxine peut être une neurotoxine (une toxine agissant sur le système nerveux), une myotoxine (agissant sur la contraction des muscles, notamment les cardiotoxines sur le cœur et d'autres comme la strychnine sur les muscles respiratoires), une hémotoxine (agissant sur le sang), une cytotoxine (agissant sur les cellules), une dermatotoxine (agissant sur la peau et les muqueuses), une hépatotoxine (agissant sur le foie), une néphrotoxine (agissant sur le rein), une entérotoxine (agissant sur le tube digestif) etc.

La toxine peut être une anatoxine ; c’est-à-dire une toxine qui a été traitée de manière à conserver son pouvoir antigénique et perdre son pouvoir toxique.

La toxine est de préférence une toxine de microorganisme, de plante, d’algue, de microalgue, de bactérie, de virus, de parasite, de levure, de champignon, d’insecte, d’animal, ou de tumeur ; de préférence une toxine d’un pathogène eucaryote ou procaryote, ou d’un cancer.

Les différentes catégories de toxines sont bien connues de l’homme du métier, qui pourra notamment se référer aux ouvrages de référence dans le domaine (tels que Michael W.

Parker, Protein Toxin Structure, Springer Science & Business Media, 29 juin 2013 ; Michael R.

Dobbs, Clinical Neurotoxicology E-Book: Syndromes, Substances, Environments, Elsevier Health Sciences, 22 juil. 2009 ; Walker AA, Robinson SD, Yeates DK, Jin J, Baumann K, Dobson J, Fry BG, King GF.

Entomo-venomics: The evolution, biology and biochemistry of insect venoms.

Toxicon.

2018 Nov;154:15-27; Vilariño N, Louzao MC, Abal P, Cagide E, Carrera C, Vieytes MR, Botana LM.

Human Poisoning from Marine Toxins: Unknowns for Optimal Consumer Protection.

Toxins (Basel).

2018 Aug 9;10(8) ; ainsi que les bases de données spécialisées telles que décrites dans Galperin, Fernández-Suárez, Rigden, The 24th annual Nucleic Acids Research database issue: a look back and upcoming changes, NAR, Volume 45, Issue D1, January 2017, Pages D1–D11; en particulier la base de données Comparative Toxicogenomics Database, telle que décrite dans Davis, Grondin Murphy, Johnson, Lay, Lennon-Hopkins, Saraceni-Richards, Sciaky, King, Rosenstein, Wiegers, Mattingly, The Comparative Toxicogenomics Database: update 2013, NAR, Volume 41, Issue D1, 1 January 2013, Pages D1104–D1114 (disponible notamment sur le site ctdbase.org)).

Par « récepteur » on entend une molécule de la membrane cellulaire ou du cytoplasme ou du noyau cellulaire qui se lie spécifiquement à un facteur spécifique (un ligand, tels un neurotransmetteur, une hormone, ou une autre substance), induisant une réponse cellulaire à ce ligand.

Les modifications du comportement du récepteur induites par le ligand conduisent à des modifications physiologiques qui constituent les « effets biologiques » du ligand.

Les récepteurs peuvent comprendre au moins : un peptide, une protéine, une glycoprotéine, un sucre, un oside, un lipide, un acide nucléique, ou une combinaison quelconque de ceux-ci.

Les récepteurs sont en général des protéines ou des protéines mixtes (protéines modifiées et/ou associées à une autre molécule).

Le récepteur peut être un récepteur de la partie externe de la membrane plasmique, un récepteur transmembranaire enchâssé dans la bicouche lipidique des membranes cellulaires (en général une protéine transmembranaire, agissant par exemple comme récepteur aux hormones et aux neurotransmetteurs - Ces récepteurs sont soit couplés à une protéine G soit porteurs d'une activité enzymatique ou de canal ionique qui permettent l'activation des voies métaboliques de la transduction du signal en réponse à la fixation du ligand), ou un récepteur intracellulaire (ces récepteurs peuvent parfois pénétrer dans le noyau de la cellule pour y moduler l'expression de gènes spécifiques, en réponse à l'activation par le ligand).

Le récepteur est de préférence un récepteur de microorganisme, de plante, d’algue, de microalgue, de bactérie, de virus, de parasite, de levure, de champignon, d’insecte, d’animal, ou de tumeur ; de préférence un récepteur d’un pathogène eucaryote ou procaryote, ou d’un cancer ; de préférence un récepteur protéique ou glycoprotéique de bactérie, de virus, de parasite, de levure, de champignon ou de tumeur.

Les différentes catégories de récepteurs sont bien connues de l’homme du métier, qui pourra notamment se référer aux ouvrages de référence dans le domaine (tels que Thomas D.

Pollard, William C.

Earnshaw, Jennifer Lippincott-Schwartz, Graham Johnson Cell Biology E-Book, Elsevier Health Sciences, 1 nov. 2016 ; Mohammed Zourob, Recognition Receptors in Biosensors, DOI 10.1007/978-1-4419-0919-0, Springer-Verlag New York 2010 ; Abbas, Lichtman, Pillai, Cellular and Molecular Immunology E-Book, Elsevier Health Sciences, 22 août 2014 ; ainsi que les bases de données spécialisées telles que décrites dans Galperin, Fernández-Suárez, Rigden, The 24th annual Nucleic Acids Research database issue: a look back and upcoming changes, NAR, Volume 45, Issue D1, January 2017, Pages D1–D11; en particulier la base de données GPCRdb, , telle que décrite dans Isberg V., Mordalski S., Munk C., Rataj K., Harpsoe K., Hauser A.S., Vroling B., Bojarski A.J., Vriend G., Gloriam D.E..

GPCRdb: an information system for G protein-coupled receptors.

Nucleic Acids Res. 2016 ; 44:D356–D364 (disponible notamment sur le site gpcrdb.org)).

Par « signal d’adressage ou de ciblage ou de transport » ou par « molécule de signalisation » ou par « signal » ou par « signal cellulaire » on entend les séquences d’adressage de peptide et de protéine, les molécules permettant le transport et/ou l’internalisation cellulaire, ainsi que les ligands de récepteurs (les récepteurs étant tels que définis ci-dessus).

La séquence d'adressage est une courte séquence d'acide aminés, généralement situé à l'extrémité N-terminale de la protéine, servant à désigner les protéines devant être adressées, et indiquer leur destination.

Ainsi, le signal d’adressage ou de ciblage ou de transport peut être un signal d’adressage ou de ciblage ou de transport au/vers le noyau ; un signal d’adressage ou de ciblage ou de transport au/vers le cytoplasme ; un signal d’adressage ou de ciblage ou de transport au/vers le cytosol ; un signal d’adressage ou de ciblage ou de transport à/vers la membrane cellulaire ; un signal d’adressage ou de ciblage ou de transport aux/vers les mitochondries ; un signal d’adressage ou de ciblage ou de transport aux/vers les péroxysomes; un signal d’adressage ou de ciblage ou de transport aux/vers les lysosomes ; un signal d’adressage ou de ciblage ou de transport au/vers le réticulum endoplasmique ; un signal d’adressage ou de ciblage ou de transport des voies de sécrétion ; et un ligand d’un récepteur, de préférence un récepteur membranaire ou transmembranaire, de préférence un récepteur membranaire ou transmembranaire d’une membrane choisie parmi une membrane cellulaire, une membrane extracellulaire, une membrane cytoplasmique et une membrane nucléaire.

Le signal d’adressage ou de ciblage ou de transport peut comprendre au moins : un peptide, une protéine, une glycoprotéine, un sucre, un oside, un lipide, un acide nucléique, ou une combinaison quelconque de ceux-ci.

De préférence, le signal d’adressage ou de ciblage ou de transport comprend au moins un peptide, une protéine, une glycoprotéine, ou un acide nucléique.

Le signal est de préférence un signal procaryote, eucaryote ou viral, de préférence un signal d’un animal, d’un végétal, d’une algue, d’une microalgue, d’un microorganisme, d’une bactérie, d’un parasite, d’une levure, d’un champignon, d’un insecte, d’un virus, ou d’un cancer ; de préférence encore un signal de mammifère, tel qu’un signal humain.

Les différentes catégories de signaux sont bien connues de l’homme du métier, qui pourra notamment se référer aux ouvrages de référence dans le domaine (tels que Thomas D.

Pollard, William C.

Earnshaw, Jennifer Lippincott-Schwartz, Graham Johnson Cell Biology E-Book, Elsevier Health Sciences, 1 nov. 2016 ; Mohammed Zourob, Recognition Receptors in Biosensors, DOI 10.1007/978-1-4419-0919-0, Springer-Verlag New York 2010 ; Abbas, Lichtman, Pillai, Cellular and Molecular Immunology E-Book, Elsevier Health Sciences, 22 août 2014).

Par « enzyme » on entend une protéine dotée de propriétés catalytiques.

Pratiquement toutes les biomolécules capables de catalyser des réactions chimiques dans les cellules sont des enzymes ; certaines biomolécules catalytiques sont cependant constituées d'ARN et sont donc distinctes des enzymes : ce sont les ribozymes.

Une enzyme agit en abaissant l'énergie d'activation d'une réaction chimique, ce qui accroît la vitesse de réaction.

L'enzyme n'est pas modifiée au cours de la réaction.

Les molécules initiales sont les substrats de l'enzyme, et les molécules formées à partir de ces substrats sont les produits de la réaction.

Les enzymes sont notamment caractérisées par leur très grande spécificité.

De plus, une enzyme a la caractéristique d'être réutilisable.

Les enzymes sont généralement des protéines globulaires qui agissent seules ou en complexes de plusieurs enzymes ou sous-unités.

Comme toutes les protéines, les enzymes sont constituées d'une ou plusieurs chaînes polypeptidiques repliées pour former une structure tridimensionnelle correspondant à leur état natif.

Les enzymes sont des molécules bien plus grandes que leurs substrats.

Leur taille peut varier d’une cinquantaine-centaine de résidus à plus de 2 000 résidus.

Seule une toute petite partie de l'enzyme — entre deux et quatre résidus le plus souvent, parfois plus — est directement impliquée dans la catalyse, ce qu'on appelle le site catalytique (oudomaine catalytique).

Ce dernier peut être situé à proximité d'un ou plusieurssites de liaison, au niveau desquels le(s) substrat(s) est(sont) lié(s) et orienté(s) afin de permettre la catalyse de la réaction chimique.

Le site catalytique et les sites de liaison forment lesite actifde l'enzyme.

Les enzymes remplissent un grand nombre de fonctions au sein des êtres vivants.

Elles peuvent par exemple intervenir dans des mécanismes de transduction de signal et de régulation des processus cellulaires, dans la génération de mouvements, dans le transport actif transmembranaire, dans la digestion, dans le métabolisme, dans le système immunitaire, dans des mécanismes de digestion ou coupure d’acides nucléiques en encore de production d’acides nucléiques (appelées ici « enzymes agissant sur les acides nucléiques »), dans des mécanismes de conversion de prodrogue (conversion de prodrogue en drogue).

L’enzyme est de préférence une enzyme procaryote, eucaryote ou virale, de préférence une enzyme d’un animal, d’un végétal, d’une algue, d’une microalgue, d’un insecte, d’un microorganisme, d’une bactérie, d’un parasite, d’une levure, d’un champignon ou d’un virus, de préférence encore une enzyme de mammifère, telle qu’une enzyme humaine.

Les différentes catégories d’enzymes sont bien connues de l’homme du métier, qui pourra notamment se référer aux ouvrages de référence dans le domaine (tels que Schomburg D., Schomburg I., Springer Handbook of Enzymes. 2 edn.

Heidelberg: Springer; 2001-2009 ; Liébecq C., IUPAC-IUBMB Joint Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN) and Nomenclature Committee of IUBMB (NC-IUBMB) Biochem.

Mol.

Biol.

Int. 1997;43:1151–1156; IUBMB (1992), Enzyme Nomenclature 1992, Academic Press, San Diego; ainsi que les bases de données spécialisées telles que décrites dans Schomburg D, Schomburg I.

Methods Mol Biol. 2010;609:113-28.

Enzyme databases ; en particulier la base de données BRENDA (disponible notamment sur le site brenda-enzymes.org), telle que décrite par exemple par Chang A, Schomburg I, Placzek S, Jeske L, Ulbrich M, Xiao M, Sensen CW, Schomburg D, Nucleic Acids Res.

2015 Jan;43.

Epub 2014 Nov 5.

BRENDA in 2015: exciting developments in its 25th year of existence).

Par « activité enzymatique » ou « activité catalytique » ou encore « activité » d’une enzyme, on entend l’efficacité d’une enzyme à convertir un substrat en produit dans un environnement donné.

L’efficacité de l’enzyme prend en compte ici la vitesse de conversion du substrat en produit par l’enzyme et le taux de conversion du substrat en produit par l’enzyme.

Par « taux de conversion du substrat en produit par l’enzyme » on entend ici le ratio entre la quantité de produit final obtenu par rapport à la quantité initiale de substrat pour une quantité définie d’enzyme.

Par exemple, une activité enzymatique au sens de l’invention peut être exprimée en quantité de phloroglucinol produit dans un volume donné (en g/L).

Par « hormone » on entend une substance chimique biologiquement active, en général synthétisée par une cellule glandulaire (généralement suite à une stimulation) et sécrétée dans le milieu intérieur où elle circule (par voie sanguine, par la lymphe ou par la sève).

Elle transmet un message sous forme chimique (en général en agissant sur des récepteurs spécifiques d'une cellule cible) et joue donc un rôle de messager dans l'organisme.

Elle est capable d'agir à très faible dose.

L’hormone est avantageusement une hormone végétale ou animale.

Les hormones végétales sont également appelées phytohormones ou facteurs de croissance.

Elles ont souvent comme fonction d'assurer la croissance de la plante ou sa morphogenèse.

Les hormones animales sont dans la plupart des cas produites par le système endocrinien (une glande endocrine ou un tissu endocrinien).

Avantageusement, l’hormone est une hormone de vertébrés, de préférence choisies parmi les classes chimiques suivantes :

-Les hormones dérivées d'amines, qui sont constituées d'un seul acide aminé (la tyrosine ou le tryptophane) mais sous une forme dérivée.

-Les hormones peptidiques ; qui sont des chaînes d'acides aminés, donc des protéines, appelées peptides pour les plus courtes.

-Les hormones stéroïdes, qui sont des stéroïdes dérivés du cholestérol.

-Les hormones à base de lipides et de phospholipides.

L’hormone est de préférence choisie parmi les hormones peptidiques ou protéiques, les hormones dérivées d’amines, les hormones stéroïdes et les hormones lipidiques.

L’hormone est de préférence une hormone d’un animal ou d’un végétal, de préférence une hormone de mammifère, de préférence une hormone humaine.

Les différentes catégories d’hormones sont bien connues de l’homme du métier, qui pourra notamment se référer aux ouvrages de référence dans le domaine (tels que Davies P.J. (2010) The Plant Hormones: Their Nature, Occurrence, and Functions.

In: Davies P.J. (eds) Plant Hormones.

Springer, Dordrecht ; AW Norman, G Litwack, Hormones, Academic Press, 1997; A Kastin, Handbook of biologically active peptides, Academic Press, 2013).

Par « anticorps » on entend une protéine ou une glycoprotéine complexe utilisée par le système immunitaire pour détecter et neutraliser les agents pathogènes de manière spécifique.

Chez les mammifères, les anticorps sont pour la plupart sécrétés par des cellules dérivées des lymphocytes B : les plasmocytes.

Les anticorps constituent l'immunoglobuline principale du sang.

Les anticorps comprennent également les auto-anticorps (produits par exemple dans le cas d'une maladie auto-immune).

Les anticorps sont des protéines, des glycoprotéines de la superfamille des immunoglobulines formées de 4 chaînes polypeptidiques (150 000 uma ou dalton) : deux chaînes lourdes (H pour heavy de 50 000 uma chacune) et deux chaînes légères (L pour light de 25 000 uma chacune) qui sont reliées entre elles par un nombre variable de ponts disulfures assurant une flexibilité de la molécule.

Ces chaînes forment une structure en Y (chaque chaîne légère constitue pour moitié un bras du Y) et sont constituées de domaines immunoglobulines pouvant comprendre 110 acides aminés environ.

Chaque chaîne légère est constituée d'un domaine constant et d'un domaine variable ; les chaînes lourdes sont composées d'un fragment variable et de trois ou quatre fragments constants selon l'isotype.

Pour un anticorps donné, les deux chaînes lourdes sont identiques, de même pour les deux chaînes légères.

Les domaines constants sont caractérisés par une séquence en acides aminés très proche d'un anticorps à l'autre, caractéristiques de l'espèce et de l'isotype.

Chaque chaîne légère en possède un exemplaire noté CL.

Les chaînes lourdes comportent, selon l'isotype, trois ou quatre domaines constants CH1, CH2, CH3, (CH4).

Les domaines constants ne sont généralement pas impliqués dans la reconnaissance de l'antigène, mais interviennent dans l'activation du système du complément, ainsi que dans l'élimination des complexes immuns (anticorps lié à son antigène) par les cellules immunitaires possédant les récepteurs aux fragments constants (RFc).

Un anticorps possède quatre domaines variables situés aux extrémités des deux « bras ».

L'association entre un domaine variable porté par une chaîne lourde (VH) et le domaine variable adjacent porté par une chaîne légère (VL) constitue le site de reconnaissance (ou paratope) de l'antigène.

Ainsi, une molécule d'immunoglobuline possède deux sites de liaison à l'antigène, un au bout de chaque bras.

Ces deux sites sont identiques (mais destiné à différents épitopes), d'où la possibilité de lier deux molécules d'antigène par anticorps.

Le clivage enzymatique spécifique permet d'isoler différents fragments :

-le fragment Fc (cristallisable).

Il est le support des propriétés biologiques de l'immunoglobuline, en particulier sa capacité à être reconnu par des effecteurs de l'immunité ou à activer le complément.

Il est constitué des fragments constants des chaînes lourdes (CH2) au-delà de la région charnière (« hinge », en anglais).

Il ne reconnaît pas l'antigène ;

-le fragment Fv.

C'est le plus petit fragment gardant les propriétés de l'anticorps que possède l'immunoglobuline.

Il est constitué uniquement des régions variables VL et VH, il fixe donc l'antigène avec la même affinité que l'anticorps complet et est monovalent ;

-le fragment Fab.

Il a la même affinité pour l'antigène que l'anticorps complet.

Le fragment Fab est formé de la chaîne légère en entier (VL+CL) et d'une partie de la chaîne lourde (VH+CH1).

Il est monovalent ;

-le fragment F(ab')2.

Il correspond à l'association de deux fragments Fab reliés par une petite partie des parties constantes des chaînes lourdes, la région charnière (en anglais : hinge).

Il a la même affinité que l'anticorps pour l'antigène et est divalent.

Les anticorps monoclonaux sont des anticorps ne reconnaissant qu'un seul type d'épitope sur un antigène donné.

Ils sont par définition tous identiques et produits par un seul clone de plasmocyte.

Les anticorps polyclonaux sont un mélange d'anticorps reconnaissant différents épitopes sur un antigène donné, chaque idiotype étant sécrété par un clone de plasmocytes différent.

Au cours de la réponse immunitaire, un organisme synthétise des anticorps dirigés contre plusieurs épitopes d'un antigène : la réponse est dite polyclonale.

L’anticorps peut être un fragment fonctionnel d’un anticorps.

Dans ce cas, ledit fragment peut être choisi parmi un fragment Fc d’un anticorps, un fragment Fv d’un anticorps, un fragment Fab d’un anticorps, et un fragment F(ab’) d’un anticorps.

L’anticorps est de préférence un anticorps d’un animal, de préférence un anticorps de mammifère, de préférence un anticorps humain ou humanisé.

Avantageusement, l’anticorps est un anticorps monoclonal.

Les différentes catégories d’anticorps sont bien connues de l’homme du métier, qui pourra notamment se référer aux ouvrages de référence dans le domaine (tels que Thomas D.

Pollard, William C.

Earnshaw, Jennifer Lippincott-Schwartz, Graham Johnson Cell Biology E-Book, Elsevier Health Sciences, 1 nov. 2016 ; Mohammed Zourob, Recognition Receptors in Biosensors, DOI 10.1007/978-1-4419-0919-0, Springer-Verlag New York 2010 ; Abbas, Lichtman, Pillai, Cellular and Molecular Immunology E-Book, Elsevier Health Sciences, 22 août 2014 ; Bayer V., An Overview of Monoclonal Antibodies.

Semin Oncol Nurs.

2019 Sep 2:150927 ; Wang W, Wang EQ, Balthasar JP.

Monoclonal antibody pharmacokinetics and pharmacodynamics.

Clin Pharmacol Ther.

2008 Nov;84(5):548-58).

Par «microorganisme» ou «micro-organisme», on entend un organisme vivant microscopique.

Les micro-organismes comprennent notamment des bactéries, des champignons microscopiques, des archéobactéries, des protistes, des algues vertes microscopiques, des animaux du plancton, des planaires, et des amibes.

Il est possible de distinguer d'une part les micro-organismes procaryotes qui ne possèdent pas de noyau comme les bactéries et les Archaea, et d'autre part les micro-organismes eucaryotes possédant un noyau.

Les eucaryotes microscopiques comprennent les champignons comme les levures et deux types de protistes : les algues et protozoaires.

Les micro-organismes sont en général unicellulaires, certaines espèces pouvant être multicellulaires.

Des protistes unicellulaires peuvent être visibles à l'œil nu et quelques espèces multicellulaires sont microscopiques.

La taille moyenne des cellules bactériennes est de 0,5 à 1 μm, mais il existe certaines bactéries ayant une taille de plus de 50 μm.

Les cellules eucaryotes ont un diamètre allant de 5 à 20 μm.

Par « procaryote » (ou Prokaryota) on entend un être vivant dont la structure cellulaire ne comporte pas de noyau, et presque jamais d'organites membranés (la seule exception étant les thylakoïdes chez les cyanobactéries).

Il s'agit notamment des microorganismes unicellulaires simples tels que les bactéries (comprenant les archées et les eubactéries).

Dans la classification du vivant en sept règnes, les procaryotes forment un taxon paraphylétique, regroupant ainsi des êtres vivants partageant une structure cellulaire similaire et simple.

Selon la classification admise, ce taxon s'oppose aux « eucaryotes », caractérisés par la présence d'un noyau et de multiples autres organites.

Par « eucaryote » (ou Eukaryota), on entend donc un organisme appartenant au domaine des eucaryotes, un domaine regroupant tous les organismes, unicellulaires ou multicellulaires, qui se caractérisent par la présence d'un noyau et généralement d'organites spécialisés dans la respiration, en particulier mitochondries chez les aérobies mais aussi hydrogénosomes chez certains anaérobies.

Par « bactérie», on entend un organisme microscopique et procaryote présent dans tous les milieux, appartenant au règne des bactéries.

Le terme bactérie désigne ici à la fois les eubactéries et les archaebactéries (ou archées).

Par «algue », on entend un organisme capable de photosynthèse oxygénique et dont le cycle de vie se déroule généralement en milieu aquatique.

Les algues comprennent notamment les cyanobactéries et les algues eucaryotes.

Par «cyanobactérie », on entend un organisme procaryote appartenant au groupe desCyanobacteria, appelées également algues bleues.

Par « algue eucaryote », on entend un organisme eucaryote appartenant au groupe des algues eucaryotes, comprenant les embranchements desGlaucophyta ou Glaucocystophyta, des Rhodophyta, desChlorobionta ou Viridiplantae, des Cryptophyta, des Euglenozoa, des Cercozoa, desHaptophyta ou Prymnesiophyta, desDinophyta, et desOchrophyta ou Heterokontophyta.

Les algues eucaryotes selon l’invention comprennent en particulier divers groupes à espèces unicellulaires (Euglénophytes, Cryptophytes, Haptophytes, Glaucophytes, etc.), d'autres groupes à espèces unicellulaires ou pluricellulaires (tels que les « algues rouges » ouRhodophyta, les Stramenopiles (regroupant notamment les Diatomées et les « algues brunes » ou Phéophycées), et des végétaux assez proches des plantes terrestres (tels que les « algues vertes », qui comprennent entre autres les Ulvophycées).

Par « microalgue » ou « micro-algue » on entend les algues microscopiques, parfois appelées microphyte.

Unicellulaires ou pluricellulaires indifférenciées, ce sont des micro-organismes généralement photosynthétiques Eucaryotes.

Les microalgues peuvent comprendre également des procaryotes, regroupant l'ensemble des cyanobactéries (ou "algues bleues").

Vivant dans les milieux fortement aqueux, elles peuvent posséder une mobilité flagellaire.

Elles colonisent tous les biotopes exposés à la lumière.

Toutefois, la grande majorité des microalgues est capable de se nourrir par osmotrophie la nuit et est donc, de fait, mixotrophes.

Les microalgues jouent un rôle important dans le cycle du carbone et de manière plus générale dans les cycles biogéochimiques des lacs et de l'océan.

Les microalgues peuvent être cultivées de manière monoclonale dans des photobioréacteurs ou des fermenteurs industriels.

Par « animal » on entend un organisme appartenant au règne animal.

Selon la classification classique, un animal est un être vivant hétérotrophe, c’est-à-dire qu’il se nourrit de substances organiques.

On entend également le taxon des animaux nomméAnimali a, dans les classifications scientifiques modernes (création originale de Linné en 1758, eu égard au Code international de nomenclature zoologique (ICZN)) ou encoreMetazoa(synonyme junior créé par Haeckel en 1874).

Un animal est un être complexe et multicellulaires (métazoaires).

Quel que soit le terme employé ou quelle que soit la classification retenue (évolutionniste ou cladiste), on entend ici par animal des organismes eucaryotes pluricellulaires généralement mobiles et hétérotrophes.

Les animaux comprennent notamment le groupe des vertébrés.

Par « vertébrés » on entend un organisme appartenant au groupe des animaux vertébrés (aussi appelée Vertebrata), qui est un sous-embranchement du règne animal.

Les vertébrés possèdent un squelette osseux ou cartilagineux, qui comporte en particulier une colonne vertébrale.

Ces animaux bilatériens appartiennent à l'embranchement des Chordés et regroupent l'ensemble des Poissons ainsi que les Tétrapodes.

On y inclut également les Myxines (des poissons sans mâchoires) bien qu'elles n'aient pas de véritable colonne.

Par « mammifère » on entend un animal appartenant au taxon ou au clade (un regroupement cladistique de lignées biologiques) ou la classe des mammifères (classe également appelée Mammalia), regroupant des animaux vertébrés.

Leur aire de répartition est planétaire, ils ont conquis une grande partie des niches écologiques de la macrofaune et demeurent un des taxons dominants depuis l'Éocène.

La caractéristique principale de ce clade est l'allaitement des jeunes à partir d'une sécrétion cutanéo-glandulaire spécialisée appelée lait.

Les nouveau-nés nécessitent systématiquement des soins parentaux du fait de leur appareil digestif immature à la naissance (le lait est leur source de nourriture vitale et obligatoire).

D'autres caractéristiques permettent également de distinguer les mammifères des autres taxons, y compris fossiles.

Un « humain » appartient au clade des mammifère.

Par « végétal », on entend un organisme appartenant au règne végétal.

Le règne végétal comprend les lignées qui végètent : c'est-à-dire qui respirent, se nourrissent, croissent comme les plantes, selon les classifications scientifiques classiques.

Le règne végétal est un assemblage polyphylétique d’organismes photosynthétiques et dont les cellules ont une paroi faite de cellulose.

Le terme végétal désigne à la fois les plantes terrestres (ou végétaux verts) et les algues vertes, constituant le taxon des Chlorobiontes, ainsi que les algues rouges, les algues brunes et les champignons.

Le groupe végétal est donc formé de deux lignées, l’une d’algues ; et la seconde de plantes (en particulier les plantes terrestres), qui comprennent notamment les bryophytes (mousses et hépatiques), fougères (ptéridophytes), gymnospermes et angiospermes.

Avantageusement, le végétal est une plante.

Par « insecte » (ou Insecta) on entend une classe d'animaux invertébrés de l'embranchement des arthropodes et du sous-embranchement des hexapodes.

Ils sont caractérisés par un corps segmenté en trois tagmes (tête possédant des pièces buccales externes, une paire d'antennes et au moins une paire d'yeux composés ; thorax pourvu de trois paires de pattes articulées et deux paires d'ailes plus ou moins modifiées ; abdomen dépourvu d'appendices) protégés par une cuticule formant un exosquelette composé de chitine et pourvu de trachées respiratoires.

Par « parasite » on entend un être vivant au moins partiellement de parasitisme.

Le parasitisme est une relation biologique durable entre deux êtres vivants hétérospécifiques où un des protagonistes — le parasite — tire profit d'un organisme hôte pour se nourrir, s'abriter ou se reproduire.

Cette relation aura un effet négatif pour l’hôte.

Les organismes qui ne sont pas parasites peuvent être qualifiés de « libres ».

On trouve des parasites dans l'ensemble du monde vivant.

Certains groupes sont composés quasi exclusivement de parasites (exemples : les plathelminthes monogènes), bien que la plupart comportent à la fois des espèces parasites et libres (exemple : les nématodes).

Les vertébrés comportent quelques espèces parasites (telles que les chauves-souris hématophages, les lamproies, les poissons-vampires (ou candirús), etc.).

De nombreux parasites peuvent modifier le comportement de leur hôte, à l'avantage du parasite.

Avantageusement, le parasite est un parasite d’un animal, de préférence humain.

Le parasite d’un animal est généralement un métazoaire ou un protozoaire.

La parasite d’animal n'inclut ici ni virus (virose), ni les bactéries (infection bactérienne), ni les champignons (mycose)).

La présence du parasite dans l’organisme est appelée parasitose.

Lors de la parasitose, il y a action des leucocytes polynucléaires éosinophiles: l’hyper éosinophilie qui correspond à une augmentation de ces cellules de défense dans le sang.

L’action des cristalloïdes (protéines majeures) sont responsables de cette action antiparasitaire.

Des exemples de parasites d’animaux incluent :

-les protozoaires (comprenant les classes: des Rhizopodes intestinaux (Amibes) ; des Flagellés ; des Sporozoaires : et des Ciliés) ;

-les métazoaires (comprenant les Helminthes (vers) ; les Plathelminthes(vers plats, non chitineux) ; les trématodes (non segmentés) ; les Schistosomes ; les Cestodes (segmentés) ; les taenias ; les Némathelminthes (vers rond, chitineux, non segmentés, à sexe séparé), les Filaires, etc.) ;

-les arthropodes (incluant les Arachnides et des Insectes parasites ou vecteurs de parasites).

Par « champignon » ou « fungus » ou « fungi » on entend un organisme eucaryote appartenant au règne des Fungi, aussi appelé Mycota ou Mycètes ou fonge.

Ce règne constitue un large groupe diversifié, depuis des organismes unicellulaires (levures) ou pluricellulaires (moisissures) microscopiques, jusqu'aux « champignons supérieurs » dotés le plus souvent d'un pied et d'un chapeau.

Les champignons sont notamment caractérisés par l'existence simultanée d’une paroi cellulaire périphérique et de vacuoles turgescentes dans le cytoplasme, leur corps végétatif non différencié et leur paroi peptido-polyosidique, ainsi que l’absence de chloroplastes, de chlorophylle et d'amidon.

Ce sont des organismes hétérotrophes au carbone.

Par « levure » on entend un champignon unicellulaire apte à provoquer la fermentation des matières organiques animales ou végétales.

Les levures présentent en général un métabolisme de respiration oxydatif et peuvent également utiliser un métabolisme fermentatif alcoolique.

Ces micro-organismes eucaryotes, de forme variable selon l’espèce (sphérique, ovoïde ou elliptique, en bouteille, triangulaire ou apiculée (renflée à chaque bout comme un citron) mais généralement ovales, d'environ 6 à 10 microns et jusqu’à 50 microns, se multiplient par bourgeonnement ou par scission (scissiparité).

Ils sont souvent capables d'accomplir une sporulation soit dans un but de dormance en milieu défavorable, soit dans un but de dispersion.

Les levures sont en général caractérisées par une paroi cellulaire (constituée d'une couche externe de mannoprotéines, associés à des glucanes et une couche interne de glucanes associés à une petite quantité de chitine) entourant la membrane plasmique et protégeant la levure des agressions physico-chimiques du milieu extérieur ; une membrane cytoplasmique composée principalement de phospholipides double couche ; un noyau contenant l'information génétique du génome chromosomique de la levure ; des mitochondries qui jouent un rôle important dans la respiration aérobie de la levure et la production d'ATP.

Certaines levures possèdent un pouvoir pathogène chez les animaux est sont responsables des mycoses de type candidoses (genre Candida).

Des exemples de levures incluent celles du genreS acc haromyces(tel queSaccharomyces cerevisiae) ouSchyzosaccharomyces.

Par « virus » on entend un agent infectieux nécessitant un hôte (en général une cellule) dont il utilise le métabolisme et ses constituants pour se répliquer.

Les virus changent de forme au cours de leur cycle, en passant par deux stades :

-une forme extracellulaire (unité matérielle indépendante appelée virion lorsqu'il y a une capside ou, pour quelques formes, viroïde).

Sous la forme extracellulaire, les virus sont des objets particulaires, infectieux, constitués au minimum d'un acide nucléique souvent englobé dans une capside de protéines ;

-une forme intracellulaire (virus intégré sous forme dormante ou détournant activement la machinerie cellulaire au profit de sa réplication).

Sous la forme intracellulaire (à l'intérieur de la cellule hôte), les virus sont des éléments génétiques qui peuvent se répliquer en parasitant tout ou partie du métabolisme de la cellule hôte, que ce soit intégré à un chromosome du génome hôte (on parle alors de provirus) ou parallèlement à lui (cas par exemple des usines à virions).

Le virus est de préférence un virus d’eucaryote (c’est à dire un virus infectant les eucaryotes et plus particulièrement les cellules eucaryotes), de préférence encore un virus d’animal (c’est à dire un virus infectant les animaux et plus particulièrement les cellules animales), de préférence encore un virus de mammifère (c’est à dire un virus infectant les mammifères et plus particulièrement les cellules mammifères), de préférence encore un virus d’humain (c’est à dire un virus infectant les humains et plus particulièrement les cellules humaines).

Le virus peut également être un virus de végétal (c’est à dire un virus infectant les végétaux et plus particulièrement les cellules végétales), de préférence un virus de plante (c’est à dire un virus infectant les plantes et plus particulièrement les cellules de plantes).

Le virus est de préférence un virus pathogène.

Par « maladie » ou « affection » outrouble » ou « pathologie » on entend une altération des fonctions ou de la santé d'un organisme vivant.

On parle aussi bien de la maladie, se référant à l'ensemble des altérations de santé, que d'une maladie, qui désigne alors une entité particulière caractérisée par des causes, des symptômes, une évolution et des possibilités thérapeutiques propres.

Par « infection » ou « maladie infectieuse » on entend une maladie provoquée par la transmission d'un micro-organisme ou d'un agent infectieux : virus, bactérie, parasite, champignon, protozoaires.

Par « maladie auto-immune » on entend une maladie consécutive à une anomalie du système immunitaire conduisant ce dernier à s'attaquer aux composants normaux de l'organisme (le "soi").

Par « maladie métabolique » on entend un trouble médical qui affecte les métabolismes dans la cellule, en particulier la production d'énergie.

En général, une maladie métabolique empêche la bonne transformation par l’organisme des sucres, des graisses et des protéines.

Par « maladie dermatologique » on entend une maladie de la peau, des muqueuses et des phanères (ongles, cheveux, poils).

Par « maladie cardiovasculaire » ou « maladie cardioneurovasculaire » on entend une maladie qui concerne le cœur et la circulation sanguine.

Par « maladie respiratoire », on entend une maladie affectant l’appareil respiratoire.

L’appareil respiratoire est un ensemble d’organes permettant la respiration (c’est-à-dire les échanges gazeux entre l'organisme et l'environnement).

Chez les mammifères tels que l’humain, l’appareil respiratoire comprend le nez, la bouche, le pharynx, le larynx, la trachée, le diaphragme et les poumons, ces derniers comprenant les bronches, les bronchioles, les alvéoles et les acini.

Par « maladie des poumons » ou « maladie pulmonaire », on entend une maladie respiratoire qui affecte les poumons.

Les maladies respiratoires et/ou pulmonaires peuvent être d’origine infectieuse, virale, génétique, environnementale, ou résulter d’une combinaison de ces facteurs.

Par « maladie neurodégénérative », une entend une maladie chronique invalidante, qui peut être à évolution lente et discrète.

Elle provoque généralement une détérioration du fonctionnement des cellules nerveuses, en particulier les neurones, pouvant conduire à la mort cellulaire (ou neurodégénérescence).

Les troubles induits par les maladies neurodégénératives sont variés et peuvent être d'ordre cognitivo-comportemental, sensoriel et moteur.

Par « maladie génétique  »on entend une maladie due à une ou plusieurs anomalies sur un ou plusieurs chromosomes qui entraînent un défaut de fonctionnement de certaines cellules de l'organisme.

Les maladies génétiques sont dites dominantes ou récessives, si l'allèle responsable est ou non dominant (chez un individu chaque gène est représenté par deux allèles).

On peut aussi les classer en fonction de la position du gène responsable de l'anomalie.

S'il est situé sur la paire de chromosomes sexuels, la maladie est dite «gonosomale», s'il est localisé sur une paire de chromosomes homologues, la maladie est dite «autosomale».

Par « maladie hormonale » ou « maladie endocrinienne » on entend une maladie causée par un dysfonctionnement des hormones sécrétées par les glandes endocrines.

Par « maladie psychiatrique » ou « maladie psychique » ou « maladie mentale » ou « trouble psychiatrique » ou « trouble psychique » ou « trouble mental », on entend un ensemble d'affections et troubles d'origines très différentes entraînant des difficultés dans la vie d'un individu et/ou de son entourage, des souffrances et des troubles émotionnels et du comportement.

Les troubles psychiques touchent toutes les populations, sans distinction de sexe ou d'âge.

Ces troubles peuvent être ponctuels, chroniques ou permanents.

Par « cancer » ou « maladie cancéreuse » on entend est une maladie provoquée par la transformation de cellules qui deviennent anormales et prolifèrent de façon excessive (on peut parler de prolifération anarchique).

Ces cellules déréglées peuvent finir par former une masse qu'on appelle tumeur (en général une tumeur maligne).

Les cellules cancéreuses ont généralement tendance à envahir les tissus voisins et à se détacher de la tumeur.

Elles peuvent alors migrer par les vaisseaux sanguins et les vaisseaux lymphatiques pour aller former une autre tumeur : on parle de métastase.

Les cancers rassemblent un ensemble de pathologies très diverses de formes et de conséquences, tout en partageant cependant systématiquement un ensemble très typique de caractéristiques quel que soit le cancer concerné.

Les éléments histologiques suivants peuvent notamment être retrouvés dans la plupart des cancers :

-une indépendance des cellules cancéreuses vis-à-vis des signaux qui stimulent normalement la multiplication des cellules ;

-une insensibilité des cellules cancéreuses aux signaux et mécanismes anti-prolifératifs ;

-une capacité proliférative qui n'est plus limitée (croissance à l'infini, résultant souvent en néoplasmes) ;

-la disparition du phénomène d'apoptose chez ces mêmes cellules cancéreuses, autrement dit une forme d'"immortalité" agressive aux dépens du malade ;

-la régression ou dédifférenciation cellulaire vers une forme rappelant de plus en plus des cellules souches embryonnaires (la cellule cancéreuse peut ainsi passer d’un état de cellule spécialisée/différenciée vers un état de cellule non spécialisée, immature, multipotent ou pluripotent) ;

-une capacité anormale à susciter l'angiogenèse ;

-souvent l'acquisition d'un pouvoir invasif dans les stades avancés ;

-des lésions dans les tissus environnants (nécroses), qu'il y ait ou non invasion tissulaire;

-à de très rares exceptions, il s'agit de cellules issues de l'individu touché par ce cancer (ce sont des cellules du Soi).

Par « tumeur » on entend une augmentation de volume d'un tissu, sans précision de cause.

C'est une néoformation de tissus corporels (néoplasie) qui se produit à la suite d'un dérèglement de la croissance cellulaire, de type bénin ou malin (quand il s'agit d'une tumeur maligne, on parle de cancer).

Une néoplasie peut concerner n'importe quel type de tissu.

En fonction de la localisation de la tumeur et de la fonction du tissu affecté, elle peut conduire à un dysfonctionnement des organes et nuire à l'ensemble de l'organisme, voire causer sa mort.

Les tumeurs peuvent survenir chez tous les organismes multicellulaires, y compris les plantes.

On distingue les tumeurs bénignes et malignes :

-Les tumeurs bénignes sont des tumeurs en général sans gravité, c'est-à-dire ne pouvant donner lieu à des tumeurs filles (métastases), comme c'est le cas des verrues ou des grains de beauté.

Cependant, une tumeur bénigne peut entraîner des complications graves (compression, inflammation, etc.) par son action mécanique.

-Les tumeurs malignes sont souvent désignées sous le terme de cancer.

En plus d'attaquer les tissus environnants, elles produisent des tumeurs filles (métastases) qui se propagent à travers le sang ou la lymphe.

Par « tumeur », on entend ici de préférence une tumeur maligne.

Par « maladie liée à une infection et/ou liée à une exposition à une toxine » on entend une maladie de préférence non infectieuse, qui est provoquée, causée, amplifiée et/ou entretenue par au moins une infection et/ou par une exposition ponctuelle, occasionnelle, régulière, prolongée ou répétée à au moins une toxine.

Par « prévention » ou « prévention d’une maladie » ou « prévention de l’apparition d’une maladie » on entend la diminution du risque d’apparaitre, de développer ou d’amplifier une maladie, les causes d’une maladie, les symptômes d’une maladie, les effets (ou conséquences, de préférence les effets/conséquences néfastes, délétères) d’une maladie, ou une combinaison quelconque de ceux-ci ; et/ou le fait de retarder l’apparition, le développement ou l’amplification d’une maladie, les causes d’une maladie, les symptômes d’une maladie, les effets (ou conséquences, de préférence les effets/conséquences néfastes, délétères) d’une maladie, ou une combinaison quelconque de ceux-ci.

Par « traitement » ou « traitement d’une maladie », on entend la diminution, l’inhibition, et/ou la disparition d’une maladie, des causes d’une maladie, des symptômes d’une maladie, des effets (ou conséquences, de préférence les effets/conséquences néfastes, délétères) d’une maladie, ou d’une combinaison quelconque de ceux-ci.

Par « vaccin » ou « composition vaccinale » on entend une substance pathogène ou tumorale qui, inoculée à un individu sous une forme de préférence inoffensive, lui confère l'immunité contre une maladie (ou la protection contre une maladie).

En général un vaccin stimule la réponse immunitaire de l'organisme.

Un vaccin peut être préventif, permettant de prévenir l’apparition d’une maladie.

Un vaccin peut également être thérapeutique, permettant d’aider le patient à lutter contre une maladie en cours.

Par « médicament », on entend toute substance ou composition présentée comme possédant des propriétés curatives ou préventives à l'égard des maladies humaines ou animales.

Un médicament comprend donc toute substance ou composition pouvant être utilisée chez l'être humain ou l'animal ou pouvant leur être administrée, en vue d'établir un diagnostic médical ou de restaurer, corriger ou modifier leurs fonctions physiologiques en exerçant une action pharmacologique, immunologique ou métabolique.

Dans la description détaillée qui suit, les modes de réalisation pourront être pris seuls ou combinés de manière appropriée par l’homme du métier.

Capside

Les Inventeurs ont mis au point, de manière tout à fait surprenante, des capsides de phage T5 vides, dépourvues d’ADN génomique de phage, capables d’exposer à leur surface des protéines de fusion d’intérêt.

Ces capsides fonctionnalisées sont notamment capables d’exercer,in vivo, les fonctions et activités de la protéine de fusion d’intérêt utilisée.

La présente invention concerne donc une capside de phage T5 dépourvue d’ADN génomique dudit phage et exposant, à sa surface, au moins une protéine de fusion, ladite protéine de fusion comprenant :

- au moins un fragment de peptide ou de protéine ayant au moins 80% d’identité avec un fragment d’une protéine de décoration pb10, de préférence au moins 81% d’identité, de préférence au moins 82% d’identité, de préférence au moins 83% d’identité, de préférence au moins 84% d’identité, de préférence au moins 85% d’identité, de préférence au moins 86% d’identité, de préférence au moins 87% d’identité, de préférence au moins 88% d’identité, de préférence au moins 89% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 91% d’identité, de préférence au moins 92% d’identité, de préférence au moins 93% d’identité, de préférence au moins 94% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité, de préférence au moins 96% d’identité, de préférence au moins 97% d’identité, de préférence au moins 98% d’identité, de préférence au moins 99% d’identité, de préférence 100% d’identité avec un fragment d’une protéine de décoration pb10 ; ledit fragment d’une protéine de décoration pb10 comprenant de préférence au moins 80 acides aminés consécutifs d’une protéine pb10 ; et

- au moins un fragment fonctionnel d’un antigène, ou au moins un fragment fonctionnel d’une toxine, ou au moins un fragment de récepteur, ou au moins un fragment fonctionnel d’un signal d’adressage ou de ciblage ou de transport, ou au moins un fragment fonctionnel d’une enzyme, ou au moins un fragment fonctionnel d’une hormone, ou au moins un fragment fonctionnel d’un anticorps, ou au moins un antigène, ou au moins une toxine, ou au moins un récepteur, ou au moins un signal d’adressage ou de ciblage ou de transport, ou au moins une enzyme, ou au moins une hormone, ou au moins un anticorps, ou une combinaison quelconque de ceux-ci, de préférence au moins un fragment fonctionnel d’antigène, de préférence encore au moins un antigène.

La capside selon l’invention est donc une capside vide fonctionnalisée.

Selon un mode de réalisation avantageux, la capside est caractérisée en ce que le fragment de la protéine de décoration pb10 est choisi parmi :

i) un fragment de peptide ou de protéine ayant au moins 80% d’identité avec une portion du domaine N-terminal d’une protéine pb10, de préférence au moins 81% d’identité, de préférence au moins 82% d’identité, de préférence au moins 83% d’identité, de préférence au moins 84% d’identité, de préférence au moins 85% d’identité, de préférence au moins 86% d’identité, de préférence au moins 87% d’identité, de préférence au moins 88% d’identité, de préférence au moins 89% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 91% d’identité, de préférence au moins 92% d’identité, de préférence au moins 93% d’identité, de préférence au moins 94% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité, de préférence au moins 96% d’identité, de préférence au moins 97% d’identité, de préférence au moins 98% d’identité, de préférence au moins 99% d’identité, de préférence 100% d’identité; ladite portion comprenant de préférence au moins 80 acides aminés consécutifs du domaine N-terminal d’une protéine pb10 ;

ii) un fragment de peptide ou de protéine ayant au moins 80% d’identité avec le domaine N-terminal d’une protéine pb10, de préférence au moins 81% d’identité, de préférence au moins 82% d’identité, de préférence au moins 83% d’identité, de préférence au moins 84% d’identité, de préférence au moins 85% d’identité, de préférence au moins 86% d’identité, de préférence au moins 87% d’identité, de préférence au moins 88% d’identité, de préférence au moins 89% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 91% d’identité, de préférence au moins 92% d’identité, de préférence au moins 93% d’identité, de préférence au moins 94% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité, de préférence au moins 96% d’identité, de préférence au moins 97% d’identité, de préférence au moins 98% d’identité, de préférence au moins 99% d’identité, de préférence 100% d’identité; ledit domaine N-terminal d’une protéine pb10 comprenant de préférence les acides aminés inclus entre les positions 1 et 80 ;

iii) un fragment ou un peptide d’une protéine comprenant une séquence d’acides aminés ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO :1, de préférence au moins 81% d’identité, de préférence au moins 82% d’identité, de préférence au moins 83% d’identité, de préférence au moins 84% d’identité, de préférence au moins 85% d’identité, de préférence au moins 86% d’identité, de préférence au moins 87% d’identité, de préférence au moins 88% d’identité, de préférence au moins 89% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 91% d’identité, de préférence au moins 92% d’identité, de préférence au moins 93% d’identité, de préférence au moins 94% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité, de préférence au moins 96% d’identité, de préférence au moins 97% d’identité, de préférence au moins 98% d’identité, de préférence au moins 99% d’identité, de préférence 100% d’identité avec la séquence SEQ ID NO :1 ; ledit fragment ou peptide comprenant de préférence au moins 80 acides aminés consécutifs de ladite protéine ;

iv) un fragment ou un peptide d’une protéine consistant en une séquence d’acides aminés ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 1, de préférence au moins 81% d’identité, de préférence au moins 82% d’identité, de préférence au moins 83% d’identité, de préférence au moins 84% d’identité, de préférence au moins 85% d’identité, de préférence au moins 86% d’identité, de préférence au moins 87% d’identité, de préférence au moins 88% d’identité, de préférence au moins 89% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 91% d’identité, de préférence au moins 92% d’identité, de préférence au moins 93% d’identité, de préférence au moins 94% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité, de préférence au moins 96% d’identité, de préférence au moins 97% d’identité, de préférence au moins 98% d’identité, de préférence au moins 99% d’identité, de préférence 100% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 1 ; ledit fragment ou peptide comprenant de préférence au moins 80 acides aminés consécutifs de ladite protéine;

v) un peptide comprenant une séquence d’acides aminés ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 3, de préférence au moins 81% d’identité, de préférence au moins 82% d’identité, de préférence au moins 83% d’identité, de préférence au moins 84% d’identité, de préférence au moins 85% d’identité, de préférence au moins 86% d’identité, de préférence au moins 87% d’identité, de préférence au moins 88% d’identité, de préférence au moins 89% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 91% d’identité, de préférence au moins 92% d’identité, de préférence au moins 93% d’identité, de préférence au moins 94% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité, de préférence au moins 96% d’identité, de préférence au moins 97% d’identité, de préférence au moins 98% d’identité, de préférence au moins 99% d’identité, de préférence 100% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 3 ; et

vi) un peptide consistant en une séquence d’acides aminés ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 3, de préférence au moins 81% d’identité, de préférence au moins 82% d’identité, de préférence au moins 83% d’identité, de préférence au moins 84% d’identité, de préférence au moins 85% d’identité, de préférence au moins 86% d’identité, de préférence au moins 87% d’identité, de préférence au moins 88% d’identité, de préférence au moins 89% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 91% d’identité, de préférence au moins 92% d’identité, de préférence au moins 93% d’identité, de préférence au moins 94% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité, de préférence au moins 96% d’identité, de préférence au moins 97% d’identité, de préférence au moins 98% d’identité, de préférence au moins 99% d’identité, de préférence 100% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 3.

Selon un mode de réalisation particulier, le fragment de la protéine de décoration pb10 est choisi parmi une protéine comprenant (ou consistant essentiellement en ou consistant en) une séquence d’acides aminés ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO :1, de préférence au moins 81% d’identité, de préférence au moins 82% d’identité, de préférence au moins 83% d’identité, de préférence au moins 84% d’identité, de préférence au moins 85% d’identité, de préférence au moins 86% d’identité, de préférence au moins 87% d’identité, de préférence au moins 88% d’identité, de préférence au moins 89% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 91% d’identité, de préférence au moins 92% d’identité, de préférence au moins 93% d’identité, de préférence au moins 94% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité, de préférence au moins 96% d’identité, de préférence au moins 97% d’identité, de préférence au moins 98% d’identité, de préférence au moins 99% d’identité, de préférence 100% d’identité avec la séquence SEQ ID NO :1.

Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, la capside est caractérisée en ce que le fragment de la protéine de décoration pb10 est choisi parmi les fragments de peptide ou de protéine et les peptides tels que définis aux points i), ii), v) et vi) du paragraphe ci-dessus.

En effet, les Inventeurs ont montré que la fonctionnalisation (l’exposition de la protéine de fusion à la surface de la capside est particulièrement efficace lorsque le fragment de la protéine pb10 comprend le domaine N-terminal de la protéine pb10 ou consiste ce domaine N-terminal.

Avantageusement, l’antigène est choisi parmi les antigènes comprenant (ou consistant essentiellement en, ou consistant en) au moins : un peptide, une protéine, une glycoprotéine, un sucre, un oside, un lipide, un acide nucléique, ou une combinaison quelconque de ceux-ci.

L’antigène est de préférence un antigène de microorganisme, de plante, d’algue, de microalgue, de bactérie, de virus, de parasite, de levure, de champignon, d’insecte, d’animal, ou de tumeur ; de préférence un antigène d’un pathogène eucaryote ou procaryote, ou d’un cancer ; de préférence un antigène protéique, un lipide ou un sucre de bactérie, de virus, de parasite, de levure, de champignon ou de tumeur.

Avantageusement, la toxine est choisie parmi les toxines comprenant (ou consistant essentiellement en, ou consistant en) au moins : une molécule chimique, un peptide, une protéine, une glycoprotéine, un sucre, un oside, un lipide, un acide nucléique, ou une combinaison quelconque de ceux-ci.

La toxine est de préférence une toxine de microorganisme, de plante, d’algue, de microalgue, de bactérie, de virus, de parasite, de levure, de champignon, d’insecte, d’animal, ou de tumeur ; de préférence une toxine d’un pathogène eucaryote ou procaryote, ou d’un cancer.

Avantageusement, le récepteur est choisi parmi les récepteurs comprenant (ou consistant essentiellement en, ou consistant en) au moins : un peptide, une protéine, une glycoprotéine, un sucre, un oside, un lipide, un acide nucléique, ou une combinaison quelconque de ceux-ci.

Le récepteur est de préférence un récepteur de microorganisme, de plante, d’algue, de microalgue, de bactérie, de virus, de parasite, de levure, de champignon, d’insecte, d’animal, ou de tumeur ; de préférence un récepteur d’un pathogène eucaryote ou procaryote, ou d’un cancer ; de préférence un récepteur protéique ou glycoprotéique de bactérie, de virus, de parasite, de levure, de champignon ou de tumeur.

Avantageusement, le signal d’adressage ou de ciblage ou de transport est choisi parmi les signaux d’adressage ou de ciblage ou de transport comprenant (ou consistant essentiellement en, ou consistant en) au moins : un peptide, une protéine, une glycoprotéine, un sucre, un oside, un lipide, un acide nucléique, ou une combinaison quelconque de ceux-ci.

De préférence le signal d’adressage ou de ciblage ou de transport comprend (ou consiste essentiellement en, ou consiste en) au moins un peptide, une protéine, une glycoprotéine, ou un acide nucléique.

Le signal est de préférence un signal procaryote, eucaryote ou viral, de préférence un signal d’un animal, d’un végétal, d’une algue, d’une microalgue, d’un microorganisme, d’une bactérie, d’un parasite, d’une levure, d’un champignon, d’un insecte, d’un virus, ou d’un cancer ; de préférence encore un signal de mammifère, tel qu’un signal humain.

Avantageusement, le signal d’adressage ou de ciblage ou de transport est choisi parmi un signal d’adressage ou de ciblage ou de transport au/vers le noyau ; un signal d’adressage ou de ciblage ou de transport au/vers le cytoplasme ; un signal d’adressage ou de ciblage ou de transport au/vers le cytosol ; un signal d’adressage ou de ciblage ou de transport à/vers la membrane cellulaire ; un signal d’adressage ou de ciblage ou de transport aux/vers les mitochondries ; un signal d’adressage ou de ciblage ou de transport aux/vers les péroxysomes; un signal d’adressage ou de ciblage ou de transport aux/vers les lysosomes ; un signal d’adressage ou de ciblage ou de transport au/vers le réticulum endoplasmique ; un signal d’adressage ou de ciblage ou de transport des voies de sécrétion ; et un ligand d’un récepteur, de préférence un récepteur membranaire ou transmembranaire, de préférence un récepteur membranaire ou transmembranaire d’une membrane choisie parmi une membrane cellulaire, une membrane extracellulaire, une membrane cytoplasmique et une membrane nucléaire.

Avantageusement, le fragment fonctionnel d’une enzyme comprend au moins, ou est essentiellement constitué d’au moins, ou est constitué d’au moins, un domaine catalytique d’une enzyme, de préférence un site actif d’une enzyme.

L’enzyme est de préférence une enzyme procaryote, eucaryote ou virale, de préférence une enzyme d’un animal, d’un végétal, d’une algue, d’une microalgue, d’un insecte, d’un microorganisme, d’une bactérie, d’un parasite, d’une levure, d’un champignon ou d’un virus, de préférence encore une enzyme de mammifère, telle qu’une enzyme humaine.

Avantageusement, l’enzyme est choisie parmi les enzymes de conversion de prodrogue, les enzymes agissant sur les acides nucléiques, les enzymes du métabolisme, les enzymes du système immunitaire et les enzymes de la digestion.

Avantageusement, l’hormone est choisie parmi les hormones peptidiques ou protéiques, les hormones dérivées d’amines, les hormones stéroïdes et les hormones lipidiques.

L’hormone est de préférence une hormone d’un animal ou d’un végétal, de préférence une hormone de mammifère, de préférence une hormone humaine.

Avantageusement, le fragment fonctionnel d’un anticorps est choisi parmi un fragment Fc d’un anticorps, un fragment Fv d’un anticorps, un fragment Fab d’un anticorps, et un fragment F(ab’) d’un anticorps.

L’anticorps est de préférence un anticorps d’un animal, de préférence un anticorps de mammifère, de préférence un anticorps humain ou humanisé.

Le fragment de peptide ou de protéine ayant au moins 80% d’identité avec un fragment d’une protéine de décoration pb10, et/ou la protéine de fusion peuvent être obtenus par les méthodes classiques de production/obtention de fragment de peptide ou de protéine et/ou de protéine de fusion.

Ces méthodes comprennent par exemple les méthodes d’expression à l’aide d’un système d’expression (par exemple par un vecteur), inséré dans une cellule d’expression, par exemple par clonage suivie d’une purification.

L’homme du métier saura définir les étapes appropriées pour mettre en œuvre ces méthodes.

La protéine de fusion est avantageusement produite par tout système d’expression approprié, dont l’homme du métier saura définir les propriétés.

La protéine de fusion peut notamment être produite à partir d’un végétal ou d’une cellule végétale, d’un animal (non humain) ou d’une cellule animale (à l’exclusion des cellules souches embryonnaires humaines), d’un insecte ou d’une cellule d’insecte, d’une algue ou microalgue ou d’une cellule d’algue ou de microalgue, d’un champignon ou d’une cellule de champignon, d’une levure, d’un parasite ou d’une cellule de parasite, d’un microorganisme ou d’une cellule de microorganisme, ou d’une bactérie.

La protéine de fusion est de préférence produite par un organisme eucaryote ou une cellule d’eucaryote.

Lorsque le fragment fonctionnel d’un antigène, d’une toxine, d’un récepteur, d’un signal d’adressage ou de ciblage ou de transport, d’une enzyme, d’une hormone, d’un anticorps, ou l’antigène, la toxine, le récepteur, le signal d’adressage ou de ciblage ou de transport, l’enzyme, l’hormone, l’anticorps, ou la combinaison quelconque de ceux-ci, comprend, consiste essentiellement en ou consiste en une substance ou une molécule non protéique (ne comprenant pas de fragment ou de portion de protéine ou de peptide), ladite substance ou molécule non protéique peut être fusionnée au fragment de peptide ou de protéine ayant au moins 80% d’identité avec un fragment d’une protéine de décoration pb10 en utilisant les méthodes connues de l’homme du métier, qui saura choisir la méthode la plus appropriée.

Ces méthodes comprennent par exemple les méthodes de fusion par réaction avec une amine (fusion par liaisons covalentes ; tel que décrit notamment dans l’article Robertson et al., 2011 (DOI : dx.doi.org/10.1021/bc100365j ) et les méthodes de fusions par réaction avec une streptavidine (fusion par liaisons non covalentes ; tel que décrit notamment dans l’article Edgar et al, 2009 (DOI: 10.1073/pnas.0601211103).

Selon un mode de réalisation, la capside comprend en outre :

(i) au moins une copie d’une protéine ayant au moins 80% d’identité avec une protéine de capside pb8, de préférence au moins 81% d’identité, de préférence au moins 82% d’identité, de préférence au moins 83% d’identité, de préférence au moins 84% d’identité, de préférence au moins 85% d’identité, de préférence au moins 86% d’identité, de préférence au moins 87% d’identité, de préférence au moins 88% d’identité, de préférence au moins 89% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 91% d’identité, de préférence au moins 92% d’identité, de préférence au moins 93% d’identité, de préférence au moins 94% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité, de préférence au moins 96% d’identité, de préférence au moins 97% d’identité, de préférence au moins 98% d’identité, de préférence au moins 99% d’identité, de préférence 100% d’identité avec une protéine de capside pb8 ; ou

(ii) au moins une copie d’une protéine ayant au moins 80% d’identité avec une protéine portale pb7, de préférence au moins 81% d’identité, de préférence au moins 82% d’identité, de préférence au moins 83% d’identité, de préférence au moins 84% d’identité, de préférence au moins 85% d’identité, de préférence au moins 86% d’identité, de préférence au moins 87% d’identité, de préférence au moins 88% d’identité, de préférence au moins 89% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 91% d’identité, de préférence au moins 92% d’identité, de préférence au moins 93% d’identité, de préférence au moins 94% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité, de préférence au moins 96% d’identité, de préférence au moins 97% d’identité, de préférence au moins 98% d’identité, de préférence au moins 99% d’identité, de préférence 100% d’identité avec une protéine portale pb7; ou

(iii) au moins une copie d’une protéine ayant au moins 80% d’identité avec une protéase pb11, de préférence au moins 81% d’identité, de préférence au moins 82% d’identité, de préférence au moins 83% d’identité, de préférence au moins 84% d’identité, de préférence au moins 85% d’identité, de préférence au moins 86% d’identité, de préférence au moins 87% d’identité, de préférence au moins 88% d’identité, de préférence au moins 89% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 91% d’identité, de préférence au moins 92% d’identité, de préférence au moins 93% d’identité, de préférence au moins 94% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité, de préférence au moins 96% d’identité, de préférence au moins 97% d’identité, de préférence au moins 98% d’identité, de préférence au moins 99% d’identité, de préférence 100% d’identité avec une protéase pb11 ; ou

(iv) une combinaison quelconque de (i) à (iii).

Avantageusement, la protéine de capside pb8 comprend, ou consiste essentiellement en, ou consiste en une séquence d’acides aminés ayant la séquence SEQ ID NO : 8.

Avantageusement, la protéine portale pb7 comprend, ou consiste essentiellement en, ou consiste en une séquence d’acides aminés ayant la séquence SEQ ID NO : 7.

Avantageusement, la protéase pb11 comprend, ou consiste essentiellement en, ou consiste en une séquence d’acides aminés ayant la séquence SEQ ID NO : 9.

Avantageusement, la protéine de décoration pb10, la protéine de capside pb8, la protéine portale pb7 et/ou la protéase pb11 sont des protéines du phage T5.

Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux l’activité et/ou l’expression de la protéase est inductible (par exemple en plaçant le gène codant la protéase sous le contrôle d’un promoteur inductible).

Avantageusement, la capside est sous forme mature expansée.

La capside est de préférence isolée et/ou purifié.

La capside est de préférence recombinante.

Méthode de production de la capside

Les Inventeurs ont également mis au point des méthodes particulièrement efficaces de production des capsides selon l’invention.

Ainsi, l’invention se rapporte également à une méthode de production d’une capside, comprenant les étapes suivantes :

a) production d’une capside de phage T5 dépourvue d’ADN génomique et dépourvue de protéine pb10 ;

b) mise en contact de la capside de l’étape a) avec une protéine de fusion telle que définie ci-dessus, afin d’obtenir une capside décorée ; et

c) Optionnellement, purification de la capside décorée de l’étape b) à l’aide d’un détergent neutre, de préférence choisi parmi le n-Octyl-β-D-Glucopyranoside (β-OG) et le Dodecyldimethylaminoxid (LDAO).

L’absence de la protéine de décoration pb10 (ou pour un fragment de celle-ci) dans l’étape a) permet de garantir l’absence totale de décoration au cours de la production des capsides et avant l’addition des protéines de fusion.

Cela offre l’avantage de permettre la fusion avec tout type de substance ou de molécule (même non protéique), à façon.

Avantageusement, la protéine de fusion est produite par les méthodes décrites ci-dessus.

Les Inventeurs ont en outre montré que, de manière tout à fait inattendue, l’utilisation des détergents n-Octyl-β-D-Glucopyranoside (β-OG) et/ou Dodecyldimethylaminoxid (LDAO) au cours des étapes de purification des capsides permet l’obtention de capsides pures.

En particulier, l’utilisation de ces détergents permet d’éliminer la majorité des endotoxines contaminantes (issues notamment des bactéries d’expression ou de production) et de respecter (ne pas dépasser) les taux d’endotoxines tolérés pour des administrations chez un sujet animal, notamment humain.

Selon un mode de réalisation, la capside de l’étape a) est obtenue par une méthode comprenant les étapes suivantes :

1)Infection d’une bactérie, de préférence une bactérie de la famille des Enterobacteriaceae, de préférence encore une bactérie du genre Escherichia, de préférence encore une bactérie Escherichia coli, avec un phage T5 mutant, déficient pour le gène codant le moteur d’encapsidation de l’ADN de T5 -la terminase- et déficient pour le gène codant la protéine de décoration pb10 (de préférence dépourvu du gène codant la protéine de décoration pb10) ;

2)Lyse des bactéries de l’étape 1, Précipitation ou ultracentrifugation du lysat bactérien en résultant, et resuspension du culot dans un tampon salin.

3)Sédimentation de vitesse sur gradient de glycérol, incubation des fractions contenant les capsides en présence de β-OG (de préférence 1%), puis purification par plusieurs étapes de chromatographie par échange d’ions en présence de LDAO (de préférence 0,1%) de préférence au cours de la première étape.

Selon un mode de réalisation, la capside décorée de l’étape b) est obtenue par une méthode comprenant les étapes suivantes :

1.mise en contact de la capside de l’étape a) avec une protéine de fusion telle que définie ci-dessus, pendant un temps déterminé (de préférence au moins 10 min, de préférence entre 10 et 60 min), à une température allant de 2 à 20°C (de préférence une température comprise entre 3 et 5°C)

2.les concentrations respectives des capsides (calculées selon le protocole décrit dans Vernhes et al. 2017) et de la protéine de décoration respectent de préférence le ratio molaire 120 X [capside]/ [pb10] = 1 +/- 0,1.

Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, la capside de l’étape a) est obtenue par une méthode comprenant les étapes suivantes :

a-1) obtention d’un vecteur comprenant :

(i)au moins un gène codant pour une protéine ayant au moins 80% d’identité avec une protéine de capside pb8, de préférence au moins 81% d’identité, de préférence au moins 82% d’identité, de préférence au moins 83% d’identité, de préférence au moins 84% d’identité, de préférence au moins 85% d’identité, de préférence au moins 86% d’identité, de préférence au moins 87% d’identité, de préférence au moins 88% d’identité, de préférence au moins 89% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 91% d’identité, de préférence au moins 92% d’identité, de préférence au moins 93% d’identité, de préférence au moins 94% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité, de préférence au moins 96% d’identité, de préférence au moins 97% d’identité, de préférence au moins 98% d’identité, de préférence au moins 99% d’identité, de préférence 100% d’identité avec une protéine de capside pb8 ;

(ii)au moins un gène codant pour une protéine ayant au moins 80% d’identité avec une protéine portale pb7, de préférence au moins 81% d’identité, de préférence au moins 82% d’identité, de préférence au moins 83% d’identité, de préférence au moins 84% d’identité, de préférence au moins 85% d’identité, de préférence au moins 86% d’identité, de préférence au moins 87% d’identité, de préférence au moins 88% d’identité, de préférence au moins 89% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 91% d’identité, de préférence au moins 92% d’identité, de préférence au moins 93% d’identité, de préférence au moins 94% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité, de préférence au moins 96% d’identité, de préférence au moins 97% d’identité, de préférence au moins 98% d’identité, de préférence au moins 99% d’identité, de préférence 100% d’identité avec une protéine portale pb7;

(iii)au moins un gène codant pour une protéine ayant au moins 80% d’identité avec une protéase pb11 de préférence au moins 81% d’identité, de préférence au moins 82% d’identité, de préférence au moins 83% d’identité, de préférence au moins 84% d’identité, de préférence au moins 85% d’identité, de préférence au moins 86% d’identité, de préférence au moins 87% d’identité, de préférence au moins 88% d’identité, de préférence au moins 89% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 91% d’identité, de préférence au moins 92% d’identité, de préférence au moins 93% d’identité, de préférence au moins 94% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité, de préférence au moins 96% d’identité, de préférence au moins 97% d’identité, de préférence au moins 98% d’identité, de préférence au moins 99% d’identité, de préférence 100% d’identité avec une protéase pb11; et

dans lequel les gènes (i) à (iii) sont placés sous le contrôle d’un promoteur inductible ; de préférence dans lequel les gènes (i) à (iii) sont organisés au sein d’un unique opéron ;

de préférence dans lequel les gènes (i) à (iii) sont ordonnés conformément au génome du phage T5 ; et

a-2) expression du vecteur de l’étape a-1) par une bactérie, de préférence une bactérie de la famille desEnterobacteriaceae, de préférence encore une bactérie du genreEscherichia, de préférence encore une bactérieEscherichia coli ; afin d’obtenir une capside de phage T5 dépourvue d’ADN génomique et dépourvue de protéine pb10 ; et

a-3) Optionnellement, purification de la capside de l’étape a-2) à l’aide d’un détergent neutre, de préférence choisi parmi le n-Octyl-β-D-Glucopyranoside (β-OG) et le Dodecyldimethylaminoxid (LDAO).

En effet, les Inventeurs ont montré, de manière tout à fait surprenante, qu’il est possible de produire ces capsides vides fonctionnalisées sans passer par la production d’un phage mutant.

Ceci permet de s’affranchir étape d’infection d’une culture bactérienne par un phage mutant, et donc éviter la production d’un stock important de phage, en amont de la production des capsides.

Cette méthode offre également l’avantage d’éviter la réversion du phage au génotype sauvage, augmentant ainsi le rendement en capsides vides et la sécurité.

Cette méthode de production et de décoration mise au point par les Inventeurs est donc totalement indépendante du bactériophage T5.

Ce système est basé sur la construction de vecteurs (en particulier des plasmides recombinants) portant les gènes codant pour les protéines de capside du bactériophage T5.

Grâce à ce système, il est possible de produire soit directement des capsides vides décorées et fonctionnelles, soit des capsides vides non décorées, qui peuvent être décorées dans un second temps, par simple mise en contact avec la protéine de fusion d’intérêt.

Les données montrent, de façon tout à fait inattendue, que l’expression de ces plasmides chez des bactéries conduit à l’assemblage de capsides dont la morphologie est similaire à celle des capsides produites par la méthode classique utilisant un phage complet (mutant ou non), et dont les propriétés de décoration sont comparables à celles des capsides produites à partir du phage complet.

En effet, les données montrent que les propriétés d’autoassemblage des capsides à partir de l’expression ectopique des gènes de capsides, en dehors du cycle viral du phage T5, sont conservées.

Ainsi, les Inventeurs ont développé une méthode de production simplifiées, à grande échelle, de capsides recombinantes, dépourvues d’ADN génomiques, pouvant être décorées de deux façons différentes : i) par addition in vitro de la protéine de décoration purifiée ; ii) par co-production in situ de la protéine de décoration.

L’absence du gène codant pour la protéine de décoration pb10 (ou pour un fragment de celle-ci) dans le vecteur utilisé permet de garantir l’absence totale de décoration au cours de la purification des capsides et avant l’addition des protéines chimères purifiées.

Cela offre l’avantage de permettre la fusion avec tout type de substance ou de molécule (même non protéique), à façon.

Avantageusement, la protéine de capside pb8 comprend, ou consiste essentiellement en, ou consiste en une séquence d’acides aminés ayant la séquence SEQ ID NO : 8.

Avantageusement, la protéine portale pb7 comprend, ou consiste essentiellement en, ou consiste en une séquence d’acides aminés ayant la séquence SEQ ID NO : 7.

Avantageusement, la protéase pb11 comprend, ou consiste essentiellement en, ou consiste en une séquence d’acides aminés ayant la séquence SEQ ID NO : 9.

Avantageusement, la protéine de décoration pb10, la protéine de capside pb8, la protéine portale pb7 et/ou la protéase pb11 sont des protéines du phage T5.

Avantageusement, l’opéron utilisé (inséré) dans le vecteur de l’étape a-1) comprend (ou consiste essentiellement en, ou consiste en) une séquence d’acide nucléique ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 11, de préférence au moins 81% d’identité, de préférence au moins 82% d’identité, de préférence au moins 83% d’identité, de préférence au moins 84% d’identité, de préférence au moins 85% d’identité, de préférence au moins 86% d’identité, de préférence au moins 87% d’identité, de préférence au moins 88% d’identité, de préférence au moins 89% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 91% d’identité, de préférence au moins 92% d’identité, de préférence au moins 93% d’identité, de préférence au moins 94% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité, de préférence au moins 96% d’identité, de préférence au moins 97% d’identité, de préférence au moins 98% d’identité, de préférence au moins 99% d’identité, de préférence 100% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 11.

Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux l’activité et/ou l’expression de la protéase est inductible (par exemple en plaçant le gène codant la protéase sous le contrôle d’un promoteur inductible).

Les Inventeurs ont également montré qu’il est possible de produire directement la capside vide décorée, en utilisant un vecteur codant pour les protéines de la capside et la protéine de fusion.

Les rendements et l’efficacité sont particulièrement élevés en utilisant cette méthode.

L’invention concerne donc une méthode de production d’une capside comprenant les étapes suivantes :

a) obtention d’un vecteur comprenant :

(i)au moins un gène codant pour une protéine ayant au moins 80% d’identité avec une protéine de capside pb8, de préférence au moins 81% d’identité, de préférence au moins 82% d’identité, de préférence au moins 83% d’identité, de préférence au moins 84% d’identité, de préférence au moins 85% d’identité, de préférence au moins 86% d’identité, de préférence au moins 87% d’identité, de préférence au moins 88% d’identité, de préférence au moins 89% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 91% d’identité, de préférence au moins 92% d’identité, de préférence au moins 93% d’identité, de préférence au moins 94% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité, de préférence au moins 96% d’identité, de préférence au moins 97% d’identité, de préférence au moins 98% d’identité, de préférence au moins 99% d’identité, de préférence 100% d’identité avec une protéine de capside pb8 ;

(ii)au moins un gène codant pour une protéine ayant au moins 80% d’identité avec une protéine portale pb7, de préférence au moins 81% d’identité, de préférence au moins 82% d’identité, de préférence au moins 83% d’identité, de préférence au moins 84% d’identité, de préférence au moins 85% d’identité, de préférence au moins 86% d’identité, de préférence au moins 87% d’identité, de préférence au moins 88% d’identité, de préférence au moins 89% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 91% d’identité, de préférence au moins 92% d’identité, de préférence au moins 93% d’identité, de préférence au moins 94% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité, de préférence au moins 96% d’identité, de préférence au moins 97% d’identité, de préférence au moins 98% d’identité, de préférence au moins 99% d’identité, de préférence 100% d’identité avec une protéine portale pb7;

(iii)au moins un gène codant pour une protéine ayant au moins 80% d’identité avec une protéase pb11 de préférence au moins 81% d’identité, de préférence au moins 82% d’identité, de préférence au moins 83% d’identité, de préférence au moins 84% d’identité, de préférence au moins 85% d’identité, de préférence au moins 86% d’identité, de préférence au moins 87% d’identité, de préférence au moins 88% d’identité, de préférence au moins 89% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 91% d’identité, de préférence au moins 92% d’identité, de préférence au moins 93% d’identité, de préférence au moins 94% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité, de préférence au moins 96% d’identité, de préférence au moins 97% d’identité, de préférence au moins 98% d’identité, de préférence au moins 99% d’identité, de préférence 100% d’identité avec une protéase pb11; et

(iv)au moins un gène codant une protéine de fusion telle que définie ci-dessus;

dans lequel les gènes (i) à (iv) sont placés sous le contrôle d’un promoteur inductible ; de préférence dans lequel les gènes (i) à (iv) sont organisés au sein d’un unique opéron ;

de préférence dans lequel les gènes (i) à (iii) sont ordonnés conformément au génome du phage T5, et le gène (iv) codant la protéine de fusion occupe le locus du gène codant la protéine pb10 dans ledit génome ;

b) expression du vecteur de l’étape a) par une bactérie, de préférence une bactérie de la famille desEnterobacteriaceae, de préférence encore une bactérie du genreEscherichia, de préférence encore une bactérieEscherichia coli ; afin d’obtenir une capside de phage T5 dépourvue d’ADN génomique et exposant, à sa surface, au moins une copie de la protéine de fusion ; et

c) Optionnellement, purification de la capside décorée de l’étape b) à l’aide d’un détergent neutre, de préférence choisi parmi le n-Octyl-β-D-Glucopyranoside (β-OG) et le Dodecyldimethylaminoxid (LDAO).

Selon un mode de réalisation, l’opéron utilisé (inséré) dans le vecteur de l’étape a) comprend (ou consiste essentiellement en, ou consiste en) une séquence d’acide nucléique ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 10, de préférence au moins 81% d’identité, de préférence au moins 82% d’identité, de préférence au moins 83% d’identité, de préférence au moins 84% d’identité, de préférence au moins 85% d’identité, de préférence au moins 86% d’identité, de préférence au moins 87% d’identité, de préférence au moins 88% d’identité, de préférence au moins 89% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 91% d’identité, de préférence au moins 92% d’identité, de préférence au moins 93% d’identité, de préférence au moins 94% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité, de préférence au moins 96% d’identité, de préférence au moins 97% d’identité, de préférence au moins 98% d’identité, de préférence au moins 99% d’identité, de préférence 100% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 10.

Avantageusement, la protéine de capside pb8 comprend, ou consiste essentiellement en, ou consiste en une séquence d’acides aminés ayant la séquence SEQ ID NO : 8.

Avantageusement, la protéine portale pb7 comprend, ou consiste essentiellement en, ou consiste en une séquence d’acides aminés ayant la séquence SEQ ID NO : 7.

Avantageusement, la protéase pb11 comprend, ou consiste essentiellement en, ou consiste en une séquence d’acides aminés ayant la séquence SEQ ID NO : 9.

Avantageusement, la protéine de décoration pb10, la protéine de capside pb8, la protéine portale pb7 et/ou la protéase pb11 sont des protéines du phage T5.

La présente invention concerne en outre la capside susceptible d’être obtenue par une méthode de production décrite ci-dessus, ainsi qu’une capside obtenue par une méthode de production décrite ci-dessus, ainsi qu’une capside directement obtenue par une méthode de production décrite ci-dessus.

Protéine de fusion – Acide nucléique- Vecteur – Cellule hôte – Nanoparticule

Les Inventeurs ont montré qu’il est possible de produire ces capsides vides fonctionnalisées de manière totalement indépendante du bactériophage T5, évitant ainsi la réversion du phage au génotype sauvage, augmentant le rendement en capsides vides et la sécurité.

Cette méthode de production et de décoration est basée sur la construction de vecteurs inédits (en particulier des plasmides recombinants) portant les gènes codant pour les protéines de capside du bactériophage T5.

L’invention se rapporte donc à un vecteur comprenant :

(i)au moins un gène codant pour une protéine ayant au moins 80% d’identité avec une protéine de capside pb8, de préférence au moins 81% d’identité, de préférence au moins 82% d’identité, de préférence au moins 83% d’identité, de préférence au moins 84% d’identité, de préférence au moins 85% d’identité, de préférence au moins 86% d’identité, de préférence au moins 87% d’identité, de préférence au moins 88% d’identité, de préférence au moins 89% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 91% d’identité, de préférence au moins 92% d’identité, de préférence au moins 93% d’identité, de préférence au moins 94% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité, de préférence au moins 96% d’identité, de préférence au moins 97% d’identité, de préférence au moins 98% d’identité, de préférence au moins 99% d’identité, de préférence 100% d’identité avec une protéine de capside pb8 ;

(ii)au moins un gène codant pour une protéine ayant au moins 80% d’identité avec une protéine portale pb7, de préférence au moins 81% d’identité, de préférence au moins 82% d’identité, de préférence au moins 83% d’identité, de préférence au moins 84% d’identité, de préférence au moins 85% d’identité, de préférence au moins 86% d’identité, de préférence au moins 87% d’identité, de préférence au moins 88% d’identité, de préférence au moins 89% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 91% d’identité, de préférence au moins 92% d’identité, de préférence au moins 93% d’identité, de préférence au moins 94% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité, de préférence au moins 96% d’identité, de préférence au moins 97% d’identité, de préférence au moins 98% d’identité, de préférence au moins 99% d’identité, de préférence 100% d’identité avec une protéine portale pb7;

(iii)au moins un gène codant pour une protéine ayant au moins 80% d’identité avec une protéase pb11 de préférence au moins 81% d’identité, de préférence au moins 82% d’identité, de préférence au moins 83% d’identité, de préférence au moins 84% d’identité, de préférence au moins 85% d’identité, de préférence au moins 86% d’identité, de préférence au moins 87% d’identité, de préférence au moins 88% d’identité, de préférence au moins 89% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 91% d’identité, de préférence au moins 92% d’identité, de préférence au moins 93% d’identité, de préférence au moins 94% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité, de préférence au moins 96% d’identité, de préférence au moins 97% d’identité, de préférence au moins 98% d’identité, de préférence au moins 99% d’identité, de préférence 100% d’identité avec une protéase pb11; et

dans lequel les gènes (i) à (iii) sont placés sous le contrôle d’un promoteur inductible ; de préférence dans lequel les gènes (i) à (iii) sont organisés au sein d’un unique opéron ;

de préférence dans lequel les gènes (i) à (iii) sont ordonnés conformément au génome du phage T5.

L’invention se rapporte également à un vecteur comprenant :

(i)au moins un gène codant pour une protéine ayant au moins 80% d’identité avec une protéine de capside pb8, de préférence au moins 81% d’identité, de préférence au moins 82% d’identité, de préférence au moins 83% d’identité, de préférence au moins 84% d’identité, de préférence au moins 85% d’identité, de préférence au moins 86% d’identité, de préférence au moins 87% d’identité, de préférence au moins 88% d’identité, de préférence au moins 89% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 91% d’identité, de préférence au moins 92% d’identité, de préférence au moins 93% d’identité, de préférence au moins 94% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité, de préférence au moins 96% d’identité, de préférence au moins 97% d’identité, de préférence au moins 98% d’identité, de préférence au moins 99% d’identité, de préférence 100% d’identité avec une protéine de capside pb8 ;

(ii)au moins un gène codant pour une protéine ayant au moins 80% d’identité avec une protéine portale pb7, de préférence au moins 81% d’identité, de préférence au moins 82% d’identité, de préférence au moins 83% d’identité, de préférence au moins 84% d’identité, de préférence au moins 85% d’identité, de préférence au moins 86% d’identité, de préférence au moins 87% d’identité, de préférence au moins 88% d’identité, de préférence au moins 89% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 91% d’identité, de préférence au moins 92% d’identité, de préférence au moins 93% d’identité, de préférence au moins 94% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité, de préférence au moins 96% d’identité, de préférence au moins 97% d’identité, de préférence au moins 98% d’identité, de préférence au moins 99% d’identité, de préférence 100% d’identité avec une protéine portale pb7;

(iii)au moins un gène codant pour une protéine ayant au moins 80% d’identité avec une protéase pb11 de préférence au moins 81% d’identité, de préférence au moins 82% d’identité, de préférence au moins 83% d’identité, de préférence au moins 84% d’identité, de préférence au moins 85% d’identité, de préférence au moins 86% d’identité, de préférence au moins 87% d’identité, de préférence au moins 88% d’identité, de préférence au moins 89% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 91% d’identité, de préférence au moins 92% d’identité, de préférence au moins 93% d’identité, de préférence au moins 94% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité, de préférence au moins 96% d’identité, de préférence au moins 97% d’identité, de préférence au moins 98% d’identité, de préférence au moins 99% d’identité, de préférence 100% d’identité avec une protéase pb11; et

(iv)au moins un gène codant une protéine de fusion telle que définie ci-dessus;

dans lequel les gènes (i) à (iv) sont placés sous le contrôle d’un promoteur inductible ; de préférence dans lequel les gènes (i) à (iv) sont organisés au sein d’un unique opéron ;

de préférence dans lequel les gènes (i) à (iii) sont ordonnés conformément au génome du phage T5, et le gène (iv) codant la protéine de fusion occupe le locus du gène codant la protéine pb10 dans ledit génome ;

Avantageusement, la protéine de capside pb8 comprend, ou consiste essentiellement en, ou consiste en une séquence d’acides aminés ayant la séquence SEQ ID NO : 8.

Avantageusement, la protéine portale pb7 comprend, ou consiste essentiellement en, ou consiste en une séquence d’acides aminés ayant la séquence SEQ ID NO : 7.

Avantageusement, la protéase pb11 comprend, ou consiste essentiellement en, ou consiste en une séquence d’acides aminés ayant la séquence SEQ ID NO : 9.

Avantageusement, la protéine de décoration pb10, la protéine de capside pb8, la protéine portale pb7 et/ou la protéase pb11 sont des protéines du phage T5.

Le promoteur est de préférence un promoteur T7 ; de préférence le vecteur est un vecteur d’expression, de préférence un vecteur d’expression bactérien, de préférence un plasmide d’expression bactérien, de préférence un plasmide d’expression par l’ARN polymérase T7.

L’invention concerne en outre une cellule hôte comprenant au moins une capside telle que définie ci-dessus, ou au moins une capside susceptible d’être obtenue (ou obtenue, ou directement obtenue) par l’une quelconque des méthodes de production définies ci-dessus, ou au moins un vecteur tel que défini ci-dessus, ou un mélange quelconque de ceux-ci.

La cellule hôte peut être une cellule d’eucaryote ou une cellule procaryote.

La cellule hôte est de préférence une bactérie, de préférence une bactérie de la famille desEnterobacteriaceae, de préférence encore une bactérie du genreEscherichia, de préférence encore une bactérieEscherichia coli.La cellule hôte est de préférence isolée.

La cellule hôte est de préférence recombinante.

L’invention concerne également une protéine de fusion telle que définie ci-dessus.

La protéine de fusion est de préférence isolée et/ou purifié.

La protéine de fusion est de préférence recombinante.

L’invention concerne également l’acide nucléique codant la protéine de fusion telle que définie ci-dessus.

L’acide nucléique est de préférence isolé et/ou purifié.

L’acide nucléique est de préférence recombinant.

L’invention concerne également une nanoparticule comprenant au moins une capside telle que définie ci-dessus, ou au moins une capside susceptible d’être obtenue par une méthode de production décrite ci-dessus, ou au moins une capside obtenue par une méthode de production décrite ci-dessus, ou au moins une capside directement obtenue par une méthode de production décrite ci-dessus, ou au moins un vecteur tel que défini ci-dessus, ou au moins une cellule hôte telle que définie ci-dessus, ou un mélange quelconque de ceux-ci.

L’invention concerne en outre une capside telle que définie ci-dessus, ou une capside susceptible d’être obtenue par une méthode de production décrite ci-dessus, ou une capside obtenue par une méthode de production décrite ci-dessus, ou une capside directement obtenue par une méthode de production décrite ci-dessus, caractérisée en qu’elle est une nanoparticule et/ou un vecteur tel que défini ci-dessus, caractérisé en qu’il est une nanoparticule.

L’invention concerne l’utilisation d’au moins une capside telle que définie ci-dessus, ou d’au moins une capside susceptible d’être obtenue par une méthode de production décrite ci-dessus, ou d’au moins une capside obtenue par une méthode de production décrite ci-dessus, ou d’au moins une capside directement obtenue par une méthode de production décrite ci-dessus, ou d’au moins un vecteur tel que défini ci-dessus, ou d’un mélange quelconque de ceux-ci, comme nanoparticule.

Avantageusement, l’utilisation est une utilisation biotechnologique non médicale.

Composition – Composition pharmaceutique

L’invention concerne en outre une composition comprenant au moins une capside telle que définie ci-dessus, ou au moins une capside susceptible d’être obtenue par une méthode de production décrite ci-dessus, ou au moins une capside obtenue par une méthode de production décrite ci-dessus, ou au moins une capside directement obtenue par une méthode de production décrite ci-dessus, ou au moins un vecteur tel que défini ci-dessus, ou au moins une cellule hôte telle que définie ci-dessus, ou au moins une nanoparticule telle que définie ci-dessus, ou un mélange quelconque de ceux-ci.

La composition peut comprendre en outre au moins un excipient cosmétiquement acceptable (dans ce cas, la composition est une composition cosmétique) et/ou au moins un véhicule approprié qui peut être tout excipient et/ou tout véhicule parmi ceux connus de l’homme du métier en vue d’obtenir une composition telle que définie ci-dessus.

Les Inventeurs ont montré, de manière tout à fait surprenante, que la protéine de fusion, exposée par les capsides selon l’invention, conserve l’ensemble de ses propriétés et fonctionnalités, notamment une fois administrée in vivo.

En particulier, l’administration de ces capsides fonctionnalisées par un antigène chez des souris modèles, induit une immunisation efficace, avec l’induction significative d’une réponse par anticorps et d’une réponse cellulaire.

Cette immunisation résulte en une vaccination efficace de ces souris.

L’invention concerne donc une composition pharmaceutique et/ou vaccinale comprenant au moins une capside telle que définie ci-dessus, ou au moins une capside susceptible d’être obtenue par une méthode de production décrite ci-dessus, ou au moins une capside obtenue par une méthode de production décrite ci-dessus, ou au moins une capside directement obtenue par une méthode de production décrite ci-dessus, ou au moins un vecteur tel que défini ci-dessus, ou au moins une cellule hôte telle que définie ci-dessus, ou au moins une nanoparticule telle que définie ci-dessus, ou un mélange quelconque de ceux-ci.

Selon un mode de réalisation, la composition pharmaceutique et/ou vaccinale comprend en outre au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable et/ou au moins un adjuvant pharmaceutiquement acceptable et/ou au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable, qui peut être tout excipient et/ou tout adjuvant et/ou tout véhicule approprié parmi ceux connus de l’homme du métier en vue d’obtenir une composition pharmaceutique et/ou vaccinale telle que définie ci-dessus.

Selon un mode de réalisation avantageux, la composition (pharmaceutique ou non, vaccinale ou non) se présente sous une forme propre à une administration par voie topique, par voie orale, par injection.

Les conditions opératoires pour préparer ces compositions font partie des connaissances générales de l’homme du métier.

Avantageusement, la composition est dépourvue d’adjuvant additionnel.

En effet, les Inventeurs ont montré que la capside selon l’invention procurait l’effet d’un adjuvant, avec un effet adjuvant au moins aussi efficace qu’un adjuvant modèle (l’adjuvant complet de Freund).

Utilisation thérapeutique – Méthode de traitement

Les Inventeurs ont montré, de manière tout à fait surprenante, que la protéine de fusion, exposée par les capsides selon l’invention, conserve l’ensemble de ses propriétés et fonctionnalités, notamment une fois administrée in vivo.

En particulier, l’administration de ces capsides fonctionnalisées par un antigène chez des souris modèles, induit une immunisation efficace, avec l’induction significative d’une réponse par anticorps et d’une réponse cellulaire.

Cette immunisation résulte en une vaccination efficace de ces souris.

L’invention concerne donc une capside telle que définie ci-dessus, ou une capside susceptible d’être obtenue par une méthode de production décrite ci-dessus, ou une capside obtenue par une méthode de production décrite ci-dessus, ou une capside directement obtenue par une méthode de production décrite ci-dessus, ou un vecteur tel que défini ci-dessus, ou une cellule hôte telle que définie ci-dessus, ou une nanoparticule telle que définie ci-dessus, ou une composition pharmaceutique et/ou vaccinale telle que définie ci-dessus, ou un mélange quelconque de ceux-ci, pour son utilisation comme médicament et/ou comme vaccin.

L’invention concerne également une composition pharmaceutique et/ou vaccinale comprenant au moins une capside telle que définie ci-dessus, ou au moins une capside susceptible d’être obtenue par une méthode de production décrite ci-dessus, ou au moins une capside obtenue par une méthode de production décrite ci-dessus, ou au moins une capside directement obtenue par une méthode de production décrite ci-dessus, ou au moins un vecteur tel que défini ci-dessus, ou au moins une cellule hôte telle que définie ci-dessus, ou au moins une nanoparticule telle que définie ci-dessus, ou un mélange quelconque de ceux-ci, pour son utilisation comme médicament et/ou comme vaccin.

L’invention concerne également l’utilisation d’une capside telle que définie ci-dessus, ou d’une capside susceptible d’être obtenue par une méthode de production décrite ci-dessus, ou d’une capside obtenue par une méthode de production décrite ci-dessus, ou d’une capside directement obtenue par une méthode de production décrite ci-dessus, ou d’un vecteur tel que défini ci-dessus, ou d’une cellule hôte telle que définie ci-dessus, ou d’une nanoparticule telle que définie ci-dessus, ou d’une composition pharmaceutique et/ou vaccinale telle que définie ci-dessus, ou d’un mélange quelconque de ceux-ci, pour la fabrication d’un médicament et/ou d’un vaccin.

L’invention concerne également une méthode de prévention ou de traitement thérapeutique, comprenant l’administration d’une capside telle que définie ci-dessus, ou d’une capside susceptible d’être obtenue par une méthode de production décrite ci-dessus, ou d’une capside obtenue par une méthode de production décrite ci-dessus, ou d’une capside directement obtenue par une méthode de production décrite ci-dessus, ou d’un vecteur tel que défini ci-dessus, ou d’une cellule hôte telle que définie ci-dessus, ou d’une nanoparticule telle que définie ci-dessus, ou d’une composition pharmaceutique et/ou vaccinale telle que définie ci-dessus, ou d’un mélange quelconque de ceux-ci.

L’invention concerne également une capside telle que définie ci-dessus, ou une capside susceptible d’être obtenue par une méthode de production décrite ci-dessus, ou une capside obtenue par une méthode de production décrite ci-dessus, ou une capside directement obtenue par une méthode de production décrite ci-dessus, ou un vecteur tel que défini ci-dessus, ou une cellule hôte telle que définie ci-dessus, ou une nanoparticule telle que définie ci-dessus, ou une composition pharmaceutique et/ou vaccinale telle que définie ci-dessus, ou un mélange quelconque de ceux-ci, pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement d’une infection, telle qu’une infection virale ou bactérienne ; d’une maladie auto-immune ; d’une maladie métabolique ; d’une maladie dermatologique, d’une maladie cardio-vasculaire ; d’une maladie respiratoire ; d’une maladie neurodégénérative ; d’une maladie génétique ; d’une maladie hormonale ; d’une maladie psychiatrique ; d’un cancer ; d’une maladie liée à une infection et/ou à une toxine, telles qu’une maladie liée à une infection virale ou bactérienne et/ou liée à une exposition à une toxine.

L’invention concerne également une composition pharmaceutique et/ou vaccinale comprenant au moins une capside telle que définie ci-dessus, ou au moins une capside susceptible d’être obtenue par une méthode de production décrite ci-dessus, ou au moins une capside obtenue par une méthode de production décrite ci-dessus, ou au moins une capside directement obtenue par une méthode de production décrite ci-dessus, ou au moins un vecteur tel que défini ci-dessus, ou au moins une cellule hôte telle que définie ci-dessus, ou au moins une nanoparticule telle que définie ci-dessus, ou un mélange quelconque de ceux-ci, pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement d’une infection, telle qu’une infection virale ou bactérienne ; d’une maladie auto-immune ; d’une maladie métabolique ; d’une maladie dermatologique, d’une maladie cardio-vasculaire ; d’une maladie respiratoire ; d’une maladie neurodégénérative ; d’une maladie génétique ; d’une maladie hormonale ; d’une maladie psychiatrique ; d’un cancer ; d’une maladie liée à une infection et/ou à une toxine, telles qu’une maladie liée à une infection virale ou bactérienne et/ou liée à une exposition à une toxine.

Les exemples qui suivent visent à illustrer la présente invention.

Exemples

Exemple 1 : Construction de protéines pb10 du phage T5 fusionnées avec l’ovalbumine et démonstration de leurs propriétés de décoration de la capside vide du phage T5

1.1. Production de protéines « chimères » : Protéine pb10 entière fusionnée à une protéine d’intérêt ou Domaine N-terminal de pb10 fusionné à une protéine d’intérêt : Antigène Ovalbumine

L’exemple montré ici est celui des protéines pb10 fusionnées avec l’ovalbumine (Ova ; MM=42, 8 kDa) utilisé comme antigène modèle dans les tests de vaccination. Il décrit la production de protéines « chimères » constituées de la protéine pb10 entière fusionnée à une protéine d’intérêt ou seulement du domaine N-terminal de pb10 fusionné à une protéine d’intérêt qui remplace le domaine C-terminal.

La production des protéines chimères est faite comme suit :

-Expression des gènes pb10-OVAH6 (PO) et pb10N-Ter-OVAH6 (PNO), clonés dans pET28b, a été effectuée dans la soucheE scherichia coliBL21(DE3).

-Culture des bactéries transformées en milieu LB (Luria Broth), supplémenté en Kanamycine (50µg/mL) jusqu’à une DO600nm de 0,8.

-Induction de l’expression des gènes PO et PNO par addition d’isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG 0,4mM) et poursuite de la culture pendant 2 heures.

-Cassage des culots bactériens, ultracentrifugation à 100 000 g, et récolte du surnageant.

1)Purification des protéines PO et PNO à partir de la fraction cytoplasmique (surnageant) en trois étapes:

1) purification sur colonne de Nickel en présence de 0,1% de LDAO (Dodecyldimethylaminoxid).

2) purification sur colonne échangeuse d’anions.

3) par chromatographie d’exclusion par la taille.

La pureté des protéines chimères PO et PNO est analysée par SDS-PAGE (Fractions éluées après chromatographie d’exclusion par la taille sur colonne Superdex75 HR10/300 (GE Healthcare)). Les résultats obtenus sont montrés sur laFigure 2.

NB : à l’issue de ces trois étapes le taux d’endotoxines est conforme aux exigences de vaccination (< 100 UE/mL).

1.2. Démonstration des propriétés de « décoration » des protéines chimères

1.2.1. Matériel et méthodes

Les protéines chimères produites selon l’exemple 1.1 ci-dessus ont été utilisées pour décorer des capsides vides du bactériophage T5. Les tests de décoration ont été faits en incubant pendant 10 minutes à 4°C les protéines PO et PNO purifiées avec des capsides produites selon la méthode décrite dans l’article Preux et al, 2013 et Vernhes et al, 2017, modifiée et optimisée comme suit :

i) Un nouveau mutant du phage T5 a été construit pour la production des capsides vides - T5stAmN5-∆dec - qui résulte de la délétion du gène codant pour la protéine de décoration pb10 dans le phage T5stAmN5 décrit dans les publications Preux et al., 2013 et Zivanovic 2014. Ce mutant permet de garantir l’absence totale de décoration au cours de la purification des capsides et avant l’addition des protéines chimères purifiées (données non montrées).

ii) Deux détergents sont utilisés successivement au cours des étapes de purification des capsides. Le n-Octyl-β-D-Glucopyranoside (β-OG) et le Dodecyldimethylaminoxid (LDAO). Brièvement, les capsides récoltées dans le lysat bactérien résultant de l’infection d’une culture bactérienne de la souche E.coli F par le phage mutant T5anN5-∆dec, sont précipitées en présence de 0,5 M NaCl et 8% de PEG 6000, centrifugées, resuspendues dans une solution tampon Tris 50 mM, pH 7.6 contenant NaCl 200 à 400 mM. Après une première étape de purification par sédimentation de vitesse sur un gradient de glycérol, les fractions contenant les capsides sont incubées pendant 6 à 12 heures en présence de 1% de β-OG, avant d’être injectées sur une colonne échangeuse d’anions. Deux étapes de purification successives sont effectuées sur cette colonne. Lors de la première étape le tampon d’équilibration et le tampon d’élution contiennent 0,2 à 0,05 % de LDAO. Les fractions contenant les capsides sont soumises à une nouvelle purification par échange d’anions en absence de détergents. Ce protocole permet d’éliminer une très grande partie des endotoxines contaminantes et de respecter (ne pas dépasser) les taux d’endotoxines tolérés pour les injections de capsides chez la souris (comme le montre laFigure 2).

Deux méthodes permettent de révéler les propriétés de fixation des protéines PO et PNO sur les capsides pures : 1) Une approche biochimique par électrophorèse native sur gel d’agarose, méthode qui permet de visualiser la décoration complète des capsides par un effet de retard sur gel (Figure 3). 2) La résonance plasmonique de surface (SPR, Surface Plasmon Resonance), méthode qui permet de déterminer les constantes cinétiques d’association et de dissociation des protéines chimères sur les capsides vides et de calculer une constante d’affinité (Figure 4). Ces deux techniques ont été décrites dans l’article Vernhes et al, Scientific Reports 2017).

1.2. 2 . Analyse de la décoration par électrophorèse native sur gel d’agarose

LaFigure 3montre les résultats des essais de décoration de capsides vides pures avec les protéines pb10, PO et PNO. Les concentrations respectives des différentes protéines de décoration et des capsides ont été ajustées pour obtenir des rapports de concentration [protéine]/[sites de fixation sur la capside] = 1 +/- 0,1.

La migration des capsides décorées [1] est retardée par rapport aux capsides non décorées [0]. La Figure 3 montre que les capsides sont entièrement décorées avec les mêmes concentrations de protéines pb10, PO et PNO. Ce premier test indique que l’affinité des protéines PO et PNO pour les capsides est comparable à celle de la protéine native pb10.

1.2.3. Mesure de l’affinité des protéines de décoration par SPR

LaFigure 4montre que les protéines chimères PO et PNO ont la même affinité que la protéine de décoration pb10 pour les capsides vides de phage T5. La fusion de l’antigène complet ovalbumine à l’extrémité C-terminale de de la protéine pb10 entière ou bien à l’extrémité C-terminale du seul domaine pb10N-Ter n’affecte donc pas la forte affinité de la protéine de décoration pour les capsides.

1.2.4. Conclusion

La capside de T5 constitue donc une nanoparticule d’origine biologique pouvant exposer à sa surface 120 copies d’une protéine dont la fonction peut varier en fonction de la nature du peptide ou de la protéine qui est fusionné(e) à la protéine de décoration.

1.3. Production de protéines « chimères » : Protéine pb10 entière fusionnée à une protéine d’intérêt ou Domaine N-terminal de pb10 fusionné à une protéine d’intérêt  : Protéine fluorescente mCHERRY

Un deuxième exemple de modification de la protéine de décoration a été étudié. Les protéines chimères fusionnées avec la protéine fluorescente mCHERRY (28,9kda) pb10-mCHERRYH6 (SEQ ID NO :14) et pb10N-Ter -mCHERRYH6 (SEQ ID NO :15) ont été construites et leurs propriétés de décoration ont été testées. Les résultats, montrés par laFigure 5, confirment qu’il est possible de fusionner une seconde protéine de grande taille à l’extrémité C-terminale de pb10 ou de son domaine Nter sans affecter les propriétés de fixation à la capside. Cette protéine de décoration peut être utilisée pour décorer les capsides de phages entiers. Cela permet notamment des applications en microscopie de fluorescence.

1.4. Développement d’un système de production des capsides indépendant du phage T5

La méthode de production des capsides vides, qui a été utilisée au début de cette étude, repose sur l’infection d’une culture bactérienne par un phage T5 mutant, ce qui impose la production d’un stock important de ce phage, en amont de la production des capsides. De plus, lors de l’infection, on observe une forte fréquence de réversion du phage au génotype sauvage, ce qui diminue le rendement en capsides vides. Pour s’affranchir de ces contraintes et dans la perspective d’augmenter l’échelle de production des capsides, les Inventeurs ont développé un système de production et de décoration des capsides totalement indépendant du bactériophage T5.

Les 4 gènes de capside codant pour la protéine portale pb7, la protéine de décoration pb10, la protéase de maturation pb11 et la protéine majeure de capside pb8 ont été clonés dans un vecteur pET28b, tels qu’ils sont organisés dans le génome de T5 (pETcapT5;Figure 6). Leur expression, sous contrôle d’un promoteur T7, est réprimée en présence de glucose et inductible par l’IPTG, ce qui permet de contrôler l’expression basale de la protéase qui est toxique pour la souche d’expression E. coli. Une deuxième version de ce plasmide (pETcapT5∆dec;Figure 7) dans laquelle le gène de la protéine pb10 a été délété a également été construite. Les séquences des opérons tels qu’insérés dans ces plasmides, ainsi que celles des plasmides obtenus sont les suivantes :

Opéron (insert) capT5 :SEQ ID NO: 10 ; Opéron (insert) capT5∆dec : SEQ ID NO: 11 ; pETcapT5 : SEQ ID NO: 12 ; pETcapT5∆dec : SEQ ID NO: 13.

La purification des capsides produites à partir des plasmides a été effectuée selon les protocoles déjà décrits pour les capsides produites à partir des phages mutants, avec quelques variations. En particulier les capsides récoltées après la première étape de purification sur gradient de glycérol ont été centrifugées pendant 20 à 30 minutes à 60 000g. Cette étape d’ultracentrifugation permet de concentrer les capsides et d’éliminer une part importante des protéines solubles et ADN contaminants, avant les étapes de chromatographie par échange d’anions.

Les résultats démontrent que l’expression, chez la bactérie E. coli, des gènes de capside à partir de ces plasmides conduit à l’autoassemblage de capsides dont la morphologie est similaire à celle des capsides produites par le phage puis expansées in vitro (Figure 8 A). La capacité de ces capsides recombinantes à fixer la protéine de décoration a été évaluée par une approche biochimique utilisant des gels d’agarose natif, qui donne une estimation de l’affinité de pb10 pour ses sites de fixation (Figure 8 B). Les essais de fixation sur les deux populations de capsides ont été effectués avec la protéine pb10 purifiée. Les capsides qui ont été assemblées en absence de pb10 montrent des propriétés de décoration comparables à celles des capsides produites à partir du phage. Les capsides produites en présence de la protéine de décoration pb10 ont une mobilité électrophorétique comparable à celles des capsides totalement décorées, et leur migration sur le gel n’est pas modifiée par l’addition de pb10. Ce résultat montre qu’elles ont été décorées in situ, au cours de leur assemblage et leur incapacité à fixer la protéine de décoration si elle est ajoutée après leur purification, et que tous les sites de fixation sont saturés lors de l’assemblage (efficacité optimale). La présence de pb10 sur ces capsides a été vérifiée par Western Blot à l’aide d’anticorps polyclonaux dirigés contre pb10 (Figure 9).

1.5. Observations

Ces données démontrent les propriétés d’autoassemblage des capsides vides à partir de l’expression ectopique des gènes de capsides, en dehors du cycle viral du phage T5. Ces données se distinguent notamment des résultats publiés antérieurement (Huet et al., 2016) au moins par:

i) la toxicité de la protéase peut être contrôlée, avant l’induction à l’IPTG, par répression de l’expression basale des gènes de capsides en présence de 0,2% à 0,5% de glucose, ce qui augmente significativement le rendement en capsides ;

ii) les capsides produites avec le plasmide pETcapT5Δpb10 sont obtenues dans leur conformation expansée et celles produites à partir du plasmide pETcapT5 sont obtenues dans leur conformation expansée et totalement décorée.

Ces capsides de T5 recombinantes peuvent donc être décorées de deux façons différentes: i) par addition in vitro de la protéine de décoration purifiée. ii) par co-production in vivo de la protéine de décoration avec les protéines formant la capside. Ces deux méthodes permettent la production simplifiée de nanoparticules fonctionnalisables et permettent de les produire à plus grande échelle, par rapport à la production qui utilise les phages T5.

Exemple 2 : Expériences de vaccination de souris (in vivo)

Les résultats obtenus dans les expériences in vivo ont été générés en utilisant des préparations de capsides de phages et de protéines recombinantes produites par le groupe de Pascale Boulanger (PB). La contamination en endotoxines des préparations a été testée par le groupe de Karim Benihoud (KB).

2.1. EXPÉRIENCE 1 :

Objectif: comparer les réponses immunitaires induites par les protéines recombinantes pb10-OvaH6 (PO) et Pb10Nterm-OvaH6 (PNO) selon qu’elles sont associées ou non avec des capsides purifiées de phage T5 (C).

Tableau 1 : Plan d’expérience Expérience 1

Groupes	Protéines	Capsides	Adjuvant complet de Freund (ACF)
PO	PO	-	-
PO + C	PO	+	-
PNO	PNO	-	-
PNO + C	PNO	+	-
PO + ACF	PO	-	+

Légende : pb10-OvaH6 = PO ; pb10Nterm-OvaH6 =PNO ; capside purifiée de phage T5 = C

2.2. EXPÉRIENCE 2 :

Objectif: comparer les réponses immunitaires induites par les protéines recombinantes pb10-Ova (PO) et pb10Nterm-Ova (PNO) selon qu’elles sont associées ou non avec des capsides purifiées de phage T5.

Tableau 2 : Plan d’expérience Expérience 2

Groupes	Protéines	Capsides	Adjuvant complet de Freund (ACF)
PO	PO	-	-
PO + C	PO	+	-
PNO	PNO	-	-
PNO + C	PNO	+	-
PO + ACF	PO	-	+

Dans cette expérience, la contamination en endotoxines des préparations de capsides purifiées et des protéines recombinantes a été testée.

2.3. EXPÉRIENCE 3 :

Objectif: comparer les réponses immunitaires induites par la protéine recombinante Pb10Nterm-OvaH6 (PNO)) selon qu’elle est associée ou non avec des capsides purifiées de phage T5.

Tableau 3 : Plan d’expérience Expérience 3

Groupes	Protéine	Capsides	Adjuvant complet de Freund (ACF)
PNO	PNO	-	-
PNO+C	PNO	+	-
PNO +ACF	PNO	-	+

Dans cette expérience, la contamination en endotoxines des préparations de capsides purifiées et des protéines recombinantes a été testée.

2.4. Matériels et Méthodes

2.4.1. Détermination de la teneur en endotoxines

Les niveaux d’endotoxine dans les préparations protéiques et les capsides utilisées pour les expériences in vivo ont été quantifiés à l’aide du LAL Chromogenic Endotoxin Quantitation Kit (Pierce LAL) selon les instructions du fabricant (Thermo Scientific).

2.4.2. Immunisation des souris

Des souris C57BL/6 femelles âgées de six semaines ont été fournies par Janvier (Le Genest Saint Isle, France). Toutes les souris ont été conditionnées pendant au moins une semaine dans nos installations pour animaux avant le début des expériences. Toutes les expériences sur animaux ont été approuvées (numéro d'autorisation 19055-2019021108472030) par le Comité d'éthique n°26 (officiellement reconnu par le ministère français de la Recherche) conformément à la directive européenne 2010/63 UE et à sa transposition en droit français.

Des protéines pn10 fusion recombinantes (3,6 µM) avec ou sans capside (32 nM) ont été injectées par voie sous-cutanée dans un volume de 50 µl de tampon PBS. Dans certaines expériences, un groupe témoin a reçu une injection de pb10-Ova (3,6 µM) mélangé avec un adjuvant complet de Freund (FCA, Sigma). Des conditions similaires ont été utilisées lors des ré-administrations (deuxième injection), à l'exception du groupe témoin pour lequel l’adjuvant complet de Freund a été remplacé par l’adjuvant de Freund incomplet (IFA, Sigma). Des échantillons de sang ont été prélevés dans la veine sous-maxillaire à différents temps après administration des préparations vaccinales. Les sérums ont été préparés et analysés pour déterminer la présence d'anticorps spécifiques par ELISA, comme décrit ci-dessous. Les rates ont été recueillies 10 jours après la deuxième injection pour mesurer les réponses immunitaires cellulaires.

2.4.3. Mesure des réponses anticorps

L’ovalbumine (1 µg, Sigma) a été immobilisée sur des plaques à 96 puits (Nunc). Après lavage en tampon TBST et saturation avec du TBS-Tween à 5% de lait, des dilutions en série des sérums dans du TBST 5% lait ont été ajoutées. Les anticorps liés ont été détectés avec des anticorps de chèvre spécifiques des IgG ou des isotypes (IgG1, IgG2b, IgG2c, IgG3 ou IgM) de souris conjugués à la peroxydase (Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL). L'activité peroxydase a été révélée par incubation avec le substrat dichlorhydrate de O-phénylènediamine (Sigma – Aldrich) pendant 30 min. La réaction a été arrêtée par addition d’HCl 3N et des lectures spectrophotométriques ont été effectuées à 490 nm. Les titres ont été définis comme étant l'inverse de la dilution la plus élevée donnant une DO490 deux fois supérieure aux valeurs de bruit fond. Un protocole similaire a été utilisé pour mesurer les Ac spécifiques de capside ou de pb10.

2.4.4. Mesure des réponses immunitaires cellulaires

Les rates ont été broyées dans du milieu RPMI complémenté de 10% sérum de veau fœtal et du bmercaptoéthanol-10-5 M, puis filtrées sur un tamis de 100 µm. Après élimination des globules rouges par le tampon de lyse ACK (Invitrogen, Cergy Pontoise, France), les cellules ont été remises en suspension et la concentration a été ajustée à 2,5 × 106 cellules / mL. Les splénocytes ont ensuite été restimulés dans différentes conditions (milieu seul, peptide Ova257-264 (5 µg / ml), dans un volume de 200 µl pendant un jour (ELISPOT) ou pendant trois jours (ELISA). Pour les ELISPOT, les plaques ont été révélées selon les indications du fournisseur (Diaclone). Le nombre de spots de cellules productrices d’IFNγ a été compté à l’aide de l’ImmunoSpot® S6 FluoroSpot (CTL, Cleveland, Ohio). Pour le test ELISA, la concentration d’IFNγ dans les surnageants a été déterminée en utilisant un kit de dosage de l’IFNγ (eBioscience). Une re-stimulation avec de l'ionomycine (1 µM) et du Phorbol myristate acétate (0,1 µM) a été utilisée pour contrôler la qualité des préparations de splénocytes.

2.5. Résultats

Les résultats sont présentés dans le Tableau 4 ci-dessous, présentant les données de mesures de concentration en endotoxines, la Figure 10 (cinétique de la réponse anticorps anti-Ova induite par les protéines fusion pb10) ; la Figure 11 (caractérisation de la nature des anticorps induits par les protéines pb10 fusion) ; la Figure 12 (analyse des réponses cellulaires induites par les protéines pb10 fusion avec l’Ova) ; et la Figure 13 (analyse des réponses cellulaires induites par la protéine PNO).

Tableau 4 : Concentration en endotoxines des Expériences 1 à 3

Concentration en endotoxines	Capsides	PO	PNO
EXPERIENCE 1	> 200 EU/ml	42 EU/ml	108 EU/ml
EXPERIENCE 2	64,4 EU/ml	14 EU/ml	13,7 EU/ml
EXPERIENCE 3	23,6 EU/ml (2,8 EU/100 µg)	-	18,5 EU/ml (9,3 EU/100µg)

Résultats issus de l’expérience 2

Les données de la Figure 10 montrent que :

- Les protéines PO et PNO injectées seules induisent un faible niveau de production d’anticorps anti-Ova (IgG)

- Les protéines PO et PNO injectées avec des capsides purifiées de phage T5 induisent de fortes réponses Ac avec un plateau atteint au jour 28 après l’administration des préparations vaccinales. Cette réponse est durable puisque les Ac anti-Ova sont détectés encore à fort taux 192 jours après l’administration de PO ou PNO associées avec des capsides purifiées.

- La cinétique des réponses Ac anti-Ova (IgG Totaux) dans les groupes injectés avec PO ou PNO plus capsides est comparable à celle obtenue lorsque l’on co-injecte les souris avec PO + ACF (contrôle positif de réponse).

- La co-administration des protéines fusion pb10 avec des capsides purifiées de phage T5 induit une réponse Ac anti-Ova de longue durée tout à fait comparable à celle obtenue avec un adjuvant standard, l’ACF (Adjuvant Complet de Freund).

Les données de la Figure 11 montrent :

- Production très importante d’Ac anti-Ova de type IgG1, IgG2b, IgG2c et IgG3 dans les groupes de souris injectées avec PO +C ou PNO +C, comparativement aux groupes PO ou PNO seules.

- Pas de différence dans les isotypes produits entre les groupes PO +C et PNO +C ce qui suggère que la partie N-terminale de pb10 seule est suffisante et que la présence d’une protéine pb10 entière dans n’est pas nécessaire pour la production d’Ac anti-Ova.

- Comparativement au groupe PO + ACF, les groupes PO +C et PNO +C produisent moins d’Ac anti-Ova de type IgG1 mais produisent plus d’Ac de type IgG3. Il n’y a pas de différence signification pour les Ac anti-Ova d’isotype IgG2b et IgG2c (pour IgG2c il y a une tendance à une augmentation).

- L’administration des protéines PO ou PNO avec des capsides purifiées conduit à une réponse Ac anti-Ova présentant un large profil isotypique. Cependant, comparativement à l’ACF, on observe un biais significatif en faveur des IgG3 (isotype activateur du complément) et une réduction significative des IgG1.

Les données de la Figure 12 montrent que :

- Le test de restimulation des splénocytes par le peptide immunodominant Ova257-264 montre un plus grand nombre de splénocytes producteurs d’IFNγ pour les souris injectées par PO +C ou PNO +C comparativement aux souris injectées par PO ou PNO seules. Ces résultats démontrent que les souris vaccinées avec les protéines fusion + capsides ont une réponse T anti-Ova plus importante. Comme la restimulation a été réalisée avec un épitope T de classe I ceci démontre qu’il y a chez ces souris une plus forte production de lymphocytes T CD8+ spécifiques de l’ovalbumine et qu’ils sont fonctionnels (production d’IFNγ).

- Le nombre de splénocytes producteurs d’IFNγ n’est pas significativement différent entre les groupes PO +C et PNO +C suggérant que la protéine pb10 fusion ne doit pas nécessairement contenir toute la séquence de pb10.

Les protéines pb10 fusion co-administrées avec les capsides purifiées de phages induisent chez la souris de fortes réponses cellulaires.

Résultats issus de l’expérience 3

Les données de la Figure 13 montrent que :

- Le test de restimulation des splénocytes par le peptide immunodominant Ova257-264 montre un plus grand nombre de splénocytes producteurs d’IFNγ pour les souris injectées par PNO + C comparativement aux souris injectées par PNO seules (figure 4a).

- De même le test de restimulation montre une plus forte production d’IFNγ dans les surnageants de splénocytes issus de souris injectées par PNO +C (figure 4B)

- Le nombre de splénocytes producteurs d’IFNγ ou la quantité d’IFNγ produite dans le surnageant est supérieur à ceux retrouvés avec les splénocytes de souris injectées avec PNO + ACF.

Les résultats montrent que la protéine PNO induit une réponse cellulaire anti-Ova significativement plus importante lorsqu’elle est associée à des capsides purifiées. Cette réponse est également plus importante que celle obtenue lorsqu’on coadministre cette protéine avec l’adjuvant ACF.

Claims (18)

1. Capside de phage T5 dépourvue d’ADN génomique dudit phage et exposant, à sa surface, au moins une protéine de fusion, ladite protéine de fusion comprenant :
   - au moins un fragment de peptide ou de protéine ayant au moins 80% d’identité avec un fragment d’une protéine de décoration pb10, de préférence au moins 85% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité ; ledit fragment d’une protéine de décoration pb10 comprenant de préférence au moins 80 acides aminés consécutifs d’une protéine pb10 ; et
   - au moins un fragment fonctionnel d’un antigène, ou au moins un fragment fonctionnel d’une toxine, ou au moins un fragment de récepteur, ou au moins un fragment fonctionnel d’un signal d’adressage ou de ciblage ou de transport, ou au moins un fragment fonctionnel d’une enzyme, ou au moins un fragment fonctionnel d’une hormone, ou au moins un fragment fonctionnel d’un anticorps, ou au moins un antigène, ou au moins une toxine, ou au moins un récepteur, ou au moins un signal d’adressage ou de ciblage ou de transport, ou au moins une enzyme, ou au moins une hormone, ou au moins un anticorps, ou une combinaison quelconque de ceux-ci, de préférence au moins un fragment fonctionnel d’antigène, de préférence encore au moins un antigène.
2. Capside selon la revendication 1, caractérisée en ce que le fragment de la protéine de décoration pb10 est choisi parmi :
   i) un fragment de peptide ou de protéine ayant au moins 80% d’identité avec une portion du domaine N-terminal d’une protéine pb10, de préférence au moins 85% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité ; ladite portion comprenant de préférence au moins 80 acides aminés consécutifs du domaine N-terminal d’une protéine pb10 ;
   ii) un fragment de peptide ou de protéine ayant au moins 80% d’identité avec le domaine N-terminal d’une protéine pb10, de préférence au moins 85% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité ; ledit domaine N-terminal d’une protéine pb10 comprenant de préférence les acides aminés inclus entre les positions 1 et 80 ;
   iii) un fragment ou un peptide d’une protéine comprenant une séquence d’acides aminés ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO :1, de préférence au moins 85% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité avec la séquence SEQ ID NO :1; ledit fragment ou peptide comprenant de préférence au moins 80 acides aminés consécutifs de ladite protéine ;
   iv) un fragment ou un peptide d’une protéine consistant en une séquence d’acides aminés ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 1, de préférence au moins 85% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 1; ledit fragment ou peptide comprenant de préférence au moins 80 acides aminés consécutifs de ladite protéine ;
   v) un peptide comprenant une séquence d’acides aminés ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 3, de préférence au moins 85% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 3 ; et
   vi) un peptide consistant en une séquence d’acides aminés ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 3, de préférence au moins 85% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 3.
3. Capside selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu’elle comprend en outre (i) au moins une copie d’une protéine ayant au moins 80% d’identité avec une protéine de capside pb8 ; ou (ii) au moins une copie d’une protéine ayant au moins 80% d’identité avec une protéine portale pb7 ; ou (iii) au moins une copie d’une protéine ayant au moins 80% d’identité avec une protéase pb11 ; ou (iv) une combinaison quelconque de (i) à (iii).
4. Capside selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu’elle est sous forme mature expansée.
5. Méthode de production d’une capside selon l’une quelconque des revendications précédentes, comprenant les étapes suivantes :
   a) production d’une capside de phage T5 dépourvue d’ADN génomique et dépourvue de protéine pb10 ;
   b) mise en contact de la capside de l’étape a) avec une protéine de fusion telle que définie dans l’une quelconque des revendications précédentes, afin d’obtenir une capside décorée ; et
   c) Optionnellement, purification de la capside décorée de l’étape b) à l’aide d’un détergent neutre, de préférence choisi parmi le n-Octyl-β-D-Glucopyranoside (β-OG) et le Dodecyldimethylaminoxid (LDAO).
6. Méthode selon la revendication 5, dans laquelle la capside de l’étape a) est obtenue par une méthode comprenant les étapes suivantes :
   a-1) obtention d’un vecteur comprenant :
   (i)au moins un gène codant pour une protéine ayant au moins 80% d’identité avec une protéine de capside pb8 ;
   (ii)au moins un gène codant pour une protéine ayant au moins 80% d’identité avec une protéine portale pb7 ; et
   (iii)au moins un gène codant pour une protéine ayant au moins 80% d’identité avec une protéase pb11 ;
   dans lequel les gènes (i) à (iii) sont placés sous le contrôle d’un promoteur inductible ; de préférence dans lequel les gènes (i) à (iii) sont organisés au sein d’un unique opéron ;
   de préférence dans lequel les gènes (i) à (iii) sont ordonnés conformément au génome du phage T5 ; et
   a-2) expression du vecteur de l’étape a-1) par une bactérie, de préférence une bactérie de la famille desEnterobacteriaceae, de préférence encore une bactérie du genreEscherichia, de préférence encore une bactérieEscherichia coli ; afin d’obtenir une capside de phage T5 dépourvue d’ADN génomique et dépourvue de protéine pb10 ; et
   a-3) Optionnellement, purification de la capside de l’étape a-2) à l’aide d’un détergent neutre, de préférence choisi parmi le n-Octyl-β-D-Glucopyranoside (β-OG) et le Dodecyldimethylaminoxid (LDAO).
7. Méthode de production d’une capside selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, comprenant les étapes suivantes :
   a) obtention d’un vecteur comprenant :
   (i)au moins un gène codant pour une protéine ayant au moins 80% d’identité avec une protéine de capside pb8 ;
   (ii)au moins un gène codant pour une protéine ayant au moins 80% d’identité avec une protéine portale pb7 ;
   (iii)au moins un gène codant pour une protéine ayant au moins 80% d’identité avec une protéase pb11 ; et
   (iv)au moins un gène codant une protéine de fusion telle que définie dans l’une quelconque des revendications 1 à 4 ;
   dans lequel les gènes (i) à (iv) sont placés sous le contrôle d’un promoteur inductible ; de préférence dans lequel les gènes (i) à (iv) sont organisés au sein d’un unique opéron ;
   de préférence dans lequel les gènes (i) à (iii) sont ordonnés conformément au génome du phage T5, et le gène (iv) codant la protéine de fusion occupe le locus du gène codant la protéine pb10 dans ledit génome ;
   b) expression du vecteur de l’étape a) par une bactérie, de préférence une bactérie de la famille desEnterobacteriaceae, de préférence encore une bactérie du genreEscherichia, de préférence encore une bactérieEscherichia coli ; afin d’obtenir une capside de phage T5 dépourvue d’ADN génomique et exposant, à sa surface, au moins une copie de la protéine de fusion ; et
   c) Optionnellement, purification de la capside décorée de l’étape b) à l’aide d’un détergent neutre, de préférence choisi parmi le n-Octyl-β-D-Glucopyranoside (β-OG) et le Dodecyldimethylaminoxid (LDAO).
8. Vecteur tel que défini dans la revendication 7, comprenant :
   (i)au moins un gène codant pour une protéine ayant au moins 80% d’identité avec une protéine de capside pb8 ;
   (ii)au moins un gène codant pour une protéine ayant au moins 80% d’identité avec une protéine portale pb7 ;
   (iii)au moins un gène codant pour une protéine ayant au moins 80% d’identité avec une protéase pb11 ; et
   (iv)au moins un gène codant une protéine de fusion telle que définie dans l’une quelconque des revendications 1 à 4 ;
   dans lequel les gènes (i) à (iv) sont placés sous le contrôle d’un promoteur inductible ; de préférence dans lequel les gènes (i) à (iv) sont organisés au sein d’un unique opéron ;
   de préférence dans lequel les gènes (i) à (iii) sont ordonnés conformément au génome du phage T5, et le gène (iv) codant la protéine de fusion occupe le locus du gène codant la protéine pb10 dans ledit génome ;
   de préférence dans lequel le promoteur est un promoteur T7 ; de préférence dans lequel le vecteur est un vecteur d’expression, de préférence un vecteur d’expression bactérien, de préférence un plasmide d’expression bactérien, de préférence un plasmide d’expression par l’ARN polymérase T7.
9. Cellule hôte comprenant au moins une capside selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, ou au moins une capside susceptible d’être obtenue par la méthode de production selon l’une quelconque des revendications 5 à 7, ou au moins un vecteur selon la revendication 8, ou un mélange quelconque de ceux-ci, ladite cellule hôte étant de préférence une bactérie, de préférence une bactérie de la famille desEnterobacteriaceae, de préférence encore une bactérie du genreEscherichia, de préférence encore une bactérieEscherichia coli.
10. Protéine de fusion telle que définie dans l’une quelconque des revendications précédentes.
11. Acide nucléique codant la protéine de fusion selon la revendication 10.
12. Nanoparticule comprenant au moins une capside selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, ou au moins une capside susceptible d’être obtenue par la méthode de production selon l’une quelconque des revendications 5 à 7, ou au moins un vecteur selon la revendication 8, ou au moins une cellule hôte selon la revendication 9, ou un mélange quelconque de ceux-ci.
13. Capside selon l’une quelconque des revendications 1 à 4 ou capside susceptible d’être obtenue par la méthode de production selon l’une quelconque des revendications 5 à 7, caractérisée en qu’elle est une nanoparticule.
14. Composition pharmaceutique comprenant au moins une capside selon l’une quelconque des revendications 1 à 4 et 13, ou au moins une capside susceptible d’être obtenue par la méthode de production selon l’une quelconque des revendications 5 à 7, ou au moins un vecteur selon la revendication 8, ou au moins une cellule hôte selon la revendication 9, ou au moins une nanoparticule selon la revendication 12, ou un mélange quelconque de ceux-ci.
15. Capside selon l’une quelconque des revendications 1 à 4 et 13, ou capside susceptible d’être obtenue par la méthode de production selon l’une quelconque des revendications 5 à 7, ou vecteur selon la revendication 8, ou cellule hôte selon la revendication 9, ou nanoparticule selon la revendication 12, ou composition pharmaceutique selon la revendication 14, pour son utilisation comme médicament et/ou comme vaccin.
16. Capside selon l’une quelconque des revendications 1 à 4 et 13, ou capside susceptible d’être obtenue par la méthode de production selon l’une quelconque des revendications 5 à 7, ou vecteur selon la revendication 8, ou cellule hôte selon la revendication 9, ou nanoparticule selon la revendication 12, ou composition pharmaceutique selon la revendication 14, pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement d’une infection, telle qu’une infection virale ou bactérienne ; d’une maladie auto-immune ; d’une maladie métabolique ; d’une maladie dermatologique, d’une maladie cardio-vasculaire ; d’une maladie respiratoire ; d’une maladie neurodégénérative ; d’une maladie génétique ; d’une maladie hormonale ; d’une maladie psychiatrique ; d’un cancer ; d’une maladie liée à une infection et/ou à une toxine, telles qu’une maladie liée à une infection virale ou bactérienne et/ou liée à une exposition à une toxine.
17. Utilisationin vitrode la capside selon l’une quelconque des revendications 1 à 4 et 13, ou de la capside susceptible d’être obtenue par la méthode de production selon l’une quelconque des revendications 5 à 7, ou du vecteur selon la revendication 8, comme nanoparticule.
18. Capside obtenue par la méthode de production selon l’une quelconque des revendications 5 à 7.