EP4031668A1 - Production et fonctionnalisation de nanoparticules dérivées du phage t5 et utilisations thérapeutiques - Google Patents

Production et fonctionnalisation de nanoparticules dérivées du phage t5 et utilisations thérapeutiques

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Publication number
EP4031668A1
EP4031668A1 EP20785815.0A EP20785815A EP4031668A1 EP 4031668 A1 EP4031668 A1 EP 4031668A1 EP 20785815 A EP20785815 A EP 20785815A EP 4031668 A1 EP4031668 A1 EP 4031668A1
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EP
European Patent Office
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identity
protein
capsid
fragment
phage
Prior art date
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Pending
Application number
EP20785815.0A
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German (de)
English (en)
Inventor
Pascale BOULANGER
Emeline VERNHES
Nicolas DUCROT
Linda LARBI CHERIF
Karim Benihoud
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite Paris Saclay
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite Paris Saclay
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Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Universite Paris Saclay filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
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Pending legal-status Critical Current

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    • C12N2795/10042—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector virus or viral particle as vehicle, e.g. encapsulating small organic molecule

Definitions

  • the present invention lies in the field of bacterial virology, biochemistry and virotherapy. It relates to T5 phage capsids lacking genomic DNA of said phage and exhibiting, on their surface, at least one fusion protein of interest, in particular of therapeutic interest.
  • the present invention also relates to methods of producing such a capsid and to vectors for their production.
  • the invention further relates to the fusion proteins of interest displayed on the capsid and the nucleic acids encoding them.
  • the invention also relates to nanoparticles comprising these functionalized capsids, pharmaceutical compositions comprising these nanoparticles and / or these functionalized capsids, as well as their therapeutic uses, in particular as a medicament and / or as a vaccine.
  • Phages are bacterial viruses, ubiquitous throughout the biosphere.
  • the largest family of bacterial viruses includes caudate bacteriophages, made up of an icosahedral capsid containing the viral genome, which is a double-stranded DNA molecule, and a tail allowing injection of the genome into the host cell.
  • the icosahedral capsids of these viruses are extremely stable macromolecular assemblies which often expose so-called “decoration” proteins on their surface. These proteins can be genetically modified to produce viruses carrying chimeric proteins, formed from the native protein fused to a functional protein of therapeutic or biotechnological interest (Tao et al. 2013; Razazan et al. 2018).
  • the approach developed so far to obtain viruses or only their capsid decorated with chimeric proteins consists in modifying the decoration protein in the genome of the virus or in a plasmid and then in producing viral particles from the infection of their host bacteria.
  • the viral genome is integrated into the particles and capsids thus produced, thus limiting their therapeutic and biotechnological applications.
  • the particles thus produced can retain an infectious character, with a non-negligible risk of genetic mutations (which can in particular lead to a reversion to a wild phenotype).
  • genetic mutations present a problem for homogeneous productions on an industrial scale.
  • Bacteriophage T5 which infects the bacterium Escherichia coli, has a 90 nm diameter capsid that self-assembles through various structural states whose maturation follows a well-defined sequence of steps ( Figure 1).
  • An icosahedral procapsid is initially assembled from the major capsid protein pb8, the portal protein pb7 and the processing protease pb11.
  • the procapsid is matured by the protease pb11, which produces an empty capsid, ready to receive the viral genome.
  • DNA packaging is carried out by a molecular motor and this step is accompanied by a structural reorganization of the capsid protein subunits, causing the capsid to expand.
  • the monomeric decoration protein pb10 can then decorate the outer surface of the expanded mature form thus obtained, 120 copies thus being able to be exposed.
  • the structure of the decoration protein pb10 revealed a protein formed of two independent domains, an N-terminal domain binding to the capsid and an external C-terminal domain exposed to the solvent ( Figure 1C, Vernhes et al. 2017).
  • the affinity of chimeric decoration proteins, formed from the fusion of the decoration protein to a functional protein of therapeutic or biotechnological interest, at the capsid has not been studied.
  • the possibility of producing T5 capsids empty of viral genomic DNA, exposing a functionalized protein has to date not been explored.
  • the present invention makes it possible to meet these needs.
  • the present inventors have designed novel chimeric proteins, consisting of the entire pb10 protein fused to a protein of interest or only the N-terminal domain of pb10 fused to a protein of interest which replaces the C-terminal domain.
  • these proteins Modified, called fusion proteins, can be properly exposed to the surface of T5 phage capsids entirely devoid of genomic DNA, with high efficiency.
  • the data show in particular that, quite unexpectedly, the affinity of these modified proteins for the T5 phage capsids is identical to that of the native pb10 protein.
  • the empty capsid (devoid of genome) of T5 therefore constitutes a nanoparticle of biological origin, safe, capable of exposing on its surface 120 copies of a protein whose function may vary with the nature of the molecule of interest which is fused to decoration protein.
  • the Inventors have also shown, quite surprisingly, that it is possible to produce these functionalized empty capsids without going through the production of a mutant phage.
  • This is all the more advantageous and surprising as the protocol for producing DNA-free capsids has so far required a step of infection of a bacterial culture by a mutant phage.
  • this step requires the production of a large stock of phage, upstream of the production of the capsids.
  • the Inventors have developed a system for producing and decorating capsids that is completely independent of the T5 bacteriophage.
  • This system is based on the construction of recombinant plasmids carrying the genes encoding only the capsid proteins of bacteriophage T5. Thanks to this system, it is possible to produce either directly decorated and functional empty capsids, or expanded and undecorated empty capsids, which can be decorated in a second step, by simple contact with the fusion protein of interest. .
  • the inventors have therefore developed a simplified large-scale production method of recombinant capsids, devoid of genomic DNA, which can be decorated in two different ways: i) by addition in vitro of the purified decoration protein; ii) by in situ co-production of the decoration protein.
  • the inventors have also validated, for the first time, the potential of biotechnological applications (in particular therapeutic), empty capsids of T5 phages thus functionalized.
  • the data of the Inventors show that, quite surprisingly, the administration of these capsids functionalized by an antigen in model mice induces an effective immunization, with the significant induction of a humoral response (antibody) and of a cellular response. This immunization results in effective vaccination of these mice.
  • the Inventors have developed, quite surprisingly, empty T5 phage capsids, devoid of phage genomic DNA, exposing fusion proteins of interest on their surface.
  • These functionalized capsids can be produced on a large scale, by overcoming the viral cycle of phage T5, with high reproducibility.
  • these functionalized capsids are capable of exerting, in vivo, the functions and activities of the fusion protein of interest used.
  • the present invention therefore relates to a T5 phage capsid devoid of genomic DNA of said phage and exhibiting, at its surface, at least one fusion protein, comprising at least one peptide or protein fragment having at least 80% identity with a fragment of a pb10 decoration protein, as well as these production methods.
  • the invention relates in particular to a method for producing such a capsid, comprising obtaining a vector encoding proteins of the T5 phage capsid, as well as said vector.
  • the present invention also relates to the fusion proteins of interest displayed on the capsid and the nucleic acids encoding them.
  • the invention also relates to nanoparticles comprising these functionalized capsids, pharmaceutical compositions comprising these nanoparticles and / or these functionalized capsids, as well as their therapeutic uses, in particular as a medicament and / or as a vaccine.
  • Figure 1 shows the processing cycle of the T5 phage capsid.
  • prohead I which includes the dodecameric complex of the portal protein (pb7).
  • the protease (pb11) also located inside the prohead I performs the cleavage of the D-domain of the pb8p subunits but also of the 10 N-terminal amino acids of the portal and it self-proteolysis at its two ends to form prohead II.
  • the encapsidation of the genome by the terminase through the portal complex induces the expansion of the capsid and the attachment of the decoration protein (pb10) to the surface of the capsid.
  • the capsid is finally closed by a p144 "plug" protein which forms a connector with the portal.
  • Figure 2 shows the analysis of the purity of the PO and PNO chimeric proteins by SDS-PAGE - Fractions eluted after size exclusion chromatography on a Superdex75 HR10 / 300 column (GE Healthcare).
  • Figure 3 shows the attempts to decorate pure empty capsids with the proteins pb10, PO and PNO.
  • Figure 4 shows: A. Association and dissociation profiles of the proteins pb10, PO and PNO (resonance units, RU as a function of time) measured for increasing protein concentrations (0.312; 0.625; 1.25; 2.5 ). B. Affinity constants KD are calculated from the kinetic constants ka and kd for each of the proteins pb10, PO and PNO.
  • Figure 5 shows the SPR (Surface Plasmon Resonance) profiles of binding of the proteins pb10 H6, pb10-mCHERRYH6 and N-Ter pb10-mCHERRYH6 on empty capsids of phage T5 and the calculation of the affinity constants, from the kinetic constants measured by SPR.
  • SPR Surface Plasmon Resonance
  • Figure 6 shows a schematic representation of the vector pETcapT5 (of SEQ ID 12).
  • Figure 7 shows a schematic representation of the vector pETcapT5Adec (of SEQ ID 13).
  • FIG. 8 shows: A) Analysis by electronic cryo-microscopy of the capsids produced from the recombinant and purified plasmids. From left to right: control capsids produced from phage T5 mutated in the terminase gene, capsids produced from plasmids pETcapT5Apb10 and pETcapT5. B) Analysis on native agarose gel of the decoration of the capsids with the pb10 protein (protocol described in Vernhes et al.). The capsids were incubated with the pb10 protein at different ratios [number of copies of pb10] / [number of pb10 binding sites] (1/1, 2/1 or 4/1).
  • the saturation of the capsids with pb10 is obtained for the ratios 1/1 and 2/1 respectively for the “native” capsids produced from the mutant phage and for the capsids produced from the plasmid pETcapT5Adec.
  • the capsids produced from the pETcapT5 plasmid migrate to the position of the pb10-saturated capsids, indicating that they are fully decorated upon assembly in bacteria.
  • FIG. 9 shows the results of western blot showing the presence of pb10 on the capsids, revealed with polyclonal antibodies directed against pb10.
  • 1 purified capsids obtained from the plasmid pETcapT5Adec
  • 2 capsids obtained from the plasmid pETcapT5.
  • Figure 10 shows the kinetics of the anti-Ovalbumin (Ova) antibody response induced by the pb10 fusion proteins.
  • Mice were immunized subcutaneously with a dose of PO or PNO fusion proteins alone or in combination with purified phage capsids or complete Freund's adjuvant.
  • the total anti-Ova antibodies (IgG) were quantified by ELISA at various times after administration.
  • F Kinetics of the Ac response for each group (mean + standard deviation).
  • Figure 1 shows the characterization of the nature of the antibodies induced by the pb10 fusion proteins.
  • mice were immunized subcutaneously with a dose of PO or PNO fusion proteins alone or in combination with purified T5 phage capsids or complete Freund's adjuvant.
  • Figure 12 shows the analysis of the cellular responses induced by the pb10 fusion proteins with the Ova.
  • Figure 13 shows the analysis of cellular responses induced by the PNO protein.
  • phage or “bacteriophage” or “bacterial virus” is meant a virus infecting bacteria. Phages are ubiquitous throughout the biosphere. By the early 2000s, more than 5,000 different bacteriophages had been observed and described. The oldest described phages, those whose structure has been the most studied, generally consist of a protein shell or capsid (enveloping and protecting the central nucleic acid molecule), and a specialized apparatus with a complex structure. (the tail) through which the phage attaches itself to the host bacteria to inject its nucleic acid (genetic material, or genome) into it.
  • nucleic acid genetic material, or genome
  • phages with double-stranded DNA with tails (representing more than 95% of the phages described); tailless, cubic symmetry, single-stranded DNA phages; RNA phages; single-stranded filamentous phages.
  • Isometric (DNA) bacteriophages containing 12 to 14% of lipids in the form of a double layer located between the outer and inner shells of the viral capsid (phage PM2) have also been described.
  • the dimensions of the phages vary from 24 to 200 nm.
  • the genetic material is a double-stranded DNA molecule (this is the case for more than 95% of known phages), the length of the latter can vary from 5 to 650 kilobases (kbp).
  • phages with a tail are classified in the Caudovirales family (also called caudate phage or caudate virus).
  • the morphology of the tail allows this large family to be subdivided into 3 groups:
  • the Siphoviridae characterized by a long non-contractile tail, form the largest family (60% of caudate viruses; example: phage T5);
  • Myoviridae have long contractile tails, consisting of an outer tube that contracts around the rigid central tube when the virus is on the surface of its host bacteria.
  • the rigid tube then perforates the bacterial wall and creates a passage for phage DNA (example: phage T4);
  • Podoviridae have small, non-contractile tails, they incorporate in their capsid proteins which serve to package DNA in the capsid during virion formation and which are ejected into the host wall before ejection of the DNA (examples: phages T7 and P22).
  • Phages require a host bacteria to reproduce, into which they inject their genetic material. Once in the host bacterium, the viral genome is generally replicated and translated, by the host's enzymes and ribosomes (depending on the case, certain viral proteins may also be involved), to form numerous copies of the phage which are released with the lysis of the host bacterium: we speak of lytic cycle or production cycle.
  • the genetic material is replicated and integrates with the chromosome of the bacteria (or exists as a plasmid), but is not expressed to form virions.
  • the virus is then referred to as prophage, which is transmitted to the offspring of the infected bacteria (lysogenic line) and we speak of lysogeny or lysogenic cycle. In response to an induction (eg stress of the bacteria), the lysogenic infection switches to a lytic cycle.
  • phages can also be classified according to their replication cycle: phages known as “virulent phages”: they are strictly lytic; phages known as “temperate phages”, which can generate lytic infections or lysogenic infections; chronically infected phages, which do not cause lysis of the infected cell, but sprout at the bacterial membrane, without breaking it (chronic infection). This is the case with filamentous phages such as M13 or f1 of Escherichia coli.
  • Lytic phages can also be characterized by the presence of "lysis plaques". Infection of a bacterial cell by a single phage can cause it to lysis after 20 to 30 minutes with release of a few tens or even hundreds of phage particles. In the laboratory, each particle released in this way will infect a new bacterium and start the lytic cycle all over again. As a result of these cascade microscopic lyses, “lysis plaques” form in the bacterial mat on the surface of the agar plates, allowing the test results to be read with the naked eye. The size and appearance of these lysis plaques constitute a phenotype contributing to characterize the phages.
  • phage T5 is meant a virus belonging to the genus Tequintavirus (synonyms T5-like phages, T5-like viruses, T5likevirus), included in the family of Demerecviridae, itself belonging to the order of Caudovirales (also called viruses " caudates ”).
  • T5 belongs to the suborder Siphoviridae among the Caudovirales. It therefore has a long, non-contractile tail. It is a strictly lytic phage which infects in particular the bacterium Escherichia coli.
  • the T5 phage consists of an icosahedral capsid 90 nm in diameter, containing its genome (a double stranded DNA of 121,000 base pairs (121 kbp), as well as a 250 nm tail allowing it to recognize the bacteria. target and inject its genome into it.
  • the end of the tail ends in the shape of a cone at the end of which there is a specific binding protein for the T5 receptor.
  • This receptor is a protein of the bacterial outer membrane (FhuA in the T5, another membrane receptor for other Tequintaviruses)
  • the tail is also equipped with three long fibers attached to the base of the cone which interact with the sweet part of the lipopolysaccharides on the surface of the bacteria.
  • the genome of bacteriophage T5 can be divided into three parts, distributed as follows: approximately 8% of the total genome, at the end injected first. This part of the genome, called "Direct Terminal Repeat", is repeated in the same orientation on the other end of the DNA at position 92-100%. It encodes proteins involved in stopping bacterial replication / transcription / translation as well as the destruction of host DNA, as well as a deoxyribonucleotidase; from 8 to 67% of the genome, encoding early genes (expressed at the end of the injection of viral DNA). These genes code for proteins involved in DNA replication, nucleotide metabolism and cell lysis factors; 67-92% of the genome, mainly comprising late genes (expression from 12-13 minutes post-infection). These are mainly so-called “structural” genes, the encoded proteins of which are used for the assembly of new virions.
  • the capsid of bacteriophage T5 self-assembles through various structural states, the maturation of which follows a well-defined sequence of steps ( Figure 1).
  • An icosahedral procapsid is initially assembled, consisting of 775 copies of the major capsid protein pb8, organized into 11 pentamers forming 11 of the 12 vertices of the capsid, and 120 hexamers forming the faces.
  • the pb8 protein (51 kDa) is synthesized in the form of a precursor including a D-domain, corresponding to the 159 N-terminal amino acids of the protein, which serves as a scaffold domain during the assembly of the capsid.
  • the twelfth vertex of the capsid is formed by a dodecamer of the portal protein pb7 (47 kDa), which constitutes an entry pore for DNA.
  • This procapsid also contains the protease pb11 which cleaves the 775 copies of the D-domain of pb8, cut the N-terminal 10 residues of the portal protein and self-proteolyses to produce an empty capsid, ready to receive the viral genome.
  • the encapsidation of the DNA is ensured by a molecular motor and this step is accompanied by a structural reorganization of the 775 subunits of the capsid protein causing the expansion of the capsid.
  • the expanded mature form has the binding sites of the monomeric protein pb10 (17.3 kDa) at the center of the hexamers, 120 copies of which decorate the external surface of the icosahedron.
  • capsid or phage capsid
  • capsomers the structure that surrounds the genome (nucleic acid, DNA or RNA) of a phage, without the tail. It is made up of a large number of protein units which come together to form identical structural groups called capsomers.
  • the nucleocapsid is the assembly formed by the phage capsid (present in naked or enveloped phages, the envelope or peplos not being the capsid, but a lipoprotein envelope surrounding the capsid) and the viral genome (RNA or DNA) . According to the geometric relationships that the capsomers have with each other and with the genome that they cover and protect, three classes of nucleocapsids can be defined:
  • Icosahedral nucleocapsids which have all or part of the symmetry elements of icosahedra and whose structure is therefore close to that of geodes;
  • empty capsid is meant a capsid not comprising a phage genome (devoid of phage nucleic acid).
  • An empty capsid is therefore a capsid that has not encapsidated (incorporated) the phage genome.
  • an empty capsid is a capsid lacking genomic DNA from the T5 phage.
  • an empty capsid of a phage is a capsid devoid of any nucleic acid from said phage.
  • an empty capsid is a capsid free of any nucleic acid (eg free of nucleic acid from phage, the host cell and the producer cell, preferably free of contaminating nucleic acid).
  • free of nucleic acid or “not comprising nucleic acid” is meant a substance comprising less than 5% nucleic acid, preferably less than 4%, preferably less than 3%, preferably less. 2%, preferably less than 1%, preferably less than 0.5%, preferably less than 0.1%, preferably less than 0.01%, preferably less than 0.001%, preferably less than 0 , 0001%, preferably less than 0.00001%, preferably less than 0.000001%, nucleic acid (by molar mass).
  • capsid protein or “capsid structural protein” is meant a protein involved in the structure of the phage capsid.
  • capsid structural protein means a component which is part of the capsid.
  • these proteins include in particular the major capsid protein pb8, the portal protein pb7, the protease pb11 and the decoration protein pb10.
  • capsid decoration protein of phage T5 or “decoration protein pb10” or “protein pb10” or “pb10” is understood to mean a monomeric protein of phage T5, binding to the outer surface of the capsid of phage T5, preferably on the hexamers forming the faces of the capsid of phage T5, preferably on binding sites present on the hexamers forming the faces of the capsid of phage T5, more preferably on binding sites present in the center of the hexamers forming the faces of the capsid of phage T5.
  • the decoration protein pb10 consisting of 164 amino acids (Examples of references for pb10: GenBank: MU05286.1 or NCBI: YP_006979.1, as presented in SEQ ID: 16), comprises two independent domains, an N-terminal domain attachment to the capsid and an exposed outer C-terminal domain, i.e., shown at the outer portion of the capsid. These two domains are separated by a short "linker” or hinge of the poly-proline type.
  • the pb10 decoration protein has, for example, the amino acid sequence SEQ ID NO: 1, which respectively includes one and two additional amino acids in N-terminal and C-terminal positions, which can be introduced by cloning requirements.
  • the pb10 decoration protein can present the exact sequence of the native protein, if the cloning techniques used for its expression do not introduce a modification of its amino acid sequence (it is for example in this case of the amino acid sequence SEQ ID NO: 16).
  • the terms "phage T5 capsid decoration protein”, "pb10 decoration protein”, “pb10 protein” and “pb10” are used interchangeably herein.
  • N-terminal domain of a pb10 protein is meant the domain located at the N-terminal position of the pb10 protein, that is to say the domain of the pb10 protein comprising (or consisting essentially of, or consisting of ) the first 80 amino acids of the protein sequence of pb10 (ie the amino acids going from position 1 to position 80 inclusive).
  • the N-terminal domain of the pb10 protein comprises in particular the domain for binding to the capsid.
  • the N-terminal domain of the pb10 protein has, for example, the amino acid sequence SEQ ID NO: 3, corresponding to the first 80 consecutive amino acids of SEQ ID NO: 1.
  • the N-terminal domain of the pb10 protein can alternatively present, for example, the amino acid sequence corresponding to the first 77 consecutive amino acids of SEQ ID NO: 16, or the amino acid sequence corresponding to the 76 amino acids consecutive between positions 2 and 77 (inclusive) of SEQ ID NO: 16.
  • C-terminal domain of a pb10 protein is meant the domain located in the C-terminal position of the pb10 protein, that is, that is to say the domain comprising (or consisting essentially of, or consisting of) for example the last 92 amino acids of the protein sequence of pb10 as defined in SEQ ID NO: 1 (i.e. the amino acids ranging from position 74 to position 165 included).
  • the C-terminal domain of the pb10 protein comprises in particular the exposed external domain, that is to say shown at the level of the external part of the capsid.
  • major capsid protein pb8 or “pb8” is meant a protein of phage T5, which is organized into 11 pentamers to form 11 of the 12 tops of the T5 capsid, and 120 hexamers forming the faces.
  • the pb8 protein (51 kDa) is synthesized as a 51 kDa precursor including a D domain which corresponds to the 159 N-terminal amino acids of the protein.
  • the D domain serves as a scaffolding domain during the assembly of the procapsid, then this domain is cleaved by the protease pb11, to form the capsid.
  • the major capsid protein pb8 has, for example, the amino acid sequence SEQ ID NO: 8.
  • pb7 portal protein or "pb7” is meant a protein from phage T5, which organizes into a dodecamer to form 1 of the 12 capsid vertices of phage T5. This dodecamer provides an entry pore for phage DNA.
  • the pb7 protein is about 47 kDa.
  • the portal protein pb7 has, for example, the amino acid sequence SEQ ID NO: 7.
  • protease a protein of phage T5 which cleaves the 775 copies of the D domain of pb8, cuts the N-terminal 10 residues of the portal protein and self-proteolyses to produce an empty capsid, ready to receive the viral genome.
  • the pb11 protease has, for example, the amino acid sequence SEQ ID NO: 9.
  • “decorated capsid” is meant a capsid comprising at least one decoration protein and / or at least one fusion protein exposed at its surface. Typically, the decorative protein is exposed on at least one of the faces making up the capsid.
  • nucleic acid molecule or by “nucleic acid” is meant a polymer of any length of deoxyribonucleic acid (DNA), or polydeoxyribonucleotides, including in particular complementary DNAs or cDNAs, genomic DNAs, plasmids. , vectors, viral genomes, isolated DNA, probes, primers and any mixture thereof; or a polymer of any length of ribonucleic acid (RNA), or polyribonucleotides, including in particular messenger RNAs or mRNAs, antisense RNAs; or mixed polyribo-polydeoxyribonucleotides. They encompass single or double stranded, linear or circular, natural or synthetic polynucleotides. Additionally, a polynucleotide can include unnatural nucleotides and can be interrupted by non-nucleotide components.
  • DNA deoxyribonucleic acid
  • polydeoxyribonucleotides including in particular complementary DNAs or cDNAs,
  • nucleic acid In the context of the present invention, the terms “nucleic acid”, “nucleic acid molecule”, “polynucleotide” and “nucleotide sequence” are used interchangeably.
  • genomic is meant all the genetic material of a species encoded in its deoxyribonucleic acid (DNA) or its ribonucleic acid (RNA).
  • DNA or RNA contains in particular all the genes encoding proteins or corresponding to structured RNAs. It therefore breaks down into coding sequences (transcribed into messenger RNA and translated into proteins) and non-coding (not transcribed, or transcribed into RNA, but not translated).
  • genomic DNA therefore means the genome which is in the form of DNA.
  • phage genomic DNA all of the genetic material of a phage, which is in the form of DNA.
  • capsid devoid of phage genomic DNA a capsid which comprises less than 5% of genomic phage DNA (entire genomic DNA or fragments) by molar mass, preferably less than 4%, preferably less than 3%, preferably less than 2%, preferably less than 1%, preferably less than 0.5%, preferably less than 0.4%, preferably less than 0.3%, preferably less than 0.2%, preferably less than 0.1%, preferably less than 0.01%, preferably less than 0.001%, preferably less than 0.0001%, preferably less than 0.00001%, preferably less than 0.000001%, genomic phage DNA, by molar mass.
  • the capsid lacking genomic phage DNA does not include any trace of genomic phage DNA: in other words, the capsid is pure genomic phage DNA. Still advantageously, the capsid lacking phage genomic DNA does not include any phage nucleic acid: in other words, the capsid is pure phage nucleic acid. According to an advantageous embodiment, the capsid devoid of phage genomic DNA does not include genomic DNA of bacteria and / or does not include plasmid DNA of bacteria, or does not include any DNA, or does not include any nucleic acid. .
  • the capsid devoid of phage genomic DNA comprises less than 5% of DNA originating from bacteria (whole genomic DNA or fragments, plasmids), preferably less than 4%, preferably less than 3%, preferably less than 2%, preferably less than 1%, preferably less than 0.5%, preferably less than 0.4%, preferably less than 0.3%, preferably less than 0.2%, preferably less than 0.1%, preferably less than 0.01%, preferably less than 0.001%, preferably less than 0.0001%, preferably less than 0.00001%, preferably less than 0.000001%, by mass molar.
  • isolated molecule is meant a molecule, in particular a protein, a polypeptide, a peptide, a nucleic acid molecule, a plasmid vector, a viral vector or a host cell, which is extracted from its natural environment (ie. that is to say separated from at least one other component with which it is naturally associated).
  • polypeptide polymers of amino acid residues which include at least nine amino acids linked by peptide bonds.
  • the polymer can be linear, branched or cyclic.
  • the polymer can comprise natural amino acids and / or amino acid analogues and it can be interrupted by non-amino acid residues.
  • the polymer of amino acids contains more than 50 amino acid residues, it is preferably called a polypeptide or a protein, whereas if the polymer consists of 50 amino acids or less, it is preferably referred to as a "peptide”.
  • the reading and writing directions of an amino acid sequence of a polypeptide, protein and peptide as used herein are the conventional reading and writing directions.
  • the read and write convention for amino acid sequences of a polypeptide, protein and peptide places the amine terminus to the left, the sequence then being written and read from the amine terminus (N- terminus) at the carboxyl terminus (C-terminus), from left to right.
  • vector is meant a vehicle, preferably a nucleic acid molecule or a viral particle, which contains the elements necessary to allow the administration, propagation and / or expression of one or more molecule (s). ) nucleic acids in a host cell or organism.
  • this term encompasses vectors for maintenance (cloning vectors), vectors for expression in various host cells or organisms (expression vectors), extrachromosomal vectors (e.g. multicopy plasmids ) or integration vectors (eg designed to integrate into the genome of a host cell and produce additional copies of the nucleic acid molecule it contains when the host cell replicates).
  • This term also encompasses shuttle vectors (e.g., functioning in both prokaryotic and / or eukaryotic hosts) and transfer vectors (e.g., for the transfer of nucleic acid molecule (s) into the genome of a. host cell).
  • vectors can be natural, synthetic or man-made genetic sources, or a combination of natural and man-made genetic elements.
  • vector should be understood broadly to include plasmid (or plasmid) and viral vectors.
  • Plasmid refers to a replicable DNA construct.
  • plasmid vectors contain selection marker genes which allow host cells carrying the plasmid to be identified and / or selected positively or negatively in the presence of the compound corresponding to the selection marker.
  • selection marker genes A variety of positive or negative selection marker genes are known in the art.
  • an antibiotic resistance gene can be used as a positive selection marker gene making it possible to select a host cell in the presence of the corresponding antibiotic.
  • viral vector refers to a nucleic acid vector which comprises at least one element of a virus genome and may be packaged in a virus particle or a virus particle.
  • Viral vectors can be replication competent or selective (eg, designed to replicate better or selectively in specific host cells), or can be genetically deactivated so as to be replication defective or deficient.
  • host cell is meant a cell containing at least one capsid according to the invention, or at least one capsid capable of being obtained by the production method according to the invention, or at least one capsid. at least one vector according to the invention, or at least one nucleic acid molecule according to the invention, or any mixture of these.
  • the host cell is capable of expressing the genes encoded by the vector according to the invention and / or of producing the vector of the invention.
  • the host cell is capable of being infected with a phage (preferably a T5 phage) and / or of producing a T5 phage and / or of producing a capsid (empty or not; decorated or not) of T5 phage.
  • the host cell is capable of producing an empty T5 phage capsid, decorated with the fusion protein according to the invention.
  • the host cell is capable of producing an empty T5 phage capsid, in a mature expanded form, preferably decorated with the fusion protein according to the invention.
  • the host cell can be made up of a single type of cells or a group of different types of cells.
  • the host cell can also be a hybrid cell, that is, one resulting from the fusion of two or more cells of different types.
  • the host cell can belong to cultured cell lines, primary cells, stem cells or proliferative cells.
  • the term "host cells” includes prokaryotic cells, lower eukaryotic cells such as yeast cells, and other eukaryotic cells such as fungal cells, insect cells, plant cells, and cells. algae, microalgal cells, parasite cells, animal cells and mammalian cells (eg human or non-human, preferably non-human).
  • the host cell can be a differentiated cell, a pluripotent cell, a totipotent cell, a stem cell, an induced pluripotent stem cell (iPS or iPS), an induced totipotent stem cell, or an embryonic cell or an embryonic stem cell. .
  • the cell is preferably a non-human cell.
  • host cell more broadly includes cells which contain or have contained the nucleic acid molecule according to the invention, as well as the progeny of such cells.
  • the host cell can, for example, be isolated or organized into a tissue, an organ or even be within a whole organism. In the case where the host cell is within a whole organism, said organism is not human.
  • the host cell is advantageously a bacterium, preferably a bacterium of the Enterobacteriaceae family, more preferably a bacterium of the genus Escherichia, more preferably an Escherichia coli bacterium.
  • identity or “sequence identity” is meant an exact sequence correspondence between two polypeptides or two amino acid molecules.
  • the percentages of identity to which reference is made in the context of the disclosure of the present invention are determined after optimal alignment of the sequences to be compared, which can therefore comprise one or more additions, deletions, truncations and / or substitutions. This percentage identity can be calculated by any method of sequence analysis well known to those skilled in the art. The percentage identity can be determined after global alignment of the sequences to be compared, taken in their entirety, on their entire length. Besides manually, it is possible to determine the overall alignment of sequences by means of the algorithm of Needleman and Wunsch (1970).
  • the comparison of the sequences can be carried out using any software well known to those skilled in the art, such as, for example, the Needle software.
  • the parameters used can in particular be the following: “Gap Open” equal to 10.0, “Gap Extend” equal to 0.5 and the EDNAFULL matrix (EMBOSS version of NCBI NUC4.4).
  • the comparison of the sequences can be performed using any software well known to those skilled in the art, such as, for example, Needle software.
  • the parameters used can in particular be the following: “Gap Open” equal to 10.0, “Gap Extend” equal to 0.5 and the BLOSUM62 matrix.
  • the percentage identity defined in the context of the present invention is determined by means of an overall alignment of the sequences to be compared over their entire length.
  • “at least 80% sequence identity” as used herein represents 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% sequence identity.
  • fusion protein or “fusion protein” is meant an artificial protein obtained by the combination of a protein (hereinafter called “F protein”), or of one or more part (s) of a protein ( hereinafter called “part (s) of F protein”), with one or more protein (s) (or one or more parts of protein (s)) different (that is to say that said one or more protein (s) and one or more part (s) of protein (s) is (are) different from the F protein and / or any of its parts) or with one or more non-protein molecule (s) (or part of a non-protein molecule) or a mixed molecule (i.e.
  • a molecule comprising a protein (or part of a protein) and a molecule non-protein (or part of a non-protein molecule); or part of a mixed molecule).
  • Said one or more protein (s) (or one or more parts of protein (s)) different (s) and / or said one or more non-protein molecule (s) (or part of a non-protein molecule) and / or said mixed molecule is / are in particular exogenous (that is to say derived from an organism different / distinct from that from which the F protein of the fusion protein is derived).
  • the fusion protein comprises a protein, and / or one or more parts of a protein, and / or a mixed molecule
  • said protein and / or said one or more protein part (s) and / or said mixed molecule preferably comprises (comprise) at least 10 consecutive amino acids, more preferably at least 12 consecutive amino acids, more preferably at least 15 consecutive amino acids, more preferably at least 20 consecutive amino acids, more preferably at least 30 consecutive amino acids.
  • the fusion protein comprises a protein, and / or one or more parts of a protein, and / or a mixed molecule
  • said protein and / or said (said) one or more part (s) of protein (s) and / or said mixed molecule preferably exhibits (exhibit) a three-dimensional structure, under non-denaturing conditions (for example conditions which are usually non-denaturing for proteins, in particular in the absence of denaturing and / or chaotropic agents).
  • non-protein molecule is advantageously meant a carbohydrate, a sugar, an oside, a lipid, a nucleic acid, a neurotransmitter, or any combination thereof.
  • mixed molecule any protein (or part of protein) which has undergone a post-translational modification (for example acetylation, acylation, biotinylation, glycosylation, hydroxylation, lipoylation, phosphorylation, amidation, etc. ubiquitination, sumoylation, deamination, etc.), or any protein (or part of protein) that has been combined with a non-protein molecule (or part of a non-protein molecule), such as a protein (or part of protein) combined with a carbohydrate, sugar, oside, lipid, nucleic acid, neurotransmitter, or any part thereof or any combination thereof.
  • a mixed molecule comprises, for example, a glycoprotein.
  • proteins or parts of protein, or of non-protein molecules (or parts of non-protein molecules), or of mixed molecules (or parts of mixed molecules) combined with the protein (or with one or more parts of a protein) of the fusion protein (i.e. the F protein of the fusion protein) include antigens, toxins, receptors, targeting or targeting or transport signals , enzymes, hormones, antibodies, any fragment thereof (preferably a functional fragment), and any combination thereof.
  • fragment of peptide or protein or “part of peptide or protein” or means a portion of a peptide or of a protein, that is to say a portion of the sequence of consecutive amino acids composing said peptide or said protein (called peptide or protein from which the fragment is derived).
  • fragment of a molecule or “part of a molecule” is meant a portion of a non-protein molecule or of a mixed molecule.
  • the term “functional fragment” is understood to mean any fragment of a peptide or protein, or any fragment of a molecule, exhibiting at least one of the original functions of the peptide, of the protein or of the molecule from which said fragment is derived.
  • the functional fragment performs said function with an efficiency equal to at least 30% of that of said peptide or of said protein or of said molecule, preferably at least 40%, preferably at least 45%, preferably at least 50 %, preferably at least 55%, preferably at least 60%, preferably at least 65%, preferably at least 70%, preferably at least 75%, preferably at least 80%, preferably at least 85% , preferably at least 90%, preferably at least 91%, preferably at least 92%, preferably at least 93%, preferably at least 94%, preferably at least 95%, preferably at least 96%, preferably at least 97%, preferably at least 98%, preferably at least 99%, preferably at least 100% of the efficiency of said peptide or of said protein or of said molecule.
  • the fragment when the fragment is a fragment of a peptide, of a protein, or of a mixed molecule, the fragment preferably comprises at least 10 consecutive amino acids of the peptide, of the protein, or of the mixed molecule, from which it is derived; more preferably at least 12 consecutive amino acids, more preferably at least 15 consecutive amino acids, more preferably at least 20 consecutive amino acids, more preferably at least 30 consecutive amino acids of the peptide or of the protein, or of the molecule mixed from which he comes.
  • the fragment when the fragment is a fragment of a peptide, protein, or mixed molecule, the fragment preferably has a three-dimensional structure, under non-denaturing conditions (for example conditions which are usually non-denaturing for proteins, in particular in the absence of denaturing and / or chaotropic agents).
  • non-denaturing conditions for example conditions which are usually non-denaturing for proteins, in particular in the absence of denaturing and / or chaotropic agents.
  • three-dimensional structure or “tertiary structure” is meant the intrinsic folding of a molecule in space.
  • a molecule having a three-dimensional structure is a molecule having a stable spatial configuration, (commonly called folding), which is specific to it and which is intimately linked to its function: when this structure is dissociated by the use of denaturing or chaotropic agents, the molecule is said to be denatured and loses its function.
  • a three-dimensional structure is an inflexible structure.
  • a non-three dimensional structure can adopt a dynamic set of configurations that are constantly changing over time.
  • the three-dimensional structure is the folding of the polypeptide chain in space.
  • the three-dimensional structure is not a linear chain of amino acids capable of adopting a dynamic set of configurations that constantly change over time (it is not a linear succession of amino acids without any spatial configuration).
  • the three-dimensional structure of proteins, peptides, mixed molecules comprising a protein or a peptide, or fragments thereof, is maintained by different interactions which can be:
  • nanoparticle an object whose three dimensions are at the nanometric scale, that is to say a particle whose nominal diameter is less than approximately 100 nm (for example as defined by the ISO TS / 27687).
  • phage nanoparticle or phage nanoparticle is meant a nanoparticle comprising at least one phage or at least one phage fragment; or consisting essentially of at least one phage or at least one fragment of a phage; or consisting of at least one phage or at least one phage fragment (the term fragment being used here in connection with a phage in the same sense as the term fragment used in connection with peptides, proteins and molecules, such as defined above).
  • the nanoparticle comprises at least one capsid or at least one fragment of a capsid; or consists essentially of at least one capsid or at least one fragment of a capsid; or consists of at least one capsid or at least one fragment of a capsid.
  • said capsid is as defined above. Said capsid is preferably decorated, in expanded, empty, mature form, or any combination thereof.
  • operon is meant a functional DNA unit grouping together genes which operate under the signal of the same promoter. These genes are preferably transcribed into messenger RNA together and preferably contribute to the performance of the same physiological function. Advantageously, either all the genes of an operon are transcribed together, or none are transcribed, since they are all under the control of the same promoter.
  • promoter is meant a section of DNA which initiates the transcription of a section of DNA recognized by an RNA polymerase.
  • antigen means a natural or synthetic molecule which, recognized by antibodies or cells of the immune system of an organism, is capable of triggering an immune response in the latter.
  • any foreign substance, any microbe, introduced into the body can behave as an antigen, that is to say cause the production of special proteins, the antibodies which have the property of neutralizing the harmful effects of the foreign substance.
  • Antigens are generally peptides, proteins, sugars (such as polysaccharides or polysaccharides) and their lipid derivatives (lipids).
  • the antigens can also be nucleic acids, or haptens (ie fragments of antigens).
  • Antigens, as markers for agents foreign to the body are the basis of the adaptive immune response.
  • the term “epitope” or “antigenic determinant” is the part of the antigen recognized by an antibody or a lymphocyte receptor.
  • the same antigen can comprise several epitopes (identical or different) and thus induce a varied immune response. There are sequential epitopes, corresponding to an amino acid sequence, and conformational epitopes, linked to the structure of the protein and therefore sensitive to denaturation.
  • the recognition of the antigen by the lymphocytes depends on the nature of the epitope. B lymphocytes bind directly to conformational epitopes through immunoglobulins in their membrane.
  • T cells recognize sequential epitopes presented by antigen presenting cells.
  • the antigen can be exogenous, i.e. it is foreign to the individual (in this case, it can be allogeneic: from an individual of the same species; or xenogeneic: from other species), or it may be endogenous, i.e. an antigen specific to the host (self-antigens).
  • the antigen is preferably an antigen of a microorganism, plant, alga, microalgae, bacterium, virus, parasite, yeast, fungus, insect, animal, or tumor; preferably an antigen of a eukaryotic or prokaryotic pathogen, or of a cancer; preferably a protein antigen, a lipid or a sugar of a bacterium, virus, parasite, yeast, fungus or tumor.
  • toxin is meant a substance toxic to one or more living organisms.
  • a toxin is typically synthesized by a living organism (bacteria, poisonous fungus, poisonous insect or snake), to which it confers its pathogenic power.
  • Toxins produced by bacteria are called bacteriotoxins, those produced by fungi are called mycotoxins, those produced by plants are called phytotoxins, those produced by algae are called phycotoxins, those produced by animals are called animal toxins.
  • the toxin can be a chemical molecule, a peptide, a protein, a glycoprotein, a sugar, an oside, a lipid, a nucleic acid, or any combination of these Several families of bacteria secrete biotoxins (exotoxins) in tissues they colonize.
  • Toxic plants produce toxins via their secondary metabolites: these are molecules which, unlike primary toxins (proteins, lipids, carbohydrates, amino acids, etc.) are produced outside the metabolic pathways necessary to ensure survival ( therefore primary metabolites). Plant toxins can be classified into three groups: phenols, nitrogen and terpenes.
  • the toxin can be a neurotoxin (a toxin acting on the nervous system), a myotoxin (acting on the contraction of muscles, especially cardiotoxins on the heart and others like strychnine on the respiratory muscles), a hemotoxin (acting on blood), cytotoxin (acts on cells), dermatotoxin (acts on skin and mucous membranes), hepatotoxin (acts on liver), nephrotoxin (acts on kidney), enterotoxin (acts on tube digestive) etc.
  • the toxin can be an anatoxin; that is to say a toxin which has been treated in such a way as to retain its antigenic power and lose its toxic power.
  • the toxin is preferably a toxin of a microorganism, plant, algae, microalgae, bacteria, virus, parasite, yeast, fungus, insect, animal, or tumor; preferably a toxin from a eukaryotic or prokaryotic pathogen, or from cancer.
  • the different categories of toxins are well known to those skilled in the art, who may in particular refer to reference books in the field (such as Michael W. Parker, Protein Toxin Structure, Springer Science & Business Media, June 29, 2013; Michael R.
  • receptor is meant a molecule of the cell membrane or of the cytoplasm or of the cell nucleus which binds specifically to a specific factor (a ligand, such as a neurotransmitter, a hormone, or another substance), inducing a cellular response to this. ligand.
  • a ligand such as a neurotransmitter, a hormone, or another substance
  • the changes in the behavior of the receptor induced by the ligand lead to physiological changes which constitute the "biological effects" of the ligand.
  • the receptors can include at least: a peptide, a protein, a glycoprotein, a sugar, an oside, a lipid, a nucleic acid, or any combination thereof.
  • the receptors are generally proteins or mixed proteins (proteins modified and / or associated with another molecule).
  • the receptor can be a receptor on the outer part of the plasma membrane, a transmembrane receptor embedded in the lipid bilayer of cell membranes (usually a transmembrane protein, for example acting as a receptor for hormones and neurotransmitters - These receptors are either coupled to a G protein either carrying enzymatic or ion channel activity which enables the activation of metabolic signal transduction pathways in response to ligand binding), or an intracellular receptor (these receptors can sometimes enter the nucleus of the cell to modulate the expression of specific genes therein, in response to activation by the ligand).
  • the receptor is preferably a receptor of a microorganism, plant, algae, microalgae, bacteria, virus, parasite, yeast, fungus, insect, animal, or tumor; preferably a receptor for a eukaryotic or prokaryotic pathogen, or for cancer; preferably a protein or glycoprotein receptor from bacteria, viruses, parasites, yeasts, fungi or tumors.
  • the different categories of receptors are well known to those skilled in the art, who may in particular refer to reference works in the field (such as Thomas D. Pollard, William C.
  • targeting or targeting or transport signal or by “signaling molecule” or by “signal” or by “cellular signal” is meant the peptide and cell targeting sequences. protein, molecules allowing cellular transport and / or internalization, as well as receptor ligands (the receptors being as defined above).
  • the addressing sequence is a short sequence of amino acids, usually located at the N-terminus of the protein, used to designate the proteins to be addressed, and to indicate their destination.
  • the addressing or targeting or transport signal may be an addressing or targeting or transport signal to / to the core; an addressing or targeting or transport signal to / to the cytoplasm; an addressing or targeting or transport signal to / to the cytosol; an addressing or targeting or transport signal to / to the cell membrane; an addressing or targeting or transport signal to / to the mitochondria; an addressing or targeting or transport signal to / to the peroxisomes; an addressing or targeting or transport signal to / to the lysosomes; an addressing or targeting or transport signal to / to the endoplasmic reticulum; a signal for addressing or targeting or transporting the secretion pathways; and a ligand of a receptor, preferably a membrane or transmembrane receptor, preferably a membrane or transmembrane receptor of a membrane selected from a cell membrane, an extracellular membrane, a cytoplasmic membrane or a nuclear membrane.
  • the addressing or targeting or transport signal can comprise at least: a peptide, a protein, a glycoprotein, a sugar, an oside, a lipid, a nucleic acid, or any combination thereof.
  • the targeting or targeting or transport signal comprises at least one peptide, a protein, a glycoprotein, or a nucleic acid.
  • the signal is preferably a prokaryotic, eukaryotic or viral signal, preferably a signal from an animal, a plant, an alga, a microalga, a microorganism, a bacterium, a parasite, yeast, fungus, insect, virus, or cancer; more preferably a mammalian signal, such as a human signal.
  • enzyme By “enzyme” is meant a protein endowed with catalytic properties. Virtually all biomolecules capable of catalyzing chemical reactions in cells are enzymes; however, some catalytic biomolecules are made up of RNA and are therefore distinct from enzymes: these are ribozymes.
  • An enzyme works by lowering the activation energy of a chemical reaction, which increases the reaction rate. The enzyme is not changed during the reaction. The initial molecules are the substrates of the enzyme, and the molecules formed from these substrates are the products of the reaction. Enzymes are particularly characterized by their very high specificity. In addition, an enzyme has the characteristic of being reusable.
  • Enzymes are generally globular proteins that act alone or in complexes of several enzymes or subunits. Like all proteins, enzymes are made up of one or several polypeptide chains folded to form a three-dimensional structure corresponding to their native state.
  • Enzymes are molecules much larger than their substrates. Their size can vary from around fifty-hundred residues to over 2,000 residues. Only a very small part of the enzyme - usually between two and four residues, sometimes more - is directly involved in catalysis, which is called the catalytic site (or catalytic domain). The latter may be located near one or more binding sites, at which the substrate (s) is (are) bound (s) and oriented (s) in order to allow catalysis of the chemical reaction. The catalytic site and the binding sites form the active site of the enzyme.
  • Enzymes perform a large number of functions in living things. They can, for example, be involved in signal transduction mechanisms and in the regulation of cellular processes, in the generation of movements, in active transmembrane transport, in digestion, in metabolism, in the immune system, in mechanisms of digestion or cleavage of nucleic acids in the production of nucleic acids (referred to herein as "enzymes acting on nucleic acids”), in mechanisms of prodrug conversion (conversion of prodrug to drug).
  • the enzyme is preferably a prokaryotic, eukaryotic or viral enzyme, preferably an enzyme from an animal, a plant, an alga, a microalga, an insect, a microorganism, a bacterium, a parasite, a yeast, a fungus or a virus, more preferably a mammalian enzyme, such as a human enzyme.
  • a prokaryotic, eukaryotic or viral enzyme preferably an enzyme from an animal, a plant, an alga, a microalga, an insect, a microorganism, a bacterium, a parasite, a yeast, a fungus or a virus, more preferably a mammalian enzyme, such as a human enzyme.
  • the different categories of enzymes are well known to those skilled in the art, who may in particular refer to reference works in the field (such as Schomburg D., Schomburg I., Springer Handbook of Enzymes. 2 edn.
  • Enzyme databases in particular the BRENDA database (available in particular on the site brenda-enzymes.org), as described for example by Chang A, Schomburg I, Placzek S, Jeske L, Ulbrich M, Xiao M, Sensen CW, Schomburg D, Nucleic Acids Res. 2015 Jan; 43. Epub 2014 Nov 5. BRENDA in 2015: exciting developments in its 25th year of existence).
  • enzyme activity or “catalytic activity” or even “activity” of an enzyme is understood to mean the efficiency of an enzyme in converting a substrate into a product in a given environment.
  • the efficiency of the enzyme here takes into account the rate of conversion of the substrate into product by the enzyme and the rate of conversion of the substrate into product by the enzyme.
  • rate of conversion of the substrate into product by the enzyme is meant here the ratio between the quantity of final product obtained relative to the initial quantity of substrate for a defined quantity of enzyme.
  • an enzymatic activity within the meaning of the invention can be expressed as an amount of phloroglucinol produced in a given volume (in g / L).
  • hormone is meant a biologically active chemical substance, generally synthesized by a glandular cell (generally following stimulation) and secreted into the internal environment where it circulates (by blood, by the lymph or by the sap). It transmits a message in chemical form (generally by acting on specific receptors in a target cell) and therefore plays a role of messenger in the body. It is able to act at very low doses.
  • the hormone is advantageously a plant or animal hormone.
  • Plant hormones are also called phytohormones or growth factors. They often have the function of ensuring the growth of the plant or its morphogenesis.
  • Animal hormones are in most cases produced by the endocrine system (an endocrine gland or endocrine tissue).
  • the hormone is a vertebrate hormone, preferably chosen from the following chemical classes:
  • Hormones derived from amines which consist of a single amino acid (tyrosine or tryptophan) but in a derived form.
  • Peptide hormones which are chains of amino acids, therefore proteins, called peptides for the shortest ones.
  • Steroid hormones which are steroids derived from cholesterol.
  • Hormones based on lipids and phospholipids are based on lipids and phospholipids.
  • the hormone is preferably selected from peptide or protein hormones, hormones derived from amines, steroid hormones and lipid hormones.
  • the hormone is preferably a hormone from an animal or plant, preferably a mammalian hormone, preferably a human hormone.
  • the different categories of hormones are well known to those skilled in the art, who may in particular refer to reference books in the field (such as Davies PJ (2010) The Plant Hormones: Their Nature, Occurrence, and Functions. In: Davies PJ (eds) Plant Hormones, Springer, Dordrecht; AW Norman, G Litwack, Hormones, Academy Press, 1997; A Kastin, Handbook of biologically active peptides, Academy Press, 2013).
  • antibody is meant a complex protein or glycoprotein used by the immune system to specifically detect and neutralize pathogens. In mammals, antibodies are mostly secreted by cells derived from B lymphocytes: plasma cells. Antibodies (also called immunoglobulins) are the main globulins in the blood. Antibodies also include autoantibodies (eg produced in the case of an autoimmune disease).
  • Antibodies are proteins, glycoproteins of the immunoglobulin superfamily made up of 4 polypeptide chains (150,000 amu or dalton): two heavy chains (H for heavy of 50,000 amu each) and two light chains (L for light of 25,000 amu each) ) which are interconnected by a variable number of disulfide bridges ensuring the cohesion of the molecule. These chains form a Y structure (half of each light chain constitutes an arm of the Y) and are made up of immunoglobulin domains which may comprise approximately 110 amino acids. Each light chain consists of a constant domain and a variable domain; heavy chains are composed of a variable fragment and three or four constant fragments depending on the isotype.
  • the two heavy chains are identical, as are the two light chains.
  • the constant domains are characterized by an amino acid sequence very close from one antibody to another, characteristic of the species and of the isotype. Each light chain has a copy marked CL.
  • the heavy chains comprise, depending on the isotype, three or four constant domains CH1, CH2, CH3, (CH4).
  • the constant domains are generally not involved in the recognition of the antigen, but intervene in the activation of the complement system, as well as in the elimination of immune complexes (antibody bound to its antigen) by the immune cells possessing the receptors to constant fragments (RFc).
  • An antibody has four variable domains located at the ends of the two "arms”.
  • variable domain carried by a heavy chain (VH) and the adjacent variable domain carried by a light chain (VL) constitutes the recognition site (or paratope) of the antigen.
  • VH heavy chain
  • VL light chain
  • an immunoglobulin molecule has two antigen binding sites, one at the end of each arm. These two sites are identical (but intended for different epitopes), hence the possibility of binding two antigen molecules by antibody.
  • the specific enzymatic cleavage makes it possible to isolate different fragments: the Fc fragment (crystallizable). It supports the biological properties of immunoglobulin, in particular its ability to be recognized by immunity effectors or to activate complement. It is made up of constant fragments of heavy chains (CH2) beyond the hinge region. It does not recognize the antigen; the Fv fragment. It is the smallest fragment which retains the properties of the antibody possessed by immunoglobulin. It consists only of the VL and VH variable regions, so it binds the antigen with the same affinity as the complete antibody and is monovalent; the Fab fragment. It has the same affinity for the antigen as the whole antibody.
  • the Fc fragment crystallizable
  • CH2 constant fragments of heavy chains
  • the Fab fragment is formed from the entire light chain (VL + CL) and part of the heavy chain (VH + CH1). He is monovalent; the F (ab ') 2 fragment. It corresponds to the association of two Fab fragments linked by a small part of the constant parts of the heavy chains, the hinge region. It has the same affinity as the antibody for the antigen and is divalent.
  • Monoclonal antibodies are antibodies that recognize only one type of epitope on a given antigen. They are by definition all identical and produced by a single plasma cell clone. Polyclonal antibodies are a mixture of antibodies recognizing different epitopes on a given antigen, each idiotype being secreted by a different clone of plasma cells. During the immune response, an organism synthesizes antibodies directed against several epitopes of an antigen: the response is said to be polyclonal.
  • the antibody can be a functional fragment of an antibody. In this case, said fragment can be chosen from an Fc fragment of an antibody, an Fv fragment of an antibody, an Fab fragment of an antibody, and an F (ab ') fragment of an antibody.
  • the antibody is preferably an animal antibody, preferably a mammalian antibody, preferably a human or humanized antibody.
  • the antibody is a monoclonal antibody.
  • the different categories of antibodies are well known to those skilled in the art, who may refer in particular to reference works in the field (such as Thomas D. Pollard, William C. Earnshaw, Jennifer Lippincott-Schwartz, Graham Johnson Cell Biology E-Book, Elsevier Health Sciences, Nov.
  • microorganism or “microorganism” is meant a microscopic living organism. Microorganisms include bacteria, fungi, archeobacteria, protists, microscopic green algae, plankton animals, planarians, and amoebae. It is possible to distinguish on the one hand prokaryotic microorganisms which do not have a nucleus such as bacteria and Archaea, and on the other hand eukaryotic microorganisms having a nucleus. Microscopic eukaryotes include fungi like yeasts and two types of protists: algae and protozoa. Microorganisms are generally unicellular, some species may be multicellular. Unicellular protists can be visible to the naked eye and some multicellular species are microscopic.
  • the average bacterial cell size is 0.5-1 ⁇ m, but there are some bacteria that are larger than 50 ⁇ m.
  • Eukaryotic cells have a diameter ranging from 5 to 100 ⁇ m.
  • Prokaryote or Prokaryota is meant a living being whose cellular structure does not include a nucleus, and almost never membrane organelles (the only exception being thylakoids in cyanobacteria). These include simple unicellular microorganisms such as bacteria (including archaea and eubacteria). In the classification of living things into seven kingdoms, prokaryotes form a paraphyletic taxon, thus grouping together living things sharing a similar and simple cellular structure.
  • eukaryotes characterized by the presence of a nucleus and multiple other organelles.
  • eukaryote or Eukaryota
  • eukaryote we therefore mean an organism belonging to the field of eukaryotes, a domain grouping together all the organisms, unicellular or multicellular, which are characterized by the presence of a nucleus and generally of organelles specialized in respiration. , in particular mitochondria in aerobes but also hydrogenosomes in certain anaerobes.
  • bacteria is understood to mean a microscopic and prokaryotic organism present in all media, belonging to the kingdom of bacteria.
  • the term bacterium here designates both eubacteria and archaebacteria (or archaea).
  • alga is understood to mean an organism capable of oxygenic photosynthesis and whose life cycle generally takes place in an aquatic environment. Algae especially include cyanobacteria and eukaryotic algae. By “cyanobacteria” is meant a prokaryotic organism belonging to the group of Cyanobacteria, also called blue algae.
  • eukaryotic alga a eukaryotic organism belonging to the group of eukaryotic algae, comprising the branches of Glaucophyta or Glaucocystophyta, Rhodophyta, Chlorobionta or Viridiplantae, Cryptophyta, Euglenozoa, Cercozoa, Haptophyta, Prymnesiophyta or Prymnesiophyta , and Ochrophyta or Hetero sparklephyta.
  • the eukaryotic algae according to the invention comprise in particular various groups with unicellular species (Euglenophytes, Cryptophytes, Haptophytes, Glaucophytes, etc.), other groups with unicellular or pluricellular species (such as the “red algae” or Rhodophyta, the Stramenopiles. (including in particular Diatoms and “brown algae” or Pheophyceae), and plants fairly close to terrestrial plants (such as “green algae”, which include among others Ulvophyceae).
  • groups with unicellular species Euglenophytes, Cryptophytes, Haptophytes, Glaucophytes, etc.
  • other groups with unicellular or pluricellular species such as the “red algae” or Rhodophyta, the Stramenopiles. (including in particular Diatoms and “brown algae” or Pheophyceae)
  • plants fairly close to terrestrial plants such as “green algae”, which include among others Ulvophyceae).
  • microalga microscopic algae, sometimes called microphyte. Unicellular or undifferentiated multicellular, they are generally eukaryotic photosynthetic microorganisms. Microalgae can also include prokaryotes, grouping together all cyanobacteria (or “blue algae”). Living in strongly aqueous environments, they can have flagellar mobility. They colonize all biotopes exposed to light. However, the vast majority of microalgae are able to feed by osmotrophy at night and are therefore, in fact, mixotrophic. Microalgae play an important role in the carbon cycle and more generally in the biogeochemical cycles of lakes and the ocean. Microalgae can be cultured monoclonal in photobioreactors or industrial fermenters.
  • animal is meant an organism belonging to the animal kingdom. According to the classical classification, an animal is a heterotrophic living being, that is, it feeds on organic substances. We also hear the taxon of animals called Animalia, in modern scientific classifications (original creation of Linnaeus in 1758, with regard to the International Code of Zoological Nomenclature (ICZN)) or Metazoa (junior synonym created by Haeckel in 1874). An animal is a complex, multicellular (metazoan) being. Whatever the term used or whatever the classification adopted (evolutionist or cladist), here the term animal is understood to mean multicellular eukaryotic organisms which are generally mobile and heterotrophic.
  • Vertebrates an organism belonging to the group of vertebrate animals (also called Vertebrata), which is a sub-branch of the animal kingdom. Vertebrates have a bony or cartilaginous skeleton, which in particular has a spine. These bilaterian animals belong to the branch of the Chordates and group together all the Pisces as well as the Tetrapods. It also includes the Hagfishes (fish without jaws) although they do not have a real column.
  • mammal an animal belonging to the taxon or to the clade (a cladistic grouping of biological lines) or the class of mammals (also called class. Mammalia), grouping together vertebrate animals. Their distribution area is global, they have conquered a large part of the ecological niches of macrofauna and have remained one of the dominant taxa since the Eocene.
  • the main feature of this clade is the suckling of young from a specialized skin-glandular secretion called milk. Newborns routinely require parental care because of their immature digestive system at birth (milk is their vital and mandatory food source). Other characteristics also make it possible to distinguish mammals from other taxa, including fossils.
  • a "human” belongs to the mammalian clade.
  • plant is meant an organism belonging to the plant kingdom.
  • the vegetable kingdom includes lines which vegetate: that is to say which breathe, feed, grow like plants, according to classical scientific classifications.
  • the plant kingdom is a polyphyletic assembly of photosynthetic organisms whose cells have a cellulose wall.
  • the term plant designates both terrestrial plants (or green plants) and green algae, constituting the taxon of Chlorobionts, as well as red algae, brown algae and fungi.
  • the plant group is therefore made up of two lineages, one of algae; and the second of plants (in particular terrestrial plants), which include in particular bryophytes (mosses and liverworts), ferns (pteridophytes), gymnosperms and angiosperms.
  • the plant is a plant.
  • insect is meant a class of invertebrate animals of the arthropod phylum and of the hexapod subphylum. They are characterized by a body segmented into three tagmes (head with external mouthparts, a pair of antennae and at least one pair of compound eyes; thorax with three pairs of articulated legs and two pairs of more or less wings modified; abdomen devoid of appendages) protected by a cuticle forming an exoskeleton composed of chitin and provided with respiratory tracheae.
  • tagmes head with external mouthparts, a pair of antennae and at least one pair of compound eyes; thorax with three pairs of articulated legs and two pairs of more or less wings modified; abdomen devoid of appendages
  • parasite is meant a living being at least partially parasitic.
  • Parasitism is a lasting biological relationship between two heterospecific living beings where one of the protagonists - the parasite - takes advantage of a host organism for food, shelter or reproduction. This relationship will have a negative effect on the host.
  • Organisms that are not parasitic can be described as "free”. Parasites are found throughout the living world. Some groups are composed almost exclusively of parasites (examples: monogenic flatworms), although most include both parasitic and free species (example: nematodes). Vertebrates have some parasitic species (such as blood-sucking bats, lampreys, vampire fish (or candirùs), etc.). Many parasites can modify the behavior of their host, to the benefit of the parasite.
  • the parasite is a parasite of an animal, preferably a human.
  • the parasite of an animal is usually a metazoan or a protozoan.
  • the animal parasite does not include here viruses (virosis), bacteria (bacterial infection), or fungi (mycosis)).
  • the presence of the parasite in the body is called parasitosis.
  • leukocytes eosinophilic polynuclear cells.
  • Parasitosis is characterized by hyper eosinophilia which corresponds to an increase in these defense cells in the blood. Crystalloids (major proteins) are responsible for this antiparasitic action.
  • animal parasites include: protozoa (comprising the classes: Intestinal Rhizopods (Amoeba); Flagellates; Sporozoa: and Ciliates; Metazoa (including Helminths (worms); Platworms (flatworms, not chitinous); trematodes (unsegmented); Schistosomes; Cestodes (segmented); taenias; Nemathelminths (roundworms, chitinous, unsegmented, sex-separated), Filariae, etc.); arthropods (including Arachnids and Parasitic Insects or Parasitic Vectors).
  • protozoa comprising the classes: Intestinal Rhizopods (Amoeba); Flagellates; Sporozoa: and Ciliates; Metazoa (including Helminths (worms); Platworms (flatworms, not chitinous); trematodes (unsegmented
  • fungus or “fungus” or “fungi” is meant a eukaryotic organism belonging to the kingdom of the Fungi, also called Mycota or Mycetes or fungus. This kingdom constitutes a large and diverse group, from microscopic unicellular (yeasts) or multicellular (molds) organisms, to “higher fungi” most often with a stem and a cap. Fungi are particularly characterized by the simultaneous existence of a peripheral cell wall and turgid vacuoles in the cytoplasm, their undifferentiated vegetative body and their peptido-polysaccharide wall, as well as the absence of chloroplasts, chlorophyll and starch. . They are carbon heterotrophic organisms.
  • yeast is understood to mean a unicellular fungus capable of causing the fermentation of organic animal or plant materials. Yeasts generally exhibit oxidative respiration metabolism and may also use alcoholic fermentative metabolism. These eukaryotic microorganisms, of variable shape depending on the species (spherical, ovoid or elliptical, bottled, triangular or apiculate (swollen at each end like a lemon) but generally oval, about 6 to 10 microns and up to 50 microns, multiply by budding or by scission (scissiparity). They are often capable of accomplishing a sporulation either with an aim of dormancy in unfavorable environment, or with an aim of dispersion.
  • Yeasts are generally characterized by a cell wall (made up of an outer layer of mannoproteins, associated with glucans and an inner layer of glucans associated with a small amount of chitin) surrounding the plasma membrane and protecting the yeast from physicochemical attacks from the external environment; a cytoplasmic membrane composed mainly of double-layered phospholipids; a nucleus containing the genetic information of the yeast chromosomal genome; mitochondria which play an important role in aerobic yeast respiration and ATP production. Certain yeasts have a pathogenic power in animals and are responsible for mycoses of the candidiasis type (genus Candida).
  • yeasts include those of the genus Saccharomyces (such as Saccharomyces cerevisiae) or Schyzosaccharomyces.
  • virus is meant an infectious agent requiring a host (generally a cell) whose metabolism and its constituents it uses to replicate. Viruses change shape during their cycle, going through two stages: an extracellular form (an independent material unit called a virion when there is a capsid or, for some forms, a viroid). In the extracellular form, viruses are particulate, infectious objects made up at least of a nucleic acid often included in a protein capsid; an intracellular form (virus integrated in dormant form or actively diverting the cellular machinery for the benefit of its replication).
  • viruses are genetic elements that can replicate by parasitizing all or part of the metabolism of the host cell, whether integrated into a chromosome of the host genome (we speak of then provirus) or in parallel with it (eg virion factories).
  • the virus is preferably a eukaryotic virus (ie a virus infecting eukaryotes and more particularly eukaryotic cells), more preferably an animal virus (ie a virus infecting animals and more. particularly animal cells), more preferably a mammalian virus (i.e. a virus infecting mammals and more particularly mammalian cells), more preferably a human virus (i.e. a virus infecting mammals. humans and more particularly human cells).
  • the virus can also be a plant virus (i.e. a virus infecting plants and more particularly plant cells), preferably a plant virus (i.e. a virus infecting plants and more particularly cells. plants).
  • the virus is preferably a pathogenic virus.
  • disease or “affection” or disorder ”or“ pathology ”is meant an alteration of the functions or the health of a living organism. We speak as well of disease, referring to all the alterations in health, as of a disease, which then designates a particular entity characterized by causes, symptoms, development and specific therapeutic possibilities.
  • infection or “infectious disease” is meant a disease caused by the transmission of a microorganism or an infectious agent: virus, bacterium, parasite, fungus, protozoan.
  • autoimmune disease is meant a disease resulting from an abnormality of the immune system leading the latter to attack the normal components of the body (the "self”).
  • metabolic disease is meant a medical disorder which affects the metabolisms in the cell, in particular the production of energy. Usually, metabolic disease prevents the body from properly processing sugars, fats and proteins.
  • skin disease is meant a disease of the skin, mucous membranes and integuments (nails, hair, body hair).
  • cardiovascular disease or “cardioneurovascular disease” is meant a disease which affects the heart and blood circulation.
  • respiratory disease is meant a disease affecting the respiratory system.
  • the respiratory system is a set of organs allowing respiration (i.e. gas exchange between the body and the environment). In mammals such as humans, the respiratory system includes the nose, mouth, pharynx, larynx, trachea, diaphragm, and lungs, the latter including the bronchi, bronchioles, alveoli, and acini.
  • lung disease or “lung disease” is meant a respiratory disease which affects the lungs. Respiratory and / or pulmonary diseases can be infectious, viral, genetic, environmental, or result from a combination of these factors.
  • neurodegenerative disease is meant a chronic debilitating disease, which may be slow and discrete in course. It generally causes a deterioration in the functioning of nerve cells, in particular neurons, which can lead to cell death (or neurodegeneration).
  • the disorders induced by neurodegenerative diseases are varied and can be cognitive-behavioral, sensory or motor.
  • genetic disease is meant a disease due to one or more abnormalities on one or more chromosomes which cause a malfunction of certain cells of the organism. Genetic diseases are said to be dominant or recessive, whether or not the responsible allele is dominant (in an individual, each gene is represented by two alleles). They can also be classified according to the position of the gene responsible for the anomaly. If it is located on the pair of sex chromosomes, the disease is called “gonosomal”, if it is located on a pair of homologous chromosomes, the disease is called “autosomal”.
  • hormones secreted by the endocrine glands are diseases and conditions in which hormones secreted.
  • psychiatric illness or “mental illness” or “mental illness” or “psychiatric disorder” or “psychic disorder” or “mental disorder” is meant a set of conditions and disorders of very different origins leading to difficulties in the life of an individual and / or those around him, suffering and emotional and behavioral disturbances.
  • Mental disorders affect all populations, regardless of sex or age. These disorders can be occasional, chronic or permanent.
  • cancer or “cancerous disease” is meant a disease caused by the transformation of cells which become abnormal and proliferate excessively (one can speak of anarchic proliferation). These disordered cells can eventually form a lump called a tumor (usually a malignant tumor). Cancer cells usually tend to invade nearby tissue and break away from the tumor. They can then migrate through blood vessels and lymphatic vessels to form another tumor: this is called metastasis. Cancers bring together a set of very diverse pathologies of forms and consequences, while systematically sharing a very typical set of characteristics regardless of the cancer concerned.
  • the following histological elements can in particular be found in most cancers: independence of cancer cells from signals which normally stimulate cells to multiply; insensitivity of cancer cells to antiproliferative signals and mechanisms; a proliferative capacity which is no longer limited (infinite growth, often resulting in neoplasms); the disappearance of the phenomenon of apoptosis in these same cancer cells, in other words a form of aggressive "immortality" at the expense of the patient; cell regression or dedifferentiation to a form more and more reminiscent of embryonic stem cells (the cancer cell can thus pass from a state of a specialized / differentiated cell to a state of a non-specialized, immature, multipotent or pluripotent cell); an abnormal ability to induce angiogenesis; often the acquisition of an invasive power in the advanced stages; lesions in the surrounding tissues (necrosis), whether or not there is tissue invasion; with very rare exceptions, these are cells from the individual affected by this cancer
  • tumor is meant an increase in the volume of a tissue, without specifying the cause. It is a neoformation of body tissues (neoplasia) which occurs as a result of a deregulation of cell growth, of the benign or malignant type (when it is a malignant tumor, we speak of cancer). Neoplasia can involve any type of tissue. Depending on the location of the tumor and the function of the affected tissue, it can lead to organ dysfunction and harm the whole body or even cause death. Tumors can occur in all multicellular organisms, including plants. A distinction is made between benign and malignant tumors:
  • Benign tumors are tumors that are generally harmless, that is to say that cannot give rise to daughter tumors (metastases), as is the case with warts or moles.
  • a benign tumor can cause serious complications (compression, inflammation, etc.) by its mechanical action.
  • Malignant tumors are often referred to as cancer. In addition to attacking surrounding tissue, they produce daughter tumors (metastases) that spread through the blood or lymph.
  • tumor is meant herein preferably a malignant tumor.
  • disease linked to an infection and / or linked to an exposure to a toxin is meant a disease which is preferably non-infectious, which is caused, caused, amplified and / or maintained by at least one infection and / or by a one-off exposure. , occasional, regular, prolonged or repeated to at least one toxin.
  • prevention or “prevention of a disease” or “prevention of the onset of a disease” is meant the reduction in the risk of appearing, developing or amplifying a disease, the causes of a disease, symptoms of a disease, the effects (or consequences, preferably adverse, deleterious effects / consequences) of a disease, or any combination thereof; and / or the fact of delaying the onset, development or amplification of a disease, the causes of a disease, the symptoms of a disease, the effects (or consequences, preferably the adverse effects / consequences, deleterious) disease, or any combination thereof.
  • treatment or “treatment of a disease” is meant the reduction, inhibition, and / or disappearance of a disease, the causes of a disease, the symptoms of a disease, the effects (or consequences, preferably adverse, deleterious effects / consequences) of a disease, or any combination thereof.
  • vaccine or “vaccine composition” is meant a pathogenic or tumor substance which, inoculated into an individual in a preferably harmless form, confers immunity against a disease (or protection against a disease).
  • a vaccine stimulates the body's immune response.
  • a vaccine can be preventative, preventing the onset of disease.
  • a vaccine can also be therapeutic, helping the patient to fight an ongoing disease.
  • drug is understood to mean any substance or composition presented as having curative or preventive properties with regard to human or animal diseases.
  • a medicinal product therefore comprises any substance or composition which can be used in humans or animals or which can be administered to them, with a view to establishing a medical diagnosis or to restoring, correcting or modifying their physiological functions by exerting a pharmacological action, immunological or metabolic.
  • T5 phage capsids devoid of phage genomic DNA, capable of exposing fusion proteins of interest on their surface.
  • These functionalized capsids are in particular capable of exerting, in vivo, the functions and activities of the fusion protein of interest used.
  • the present invention therefore relates to a T5 phage capsid devoid of genomic DNA of said phage and exhibiting, at its surface, at least one fusion protein, said fusion protein comprising at least one peptide or protein fragment having at least 80%. identity with a fragment of a pb10 decorating protein, preferably at least 81% identity, preferably at least 82% identity, preferably at least 83% identity, preferably at least 84% identity, preferably at least 85% identity, preferably at least 86% identity, preferably at least 87% identity, preferably at least 88% identity, preferably at least 89% identity, preferably at least 90% identity, preferably at least 91% identity, preferably at least 92% identity, preferably at least 93% identity, preferably at least 94% identity, preferably at least 95% identity, preferably at least 96% identity, preferably at least 97% identity, preferably at least 98% identity, preferably at least 99% identity, preferably 100% identity with a fragment of a pb10 decoration protein; said fragment of a p
  • the present invention relates in particular to a T5 phage capsid lacking genomic DNA of said phage and exposing, at its surface, at least one fusion protein, said fusion protein comprising:
  • - at least one peptide or protein fragment having at least 80% identity with a fragment of a pb10 decoration protein, preferably at least 81% identity, preferably at least 82% identity, of preferably at least 83% identity, preferably at least 84% identity, preferably at least 85% identity, preferably at least 86% identity, preferably at least 87% identity, preferably at least 88% identity, preferably at least 89% identity, preferably at least 90% identity, preferably at least 91% identity, preferably at least 92% identity, preferably at least 93% identity, preferably at least 94% identity, preferably at least 95% identity, preferably at least 96% identity, preferably at least 97% identity, preferably at least 98% identity, preferably at least 99% identity, preferably 100% identity with a fragment of a pb10 decoration protein; said fragment of a pb10 decoration protein comprising (or consisting essentially of, or consisting of) preferably at least 76 consecutive amino acids of a pb10 protein, preferably at least 77 consecutive amino acids
  • At least one functional fragment of an antigen or at least one functional fragment of a toxin, or at least one receptor fragment, or at least one functional fragment of an addressing or targeting or transport signal, or at least one functional fragment of an enzyme, or at least one functional fragment of a hormone, or at least one functional fragment of an antibody, or at least one antigen, or at least one toxin, or at least one receptor, or at least one addressing or targeting or transport signal, or at least one enzyme, or at least one hormone, or at least one antibody , or any combination thereof, preferably at least one functional fragment of antigen, more preferably at least one antigen.
  • the capsid according to the invention is therefore a functionalized empty capsid.
  • the capsid is characterized in that the fragment of the pb10 decoration protein is chosen from: i) a fragment of peptide or protein having at least 80% identity with a portion of the N- domain. terminal of a pb10 protein, preferably at least 81% identity, preferably at least 82% identity, preferably at least 83% identity, preferably at least 84% identity, preferably at least at least 85% identity, preferably at least 86% identity, preferably at least 87% identity, preferably at least 88% identity, preferably at least 89% identity, preferably at least 89% identity at least 90% identity, preferably at least 91% identity, preferably at least 92% identity, preferably at least 93% identity, preferably at least 94% identity, preferably at least less 95% identity, preferably at least 96% identity, preferably at least 97% identity, preferably at least 98% identity, preferably at least 99% identity, preferably 100% identity; said portion comprising (or consisting essentially of, or consisting of) preferably at least 76 consecutive
  • the fragment of the pb10 decoration protein can be selected from a fragment which comprises (or consists essentially of or consists of) the N-terminal domain of a pb10 protein, and a whole pb10 protein (which may be native or modified, in particular modified by cloning imperatives).
  • the fragment of the pb10 decoration protein is chosen from a protein comprising (or consisting essentially of or consisting of) an amino acid sequence having at least 80% identity with the sequence SEQ ID NO : 1 or with the sequence SEQ ID NO: 16, preferably at least 81% identity, preferably at least 82% identity, preferably at least 83% identity, preferably at least 84% identity identity, preferably at least 85% identity, preferably at least 86% identity, preferably at least 87% identity, preferably at least 88% identity, preferably at least 89% identity identity, preferably at least 90% identity, preferably at least 91% identity, preferably at least 92% identity, preferably at least 93% identity, preferably at least 94% identity identity, preferably at least 95% identity, preferably at least 96% identity, preferably at least 97% identity, preferably at least 98% i identity, preferably at least 99% identity, preferably 100% identity with the sequence SEQ ID NO: 1 or with the sequence SEQ ID NO: 16.
  • the fragment of the decoration protein pb10 is chosen from fragments of peptide or protein and peptides as defined in points iii), iv), v), vi) and vii) of paragraph below. above, and more preferably, the fragment of the pb10 decoration protein is chosen from peptide or protein fragments and peptides as defined in points iii) and v) of the above paragraph.
  • the capsid is characterized in that the fragment of the pb10 decoration protein is chosen from peptide or protein fragments and peptides as defined in points i), ii), v) and vi) of the above paragraph, and more preferably, the fragment of the pb10 decoration protein is chosen from peptide or protein fragments and peptides as defined in points v) and vi) of the above paragraph .
  • the functionalization the exposure of the fusion protein to the surface of the capsid
  • the fragment of the pb10 protein comprises the N-terminal domain of the pb10 protein or consists of this N-terminal domain.
  • the functional fragment of an antigen, the functional fragment of a toxin, the receptor fragment, the functional fragment of an addressing or targeting or transport signal, the functional fragment of an enzyme, the functional fragment of a hormone, the functional fragment of an antibody, the antigen, the toxin, the receptor, the targeting or targeting or transport signal, the enzyme, the hormone, the The antibody, or any combination thereof, is a peptide, polypeptide or protein comprising at least 10 consecutive amino acids, more preferably at least 12 consecutive amino acids, more preferably at least 15 consecutive amino acids, of more preferably at least 20 consecutive amino acids, more preferably at least 30 consecutive amino acids.
  • the functional fragment of an antigen, the functional fragment of a toxin, the receptor fragment, the functional fragment of an addressing or targeting or transport signal, the functional fragment of an enzyme, the functional fragment of a hormone, the functional fragment of an antibody, the antigen, the toxin, the receptor, the targeting or targeting or transport signal, the enzyme, the hormone, the antibody, or any combination thereof has a three-dimensional structure.
  • the functional fragment of an antigen, the functional fragment of a toxin, the receptor fragment, the functional fragment of an addressing or targeting or transport signal, the functional fragment of an enzyme, the functional fragment of a hormone, the functional fragment of an antibody, the antigen, the toxin, the receptor, the targeting or targeting or transport signal, the enzyme, the hormone, the The antibody, or any combination thereof, is not a tag usually used for affinity purification of a molecule, more preferably it is not a histidine tag (consisting of a chain of 6 to 10 amino acids of histidine).
  • the antigen is chosen from antigens comprising (or consisting essentially of, or consisting of) at least: a peptide, a protein, a glycoprotein, a sugar, an oside, a lipid, a nucleic acid, or any combination. of these.
  • the antigen is preferably an antigen of a microorganism, plant, alga, microalgae, bacterium, virus, parasite, yeast, fungus, insect, animal, or tumor; preferably an antigen of a eukaryotic or prokaryotic pathogen, or of a cancer; preferably a protein antigen, a lipid or a sugar of a bacterium, virus, parasite, yeast, fungus or tumor.
  • the toxin is chosen from toxins comprising (or consisting essentially of, or consisting of) at least: a chemical molecule, a peptide, a protein, a glycoprotein, a sugar, an oside, a lipid, a nucleic acid, or any combination of these.
  • the toxin is preferably a toxin of a microorganism, plant, algae, microalgae, bacteria, virus, parasite, yeast, fungus, insect, animal, or tumor; preferably a toxin from a eukaryotic or prokaryotic pathogen, or cancer.
  • the receptor is chosen from receptors comprising (or consisting essentially of, or consisting of) at least: a peptide, a protein, a glycoprotein, a sugar, an oside, a lipid, a nucleic acid, or any combination of these.
  • the receptor is preferably a receptor of a microorganism, plant, algae, microalgae, bacteria, virus, parasite, yeast, fungus, insect, animal, or tumor; preferably a receptor for a eukaryotic or prokaryotic pathogen, or for cancer; preferably a protein or glycoprotein receptor from bacteria, viruses, parasites, yeasts, fungi or tumors.
  • the addressing or targeting or transport signal is chosen from the addressing or targeting or transport signals comprising (or consisting essentially of, or consisting of) at least: a peptide, a protein, a glycoprotein, a sugar, an oside, a lipid, a nucleic acid, or any combination thereof.
  • the targeting or targeting or transport signal comprises (or consists essentially of, or consists of) at least one peptide, a protein, a glycoprotein, or a nucleic acid.
  • the signal is preferably a prokaryotic, eukaryotic or viral signal, preferably a signal from an animal, a plant, an alga, a microalga, a microorganism, a bacterium, a parasite, yeast, fungus, insect, virus, or cancer; more preferably a mammalian signal, such as a human signal.
  • the addressing or targeting or transport signal is chosen from an addressing or targeting or transport signal to / to the core; an addressing or targeting or transport signal to / to the cytoplasm; an addressing or targeting or transport signal to / to the cytosol; an addressing or targeting or transport signal to / to the cell membrane; an addressing or targeting or transport signal to / to the mitochondria; an addressing or targeting or transport signal to / to the peroxisomes; an addressing or targeting or transport signal to / to the lysosomes; an addressing or targeting or transport signal to / to the reticulum endoplasmic; a signal for addressing or targeting or transporting the secretion pathways; and a ligand of a receptor, preferably a membrane or transmembrane receptor, preferably a membrane or transmembrane receptor of a membrane selected from a cell membrane, an extracellular membrane, a cytoplasmic membrane and a nuclear membrane.
  • the functional fragment of an enzyme comprises at least, or essentially consists of at least, or consists of at least, one catalytic domain of an enzyme, preferably an active site of an enzyme.
  • the enzyme is preferably a prokaryotic, eukaryotic or viral enzyme, preferably an enzyme from an animal, a plant, an alga, a microalga, an insect, a microorganism, a bacterium, a parasite, a yeast, a fungus or a virus, more preferably a mammalian enzyme, such as a human enzyme.
  • the enzyme is chosen from prodrug converting enzymes, enzymes acting on nucleic acids, metabolic enzymes, enzymes of the immune system and enzymes for digestion.
  • the hormone is chosen from peptide or protein hormones, hormones derived from amines, steroid hormones or lipid hormones.
  • the hormone is preferably a hormone from an animal or plant, preferably a mammalian hormone, preferably a human hormone.
  • the functional fragment of an antibody is chosen from an Fc fragment of an antibody, an Fv fragment of an antibody, an Fab fragment of an antibody, and an F (ab ’) fragment of an antibody.
  • the antibody is preferably an animal antibody, preferably a mammalian antibody, preferably a human or humanized antibody.
  • the peptide or protein fragment having at least 80% identity with a fragment of a pb10 decoration protein, and / or the fusion protein can be obtained by the conventional methods of production / obtaining of fragment of a peptide or of a fusion protein and / or protein These methods include, for example, methods of expression using an expression system (for example by a vector), inserted into an expression cell , for example by cloning followed by purification. Those skilled in the art will know how to define the appropriate steps for implementing these methods.
  • the fusion protein is advantageously produced by any suitable expression system, of which the person skilled in the art will know how to define the appropriate steps for carrying out these methods. define the properties.
  • the fusion protein can in particular be produced from a plant or a plant cell, an animal (non-human) or an animal cell (excluding human embryonic stem cells) , an insect or an insect cell, of an alga or microalga or of an alga or microalga cell, of a fungus or of a fungus cell, of a yeast, of a parasite or of a parasite cell, of a microorganism or a cell of a microorganism, or a bacterium.
  • the fusion protein is preferably produced by a eukaryotic organism or a eukaryotic cell.
  • an antigen, toxin, receptor, targeting or targeting or transport signal, enzyme, hormone, antibody, or any combination thereof comprises, consists essentially of or consists of a non-protein substance or molecule (not comprising a fragment or portion of protein or peptide), said non-protein substance or molecule may be fused to the fragment of peptide or protein having at least 80% identity with a fragment of a pb10 decoration protein using methods known to those skilled in the art, who will be able to choose the most appropriate method.
  • These methods include, for example, the methods of fusion by reaction with an amine (fusion by covalent bonds; as described in particular in the article Robertson et al. 2011 (DOI: dx.doi.org/10.1021/bc100365j) and the methods of fusions by reaction with a streptavidin (fusion by non-covalent bonds; as described in particular in the article Edgar et al. 2009 (DOI: 10.1073 / pnas.0601211103).
  • the capsid further comprises:
  • the pb8 capsid protein comprises, or consists essentially of, or consists of an amino acid sequence having the sequence SEQ ID NO: 8.
  • the pb7 portal protein comprises, or consists essentially of, or consists of an amino acid sequence having the sequence SEQ ID NO: 7.
  • the pb11 protease comprises, or consists essentially of, or consists of an amino acid sequence having the sequence SEQ ID NO: 9.
  • the decoration protein pb10, the capsid protein pb8, the portal protein pb7 and / or the protease pb11 are proteins of the phage T5.
  • the activity and / or expression of pb7, pb8, pb10, pb11 and any combination of these may be inducible (for example by placing the gene encoding the corresponding protein (s) under the control of a inducible promoter).
  • the activity and / or expression of the protease is inducible (for example by placing the gene encoding the protease under the control of an inducible promoter).
  • the capsid is in expanded mature form.
  • the capsid is preferably isolated and / or purified.
  • the capsid is preferably recombinant.
  • the inventors have also developed particularly effective methods of producing the capsids according to the invention.
  • the invention also relates to a method of producing a capsid, comprising the following steps: a) production of a T5 phage capsid lacking genomic DNA and lacking pb10 protein; b) contacting the capsid from step a) with a fusion protein as defined above, in order to obtain a decorated capsid; and c) Optionally, purification of the decorated capsid from step b) using a neutral detergent, preferably chosen from n-Octyl-6-D-Glucopyranoside (6-OG) and Dodecyldimethylaminoxid (LDAO) ).
  • a neutral detergent preferably chosen from n-Octyl-6-D-Glucopyranoside (6-OG) and Dodecyldimethylaminoxid (LDAO)
  • step a The absence of the decoration protein pb10 (or for a fragment thereof) in step a) makes it possible to guarantee the total absence of decoration during the production of the capsids and before the addition of the fusion proteins. . This offers the advantage of allowing fusion with any type of substance or molecule (even non-protein), on demand.
  • the fusion protein is produced by the methods described above.
  • the inventors have also shown that, quite unexpectedly, the use of the detergents n-Octyl-6-D-Glucopyranoside (6-OG) and / or Dodecyldimethylaminoxid (LDAO) during the stages of purification of the capsids makes it possible to obtain pure capsids.
  • the use of these detergents makes it possible to eliminate the majority of contaminating endotoxins (resulting in particular from expression or production bacteria) and to respect (do not exceed) the endotoxin levels tolerated for administrations in a subject. animal, especially human.
  • the capsid from step a) is obtained by a method comprising the following steps:
  • a bacterium preferably a bacterium of the Enterobacteriaceae family, more preferably a bacterium of the genus Escherichia, more preferably an Escherichia coli bacterium, with a mutant T5 phage, deficient for the gene encoding the motor of packaging of T5 DNA -the terminase- and deficient for the gene encoding the pb10 decoration protein (preferably lacking the gene encoding the pb10 decoration protein);
  • step 2 Lysis of the bacteria from step 1, Precipitation or ultracentrifugation of the resulting bacterial lysate, and resuspension of the pellet in saline buffer.
  • the decorated capsid from step b) is obtained by a method comprising the following steps:
  • step a) bringing the capsid from step a) into contact with a fusion protein as defined above, for a determined time (preferably at least 10 min, preferably between 10 and 60 min), at a temperature ranging from 2 to 20 ° C (preferably a temperature between 3 and 5 ° C)
  • the capsid of step a) is obtained by a method comprising the following steps: a-1) obtaining a vector comprising:
  • At least one gene encoding a protein having at least 80% identity with a pb7 portal protein preferably at least 81% identity, preferably at least 82% identity, preferably at least 83 % identity, preferably at least 84% identity, preferably at least 85% identity, preferably at least 86% identity, preferably at least 87% identity, preferably at least 88 % identity, preferably at least 89% identity, preferably at least 90% identity, preferably at least 91% identity, preferably at least 92% identity, preferably at least 93 % identity, preferably at least 94% identity, preferably at least 95% identity, preferably at least 96% identity, preferably at least 97% identity, preferably at least 98 % identity, preferably at least 99% identity, preferably 100% identity with a pb7 portal protein;
  • the inventors have shown, quite surprisingly, that it is possible to produce these functionalized empty capsids without going through the production of a mutant phage.
  • This makes it possible to dispense with the step of infection of a bacterial culture by a mutant phage, and therefore to avoid the production of a large stock of phage, upstream of the production of the capsids.
  • This method also offers the advantage of avoiding the reversion of the phage to the wild-type genotype, thus increasing the yield of empty capsids and the safety.
  • This production and decoration method developed by the inventors is therefore completely independent of the bacteriophage T5.
  • This system is based on the construction of vectors (in particular recombinant plasmids) carrying the genes encoding the capsid proteins of bacteriophage T5. Thanks to this system, it is possible to produce either directly empty decorated and functional capsids (in this case the vector includes a sequence encoding the decoration protein and / or a fragment thereof), or empty undecorated capsids, which can be decorated in a second step, by simple contact with the fusion protein of interest.
  • the Inventors have developed a simplified large-scale production method of recombinant capsids, devoid of genomic DNA, which can be decorated in two different ways: i) by addition in vitro of the purified decoration protein; ii) by in situ co-production of the decoration protein.
  • the absence of the gene encoding the decoration protein pb10 (or for a fragment thereof) in the vector used makes it possible to guarantee the total absence of decoration during the purification of the capsids and before the addition of the chimeric proteins. purified. This offers the advantage of allowing fusion with any type of substance or molecule (even non-protein), on demand.
  • the operon used (inserted) in the vector of step a-1) comprises (or consists essentially of, or consists of) preferably a nucleic acid sequence having at least 80% identity with the sequence SEQ ID NO: 11, preferably at least 81% identity, preferably at least 82% identity, preferably at least 83% identity, preferably at least 84% identity, preferably at least 85% identity, preferably at least 86% identity, preferably at least 87% identity, preferably at least 88% identity, preferably at least 89% identity, preferably at least 90% identity, preferably at least 91% identity, preferably at least 92% identity, preferably at least 93% identity, preferably at least 94% identity, preferably at least 95% identity, preferably at least 96% identity, preferably at least 97% identity, preferably at least 98% identity, preferably at least 99% identity, preferably 100% d 'Identity with the sequence SEQ ID NO: 11.
  • the pb8 capsid protein comprises, or consists essentially of, or consists of an amino acid sequence having the sequence SEQ ID NO: 8.
  • the pb7 portal protein comprises, or consists essentially of, or consists of an amino acid sequence having the sequence SEQ ID NO: 7.
  • the pb11 protease comprises, or consists essentially of, or consists of an amino acid sequence having the sequence SEQ ID NO: 9.
  • the decoration protein pb10, the capsid protein pb8, the portal protein pb7 and / or the protease pb11 are proteins of the phage T5.
  • the activity and / or expression of pb7, pb8, pb10, pb11 and any combination of these may be inducible (for example by placing the gene encoding the corresponding protein (s) under the control of a inducible promoter).
  • the activity and / or expression of the protease is inducible (for example by placing the gene encoding the protease under the control of an inducible promoter).
  • the inventors have also shown that it is possible to directly produce the empty decorated capsid, using a vector encoding the proteins of the capsid and the protein pb10. Yields and efficiency are particularly high using this method.
  • the invention therefore relates to a method of producing a capsid comprising the following steps: a) obtaining a vector comprising:
  • At least one gene encoding a protein having at least 80% identity with a pb7 portal protein preferably at least 81% identity, preferably at least 82% identity, preferably at least 83 % identity, preferably at least 84% identity, preferably at least 85% identity, preferably at least 86% identity, preferably at least 87% identity, preferably at least 88 % identity, preferably at least 89% identity, preferably at least 90% identity, preferably at least 91% identity, preferably at least 92% identity, preferably at least 93 % identity, preferably at least 94% identity, preferably at least 95% identity, preferably at least 96% identity, preferably at least 97% identity, preferably at least 98 % identity, preferably at least 99% identity, preferably 100% identity with a pb7 portal protein;
  • step a) expression of the vector of step a) by a bacterium, preferably a bacterium of the Enterobacteriaceae family, more preferably a bacterium of the genus Escherichia, more preferably an Escherichia coli bacterium; in order to obtain a T5 phage capsid devoid of genomic DNA and exhibiting, on its surface, at least one copy of the fusion protein; and c) Optionally, purification of the decorated capsid from step
  • the operon used (inserted) into the vector of step a) comprises (or consists essentially of, or consists of) a nucleic acid sequence having at least 80% identity with the sequence SEQ ID NO: 10, preferably at least 81% identity, preferably at least 82% identity, preferably at least 83% identity, preferably at least 84% identity, preferably at least 85% identity, preferably at least 86% identity, preferably at least 87% identity, preferably at least 88% identity, preferably at least 89% identity, preferably at least 90% identity, preferably at least 91% identity, preferably at least 92% identity, preferably at least 93% identity, preferably at least 94% identity, preferably at least 95% identity, preferably at least 96% identity, preferably at least 97% identity, preferably at least 98% identity, preferably at least 99% identity, preferably 100% of identity with the sequence SEQ ID NO: 10.
  • the pb8 capsid protein comprises, or consists essentially of, or consists of an amino acid sequence having the sequence SEQ ID NO: 10.
  • the pb7 portal protein comprises, or consists essentially of, or consists of an amino acid sequence having the sequence SEQ ID NO: 7.
  • the pb11 protease comprises, or consists essentially of, or consists of an amino acid sequence having the sequence SEQ ID NO: 9.
  • the decoration protein pb10, the capsid protein pb8, the portal protein pb7 and / or the protease pb11 are proteins of the phage T5.
  • the present invention further relates to the capsid obtainable by a production method described above, as well as to a capsid obtained by a production method described above, as well as to a capsid directly obtained by a production method. production described above.
  • the inventors have shown that it is possible to produce these functionalized empty capsids completely independent of the T5 bacteriophage, thus avoiding the reversion of the phage to the wild-type genotype, increasing the yield of empty capsids and the safety.
  • This method of production and decoration is based on the construction of novel vectors (in particular recombinant plasmids) carrying the genes encoding the capsid proteins of bacteriophage T5.
  • novel vectors in particular recombinant plasmids carrying the genes encoding the capsid proteins of bacteriophage T5.
  • the invention therefore relates to a vector comprising:
  • At least one gene encoding a protein having at least 80% identity with a pb7 portal protein preferably at least 81% identity, preferably at least 82% identity, preferably at least 83 % identity, preferably at least 84% identity, preferably at least 85% identity, preferably at least 86% identity, preferably at least 87% identity, preferably at least 88 % identity, preferably at least 89% identity, preferably at least 90% identity, preferably at least 91% identity, preferably at least 92% identity, preferably at least 93% identity, preferably at least 94% identity, preferably at least 95% identity, preferably at least 96% identity, preferably at least 97% identity, preferably at least 98% identity, preferably at least 99% identity, preferably 100% identity identity with a pb7 portal protein;
  • At least one gene encoding a protein having at least 80% identity with a pb7 portal protein preferably at least 81% identity, preferably at least 82% identity, preferably at least 83 % identity, preferably at least 84% identity, preferably at least 85% identity, preferably at least 86% identity, preferably at least 87% identity, preferably at least 88 % identity, preferably at least 89% identity, preferably at least 90% identity, preferably at least 91% identity, preferably at least 92% identity, preferably at least 93% identity, preferably at least 94% identity, preferably at least 95% identity, preferably at least 96% identity, preferably at least 97% identity, preferably at least 98% identity, preferably at least 99% identity, preferably 100% identity identity with a pb7 portal protein;
  • (iv) at least one gene encoding a fusion protein as defined above; wherein the genes (i) to (iv) are placed under the control of an inducible promoter; preferably in which the genes (i) to (iv) are organized within a single operon; preferably wherein the genes (i) to (iii) are ordered according to the genome of phage T5, and the gene (iv) encoding the fusion protein occupies the locus of the gene encoding the pb10 protein in said genome;
  • the pb8 capsid protein comprises, or consists essentially of, or consists of an amino acid sequence having the sequence SEQ ID NO: 8.
  • the pb7 portal protein comprises, or consists essentially of, or consists of an amino acid sequence having the sequence SEQ ID NO: 7.
  • the pb11 protease comprises, or consists essentially of, or consists of an amino acid sequence having the sequence SEQ ID NO: 9.
  • the capsid protein pb8, the portal protein pb7 and / or the protease pb11 are proteins of phage T5 and the fusion protein comprises at least one fragment of the protein pb10 of phage T5 (preferably at least the N- domain. terminal of the pb10 decoration protein of phage T5 as defined above) ....
  • the promoter is preferably a T7 promoter; preferably the vector is an expression vector, preferably a bacterial expression vector, preferably a bacterial expression plasmid, preferably a T7 RNA polymerase expression plasmid.
  • the invention further relates to a host cell comprising at least one capsid as defined above, or at least one capsid capable of being obtained (or obtained, or directly obtained). by any one of the production methods defined above, or at least one vector as defined above, or any mixture of these.
  • the host cell can be a eukaryotic cell or a prokaryotic cell.
  • the host cell is preferably a bacterium, preferably a bacterium of the Enterobacteriaceae family, more preferably a bacterium of the genus Escherichia, more preferably an Escherichia coli bacterium.
  • the host cell is preferably isolated.
  • the host cell is preferably recombinant.
  • the invention also relates to a fusion protein as defined above.
  • the fusion protein is preferably isolated and / or purified.
  • the fusion protein is preferably recombinant.
  • the invention also relates to the nucleic acid encoding the fusion protein as defined above.
  • the nucleic acid is preferably isolated and / or purified.
  • the nucleic acid is preferably recombinant.
  • the invention also relates to a nanoparticle comprising at least one capsid as defined above, or at least one capsid capable of being obtained by a production method described above, or at least one capsid obtained by a production method described above, or at least one capsid directly obtained by a production method described above, or at least one vector as defined above, or at least one host cell as defined above, or a mixture any of these.
  • the invention further relates to a capsid as defined above, or a capsid obtainable by a production method described above, or a capsid obtained by a production method described above, or a capsid directly obtained by a production method described above, characterized as being a nanoparticle and / or a vector as defined above, characterized as being a nanoparticle.
  • the invention relates to the use of at least one capsid as defined above, or of at least one capsid capable of being obtained by a production method described above, or of at least one capsid obtained by a production method described above, or at least one capsid directly obtained by a production method described above, or at least one vector as defined above, or any mixture of these, like nanoparticle.
  • the use is a non-medical biotechnological use.
  • the use is in vitro use.
  • composition - Composition - Pharmaceutical composition
  • the invention further relates to a composition
  • a composition comprising at least one capsid as defined above, or at least one capsid capable of being obtained by a production method described above, or at least one capsid obtained by a method of production described above, or at least one capsid directly obtained by a production method described above, or at at least one vector as defined above, or at least one host cell as defined above, or at least one nanoparticle as defined above, or any mixture of these.
  • the composition can also comprise at least one cosmetically acceptable excipient (in this case, the composition is a cosmetic composition) and / or at least one suitable vehicle which can be any excipient and / or any vehicle among those known to a person skilled in the art. trade with a view to obtaining a composition as defined above.
  • at least one cosmetically acceptable excipient in this case, the composition is a cosmetic composition
  • suitable vehicle which can be any excipient and / or any vehicle among those known to a person skilled in the art. trade with a view to obtaining a composition as defined above.
  • the inventors have shown, quite surprisingly, that the fusion protein, exposed by the capsids according to the invention, retains all of its properties and functionalities, in particular once administered in vivo.
  • the administration of these antigen-functionalized capsids in model mice induces effective immunization, with significant induction of a humoral response (antibody) and a cellular response. This immunization results in effective vaccination of these mice.
  • the invention therefore relates to a pharmaceutical and / or vaccine composition
  • a pharmaceutical and / or vaccine composition comprising at least one capsid as defined above, or at least one capsid capable of being obtained by a production method described above, or at least one capsid obtained. by a production method described above, or at least one capsid directly obtained by a production method described above, or at least one vector as defined above, or at least one host cell as defined above. above, or at least one nanoparticle as defined above, or any mixture of these.
  • the pharmaceutical and / or vaccine composition further comprises at least one pharmaceutically acceptable excipient and / or at least one pharmaceutically acceptable adjuvant and / or at least one pharmaceutically acceptable vehicle, which can be any excipient and / or any adjuvant and / or any suitable vehicle from among those known to those skilled in the art with a view to obtaining a pharmaceutical and / or vaccine composition as defined above.
  • the composition (pharmaceutical or not, vaccine or not) is provided in a form suitable for topical administration, orally, by injection.
  • the operating conditions for preparing these compositions are part of the general knowledge of those skilled in the art.
  • the composition is devoid of additional adjuvant.
  • the capsid according to the invention provides the effect of an adjuvant, with an adjuvant effect at least as effective as a model adjuvant (Freund's complete adjuvant).
  • the inventors have shown, quite surprisingly, that the fusion protein, exposed by the capsids according to the invention, retains all of its properties and functionalities, in particular once administered in vivo.
  • the administration of these capsids functionalized by an antigen in model mice induces effective immunization, with the significant induction of a humoral response (antibody) and a cellular response. This immunization results in effective vaccination of these mice.
  • the invention therefore relates to a capsid as defined above, or to a capsid capable of being obtained by a production method described above, or to a capsid obtained by a production method described above, or to a capsid directly. obtained by a production method described above, or a vector as defined above, or a host cell as defined above, or a nanoparticle as defined above, or a pharmaceutical and / or vaccine composition as defined above, or any mixture thereof, for use as a medicament and / or as a vaccine.
  • the invention also relates to a pharmaceutical and / or vaccine composition
  • a pharmaceutical and / or vaccine composition comprising at least one capsid as defined above, or at least one capsid capable of being obtained by a production method described above, or at least one capsid obtained. by a production method described above, or at least one capsid directly obtained by a production method described above, or at least one vector as defined above, or at least one host cell as defined above. above, or at least one nanoparticle as defined above, or any mixture thereof, for its use as a medicament and / or as a vaccine.
  • the invention also relates to the use of a capsid as defined above, or of a capsid obtainable by a production method described above, or of a capsid obtained by a production method described above, or of a capsid directly obtained by a production method described above, or of a vector as defined above, or of a host cell as defined above, or of a nanoparticle as defined above, or a pharmaceutical and / or vaccine composition as defined above, or any mixture thereof, for the manufacture of a medicament and / or a vaccine.
  • the invention also relates to a method of prevention or therapeutic treatment, comprising the administration of a capsid as defined above, or of a capsid obtainable by a production method described above, or of a capsid obtained by a production method described above, or of a capsid directly obtained by a production method described above, or of a vector as defined above, or of a host cell as defined above, or of a nanoparticle as defined above, or of a pharmaceutical and / or vaccine composition as defined above, or of any mixture of these.
  • the invention also relates to a capsid as defined above, or a capsid obtainable by a production method described above, or a capsid obtained by a production method described above, or a capsid directly. obtained by a production method described above, or a vector as defined above, or a host cell as defined above, or a nanoparticle as defined above, or a pharmaceutical and / or vaccine composition as defined above, or any mixture thereof, for its use in the prevention and / or treatment of an infection, such as a viral or bacterial infection; an autoimmune disease; metabolic disease; of a disease dermatologic, cardiovascular disease; respiratory disease; neurodegenerative disease; a genetic disease; hormonal disease; psychiatric illness; of a cancer ; a disease linked to an infection and / or a toxin, such as a disease linked to a viral or bacterial infection and / or linked to exposure to a toxin.
  • an infection such as a viral or bacterial infection
  • an autoimmune disease such as a viral or bacterial infection
  • the invention also relates to a pharmaceutical and / or vaccine composition
  • a pharmaceutical and / or vaccine composition comprising at least one capsid as defined above, or at least one capsid capable of being obtained by a production method described above, or at least one capsid obtained. by a production method described above, or at least one capsid directly obtained by a production method described above, or at least one vector as defined above, or at least one host cell as defined above.
  • an infection such as a viral or bacterial infection; an autoimmune disease; metabolic disease; dermatological disease, cardiovascular disease; respiratory disease; neurodegenerative disease; a genetic disease; hormonal disease; psychiatric illness; of a cancer ; a disease linked to an infection and / or a toxin, such as a disease linked to a viral or bacterial infection and / or linked to exposure to a toxin.
  • an infection such as a viral or bacterial infection; an autoimmune disease; metabolic disease; dermatological disease, cardiovascular disease; respiratory disease; neurodegenerative disease; a genetic disease; hormonal disease; psychiatric illness; of a cancer ; a disease linked to an infection and / or a toxin, such as a disease linked to a viral or bacterial infection and / or linked to exposure to a toxin.
  • Example 1 Construction of pb10 proteins of phage T5 fused with ovalbumin and demonstration of their decoration properties of the empty capsid of phage T5
  • IPTG 0.4mM isopropyl-B-D-thiogalactopyranoside
  • the endotoxin level complies with the vaccination requirements ( ⁇ 100 EU / mL).
  • the chimeric proteins produced according to Example 1.1 above were used to decorate empty capsids of bacteriophage T5. Decoration tests were done by incubating for 10 minutes at 4 ° C., the PO and PNO proteins purified with capsids produced according to the method described in the article Preux et al. 2013 and Vernhes et al. 2017, modified and optimized as follows: i) A new mutant of phage T5 was constructed for the production of empty capsids - T5stAmN5- Adec - which results from the deletion of the gene encoding the decoration protein pb10 in phage T5stAmN5 described in the publications Preux et al. 2013 and Zivanovic 2014.
  • This mutant makes it possible to guarantee the total absence of decoration during the production of the capsids and before the addition of the purified chimeric proteins (data not shown).
  • Two detergents are used successively during the capsid purification steps. N-Octyl-BD-Glucopyranoside (B-OG) and Dodecyldimethylaminoxid (LDAO). Briefly, the capsids harvested in the bacterial lysate resulting from the infection of a bacterial culture of the E.coli F strain by the mutant phage T5amN5-Adec, are precipitated in the presence of 0.5 M NaCl and 8% of PEG 6000.
  • the fractions containing the capsids are incubated for 6 to 12 hours in the presence of 1% B-OG, before being injected onto an anion exchange column. . Two successive purification steps are carried out on this column. In the first step the equilibration buffer and the elution buffer contain 0.2 to 0.05% LDAO.
  • the fractions containing the capsids are subjected to a new purification by anion exchange in the absence of detergents. This protocol makes it possible to eliminate a very large part of the contaminating endotoxins and to respect (do not exceed) the endotoxin levels tolerated for them. capsid injections in mice.
  • Figure 3 shows the results of the pure empty capsid decoration assays with the pb10, PO and PNO proteins.
  • concentration ratios [protein] / [binding sites on the capsid] 1 +/- 0.1.
  • FIG. 3 shows that the capsids are fully decorated with the same concentrations of pb10, PO and PNO proteins. This first test indicates that the affinity of the PO and PNO proteins for the capsids is comparable to that of the native protein pb10.
  • the T5 capsid therefore constitutes a nanoparticle of biological origin capable of exposing on its surface 120 copies of a protein whose function may vary depending on the nature of the peptide or of the protein which is fused to the decoration protein.
  • chimeras' Whole pb10 protein fused to a protein of interest 3 fused to a protein of interest: mCHERRY fluorescent protein
  • T5 phage-independent capsid production system The empty capsid production method, which was used at the start of this study, is based on the infection of a bacterial culture with a mutant T5 phage, which requires the production of a large stock of this phage, upstream of the production of the capsids. In addition, during infection, there is a high frequency of phage reversion to the wild-type genotype, which decreases the yield of empty capsids. To overcome these constraints and with a view to increasing the production scale of capsids, the Inventors have developed a system for producing and decorating capsids that is completely independent of the T5 bacteriophage.
  • the 4 capsid genes encoding the portal protein pb7, the decoration protein pb10, the processing protease pb11 and the major capsid protein pb8 were cloned into a vector pET28b, as they are organized in the genome of T5 ( pETcapT5; Figure 6). Their expression, under the control of a T7 promoter, is repressed in the presence of glucose and inducible by IPTG, which makes it possible to control the basal expression of the protease which is toxic to the strain of expression E. coli.
  • a second version of this plasmid (pETcapT5Adec; Figure 7) in which the gene for the pb10 protein has been deleted was also constructed.
  • the sequences of the operons as inserted into these plasmids, as well as those of the plasmids obtained are as follows:
  • CapT5 operon (insert): SEQ ID NO: 10; CapT5Adec (insert) operon: SEQ ID NO: 11; pETcapT5: SEQ ID NO: 12; pETcapT5Adec: SEQ ID NO: 13.
  • the purification of the capsids produced from the plasmids was carried out according to the protocols already described for the capsids produced from the mutant phages, with some variations.
  • the capsids harvested after the first stage of purification on a glycerol gradient were centrifuged for 20 to 30 minutes at 60,000 g. This ultracentrifugation step makes it possible to concentrate the capsids and to eliminate a large part of the soluble proteins and contaminating DNA, before the anion exchange chromatography steps.
  • the capsids which were assembled in the absence of pb10 show decorative properties comparable to those of the capsids produced from the phage.
  • the capsids produced in the presence of the pb10 decoration protein have electrophoretic mobility comparable to those of fully decorated capsids, and their migration on the gel is not affected by the addition of pb10. This result shows that they were decorated in situ during their assembly, their inability to bind the decoration protein if it is added after their purification, and that all the binding sites are saturated during assembly (optimal efficiency ).
  • the presence of pb10 on these capsids was verified by Western blot using polyclonal antibodies directed against pb10 ( Figure 9).
  • T5 capsids can therefore be decorated in two different ways: i) by addition in vitro of the purified decoration protein, ii) by co-production in vivo of the decoration protein with the proteins forming the capsid. These two methods allow the simplified production of functionalizable nanoparticles and allow them to be produced on a larger scale, compared to the production which uses T5 phages.
  • Example 2 Mouse vaccination experiments (in vivo) The results obtained in the in vivo experiments were generated using preparations of phage capsids and recombinant proteins produced by the group of Pascale Boulanger (PB). The endotoxin contamination of the preparations was tested by the group of Karim Benihoud (KB).
  • PB Pascale Boulanger
  • Endotoxin levels in protein preparations and capsids used for in vivo experiments were quantified using the LAL Chromogenic Endotoxin Quantitation Kit (Pierce LAL) according to the manufacturer's instructions (Thermo Fisher Scientific).
  • mice Six week old female C57BL / 6 mice were provided by Janvier (Le Genest Saint Isle, France). All mice were conditioned for at least one week in our animal facilities before the start of the experiments. All animal experiments have been approved (authorization number 19055-2019021108472030) by Ethics Committee n ° 26 (officially recognized by the French Ministry of Research) in accordance with European Directive 2010/63 EU and its transposition in French law.
  • Recombinant fusion pb10 proteins (3.6 mM) with or without capsid (32 nM) were injected subcutaneously in a volume of 50 ⁇ l of PBS buffer.
  • a control group was injected with pb10-0va (3.6 mM) mixed with complete Freund's adjuvant (FCA, Sigma). Similar conditions were used for the re-administrations (second injection), except for the control group in which Freund's complete adjuvant was replaced with incomplete Freund's adjuvant (IFA, Sigma).
  • Blood samples were taken from the submandibular vein at various times after administration of the vaccine preparations. The sera were prepared and analyzed for the presence of specific antibodies by ELISA, as described below. The spleens were collected 10 days after the second injection to measure cellular immune responses.
  • Ovalbumin (1 ⁇ g, Sigma) was immobilized on 96 well plates (Nunc). After washing in TBST buffer and saturation with TBS-Tween at 5% milk, serial dilutions of the sera in TBST 5% milk were added. Bound antibodies were detected with goat antibodies specific for IgG or isotypes (lgG1, lgG2b, lgG2c, lgG3 or IgM) of mice conjugated to peroxidase (Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL). The peroxidase activity was revealed by incubation with the O-phenylenediamine dihydrochloride substrate (Sigma - Aldrich) for 30 min.
  • the reaction was stopped by adding 3N HCl and spectrophotometric readings were taken at 490 nm.
  • the titers were defined as being the inverse of the highest dilution giving an OD490 twice the background values.
  • a similar protocol was used to measure specific Ab for capsid or pb10.
  • the spleens were ground in RPMI medium supplemented with 10% fetal calf serum and 10 5 M mercaptoethanol, then filtered through a 100 ⁇ m sieve. After removal of the red blood cells with the ACK lysis buffer (Invitrogen, Cergy Pontoise, France), the cells were resuspended and the concentration was adjusted to 2.5 c 10 6 cells / mL. The splenocytes were then restimulated under different conditions (medium alone, peptide Ova257-264 (5 ⁇ g / ml), in a volume of 200 ⁇ l for one day (ELISPOT) or for three days (ELISA).
  • ELISPOT peptide Ova257-264
  • ELISPOTs For ELISPOTs, the plates were revealed according to the supplier's instructions (Diaclone). The number of spots of IFN ⁇ -producing cells was counted using ImmunoSpot® S6 FluoroSpot (CTL, Cleveland, Ohio). For the ELISA test, the Concentration of IFN ⁇ in the supernatants was determined using an IFN ⁇ assay kit (eBioscience). Re-stimulation with ionomycin (1 pM) and Phorbol myristate acetate (0.1 pM) was used to control the quality of splenocyte preparations.
  • the PO + C and PNO + C groups produce less anti-Ova Ab type lgG1 but produce more Ac type lgG3. There is no significant difference for anti-Ova Ab of isotype lgG2b and lgG2c (for lgG2c there is a tendency to increase).
  • mice vaccinated with the fusion + capsid proteins have a greater anti-Ova T response.
  • T epitope capable of associating with class I molecules of the major histocompatibility complex
  • the number of IFN ⁇ -producing splenocytes is not significantly different between the PO + C and PNO + C groups, suggesting that the pb10 fusion protein does not necessarily have to contain the entire pb10 sequence.
  • the pt> 10 fusion proteins co-administered with the purified phage capsids induce strong cellular responses in mice.
  • the splenocyte restimulation test with the immunodominant peptide Ova257-264 shows a greater number of IFN ⁇ -producing splenocytes for mice injected with PNO + C compared to mice injected with PNO alone (FIG. 13A).
  • the number of IFN ⁇ -producing splenocytes or the quantity of IFN ⁇ produced in the supernatant is greater than those found with the splenocytes of mice injected with PNO + ACF.

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Abstract

La présente invention concerne des capsides de phage T5 dépourvues d'ADN génomique dudit phage et exposant, à leur surface, au moins une protéine de fusion d'intérêt. L'invention concerne en particulier une capside de phage T5 dépourvue d'ADN génomique dudit phage et exposant, à sa surface, au moins une protéine de fusion, ladite protéine de fusion comprenant : - au moins un fragment de peptide ou de protéine ayant au moins 80% d'identité avec un fragment d'une protéine de décoration pb10; et - au moins un fragment fonctionnel d'un antigène, ou au moins un fragment fonctionnel d'une toxine, ou au moins un fragment de récepteur, ou au moins un fragment fonctionnel d'un signal d'adressage ou de ciblage ou de transport, ou au moins un fragment fonctionnel d'une enzyme, ou au moins un fragment fonctionnel d'une hormone, ou au moins un fragment fonctionnel d'un anticorps, ou au moins un antigène, ou au moins une toxine, ou au moins un récepteur, ou au moins un signal d'adressage ou de ciblage ou de transport, ou au moins une enzyme, ou au moins une hormone, ou au moins un anticorps, ou une combinaison quelconque de ceux-ci. La présente invention porte également sur les méthodes de production d'une telle capside et sur des vecteurs permettant leur production. L'invention concerne en outre les protéines de fusion d'intérêt exposées sur la capside et les acides nucléiques les codant. L'invention concerne également des nanoparticules comprenant ces capsides fonctionnalisées, des compositions pharmaceutiques comprenant ces nanoparticules et/ou ces capsides fonctionnalisées, ainsi que leurs utilisations thérapeutiques, notamment comme médicament et/ou comme vaccin.

Description

DESCRIPTION
TITRE
Production et fonctionnalisation de nanoparticules dérivées du phage T5 et utilisations thérapeutiques
DOMAINE DE L’INVENTION
La présente invention se situe dans le domaine de la virologie bactérienne, de la biochimie et de la virothérapie. Elle concerne des capsides de phage T5 dépourvues d’ADN génomique dudit phage et exposant, à leur surface, au moins une protéine de fusion d’intérêt, notamment d’intérêt thérapeutique. La présente invention porte également sur les méthodes de production d’une telle capside et sur des vecteurs permettant leur production. L’invention concerne en outre les protéines de fusion d’intérêt exposées sur la capside et les acides nucléiques les codant. L’invention concerne également des nanoparticules comprenant ces capsides fonctionnalisées, des compositions pharmaceutiques comprenant ces nanoparticules et/ou ces capsides fonctionnalisées, ainsi que leurs utilisations thérapeutiques, notamment comme médicament et/ou comme vaccin.
ETAT DE LA TECHNIQUE
Les phages (ou bactériophages) sont des virus bactériens, omniprésents dans l'ensemble de la biosphère. La plus grande famille des virus bactériens regroupe les bactériophages caudés, constitués d’une capside icosaédrique renfermant le génome viral qui est une molécule d’ADN double brin, et d’une queue permettant l’injection du génome dans la cellule hôte. Les capsides icosaédriques de ces virus sont des assemblages macromoléculaires extrêmement stables qui, souvent, exposent à leur surface des protéines dites « de décoration ». Ces protéines peuvent être modifiées génétiquement afin de produire des virus portant des protéines chimères, formées de la protéine native fusionnée à une protéine fonctionnelle d’intérêt thérapeutique ou biotechnologique (Tao et al. 2013 ; Razazan et al. 2018). La démarche développée jusqu’à présent pour obtenir des virus ou seulement leur capside décorée avec des protéines chimères, consiste à modifier la protéine de décoration dans le génome du virus ou dans un plasmide puis à produire des particules virales à partir de l’infection de leurs bactéries hôtes. Toutefois, le génome viral est intégré dans les particules et capsides ainsi produites, limitant ainsi leurs applications thérapeutiques et biotechnologiques. En effet, les particules ainsi produites peuvent conserver un caractère infectieux, avec un risque de mutations génétiques non négligeable (pouvant notamment conduire à une réversion vers un phénotype sauvage). Outre les risques sanitaires et thérapeutique, les mutations génétiques présentent un problème pour des productions homogènes à l’échelle industrielle.
Dans ce contexte, il apparaît nécessaire de pouvoir s’affranchir de la présence de l’acide nucléique viral. Toutefois, la possibilité de produire des capsides vides d’ADN, de les purifier et de les décorer « à façon » avec une protéine fonctionnalisée reste inexplorée. Or, de telles capsides présenteraient au minimum les avantages d’être sûres et sans risques sur le plan thérapeutique et sanitaire, tout en permettant une production à grande échelle (notamment à l’échelle industrielle). En effet, l’absence du génome viral permet l’élimination de tout risque de mutation ou de réversion à un phénotype sauvage et assure un niveau de reproductivité élevé et une prolifération in vivo entièrement maîtrisée et contrôlée, le potentiel d’application biotechnologiques et thérapeutiques étant apporté par la fonctionnalisation à façon de ces particules et capsides. Il existe donc un fort besoin de développer des particules et capsides de phages qui soient à la fois fonctionnalisées et dépourvues d’acide nucléique génomique.
Le bactériophage T5, qui infecte la bactérie Escherichia coli, possède une capside de 90 nm de diamètre qui s’auto-assemble en passant par différents états structuraux dont la maturation suit une séquence d’étapes bien définie (Figure 1 ). Une procapside icosaédrique est initialement assemblée à partir de la protéine majeure de capside pb8, de la protéine portale pb7 et de la protéase de maturation pb11 . La procapside est maturée par la protéase pb11 , ce qui produit une capside vide, prête à recevoir le génome viral. L’encapsidation de l’ADN est assurée par un moteur moléculaire et cette étape s’accompagne d’une réorganisation structurale des sous-unités de la protéine de capside, provoquant l’expansion de la capside. La protéine de décoration monomérique pb10 peut alors décorer la surface extérieure de la forme mature expansée ainsi obtenue, 120 copies pouvant ainsi être exposées.
Il a été montré qu’il est possible de produire et purifier des capsides vides non décorées, qui ne contiennent pas le génome viral (Preux et al. 2013). L’expansion de ces capsides peut être provoquée in vitro. Les capsides non décorées ainsi obtenues ont alors la même géométrie que les capsides de la particule infectieuse (Figure 1 B et article Preux et al. 2013).
Il a été montré que la protéine de décoration pb10 se lie à la capside du phage T5 avec une haute affinité (mesurée par une constante de dissociation KD= 1012 M). La structure de la protéine de décoration pb10 a révélé une protéine formée de deux domaines indépendants, un domaine N- terminal de fixation à la capside et un domaine C-terminal externe exposé au solvant (Figure 1 C, Vernhes et al. 2017). Toutefois, l’affinité de protéines de décoration chimères, formées de la fusion la protéine de décoration à une protéine fonctionnelle d’intérêt thérapeutique ou biotechnologique, à la capside, n’a pas été étudiée. Ainsi, la possibilité de produire des capsides de T5 vides d’ADN génomique viral, exposant une protéine fonctionnalisée n’a à ce jour pas été explorée.
Il existe donc un fort besoin de développer des particules et capsides de phage T5 fonctionnalisées, ne présentant pas de risque d’infection ou de réversion, ainsi que des méthodes de production à grande échelle de telles particules et capsides, adaptées à des utilisations thérapeutiques et biotechnologiques.
La présente invention permet de répondre à ces besoins. Les présents Inventeurs ont conçu des protéines chimères inédites, constituées de la protéine pb10 entière fusionnée à une protéine d’intérêt ou seulement du domaine N-terminal de pb10 fusionné à une protéine d’intérêt qui remplace le domaine C-terminal. Ils ont notamment démontré pour la première fois que ces protéines modifiées, appelées protéines de fusion, peuvent être correctement exposées à la surface de capsides du phage T5 entièrement dépourvues d’ADN génomique, avec une grande efficacité. Les données montrent en particulier que, de manière tout à fait inattendue, l’affinité de ces protéines modifiées pour les capsides du phage T5 est identique à celle de la protéine pb10 native. La capside vide (dépourvue de génome) de T5 constitue donc une nanoparticule d’origine biologique, sûre, pouvant exposer à sa surface 120 copies d’une protéine dont la fonction peut varier avec la nature de la molécule d’intérêt qui est fusionnée à la protéine de décoration.
Les Inventeurs ont également montré, de manière tout à fait surprenante, qu’il est possible de produire ces capsides vides fonctionnalisées sans passer par la production d’un phage mutant. Ceci est d’autant plus avantageux et surprenant que le protocole de production de capsides dépourvues d’ADN imposait jusqu’à présent une étape d’infection d’une culture bactérienne par un phage mutant. Cependant, cette étape nécessite la production d’un stock important de phage, en amont de la production des capsides. De plus, lors de l’infection, on observe une forte fréquence de réversion du phage vers le génotype sauvage, ce qui diminue le rendement en capsides vides. Pour d’affranchir de ces contraintes et dans la perspective d’augmenter l’échelle de production des capsides, les Inventeurs ont développé un système de production et de décoration des capsides totalement indépendant du bactériophage T5. Ce système est basé sur la construction de plasmides recombinants portant les gènes codant uniquement pour les protéines de capside du bactériophage T5. Grâce à ce système, il est possible de produire soit directement des capsides vides décorées et fonctionnelles, soit des capsides vides expansées et non décorées, qui peuvent être décorées dans un second temps, par simple mise en contact avec la protéine de fusion d’intérêt. Les données montrent, de façon tout à fait inattendue, que l’expression de ces plasmides chez des bactéries conduit à l’assemblage de capsides dont la morphologie est similaire à celle des capsides produites par la méthode classique utilisant un phage complet (mutant ou non), et dont les propriétés de décoration sont comparables à celles des capsides produites à partir du phage complet. En effet, les données montrent que les propriétés d’autoassemblage des capsides à partir de l’expression ectopique des gènes de capsides, en dehors du cycle viral du phage T5, sont conservées. Les Inventeurs ont donc développé une méthode de production simplifiée, à grande échelle, de capsides recombinantes, dépourvues d’ADN génomique, pouvant être décorées de deux façons différentes : i) par addition in vitro de la protéine de décoration purifiée ; ii) par co-production in situ de la protéine de décoration.
Les Inventeurs ont également validé, pour la première fois, le potentiel d’applications biotechnologiques (notamment thérapeutiques), des capsides vides de phages T5 ainsi fonctionnalisées. Ainsi, les données des Inventeurs montrent que, de manière tout à fait surprenante, l’administration de ces capsides fonctionnalisées par un antigène chez des souris modèles, induit une immunisation efficace, avec l’induction significative d’une réponse humorale (anticorps) et d’une réponse cellulaire. Cette immunisation résulte en une vaccination efficace de ces souris. Ces résultats inattendus démontrent ainsi que la protéine de fusion, exposée par ces capsides, conserve l’ensemble de ses propriétés et fonctionnalités. Au regard des données obtenues par les inventeurs et présentées en substance dans la partie exemples qui suit, il apparaît que la présente invention présente autant d’applications biotechnologiques et thérapeutiques que de protéines de fusion différentes susceptibles d’être construites.
EXPOSE DE L’INVENTION
Dans le cadre de la présente invention, les Inventeurs ont mis au point, de manière tout à fait surprenante, des capsides de phage T5 vides, dépourvues d’ADN génomique de phage, exposant à leur surface des protéines de fusion d’intérêt. Ces capsides fonctionnalisées peuvent être produites à grande échelle, en s’affranchissant du cycle viral du phage T5, avec une grande reproductibilité. En outre, ces capsides fonctionnalisées sont capables d’exercer, in vivo, les fonctions et activités de la protéine de fusion d’intérêt utilisée.
La présente invention concerne donc une capside de phage T5 dépourvue d’ADN génomique dudit phage et exposant, à sa surface, au moins une protéine de fusion, comprenant au moins un fragment de peptide ou de protéine ayant au moins 80% d’identité avec un fragment d’une protéine de décoration pb10, ainsi que ces méthodes de production. L’invention concerne notamment une méthode de production d’une telle capside, comprenant l’obtention d’un vecteur codant des protéines de la capside du phage T5, ainsi que ledit vecteur.
La présente invention concerne également les protéines de fusion d’intérêt exposées sur la capside et les acides nucléiques les codant. L’invention concerne en outre des nanoparticules comprenant ces capsides fonctionnalisées, des compositions pharmaceutiques comprenant ces nanoparticules et/ou ces capsides fonctionnalisées, ainsi que leurs utilisations thérapeutiques, notamment comme médicament et/ou comme vaccin.
DESCRIPTION DES FIGURES
La Figure 1 montre le cycle de maturation de la capside du phage T5. A) Image de microscopie électronique en coloration négative du bactériophage T5 et reconstruction de la capside du bactériophage T5 à partir de données de cryo- microscopie électronique. La protéine de décoration pb10 est colorée en rouge (120 copies fixées à la surface de la capside). B) Schéma du mécanisme d’assemblage de la capside du bactériophage T5. Le précurseur de la protéine majeure de capside, pb8p, consiste en un domaine d’échafaudage appelé domaine-D (résidus 1 à 159, représenté par un triangle gris) et un domaine structural mature, pb8m (résidus 160 à 458, représenté par un rectangle violet). pb8p s’auto-assemble en une procaside icosaédrique appelée prohead I qui inclut le complexe dodécamérique de la protéine portale (pb7). La protéase (pb11 ) également localisée à l’intérieur de la prohead I effectue le clivage du domaine-D des sous-unités de pb8p mais aussi des 10 acides aminés N-terminaux de la portale et elle s’auto-protéolyse à ses deux extrémités pour former la prohead II. L’encapsidation du génome par la terminase à travers le complexe portai induit l’expansion de la capside et la fixation de la protéine de décoration (pb10) à la surface de la capside. La capside est finalement fermée par une protéine « bouchon » p144 qui forme avec la portale un connecteur permettant la fixation de la queue du phage qui est assemblée séparément. C) L’infection des bactéries par un phage T5 muté dans le gène de la terminase et incapable d’encapsider l’ADN conduit à l’accumulation des formes prohead I, qui peuvent être purifiées et expansées in vitro, puis décorées par la protéine de décoration pb10.
La Figure 2 montre l’analyse de la pureté des protéines chimères PO et PNO par SDS-PAGE - Fractions éluées après chromatographie d’exclusion par la taille sur colonne Superdex75 HR10/300 (GE Healthcare).
La Figure 3 montre les essais de décoration de capsides vides pures avec les protéines pb10, PO et PNO. Les concentrations respectives des différentes protéines de décoration et des capsides ont été ajustées pour avoir des rapports de concentration [protéine] /[sites de fixation sur la capside] = 1 +/- 0,1.
La Figure 4 montre : A. Profils d’association et de dissociation des protéines pb10, PO et PNO (résonance units, RU en fonction du temps) mesurés pour des concentrations croissantes de protéines (0,312 ; 0,625 ; 1 ,25 ; 2,5). B. Les constantes d’affinité KD sont calculées à partir des constantes cinétiques ka et kd pour chacune des protéines pb10, PO et PNO.
La Figure 5 montre les profils SPR (Surface Plasmon Résonance) de fixation des protéines pb10 H6, pb10-mCHERRYH6 et N-Ter pb10-mCHERRYH6 sur des capsides vides du phage T5 et le calcul des constantes d’affinité, à partir des constantes cinétiques mesurées par SPR.
La Figure 6 montre une représentation schématique du vecteur pETcapT5 (de SEQ ID 12).
La Figure 7 montre une représentation schématique du vecteur pETcapT5Adec (de SEQ ID 13).
La Figure 8 montre: A) Analyse par cryo-microscopie électronique des capsides produites à partir des plasmides recombinants et purifiés. De gauche à droite: capsides témoins produites à partir du phage T5 muté dans le gène de la terminase, capsides produites à partir des plasmides pETcapT5Apb10 et pETcapT5. B) Analyse sur gel d’agarose natif de la décoration des capsides avec la protéine pb10 (protocole décrit dans Vernhes et al.). Les capsides ont été incubées avec la protéine pb10 aux différents ratios [nombre de copies de pb10]/ [nombre de site de fixation de pb10] (1 /1 , 2/1 ou 4/1 ). La saturation des capsides en pb10 est obtenue pour les ratios 1 /1 et 2/1 respectivement pour les capsides « natives » produites à partir du phage mutant et pour les capsides produites à partir du plasmide pETcapT5Adec. Les capsides produites à partir du plasmide pETcapT5 migrent à la position des capsides saturées en pb10, indiquant qu’elles sont totalement décorées lors de leur assemblage dans les bactéries.
La Figure 9 montre les résultats de western blot montrant la présence de pb10 sur les capsides, révélée avec des anticorps polyclonaux dirigés contre pb10. 1 : capsides purifiées obtenues à partir du plasmide pETcapT5Adec ; 2 : capsides obtenues à partir du plasmide pETcapT5.
La Figure 10 montre la cinétique de la réponse anticorps anti-Ovalbumine (Ova) induite par les protéines fusion pb10. Les souris ont été immunisées par voie sous-cutanée avec une dose de protéines fusion PO ou PNO seules ou associées avec des capsides purifiées de phages ou de l’adjuvant complet de Freund. Les anticorps anti-Ova totaux (IgG) ont été quantifies par ELISA à différents temps après administration. A-E Chaque courbe représente les résultats de souris individuelles (n = 6). F Cinétique de la réponse Ac pour chaque groupe (moyenne + écart-type). La Figurel 1 montre la caractérisation de la nature des anticorps induits par les protéines pb10 fusion. Les souris ont été immunisées par voie sous-cutanée avec une dose de protéines fusion PO ou PNO seules ou associées avec des capsides purifiées de phages T5 ou de l’adjuvant complet de Freund. Les anticorps anti-Ova d’isotypes lgG1 , lgG2b, lgG2c et lgG3 ont été quantifiés par ELISA au jour 42. Les données correspondent aux moyennes + écart-types SEM (n = 6). Test ANOVA suivi du test de Tukey : *, p < 0,005 ; **, p < 0,01 ; ***, p < 0,001 ; ns, différence non significative.
La Figure 12 montre l’analyse des réponses cellulaires induites par les protéines pb10 fusion avec l’Ova. Les souris ont été immunisées par voie sous-cutanée avec une dose de protéines fusion PO ou PNO seules ou associées avec des capsides purifiées de phages T5. Puis, elles ont reçu au jour 196 une seconde administration des mêmes préparations vaccinales. Après 10 jours, la réponse des splénocytes à une stimulation antigénique par le peptide ova257-264 a été mesurée en quantifiant par ELISPOT le nombre de splénocytes producteur d’IFNy. Les barres représentent les moyennes obtenues pour chaque groupe et les cercles les résultats individuels obtenus pour chaque souris (n = 6). Test ANOVA suivi du test de Tukey : **, p < 0,01 ; ***, p < 0,001 ; ns, différence non significative.
La Figure 13 montre l’analyse des réponses cellulaires induites par la protéine PNO. Les souris ont été immunisées par voie sous-cutanée avec une dose de protéines fusion PO seule ou associée avec des capsides purifiées de phages T5 ou de l’adjuvant complet de Freund. Puis, elles ont reçu au jour 59 une seconde administration des mêmes préparations vaccinales. Après 10 jours, la réponse des splénocytes à une stimulation antigénique par le peptide Ova257-264 a été mesurée en quantifiant le nombre de splénocytes producteurs d’IFNy (A) ou en mesurant le taux d’IFNy dans les surnageants de culture des splénocytes (B). Les barres représentent les moyennes obtenues pour chaque groupe et les cercles les résultats individuels obtenus pour chaque souris (n = 5). Test ANOVA suivi du test de Tukey : **, p < 0,01 ; ***, p < 0,001 ; ns, différence non significative.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L’INVENTION
Définitions
Par « phage » ou « bactériophage » ou « virus bactérien » on entend un virus infectant des bactéries. Les phages sont omniprésents dans l'ensemble de la biosphère. Au début des années 2000, plus de 5000 bactériophages différents avaient été observés et décrits. Les phages les plus anciennement décrits, ceux dont la structure a été la plus étudiée, sont en général constitués d'une coque protéinique ou capside (enveloppant et protégeant la molécule centrale d'acide nucléique), et d'un appareil spécialisé à structure complexe (la queue) par lequel le phage se fixe sur la bactérie hôte pour y injecter son acide nucléique (matériel génétique, ou génome). Mais tous les bactériophages ne répondent pas à ce modèle classique et on peut actuellement les réunir en quatre grands groupes morphologiques : les phages à ADN bicaténaire, avec queue (représentant plus de 95% des phages décrits) ; les phages sans queue, à symétrie cubique et à ADN monocaténaire ; les phages à ARN ; les phages filamenteux à ADN monocaténaire. Des bactériophages isométriques (à ADN) contenant 12 à 14% de lipides sous forme d'une double couche située entre les coques externe et interne de la capside virale (phage PM2) ont également été décrits. Les dimensions des phages varient de 24 à 200 nm. Lorsque le matériel génétique est une molécule d'ADN double-brin (c’est le cas pour plus de 95 % des phages connus), la longueur de cette dernière peut varier de 5 à 650 kilobases (kpb).
Ainsi, différents critères peuvent être appliqués pour classer les phages en différents morphotypes et les répartir au sein de familles. Sont notamment pris en compte la forme et les dimensions de la tête, la structure de la queue, l'existence ou l'absence d'un manchon caudal contractile, la structure (rudimentaire ou complexe) de la plaque terminale, les dimensions globales du virion, la nature de l'acide nucléique (ADN bicaténaire, ADN monocaténaire, ARN), etc. Par exemple, les phages possédant une queue sont classés dans la famille des Caudovirales (appelés aussi phage caudés ou virus caudés). La morphologie de la queue permet de subdiviser cette large famille en 3 groupes :
Les Siphoviridae, caractérisés par une longue queue non contractile, forment la plus grande famille (60 % des virus caudés ; exemple : phage T5) ;
Les Myoviridae ont de longues queues contractiles, composées d'un tube extérieur qui se contracte autour du tube central rigide lorsque le virus se trouve à la surface de sa bactérie hôte. Le tube rigide perfore alors la paroi bactérienne et crée un passage pour l'ADN phagique (exemple : phage T4) ;
Les Podoviridae ont de petites queues non contractiles, ils intègrent dans leur capside des protéines qui servent à empaqueter l'ADN dans la capside lors de la formation du virion et qui sont éjectées dans la paroi de l'hôte avant l'éjection de l'ADN (exemples : phages T7 et P22).
Les phages nécessitent une bactérie hôte pour se reproduire, dans lesquelles ils injectent leur matériel génétique. Une fois dans la bactérie hôte, le génome viral est en général répliqué et traduit, par les enzymes et les ribosomes de l'hôte (selon les cas, certaines protéines virales peuvent également être impliquées), pour former de nombreuses copies du phage qui sont libérées avec la lyse de la bactérie-hôte : on parle de cycle lytique ou cycle de production. Pour certains bactériophages, le matériel génétique est répliqué et s'intégre au chromosome de la bactérie (ou existe sous forme de plasmide), mais n'est pas exprimé pour former des virions. Le virus est alors désigné sous le terme de prophage, lequel est transmis à la descendance de la bactérie infectée (lignée lysogénique) et on parle de lysogénie ou de cycle lysogénique. En réponse à une induction (ex : stress de la bactérie), l'infection lysogénique bascule vers un cycle lytique.
Ainsi, les phages peuvent également être classés en fonction de leur cycle de réplication : les phages dits « phages virulents » : ils sont strictement lytiques ; les phages dits « phages tempérés », qui peuvent générer des infections lytiques ou des infections lysogéniques ; les phages à infection chronique, qui ne provoquent pas la lyse de la cellule infectée, mais bourgeonnent à la membrane bactérienne, sans la rompre (infection chronique). C'est le cas des phages filamenteux comme M13 ou f1 d'Escherichia coli.
Les phages lytiques peuvent également être caractérisés par la présence de « plages de lyse ». L'infection d'une cellule bactérienne par un seul phage peut provoquer sa lyse au bout de 20 à 30 minutes avec libération de quelques dizaines voire centaines de particules phagiques. En laboratoire, chaque particule ainsi libérée va infecter une nouvelle bactérie et recommencer le cycle lytique. Conséquence de ces lyses microscopiques en cascade, des « plages de lyse » se forment dans le tapis bactérien à la surface des géloses, permettant la lecture à l'œil nu des résultats de test. La taille et l'aspect de ces plages de lyse constituent un phénotype contribuant à caractériser les phages.
Par « phage T5 » on entend un virus appartenant au genre Tequintavirus (synonymes T5-like phages, T5-like viruses, T5likevirus), inclut dans la famille des Demerecviridae, elle-même appartenant à l’ordre des Caudovirales (encore nommés virus « caudés »).
T5 appartient au sous-ordre des Siphoviridae parmi les Caudovirales. Il possède donc une queue longue non contractile. C'est un phage strictement lytique qui infecte notamment la bactérie Escherichia coli. Le phage T5 est constitué d’une capside icosaédrique de 90 nm de diamètre, contenant son génome (un ADN double brin de 121 000 paires de bases (121 kbp), ainsi que d'une queue de 250 nm lui permettant de reconnaître la bactérie cible et d'y injecter son génome. L'extrémité de la queue se termine en forme de cône au bout duquel se trouve une protéine de liaison spécifique au récepteur de T5. Ce récepteur est une protéine de la membrane externe bactérienne (FhuA dans le cas de T5, autre récepteur membranaire pour les autres Tequintavirus). La queue est également équipée de trois fibres longues fixées à la base du cône qui interagissent avec la partie sucrée des lipopolysaccharides à la surface de la bactérie.
Le génome du bactériophage T5 peut être divisé en trois parties, réparties comme suit : environ 8 % du génome total, à l'extrémité injectée en premier. Cette partie du génome, nommée « Direct Terminal Repeat » est répétée dans la même orientation à l’autre extrémité de l’ADN en position 92-100%. Elle code des protéines impliquées dans l’arrêt de la réplication/transcription/traduction bactérienne ainsi que la destruction de l’ADN de l'hôte, ainsi qu’une déoxyribonucléotidase; de 8 à 67 % du génome, codant des gènes précoces (exprimés à la fin de l'injection de l'ADN viral). Ces gènes codent des protéines impliquées dans la réplication de l’ADN, le métabolisme des nucléotides et des facteurs de lyse de la cellule; de 67 à 92 % du génome, comprenant principalement les gènes tardifs (expression à partir de 12-13 minutes post-infection). Ce sont principalement des gènes dits « structuraux », dont les protéines codées servent à l'assemblage de nouveaux virions.
La capside du bactériophage T5 s’auto-assemble en passant par différents états structuraux dont la maturation suit une séquence d’étapes bien définie (Figure 1 ). Une procapside icosaédrique est initialement assemblée, constituée de 775 copies de la protéine majeure de capside pb8, organisées en 11 pentamères formant 11 des 12 sommets de la capside, et 120 hexamères formant les faces. La protéine pb8 (51 kDa) est synthétisée sous la forme d’un précurseur incluant un domaine-D, correspondant aux 159 acides aminés N-terminaux de la protéine, qui sert de domaine d’échafaudage lors de l’assemblage de la capside. Le douzième sommet de la capside est formé par un dodécamère de la protéine portale pb7 (47 kDa), qui constitue un pore d’entrée pour l’ADN. Cette procapside contient également la protéase pb11 qui assure le clivage des 775 copies du domaine-D de pb8, coupe les 10 résidus N-terminaux de la protéine portale et s’auto-protéolyse pour produire une capside vide, prête à recevoir le génome viral. L’encapsidation de l’ADN est assurée par un moteur moléculaire et cette étape s’accompagne d’une réorganisation structurale des 775 sous-unités de la protéine de capside provoquant l’expansion de la capside. La forme mature expansée présente au centre des hexamères les sites de fixation de la protéine monomérique pb10 (17,3 kDa) dont 120 copies viennent décorer la surface externe de l’icosaèdre.
Par « capside » ou « capside phagique » on entend la structure qui entoure le génome (l'acide nucléique, ADN ou ARN) d’un phage, sans la queue. Elle est constituée de très nombreuses unités protéiques qui se regroupent pour former des ensembles structurels identiques appelés capsomères. La nucléocapside est l'ensemble formé de la capside du phage (présente chez les phages nus ou enveloppés, l'enveloppe ou péplos n'étant pas la capside, mais une enveloppe lipoprotéique entourant la capside) et du génome viral (ARN ou ADN). Selon les rapports géométriques que les capsomères présentent entre eux et avec le génome qu'ils recouvrent et protègent, on peut définir trois classes de nucléocapsides :
Les nucléocapsides à symétrie hélicoïdale;
Les nucléocapsides icosaédriques, qui présentent tout ou partie des éléments de symétrie des icosaèdres et dont la structure est donc proche de celle des géodes;
Les nucléocapsides à symétrie mixte, qui peuvent présenter une structure à symétrie hélicoïdale associée à une structure icosaédrique.
Par « capside vide » on entend une capside ne comprenant pas de génome phagique (dépourvue d’acide nucléique phagique). Une capside vide est donc une capside n’ayant pas encapsidé (incorporé) le génome du phage. Dans le cas du phage T5, par exemple, une capside vide est une capside dépourvue d’ADN génomique du phage T5. De préférence, une capside vide d’un phage est une capside dépourvue de tout acide nucléique dudit phage. De préférence encore, une capside vide est une capside dépourvue de tout acide nucléique (par exemple dépourvue d’acide nucléique provenant de phage, de la cellule hôte et de la cellule productrice, de préférence dépourvue d’acide nucléique contaminant). Par « dépourvu d’acide nucléique » ou « ne comprenant pas d’acide nucléique », on entend une substance comprenant moins de 5% d’acide nucléique, de préférence moins de 4%, de préférence moins de 3%, de préférence moins de 2%, de préférence moins de 1%, de préférence moins de 0,5%, de préférence moins de 0,1%, de préférence moins de 0,01%, de préférence moins de 0,001%, de préférence moins de 0,0001%, de préférence moins de 0,00001% , de préférence moins de 0,000001%, d’acide nucléique (en masse molaire).
Par « protéine de capside » ou « protéine de structure de capside » on entend une protéine impliquée dans la structure de la capside du phage. Autrement dit, on entend par protéine de structure de capside un composant qui fait partie de la capside. Dans le cas du phage T5, ces protéines comprennent notamment la protéine majeure de capside pb8, la protéine portale pb7, la protéase pb11 et la protéine de décoration pb10. Par « protéine de décoration de capside du phage T5 » ou « protéine de décoration pb10 » ou « protéine pb10 » ou « pb10 », on entend une protéine monomérique du phage T5, se fixant sur la surface externe de la capside du phage T5, de préférence sur les hexamères formant les faces de la capside du phage T5, de préférence sur des sites de fixation présents sur les hexamères formant les faces de la capside du phage T5, de préférence encore sur des sites de fixation présents au centre des hexamères formant les faces de la capside du phage T5. La protéine de décoration pb10, constituée de 164 acides aminés (Exemples de références pour pb10 : GenBank: MU05286.1 ou NCBI: YP_006979.1 , tels que présentés dans SEQ ID : 16), comprend deux domaines indépendants, un domaine N-terminal de fixation à la capside et un domaine C-terminal externe exposé, c’est-à-dire montré au niveau de la partie extérieure de la capside. Ces deux domaines sont séparées par un court « linker» ou charnière de type poly-proline. La protéine de décoration pb10 présente par exemple la séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 1 , qui inclut respectivement un et deux acides aminés additionnels en positions N-terminale et C-terminale, pouvant être introduits par des impératifs de clonage. Alternativement la protéine de décoration pb10 peut présenter l’exacte séquence de la protéine native, si les techniques de clonage utilisées pour son expression n’introduisent pas de modification de sa séquence d’acides aminés (il s’agit par exemple dans ce cas de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 16). Les termes « protéine de décoration de capside du phage T5 », « protéine de décoration pb10 », « protéine pb10 » et « pb10 », sont ici utilisés de manière interchangeable.
Par « domaine N-terminal d’une protéine pb10 » on entend le domaine situé en position N-terminale de la protéine pb10, c’est-à-dire le domaine de la protéine pb10 comprenant (ou consistant essentiellement en, ou consistant en) les 80 premiers acides aminés de la séquence protéique de pb10 (soit les acides aminés allant de la position 1 à la position 80 incluses). Le domaine N-terminal de la protéine pb10 comprend notamment le domaine de fixation à la capside. Le domaine N-terminal de la protéine pb10 présente par exemple la séquence d’acides aminés SEQ ID NO :3, correspondant aux 80 premiers acides aminés consécutifs de la SEQ ID NO : 1 . Le domaine N-terminal de la protéine pb10 peut alternativement présenter, par exemple, la séquence d’acides aminés correspondant aux 77 premiers acides aminés consécutifs de la SEQ ID NO : 16, ou encore la séquence d’acides aminés correspondant aux 76 acides aminés consécutifs compris entre les position 2 et 77 (incluses) de la SEQ ID NO : 16. Par « domaine C-terminal d’une protéine pb10 » on entend le domaine situé en position C-terminale de la protéine pb10, c’est-à-dire le domaine comprenant (ou consistant essentiellement en, ou consistant en) par exemple les 92 derniers acides aminés de la séquence protéique de pb10 telle que définie en SEQ ID NO : 1 (soit les acides aminés allant de la position 74 à la position 165 incluses). Le domaine C-terminal de la protéine pb10 comprend notamment le domaine externe exposé, c’est-à-dire montré au niveau de la partie extérieure de la capside.
Par « protéine majeure de capside pb8 » ou « pb8 », on entend une protéine du phage T5, qui s’organise en 11 pentamères pour former 11 des 12 sommets de la capside de T5, et 120 hexamères formant les faces. La protéine pb8 (51 kDa) est synthétisée sous la forme d’un précurseur de 51 kDa incluant un domaine D qui correspond aux 159 acides aminés N-terminaux de la protéine. Le domaine D sert de domaine d’échafaudage lors de l’assemblage de la procapside, puis ce domaine est clivé par la protéase pb11 , pour former la capside. La protéine majeure de capside pb8 présente par exemple la séquence d’acides aminés SEQ ID NO :8.
Par « protéine portale pb7 » ou « pb7 », on entend une protéine du phage T5, qui s’organise en dodécamère pour former 1 des 12 sommets de la capside du phage T5. Ce dodécamère constitue un pore d’entrée pour l’ADN phagique. La protéine pb7 fait environ 47 kDa. La protéine portale pb7 présente par exemple la séquence d’acides aminés SEQ ID NO :7.
Par « protéase pb 11 » ou « pb11 », on entend une protéine du phage T5 qui assure le clivage des 775 copies du domaine D de pb8, coupe les 10 résidus N-terminaux de la protéine portale et s’auto- protéolyse pour produire une capside vide, prête à recevoir le génome viral. La protéase pb11 présente par exemple la séquence d’acides aminés SEQ ID NO :9.
Par « capside décorée » on entend une capside comprenant au moins une protéine de décoration et/ou au moins une protéine de fusion exposée à sa surface. Typiquement, la protéine de décoration est exposée sur au moins une des faces composant la capside.
Par « forme mature expansée d’une capside » ou « forme expansée » on entend une capside de bactériophage T5 de diamètre mesuré par cryo-microscopie électronique de 90nm +/- 2nm comme décrit dans référence Preux et al. 2013 (DOI: 10.1016/j . j mb.2013.03.002), capable de fixer 120 copies de la protéine de décoration pb10, propriété qui est évaluée par des expériences de retard sur gel d’agarose natif montrant une diminution de la mobilité électrophorétique des capsides pour un ratio [nombre de copies de pb10]/[nombre de site de fixation de pb10] = 1 +/-0,1 comme décrit dans la référence Vernhes et al. 2017 (DOI: 10.1038/srep41662) et dans la figure 3.
Par «molécule d’acides nucléiques » ou par « acide nucléique », on entend un polymère de n'importe quelle longueur d’acide désoxyribonucléique (ADN), ou polydésoxyribonucléotides, incluant notamment les ADN complémentaires ou ADNc, les ADN génomiques, les plasmides, les vecteurs, les génomes viraux, l'ADN isolé, les sondes, les amorces et tout mélange de ceux-ci ; ou un polymère de n'importe quelle longueur d’acide ribonucléique (ARN), ou polyribonucléotides, incluant notamment les ARN messagers ou ARNm, ARN antisens ; ou des polyribo-polydésoxyribonucléotides mélangés. Ils englobent des polynucléotides simples ou double brins, linéaires ou circulaires, naturels ou synthétiques. En outre, un polynucléotide peut comprendre des nucléotides non naturels et peut être interrompu par des composants non nucléotidiques.
Dans le cadre de la présente invention, les termes "acide nucléique", "molécule d'acides nucléiques", "polynucléotide" et "séquence nucléotidique" sont utilisés de manière interchangeable. Par « génome » on entend l'ensemble du matériel génétique d'une espèce codé dans son acide désoxyribonucléique (ADN) ou son acide ribonucléique (ARN). L’ADN ou l’ARN contient en particulier tous les gènes codant des protéines ou correspondant à des ARN structurés. Il se décompose donc en séquences codantes (transcrites en ARN messagers et traduites en protéines) et non codantes (non transcrites, ou transcrites en ARN, mais non traduites). Par « ADN génomique » on entend donc le génome qui se présente sous la forme d’un ADN.
Par « ADN génomique de phage » on entend l'ensemble du matériel génétique d’un phage, qui se présente sous la forme d’un ADN.
Par « capside dépourvue d’ADN génomique de phage » on entend une capside qui comprend moins de 5% d’ADN génomique de phage (d’ADN génomique entier ou de fragments) en masse molaire, de préférence moins de 4%, de préférence moins de 3%, de préférence moins de 2%, de préférence moins de 1%, de préférence moins de 0,5%, de préférence moins de 0,4%, de préférence moins de 0,3%, de préférence moins de 0,2%, de préférence moins de 0,1%, de préférence moins de 0,01%, de préférence moins de 0,001%, de préférence moins de 0,0001%, de préférence moins de 0,00001%, de préférence moins de 0,000001%, d’ADN génomique de phage, en masse molaire. Avantageusement, la capside dépourvue d’ADN génomique de phage ne comprend aucune trace d’ADN génomique de phage : autrement dit, la capside est pure d’ADN génomique de phage. Avantageusement encore, la capside dépourvue d’ADN génomique de phage ne comprend aucun acide nucléique de phage : autrement dit, la capside est pure d’acide nucléique de phage. Selon un mode de réalisation avantageux, la capside dépourvue d’ADN génomique de phage ne comprend pas d’ADN génomique de bactérie et/ou ne comprend pas d’ADN plasmidique de bactérie, ou ne comprend aucun ADN, ou ne comprend aucun acide nucléique. Avantageusement, la capside dépourvue d’ADN génomique de phage comprend moins de 5% d’ADN provenant de bactérie (ADN génomique entier ou fragments, plasmides), de préférence moins de 4%, de préférence moins de 3%, de préférence moins de 2%, de préférence moins de 1%, de préférence moins de 0,5%, de préférence moins de 0,4%, de préférence moins de 0,3%, de préférence moins de 0,2%, de préférence moins de 0,1%, de préférence moins de 0,01%, de préférence moins de 0,001%, de préférence moins de 0,0001%, de préférence moins de 0,00001%, de préférence moins de 0,000001%, en masse molaire.
Par « molécule isolée », on entend une molécule, notamment une protéine, un polypeptide, un peptide, une molécule d’acides nucléiques, un vecteur plasmidique, un vecteur viral ou une cellule hôte, qui est extrait de son environnement naturel (c'est-à-dire séparé d'au moins un autre composant auquel il est naturellement associé).
Par « polypeptide », “protéine” et “peptide”, on entend des polymères de résidus d'acides aminés qui comprennent au moins neuf acides aminés liés par des liaisons peptidiques. Le polymère peut être linéaire, ramifié ou cyclique. Le polymère peut comprendre des acides aminés naturels et/ou analogues d’acides aminés et il peut être interrompu par des résidus non-acides aminés. Comme indication générale et sans y être cependant lié dans la présente demande, si le polymère d'acides aminés contient plus de 50 résidus d'acides aminés, il est de préférence appelé un polypeptide ou une protéine, alors que si le polymère est constitué de 50 acides aminés ou moins, il est de préférence appelé "peptide". Les sens de lecture et d’écriture d’une séquence d’acides aminés d’un polypeptide, d’une protéine et d’un peptide tel qu’utilisés ici sont les sens de lecture et d’écriture conventionnels. La convention de lecture et d'écriture pour des séquences d’acides aminés d’un polypeptide, d’une protéine et d’un peptide place la terminaison amine à gauche, la séquence étant alors écrite et lue de la terminaison amine (N-terminus) à la terminaison carboxyle (C-terminus), de gauche à droite.
Par « vecteur », on entend un véhicule, de préférence une molécule d'acide nucléique ou une particule virale, qui contient les éléments nécessaires pour permettre l'administration, la propagation et/ou l'expression d'une ou plusieurs molécule(s) d'acides nucléiques dans une cellule hôte ou un organisme.
D’un point de vue fonctionnel, ce terme englobe des vecteurs pour la maintenance (vecteurs de clonage), des vecteurs pour l'expression dans diverses cellules ou organismes hôtes (vecteurs d'expression), des vecteurs extrachromosomiques (par exemple des plasmides multicopie) ou des vecteurs d'intégration (par exemple conçus pour s'intégrer dans le génome d’une cellule hôte et produire des copies supplémentaires de la molécule d'acides nucléiques qu’il contient lorsque la cellule hôte se réplique). Ce terme englobe également des vecteurs navettes (par exemple, fonctionnant à la fois dans des hôtes procaryotes et/ou eucaryotes) et des vecteurs de transfert (par exemple pour le transfert de molécule(s) d'acides nucléiques dans le génome d’une cellule hôte). D’un point de vue structurel, les vecteurs peuvent être des sources génétiques naturelles, synthétiques ou artificielles, ou une combinaison d'éléments génétiques naturels et artificiels.
Ainsi, dans le contexte de l'invention, le terme "vecteur" doit être compris de manière large en incluant des vecteurs plasmidiques (ou plasmides) et viraux.
Un "plasmide" tel qu'utilisé ici désigne une construction d'ADN réplicable. Habituellement, les vecteurs plasmidiques contiennent des gènes marqueurs de sélection qui permettent aux cellules hôtes portant le plasmide d'être identifiées et/ou sélectionnées de manière positive ou négative en présence du composé correspondant au marqueur de sélection. Une variété de gènes marqueurs de sélection positives ou négatives sont connus dans la technique. À titre d'illustration, un gène de résistance aux antibiotiques peut être utilisé comme un gène marqueur de sélection positive permettant de sélectionner une cellule hôte en présence de l'antibiotique correspondant.
Le terme "vecteur viral" tel qu'utilisé ici se réfère à un vecteur d'acide nucléique qui comprend au moins un élément d'un génome du virus et peut être conditionné dans une particule virale ou une particule virale. Les vecteurs viraux peuvent être compétents pour la réplication ou sélectifs (par exemple, conçus pour se répliquer mieux ou sélectivement dans des cellules hôtes spécifiques), ou peuvent être génétiquement désactivés de manière à être défectueux ou déficients en réplication.
Par « cellule hôte », on entend une cellule contenant au moins une capside selon l’invention, ou au moins une capside susceptible d’être obtenue par la méthode de production selon l’invention, ou au moins un vecteur selon l’invention, ou au moins une molécule d’acides nucléiques selon l’invention, ou un mélange quelconque de ceux-ci. Avantageusement encore, la cellule hôte est capable d’exprimer les gènes codés par le vecteur selon l’invention et/ou de produire le vecteur de l'invention. Avantageusement encore, la cellule hôte est capable d’être infectée par un phage (de préférence un phage T5) et/ou de produire un phage T5 et/ou de produire une capside (vide ou non ; décorée ou non) de phage T5. Avantageusement encore, la cellule hôte est capable de produire une capside vide de phage T5, décorée par la protéine fusion selon l’invention. Avantageusement encore, la cellule hôte est capable de produire une capside vide de phage T5, sous une forme mature expansée, de préférence décorée par la protéine fusion selon l’invention.
La cellule hôte peut être constituée d'un type unique de cellules ou d'un groupe de différents types de cellules. La cellule hôte peut également être une cellule hybride, c’est-à-dire résultant de la fusion d’au moins deux cellules de types différents.
La cellule hôte peut appartenir à des lignées cellulaires cultivées, à des cellules primaires, à des cellules souches ou à des cellules prolifératives. Le terme "cellules hôtes" comprend des cellules procaryotes, des cellules eucaryotes inférieures telles que des cellules de levures, et d'autres cellules eucaryotes telles que des cellules de champignons, des cellules d'insectes, des cellules de plantes, des cellules d’algues, des cellules de microalgues, des cellules de parasites, des cellules animales et des cellules de mammifères (par exemple humaines ou non humaines, de préférence non humaines). La cellule hôte peut être une cellule différenciée, une cellule pluripotente, une cellule totipotente, une cellule souche, une cellules souche pluripotente induite (CSPi ou iPS en anglais), une cellule souche totipotente induite, ou encore une cellule embryonnaire ou une cellule souche embryonnaire. Dans le cas d’une cellule embryonnaire ou d’une cellule souche embryonnaire, la cellule est de préférence une cellule non humaine.
Le terme « cellule hôte » comprend plus largement des cellules qui contiennent ou ont contenu la molécule d’acides nucléiques selon l’invention, ainsi que la descendance de telles cellules.
La cellule hôte peut par exemple être isolée ou organisée en tissu, en organe ou encore être au sein d’un organisme complet. Dans le cas où la cellule hôte est au sein d’un organisme complet, ledit organisme n’est pas humain.
La cellule hôte est avantageusement une bactérie, de préférence une bactérie de la famille des Enterobacteriaceae, de préférence encore une bactérie du genre Escherichia, de préférence encore une bactérie Escherichia coli.
Par « identité » ou « identité de séquence », on entend une correspondance exacte de séquence entre deux polypeptides ou deux molécules d’acides aminés. Les pourcentages d’identité auxquels il est fait référence dans le cadre de l’exposé de la présente invention sont déterminés après alignement optimal des séquences à comparer, qui peuvent donc comprendre une ou plusieurs additions, délétions, troncatures et/ou substitutions. Ce pourcentage d’identité peut être calculé par toute méthode d’analyse de séquences bien connue de l’homme du métier. Le pourcentage d’identité peut être déterminé après alignement global des séquences à comparer prises dans leur intégralité, sur toute leur longueur. Outre manuellement, il est possible de déterminer l’alignement global de séquences au moyen de l’algorithme de Needleman et Wunsch (1970).
Pour les séquences nucléotidiques, la comparaison des séquences peut être effectuée à l’aide de tout logiciel bien connu de l’homme du métier, comme par exemple le logiciel Needle. Les paramètres utilisés peuvent notamment être les suivants : « Gap Open » égal à 10,0, « Gap Extend » égal à 0,5 et la matrice EDNAFULL (Version EMBOSS du NCBI NUC4.4).
Pour les séquences d’acides aminés, la comparaison des séquences peut être effectuée à l’aide de tout logiciel bien connu de l’homme du métier, comme par exemple le logiciel Needle. Les paramètres utilisés peuvent notamment être les suivants : « Gap Open » égal à 10,0, « Gap Extend » égal à 0,5 et la matrice BLOSUM62.
De préférence, le pourcentage d’identité défini dans le cadre de la présente invention est déterminé au moyen d’un alignement global des séquences à comparer sur toute leur longueur. À titre illustratif, "au moins 80% d'identité de séquence", tel qu'utilisé ici, représente 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% d'identité de séquence.
Par « protéine de fusion » ou « protéine fusion » on entend une protéine artificielle obtenue par la combinaison d’une protéine (appelée ci-après « protéine F »), ou d’une ou plusieurs partie(s) d’une protéine (appelée(s) ci-après « partie(s) de protéine F »), avec une ou plusieurs protéine(s) (ou une ou plusieurs parties de protéine(s)) différente(s) (c’est-à-dire que ladite ou lesdites une ou plusieurs protéine(s) et une ou plusieurs partie(s) de protéine(s) est(sont) différente(s) de la protéine F et/ou de l’une quelconque de ses parties) ou avec une ou plusieurs molécule(s) non protéique(s) (ou une partie de molécule non protéique) ou une molécule mixte (c’est-à-dire une molécule comprenant une protéine (ou une partie d’une protéine) et une molécule non protéique (ou une partie de molécule non protéique) ; ou une partie de molécule mixte). Ladite une ou plusieurs protéine(s) (ou une ou plusieurs parties de protéine(s)) différente(s) et/ou ladite une ou plusieurs molécule(s) non protéique(s) (ou une partie de molécule non protéique) et/ou ladite molécule mixte est/sont en particulier exogène(s) (c’est-à-dire issue d’un organisme différent/distinct de celui dont la protéine F de la protéine de fusion est issue). Lorsque la protéine de fusion comprend une protéine, et/ou une ou plusieurs parties d’une protéine, et/ou une molécule mixte, ladite protéine et/ou ladite(lesdites) une ou plusieurs partie de protéine(s) et/ou ladite molécule mixte comprend(comprennent) de préférence au moins 10 acides aminés consécutifs, de préférence encore au moins 12 acides aminés consécutifs, de préférence encore au moins 15 acides aminés consécutifs, de préférence encore au moins 20 acides aminés consécutifs, de préférence encore au moins 30 acides aminés consécutifs. Lorsque la protéine de fusion comprend une protéine, et/ou une ou plusieurs parties d’une protéine, et/ou une molécule mixte, ladite protéine et/ou ladite(lesdites) une ou plusieurs partie(s) de protéine(s) et/ou ladite molécule mixte présente(présentent) de préférence une structure tridimensionnelle, dans des conditions non dénaturantes (par exemple des conditions habituellement non dénaturantes pour les protéines, notamment en absence d’agents dénaturants et/ou chaotropiques). Par « molécule non protéique », on entend avantageusement un glucide, un sucre, un oside, un lipide, un acide nucléique, un neurotransmetteur, ou une combinaison quelconque de ceux-ci.
Par « molécule mixte », on entend toute protéine (ou partie de protéine) ayant subi une modification post-traductionnelle (par exemple une acétylation, une acylation, une biotinylation, une glycosylation, une hydroxylation, une lipoylation, une phosphorylation, une amidation, une ubiquitination, une sumoylation, une déamination, etc.), ou toute protéine (ou partie de protéine) ayant été combinée avec une molécule non protéique (ou une partie de molécule non protéique), telle qu’une protéine (ou une partie de protéine) combinée avec un glucide, un sucre, un oside, un lipide, un acide nucléique, un neurotransmetteur, ou toute partie de ceux-ci ou toute combinaison de ceux-ci. Une molécule mixte comprend par exemple une glycoprotéine. Avantageusement, des exemples de protéines (ou parties de protéine), ou de molécules non protéique (ou parties de molécule non protéique), ou de molécules mixtes (ou parties de molécule mixte) combinées à la protéine (ou à l’une ou plusieurs parties d’une protéine) de la protéine de fusion (c’est-à-dire à la protéine F de la protéine de fusion) comprennent les antigènes, les toxines, les récepteurs, les signaux d’adressage ou de ciblage ou de transport, les enzymes, les hormones, les anticorps, tout fragment de ceux-ci (de préférence un fragment fonctionnel), et toute combinaison quelconque de ceux-ci.
Par « fragment de peptide ou de protéine » ou « partie de peptide ou de protéine » ou entend une portion d’un peptide ou d’une protéine, c’est-à-dire une portion de la séquence d’acides aminés consécutifs composant ledit peptide ou ladite protéine (appelés peptide ou protéine dont le fragment est issu). Par « fragment de molécule » ou « partie de molécule » ou entend une portion d’une molécule non protéique ou d’une molécule mixte. Par « fragment fonctionnel », on entend tout fragment de peptide ou de protéine, ou tout fragment de molécule, présentant au moins une des fonctions originales du peptide, de la protéine ou de la molécule dont ledit fragment est issu. De préférence, le fragment fonctionnel réalise ladite fonction avec une efficacité égale à au moins 30% de celle dudit peptide ou de ladite protéine ou de ladite molécule, de préférence au moins 40%, de préférence au moins 45%, de préférence au moins 50%, de préférence au moins 55%, de préférence au moins 60%, de préférence au moins 65%, de préférence au moins 70%, de préférence au moins 75%, de préférence au moins 80%, de préférence au moins 85%, de préférence au moins 90%, de préférence au moins 91%, de préférence au moins 92%, de préférence au moins 93%, de préférence au moins 94%, de préférence au moins 95%, de préférence au moins 96%, de préférence au moins 97%, de préférence au moins 98%, de préférence au moins 99%, de préférence au moins 100% de l’efficacité dudit peptide ou de ladite protéine ou de ladite molécule. Lorsque le fragment est un fragment de peptide, de protéine, ou de molécule mixte, le fragment comprend de préférence au moins 10 acides aminés consécutifs du peptide, de la protéine, ou de la molécule mixte, dont il est issu ; de préférence encore au moins 12 acides aminés consécutifs, de préférence encore au moins 15 acides aminés consécutifs, de préférence encore au moins 20 acides aminés consécutifs, de préférence encore au moins 30 acides aminés consécutifs du peptide ou de la protéine, ou de la molécule mixte dont il est issu. Lorsque le fragment est un fragment de peptide, de protéine, ou de molécule mixte, le fragment présente de préférence une structure tridimensionnelle, dans des conditions non dénaturantes (par exemple des conditions habituellement non dénaturantes pour les protéines, notamment en absence d’agents dénaturants et/ou chaotropiques).
Par « structure tridimensionnelle » ou « structure tertiaire » on entend le repliement intrinsèque d’une molécule dans l’espace. Une molécule ayant une structure tridimensionnelle est une molécule possédant une configuration spatiale stable, (couramment appelé repliement), qui lui est propre et qui est intimement liée à sa fonction: lorsque cette structure est dissociée par l'emploi d'agents dénaturants ou chaotropiques, la molécule est dite dénaturée et perd sa fonction. En particulier, une structure tridimensionnelle est une structure peu flexible. Par contraste, une structure non tridimensionnelle peut adopter un ensemble dynamique de configurations changeant constamment au cours du temps. Dans le cas d’une protéine, d’un peptide, d’une molécule mixte, ou d’un fragment de ceux-ci, la structure tridimensionnelle est le repliement de la chaîne polypeptidique dans l'espace. Dans ce cas, la structure tridimensionnelle n’est pas une chaîne linéaire d’acides aminés pouvant adopter un ensemble dynamique de configurations changeant constamment au cours du temps (ce n’est pas une succession linéaire des acides aminés sans aucune configuration spatiale). La structure tridimensionnelle des protéines, des peptides, des molécules mixtes comprenant une protéine ou un peptide, ou des fragment de ceux-ci, est maintenue par différentes interactions qui peuvent être:
• des interactions covalentes (ponts disulfures entre cystéines)
• des interactions électrostatiques (liaisons ioniques, liaisons hydrogène)
• des interactions de van der Waals
• des interactions avec le solvant et l'environnement (ions, lipides...)
Par « nanoparticule » on entend un objet dont les trois dimensions sont à l'échelle nanométrique, c'est-à-dire une particule dont le diamètre nominal est inférieur à 100 nm environ (par exemple tel que défini par la norme ISO TS/27687). Par « nanoparticule phagique » ou « nanoparticule de phage » on entend une nanoparticule comprenant au moins un phage ou au moins un fragment de phage ; ou constituée essentiellement d’au moins un phage ou d’au moins un fragment de phage; ou constituée d’au moins un phage ou d’au moins un fragment de phage (le terme fragment étant utilisé ici en lien avec un phage selon le même sens que le terme fragment utilisé en lien avec les peptides, protéines et molécules, tel que défini ci-dessus). Avantageusement, la nanoparticule comprend au moins une capside ou au moins un fragment de capside ; ou est constituée essentiellement d’au moins une capside ou d’au moins un fragment de capside; ou est constituée d’au moins une capside ou d’au moins un fragment de capside. Avantageusement, ladite capside est telle que définie ci-dessus. Ladite capside est de préférence décorée, sous forme mature expansée, vide, ou une combinaison quelconque de ceux-ci.
Par « opéron » on entend une unité d'ADN fonctionnelle regroupant des gènes qui opèrent sous le signal d'un même promoteur. Ces gènes sont de préférence transcrits en ARN messager ensemble et de préférence concourent à la réalisation d'une même fonction physiologique. Avantageusement, soit tous les gènes d'un opéron sont transcrits ensemble, soit aucun n'est transcrit, puisqu'ils sont tous sous le contrôle du même promoteur.
Par « promoteur » on entend une section d'ADN qui déclenche la transcription d’une section d’ADN reconnu par une ARN polymérase.
Par « antigène » on entend une molécule naturelle ou synthétique qui, reconnue par des anticorps ou des cellules du système immunitaire d’un organisme, est capable de déclencher chez celui-ci une réponse immunitaire. Ainsi toute substance étrangère, tout microbe, introduit dans le corps, peut se comporter en antigène, c’est-à-dire y provoquer la fabrication de protéines spéciales, les anticorps qui ont la propriété de neutraliser les effets nocifs de la substance étrangère. Les antigènes sont généralement des peptides, des protéines, des sucres (tels que polysaccharides ou polyosides) et leurs dérivés lipidiques (lipides). Les antigènes peuvent également être des acides nucléiques, ou des haptènes (soit des fragments d'antigènes). Les antigènes, en tant que marqueurs des agents étrangers à l'organisme, sont à la base de la réponse immunitaire adaptative. C'est la reconnaissance de l'antigène par les cellules immunocompétentes, directement ou via les cellules présentatrices d'antigène (CPA), qui active l'immunité spécifique. Dans le cas d'antigènes protéiques, on nomme « épitope » ou « déterminant antigénique » la partie de l'antigène reconnue par un anticorps ou un récepteur lymphocytaire. Un même antigène peut comporter plusieurs épitopes (identiques ou différents) et ainsi induire une réponse immunitaire variée. Il existe des épitopes séquentiels, correspondant à une séquence d'acides aminés, et des épitopes conformationnels, liés à la structure de la protéine et donc sensibles à la dénaturation. La reconnaissance de l'antigène par les lymphocytes dépend de la nature de l'épitope. Les lymphocytes B se lient directement aux épitopes conformationnels grâce aux immunoglobulines de leur membrane. Les lymphocytes T reconnaissent les épitopes séquentiels présentés par les cellules présentatrices d'antigènes. L’antigène peut être exogène, c’est-à-dire qu’il est étranger à l’individu (dans ce cas, il peut être allogénique : issu d’un individu de la même espèce ; ou xénogénique : issu d’autres espèces), ou il peut être endogène, c’est-à-dire un antigène propre à l’hôte (auto-antigènes). L’antigène est de préférence un antigène de microorganisme, de plante, d’algue, de microalgue, de bactérie, de virus, de parasite, de levure, de champignon, d’insecte, d’animal, ou de tumeur ; de préférence un antigène d’un pathogène eucaryote ou procaryote, ou d’un cancer ; de préférence un antigène protéique, un lipide ou un sucre de bactérie, de virus, de parasite, de levure, de champignon ou de tumeur. Les différentes catégories d’antigènes sont bien connues de l’homme du métier, qui pourra notamment se référer aux ouvrages de référence dans le domaine (tels que G. J. V. Nossal, G L Ada, Antigens, Lymphoid Cells and the Immune Response, Academie Press, 1971 ; Marc H. V. Van Regenmortel, Structure of Antigens, Volume 3 CRC Press, 20 déc. 1995 ; Edouard Drouhet, Garry T. Cole, Louis De Repentigny, Jean Latge, Fungal Antigens: Isolation, Purification, and Détection, Springer Science & Business Media, 11 nov. 2013 ; Graziano D.F., Finn O. J. (2005) Tumor Antigens and Tumor Antigen Discovery. In: Khleif S. N. (eds) Tumor Immunology and Cancer Vaccines. Cancer Treatment and Research, vol 123. Springer, Boston, MA; Wang M, Claesson MH, Methods Mol Biol. 2014;1184:309-17. Classification of human leukocyte antigen (HLA) supertypes ; ainsi que les bases de données spécialisées telles que décrites dans Galperin, Fernandez-Suarez, Rigden, The 24th annual Nucleic Acids Research database issue: a look back and upcoming changes, NAR, Volume 45, Issue D1 , January 2017, Pages D1 -D11 ; en particulier la base de données PMAPP, une base de données des autoantigènes humains (disponible notamment sur le site aagatlas.ncpsb.org)).
Par « toxine » on entend une substance toxique pour un ou plusieurs organismes vivants. Une toxine est typiquement synthétisée par un organisme vivant (bactérie, champignon vénéneux, insecte ou serpent venimeux), auquel elle confère son pouvoir pathogène. Les toxines produites par des bactéries sont appelées bactériotoxines, celles par les champignons sont dénommées mycotoxines, celles produites par les plantes sont appelées phytotoxines, celles produites par les algues sont appelées phycotoxines, celles par les animaux sont dénommées toxines animales. La toxine peut être une molécule chimique, un peptide, une protéine, une glycoprotéine, un sucre, un oside, un lipide, un acide nucléique, ou une combinaison quelconque de ceux-ci Plusieurs familles de bactéries sécrètent des biotoxines (exotoxines) dans les tissus qu'elles colonisent. D'autres bactéries (Gram négatif) conservent en elles-mêmes la plus grande partie des composés toxiques, qui ne sont libérés que lors de la lyse cellulaire, sous l'action de moyens chimiques, physiques ou mécaniques (les endotoxines). Les végétaux toxiques produisent des toxines via leurs métabolites secondaires : ce sont des molécules qui, à l'inverse des toxines primaires (protéines, lipides, glucides, acides aminés...) sont produites en dehors des voies métaboliques nécessaires à assurer la survie (donc des métabolites primaires). On peut classer les toxines végétales en trois groupes : les phénols, les azotés et les terpènes. La toxine peut être une neurotoxine (une toxine agissant sur le système nerveux), une myotoxine (agissant sur la contraction des muscles, notamment les cardiotoxines sur le cœur et d'autres comme la strychnine sur les muscles respiratoires), une hémotoxine (agissant sur le sang), une cytotoxine (agissant sur les cellules), une dermatotoxine (agissant sur la peau et les muqueuses), une hépatotoxine (agissant sur le foie), une néphrotoxine (agissant sur le rein), une entérotoxine (agissant sur le tube digestif) etc. La toxine peut être une anatoxine ; c’est-à-dire une toxine qui a été traitée de manière à conserver son pouvoir antigénique et perdre son pouvoir toxique. La toxine est de préférence une toxine de microorganisme, de plante, d’algue, de microalgue, de bactérie, de virus, de parasite, de levure, de champignon, d’insecte, d’animal, ou de tumeur ; de préférence une toxine d’un pathogène eucaryote ou procaryote, ou d’un cancer. Les différentes catégories de toxines sont bien connues de l’homme du métier, qui pourra notamment se référer aux ouvrages de référence dans le domaine (tels que Michael W. Parker, Protein Toxin Structure, Springer Science & Business Media, 29 juin 2013 ; Michael R. Dobbs, Clinical Neurotoxicology E-Book: Syndromes, Substances, Environments, Elsevier Health Sciences, 22 juil. 2009 ; Walker AA, Robinson SD, Yeates DK, Jin J, Baumann K, Dobson J, Fry BG, King GF. Entomo-venomics: The évolution, biology and biochemistry of insect venoms. Toxicon. 2018 Nov; 154: 15-27; Vilariho N, Louzao MC, Abal P, Cagide E, Carrera C, Vieytes MR, Botana LM. Human Poisoning from Marine Toxins: Unknowns for Optimal Consumer Protection. Toxins (Basel). 2018 Aug 9; 10(8) ; ainsi que les bases de données spécialisées telles que décrites dans Galperin, Fernàndez-Suàrez, Rigden, The 24th annual Nucleic Acids Research database issue: a look back and upcoming changes, NAR, Volume 45, Issue D1 , January 2017, Pages D1 -D11 ; en particulier la base de données Comparative Toxicogenomics Database, telle que décrite dans Davis, Grondin Murphy, Johnson, Lay, Lennon-Hopkins, Saraceni-Richards, Sciaky, King, Rosenstein, Wiegers, Mattingly, The Comparative Toxicogenomics Database: update 2013, NAR, Volume 41 , Issue D1 , 1 January 2013, Pages D1104-D1114 (disponible notamment sur le site ctdbase.org)).
Par « récepteur » on entend une molécule de la membrane cellulaire ou du cytoplasme ou du noyau cellulaire qui se lie spécifiquement à un facteur spécifique (un ligand, tels un neurotransmetteur, une hormone, ou une autre substance), induisant une réponse cellulaire à ce ligand. Les modifications du comportement du récepteur induites par le ligand conduisent à des modifications physiologiques qui constituent les « effets biologiques » du ligand. Les récepteurs peuvent comprendre au moins : un peptide, une protéine, une glycoprotéine, un sucre, un oside, un lipide, un acide nucléique, ou une combinaison quelconque de ceux-ci. Les récepteurs sont en général des protéines ou des protéines mixtes (protéines modifiées et/ou associées à une autre molécule). Le récepteur peut être un récepteur de la partie externe de la membrane plasmique, un récepteur transmembranaire enchâssé dans la bicouche lipidique des membranes cellulaires (en général une protéine transmembranaire, agissant par exemple comme récepteur aux hormones et aux neurotransmetteurs - Ces récepteurs sont soit couplés à une protéine G soit porteurs d'une activité enzymatique ou de canal ionique qui permettent l'activation des voies métaboliques de la transduction du signal en réponse à la fixation du ligand), ou un récepteur intracellulaire (ces récepteurs peuvent parfois pénétrer dans le noyau de la cellule pour y moduler l'expression de gènes spécifiques, en réponse à l'activation par le ligand). Le récepteur est de préférence un récepteur de microorganisme, de plante, d’algue, de microalgue, de bactérie, de virus, de parasite, de levure, de champignon, d’insecte, d’animal, ou de tumeur ; de préférence un récepteur d’un pathogène eucaryote ou procaryote, ou d’un cancer ; de préférence un récepteur protéique ou glycoprotéique de bactérie, de virus, de parasite, de levure, de champignon ou de tumeur. Les différentes catégories de récepteurs sont bien connues de l’homme du métier, qui pourra notamment se référer aux ouvrages de référence dans le domaine (tels que Thomas D. Pollard, William C. Earnshaw, Jennifer Lippincott-Schwartz, Graham Johnson Cell Biology E-Book, Elsevier Health Sciences, 1 nov. 2016 ; Mohammed Zourob, Récognition Receptors in Biosensors, DOI 10.1007/978-1 -4419-0919-0, Springer-Verlag New York 2010 ; Abbas, Lichtman, Pillai, Cellular and Molecular Immunology E-Book, Elsevier Health Sciences, 22 août 2014 ; ainsi que les bases de données spécialisées telles que décrites dans Galperin, Fernéndez-Suérez, Rigden, The 24th annual Nucleic Acids Research database issue: a look back and upcoming changes, NAR, Volume 45, Issue D1 , January 2017, Pages D1-D11 ; en particulier la base de données GPCRdb, , telle que décrite dans Isberg V., Mordalski S., Munk C., Rataj K., Harpsoe K., Hauser A.S., Vroling B., Bojarski A.J., Vriend G., Gloriam D.E.. GPCRdb: an information System for G protein-coupled receptors. Nucleic Acids Res. 2016 ; 44:D356-D364 (disponible notamment sur le site gpcrdb.org)).
Par « signal d’adressage ou de ciblage ou de transport » ou par « molécule de signalisation » ou par « signal » ou par « signal cellulaire » on entend les séquences d’adressage de peptide et de protéine, les molécules permettant le transport et/ou l’internalisation cellulaire, ainsi que les ligands de récepteurs (les récepteurs étant tels que définis ci-dessus). La séquence d'adressage est une courte séquence d'acide aminés, généralement situé à l'extrémité N-terminale de la protéine, servant à désigner les protéines devant être adressées, et indiquer leur destination. Ainsi, le signal d’adressage ou de ciblage ou de transport peut être un signal d’adressage ou de ciblage ou de transport au/vers le noyau ; un signal d’adressage ou de ciblage ou de transport au/vers le cytoplasme ; un signal d’adressage ou de ciblage ou de transport au/vers le cytosol ; un signal d’adressage ou de ciblage ou de transport à/vers la membrane cellulaire ; un signal d’adressage ou de ciblage ou de transport aux/vers les mitochondries ; un signal d’adressage ou de ciblage ou de transport aux/vers les péroxysomes; un signal d’adressage ou de ciblage ou de transport aux/vers les lysosomes ; un signal d’adressage ou de ciblage ou de transport au/vers le réticulum endoplasmique ; un signal d’adressage ou de ciblage ou de transport des voies de sécrétion ; et un ligand d’un récepteur, de préférence un récepteur membranaire ou transmembranaire, de préférence un récepteur membranaire ou transmembranaire d’une membrane choisie parmi une membrane cellulaire, une membrane extracellulaire, une membrane cytoplasmique ou une membrane nucléaire. Le signal d’adressage ou de ciblage ou de transport peut comprendre au moins : un peptide, une protéine, une glycoprotéine, un sucre, un oside, un lipide, un acide nucléique, ou une combinaison quelconque de ceux-ci. De préférence, le signal d’adressage ou de ciblage ou de transport comprend au moins un peptide, une protéine, une glycoprotéine, ou un acide nucléique. Le signal est de préférence un signal procaryote, eucaryote ou viral, de préférence un signal d’un animal, d’un végétal, d’une algue, d’une microalgue, d’un microorganisme, d’une bactérie, d’un parasite, d’une levure, d’un champignon, d’un insecte, d’un virus, ou d’un cancer ; de préférence encore un signal de mammifère, tel qu’un signal humain. Les différentes catégories de signaux sont bien connues de l’homme du métier, qui pourra notamment se référer aux ouvrages de référence dans le domaine (tels que Thomas D. Pollard, William C. Earnshaw, Jennifer Lippincott-Schwartz, Graham Johnson Cell Biology E-Book, Elsevier Health Sciences, 1 nov. 2016 ; Mohammed Zourob, Récognition Receptors in Biosensors, DOI 10.1007/978-1 - 4419-0919-0, Springer-Verlag New York 2010 ; Abbas, Lichtman, Pillai, Cellular and Molecular Immunology E-Book, Elsevier Health Sciences, 22 août 2014).
Par « enzyme » on entend une protéine dotée de propriétés catalytiques. Pratiquement toutes les biomolécules capables de catalyser des réactions chimiques dans les cellules sont des enzymes ; certaines biomolécules catalytiques sont cependant constituées d'ARN et sont donc distinctes des enzymes : ce sont les ribozymes. Une enzyme agit en abaissant l'énergie d'activation d'une réaction chimique, ce qui accroît la vitesse de réaction. L'enzyme n'est pas modifiée au cours de la réaction. Les molécules initiales sont les substrats de l'enzyme, et les molécules formées à partir de ces substrats sont les produits de la réaction. Les enzymes sont notamment caractérisées par leur très grande spécificité. De plus, une enzyme a la caractéristique d'être réutilisable.
Les enzymes sont généralement des protéines globulaires qui agissent seules ou en complexes de plusieurs enzymes ou sous-unités. Comme toutes les protéines, les enzymes sont constituées d'une ou plusieurs chaînes polypeptidiques repliées pour former une structure tridimensionnelle correspondant à leur état natif.
Les enzymes sont des molécules bien plus grandes que leurs substrats. Leur taille peut varier d’une cinquantaine-centaine de résidus à plus de 2 000 résidus. Seule une toute petite partie de l'enzyme — entre deux et quatre résidus le plus souvent, parfois plus — est directement impliquée dans la catalyse, ce qu'on appelle le site catalytique (ou domaine catalytique). Ce dernier peut être situé à proximité d'un ou plusieurs sites de liaison, au niveau desquels le(s) substrat(s) est(sont) lié(s) et orienté(s) afin de permettre la catalyse de la réaction chimique. Le site catalytique et les sites de liaison forment le site actif de l'enzyme.
Les enzymes remplissent un grand nombre de fonctions au sein des êtres vivants. Elles peuvent par exemple intervenir dans des mécanismes de transduction de signal et de régulation des processus cellulaires, dans la génération de mouvements, dans le transport actif transmembranaire, dans la digestion, dans le métabolisme, dans le système immunitaire, dans des mécanismes de digestion ou coupure d’acides nucléiques en encore de production d’acides nucléiques (appelées ici « enzymes agissant sur les acides nucléiques »), dans des mécanismes de conversion de prodrogue (conversion de prodrogue en drogue). L’enzyme est de préférence une enzyme procaryote, eucaryote ou virale, de préférence une enzyme d’un animal, d’un végétal, d’une algue, d’une microalgue, d’un insecte, d’un microorganisme, d’une bactérie, d’un parasite, d’une levure, d’un champignon ou d’un virus, de préférence encore une enzyme de mammifère, telle qu’une enzyme humaine. Les différentes catégories d’enzymes sont bien connues de l’homme du métier, qui pourra notamment se référer aux ouvrages de référence dans le domaine (tels que Schomburg D., Schomburg I., Springer Handbook of Enzymes. 2 edn. Heidelberg: Springer; 2001 -2009 ; Liébecq C., IUPAC-IUBMB Joint Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN) and Nomenclature Committee of IUBMB (NC-IUBMB) Biochem. Mol. Biol. Int. 1997;43:1151-1156; IUBMB (1992), Enzyme Nomenclature 1992, Academie Press, San Diego; ainsi que les bases de données spécialisées telles que décrites dans Schomburg D, Schomburg I. Methods Mol Biol. 2010;609:113-28. Enzyme databases ; en particulier la base de données BRENDA (disponible notamment sur le site brenda-enzymes.org), telle que décrite par exemple par Chang A, Schomburg I, Placzek S, Jeske L, Ulbrich M, Xiao M, Sensen CW, Schomburg D, Nucleic Acids Res. 2015 Jan;43. Epub 2014 Nov 5. BRENDA in 2015: exciting developments in its 25th year of existence).
Par « activité enzymatique » ou « activité catalytique » ou encore « activité » d’une enzyme, on entend l’efficacité d’une enzyme à convertir un substrat en produit dans un environnement donné. L’efficacité de l’enzyme prend en compte ici la vitesse de conversion du substrat en produit par l’enzyme et le taux de conversion du substrat en produit par l’enzyme. Par « taux de conversion du substrat en produit par l’enzyme » on entend ici le ratio entre la quantité de produit final obtenu par rapport à la quantité initiale de substrat pour une quantité définie d’enzyme. Par exemple, une activité enzymatique au sens de l’invention peut être exprimée en quantité de phloroglucinol produit dans un volume donné (en g/L). Par « hormone » on entend une substance chimique biologiquement active, en général synthétisée par une cellule glandulaire (généralement suite à une stimulation) et sécrétée dans le milieu intérieur où elle circule (par voie sanguine, par la lymphe ou par la sève). Elle transmet un message sous forme chimique (en général en agissant sur des récepteurs spécifiques d'une cellule cible) et joue donc un rôle de messager dans l'organisme. Elle est capable d'agir à très faible dose.
L’hormone est avantageusement une hormone végétale ou animale. Les hormones végétales sont également appelées phytohormones ou facteurs de croissance. Elles ont souvent comme fonction d'assurer la croissance de la plante ou sa morphogenèse. Les hormones animales sont dans la plupart des cas produites par le système endocrinien (une glande endocrine ou un tissu endocrinien). Avantageusement, l’hormone est une hormone de vertébrés, de préférence choisie parmi les classes chimiques suivantes :
Les hormones dérivées d'amines, qui sont constituées d'un seul acide aminé (la tyrosine ou le tryptophane) mais sous une forme dérivée.
Les hormones peptidiques, qui sont des chaînes d'acides aminés, donc des protéines, appelées peptides pour les plus courtes.
Les hormones stéroïdes, qui sont des stéroïdes dérivés du cholestérol.
Les hormones à base de lipides et de phospholipides.
L’hormone est de préférence choisie parmi les hormones peptidiques ou protéiques, les hormones dérivées d’amines, les hormones stéroïdes et les hormones lipidiques. L’hormone est de préférence une hormone d’un animal ou d’un végétal, de préférence une hormone de mammifère, de préférence une hormone humaine. Les différentes catégories d’hormones sont bien connues de l’homme du métier, qui pourra notamment se référer aux ouvrages de référence dans le domaine (tels que Davies P. J. (2010) The Plant Hormones: Their Nature, Occurrence, and Functions. In: Davies P. J. (eds) Plant Hormones. Springer, Dordrecht ; AW Norman, G Litwack, Hormones, Academie Press, 1997; A Kastin, Handbook of biologically active peptides, Academie Press, 2013).
Par « anticorps » on entend une protéine ou une glycoprotéine complexe utilisée par le système immunitaire pour détecter et neutraliser les agents pathogènes de manière spécifique. Chez les mammifères, les anticorps sont pour la plupart sécrétés par des cellules dérivées des lymphocytes B : les plasmocytes. Les anticorps (également appelés immunoglobulines) constituent les globulines principales du sang. Les anticorps comprennent également les auto-anticorps (produits par exemple dans le cas d'une maladie auto-immune).
Les anticorps sont des protéines, des glycoprotéines de la superfamille des immunoglobulines formées de 4 chaînes polypeptidiques (150000 uma ou dalton) : deux chaînes lourdes (H pour heavy de 50000 uma chacune) et deux chaînes légères (L pour light de 25 000 uma chacune) qui sont reliées entre elles par un nombre variable de ponts disulfures assurant la cohésion de la molécule. Ces chaînes forment une structure en Y (chaque chaîne légère constitue pour moitié un bras du Y) et sont constituées de domaines immunoglobulines pouvant comprendre 110 acides aminés environ. Chaque chaîne légère est constituée d'un domaine constant et d'un domaine variable ; les chaînes lourdes sont composées d'un fragment variable et de trois ou quatre fragments constants selon l'isotype. Pour un anticorps donné, les deux chaînes lourdes sont identiques, de même pour les deux chaînes légères. Les domaines constants sont caractérisés par une séquence en acides aminés très proche d'un anticorps à l'autre, caractéristiques de l'espèce et de l'isotype. Chaque chaîne légère en possède un exemplaire noté CL. Les chaînes lourdes comportent, selon l'isotype, trois ou quatre domaines constants CH1 , CH2, CH3, (CH4). Les domaines constants ne sont généralement pas impliqués dans la reconnaissance de l'antigène, mais interviennent dans l'activation du système du complément, ainsi que dans l'élimination des complexes immuns (anticorps lié à son antigène) par les cellules immunitaires possédant les récepteurs aux fragments constants (RFc). Un anticorps possède quatre domaines variables situés aux extrémités des deux « bras ». L'association entre un domaine variable porté par une chaîne lourde (VH) et le domaine variable adjacent porté par une chaîne légère (VL) constitue le site de reconnaissance (ou paratope) de l'antigène. Ainsi, une molécule d'immunoglobuline possède deux sites de liaison à l'antigène, un au bout de chaque bras. Ces deux sites sont identiques (mais destiné à différents épitopes), d'où la possibilité de lier deux molécules d'antigène par anticorps.
Le clivage enzymatique spécifique permet d'isoler différents fragments : le fragment Fc (cristallisable). Il est le support des propriétés biologiques de l'immunoglobuline, en particulier sa capacité à être reconnu par des effecteurs de l'immunité ou à activer le complément. Il est constitué des fragments constants des chaînes lourdes (CH2) au-delà de la région charnière (« hinge », en anglais). Il ne reconnaît pas l'antigène ; le fragment Fv. C'est le plus petit fragment gardant les propriétés de l'anticorps que possède l'immunoglobuline. Il est constitué uniquement des régions variables VL et VH, il fixe donc l'antigène avec la même affinité que l'anticorps complet et est monovalent ; le fragment Fab. Il a la même affinité pour l'antigène que l'anticorps complet. Le fragment Fab est formé de la chaîne légère en entier (VL+CL) et d'une partie de la chaîne lourde (VH+CH1 ). Il est monovalent ; le fragment F(ab')2. Il correspond à l'association de deux fragments Fab reliés par une petite partie des parties constantes des chaînes lourdes, la région charnière (en anglais : hinge). Il a la même affinité que l'anticorps pour l'antigène et est divalent.
Les anticorps monoclonaux sont des anticorps ne reconnaissant qu'un seul type d'épitope sur un antigène donné. Ils sont par définition tous identiques et produits par un seul clone de plasmocyte. Les anticorps polyclonaux sont un mélange d'anticorps reconnaissant différents épitopes sur un antigène donné, chaque idiotype étant sécrété par un clone différent de plasmocytes. Au cours de la réponse immunitaire, un organisme synthétise des anticorps dirigés contre plusieurs épitopes d'un antigène : la réponse est dite polyclonale. L’anticorps peut être un fragment fonctionnel d’un anticorps. Dans ce cas, ledit fragment peut être choisi parmi un fragment Fc d’un anticorps, un fragment Fv d’un anticorps, un fragment Fab d’un anticorps, et un fragment F(ab’) d’un anticorps. L’anticorps est de préférence un anticorps d’un animal, de préférence un anticorps de mammifère, de préférence un anticorps humain ou humanisé. Avantageusement, l’anticorps est un anticorps monoclonal. Les différentes catégories d’anticorps sont bien connues de l’homme du métier, qui pourra notamment se référer aux ouvrages de référence dans le domaine (tels que Thomas D. Pollard, William C. Earnshaw, Jennifer Lippincott-Schwartz, Graham Johnson Cell Biology E-Book, Elsevier Health Sciences, 1 nov. 2016 ; Mohammed Zourob, Récognition Receptors in Biosensors, DOI 10.1007/978-1 -4419-0919-0, Springer-Verlag New York 2010 ; Abbas, Lichtman, Pillai, Cellular and Molecular Immunology E-Book, Elsevier Health Sciences, 22 août 2014 ; Bayer V., An OverView of Monoclonal Antibodies. Semin Oncol Nurs. 2019 Sep 2:150927 ; Wang W, Wang EQ, Balthasar JP. Monoclonal antibody pharmacokinetics and pharmacodynamies. Clin Pharmacol Ther. 2008 Nov;84(5):548-58).
Par « microorganisme » ou « micro-organisme », on entend un organisme vivant microscopique. Les micro-organismes comprennent notamment des bactéries, des champignons microscopiques, des archéobactéries, des protistes, des algues vertes microscopiques, des animaux du plancton, des planaires, et des amibes. Il est possible de distinguer d'une part les micro-organismes procaryotes qui ne possèdent pas de noyau comme les bactéries et les Archaea, et d'autre part les micro-organismes eucaryotes possédant un noyau. Les eucaryotes microscopiques comprennent les champignons comme les levures et deux types de protistes : les algues et protozoaires. Les micro-organismes sont en général unicellulaires, certaines espèces pouvant être multicellulaires. Des protistes unicellulaires peuvent être visibles à l'œil nu et quelques espèces multicellulaires sont microscopiques.
La taille moyenne des cellules bactériennes est de 0,5 à 1 pm, mais il existe certaines bactéries ayant une taille de plus de 50 pm. Les cellules eucaryotes ont un diamètre allant de 5 à 100 pm.
Par « procaryote » (ou Prokaryota) on entend un être vivant dont la structure cellulaire ne comporte pas de noyau, et presque jamais d'organites membranés (la seule exception étant les thylakoïdes chez les cyanobactéries). Il s'agit notamment des microorganismes unicellulaires simples tels que les bactéries (comprenant les archées et les eubactéries). Dans la classification du vivant en sept règnes, les procaryotes forment un taxon paraphylétique, regroupant ainsi des êtres vivants partageant une structure cellulaire similaire et simple.
Selon la classification admise, ce taxon s'oppose aux « eucaryotes », caractérisés par la présence d'un noyau et de multiples autres organites. Par « eucaryote » (ou Eukaryota), on entend donc un organisme appartenant au domaine des eucaryotes, un domaine regroupant tous les organismes, unicellulaires ou multicellulaires, qui se caractérisent par la présence d'un noyau et généralement d'organites spécialisés dans la respiration, en particulier mitochondries chez les aérobies mais aussi hydrogénosomes chez certains anaérobies.
Par « bactérie », on entend un organisme microscopique et procaryote présent dans tous les milieux, appartenant au règne des bactéries. Le terme bactérie désigne ici à la fois les eubactéries et les archaebactéries (ou archées).
Par « algue », on entend un organisme capable de photosynthèse oxygénique et dont le cycle de vie se déroule généralement en milieu aquatique. Les algues comprennent notamment les cyanobactéries et les algues eucaryotes. Par « cyanobactérie », on entend un organisme procaryote appartenant au groupe des Cyanobacteria, appelées également algues bleues. Par « algue eucaryote », on entend un organisme eucaryote appartenant au groupe des algues eucaryotes, comprenant les embranchements des Glaucophyta ou Glaucocystophyta, des Rhodophyta, des Chlorobionta ou Viridiplantae, des Cryptophyta, des Euglenozoa, des Cercozoa, des Haptophyta ou Prymnesiophyta, des Dinophyta, et des Ochrophyta ou Heterokontophyta. Les algues eucaryotes selon l’invention comprennent en particulier divers groupes à espèces unicellulaires (Euglénophytes, Cryptophytes, Haptophytes, Glaucophytes, etc.), d'autres groupes à espèces unicellulaires ou pluricellulaires (tels que les « algues rouges » ou Rhodophyta, les Stramenopiles (regroupant notamment les Diatomées et les « algues brunes » ou Phéophycées), et des végétaux assez proches des plantes terrestres (tels que les « algues vertes », qui comprennent entre autres les Ulvophycées).
Par « microalgue » ou « micro-algue » on entend les algues microscopiques, parfois appelées microphyte. Unicellulaires ou pluricellulaires indifférenciées, ce sont des micro-organismes généralement photosynthétiques eucaryotes. Les microalgues peuvent comprendre également des procaryotes, regroupant l'ensemble des cyanobactéries (ou "algues bleues"). Vivant dans les milieux fortement aqueux, elles peuvent posséder une mobilité flagellaire. Elles colonisent tous les biotopes exposés à la lumière. Toutefois, la grande majorité des microalgues est capable de se nourrir par osmotrophie la nuit et est donc, de fait, mixotrophes. Les microalgues jouent un rôle important dans le cycle du carbone et de manière plus générale dans les cycles biogéochimiques des lacs et de l'océan. Les microalgues peuvent être cultivées de manière monoclonale dans des photobioréacteurs ou des fermenteurs industriels.
Par « animal » on entend un organisme appartenant au règne animal. Selon la classification classique, un animal est un être vivant hétérotrophe, c’est-à-dire qu’il se nourrit de substances organiques. On entend également le taxon des animaux nommé Animalia, dans les classifications scientifiques modernes (création originale de Linné en 1758, eu égard au Code international de nomenclature zoologique (ICZN)) ou encore Metazoa (synonyme junior créé par Haeckel en 1874). Un animal est un être complexe et multicellulaire (métazoaire). Quel que soit le terme employé ou quelle que soit la classification retenue (évolutionniste ou cladiste), on entend ici par animal des organismes eucaryotes pluricellulaires généralement mobiles et hétérotrophes.
Les animaux comprennent notamment le groupe des vertébrés. Par « vertébrés » on entend un organisme appartenant au groupe des animaux vertébrés (aussi appelée Vertebrata), qui est un sous- embranchement du règne animal. Les vertébrés possèdent un squelette osseux ou cartilagineux, qui comporte en particulier une colonne vertébrale. Ces animaux bilatériens appartiennent à l'embranchement des Chordés et regroupent l'ensemble des Poissons ainsi que les Tétrapodes. On y inclut également les Myxines (des poissons sans mâchoires) bien qu'elles n'aient pas de véritable colonne.
Par « mammifère » on entend un animal appartenant au taxon ou au clade (un regroupement cladistique de lignées biologiques) ou la classe des mammifères (classe également appelée Mammalia), regroupant des animaux vertébrés. Leur aire de répartition est planétaire, ils ont conquis une grande partie des niches écologiques de la macrofaune et demeurent un des taxons dominants depuis l'Éocène. La caractéristique principale de ce clade est l'allaitement des jeunes à partir d'une sécrétion cutanéo-glandulaire spécialisée appelée lait. Les nouveau-nés nécessitent systématiquement des soins parentaux du fait de leur appareil digestif immature à la naissance (le lait est leur source de nourriture vitale et obligatoire). D'autres caractéristiques permettent également de distinguer les mammifères des autres taxons, y compris fossiles. Un « humain » appartient au clade des mammifères.
Par « végétal », on entend un organisme appartenant au règne végétal. Le règne végétal comprend les lignées qui végètent : c'est-à-dire qui respirent, se nourrissent, croissent comme les plantes, selon les classifications scientifiques classiques. Le règne végétal est un assemblage polyphylétique d’organismes photosynthétiques et dont les cellules ont une paroi faite de cellulose. Le terme végétal désigne à la fois les plantes terrestres (ou végétaux verts) et les algues vertes, constituant le taxon des Chlorobiontes, ainsi que les algues rouges, les algues brunes et les champignons. Le groupe végétal est donc formé de deux lignées, l’une d’algues ; et la seconde de plantes (en particulier les plantes terrestres), qui comprennent notamment les bryophytes (mousses et hépatiques), fougères (ptéridophytes), gymnospermes et angiospermes. Avantageusement, le végétal est une plante.
Par « insecte » (ou Insecta) on entend une classe d'animaux invertébrés de l'embranchement des arthropodes et du sous-embranchement des hexapodes. Ils sont caractérisés par un corps segmenté en trois tagmes (tête possédant des pièces buccales externes, une paire d'antennes et au moins une paire d'yeux composés ; thorax pourvu de trois paires de pattes articulées et deux paires d'ailes plus ou moins modifiées ; abdomen dépourvu d'appendices) protégés par une cuticule formant un exosquelette composé de chitine et pourvu de trachées respiratoires.
Par « parasite » on entend un être vivant au moins partiellement de parasitisme. Le parasitisme est une relation biologique durable entre deux êtres vivants hétérospécifiques où un des protagonistes — le parasite — tire profit d'un organisme hôte pour se nourrir, s'abriter ou se reproduire. Cette relation aura un effet négatif pour l’hôte. Les organismes qui ne sont pas parasites peuvent être qualifiés de « libres ». On trouve des parasites dans l'ensemble du monde vivant. Certains groupes sont composés quasi exclusivement de parasites (exemples : les plathelminthes monogènes), bien que la plupart comportent à la fois des espèces parasites et libres (exemple : les nématodes). Les vertébrés comportent quelques espèces parasites (telles que les chauves-souris hématophages, les lamproies, les poissons-vampires (ou candirùs), etc.). De nombreux parasites peuvent modifier le comportement de leur hôte, à l'avantage du parasite.
Avantageusement, le parasite est un parasite d’un animal, de préférence humain. Le parasite d’un animal est généralement un métazoaire ou un protozoaire. Le parasite d’animal n'inclut ici ni virus (virose), ni les bactéries (infection bactérienne), ni les champignons (mycose)). La présence du parasite dans l’organisme est appelée parasitose. Lors de la parasitose, il y a action des leucocytes polynucléaires éosinophiles. La parasitose se caractérise par une hyper éosinophilie qui correspond à une augmentation de ces cellules de défense dans le sang. Les cristalloïdes (protéines majeures) sont responsables de cette action antiparasitaire. Des exemples de parasites d’animaux incluent : les protozoaires (comprenant les classes: des Rhizopodes intestinaux (Amibes) ; des Flagellés ; des Sporozoaires : et des Ciliés ; les métazoaires (comprenant les Helminthes (vers) ; les Plathelminthes (vers plats, non chitineux) ; les trématodes (non segmentés) ; les Schistosomes ; les Cestodes (segmentés) ; les taenias ; les Némathelminthes (vers rond, chitineux, non segmentés, à sexe séparé), les Filaires, etc.) ; les arthropodes (incluant les Arachnides et des Insectes parasites ou vecteurs de parasites).
Par « champignon » ou « fungus » ou « fungi » on entend un organisme eucaryote appartenant au règne des Fungi, aussi appelé Mycota ou Mycètes ou fonge. Ce règne constitue un large groupe diversifié, depuis des organismes unicellulaires (levures) ou pluricellulaires (moisissures) microscopiques, jusqu'aux « champignons supérieurs » dotés le plus souvent d'un pied et d'un chapeau. Les champignons sont notamment caractérisés par l'existence simultanée d’une paroi cellulaire périphérique et de vacuoles turgescentes dans le cytoplasme, leur corps végétatif non différencié et leur paroi peptido-polyosidique, ainsi que l’absence de chloroplastes, de chlorophylle et d'amidon. Ce sont des organismes hétérotrophes au carbone.
Par « levure » on entend un champignon unicellulaire apte à provoquer la fermentation des matières organiques animales ou végétales. Les levures présentent en général un métabolisme de respiration oxydatif et peuvent également utiliser un métabolisme fermentatif alcoolique. Ces micro-organismes eucaryotes, de forme variable selon l’espèce (sphérique, ovoïde ou elliptique, en bouteille, triangulaire ou apiculée (renflée à chaque bout comme un citron) mais généralement ovale, d'environ 6 à 10 microns et jusqu’à 50 microns, se multiplient par bourgeonnement ou par scission (scissiparité). Ils sont souvent capables d'accomplir une sporulation soit dans un but de dormance en milieu défavorable, soit dans un but de dispersion. Les levures sont en général caractérisées par une paroi cellulaire (constituée d'une couche externe de mannoprotéines, associés à des glucanes et une couche interne de glucanes associés à une petite quantité de chitine) entourant la membrane plasmique et protégeant la levure des agressions physico-chimiques du milieu extérieur ; une membrane cytoplasmique composée principalement de phospholipides double couche ; un noyau contenant l'information génétique du génome chromosomique de la levure ; des mitochondries qui jouent un rôle important dans la respiration aérobie de la levure et la production d'ATP. Certaines levures possèdent un pouvoir pathogène chez les animaux et sont responsables des mycoses de type candidoses (genre Candida). Des exemples de levures incluent celles du genre Saccharomyces (tel que Saccharomyces cerevisiae) ou Schyzosaccharomyces. Par « virus » on entend un agent infectieux nécessitant un hôte (en général une cellule) dont il utilise le métabolisme et ses constituants pour se répliquer. Les virus changent de forme au cours de leur cycle, en passant par deux stades : une forme extracellulaire (unité matérielle indépendante appelée virion lorsqu'il y a une capside ou, pour quelques formes, viroïde). Sous la forme extracellulaire, les virus sont des objets particulaires, infectieux, constitués au minimum d'un acide nucléique souvent englobé dans une capside de protéines ; une forme intracellulaire (virus intégré sous forme dormante ou détournant activement la machinerie cellulaire au profit de sa réplication). Sous la forme intracellulaire (à l'intérieur de la cellule hôte), les virus sont des éléments génétiques qui peuvent se répliquer en parasitant tout ou partie du métabolisme de la cellule hôte, que ce soit intégré à un chromosome du génome hôte (on parle alors de provirus) ou parallèlement à lui (cas par exemple des usines à virions).
Le virus est de préférence un virus d’eucaryote (c’est à dire un virus infectant les eucaryotes et plus particulièrement les cellules eucaryotes), de préférence encore un virus d’animal (c’est à dire un virus infectant les animaux et plus particulièrement les cellules animales), de préférence encore un virus de mammifère (c’est à dire un virus infectant les mammifères et plus particulièrement les cellules mammifères), de préférence encore un virus d’humain (c’est à dire un virus infectant les humains et plus particulièrement les cellules humaines). Le virus peut également être un virus de végétal (c’est à dire un virus infectant les végétaux et plus particulièrement les cellules végétales), de préférence un virus de plante (c’est à dire un virus infectant les plantes et plus particulièrement les cellules de plantes).
Le virus est de préférence un virus pathogène.
Par « maladie » ou « affection » ou trouble » ou « pathologie » on entend une altération des fonctions ou de la santé d'un organisme vivant. On parle aussi bien de la maladie, se référant à l'ensemble des altérations de santé, que d'une maladie, qui désigne alors une entité particulière caractérisée par des causes, des symptômes, une évolution et des possibilités thérapeutiques propres. Par « infection » ou « maladie infectieuse » on entend une maladie provoquée par la transmission d'un micro-organisme ou d'un agent infectieux : virus, bactérie, parasite, champignon, protozoaire. Par « maladie auto-immune » on entend une maladie consécutive à une anomalie du système immunitaire conduisant ce dernier à s'attaquer aux composants normaux de l'organisme (le "soi").
Par « maladie métabolique » on entend un trouble médical qui affecte les métabolismes dans la cellule, en particulier la production d'énergie. En général, une maladie métabolique empêche la bonne transformation par l’organisme des sucres, des graisses et des protéines.
Par « maladie dermatologique » on entend une maladie de la peau, des muqueuses et des phanères (ongles, cheveux, poils).
Par « maladie cardiovasculaire » ou « maladie cardioneurovasculaire » on entend une maladie qui concerne le cœur et la circulation sanguine. Par « maladie respiratoire », on entend une maladie affectant l’appareil respiratoire. L’appareil respiratoire est un ensemble d’organes permettant la respiration (c’est-à-dire les échanges gazeux entre l'organisme et l'environnement). Chez les mammifères tels que l’humain, l’appareil respiratoire comprend le nez, la bouche, le pharynx, le larynx, la trachée, le diaphragme et les poumons, ces derniers comprenant les bronches, les bronchioles, les alvéoles et les acini. Par « maladie des poumons » ou « maladie pulmonaire », on entend une maladie respiratoire qui affecte les poumons. Les maladies respiratoires et/ou pulmonaires peuvent être d’origine infectieuse, virale, génétique, environnementale, ou résulter d’une combinaison de ces facteurs.
Par « maladie neurodégénérative », une entend une maladie chronique invalidante, qui peut être à évolution lente et discrète. Elle provoque généralement une détérioration du fonctionnement des cellules nerveuses, en particulier des neurones, pouvant conduire à la mort cellulaire (ou neurodégénérescence). Les troubles induits par les maladies neurodégénératives sont variés et peuvent être d'ordre cognitivo-comportemental, sensoriel ou moteur.
Par « maladie génétique » on entend une maladie due à une ou plusieurs anomalies sur un ou plusieurs chromosomes qui entraînent un défaut de fonctionnement de certaines cellules de l'organisme. Les maladies génétiques sont dites dominantes ou récessives, si l'allèle responsable est ou non dominant (chez un individu chaque gène est représenté par deux allèles). On peut aussi les classer en fonction de la position du gène responsable de l'anomalie. S'il est situé sur la paire de chromosomes sexuels, la maladie est dite « gonosomale », s'il est localisé sur une paire de chromosomes homologues, la maladie est dite « autosomale ».
Par « maladie hormonale » ou « maladie endocrinienne » on entend une maladie causée par un dysfonctionnement des hormones sécrétées par les glandes endocrines.
Par « maladie psychiatrique » ou « maladie psychique » ou « maladie mentale » ou « trouble psychiatrique » ou « trouble psychique » ou « trouble mental », on entend un ensemble d'affections et troubles d'origines très différentes entraînant des difficultés dans la vie d'un individu et/ou de son entourage, des souffrances et des troubles émotionnels et du comportement. Les troubles psychiques touchent toutes les populations, sans distinction de sexe ou d'âge. Ces troubles peuvent être ponctuels, chroniques ou permanents.
Par « cancer » ou « maladie cancéreuse » on entend une maladie provoquée par la transformation de cellules qui deviennent anormales et prolifèrent de façon excessive (on peut parler de prolifération anarchique). Ces cellules déréglées peuvent finir par former une masse qu'on appelle tumeur (en général une tumeur maligne). Les cellules cancéreuses ont généralement tendance à envahir les tissus voisins et à se détacher de la tumeur. Elles peuvent alors migrer par les vaisseaux sanguins et les vaisseaux lymphatiques pour aller former une autre tumeur : on parle de métastase. Les cancers rassemblent un ensemble de pathologies très diverses de formes et de conséquences, tout en partageant cependant systématiquement un ensemble très typique de caractéristiques quel que soit le cancer concerné. Les éléments histologiques suivants peuvent notamment être retrouvés dans la plupart des cancers : une indépendance des cellules cancéreuses vis-à-vis des signaux qui stimulent normalement la multiplication des cellules ; une insensibilité des cellules cancéreuses aux signaux et mécanismes antiprolifératifs ; une capacité proliférative qui n'est plus limitée (croissance à l'infini, résultant souvent en néoplasmes) ; la disparition du phénomène d'apoptose chez ces mêmes cellules cancéreuses, autrement dit une forme d'"immortalité" agressive aux dépens du malade ; la régression ou dédifférenciation cellulaire vers une forme rappelant de plus en plus des cellules souches embryonnaires (la cellule cancéreuse peut ainsi passer d’un état de cellule spécialisée/différenciée vers un état de cellule non spécialisée, immature, multipotent ou pluripotent) ; une capacité anormale à susciter l'angiogenèse ; souvent l'acquisition d'un pouvoir invasif dans les stades avancés ; des lésions dans les tissus environnants (nécroses), qu'il y ait ou non invasion tissulaire; à de très rares exceptions, il s'agit de cellules issues de l'individu touché par ce cancer
(ce sont des cellules du Soi).
Par « tumeur » on entend une augmentation de volume d'un tissu, sans précision de cause. C'est une néoformation de tissus corporels (néoplasie) qui se produit à la suite d'un dérèglement de la croissance cellulaire, de type bénin ou malin (quand il s'agit d'une tumeur maligne, on parle de cancer). Une néoplasie peut concerner n'importe quel type de tissu. En fonction de la localisation de la tumeur et de la fonction du tissu affecté, elle peut conduire à un dysfonctionnement des organes et nuire à l'ensemble de l'organisme, voire causer sa mort. Les tumeurs peuvent survenir chez tous les organismes multicellulaires, y compris les plantes. On distingue les tumeurs bénignes et malignes :
Les tumeurs bénignes sont des tumeurs en général sans gravité, c'est-à-dire ne pouvant donner lieu à des tumeurs filles (métastases), comme c'est le cas des verrues ou des grains de beauté. Cependant, une tumeur bénigne peut entraîner des complications graves (compression, inflammation, etc.) par son action mécanique.
Les tumeurs malignes sont souvent désignées sous le terme de cancer. En plus d'attaquer les tissus environnants, elles produisent des tumeurs filles (métastases) qui se propagent à travers le sang ou la lymphe.
Par « tumeur », on entend ici de préférence une tumeur maligne.
Par « maladie liée à une infection et/ou liée à une exposition à une toxine » on entend une maladie de préférence non infectieuse, qui est provoquée, causée, amplifiée et/ou entretenue par au moins une infection et/ou par une exposition ponctuelle, occasionnelle, régulière, prolongée ou répétée à au moins une toxine.
Par « prévention » ou « prévention d’une maladie » ou « prévention de l’apparition d’une maladie » on entend la diminution du risque d’apparaître, de développer ou d’amplifier une maladie, les causes d’une maladie, les symptômes d’une maladie, les effets (ou conséquences, de préférence les effets/conséquences néfastes, délétères) d’une maladie, ou une combinaison quelconque de ceux- ci ; et/ou le fait de retarder l’apparition, le développement ou l’amplification d’une maladie, les causes d’une maladie, les symptômes d’une maladie, les effets (ou conséquences, de préférence les effets/conséquences néfastes, délétères) d’une maladie, ou une combinaison quelconque de ceux-ci. Par « traitement » ou « traitement d’une maladie », on entend la diminution, l’inhibition, et/ou la disparition d’une maladie, des causes d’une maladie, des symptômes d’une maladie, des effets (ou conséquences, de préférence les effets/conséquences néfastes, délétères) d’une maladie, ou d’une combinaison quelconque de ceux-ci.
Par « vaccin » ou « composition vaccinale » on entend une substance pathogène ou tumorale qui, inoculée à un individu sous une forme de préférence inoffensive, lui confère l'immunité contre une maladie (ou la protection contre une maladie). En général un vaccin stimule la réponse immunitaire de l'organisme. Un vaccin peut être préventif, permettant de prévenir l’apparition d’une maladie. Un vaccin peut également être thérapeutique, permettant d’aider le patient à lutter contre une maladie en cours.
Par « médicament », on entend toute substance ou composition présentée comme possédant des propriétés curatives ou préventives à l'égard des maladies humaines ou animales. Un médicament comprend donc toute substance ou composition pouvant être utilisée chez l'être humain ou l'animal ou pouvant leur être administrée, en vue d'établir un diagnostic médical ou de restaurer, corriger ou modifier leurs fonctions physiologiques en exerçant une action pharmacologique, immunologique ou métabolique.
Dans la description détaillée qui suit, les modes de réalisation pourront être pris seuls ou combinés de manière appropriée par l’homme du métier.
Capside
Les Inventeurs ont mis au point, de manière tout à fait surprenante, des capsides de phage T5 vides, dépourvues d’ADN génomique de phage, capables d’exposer à leur surface des protéines de fusion d’intérêt. Ces capsides fonctionnalisées sont notamment capables d’exercer, in vivo, les fonctions et activités de la protéine de fusion d’intérêt utilisée.
La présente invention concerne donc une capside de phage T5 dépourvue d’ADN génomique dudit phage et exposant, à sa surface, au moins une protéine de fusion, ladite protéine de fusion comprenant au moins un fragment de peptide ou de protéine ayant au moins 80% d’identité avec un fragment d’une protéine de décoration pb10, de préférence au moins 81% d’identité, de préférence au moins 82% d’identité, de préférence au moins 83% d’identité, de préférence au moins 84% d’identité, de préférence au moins 85% d’identité, de préférence au moins 86% d’identité, de préférence au moins 87% d’identité, de préférence au moins 88% d’identité, de préférence au moins 89% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 91% d’identité, de préférence au moins 92% d’identité, de préférence au moins 93% d’identité, de préférence au moins 94% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité, de préférence au moins 96% d’identité, de préférence au moins 97% d’identité, de préférence au moins 98% d’identité, de préférence au moins 99% d’identité, de préférence 100% d’identité avec un fragment d’une protéine de décoration pb10 ; ledit fragment d’une protéine de décoration pb10 comprenant (ou étant constitué essentiellement par, ou étant constitué par) de préférence au moins 76 acides aminés consécutifs d’une protéine pb10, de préférence au moins 77 acides aminés consécutifs d’une protéine pb10, de préférence encore au moins 80 acides aminés consécutifs d’une protéine pb10; de préférence encore au moins 76 acides aminés consécutifs du domaine N-terminal d’une protéine pb10, de préférence encore au moins 77 acides aminés consécutifs du domaine N-terminal d’une protéine pb10, de préférence encore au moins 80 acides aminés consécutifs du domaine N-terminal d’une protéine pb10. Avantageusement, la protéine fusion comprend en outre au moins une molécule, de préférence une molécule exogène.
La présente invention concerne en particulier une capside de phage T5 dépourvue d’ADN génomique dudit phage et exposant, à sa surface, au moins une protéine de fusion, ladite protéine de fusion comprenant :
- au moins un fragment de peptide ou de protéine ayant au moins 80% d’identité avec un fragment d’une protéine de décoration pb10, de préférence au moins 81% d’identité, de préférence au moins 82% d’identité, de préférence au moins 83% d’identité, de préférence au moins 84% d’identité, de préférence au moins 85% d’identité, de préférence au moins 86% d’identité, de préférence au moins 87% d’identité, de préférence au moins 88% d’identité, de préférence au moins 89% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 91% d’identité, de préférence au moins 92% d’identité, de préférence au moins 93% d’identité, de préférence au moins 94% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité, de préférence au moins 96% d’identité, de préférence au moins 97% d’identité, de préférence au moins 98% d’identité, de préférence au moins 99% d’identité, de préférence 100% d’identité avec un fragment d’une protéine de décoration pb10 ; ledit fragment d’une protéine de décoration pb10 comprenant (ou étant constitué essentiellement par, ou étant constitué par) de préférence au moins 76 acides aminés consécutifs d’une protéine pb10, de préférence au moins 77 acides aminés consécutifs d’une protéine pb10, de préférence encore au moins 80 acides aminés consécutifs d’une protéine pb10 ; ledit fragment d’une protéine de décoration pb10 comprenant de manière particulièrement préférée au moins 76 acides aminés consécutifs du domaine N-terminal d’une protéine pb10, de préférence encore au moins 77 acides aminés consécutifs du domaine N-terminal d’une protéine pb10, de préférence encore au moins 80 acides aminés consécutifs du domaine N-terminal d’une protéine pb10 ; ledit fragment d’une protéine de décoration pb10 comprenant en particulier au moins les acides aminés consécutifs inclus entre les positions 1 et 80, ou entre les acides aminés consécutifs inclus entre les positions 1 et 77, ou entre les acides aminés consécutifs inclus entre les positions 2 et 77, d’une protéine pb10 ; et
- au moins un fragment fonctionnel d’un antigène, ou au moins un fragment fonctionnel d’une toxine, ou au moins un fragment de récepteur, ou au moins un fragment fonctionnel d’un signal d’adressage ou de ciblage ou de transport, ou au moins un fragment fonctionnel d’une enzyme, ou au moins un fragment fonctionnel d’une hormone, ou au moins un fragment fonctionnel d’un anticorps, ou au moins un antigène, ou au moins une toxine, ou au moins un récepteur, ou au moins un signal d’adressage ou de ciblage ou de transport, ou au moins une enzyme, ou au moins une hormone, ou au moins un anticorps, ou une combinaison quelconque de ceux-ci, de préférence au moins un fragment fonctionnel d’antigène, de préférence encore au moins un antigène.
La capside selon l’invention est donc une capside vide fonctionnalisée.
Selon un mode de réalisation avantageux, la capside est caractérisée en ce que le fragment de la protéine de décoration pb10 est choisi parmi : i) un fragment de peptide ou de protéine ayant au moins 80% d’identité avec une portion du domaine N-terminal d’une protéine pb10, de préférence au moins 81% d’identité, de préférence au moins 82% d’identité, de préférence au moins 83% d’identité, de préférence au moins 84% d’identité, de préférence au moins 85% d’identité, de préférence au moins 86% d’identité, de préférence au moins 87% d’identité, de préférence au moins 88% d’identité, de préférence au moins 89% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 91% d’identité, de préférence au moins 92% d’identité, de préférence au moins 93% d’identité, de préférence au moins 94% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité, de préférence au moins 96% d’identité, de préférence au moins 97% d’identité, de préférence au moins 98% d’identité, de préférence au moins 99% d’identité, de préférence 100% d’identité ; ladite portion comprenant (ou étant constitué essentiellement par, ou étant constitué par) de préférence au moins 76 acides aminés consécutifs du domaine N-terminal d’une protéine pb10, de préférence au moins 77 acides aminés consécutifs du domaine N-terminal d’une protéine pb10, de préférence encore au moins 80 acides aminés consécutifs du domaine N-terminal d’une protéine pb10 ; ii) un fragment de peptide ou de protéine ayant au moins 80% d’identité avec le domaine N- terminal d’une protéine pb10, de préférence au moins 81% d’identité, de préférence au moins 82% d’identité, de préférence au moins 83% d’identité, de préférence au moins 84% d’identité, de préférence au moins 85% d’identité, de préférence au moins 86% d’identité, de préférence au moins 87% d’identité, de préférence au moins 88% d’identité, de préférence au moins 89% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 91% d’identité, de préférence au moins 92% d’identité, de préférence au moins 93% d’identité, de préférence au moins 94% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité, de préférence au moins 96% d’identité, de préférence au moins 97% d’identité, de préférence au moins 98% d’identité, de préférence au moins 99% d’identité, de préférence 100% d’identité ; ledit domaine N-terminal d’une protéine pb10 comprenant (ou étant constitué essentiellement par, ou étant constitué par) de préférence les acides aminés consécutifs inclus entre les positions 1 et 80, ou entre les acides aminés consécutifs inclus entre les positions 1 et 77, ou entre les acides aminés consécutifs inclus entre les positions 2 et 77, d’une protéine pb10 ; iii) un fragment ou un peptide d’une protéine comprenant une séquence d’acides aminés ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO :1 , de préférence au moins 81% d’identité, de préférence au moins 82% d’identité, de préférence au moins 83% d’identité, de préférence au moins 84% d’identité, de préférence au moins 85% d’identité, de préférence au moins 86% d’identité, de préférence au moins 87% d’identité, de préférence au moins 88% d’identité, de préférence au moins 89% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 91% d’identité, de préférence au moins 92% d’identité, de préférence au moins 93% d’identité, de préférence au moins 94% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité, de préférence au moins 96% d’identité, de préférence au moins 97% d’identité, de préférence au moins 98% d’identité, de préférence au moins 99% d’identité, de préférence 100% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 1 ; ledit fragment ou peptide comprenant de préférence au moins les 80 premiers acides aminés consécutifs de ladite protéine ; iv) un fragment ou un peptide d’une protéine consistant (ou consistant essentiellement) en une séquence d’acides aminés ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 1 , de préférence au moins 81% d’identité, de préférence au moins 82% d’identité, de préférence au moins 83% d’identité, de préférence au moins 84% d’identité, de préférence au moins 85% d’identité, de préférence au moins 86% d’identité, de préférence au moins 87% d’identité, de préférence au moins 88% d’identité, de préférence au moins 89% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 91% d’identité, de préférence au moins 92% d’identité, de préférence au moins 93% d’identité, de préférence au moins 94% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité, de préférence au moins 96% d’identité, de préférence au moins 97% d’identité, de préférence au moins 98% d’identité, de préférence au moins 99% d’identité, de préférence 100% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 1 ; ledit fragment ou peptide comprenant de préférence au moins les 80 premiers acides aminés consécutifs de ladite protéine; v) un peptide comprenant une séquence d’acides aminés ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 3, de préférence au moins 81% d’identité, de préférence au moins 82% d’identité, de préférence au moins 83% d’identité, de préférence au moins 84% d’identité, de préférence au moins 85% d’identité, de préférence au moins 86% d’identité, de préférence au moins 87% d’identité, de préférence au moins 88% d’identité, de préférence au moins 89% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 91% d’identité, de préférence au moins 92% d’identité, de préférence au moins 93% d’identité, de préférence au moins 94% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité, de préférence au moins 96% d’identité, de préférence au moins 97% d’identité, de préférence au moins 98% d’identité, de préférence au moins 99% d’identité, de préférence 100% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 3 ; vi) un peptide consistant (ou consistant essentiellement) en une séquence d’acides aminés ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 3, de préférence au moins 81% d’identité, de préférence au moins 82% d’identité, de préférence au moins 83% d’identité, de préférence au moins 84% d’identité, de préférence au moins 85% d’identité, de préférence au moins 86% d’identité, de préférence au moins 87% d’identité, de préférence au moins 88% d’identité, de préférence au moins 89% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 91% d’identité, de préférence au moins 92% d’identité, de préférence au moins 93% d’identité, de préférence au moins 94% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité, de préférence au moins 96% d’identité, de préférence au moins 97% d’identité, de préférence au moins 98% d’identité, de préférence au moins 99% d’identité, de préférence 100% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 3 ; et vii) un fragment ou un peptide d’une protéine comprenant (ou consistant essentiellement en, ou consistant en) une séquence d’acides aminés ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 16, de préférence au moins 81% d’identité, de préférence au moins 82% d’identité, de préférence au moins 83% d’identité, de préférence au moins 84% d’identité, de préférence au moins 85% d’identité, de préférence au moins 86% d’identité, de préférence au moins 87% d’identité, de préférence au moins 88% d’identité, de préférence au moins 89% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 91% d’identité, de préférence au moins 92% d’identité, de préférence au moins 93% d’identité, de préférence au moins 94% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité, de préférence au moins 96% d’identité, de préférence au moins 97% d’identité, de préférence au moins 98% d’identité, de préférence au moins 99% d’identité, de préférence 100% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 16 ; ledit fragment ou peptide comprenant de préférence au moins les 77 premiers acides aminés consécutifs de ladite protéine, de préférence encore les acides aminés consécutifs inclus entre les positions 2 et 76.
Ainsi, le fragment de la protéine de décoration pb10 peut être choisi parmi un fragment qui comprend (ou consiste essentiellement en ou consiste en) le domaine N-terminal d’une protéine pb10, et une protéine pb10 entière (pouvant être native ou modifiée, en particulier modifiée par des impératifs de clonage).
Selon un mode de réalisation particulier, le fragment de la protéine de décoration pb10 est choisi parmi une protéine comprenant (ou consistant essentiellement en ou consistant en) une séquence d’acides aminés ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 1 ou avec la séquence SEQ ID NO : 16, de préférence au moins 81% d’identité, de préférence au moins 82% d’identité, de préférence au moins 83% d’identité, de préférence au moins 84% d’identité, de préférence au moins 85% d’identité, de préférence au moins 86% d’identité, de préférence au moins 87% d’identité, de préférence au moins 88% d’identité, de préférence au moins 89% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 91% d’identité, de préférence au moins 92% d’identité, de préférence au moins 93% d’identité, de préférence au moins 94% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité, de préférence au moins 96% d’identité, de préférence au moins 97% d’identité, de préférence au moins 98% d’identité, de préférence au moins 99% d’identité, de préférence 100% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 1 ou avec la séquence SEQ ID NO : 16. Dans ce mode de réalisation, le fragment de la protéine de décoration pb10 est de préférence une protéine pb10 entière.
Selon un mode de réalisation préféré, le fragment de la protéine de décoration pb10 est choisi parmi les fragments de peptide ou de protéine et les peptides tels que définis aux points iii), iv), v), vi) et vii) du paragraphe ci-dessus, et de manière davantage préférée, le fragment de la protéine de décoration pb10 est choisi parmi les fragments de peptide ou de protéine et les peptides tels que définis aux points iii) et v) du paragraphe ci-dessus.
Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, la capside est caractérisée en ce que le fragment de la protéine de décoration pb10 est choisi parmi les fragments de peptide ou de protéine et les peptides tels que définis aux points i), ii), v) et vi) du paragraphe ci-dessus, et de manière davantage préférée, le fragment de la protéine de décoration pb10 est choisi parmi les fragments de peptide ou de protéine et les peptides tels que définis aux points v) et vi) du paragraphe ci-dessus. En effet, les Inventeurs ont montré que la fonctionnalisation (l’exposition de la protéine de fusion à la surface de la capside) est particulièrement efficace lorsque le fragment de la protéine pb10 comprend le domaine N-terminal de la protéine pb10 ou consiste en ce domaine N-terminal.
Selon un mode de réalisation préféré, le fragment fonctionnel d’un antigène, le fragment fonctionnel d’une toxine, le fragment de récepteur, le fragment fonctionnel d’un signal d’adressage ou de ciblage ou de transport, le fragment fonctionnel d’une enzyme, le fragment fonctionnel d’une hormone, le fragment fonctionnel d’un anticorps, l’antigène, la toxine, le récepteur, le signal d’adressage ou de ciblage ou de transport, l’enzyme, l’hormone, l’anticorps, ou la combinaison quelconque de ceux-ci, est un peptide, un polypeptide ou une protéine comprenant au moins 10 acides aminés consécutifs, de préférence encore au moins 12 acides aminés consécutifs, de préférence encore au moins 15 acides aminés consécutifs, de préférence encore au moins 20 acides aminés consécutifs, de préférence encore au moins 30 acides aminés consécutifs.
De manière préférée, le fragment fonctionnel d’un antigène, le fragment fonctionnel d’une toxine, le fragment de récepteur, le fragment fonctionnel d’un signal d’adressage ou de ciblage ou de transport, le fragment fonctionnel d’une enzyme, le fragment fonctionnel d’une hormone, le fragment fonctionnel d’un anticorps, l’antigène, la toxine, le récepteur, le signal d’adressage ou de ciblage ou de transport, l’enzyme, l’hormone, l’anticorps, ou la combinaison quelconque de ceux-ci, présente une structure tridimensionnelle.
Selon un mode de réalisation particulier, le fragment fonctionnel d’un antigène, le fragment fonctionnel d’une toxine, le fragment de récepteur, le fragment fonctionnel d’un signal d’adressage ou de ciblage ou de transport, le fragment fonctionnel d’une enzyme, le fragment fonctionnel d’une hormone, le fragment fonctionnel d’un anticorps, l’antigène, la toxine, le récepteur, le signal d’adressage ou de ciblage ou de transport, l’enzyme, l’hormone, l’anticorps, ou la combinaison quelconque de ceux-ci, n’est pas une étiquette servant usuellement à la purification par affinité d’une molécule, de préférence encore ce n’est pas une étiquette histidine (constituée d’une chaîne de 6 à 10 acides aminés d’histidine). Avantageusement, l’antigène est choisi parmi les antigènes comprenant (ou consistant essentiellement en, ou consistant en) au moins : un peptide, une protéine, une glycoprotéine, un sucre, un oside, un lipide, un acide nucléique, ou une combinaison quelconque de ceux-ci. L’antigène est de préférence un antigène de microorganisme, de plante, d’algue, de microalgue, de bactérie, de virus, de parasite, de levure, de champignon, d’insecte, d’animal, ou de tumeur ; de préférence un antigène d’un pathogène eucaryote ou procaryote, ou d’un cancer ; de préférence un antigène protéique, un lipide ou un sucre de bactérie, de virus, de parasite, de levure, de champignon ou de tumeur.
Avantageusement, la toxine est choisie parmi les toxines comprenant (ou consistant essentiellement en, ou consistant en) au moins : une molécule chimique, un peptide, une protéine, une glycoprotéine, un sucre, un oside, un lipide, un acide nucléique, ou une combinaison quelconque de ceux-ci. La toxine est de préférence une toxine de microorganisme, de plante, d’algue, de microalgue, de bactérie, de virus, de parasite, de levure, de champignon, d’insecte, d’animal, ou de tumeur ; de préférence une toxine d’un pathogène eucaryote ou procaryote, ou d’un cancer.
Avantageusement, le récepteur est choisi parmi les récepteurs comprenant (ou consistant essentiellement en, ou consistant en) au moins : un peptide, une protéine, une glycoprotéine, un sucre, un oside, un lipide, un acide nucléique, ou une combinaison quelconque de ceux-ci. Le récepteur est de préférence un récepteur de microorganisme, de plante, d’algue, de microalgue, de bactérie, de virus, de parasite, de levure, de champignon, d’insecte, d’animal, ou de tumeur ; de préférence un récepteur d’un pathogène eucaryote ou procaryote, ou d’un cancer ; de préférence un récepteur protéique ou glycoprotéique de bactérie, de virus, de parasite, de levure, de champignon ou de tumeur.
Avantageusement, le signal d’adressage ou de ciblage ou de transport est choisi parmi les signaux d’adressage ou de ciblage ou de transport comprenant (ou consistant essentiellement en, ou consistant en) au moins : un peptide, une protéine, une glycoprotéine, un sucre, un oside, un lipide, un acide nucléique, ou une combinaison quelconque de ceux-ci. De préférence le signal d’adressage ou de ciblage ou de transport comprend (ou consiste essentiellement en, ou consiste en) au moins un peptide, une protéine, une glycoprotéine, ou un acide nucléique. Le signal est de préférence un signal procaryote, eucaryote ou viral, de préférence un signal d’un animal, d’un végétal, d’une algue, d’une microalgue, d’un microorganisme, d’une bactérie, d’un parasite, d’une levure, d’un champignon, d’un insecte, d’un virus, ou d’un cancer ; de préférence encore un signal de mammifère, tel qu’un signal humain.
Avantageusement, le signal d’adressage ou de ciblage ou de transport est choisi parmi un signal d’adressage ou de ciblage ou de transport au/vers le noyau ; un signal d’adressage ou de ciblage ou de transport au/vers le cytoplasme ; un signal d’adressage ou de ciblage ou de transport au/vers le cytosol ; un signal d’adressage ou de ciblage ou de transport à/vers la membrane cellulaire ; un signal d’adressage ou de ciblage ou de transport aux/vers les mitochondries ; un signal d’adressage ou de ciblage ou de transport aux/vers les péroxysomes; un signal d’adressage ou de ciblage ou de transport aux/vers les lysosomes ; un signal d’adressage ou de ciblage ou de transport au/vers le réticulum endoplasmique ; un signal d’adressage ou de ciblage ou de transport des voies de sécrétion ; et un ligand d’un récepteur, de préférence un récepteur membranaire ou transmembranaire, de préférence un récepteur membranaire ou transmembranaire d’une membrane choisie parmi une membrane cellulaire, une membrane extracellulaire, une membrane cytoplasmique et une membrane nucléaire. Avantageusement, le fragment fonctionnel d’une enzyme comprend au moins, ou est essentiellement constitué d’au moins, ou est constitué d’au moins, un domaine catalytique d’une enzyme, de préférence un site actif d’une enzyme. L’enzyme est de préférence une enzyme procaryote, eucaryote ou virale, de préférence une enzyme d’un animal, d’un végétal, d’une algue, d’une microalgue, d’un insecte, d’un microorganisme, d’une bactérie, d’un parasite, d’une levure, d’un champignon ou d’un virus, de préférence encore une enzyme de mammifère, telle qu’une enzyme humaine.
Avantageusement, l’enzyme est choisie parmi les enzymes de conversion de prodrogue, les enzymes agissant sur les acides nucléiques, les enzymes du métabolisme, les enzymes du système immunitaire et les enzymes de la digestion.
Avantageusement, l’hormone est choisie parmi les hormones peptidiques ou protéiques, les hormones dérivées d’amines, les hormones stéroïdes ou les hormones lipidiques. L’hormone est de préférence une hormone d’un animal ou d’un végétal, de préférence une hormone de mammifère, de préférence une hormone humaine.
Avantageusement, le fragment fonctionnel d’un anticorps est choisi parmi un fragment Fc d’un anticorps, un fragment Fv d’un anticorps, un fragment Fab d’un anticorps, et un fragment F(ab’) d’un anticorps. L’anticorps est de préférence un anticorps d’un animal, de préférence un anticorps de mammifère, de préférence un anticorps humain ou humanisé.
Le fragment de peptide ou de protéine ayant au moins 80% d’identité avec un fragment d’une protéine de décoration pb10, et/ou la protéine de fusion peut (peuvent être obtenu(s) par les méthodes classiques de production/obtention de fragment de peptide ou de protéine et/ou de protéine de fusion. Ces méthodes comprennent par exemple les méthodes d’expression à l’aide d’un système d’expression (par exemple par un vecteur), inséré dans une cellule d’expression, par exemple par clonage suivie d’une purification. L’homme du métier saura définir les étapes appropriées pour mettre en œuvre ces méthodes. La protéine de fusion est avantageusement produite par tout système d’expression approprié, dont l’homme du métier saura définir les propriétés. La protéine de fusion peut notamment être produite à partir d’un végétal ou d’une cellule végétale, d’un animal (non humain) ou d’une cellule animale (à l’exclusion des cellules souches embryonnaires humaines), d’un insecte ou d’une cellule d’insecte, d’une algue ou microalgue ou d’une cellule d’algue ou de microalgue, d’un champignon ou d’une cellule de champignon, d’une levure, d’un parasite ou d’une cellule de parasite, d’un microorganisme ou d’une cellule de microorganisme, ou d’une bactérie. La protéine de fusion est de préférence produite par un organisme eucaryote ou une cellule d’eucaryote. Lorsque le fragment fonctionnel d’un antigène, d’une toxine, d’un récepteur, d’un signal d’adressage ou de ciblage ou de transport, d’une enzyme, d’une hormone, d’un anticorps, ou l’antigène, la toxine, le récepteur, le signal d’adressage ou de ciblage ou de transport, l’enzyme, l’hormone, l’anticorps, ou la combinaison quelconque de ceux-ci, comprend, consiste essentiellement en ou consiste en une substance ou une molécule non protéique (ne comprenant pas de fragment ou de portion de protéine ou de peptide), ladite substance ou molécule non protéique peut être fusionnée au fragment de peptide ou de protéine ayant au moins 80% d’identité avec un fragment d’une protéine de décoration pb10 en utilisant les méthodes connues de l’homme du métier, qui saura choisir la méthode la plus appropriée. Ces méthodes comprennent par exemple les méthodes de fusion par réaction avec une amine (fusion par liaisons covalentes ; tel que décrit notamment dans l’article Robertson et al. 2011 (DOI : dx.doi.org/10.1021/bc100365j ) et les méthodes de fusions par réaction avec une streptavidine (fusion par liaisons non covalentes ; tel que décrit notamment dans l’article Edgar et al. 2009 (DOI: 10.1073/pnas.0601211103).
Selon un mode de réalisation, la capside comprend en outre :
(i) au moins une copie d’une protéine ayant au moins 80% d’identité avec une protéine de capside pb8, de préférence au moins 81% d’identité, de préférence au moins 82% d’identité, de préférence au moins 83% d’identité, de préférence au moins 84% d’identité, de préférence au moins 85% d’identité, de préférence au moins 86% d’identité, de préférence au moins 87% d’identité, de préférence au moins 88% d’identité, de préférence au moins 89% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 91% d’identité, de préférence au moins 92% d’identité, de préférence au moins 93% d’identité, de préférence au moins 94% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité, de préférence au moins 96% d’identité, de préférence au moins 97% d’identité, de préférence au moins 98% d’identité, de préférence au moins 99% d’identité, de préférence 100% d’identité avec une protéine de capside pb8 (par exemple ayant pour séquence SEQ ID NO : 8) ; ou
(ii) au moins une copie d’une protéine ayant au moins 80% d’identité avec une protéine portale pb7, de préférence au moins 81% d’identité, de préférence au moins 82% d’identité, de préférence au moins 83% d’identité, de préférence au moins 84% d’identité, de préférence au moins 85% d’identité, de préférence au moins 86% d’identité, de préférence au moins 87% d’identité, de préférence au moins 88% d’identité, de préférence au moins 89% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 91% d’identité, de préférence au moins 92% d’identité, de préférence au moins 93% d’identité, de préférence au moins 94% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité, de préférence au moins 96% d’identité, de préférence au moins 97% d’identité, de préférence au moins 98% d’identité, de préférence au moins 99% d’identité, de préférence 100% d’identité avec une protéine portale pb7 (par exemple ayant pour séquence SEQ ID NO : 7); ou
(iii) au moins une copie d’une protéine ayant au moins 80% d’identité avec une protéase pb11 , de préférence au moins 81% d’identité, de préférence au moins 82% d’identité, de préférence au moins 83% d’identité, de préférence au moins 84% d’identité, de préférence au moins 85% d’identité, de préférence au moins 86% d’identité, de préférence au moins 87% d’identité, de préférence au moins 88% d’identité, de préférence au moins 89% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 91% d’identité, de préférence au moins 92% d’identité, de préférence au moins 93% d’identité, de préférence au moins 94% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité, de préférence au moins 96% d’identité, de préférence au moins 97% d’identité, de préférence au moins 98% d’identité, de préférence au moins 99% d’identité, de préférence 100% d’identité avec une protéase pb11 (par exemple ayant pour séquence SEQ ID NO : 9) ; ou (iv) une combinaison quelconque de (i) à (iii).
Avantageusement, la protéine de capside pb8 comprend, ou consiste essentiellement en, ou consiste en une séquence d’acides aminés ayant la séquence SEQ ID NO : 8.
Avantageusement, la protéine portale pb7 comprend, ou consiste essentiellement en, ou consiste en une séquence d’acides aminés ayant la séquence SEQ ID NO : 7.
Avantageusement, la protéase pb11 comprend, ou consiste essentiellement en, ou consiste en une séquence d’acides aminés ayant la séquence SEQ ID NO : 9.
Avantageusement, la protéine de décoration pb10, la protéine de capside pb8, la protéine portale pb7 et/ou la protéase pb11 sont des protéines du phage T5.
L’activité et/ou l’expression de pb7, pb8, pb10, pb11 et une combinaison quelconque de celles-ci peut être inductible (par exemple en plaçant le gène codant la ou les protéines correspondante(s) sous le contrôle d’un promoteur inductible). Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux l’activité et/ou l’expression de la protéase est inductible (par exemple en plaçant le gène codant la protéase sous le contrôle d’un promoteur inductible).
Avantageusement, la capside est sous forme mature expansée.
La capside est de préférence isolée et/ou purifiée. La capside est de préférence recombinante. Méthode de production de la capside
Les Inventeurs ont également mis au point des méthodes particulièrement efficaces de production des capsides selon l’invention.
Ainsi, l’invention se rapporte également à une méthode de production d’une capside, comprenant les étapes suivantes : a) production d’une capside de phage T5 dépourvue d’ADN génomique et dépourvue de protéine pb10 ; b) mise en contact de la capside de l’étape a) avec une protéine de fusion telle que définie ci-dessus, afin d’obtenir une capside décorée ; et c) Optionnellement, purification de la capside décorée de l’étape b) à l’aide d’un détergent neutre, de préférence choisi parmi le n-Octyl-6-D-Glucopyranoside (6-OG) et le Dodecyldimethylaminoxid (LDAO).
L’absence de la protéine de décoration pb10 (ou pour un fragment de celle-ci) dans l’étape a) permet de garantir l’absence totale de décoration au cours de la production des capsides et avant l’addition des protéines de fusion. Cela offre l’avantage de permettre la fusion avec tout type de substance ou de molécule (même non protéique), à façon.
Avantageusement, la protéine de fusion est produite par les méthodes décrites ci-dessus.
Les Inventeurs ont en outre montré que, de manière tout à fait inattendue, l’utilisation des détergents n-Octyl-6-D-Glucopyranoside (6-OG) et/ou Dodecyldimethylaminoxid (LDAO) au cours des étapes de purification des capsides permet l’obtention de capsides pures. En particulier, l’utilisation de ces détergents permet d’éliminer la majorité des endotoxines contaminantes (issues notamment des bactéries d’expression ou de production) et de respecter (ne pas dépasser) les taux d’endotoxines tolérés pour des administrations chez un sujet animal, notamment humain.
Selon un mode de réalisation, la capside de l’étape a) est obtenue par une méthode comprenant les étapes suivantes :
1. Infection d’une bactérie, de préférence une bactérie de la famille des Enterobacteriaceae, de préférence encore une bactérie du genre Escherichia, de préférence encore une bactérie Escherichia coli, avec un phage T5 mutant, déficient pour le gène codant le moteur d’encapsidation de l’ADN de T5 -la terminase- et déficient pour le gène codant la protéine de décoration pb10 (de préférence dépourvu du gène codant la protéine de décoration pb10) ;
2. Lyse des bactéries de l’étape 1, Précipitation ou ultracentrifugation du lysat bactérien en résultant, et resuspension du culot dans un tampon salin.
3. Sédimentation de vitesse sur gradient de glycérol, incubation des fractions contenant les capsides en présence de 6-OG (de préférence 1%), puis purification par plusieurs étapes de chromatographie par échange d’ions en présence de LDAO (de préférence 0,1%) de préférence au cours de la première étape.
Selon un mode de réalisation, la capside décorée de l’étape b) est obtenue par une méthode comprenant les étapes suivantes :
1. mise en contact de la capside de l’étape a) avec une protéine de fusion telle que définie ci- dessus, pendant un temps déterminé (de préférence au moins 10 min, de préférence entre 10 et 60 min), à une température allant de 2 à 20° C (de préférence une température comprise entre 3 et 5°C)
2. les concentrations respectives des capsides (calculées selon le protocole décrit dans Vernhes et al. 2017) et de la protéine de décoration respectent de préférence le ratio molaire 120 X [capside]/ [pb10] = 1 +/- 0,1.
Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, la capside de l’étape a) est obtenue par une méthode comprenant les étapes suivantes : a-1 ) obtention d’un vecteur comprenant :
(i) au moins un gène codant pour une protéine ayant au moins 80% d’identité avec une protéine de capside pb8, de préférence au moins 81% d’identité, de préférence au moins 82% d’identité, de préférence au moins 83% d’identité, de préférence au moins 84% d’identité, de préférence au moins 85% d’identité, de préférence au moins 86% d’identité, de préférence au moins 87% d’identité, de préférence au moins 88% d’identité, de préférence au moins 89% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 91% d’identité, de préférence au moins 92% d’identité, de préférence au moins 93% d’identité, de préférence au moins 94% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité, de préférence au moins 96% d’identité, de préférence au moins 97% d’identité, de préférence au moins 98% d’identité, de préférence au moins 99% d’identité, de préférence 100% d’identité avec une protéine de capside pb8 ;
(ii) au moins un gène codant pour une protéine ayant au moins 80% d’identité avec une protéine portale pb7, de préférence au moins 81% d’identité, de préférence au moins 82% d’identité, de préférence au moins 83% d’identité, de préférence au moins 84% d’identité, de préférence au moins 85% d’identité, de préférence au moins 86% d’identité, de préférence au moins 87% d’identité, de préférence au moins 88% d’identité, de préférence au moins 89% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 91% d’identité, de préférence au moins 92% d’identité, de préférence au moins 93% d’identité, de préférence au moins 94% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité, de préférence au moins 96% d’identité, de préférence au moins 97% d’identité, de préférence au moins 98% d’identité, de préférence au moins 99% d’identité, de préférence 100% d’identité avec une protéine portale pb7;
(iii) au moins un gène codant pour une protéine ayant au moins 80% d’identité avec une protéase pb11 de préférence au moins 81% d’identité, de préférence au moins 82% d’identité, de préférence au moins 83% d’identité, de préférence au moins 84% d’identité, de préférence au moins 85% d’identité, de préférence au moins 86% d’identité, de préférence au moins 87% d’identité, de préférence au moins 88% d’identité, de préférence au moins 89% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 91% d’identité, de préférence au moins 92% d’identité, de préférence au moins 93% d’identité, de préférence au moins 94% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité, de préférence au moins 96% d’identité, de préférence au moins 97% d’identité, de préférence au moins 98% d’identité, de préférence au moins 99% d’identité, de préférence 100% d’identité avec une protéase pb11 ; et dans lequel les gènes (i) à (iii) sont placés sous le contrôle d’un promoteur inductible ; de préférence dans lequel les gènes (i) à (iii) sont organisés au sein d’un unique opéron ; de préférence dans lequel les gènes (i) à (iii) sont ordonnés conformément au génome du phage T5 ; et a-2) expression du vecteur de l’étape a-1 ) par une bactérie, de préférence une bactérie de la famille des Enterobacteriaceae, de préférence encore une bactérie du genre Escherichia, de préférence encore une bactérie Escherichia coli ; afin d’obtenir une capside de phage T5 dépourvue d’ADN génomique et dépourvue de protéine pb10 ; et a-3) Optionnellement, purification de la capside de l’étape a-2) à l’aide d’un détergent neutre, de préférence choisi parmi le n-Octyl-6-D-Glucopyranoside (6-OG) et le Dodecyldimethylaminoxid (LDAO). En effet, les Inventeurs ont montré, de manière tout à fait surprenante, qu’il est possible de produire ces capsides vides fonctionnalisées sans passer par la production d’un phage mutant. Ceci permet de s’affranchir de l’étape d’infection d’une culture bactérienne par un phage mutant, et donc d’éviter la production d’un stock important de phage, en amont de la production des capsides. Cette méthode offre également l’avantage d’éviter la réversion du phage vers le génotype sauvage, augmentant ainsi le rendement en capsides vides et la sécurité. Cette méthode de production et de décoration mise au point par les Inventeurs est donc totalement indépendante du bactériophage T5. Ce système est basé sur la construction de vecteurs (en particulier des plasmides recombinants) portant les gènes codant pour les protéines de capside du bactériophage T5. Grâce à ce système, il est possible de produire soit directement des capsides vides décorées et fonctionnelles (dans ce cas le vecteur inclut une séquence codant la protéine de décoration et/ou un fragment de celle-ci), soit des capsides vides non décorées, qui peuvent être décorées dans un second temps, par simple mise en contact avec la protéine de fusion d’intérêt. Les données montrent, de façon tout à fait inattendue, que l’expression de ces plasmides chez des bactéries conduit à l’assemblage de capsides dont la morphologie est similaire à celle des capsides produites par la méthode classique utilisant un phage complet (mutant ou non), et dont les propriétés de décoration sont comparables à celles des capsides produites à partir du phage complet. En effet, les données montrent que les propriétés d’autoassemblage des capsides à partir de l’expression ectopique des gènes de capsides, en dehors du cycle viral du phage T5, sont conservées. Ainsi, les Inventeurs ont développé une méthode de production simplifiée, à grande échelle, de capsides recombinantes, dépourvues d’ADN génomiques, pouvant être décorées de deux façons différentes : i) par addition in vitro de la protéine de décoration purifiée ; ii) par co-production in situ de la protéine de décoration.
L’absence du gène codant pour la protéine de décoration pb10 (ou pour un fragment de celle-ci) dans le vecteur utilisé permet de garantir l’absence totale de décoration au cours de la purification des capsides et avant l’addition des protéines chimères purifiées. Cela offre l’avantage de permettre la fusion avec tout type de substance ou de molécule (même non protéique), à façon.
Dans ce cas, l’opéron utilisé (inséré) dans le vecteur de l’étape a-1 ) comprend (ou consiste essentiellement en, ou consiste en) de préférence une séquence d’acide nucléique ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 11 , de préférence au moins 81% d’identité, de préférence au moins 82% d’identité, de préférence au moins 83% d’identité, de préférence au moins 84% d’identité, de préférence au moins 85% d’identité, de préférence au moins 86% d’identité, de préférence au moins 87% d’identité, de préférence au moins 88% d’identité, de préférence au moins 89% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 91% d’identité, de préférence au moins 92% d’identité, de préférence au moins 93% d’identité, de préférence au moins 94% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité, de préférence au moins 96% d’identité, de préférence au moins 97% d’identité, de préférence au moins 98% d’identité, de préférence au moins 99% d’identité, de préférence 100% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 11.
Avantageusement, la protéine de capside pb8 comprend, ou consiste essentiellement en, ou consiste en une séquence d’acides aminés ayant la séquence SEQ ID NO : 8. Avantageusement, la protéine portale pb7 comprend, ou consiste essentiellement en, ou consiste en une séquence d’acides aminés ayant la séquence SEQ ID NO : 7.
Avantageusement, la protéase pb11 comprend, ou consiste essentiellement en, ou consiste en une séquence d’acides aminés ayant la séquence SEQ ID NO : 9.
Avantageusement, la protéine de décoration pb10, la protéine de capside pb8, la protéine portale pb7 et/ou la protéase pb11 sont des protéines du phage T5.
L’activité et/ou l’expression de pb7, pb8, pb10, pb11 et une combinaison quelconque de celles-ci peut être inductible (par exemple en plaçant le gène codant la ou les protéines correspondante(s) sous le contrôle d’un promoteur inductible). Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux l’activité et/ou l’expression de la protéase est inductible (par exemple en plaçant le gène codant la protéase sous le contrôle d’un promoteur inductible).
Les Inventeurs ont également montré qu’il est possible de produire directement la capside vide décorée, en utilisant un vecteur codant pour les protéines de la capside et la protéine pb10. Les rendements et l’efficacité sont particulièrement élevés en utilisant cette méthode.
L’invention concerne donc une méthode de production d’une capside comprenant les étapes suivantes : a) obtention d’un vecteur comprenant :
(i) au moins un gène codant pour une protéine ayant au moins 80% d’identité avec une protéine de capside pb8, de préférence au moins 81% d’identité, de préférence au moins 82% d’identité, de préférence au moins 83% d’identité, de préférence au moins 84% d’identité, de préférence au moins 85% d’identité, de préférence au moins 86% d’identité, de préférence au moins 87% d’identité, de préférence au moins 88% d’identité, de préférence au moins 89% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 91% d’identité, de préférence au moins 92% d’identité, de préférence au moins 93% d’identité, de préférence au moins 94% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité, de préférence au moins 96% d’identité, de préférence au moins 97% d’identité, de préférence au moins 98% d’identité, de préférence au moins 99% d’identité, de préférence 100% d’identité avec une protéine de capside pb8 ;
(ii) au moins un gène codant pour une protéine ayant au moins 80% d’identité avec une protéine portale pb7, de préférence au moins 81% d’identité, de préférence au moins 82% d’identité, de préférence au moins 83% d’identité, de préférence au moins 84% d’identité, de préférence au moins 85% d’identité, de préférence au moins 86% d’identité, de préférence au moins 87% d’identité, de préférence au moins 88% d’identité, de préférence au moins 89% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 91% d’identité, de préférence au moins 92% d’identité, de préférence au moins 93% d’identité, de préférence au moins 94% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité, de préférence au moins 96% d’identité, de préférence au moins 97% d’identité, de préférence au moins 98% d’identité, de préférence au moins 99% d’identité, de préférence 100% d’identité avec une protéine portale pb7;
(iii) au moins un gène codant pour une protéine ayant au moins 80% d’identité avec une protéase pb11 de préférence au moins 81% d’identité, de préférence au moins 82% d’identité, de préférence au moins 83% d’identité, de préférence au moins 84% d’identité, de préférence au moins 85% d’identité, de préférence au moins 86% d’identité, de préférence au moins 87% d’identité, de préférence au moins 88% d’identité, de préférence au moins 89% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 91% d’identité, de préférence au moins 92% d’identité, de préférence au moins 93% d’identité, de préférence au moins 94% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité, de préférence au moins 96% d’identité, de préférence au moins 97% d’identité, de préférence au moins 98% d’identité, de préférence au moins 99% d’identité, de préférence 100% d’identité avec une protéase pb11 ; et
(iv) au moins un gène codant une protéine de fusion telle que définie ci-dessus; dans lequel les gènes (i) à (iv) sont placés sous le contrôle d’un promoteur inductible ; de préférence dans lequel les gènes (i) à (iv) sont organisés au sein d’un unique opéron ; de préférence dans lequel les gènes (i) à (iii) sont ordonnés conformément au génome du phage T5, et le gène (iv) codant la protéine de fusion occupe le locus du gène codant la protéine pb10 dans ledit génome ; b) expression du vecteur de l’étape a) par une bactérie, de préférence une bactérie de la famille des Enterobacteriaceae, de préférence encore une bactérie du genre Escherichia, de préférence encore une bactérie Escherichia coli ; afin d’obtenir une capside de phage T5 dépourvue d’ADN génomique et exposant, à sa surface, au moins une copie de la protéine de fusion ; et c) Optionnellement, purification de la capside décorée de l’étape b) à l’aide d’un détergent neutre, de préférence choisi parmi le n-Octyl-6-D-Glucopyranoside (6-OG) et le Dodecyldimethylaminoxid (LDAO).
Selon un mode de réalisation, l’opéron utilisé (inséré) dans le vecteur de l’étape a) comprend (ou consiste essentiellement en, ou consiste en) une séquence d’acide nucléique ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 10, de préférence au moins 81% d’identité, de préférence au moins 82% d’identité, de préférence au moins 83% d’identité, de préférence au moins 84% d’identité, de préférence au moins 85% d’identité, de préférence au moins 86% d’identité, de préférence au moins 87% d’identité, de préférence au moins 88% d’identité, de préférence au moins 89% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 91% d’identité, de préférence au moins 92% d’identité, de préférence au moins 93% d’identité, de préférence au moins 94% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité, de préférence au moins 96% d’identité, de préférence au moins 97% d’identité, de préférence au moins 98% d’identité, de préférence au moins 99% d’identité, de préférence 100% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 10. Avantageusement, la protéine de capside pb8 comprend, ou consiste essentiellement en, ou consiste en une séquence d’acides aminés ayant la séquence SEQ ID NO : 8.
Avantageusement, la protéine portale pb7 comprend, ou consiste essentiellement en, ou consiste en une séquence d’acides aminés ayant la séquence SEQ ID NO : 7.
Avantageusement, la protéase pb11 comprend, ou consiste essentiellement en, ou consiste en une séquence d’acides aminés ayant la séquence SEQ ID NO : 9.
Avantageusement, la protéine de décoration pb10, la protéine de capside pb8, la protéine portale pb7 et/ou la protéase pb11 sont des protéines du phage T5.
La présente invention concerne en outre la capside susceptible d’être obtenue par une méthode de production décrite ci-dessus, ainsi qu’une capside obtenue par une méthode de production décrite ci-dessus, ainsi qu’une capside directement obtenue par une méthode de production décrite ci- dessus.
Protéine de fusion - Acide nucléique- Vecteur - Cellule hôte - Nanoparticule
Les Inventeurs ont montré qu’il est possible de produire ces capsides vides fonctionnalisées de manière totalement indépendante du bactériophage T5, évitant ainsi la réversion du phage vers le génotype sauvage, augmentant le rendement en capsides vides et la sécurité. Cette méthode de production et de décoration est basée sur la construction de vecteurs inédits (en particulier des plasmides recombinants) portant les gènes codant pour les protéines de capside du bactériophage T5. L’invention se rapporte donc à un vecteur comprenant :
(i) au moins un gène codant pour une protéine ayant au moins 80% d’identité avec une protéine de capside pb8, de préférence au moins 81% d’identité, de préférence au moins 82% d’identité, de préférence au moins 83% d’identité, de préférence au moins 84% d’identité, de préférence au moins 85% d’identité, de préférence au moins 86% d’identité, de préférence au moins 87% d’identité, de préférence au moins 88% d’identité, de préférence au moins 89% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 91% d’identité, de préférence au moins 92% d’identité, de préférence au moins 93% d’identité, de préférence au moins 94% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité, de préférence au moins 96% d’identité, de préférence au moins 97% d’identité, de préférence au moins 98% d’identité, de préférence au moins 99% d’identité, de préférence 100% d’identité avec une protéine de capside pb8 ;
(ii) au moins un gène codant pour une protéine ayant au moins 80% d’identité avec une protéine portale pb7, de préférence au moins 81% d’identité, de préférence au moins 82% d’identité, de préférence au moins 83% d’identité, de préférence au moins 84% d’identité, de préférence au moins 85% d’identité, de préférence au moins 86% d’identité, de préférence au moins 87% d’identité, de préférence au moins 88% d’identité, de préférence au moins 89% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 91% d’identité, de préférence au moins 92% d’identité, de préférence au moins 93% d’identité, de préférence au moins 94% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité, de préférence au moins 96% d’identité, de préférence au moins 97% d’identité, de préférence au moins 98% d’identité, de préférence au moins 99% d’identité, de préférence 100% d’identité avec une protéine portale pb7;
(iii) au moins un gène codant pour une protéine ayant au moins 80% d’identité avec une protéase pb11 de préférence au moins 81% d’identité, de préférence au moins 82% d’identité, de préférence au moins 83% d’identité, de préférence au moins 84% d’identité, de préférence au moins 85% d’identité, de préférence au moins 86% d’identité, de préférence au moins 87% d’identité, de préférence au moins 88% d’identité, de préférence au moins 89% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 91% d’identité, de préférence au moins 92% d’identité, de préférence au moins 93% d’identité, de préférence au moins 94% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité, de préférence au moins 96% d’identité, de préférence au moins 97% d’identité, de préférence au moins 98% d’identité, de préférence au moins 99% d’identité, de préférence 100% d’identité avec une protéase pb11 ; et dans lequel les gènes (i) à (iii) sont placés sous le contrôle d’un promoteur inductible ; de préférence dans lequel les gènes (i) à (iii) sont organisés au sein d’un unique opéron ; de préférence dans lequel les gènes (i) à (iii) sont ordonnés conformément au génome du phage T5. L’invention se rapporte également à un vecteur comprenant :
(i) au moins un gène codant pour une protéine ayant au moins 80% d’identité avec une protéine de capside pb8, de préférence au moins 81% d’identité, de préférence au moins 82% d’identité, de préférence au moins 83% d’identité, de préférence au moins 84% d’identité, de préférence au moins 85% d’identité, de préférence au moins 86% d’identité, de préférence au moins 87% d’identité, de préférence au moins 88% d’identité, de préférence au moins 89% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 91% d’identité, de préférence au moins 92% d’identité, de préférence au moins 93% d’identité, de préférence au moins 94% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité, de préférence au moins 96% d’identité, de préférence au moins 97% d’identité, de préférence au moins 98% d’identité, de préférence au moins 99% d’identité, de préférence 100% d’identité avec une protéine de capside pb8 ;
(ii) au moins un gène codant pour une protéine ayant au moins 80% d’identité avec une protéine portale pb7, de préférence au moins 81% d’identité, de préférence au moins 82% d’identité, de préférence au moins 83% d’identité, de préférence au moins 84% d’identité, de préférence au moins 85% d’identité, de préférence au moins 86% d’identité, de préférence au moins 87% d’identité, de préférence au moins 88% d’identité, de préférence au moins 89% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 91% d’identité, de préférence au moins 92% d’identité, de préférence au moins 93% d’identité, de préférence au moins 94% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité, de préférence au moins 96% d’identité, de préférence au moins 97% d’identité, de préférence au moins 98% d’identité, de préférence au moins 99% d’identité, de préférence 100% d’identité avec une protéine portale pb7;
(iii) au moins un gène codant pour une protéine ayant au moins 80% d’identité avec une protéase pb11 de préférence au moins 81% d’identité, de préférence au moins 82% d’identité, de préférence au moins 83% d’identité, de préférence au moins 84% d’identité, de préférence au moins 85% d’identité, de préférence au moins 86% d’identité, de préférence au moins 87% d’identité, de préférence au moins 88% d’identité, de préférence au moins 89% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 91% d’identité, de préférence au moins 92% d’identité, de préférence au moins 93% d’identité, de préférence au moins 94% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité, de préférence au moins 96% d’identité, de préférence au moins 97% d’identité, de préférence au moins 98% d’identité, de préférence au moins 99% d’identité, de préférence 100% d’identité avec une protéase pb11 ; et
(iv) au moins un gène codant une protéine de fusion telle que définie ci-dessus; dans lequel les gènes (i) à (iv) sont placés sous le contrôle d’un promoteur inductible ; de préférence dans lequel les gènes (i) à (iv) sont organisés au sein d’un unique opéron ; de préférence dans lequel les gènes (i) à (iii) sont ordonnés conformément au génome du phage T5, et le gène (iv) codant la protéine de fusion occupe le locus du gène codant la protéine pb10 dans ledit génome ;
Avantageusement, la protéine de capside pb8 comprend, ou consiste essentiellement en, ou consiste en une séquence d’acides aminés ayant la séquence SEQ ID NO : 8.
Avantageusement, la protéine portale pb7 comprend, ou consiste essentiellement en, ou consiste en une séquence d’acides aminés ayant la séquence SEQ ID NO : 7.
Avantageusement, la protéase pb11 comprend, ou consiste essentiellement en, ou consiste en une séquence d’acides aminés ayant la séquence SEQ ID NO : 9.
Avantageusement, la protéine de capside pb8, la protéine portale pb7 et/ou la protéase pb11 sont des protéines du phage T5 et la protéine de fusion comprend au moins un fragment de la protéine pb10 du phage T5 (de préférence au moins le domaine N-terminal de la protéine de décoration pb10 du phage T5 tel que défini ci-dessus)....
Le promoteur est de préférence un promoteur T7 ; de préférence le vecteur est un vecteur d’expression, de préférence un vecteur d’expression bactérien, de préférence un plasmide d’expression bactérien, de préférence un plasmide d’expression par l’ARN polymérase T7.
L’invention concerne en outre une cellule hôte comprenant au moins une capside telle que définie ci-dessus, ou au moins une capside susceptible d’être obtenue (ou obtenue, ou directement obtenue) par l’une quelconque des méthodes de production définies ci-dessus, ou au moins un vecteur tel que défini ci-dessus, ou un mélange quelconque de ceux-ci.
La cellule hôte peut être une cellule d’eucaryote ou une cellule procaryote. La cellule hôte est de préférence une bactérie, de préférence une bactérie de la famille des Enterobacteriaceae, de préférence encore une bactérie du genre Escherichia, de préférence encore une bactérie Escherichia coli. La cellule hôte est de préférence isolée. La cellule hôte est de préférence recombinante.
L’invention concerne également une protéine de fusion telle que définie ci-dessus. La protéine de fusion est de préférence isolée et/ou purifiée. La protéine de fusion est de préférence recombinante. L’invention concerne également l’acide nucléique codant la protéine de fusion telle que définie ci- dessus. L’acide nucléique est de préférence isolé et/ou purifié. L’acide nucléique est de préférence recombinant.
L’invention concerne également une nanoparticule comprenant au moins une capside telle que définie ci-dessus, ou au moins une capside susceptible d’être obtenue par une méthode de production décrite ci-dessus, ou au moins une capside obtenue par une méthode de production décrite ci-dessus, ou au moins une capside directement obtenue par une méthode de production décrite ci-dessus, ou au moins un vecteur tel que défini ci-dessus, ou au moins une cellule hôte telle que définie ci-dessus, ou un mélange quelconque de ceux-ci.
L’invention concerne en outre une capside telle que définie ci-dessus, ou une capside susceptible d’être obtenue par une méthode de production décrite ci-dessus, ou une capside obtenue par une méthode de production décrite ci-dessus, ou une capside directement obtenue par une méthode de production décrite ci-dessus, caractérisée comme étant une nanoparticule et/ou un vecteur tel que défini ci-dessus, caractérisé(e) comme étant une nanoparticule.
L’invention concerne l’utilisation d’au moins une capside telle que définie ci-dessus, ou d’au moins une capside susceptible d’être obtenue par une méthode de production décrite ci-dessus, ou d’au moins une capside obtenue par une méthode de production décrite ci-dessus, ou d’au moins une capside directement obtenue par une méthode de production décrite ci-dessus, ou d’au moins un vecteur tel que défini ci-dessus, ou d’un mélange quelconque de ceux-ci, comme nanoparticule. Avantageusement, l’utilisation est une utilisation biotechnologique non médicale. Selon un mode de réalisation préféré, l’utilisation est une utilisation in vitro.
Composition - Composition pharmaceutique
L’invention concerne en outre une composition comprenant au moins une capside telle que définie ci-dessus, ou au moins une capside susceptible d’être obtenue par une méthode de production décrite ci-dessus, ou au moins une capside obtenue par une méthode de production décrite ci-dessus, ou au moins une capside directement obtenue par une méthode de production décrite ci-dessus, ou au moins un vecteur tel que défini ci-dessus, ou au moins une cellule hôte telle que définie ci-dessus, ou au moins une nanoparticule telle que définie ci-dessus, ou un mélange quelconque de ceux-ci.
La composition peut comprendre en outre au moins un excipient cosmétiquement acceptable (dans ce cas, la composition est une composition cosmétique) et/ou au moins un véhicule approprié qui peut être tout excipient et/ou tout véhicule parmi ceux connus de l’homme du métier en vue d’obtenir une composition telle que définie ci-dessus.
Les Inventeurs ont montré, de manière tout à fait surprenante, que la protéine de fusion, exposée par les capsides selon l’invention, conserve l’ensemble de ses propriétés et fonctionnalités, notamment une fois administrée in vivo. En particulier, l’administration de ces capsides fonctionnalisées par un antigène chez des souris modèles, induit une immunisation efficace, avec l’induction significative d’une réponse humorale (anticorps) et d’une réponse cellulaire. Cette immunisation résulte en une vaccination efficace de ces souris.
L’invention concerne donc une composition pharmaceutique et/ou vaccinale comprenant au moins une capside telle que définie ci-dessus, ou au moins une capside susceptible d’être obtenue par une méthode de production décrite ci-dessus, ou au moins une capside obtenue par une méthode de production décrite ci-dessus, ou au moins une capside directement obtenue par une méthode de production décrite ci-dessus, ou au moins un vecteur tel que défini ci-dessus, ou au moins une cellule hôte telle que définie ci-dessus, ou au moins une nanoparticule telle que définie ci-dessus, ou un mélange quelconque de ceux-ci.
Selon un mode de réalisation, la composition pharmaceutique et/ou vaccinale comprend en outre au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable et/ou au moins un adjuvant pharmaceutiquement acceptable et/ou au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable, qui peut être tout excipient et/ou tout adjuvant et/ou tout véhicule approprié parmi ceux connus de l’homme du métier en vue d’obtenir une composition pharmaceutique et/ou vaccinale telle que définie ci-dessus.
Selon un mode de réalisation avantageux, la composition (pharmaceutique ou non, vaccinale ou non) se présente sous une forme propre à une administration par voie topique, par voie orale, par injection. Les conditions opératoires pour préparer ces compositions font partie des connaissances générales de l’homme du métier.
Avantageusement, la composition est dépourvue d’adjuvant additionnel. En effet, les Inventeurs ont montré que la capside selon l’invention procurait l’effet d’un adjuvant, avec un effet adjuvant au moins aussi efficace qu’un adjuvant modèle (l’adjuvant complet de Freund).
Utilisation thérapeutique - Méthode de traitement
Les Inventeurs ont montré, de manière tout à fait surprenante, que la protéine de fusion, exposée par les capsides selon l’invention, conserve l’ensemble de ses propriétés et fonctionnalités, notamment une fois administrée in vivo. En particulier, l’administration de ces capsides fonctionnalisées par un antigène chez des souris modèles, induit une immunisation efficace, avec l’induction significative d’une réponse humorale (anticorps) et d’une réponse cellulaire. Cette immunisation résulte en une vaccination efficace de ces souris.
L’invention concerne donc une capside telle que définie ci-dessus, ou une capside susceptible d’être obtenue par une méthode de production décrite ci-dessus, ou une capside obtenue par une méthode de production décrite ci-dessus, ou une capside directement obtenue par une méthode de production décrite ci-dessus, ou un vecteur tel que défini ci-dessus, ou une cellule hôte telle que définie ci- dessus, ou une nanoparticule telle que définie ci-dessus, ou une composition pharmaceutique et/ou vaccinale telle que définie ci-dessus, ou un mélange quelconque de ceux-ci, pour son utilisation comme médicament et/ou comme vaccin.
L’invention concerne également une composition pharmaceutique et/ou vaccinale comprenant au moins une capside telle que définie ci-dessus, ou au moins une capside susceptible d’être obtenue par une méthode de production décrite ci-dessus, ou au moins une capside obtenue par une méthode de production décrite ci-dessus, ou au moins une capside directement obtenue par une méthode de production décrite ci-dessus, ou au moins un vecteur tel que défini ci-dessus, ou au moins une cellule hôte telle que définie ci-dessus, ou au moins une nanoparticule telle que définie ci-dessus, ou un mélange quelconque de ceux-ci, pour son utilisation comme médicament et/ou comme vaccin.
L’invention concerne également l’utilisation d’une capside telle que définie ci-dessus, ou d’une capside susceptible d’être obtenue par une méthode de production décrite ci-dessus, ou d’une capside obtenue par une méthode de production décrite ci-dessus, ou d’une capside directement obtenue par une méthode de production décrite ci-dessus, ou d’un vecteur tel que défini ci-dessus, ou d’une cellule hôte telle que définie ci-dessus, ou d’une nanoparticule telle que définie ci-dessus, ou d’une composition pharmaceutique et/ou vaccinale telle que définie ci-dessus, ou d’un mélange quelconque de ceux-ci, pour la fabrication d’un médicament et/ou d’un vaccin.
L’invention concerne également une méthode de prévention ou de traitement thérapeutique, comprenant l’administration d’une capside telle que définie ci-dessus, ou d’une capside susceptible d’être obtenue par une méthode de production décrite ci-dessus, ou d’une capside obtenue par une méthode de production décrite ci-dessus, ou d’une capside directement obtenue par une méthode de production décrite ci-dessus, ou d’un vecteur tel que défini ci-dessus, ou d’une cellule hôte telle que définie ci-dessus, ou d’une nanoparticule telle que définie ci-dessus, ou d’une composition pharmaceutique et/ou vaccinale telle que définie ci-dessus, ou d’un mélange quelconque de ceux-ci.
L’invention concerne également une capside telle que définie ci-dessus, ou une capside susceptible d’être obtenue par une méthode de production décrite ci-dessus, ou une capside obtenue par une méthode de production décrite ci-dessus, ou une capside directement obtenue par une méthode de production décrite ci-dessus, ou un vecteur tel que défini ci-dessus, ou une cellule hôte telle que définie ci-dessus, ou une nanoparticule telle que définie ci-dessus, ou une composition pharmaceutique et/ou vaccinale telle que définie ci-dessus, ou un mélange quelconque de ceux-ci, pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement d’une infection, telle qu’une infection virale ou bactérienne ; d’une maladie auto-immune ; d’une maladie métabolique ; d’une maladie dermatologique, d’une maladie cardio-vasculaire ; d’une maladie respiratoire ; d’une maladie neurodégénérative ; d’une maladie génétique ; d’une maladie hormonale ; d’une maladie psychiatrique ; d’un cancer ; d’une maladie liée à une infection et/ou à une toxine, telle qu’une maladie liée à une infection virale ou bactérienne et/ou liée à une exposition à une toxine. L’invention concerne également une composition pharmaceutique et/ou vaccinale comprenant au moins une capside telle que définie ci-dessus, ou au moins une capside susceptible d’être obtenue par une méthode de production décrite ci-dessus, ou au moins une capside obtenue par une méthode de production décrite ci-dessus, ou au moins une capside directement obtenue par une méthode de production décrite ci-dessus, ou au moins un vecteur tel que défini ci-dessus, ou au moins une cellule hôte telle que définie ci-dessus, ou au moins une nanoparticule telle que définie ci-dessus, ou un mélange quelconque de ceux-ci, pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement d’une infection, telle qu’une infection virale ou bactérienne ; d’une maladie auto-immune ; d’une maladie métabolique ; d’une maladie dermatologique, d’une maladie cardio-vasculaire ; d’une maladie respiratoire ; d’une maladie neurodégénérative ; d’une maladie génétique ; d’une maladie hormonale ; d’une maladie psychiatrique ; d’un cancer ; d’une maladie liée à une infection et/ou à une toxine, telle qu’une maladie liée à une infection virale ou bactérienne et/ou liée à une exposition à une toxine.
Les exemples qui suivent visent à illustrer la présente invention.
EXEMPLES
Exemple 1 : Construction de protéines pb10 du phage T5 fusionnées avec l’ovalbumine et démonstration de leurs propriétés de décoration de la capside vide du phage T5
1.1. chimères » : une 'intérêt ou Domaine N-terminal de pb10 fusionné à une protéine d’intérêt : Antigène Ovalbumine
L’exemple montré ici est celui des protéines pt>10 fusionnées avec l’ovalbumine (Ova ; MM=42,8 kDa) utilisé comme antigène modèle dans les tests de vaccination. Il décrit la production de protéines « chimères » constituées de la protéine pb10 entière (SEQ ID NO : 1 ) fusionnée à une protéine d’intérêt ou seulement du domaine N-terminal de pb10 (pb10N-Ter, correspondant à la SEQ ID NO:3) fusionné à une protéine d’intérêt qui remplace le domaine C-terminal.
La production des protéines chimères est faite comme suit :
-Expression des gènes pb10-OVAH6 (PO) et pb10N-Ter-OVAH6 (PNO), clonés dans pET28b, a été effectuée dans la souche Escherichia coli BL21 (DE3).
Culture des bactéries transformées en milieu LB (Luria Broth), supplémenté en Kanamycine (50pg/mL) jusqu’à une D0600nm de 0,8.
Induction de l’expression des gènes PO et PNO par addition d’isopropyl-B-D- thiogalactopyranoside (IPTG 0,4mM) et poursuite de la culture pendant 2 heures.
Cassage des culots bactériens, ultracentrifugation à 100000 g, et récolte du surnageant. Purification des protéines PO et PNO à partir de la fraction cytoplasmique (surnageant) en trois étapes:
1 ) purification sur colonne de Nickel en présence de 0,1% de LDAO (Dodecyldimethylaminoxid).
2) purification sur colonne échangeuse d’anions.
3) purification par chromatographie d’exclusion par la taille.
La pureté des protéines chimères PO et PNO est analysée par SDS-PAGE (fractions éluées après chromatographie d’exclusion par la taille sur colonne Superdex75 HR10/300 (GE Healthcare)). Les résultats obtenus sont montrés sur la Figure 2.
NB : à l’issue de ces trois étapes, le taux d’endotoxines est conforme aux exigences de vaccination (< 100 UE/mL).
1.2. Démonstration des propriétés de « décoration >> des protéines chimères
1.2.1. Matériel et méthodes
Les protéines chimères produites selon l’exemple 1.1 ci-dessus ont été utilisées pour décorer des capsides vides du bactériophage T5. Les tests de décoration ont été faits en incubant pendant 10 minutes à 4°C les protéines PO et PNO purifiées avec des capsides produites selon la méthode décrite dans l’article Preux et al. 2013 et Vernhes et al. 2017, modifiée et optimisée comme suit : i) Un nouveau mutant du phage T5 a été construit pour la production des capsides vides - T5stAmN5- Adec - qui résulte de la délétion du gène codant pour la protéine de décoration pb10 dans le phage T5stAmN5 décrit dans les publications Preux et al. 2013 et Zivanovic 2014. Ce mutant permet de garantir l’absence totale de décoration au cours de la production des capsides et avant l’addition des protéines chimères purifiées (données non montrées). ii) Deux détergents sont utilisés successivement au cours des étapes de purification des capsides. Le n-Octyl-B-D-Glucopyranoside (B-OG) et le Dodecyldimethylaminoxid (LDAO). Brièvement, les capsides récoltées dans le lysat bactérien résultant de l’infection d’une culture bactérienne de la souche E.coli F par le phage mutant T5amN5-Adec, sont précipitées en présence de 0,5 M NaCl et 8% de PEG 6000, centrifugées, resuspendues dans une solution tampon Tris 50 mM, pH 7,6 contenant du NaCl 200 à 400 mM. Après une première étape de purification par sédimentation de vitesse sur un gradient de glycérol, les fractions contenant les capsides sont incubées pendant 6 à 12 heures en présence de 1% de B-OG, avant d’être injectées sur une colonne échangeuse d’anions. Deux étapes de purification successives sont effectuées sur cette colonne. Lors de la première étape le tampon d’équilibration et le tampon d’élution contiennent 0,2 à 0,05 % de LDAO. Les fractions contenant les capsides sont soumises à une nouvelle purification par échange d’anions en absence de détergents, Ce protocole permet d’éliminer une très grande partie des endotoxines contaminantes et de respecter (ne pas dépasser) les taux d’endotoxines tolérés pour les injections de capsides chez la souris.
Deux méthodes permettent de révéler les propriétés de fixation des protéines PO et PNO sur les capsides pures : 1 ) Une approche biochimique par électrophorèse native sur gel d’agarose, méthode qui permet de visualiser la décoration complète des capsides par un effet de retard sur gel (Figure 3). 2) La résonance plasmonique de surface (SPR, Surface Plasmon Résonance), méthode qui permet de déterminer les constantes cinétiques d’association et de dissociation des protéines chimères sur les capsides vides et de calculer une constante d’affinité (Figure 4). Ces deux techniques ont été décrites dans l’article Vernhes et al. Scientific Reports 2017).
1.2.2. Analyse de la décoration par électrophorèse native sur gel d’agarose
La Figure 3 montre les résultats des essais de décoration de capsides vides pures avec les protéines pb10, PO et PNO. Les concentrations respectives des différentes protéines de décoration et des capsides ont été ajustées pour obtenir des rapports de concentration [protéine] /[sites de fixation sur la capside] = 1 +/- 0,1 .
La migration des capsides décorées [1] est retardée par rapport aux capsides non décorées [0]. La Figure 3 montre que les capsides sont entièrement décorées avec les mêmes concentrations de protéines pb10, PO et PNO. Ce premier test indique que l’affinité des protéines PO et PNO pour les capsides est comparable à celle de la protéine native pb10.
1.2.3. Mesure de l’affinité des protéines de décoration par SPR La Figure 4 montre que les protéines chimères PO et PNO ont la même affinité que la protéine de décoration pb10 pour les capsides vides de phage T5. La fusion de l’antigène complet ovalbumine à l’extrémité C-terminale de la protéine pb10 entière ou bien à l’extrémité C-terminale du seul domaine pb10N-Ter n’affecte donc pas la forte affinité de la protéine de décoration pour les capsides.
1.2.4. Conclusion
La capside de T5 constitue donc une nanoparticule d’origine biologique pouvant exposer à sa surface 120 copies d’une protéine dont la fonction peut varier en fonction de la nature du peptide ou de la protéine qui est fusionné(e) à la protéine de décoration. chimères » : Protéine pb10 entière fusionnée à une protéine d’intérêt 3 fusionné à une protéine d’intérêt : Protéine fluorescente mCHERRY
Un deuxième exemple de modification de la protéine de décoration a été étudié. Les protéines chimères fusionnées avec la protéine fluorescente mCHERRY (28,9kda) pb10-mCHERRYH6 (SEQ ID NO : 14) et pb10N-Ter-mCHERRYH6 (SEQ ID NO : 15) ont été construites et leurs propriétés de décoration ont été testées. Les résultats, montrés par la Figure 5, confirment qu’il est possible de fusionner une seconde protéine de grande taille à l’extrémité C-terminale de pb10 ou de son domaine Nter sans affecter les propriétés de fixation à la capside. Cette protéine de décoration peut être utilisée pour décorer les capsides de phages entiers. Cela permet notamment des applications en imagerie de fluorescence.
1 .4. Développement d’un système de production des capsides indépendant du phage T5 La méthode de production des capsides vides, qui a été utilisée au début de cette étude, repose sur l’infection d’une culture bactérienne par un phage T5 mutant, ce qui impose la production d’un stock important de ce phage, en amont de la production des capsides. De plus, lors de l’infection, on observe une forte fréquence de réversion du phage vers le génotype sauvage, ce qui diminue le rendement en capsides vides. Pour s’affranchir de ces contraintes et dans la perspective d’augmenter l’échelle de production des capsides, les Inventeurs ont développé un système de production et de décoration des capsides totalement indépendant du bactériophage T5.
Les 4 gènes de capside codant pour la protéine portale pb7, la protéine de décoration pb10, la protéase de maturation pb11 et la protéine majeure de capside pb8 ont été clonés dans un vecteur pET28b, tels qu’ils sont organisés dans le génome de T5 (pETcapT5; Figure 6). Leur expression, sous contrôle d’un promoteur T7, est réprimée en présence de glucose et inductible par l’IPTG, ce qui permet de contrôler l’expression basale de la protéase qui est toxique pour la souche d’expression E. coli. Une deuxième version de ce plasmide (pETcapT5Adec; Figure 7) dans laquelle le gène de la protéine pb10 a été délété a également été construite. Les séquences des opérons tels qu’insérés dans ces plasmides, ainsi que celles des plasmides obtenus sont les suivantes :
Opéron (insert) capT5 :SEQ ID NO: 10 ; Opéron (insert) capT5Adec : SEQ ID NO: 11 ; pETcapT5 : SEQ ID NO: 12 ; pETcapT5Adec : SEQ ID NO: 13. La purification des capsides produites à partir des plasmides a été effectuée selon les protocoles déjà décrits pour les capsides produites à partir des phages mutants, avec quelques variations. En particulier les capsides récoltées après la première étape de purification sur gradient de glycérol ont été centrifugées pendant 20 à 30 minutes à 60 000g. Cette étape d’ultracentrifugation permet de concentrer les capsides et d’éliminer une part importante des protéines solubles et ADN contaminants, avant les étapes de chromatographie par échange d’anions.
Les résultats démontrent que l’expression, chez la bactérie E. coli, des gènes de capside à partir de ces plasmides conduit à l’autoassemblage de capsides dont la morphologie est similaire à celle des capsides produites par le phage puis expansées in vitro (Figure 8A). La capacité de ces capsides recombinantes à fixer la protéine de décoration a été évaluée par une approche biochimique utilisant des gels d’agarose natif, qui donne une estimation de l’affinité de pb10 pour ses sites de fixation (Figure 8B). Les essais de fixation sur les deux populations de capsides ont été effectués avec la protéine pb10 purifiée. Les capsides qui ont été assemblées en absence de pb10 montrent des propriétés de décoration comparables à celles des capsides produites à partir du phage. Les capsides produites en présence de la protéine de décoration pb10 ont une mobilité électrophorétique comparable à celles des capsides totalement décorées, et leur migration sur le gel n’est pas modifiée par l’addition de pb10. Ce résultat montre qu’elles ont été décorées in situ au cours de leur assemblage, leur incapacité à fixer la protéine de décoration si elle est ajoutée après leur purification, et que tous les sites de fixation sont saturés lors de l’assemblage (efficacité optimale). La présence de pb10 sur ces capsides a été vérifiée par Western Blot à l’aide d’anticorps polyclonaux dirigés contre pb10 (Figure 9).
1.5. Observations
Ces données démontrent les propriétés d’autoassemblage des capsides vides à partir de l’expression ectopique des gènes de capsides, en dehors du cycle viral du phage T5. Ces données se distinguent notamment des résultats publiés antérieurement (Huet et al. 2016) au moins par: i) la toxicité de la protéase peut être contrôlée, avant l’induction à l’IPTG, par répression de l’expression basale des gènes de capsides en présence de 0,2% à 0,5% de glucose, ce qui augmente significativement le rendement en capsides ; ii) les capsides produites avec le plasmide pETcapT5Apb10 sont obtenues dans leur conformation expansée et celles produites à partir du plasmide pETcapT5 sont obtenues dans leur conformation expansée et totalement décorée.
Ces capsides de T5 recombinantes peuvent donc être décorées de deux façons différentes: i) par addition in vitro de la protéine de décoration purifiée, ii) par co-production in vivo de la protéine de décoration avec les protéines formant la capside. Ces deux méthodes permettent la production simplifiée de nanoparticules fonctionnalisables et permettent de les produire à plus grande échelle, par rapport à la production qui utilise les phages T5.
Exemple 2 : Expériences de vaccination de souris (in vivo) Les résultats obtenus dans les expériences in vivo ont été générés en utilisant des préparations de capsides de phages et de protéines recombinantes produites par le groupe de Pascale Boulanger (PB). La contamination en endotoxines des préparations a été testée par le groupe de Karim Benihoud (KB).
2.1. EXPÉRIENCE 1 :
Objectif : comparer les réponses immunitaires induites par les protéines recombinantes pb10-OvaH6 (PO) et Pb10Nterm-OvaH6 (PNO) selon qu’elles sont associées ou non avec des capsides purifiées de phage T5 (C).
Tableau 1 : Plan d’expérience Expérience 1
Légende : pt>10-OvaH6 = PO ; pt>10Nterm-OvaH6 =PNO ; capside purifiée de phage T5 = C
2.2. EXPÉRIENCE 2 :
Objectif : comparer les réponses immunitaires induites par les protéines recombinantes pb10-0va (PO) et pb10Nterm-Ova (PNO) selon qu’elles sont associées ou non avec des capsides purifiées de phage T5.
Tableau 2 : Plan d’expérience Expérience 2
Dans cette expérience, la contamination en endotoxines des préparations de capsides purifiées et des protéines recombinantes a été testée.
2.3. EXPÉRIENCE 3 :
Objectif : comparer les réponses immunitaires induites par la protéine recombinante PblONterm- OvaH6 (PNO) selon qu’elle est associée ou non avec des capsides purifiées de phage T5. Tableau 3: Plan d’expérience Expérience 3
Dans cette expérience, la contamination en endotoxines des préparations de capsides purifiées et des protéines recombinantes a été testée.
2.4. Matériels et Méthodes
2.4.1. Détermination de la teneur en endotoxines
Les niveaux d’endotoxine dans les préparations protéiques et les capsides utilisées pour les expériences in vivo ont été quantifiés à l’aide du LAL Chromogenic Endotoxin Quantitation Kit (Pierce LAL) selon les instructions du fabricant (Thermo Fisher Scientific).
2.4.2. Immunisation des souris
Des souris C57BL/6 femelles âgées de six semaines ont été fournies par Janvier (Le Genest Saint Isle, France). Toutes les souris ont été conditionnées pendant au moins une semaine dans nos installations pour animaux avant le début des expériences. Toutes les expériences sur animaux ont été approuvées (numéro d'autorisation 19055-2019021108472030) par le Comité d'éthique n°26 (officiellement reconnu par le ministère français de la Recherche) conformément à la directive européenne 2010/63 UE et à sa transposition en droit français.
Des protéines pb10 fusion recombinantes (3,6 mM) avec ou sans capside (32 nM) ont été injectées par voie sous-cutanée dans un volume de 50 pl de tampon PBS. Dans certaines expériences, un groupe témoin a reçu une injection de pb10-0va (3,6 mM) mélangé avec un adjuvant complet de Freund (FCA, Sigma). Des conditions similaires ont été utilisées lors des ré-administrations (deuxième injection), à l'exception du groupe témoin pour lequel l’adjuvant complet de Freund a été remplacé par l’adjuvant de Freund incomplet (IFA, Sigma). Des échantillons de sang ont été prélevés dans la veine sous-maxillaire à différents temps après administration des préparations vaccinales. Les sérums ont été préparés et analysés pour déterminer la présence d'anticorps spécifiques par ELISA, comme décrit ci-dessous. Les rates ont été recueillies 10 jours après la deuxième injection pour mesurer les réponses immunitaires cellulaires.
2.4.3. Mesure des réponses anticorps
L’ovalbumine (1 pg, Sigma) a été immobilisée sur des plaques à 96 puits (Nunc). Après lavage en tampon TBST et saturation avec du TBS-Tween à 5% de lait, des dilutions en série des sérums dans du TBST 5% lait ont été ajoutées. Les anticorps liés ont été détectés avec des anticorps de chèvre spécifiques des IgG ou des isotypes (lgG1 , lgG2b, lgG2c, lgG3 ou IgM) de souris conjugués à la peroxydase (Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL). L'activité peroxydase a été révélée par incubation avec le substrat dichlorhydrate de O-phénylènediamine (Sigma - Aldrich) pendant 30 min. La réaction a été arrêtée par addition d’HCl 3N et des lectures spectrophotométriques ont été effectuées à 490 nm. Les titres ont été définis comme étant l'inverse de la dilution la plus élevée donnant une D0490 deux fois supérieure aux valeurs de bruit fond. Un protocole similaire a été utilisé pour mesurer les Ac spécifiques de capside ou de pb10.
2.4.4. Mesure des réponses immunitaires cellulaires
Les rates ont été broyées dans du milieu RPMI complémenté de 10% sérum de veau fœtal et du □mercaptoéthanol 105 M, puis filtrées sur un tamis de 100 pm. Après élimination des globules rouges par le tampon de lyse ACK (Invitrogen, Cergy Pontoise, France), les cellules ont été remises en suspension et la concentration a été ajustée à 2,5 c 106 cellules / mL. Les splénocytes ont ensuite été restimulés dans différentes conditions (milieu seul, peptide Ova257-264 (5 pg / ml), dans un volume de 200 pl pendant un jour (ELISPOT) ou pendant trois jours (ELISA). Pour les ELISPOT, les plaques ont été révélées selon les indications du fournisseur (Diaclone). Le nombre de spots de cellules productrices d’IFNy a été compté à l’aide de l’ImmunoSpot® S6 FluoroSpot (CTL, Cleveland, Ohio). Pour le test ELISA, la concentration d’IFNy dans les surnageants a été déterminée en utilisant un kit de dosage de l’IFNy (eBioscience). Une re-stimulation avec de l'ionomycine (1 pM) et du Phorbol myristate acétate (0,1 pM) a été utilisée pour contrôler la qualité des préparations de splénocytes.
2.5. Résultats
Les résultats sont présentés dans le Tableau 4 ci-dessous montrant les données de mesures de concentration en endotoxines ; dans la Figure 10 (cinétique de la réponse anticorps anti-Ova induite par les protéines fusion pb10) ; dans la Figure 11 (caractérisation de la nature des anticorps induits par les protéines pb10 fusion) ; dans la Figure 12 (analyse des réponses cellulaires induites par les protéines pb10 fusion avec l’Ova) ; et dans la Figure 13 (analyse des réponses cellulaires induites par la protéine PNO).
Tableau 4 : Concentration en endotoxines des Expériences 1 à 3 [Table 4]
Résultats issus de l’expérience 2 Les données de la Figure 10 montrent que :
- Les protéines PO et PNO injectées seules induisent un faible niveau de production d’anticorps anti-Ova (IgG)
- Les protéines PO et PNO injectées avec des capsides purifiées de phage T5 induisent de fortes réponses Ac avec un plateau atteint au jour 28 après l’administration des préparations vaccinales. Cette réponse est durable puisque les Ac anti-Ova sont détectés encore à fort taux 192 jours après l’administration de PO ou PNO associées avec des capsides purifiées.
- La cinétique des réponses Ac anti-Ova (IgG Totaux) dans les groupes injectés avec PO ou PNO plus capsides est comparable à celle obtenue lorsque l’on co-injecte les souris avec PO + ACF (contrôle positif de réponse).
- La co-administration des protéines fusion pb10 avec des capsides purifiées de phage T5 induit une réponse Ac anti-Ova de longue durée tout à fait comparable à celle obtenue avec un adjuvant standard, l’ACF (Adjuvant Complet de Freund).
Les données de la Figure 11 montrent :
- Production très importante d’Ac anti-Ova de type lgG1 , lgG2b, lgG2c et lgG3 dans les groupes de souris injectées avec PO +C ou PNO +C, comparativement aux groupes PO ou PNO seules.
- Pas de différence dans les isotypes produits entre les groupes PO +C et PNO +C ce qui suggère que la partie N-terminale de pb10 seule est suffisante et que la présence d’une protéine pb10 entière n’est pas nécessaire pour la production d’Ac anti-Ova.
- Comparativement au groupe PO + ACF, les groupes PO +C et PNO +C produisent moins d’Ac anti-Ova de type lgG1 mais produisent plus d’Ac de type lgG3. Il n’y a pas de différence signification pour les Ac anti-Ova d’isotype lgG2b et lgG2c (pour lgG2c il y a une tendance à une augmentation).
- L’administration des protéines PO ou PNO avec des capsides purifiées conduit à une réponse Ac anti- Ova présentant un large profil isotypique. Cependant, comparativement à l’ACF, on observe un biais significatif en faveur des lgG3 (isotype activateur du complément) et une réduction significative des l§G1.
Les données de la Figure 12 montrent que :
- Le test de restimulation des splénocytes par le peptide immunodominant Ova257-264 montre un plus grand nombre de splénocytes producteurs d’IFNy pour les souris injectées par PO +C ou PNO +C comparativement aux souris injectées par PO ou PNO seules. Ces résultats démontrent que les souris vaccinées avec les protéines fusion + capsides ont une réponse T anti-Ova plus importante. Comme la restimulation a été réalisée avec un épitope T capable de s’associer aux molécules de classe I du complexe majeur d’histocompatibilité, ceci démontre qu’il y a, chez ces souris, une plus forte production de lymphocytes T CD8+ spécifiques de l’ovalbumine et qu’ils sont fonctionnels (production d’IFNy).
- Le nombre de splénocytes producteurs d’IFNy n’est pas significativement différent entre les groupes PO +C et PNO +C suggérant que la protéine pb10 fusion ne doit pas nécessairement contenir toute la séquence de pb10. - Les protéines pt>10 fusion co-administrées avec les capsides purifiées de phages induisent chez la souris de fortes réponses cellulaires.
Résultats issus de l’expérience 3 Les données de la Figure 13 montrent que :
- Le test de restimulation des splénocytes par le peptide immunodominant Ova257-264 montre un plus grand nombre de splénocytes producteurs d’IFNy pour les souris injectées par PNO + C comparativement aux souris injectées par PNO seules (figure 13A).
- De même le test de restimulation montre une plus forte production d’IFNy dans les surnageants de splénocytes issus de souris injectées par PNO +C (figure 13B)
- Le nombre de splénocytes producteurs d’IFNy ou la quantité d’IFNy produite dans le surnageant est supérieur à ceux retrouvés avec les splénocytes de souris injectées avec PNO + ACF.
Les résultats montrent que la protéine PNO induit une réponse cellulaire anti-Ova significativement plus importante lorsqu’elle est associée à des capsides purifiées. Cette réponse est également plus importante que celle obtenue lorsque cette protéine est coadministrée avec l’adjuvant ACF.

Claims

REVENDICATIONS
1 . Capside de phage T5 dépourvue d’ADN génomique dudit phage et exposant, à sa surface, au moins une protéine de fusion, ladite protéine de fusion comprenant :
- au moins un fragment de peptide ou de protéine ayant au moins 80% d’identité avec un fragment d’une protéine de décoration pb10, de préférence au moins 85% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité ; ledit fragment d’une protéine de décoration pb10 comprenant de préférence au moins 76, de préférence au moins 77, de préférence au moins 80 acides aminés consécutifs du domaine N-terminal d’une protéine pb10 ; et
- au moins un fragment fonctionnel d’un antigène, ou au moins un fragment fonctionnel d’une toxine, ou au moins un fragment de récepteur, ou au moins un fragment fonctionnel d’un signal d’adressage ou de ciblage ou de transport, ou au moins un fragment fonctionnel d’une enzyme, ou au moins un fragment fonctionnel d’une hormone, ou au moins un fragment fonctionnel d’un anticorps, ou au moins un antigène, ou au moins une toxine, ou au moins un récepteur, ou au moins un signal d’adressage ou de ciblage ou de transport, ou au moins une enzyme, ou au moins une hormone, ou au moins un anticorps, ou une combinaison quelconque de ceux-ci, de préférence au moins un fragment fonctionnel d’antigène, de préférence encore au moins un antigène.
2. Capside selon la revendication 1 , caractérisée en ce que le fragment de la protéine de décoration pb10 est choisi parmi : i) un fragment de peptide ou de protéine ayant au moins 80% d’identité avec une portion du domaine N-terminal d’une protéine pb10, de préférence au moins 85% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité ; ladite portion comprenant de préférence au moins 76, de préférence au moins 77, de préférence au moins 80 acides aminés consécutifs du domaine N-terminal d’une protéine pb10 ; ii) un fragment de peptide ou de protéine ayant au moins 80% d’identité avec le domaine N- terminal d’une protéine pb10, de préférence au moins 85% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité ; ledit domaine N-terminal d’une protéine pb10 comprenant de préférence les acides aminés consécutifs inclus entre les positions 1 et 80, ou entre les positions 1 et 77, ou entre les positions 2 et 77 ; iii) un fragment ou un peptide d’une protéine comprenant une séquence d’acides aminés ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO :1 , de préférence au moins 85% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 1 ; ledit fragment ou peptide comprenant de préférence au moins les 80 premiers acides aminés consécutifs de ladite protéine ; iv) un fragment ou un peptide d’une protéine consistant en une séquence d’acides aminés ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 1 , de préférence au moins 85% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 1 ; ledit fragment ou peptide comprenant de préférence au moins les 80 premiers acides aminés consécutifs de ladite protéine ; v) un peptide comprenant une séquence d’acides aminés ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 3, de préférence au moins 85% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 3 ; et vi) un peptide consistant en une séquence d’acides aminés ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 3, de préférence au moins 85% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 3 vii) un fragment ou un peptide d’une protéine comprenant, ou consistant en, une séquence d’acides aminés ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 16, de préférence au moins 85% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité, avec la séquence SEQ ID NO : 16 ; ledit fragment ou peptide comprenant de préférence au moins les 77 premiers acides aminés consécutifs de ladite protéine, de préférence encore les acides aminés consécutifs inclus entre les positions 2 et 76.
3. Capside selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le fragment fonctionnel d’un antigène, le fragment fonctionnel d’une toxine, le fragment de récepteur, le fragment fonctionnel d’un signal d’adressage ou de ciblage ou de transport, le fragment fonctionnel d’une enzyme, le fragment fonctionnel d’une hormone, le fragment fonctionnel d’un anticorps, l’antigène, la toxine, le récepteur, le signal d’adressage ou de ciblage ou de transport, l’enzyme, l’hormone, l’anticorps, ou la combinaison quelconque de ceux-ci, est un peptide, un polypeptide ou une protéine comprenant au moins 10 acides aminés consécutifs, de préférence encore au moins 12 acides aminés consécutifs, de préférence encore au moins 15 acides aminés consécutifs, de préférence encore au moins 20 acides aminés consécutifs, de préférence encore au moins 30 acides aminés consécutifs.
4. Capside selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu’elle comprend en outre (i) au moins une copie d’une protéine ayant au moins 80% d’identité avec une protéine de capside pb8 ; ou (ii) au moins une copie d’une protéine ayant au moins 80% d’identité avec une protéine portale pb7 ; ou (iii) au moins une copie d’une protéine ayant au moins 80% d’identité avec une protéase pb11 ; ou (iv) une combinaison quelconque de (i) à (iii).
5. Capside selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu’elle est sous forme mature expansée.
6. Méthode de production d’une capside selon l’une quelconque des revendications précédentes, comprenant les étapes suivantes : a) production d’une capside de phage T5 dépourvue d’ADN génomique et dépourvue de protéine pb10 ; b) mise en contact de la capside de l’étape a) avec une protéine de fusion telle que définie dans l’une quelconque des revendications précédentes, afin d’obtenir une capside décorée ; et c) Optionnellement, purification de la capside décorée de l’étape b) à l’aide d’un détergent neutre, de préférence choisi parmi le n-Octyl-6-D-Glucopyranoside (6-OG) et le Dodecyldimethylaminoxid (LDAO).
7. Méthode selon la revendication 6, dans laquelle la capside de l’étape a) est obtenue par une méthode comprenant les étapes suivantes : a-1 ) obtention d’un vecteur comprenant :
(i) au moins un gène codant pour une protéine ayant au moins 80% d’identité avec une protéine de capside pb8 ;
(ii)au moins un gène codant pour une protéine ayant au moins 80% d’identité avec une protéine portale pb7 ; et
(iii) au moins un gène codant pour une protéine ayant au moins 80% d’identité avec une protéase pb11 ; dans lequel les gènes (i) à (iii) sont placés sous le contrôle d’un promoteur inductible ; de préférence dans lequel les gènes (i) à (iii) sont organisés au sein d’un unique opéron ; de préférence dans lequel les gènes (i) à (iii) sont ordonnés conformément au génome du phage T5 ; et a-2) expression du vecteur de l’étape a-1 ) par une bactérie, de préférence une bactérie de la famille des Enterobacteriaceae, de préférence encore une bactérie du genre Escherichia, de préférence encore une bactérie Escherichia coli ; afin d’obtenir une capside de phage T5 dépourvue d’ADN génomique et dépourvue de protéine pb10 ; et a-3) Optionnellement, purification de la capside de l’étape a-2) à l’aide d’un détergent neutre, de préférence choisi parmi le n-Octyl-6-D-Glucopyranoside (6-OG) et le Dodecyldimethylaminoxid (LDAO).
8. Méthode de production d’une capside selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, comprenant les étapes suivantes : a) obtention d’un vecteur comprenant :
(v) au moins un gène codant pour une protéine ayant au moins 80% d’identité avec une protéine de capside pb8 ;
(vi) au moins un gène codant pour une protéine ayant au moins 80% d’identité avec une protéine portale pb7 ;
(vii)au moins un gène codant pour une protéine ayant au moins 80% d’identité avec une protéase pb11 ; et
(viii) au moins un gène codant une protéine de fusion telle que définie dans l’une quelconque des revendications 1 à 4 ; dans lequel les gènes (i) à (iv) sont placés sous le contrôle d’un promoteur inductible ; de préférence dans lequel les gènes (i) à (iv) sont organisés au sein d’un unique opéron ; de préférence dans lequel les gènes (i) à (iii) sont ordonnés conformément au génome du phage T5, et le gène (iv) codant la protéine de fusion occupe le locus du gène codant la protéine pb10 dans ledit génome ; b) expression du vecteur de l’étape a) par une bactérie, de préférence une bactérie de la famille des Enterobacteriaceae, de préférence encore une bactérie du genre Escherichia, de préférence encore une bactérie Escherichia coli ; afin d’obtenir une capside de phage T5 dépourvue d’ADN génomique et exposant, à sa surface, au moins une copie de la protéine de fusion ; et c) Optionnellement, purification de la capside décorée de l’étape b) à l’aide d’un détergent neutre, de préférence choisi parmi le n-Octyl-6-D-Glucopyranoside (6-OG) et le Dodecyldimethylaminoxid (LDAO).
9. Vecteur tel que défini dans la revendication 8, de préférence dans lequel le promoteur est un promoteur T7 ; de préférence dans lequel le vecteur est un vecteur d’expression, de préférence un vecteur d’expression bactérien, de préférence un plasmide d’expression bactérien, de préférence un plasmide d’expression par l’ARN polymérase T7.
10. Cellule hôte comprenant au moins une capside selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, ou au moins une capside susceptible d’être obtenue par la méthode de production selon l’une quelconque des revendications 6 à 8, ou au moins un vecteur selon la revendication 9, ou un mélange quelconque de ceux-ci, ladite cellule hôte étant de préférence une bactérie, de préférence une bactérie de la famille des Enterobacteriaceae, de préférence encore une bactérie du genre Escherichia, de préférence encore une bactérie Escherichia coli.
11. Protéine de fusion telle que définie dans l’une quelconque des revendications précédentes.
12. Acide nucléique codant la protéine de fusion selon la revendication 11.
13. Nanoparticule comprenant au moins une capside selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, ou au moins une capside susceptible d’être obtenue par la méthode de production selon l’une quelconque des revendications 6 à 8, ou au moins un vecteur selon la revendication 9, ou au moins une cellule hôte selon la revendication 10, ou un mélange quelconque de ceux-ci.
14. Capside selon l’une quelconque des revendications 1 à 5 ou capside susceptible d’être obtenue par la méthode de production selon l’une quelconque des revendications 6 à 8, caractérisée en ce qu’elle est une nanoparticule.
15. Composition pharmaceutique comprenant au moins une capside selon l’une quelconque des revendications 1 à 5 et 14, ou au moins une capside susceptible d’être obtenue par la méthode de production selon l’une quelconque des revendications 6 à 8, ou au moins un vecteur selon la revendication 9, ou au moins une cellule hôte selon la revendication 10, ou au moins une nanoparticule selon la revendication 13, ou un mélange quelconque de ceux-ci.
16. Capside selon l’une quelconque des revendications 1 à 5 et 14, ou capside susceptible d’être obtenue par la méthode de production selon l’une quelconque des revendications 6 à 8, ou vecteur selon la revendication 9, ou cellule hôte selon la revendication 10, ou nanoparticule selon la revendication 13, ou composition pharmaceutique selon la revendication 15, pour son utilisation comme médicament et/ou comme vaccin.
17. Capside selon l’une quelconque des revendications 1 à 5 et 14, ou capside susceptible d’être obtenue par la méthode de production selon l’une quelconque des revendications 6 à 8, ou vecteur selon la revendication 9, ou cellule hôte selon la revendication 10, ou nanoparticule selon la revendication 13, ou composition pharmaceutique selon la revendication 15, pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement d’une infection, telle qu’une infection virale ou bactérienne ; d’une maladie auto-immune ; d’une maladie métabolique ; d’une maladie dermatologique, d’une maladie cardio-vasculaire ; d’une maladie respiratoire ; d’une maladie neurodégénérative ; d’une maladie génétique ; d’une maladie hormonale ; d’une maladie psychiatrique ; d’un cancer ; d’une maladie liée à une infection et/ou à une toxine, telle qu’une maladie liée à une infection virale ou bactérienne et/ou liée à une exposition à une toxine.
18. Utilisation de la capside selon l’une quelconque des revendications 1 à 5 et 14, ou de la capside susceptible d’être obtenue par la méthode de production selon l’une quelconque des revendications 6 à 8, ou du vecteur selon la revendication 9, comme nanoparticule.
19. Capside susceptible d’être obtenue par la méthode de production selon l’une quelconque des revendications 6 à 8 ou capside obtenue par la méthode de production selon l’une quelconque des revendications 6 à 8.
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