FR3088341A1

FR3088341A1 - Dispositif de culture cellulaire

Info

Publication number: FR3088341A1
Application number: FR1860401A
Authority: FR
Inventors: Mikhael Hadida; David MARCHAT
Original assignee: Institut Mines Telecom IMT
Current assignee: Institut Mines Telecom IMT
Priority date: 2018-11-09
Filing date: 2018-11-09
Publication date: 2020-05-15
Anticipated expiration: 2038-11-09
Also published as: US20210395662A1; WO2020095005A1; FR3088341B1; EP3877500A1

Abstract

Dispositif de culture et/ou d'ensemencement cellulaire (10) comportant : - au moins une chambre de culture présentant au moins une fenêtre optique transparente (11), - au moins une entrée de fluide (12) et au moins une sortie de fluide (13) communiquant avec la chambre de culture, - au moins un support de culture tridimensionnel (20) disposé dans la chambre de culture, présentant des surfaces (21, 22) espacées le long d'un axe (X) du support de culture, le support de culture étant disposé dans la chambre de culture de manière à être traversé d'une surface à l'autre par l'écoulement circulant entre l'entrée de fluide et la sortie de fluide, et de manière à ce que l'une de ses surfaces, de préférence la face d'entrée du fluide, soit située au moins partiellement en regard de la fenêtre optique (11).

Description

La présente invention concerne les procédés et dispositifs de culture et/ou d’ensemencement cellulaire.

Les bioréacteurs perfusés sont des systèmes de culture qui comportent un support de culture (« scaffold » en anglais) balayé par un milieu de culture.

Un exemple d’un tel bioréacteur est celui commercialisé par la société Cellec Biotek sous la référence U-CUP. Il comprend un support de culture tridimensionnel placé dans une chambre traversée par un milieu de culture animé d’un mouvement oscillant.

Un tel dispositif ne permet pas l’observation au microscope optique du comportement cellulaire sans extraire le support de culture de la chambre. Il ne permet donc pas de réaliser un suivi en temps réel du comportement cellulaire au sein du support de culture.

La demande US 2016/0040108 divulgue un bioréacteur comportant un support de culture emprisonné entre deux pièces assurant la répartition des flux de fluide entrant et sortant, maintenues assemblées entre elles par un cylindre. Ce dispositif est compatible avec une technique d’imagerie non optique telle que CT (Computed Tomography) ou MRI (Magnetic Resonance Imaging).

La demande US 2013/0344531 divulgue un dispositif permettant l’examen optique d’une culture cellulaire in vitro. Le dispositif comporte une chambre présentant une fenêtre transparente derrière laquelle est disposé un support de culture. Ce dernier se présente sous la forme d’un disque de faible épaisseur disposé entre deux pièces de forme annulaire, dont l’une est traversée par des orifices radiaux diamétralement opposés permettant la circulation d’un milieu nutritif entre eux. Le support de culture peut ainsi être balayé par le milieu nutritif. Un tel dispositif n’est pas prévu pour recevoir un support de culture tridimensionnel, plus épais, nécessitant une circulation du milieu nutritif dans son épaisseur.

La demande WO2015/134550 divulgue un dispositif de culture comportant des micro-canaux pour assurer la circulation du milieu nutritif au travers de multiples chambres de perfusion. Un tel dispositif n’est pas prévu pour l’observation par microscopique optique du support de culture, sans avoir à procéder au démontage de celui-ci.

La demande US 2011/0229970 décrit un bioréacteur permettant de diriger le flux de liquide d’une façon réglable par rapport au support de culture.

Il existe un besoin pour bénéficier d’un dispositif de culture cellulaire qui permette l’observation par voie optique du développement cellulaire, tout en offrant des conditions de circulation du milieu nutritif convenant à la culture de cellules sensibles à leur environnement fluidique, telles que les cellules cultivées en ingénierie tissulaire. Pour de telles cellules, il est important de placer les cellules dans des configurations physiologiquement pertinentes.

Il existe également un intérêt pour disposer d’un dispositif d’ensemencement cellulaire qui permette d’ensemencer un support de culture, notamment de manière homogène, et de vérifier optiquement le bon ensemencement de celui-ci.

L’invention vise à répondre à tout ou partie de ces besoins et elle y parvient grâce à un dispositif de culture et/ou d’ensemencement cellulaire comportant :

Au moins une chambre de culture présentant au moins une fenêtre optique transparente, au moins une entrée de fluide et au moins une sortie de fluide communiquant avec la chambre de culture, au moins un support de culture tridimensionnel disposé dans la chambre de culture, présentant des surfaces espacées le long d’un axe du support de culture, le support de culture étant disposé dans la chambre de culture de manière à être traversé d’une surface à l’autre par l’écoulement circulant entre l’entrée de fluide et la sortie de fluide, et de manière à ce que l’une de ses surfaces, de préférence la surface d’entrée du fluide, soit située au moins partiellement en regard de la fenêtre optique.

De préférence, le dispositif comporte au moins un réseau de micro-canaux disposé en série avec le support de culture, de préférence situé en amont du support de culture, ce réseau étant relié par exemple à l’entrée de fluide, et comportant une pluralité de sorties pour alimenter le support de culture.

Par « support de culture » on désigne tout matériau permettant d’être ensemencé avec des cellules et un développement cellulaire. Le support de culture peut le cas échéant être transplanté, auquel cas il constitue un implant.

L’invention permet d’effectuer une culture cellulaire dans un environnement fluidique permettant le contrôle des forces de cisaillement et des vitesses de circulation dans le support de culture.

En particulier, l’invention permet, si on le souhaite, d’agencer le réseau de microcanaux de manière à avoir une répartition relativement homogène du débit à la sortie de ce réseau. Cela permet d’avoir un débit relativement homogène à la sortie du support de culture.

L’invention permet un examen optique, par exemple au microscope confocal, du support de culture sans interruption de la perfusion.

L’invention peut s’utiliser, entre autres applications, dans le cadre de la compréhension de la biologie de l’os, notamment l’étude des réponses en mécanotransduction des cellules osseuses et celle de l’impact des facteurs biochimiques sur les cellules osseuses, dans le but notamment d’optimiser la fabrication de greffons osseux vivants.

L’invention offre également la possibilité de disposer de modèles osseux comme plateforme standard de criblage de molécules, notamment ostéo-actives ou anti-cancéreuses, en remplacement des modèles animaux.

L’invention permet également d’étudier l’impact de nombreux paramètres de culture sur le développement des cellules et du tissu.

L’invention permet un ensemencement homogène du support de culture, une grande facilité de mise en œuvre et une grande répétabilité des essais. La fenêtre optique permet par exemple de vérifier le bon ensemencement du support de culture.

De préférence, le dispositif comporte un collecteur débouchant sur la face de sortie du support de culture, relié à la sortie de fluide. Ce collecteur permet, en jouant sur sa géométrie, d’exercer un contrôle additionnel sur les écoulements à travers le support de culture.

De préférence, la fenêtre optique est de faible épaisseur, par exemple inférieure ou égale à 1 mm. Cela permet une bonne visualisation du support de culture depuis l’extérieur du dispositif.

Dans un exemple de mise en œuvre de l’invention, la fenêtre optique est définie par une plaque rapportée sur un corps présentant un logement pour recevoir le support de culture. La plaque utilisée est de préférence en un matériau de qualité optique, tel que du PMMA de qualité optique. Une telle plaque présente par exemple un degré de transparence élevé, ainsi qu’une faible épaisseur, ce qui est utile pour ne pas éloigner outre mesure le support de culture de l’instrument optique.

Dans une variante, la fenêtre optique est réalisée de façon monolithique avec au moins une partie du corps qui définit le logement pour recevoir le support de culture. Cette fenêtre optique peut être réalisée au moins partiellement de façon monolithique avec le réseau de micro-canaux précités.

De préférence, le support de culture est reçu de façon amovible dans la chambre de culture. Ceci permet de monter dans le dispositif une grande variété de supports de culture. Le dispositif peut comporter un joint d’étanchéité disposé autour du support de culture. Cela oblige le fluide à traverser entièrement le support de culture et évite tout risque d’écoulement périphérique. Ce joint d’étanchéité peut avoir diverses formes. Il peut être avantageux d’utiliser un joint d’étanchéité ayant une surface périphérique inclinée de façon à ce qu’un serrage axial du joint s’accompagne d’un serrage radial contre le support de culture.

Comme mentionné plus haut, le réseau de micro-canaux peut être agencé pour générer un écoulement relativement homogène en entrée du support de culture. Le réseau de micro-canaux peut ainsi être configuré pour délivrer un même débit à 10% près, sur chacune de ses sorties. Au sein du support de culture, et en sortie de celui-ci, le débit est par exemple contrôlé avec une précision égale à ou meilleure que 2%. Le support de culture peut ainsi présenter des canaux, et le débit en sortie de ces canaux peut être homogène à mieux que 2%, c’est-à-dire que si dmin est le débit minimum observé à la sortie d’un canal, et dmax le débit maximal, on a (dmax-dmin)/dmin inférieur ou égal à 0,02.

Les sorties du réseau de micro-canaux peuvent présenter une symétrie axiale ou de révolution, notamment une symétrie d’ordre deux au moins, mieux quatre au moins, encore mieux d’ordre huit au moins. Le réseau de micro-canaux peut comporter au moins deux étages de ramifications multiples.

De préférence, le réseau de micro-canaux s’étend selon un plan perpendiculaire à l’axe du support de culture. Il peut comporter des canaux qui s’étendent autour de la fenêtre optique. Cette dernière peut être centrée relativement au réseau de micro-canaux.

Le dispositif peut comporter un bloc présentant un logement définissant au moins partiellement la chambre de culture, présentant une face d’appui contre laquelle une plaque de fond est rapportée, le réseau de micro-canaux étant formé entre ladite face et la plaque de fond, les micro-canaux étant de préférence formés en creux sur ladite face d’appui. La fenêtre optique peut être formée par cette plaque de fond. Le bloc peut former le corps précité. L’invention n’est toutefois pas limitée à cette façon particulière de réaliser la fenêtre optique.

De préférence, le collecteur présente une surface conique tournée vers la face de sortie du support de culture. La forme du collecteur peut influer sur les vitesses d’écoulement au sein du support de culture. On peut ainsi jouer sur la forme du collecteur pour améliorer l’homogénéité de l’écoulement fluide au sein du support de culture. Le collecteur peut encore présenter une forme cylindrique ou autre, par exemple étagée.

Le support de culture peut présenter toute forme extérieure et par exemple une forme extérieure ayant une symétrie axiale par rapport à son axe. Le support de culture peut présenter une forme extérieure généralement cylindrique de révolution. Dans un exemple de mise en œuvre, le support de culture comporte une pluralité de canaux parallèles, s’étendant entre les surfaces d’entrée et de sortie du support de culture, ces canaux ayant de préférence une section circulaire, les canaux étant de préférence parallèle à l’axe du support de culture. Les surfaces d’entrée et de sortie peuvent être des faces planes.

Le support de culture peut également présenter une structure tri-périodique, du type gyroïde.

La forme des surfaces d’entrée et de sortie peut être diverse, étant par exemple plane et perpendiculaire à l’axe du support de culture ou autre.

La dimension axiale du support peut être comprise entre 0,2 mm et 20 mm, mieux 1 mm et 10 mm..

Le diamètre du support de culture, c’est-à-dire sa plus grande dimension transversale, peut être compris entre 3 mm et 20 mm, ou mieux 5 mm et 12 mm.

Le volume du support de culture peut être compris entre 3.5 mm³ et 6300 mm³, mieux entre 20 mm³ et 1130 mm³

L’entrée de fluide et la sortie de fluide peuvent être disposées d’un même côté de la chambre de culture, de préférence son côté supérieur. Dans ce cas, la fenêtre optique est avantageusement située du côté inférieur du dispositif. Cela permet aux tubulures connectées à l’entrée et à la sortie de fluide de ne pas interférer mécaniquement avec l’instrument optique placé en regard de la fenêtre optique.

Le dispositif peut comporter un corps définissant un logement dans lequel est disposé le support de culture, et un insert pour fermer au moins partiellement ledit logement, cet insert étant de préférence vissé dans le corps. L’insert peut comporter une lèvre d’extrémité engagée sur le joint d’étanchéité, et s’étendant de préférence sur une partie seulement de la hauteur du joint d’étanchéité. L’insert peut définir le collecteur précité. L’insert peut présenter un ajour central pour recevoir un embout de connexion d’une tubulure de départ ou de sortie, cet embout étant de préférence vissé dans l’insert.

Dans un exemple de mise en œuvre préféré de l’invention, la lèvre de l’insert présente une surface radialement intérieure conique, et le joint présente une surface radialement extérieure conique, sensiblement de même pente, de telle sorte que le déplacement axial de l’insert lors de son serrage s’accompagne par effet de coin d’un serrage du joint sur le support de culture. Le joint a par exemple une surface radialement extérieure inclinée par rapport à son axe de symétrie, de préférence une section en forme de trapèze rectangle.

L’invention a encore pour objet un système comportant un dispositif de culture et/ou d’ensemencement selon l’invention, tel que défini plus haut, et un circuit fluidique pour faire circuler un milieu de culture dans la chambre de culture, ce milieu de culture gagnant la chambre de culture par ladite entrée de fluide et la quittant par ladite sortie de fluide, ledit circuit fluidique étant de préférence agencé pour établir une circulation ou recirculation du milieu de culture à travers la chambre de culture.

La circulation du fluide peut s’effectuer toujours dans le même sens, par exemple d’abord à travers le réseau de micro-canaux puis le support de culture. En variante, la circulation s’effectue en sens inverse, à savoir d’abord à travers le support de culture puis à travers le réseau de micro-canaux. En particulier, la circulation peut s’effectuer de façon alternée dans un sens puis dans l’autre lors d’une phase d’ensemencement du support de culture, et ensuite de façon unidirectionnelle lors d’une phase de développement cellulaire.

Le système peut comporter au moins un capteur en sortie de la chambre de culture, ce capteur étant de préférence capable de mesurer le dioxygène dissous, le pH, le glucose, le lactate, ou d’autres métabolites et signaux spécifiques générés par l’activité des cellules et plus particulièrement de cellules osseuses, tels que les marqueurs ostéoblastiques (e.g., alkaline phosphatase et ostéocalcine) et ostéocytaire (e.g., sclérostine), ou des adipocytes avec par exemple les marqueurs adiponectine et FABP4.

Le système peut comporter un microscope, de préférence confocal, disposé de façon à observer le support de culture, l’observation s’effectuant à travers ladite fenêtre optique.

Le système peut comporter au moins deux dispositifs de culture selon l’invention, reliés en série.

L’invention a encore pour objet un procédé de culture et/ou d’ensemencement cellulaire, dans lequel on ensemence et potentiellement on cultive des cellules, par exemple des cellules souches, ou des cellules osseuses, notamment ostéoblastes, ostéoclastes ou ostéocytes, sur un support de culture d’un dispositif selon l’invention, ou d’un système selon l’invention.

L’invention peut être mise en œuvre pour faire se différencier différemment les cellules souches en fonction des conditions de culture.

Lorsque le système comporte deux dispositifs en série, ces derniers peuvent être ensemencés avec des cellules de types différents ou non.

Le support de culture peut aussi être ensemencé avec au moins deux types de cellules pour réaliser une co-culture.

De préférence, on effectue de façon automatisée l’ensemencement, la culture, les prélèvements et les analyses en ligne.

L’invention a encore pour objet, selon un autre de ses aspects, indépendamment ou en combinaison avec ce qui précède, un dispositif de culture et/ou d’ensemencement cellulaire comportant :

Au moins une chambre de culture, au moins une entrée de fluide et au moins une sortie de fluide communiquant avec la chambre de culture, un support de culture tridimensionnel disposé dans la chambre de culture, présentant des surfaces espacées le long d’un axe du support de culture, la circulation du fluide entre l’entrée et la sortie de fluide s’effectuant entre lesdites surfaces, un réseau de micro-canaux situé en amont du support de culture, ce réseau étant relié à l’entrée de fluide et comportant une pluralité de sorties pour alimenter le support de culture, ce réseau de micro-canaux s’étendant selon un plan perpendiculaire à l’axe du support de culture.

Une telle disposition relative du support de culture et du réseau de micro-canaux permet de minimiser l’encombrement axial du dispositif, notamment en regard de la face d’entrée du support de culture. Cela permet également de déporter l’alimentation du réseau de micro-canaux sur le côté du dispositif.

Le réseau de micro-canaux peut présenter tout ou partie des caractéristiques précitées, et notamment comporter plusieurs étages de ramifications, des sorties multiples présentant par exemple une symétrie axiale ou de révolution d’ordre 2 ou plus autour de l’axe du support de culture. Le réseau comporte, dans un exemple de réalisation, des canaux formés en creux dans un bloc et fermés par une plaque de fond. En variante, les canaux sont formés autrement, par exemple par une technique de fabrication additive.

L’invention pourra être mieux comprise à la lecture de la description qui va suivre, d’exemples de mise en œuvre non limitatifs de celle-ci, et à l’examen du dessin annexé, sur lequel :

La figure 1 représente de façon schématique en coupe un exemple de dispositif selon l’invention, ainsi qu’un instrument optique associé, la figure 2 est une vue en perspective avec coupe axiale d’un exemple plus détaillé de réalisation du dispositif, la figure 3 représente isolément, en vue de dessous, le corps du dispositif de la figure 2, la figure 4 illustre, en coupe axiale, l’assemblage de certaines pièces constitutives du dispositif des figures 2 et 3, les figures 5A à 5C représentent un exemple de système utilisant un dispositif selon l’invention, les figures 6 et 7 sont des vues analogues aux figures 5A à 5C de variantes de systèmes selon l’invention, la figure 8 illustre un exemple de géométrie de collecteur, la figure 9 représente un exemple de distribution des canaux au sein du support de culture, et la figure 10 est une vue analogue à la figure 4 d’une variante de mise en œuvre de l’invention.

Un dispositif de culture et/ou d’ensemencement cellulaire 10 selon l’invention (encore appelé bioréacteur) comporte, comme illustré de façon simplifiée et schématique à la figure 1, un support de culture cellulaire 20, disposé dans une chambre de culture de manière à pouvoir être traversé par un écoulement d’un milieu nutritionnel.

Le support de culture est tridimensionnel, présente une surface d’entrée 21 et une surface de sortie 22 espacées l’une de l’autre selon un axe X, et dans l’exemple illustré chacune de forme plane et perpendiculaire à l’axe X. Une circulation fluidique peut s’établir entre les surfaces d’entrée 21 et de sortie 22, le long de l’axe X, en raison de la porosité du support.

Le support de culture 20 présente par exemple des canaux 400 parallèles de section circulaire, ce qui peut permettre d’exposer l’ensemble de la surface de culture à une valeur de cisaillement sensiblement constante, et d’identifier ainsi plus facilement des seuils de réponse cellulaire à la stimulation mécanique. Le support de culture peut encore présenter une structure tri-périodique du type gyroïde.

On a représenté à la figure 9 un exemple de répartition des canaux 400 qui possède un bon rapport entre surface d’ensemencement et homogénéité des forces de cisaillement.

Conformément à l’invention, le dispositif comporte une fenêtre optique 11, disposée au moins partiellement en regard de la surface d’entrée de fluide 21 du support de culture.

Le dispositif comporte au moins une entrée de fluide 12 et une sortie de fluide 13, entre lesquelles s’effectue la circulation du fluide.

Un organe d’étanchéité 70 peut être disposé dans la chambre de culture autour du support de culture 20, comme illustré.

Dans l’exemple considéré, l’entrée 12 et la sortie 13 se situent à l’opposé de la fenêtre optique 11, ce qui facilite la mise en place du dispositif 10 avec la fenêtre optique 11 en regard d’un instrument O, tel qu’un microscope confocal, comme illustré.

L’entrée 12 peut être décalée latéralement de l’axe optique de l’instrument O, lequel peut être confondu ou parallèle à l’axe X du support de culture 20.

La sortie 13 du dispositif peut être reliée à un ou plusieurs capteurs 30, pour analyser le milieu ayant perfusé à travers le support de culture 20.

On a représenté sur les figures 2 à 4 de manière plus détaillée un exemple de réalisation du dispositif 10 selon l’invention.

Le dispositif 10 comporte un corps 15 réalisé par exemple par usinage d’une matière thermoplastique compatible avec les applications biologiques, par exemple du PMMA (polyméthacrylate de méthyle), du PDMS (polydiméthylsiloxane) ou du PS (polystyrène), fermé inférieurement par une plaque de fond 16 réalisée dans une matière plastique transparente et dont la région positionnée en regard du support de culture définit la fenêtre optique 11. La plaque de fond 16 est par exemple en PMMA de qualité optique, et son épaisseur e est de préférence relativement faible, par exemple inférieure ou égale à 1 mm ou 0,5 mm.

Le dispositif 10 peut être réalisé autrement, en veillant de préférence à ce que la fenêtre optique reste d’épaisseur relativement faible, par exemple inférieure ou égale à 1 mm ou mieux inférieure ou égale à 0,5 mm.

Le corps 15 comporte un premier logement 40 agencé pour recevoir un embout 42 de raccordement d’une tubulure 43 d’amenée du fluide à l’entrée 12 du dispositif.

Le corps 15 comporte un deuxième logement 50 pour recevoir un insert 51, qui est en un matériau compatible avec la culture cellulaire, par exemple dans le même matériau que le corps 15, et vissé dans le logement 50. Ce logement débouche inférieurement sur la face inférieure 17 du corps 15 par une ouverture 19, par exemple de contour circulaire comme illustré.

L’insert 51 présente un logement 52 qui débouche supérieurement, et dans lequel est fixé un embout 59 de raccordement d’une tubulure 54 à la sortie 13 de fluide du dispositif.

Le logement 52 communique inférieurement par un canal 55 avec un collecteur 56 qui s’ouvre sur le support de culture 20.

Ce dernier est reçu dans un logement 60 de l’insert 51, ouvert vers le bas, délimité à sa périphérie par une lèvre annulaire 65 de même axe que le support de culture 20.

Un joint annulaire d’étanchéité 70, visible sur la figure 2, s’interpose radialement entre la lèvre 65 et le support de culture 20. Ce joint 70 est par exemple réalisé sur mesure en silicone de grade médical, et présente toute forme adaptée à l’obtention de l’étanchéité recherchée.

Sur la figure 2 le joint présente une forme cylindrique. De préférence, le joint 70 est réalisé avec une section en forme de trapèze rectangle, comme illustré à la figure 10, et la lèvre 65 de l’insert présente une surface radialement intérieure 65a conique convergeant vers la base de la lèvre. Cette surface vient en appui contre une surface conique du joint 70, de même pente, de telle sorte qu’un déplacement axial de la lèvre 65 lors du vissage de l’insert 51 s’accompagne d’un serrage radial du joint 70 contre le support de culture, par effet de coin. L’étanchéité peut être réalisée autrement encore, sans sortir du cadre de l’invention.

Un réseau 80 de micro-canaux est réalisé en creux sur la face inférieure 17 du corps 15.

Ce réseau 80 communique avec un canal d’amenée 81 réalisé dans le prolongement du logement 40.

Le réseau 80 comporte plusieurs étages successifs de ramifications, à savoir un premier étage comportant deux branches 82 en arc de cercle se raccordant au canal d’amenée par des canaux 83.

Chaque canal 82 communique à l’une de ses extrémités avec un deuxième étage comportant deux branches 84.

Chaque branche 84 communique à une extrémité avec un troisième étage comportant deux branches 85, lesquelles débouchent dans l’ouverture 19, à la périphérie de celle-ci.

Chaque paire de branches 85 du troisième étage de ramification est l’image d’une autre paire par une rotation de k*360°/8 autour de l’axe du logement 50, où k est un entier compris entre 1 et 7.

Le réseau de micro-canaux qui alimente le support de culture peut comporter, dans une variante non illustrée, un plus grand nombre de sorties.

La plaque de fond 16 peut être collée sur la face 17 en veillant à ne pas obturer le réseau 80 ni opacifier la fenêtre optique 11. La plaque de fond peut encore être fixée autrement.

En raison de la minceur de la fenêtre optique et de la faible épaisseur de la paroi 18 définissant le fond du logement 50 autour de l’ouverture 19, la face inférieure 21 du support de culture se trouve à une distance w relativement faible de la face intérieure du dispositif, comme on peut le voir sur la figure 4, ce qui facilite l’observation du support de culture 20 au microscope à travers la fenêtre optique 11.

La géométrie du collecteur 56 influence la distribution des forces de cisaillement au sein des canaux 400 du support de culture 20. Le collecteur 56 présente de préférence, comme illustré sur la figure 8, une surface conique 56a convergeant en éloignement de la face de sortie 22 du support de culture 20. L’angle b au sommet est de préférence supérieur à 90°, étant notamment compris entre 90° et 150°, étant par exemple de 120°. La présence d’une surface conique permet d’homogénéiser l’écoulement au sein du support de culture 20 par rapport aux sorties 85 du réseau de micro-canaux.

La surface conique 56a peut se prolonger en direction du support de culture par une surface cylindrique de révolution 56b, sur une distance t, cette dernière étant de préférence comprise entre 0 et 2 mm (bornes exclues), par exemple 0,5 mm.

La géométrie conique n’est qu’un exemple de mise en œuvre de l’invention. Dans le cas d’une géométrie de révolution autre que conique, par exemple une forme de dôme ou de cylindre, les dimensions de la surface dans l’axe X et notamment la dimension t, peuvent être différentes, et par exemple aller de 0 à 20mm, étant par exemple de 5mm.

Le dispositif 10 selon l’invention peut s’utiliser au sein d’un système microfluidique 1 tel que celui illustré aux figures 5A à 5C.

Ce système 1 peut comporter un automate 2 ayant une sortie de pression programmable 3. L’automate 2 est par exemple celui commercialisé par la société Elveflow.

Une première vanne 4 à trois voies permet d’envoyer la pression du gaz délivré par l’automate soit vers un premier réservoir 5a, soit vers un deuxième réservoir 5b.

Deux ensembles de vannes à trois voies 6a et 6b complètent le système 1. L’une des voies de ces vannes est reliée à un réservoir et l’autre, par l’intermédiaire d’un connecteur en T 110a ou 110b, à l’autre des réservoirs.

Plus précisément, l’une des entrées de la vanne 6a est reliée par l’intermédiaire d’un connecteur 110a au premier réservoir 5a, tandis que l’autre entrée est reliée par un conduit 111 au connecteur 110b. L’une des sorties de la vanne 6b est reliée par l’intermédiaire du connecteur 110b au réservoir 5b tandis que l’autre sortie est reliée par une conduite 112 au connecteur 110a. Sur la figure 5 A, les conduites 111 et 112 sont représentées en pointillées, pour matérialiser le fait qu’elles ne sont parcourues, dans la configuration illustrée des vannes 6a et 6b, par aucun flux. Plus généralement, sur les figures 5 A à 5C, on a représenté en trait plein une conduite parcourue par un flux, et en pointillés une conduite inactive.

La sortie de la vanne 6a peut être reliée par l’intermédiaire d’un débitmètre 107 puis d’un piège à bulles 108 à l’entrée du dispositif 10. Le débitmètre 107 peut fournir un signal de retour à l’automate 2 afin de lui permettre de respecter une valeur de consigne de débit en modulant la pression de gaz, par exemple. L’emplacement du débitmètre 107 est différent, dans une variante.

La sortie du dispositif 10 est reliée à un ou plusieurs capteurs 8 puis à l’entrée d’une vanne à trois voies 9. Ce ou ces capteurs permettent par exemple de doser le dioxygène dissous, le pH, le glucose, le lactate, ou autres métabolites et signaux spécifiques générés par l’activité des cellules et plus particulièrement des cellules osseuses, tels que les marqueurs ostéoblastiques (e.g., alkaline phosphatase and osteocalcine) et ostéocytaire (e.g., sclérostine), ou des adipocytes avec par exemple les marqueurs adiponectine et FABP4.

L’une des sorties de cette vanne 9 est reliée à un flacon de prélèvement d’échantillon 90, et l’autre des sorties est reliée à l’entrée de la vanne 6b.

De préférence toutes les vannes précitées sont pilotables automatiquement, ce qui permet un fonctionnement automatique.

Avec la position des vannes 4, 6a, 6b et 9 illustrée à la figure 5A, la pression délivrée par l’automate au réservoir 5a pousse le liquide contenu dans celui-ci vers la vanne 6a et le dispositif 10. Le fluide sortant de ce dernier gagne par le biais des vannes 9 et 6b le réservoir 5b, qui se remplit.

Ensuite, la position des vannes 4, 6a et 6b peut être inversée, comme illustré à la figure 5B. La pression pousse le liquide contenu dans le réservoir 5b vers le dispositif 10, tandis que le retour du fluide se fait dans le réservoir 5a.

En régime de perfusion à travers le support de culture 20, le fluide circule de bas en haut dans le dispositif 10, et l’observation au sein du volume du support de culture 20 peut se faire en temps réel au microscope confocal sans interrompre la circulation du fluide ni avoir à extraire le support de culture 20. Il est ainsi possible d’observer, par exemple, une croissance tissulaire. Le joint 70 assure une parfaite perfusion du support de culture 20. Parallèlement à l’observation du support de culture 20, le ou les capteurs 8 permettent le suivi de paramètres d’activité des cellules, sans intervention humaine. Le dispositif 10 permet d’assurer un contrôle précis des paramètres fluidiques traversant le support de culture 20.

Pour effectuer un prélèvement d’échantillon, la vanne 9 est actionnée pour diriger l’écoulement sortant du dispositif 10 vers le flacon 90, comme illustré à la figure 5C.

On peut placer plusieurs dispositifs selon l’invention en série, par exemple au moins deux, de telle sorte que l’écoulement sortant de l’un gagne l’entrée de l’autre. Cela peut permettre d’étudier les effets des sécrétions des cellules présentes sur le support de culture du dispositif amont sur celles du support de culture du dispositif situé en aval.

A titre d’exemple, on a représenté à la figure 6 un système comportant deux dispositifs 10 et 10’ selon l’invention, par exemple structurellement identiques, le système étant identique à celui des figures 5A à 5C hormis la présence du deuxième dispositif 10’ relié en série à la sortie du ou des capteurs 8 et la présence d’un ou plusieurs capteurs 8’ supplémentaires entre la sortie du deuxième dispositif 10’ et la vanne 9 servant au prélèvement d’échantillons.

Il peut ainsi être intéressant de mettre en série un dispositif selon l’invention avec une culture osseuse, avec une culture de cellules d’un autre organe ou tissu afin d’étudier les interactions entre les cellules osseuses et les cellules de cet autre organe ou tissu.

Le dispositif selon l’invention peut ainsi être disposé en série avec des cellules de :

- Muscle; voir la publication Bone and muscle: Interactions beyond mechanical [Brotto et al. 2015] ;

- Foie ; voir Bone disorders in chronic liver disease [Collier 2007] ;

- Rein ; voir Mineral and bone disorders in chronic kidney disease and end-stage renal disease patients: new insights into vitamin D receptor activation [Bover et al. 2011];

- Gros intestin ; voir The role of the gastrointestinal tract in calcium homeostasis and bone remodeling [Keller et al. 2013] , Understanding the Gut-Bone Signaling Axis [McCabe et al. 2017];

- Estomac ; voir Stomach and Bone [McCabe et al. 2017];

- Pancréas ; voir Skeleton and glucose metabolism : a bone-pancreas loop [Faienza et al. 2015];

- Glande parathyroïde ; voir Bone Health and Osteoporosis : A Report of the Surgeon General [Rockville 2004];

- Glande surrénale ; voir Bone Health and Osteoporosis : A Report of the Surgeon General [Rockville 2004];

- Tissus mous e.g., cellules adipeuses et tissu lymphoïde (lymphoid tissue) ; voir Bone Health and Osteoporosis : A Report of the Surgeon General [Rockville 2004], et Osteocytes Regulate Primary Lymphoid Organs and Fat Metabolism [Sato et al. 2013]

Sur la figure 7, on a illustré la possibilité de disposer plusieurs sous-systèmes de culture 200 en parallèle, avec mutualisation de certains éléments tels que par exemple l’automate 2, lorsque celui-ci est multivoie.

Pour réaliser l’ensemencement, on peut commander les vannes de façon à faire circuler alternativement le fluide dans un sens puis dans l’autre à travers le support de culture

20.

L’invention n’est pas limitée aux exemples qui viennent d’être décrits. Par exemple, l’observation du support de culture 20 peut s’effectuer par d’autres techniques d’imagerie, par exemple OCT.

Finalement, avec l’invention, on peut disposer d’un outil précis et fiable permettant d’ajuster un grand nombre de paramètres, et en particulier les conditions d’écoulement. Le dispositif est simple d’utilisation, reproductible, permet l’ensemencement du support de culture, le renouvellement du milieu et/ou le prélèvement d’échantillons de façon automatisée.

Le dispositif selon l’invention est également polyvalent, permettant d’accueillir aussi bien des supports de culture synthétiques que des expiants. Le support de culture peut présenter une géométrie autre.

Le système fluidique au sein duquel le dispositif selon l’invention est installé peut ne pas fonctionner avec recirculation du milieu.

Il est possible d’intégrer plusieurs types de cellules au sein d’un même support de culture (co-culture) afin d’étudier par exemple des effets de contact entre les cellules.

Claims

REVENDICATIONS

1. Dispositif de culture et/ou d’ensemencement cellulaire (10) comportant :

au moins une chambre de culture présentant au moins une fenêtre optique transparente (11), au moins une entrée de fluide (12) et au moins une sortie de fluide (13) communiquant avec la chambre de culture, au moins un support de culture tridimensionnel (20) disposé dans la chambre de culture, présentant des surfaces (21, 22) espacées le long d’un axe (X) du support de culture, le support de culture étant disposé dans la chambre de culture de manière à être traversé d’une surface à l’autre par l’écoulement circulant entre l’entrée de fluide et la sortie de fluide, et de manière à ce que l’une de ses surfaces, de préférence la face d’entrée du fluide, soit située au moins partiellement en regard de la fenêtre optique (11).
2. Dispositif selon la revendication 1, comportant au moins un réseau (80) de micro-canaux situé en série avec le support de culture (20).
3. Dispositif selon la revendication 2, le réseau de micro-canaux étant situé en amont du support de culture (20), ce réseau étant relié à l’entrée de fluide et comportant une pluralité de sorties (85) pour alimenter le support de culture.
4. Dispositif selon l’une des revendications précédentes, comportant un collecteur (56) débouchant sur une surface de sortie du support de culture (20), relié à la sortie de fluide (13), le collecteur (56) présentant de préférence une surface conique (56a) tournée vers le support de culture.
5. Dispositif selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, l’épaisseur de la fenêtre optique (11) étant inférieure ou égale à 1 mm, mieux comprise entre 0,2 et 1 mm.
6. Dispositif selon l’une quelconque des revendications précédentes, la fenêtre optique (11) étant définie par une plaque (16) rapportée sur un corps (15) présentant un logement (50) pour recevoir le support de culture.
7. Dispositif selon l’une quelconque des revendications précédentes, le support de culture (20) étant reçu de façon amovible dans la chambre de culture.
8. Dispositif selon l’une quelconque des revendications précédentes, comportant un joint d’étanchéité (70) disposé autour du support de culture (20).
9. Dispositif selon l’une quelconque des revendications précédentes, comportant un corps (15) définissant un logement (50) dans lequel est disposé le support de culture (20), et un insert (51) pour fermer au moins partiellement ledit logement, cet insert étant de préférence vissé dans le corps (15).
10. Dispositif selon les revendications 4 et 9, l’insert (51) définissant ledit collecteur (56).
11. Dispositif selon les revendications 8 et 9, l’insert (51) comportant une lèvre d’extrémité (65) engagée sur le joint d’étanchéité (70), et s’étendant de préférence sur une partie seulement de la hauteur du joint d’étanchéité.
12. Dispositif selon la revendication 11, le joint (70) présentant une surface radialement extérieure inclinée par rapport à son axe de symétrie, notamment une section en forme de trapèze rectangle, de telle sorte que le serrage axial de l’insert induise, par effet de coin, un serrage radial du joint.
13. Dispositif selon l’une quelconque des revendications 9 à 12, l’insert (51) présentant un ajour central (52) pour recevoir un embout (59) de connexion d’une tubulure de départ, cet embout étant de préférence vissé dans l’insert.
14. Dispositif selon l’une quelconque des revendications précédentes, avec rattachement à la revendication 2, le réseau (80) de micro-canaux étant configuré pour délivrer un même débit à 10% près, sur chacune de ses sorties (85).
15. Dispositif selon l’une quelconque des revendications précédentes, le support de culture présentant des canaux (400), le débit en sortie des canaux du support de culture étant homogène à mieux que 2%.
16. Dispositif selon l’une quelconque des revendications précédentes, avec rattachement à la revendication 2, le réseau (80) de micro-canaux s’étendant selon un plan perpendiculaire à l’axe (X) du support de culture (20).
17. Dispositif selon l’une des revendications précédentes, comportant un bloc présentant un logement (50) définissant au moins partiellement la chambre de culture, présentant une face d’appui (17) contre laquelle une plaque de fond (16) est rapportée, le réseau (80) de micro-canaux étant formé entre ladite face et la plaque de fond, les microcanaux étant de préférence formés en creux sur ladite face d’appui (17).
18. Dispositif selon l’une quelconque des revendications précédentes, le support de culture (20) ayant une forme extérieure présentant une symétrie axiale ou de révolution par rapport audit axe (X).
19. Dispositif selon l’une quelconque des revendications précédentes, l’entrée de fluide ( 12) et la sortie de fluide (13) étant disposées d’un même côté de la chambre de culture, de préférence son côté supérieur.
20. Dispositif selon l’une quelconque des revendications précédentes, le support de culture (20) comportant une pluralité de canaux parallèles (400), s’étendant entre les faces d’entrée et de sortie du support de culture, ces canaux ayant de préférence une section circulaire, les canaux étant de préférence parallèle à l’axe (X) du support de culture.
21. Dispositif selon l’une quelconque des revendications 1 à 19, le support de culture présentant une structure tri-périodique du type gyroïde.
22. Dispositif selon l’une quelconque des revendications précédentes, le volume extérieur du support de culture (20) étant compris entre 3,5 et 6300 mm³.
23. Dispositif selon l’une quelconque des revendications précédentes, avec rattachement à la revendication 2, les sorties du réseau (80) de micro-canaux présentant une symétrie axiale ou de révolution d’ordre deux au moins, mieux quatre au moins, encore mieux d’ordre huit au moins.
24. Dispositif selon l’une quelconque des revendications précédentes, avec rattachement à la revendication 2,1e réseau (80) de micro-canaux comportant au moins deux étages (82, 84, 85) de ramifications multiples.
25. Système (1) comportant un dispositif (10) selon l’une quelconque des revendications précédentes et un circuit fluidique pour faire circuler un milieu de culture dans la chambre de culture, ce milieu de culture gagnant la chambre de culture par ladite entrée de fluide et la quittant par ladite sortie de fluide, ledit circuit fluidique étant de préférence agencé pour établir une circulation ou recirculation du milieu de culture à travers la chambre de culture.
26. Système selon la revendication précédente, comportant au moins un capteur (8), notamment en sortie de la chambre de culture, capable de mesurer le dioxygène dissous, le pH, le glucose, le lactate, ou d’autres métabolites et signaux spécifiques générés par l’activité des cellules et plus particulièrement de cellules osseuses, tels que les marqueurs ostéoblastiques (e.g., alkaline phosphatase and osteocalcine) et ostéocytaire (e.g., sclérostine), ou des adipocytes avec par exemple les marqueurs adiponectine et FABP4.
27. Système selon l’une des revendications 25 et 26, comportant un microscope (O), de préférence confocal, disposé de façon à observer le support de culture (20), l’observation s’effectuant à travers ladite fenêtre optique (11 ).
28. Système selon l’une quelconque des revendications 25 à 27, comportant au moins deux dispositifs (10, 10’ ) selon l’une quelconque des revendications 1 à 23, reliés en série.
29. Procédé de culture cellulaire, dans lequel on cultive des cellules, notamment des cellules souches autres que des cellules souches embryonnaires humaines ayant été obtenues par un procédé ayant nécessité la destruction d’un embryon humain , ou des cellules osseuses, notamment ostéoblastes, ostéoclastes ou ostéocytes, sur un support de culture (20) d’un dispositif (10) selon l’une quelconque des revendications 1 à 24 ou d’un système (1) selon l’une des revendications 25 à 28.
30. Procédé selon la revendication 29, le système étant selon la revendication 28, les dispositifs en série (10, 10’) étant ensemencés avec des cellules de types différents.
31. Procédé selon la revendication 29, le support de culture (20) étant ensemencé avec au moins deux types de cellules.
32. Procédé selon l’une quelconque des revendications 29 à 31, dans lequel on effectue de façon automatisée l’ensemencement, la culture, les prélèvements et les analyses en ligne.
33. Procédé d’ensemencement cellulaire, dans lequel on ensemence avec des cellules, notamment des cellules souches autres que des cellules souches embryonnaires humaines ayant été obtenues par un procédé ayant nécessité la destruction d’un embryon humain , ou des cellules osseuses, notamment ostéoblastes, ostéoclastes ou ostéocytes, un support de culture (20) d’un dispositif (10) selon l’une quelconque des revendications 1 à 24 ou d’un système (1) selon l’une des revendications 25 à 28.