EP3728556A1 - Puce micro-fluidique, laboratoire sur puce micro-fluidique, procédé de fabrication d'une telle puce et procédé d'analyse - Google Patents

Puce micro-fluidique, laboratoire sur puce micro-fluidique, procédé de fabrication d'une telle puce et procédé d'analyse

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EP3728556A1
EP3728556A1 EP18845401.1A EP18845401A EP3728556A1 EP 3728556 A1 EP3728556 A1 EP 3728556A1 EP 18845401 A EP18845401 A EP 18845401A EP 3728556 A1 EP3728556 A1 EP 3728556A1
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EP
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analysis
well
analysis chamber
chamber
channel
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EP18845401.1A
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Sarah Milgram
Damien FLEURY
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Nanobiose
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Nanobiose
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Pending legal-status Critical Current

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    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/16—Microfluidic devices; Capillary tubes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
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    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
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    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
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    • B01L2300/0864—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices comprising only one inlet and multiple receiving wells, e.g. for separation, splitting

Definitions

  • a first well intended to receive a biological sample, the substrate defining sidewalls and at least one bottom or top wall of the first well, the first well opening on the surface of a face of the substrate,
  • first inlet and the first outlet of the first well define a different first axis and not parallel to a second axis defined by the first analysis input and the discharge outlet of the first analysis chamber
  • first analysis chamber is closed by an analysis wall comprising capture elements configured to capture at least one biomarker of the first liquid flowing in the first analysis chamber, the analysis wall being mounted in detachable manner with respect to the substrate.
  • the microfluidic chip 1 comprises a first input channel 4a intended to feed the first well 2a.
  • the first input channel 4a opens into the first well 2a by means of the first input.
  • the first input channel 4a is intended to be connected to a flow generator which feeds the microfluidic chip 1 with a liquid or several different liquids.
  • the first input channel 4a ends with the first input.
  • the directions of flow are defined by the axes of revolution.
  • the capturing elements 6a can also be configured to fix the revealing reagent and thus allow a positive revealing control.
  • the analysis surface may include areas with positive revealing controls and / or areas with biomarker-specific sensors, as well as positional markers that are visible when acquiring the signal or measurement.
  • the chip advantageously comprises an additional channel which is connected to the first outlet channel 5a between the outlet of the first well 2a and the first analysis chamber 3a at a first junction. In this way, the developing reagent can be mixed with the liquid leaving the first well 2a without interfering with the cell culture.
  • the wall presenting the analysis surface can be transparent to optical wavelengths. It can also be performed in a non-self-fluorescent material to allow the use of fluorescence microscopy as an analytical technique.
  • Wall analysis is preferably made of glass, plastic or composite material and covered or not with a thin metal layer, polymer or chemical functionalization.
  • the chip comprises an additional channel 4b / 5b connected to the first output channel 5a between the output of the first well 2a and the first analysis chamber 3a.
  • the outlet channel 5a is intended to be fed with an additional stream which is advantageously a liquid which contains a revelation reagent.
  • the first well 2a can be fed with a second liquid comprising a second composition.
  • the first well 2 is fed with a second flow and a second pressure, at least one parameter chosen from the second composition, the second flow and the second pressure being respectively different from the first composition, the first flow and the first pressure.
  • the cell culture emits biomarkers in response to the second liquid.
  • the first and second fluid supply is configured for the biomarkers to reach the analysis chamber 3.
  • the biomarkers are picked up by the probes 6a and it is possible to compare the difference in response between the first liquid and the second liquid for a second time. same cell culture in the same chip. By changing the pressure and / or the flow, it is possible to simulate a mechanical stress on the cell culture.
  • the biomarkers representative of the cellular response contained in the liquid from the cell culture wells are then captured on the probes 6a present in the analysis chamber 3. If necessary, a revelation reagent is brought into contact with the biomarkers captured on the cells. probes 6a to highlight an analyzable signal.

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Abstract

La puce micro-fluidique (1) comporte : • au moins un canal d'entrée (4) connecté à au moins un puits (2), chaque puits (2) étant associé à un canal de sortie (5), • au moins une chambre d'analyse (3a, 3b) connectée à au moins un puits (2). • une surface d'analyse (6) comportant des éléments de captation (6a) capturant des biomarqueurs présents dans le liquide issu du puits (2) et représentatifs de la réponse cellulaire d'un échantillon biologique contenu dans le puits (2). Un flux de liquide s'écoule depuis le puits (2) vers la surface d'analyse (6) comportant les éléments de captation (6a). Le flux de liquide est compris entre 0,1µL/min et 2 mL/min et s'écoule de façon laminaire dans la chambre d'analyse (3a, 3b). La puce (1) fait partie d'un laboratoire sur puce micro-fluidique muni d'un générateur de flux appliquant plusieurs liquides différents.

Description

Puce micro-fluidique, laboratoire sur puce-micro-fluidique, procédé de fabrication d’une telle puce et procédé d’analyse
Domaine technique de l'invention
L’invention est relative à une puce micro-fluidique, à un laboratoire sur puce micro- fluidique, à un procédé de fabrication d’une puce micro-fluidique et à un procédé d’analyse.
État de la technique
Pour détecter, identifier et suivre la réponse de cellules à des stimuli biologiques (virus, bactéries, etc.), chimiques (médicaments, etc.) ou mécaniques (application d’un flux à travers les cellules, d’une pression, d’une contrainte de cisaillement, etc.), un profil cytokinique peut être établi. Pour cela, il faut connaître la nature des cytokines sécrétées par les cellules, leur quantité ainsi que la cinétique de sécrétion des cytokines.
A l’heure actuelle, les techniques et équipements disponibles pour réaliser ce type d’étude sont complexes et nécessitent de nombreuses étapes expérimentales ce qui rend ces approches peu utiles d’un point de vue industriel ou quasi-industriel. Les cellules doivent d’abord être mises en cultures avant que le résultat d’une réaction soit prélevé et analysé. L’analyse comportera alors plusieurs étapes de marquage, lavage, révélation et analyse. Ces étapes sont à la fois longues et coûteuses. Le résultat n’est accessible que plusieurs heures, voire plusieurs jours après la réalisation de l’expérience de biologie cellulaire.
Aussi, pour réduire la durée des analyses et leur coût, la quantité d’échantillons analysés et leur temps d’exposition sont réduits au strict minimum. Cependant, lorsque la quantité d’échantillons et/ou le temps d’analyse sont trop réduits, cela peut conduire à des résultats qui reflètent mal la réponse réelle du système immunitaire car les équipements et/ou les protocoles ne sont pas adaptés. Pour remédier à ce problème, différents dispositifs sont développés. Selon l’approche proposée dans le document intitulé « Reconfigurable microfluidic device with integrated antibody arrays for capture, multiplexed stimulation and cytokine profiling of human monocytes », Vu et al., Biomicrofluidics 9, 04415 (2015), plusieurs populations de cellules sont capturées et organisées en deux dimensions sur des zones spécifiques d’une surface d’analyse. Un système de perfusion monté sur la surface d’analyse permet le multiplexage, c’est-à-dire qu’il est choisi pour pouvoir observer simultanément la réponse cytokinique générée par plusieurs types de stimuli biochimiques après la perfusion. Les cytokines produites en réponse aux différents stimuli sont capturées sur d’autres zones spécifiques de la surface d’analyse et révélées grâce à des réactifs spécifiques. La capture des cellules par leurs récepteurs membranaires et leur organisation en 2D crée un environnement de culture cellulaire sensiblement éloigné des conditions physiologiques.
Selon un autre axe d’amélioration, Prot et al. proposent dans la publication intitulée « Integrated proteomic and transcriptomic investigation of the acetaminophen toxicity in liver microfluidic biochip » (PLoS One, 2011. 6(8) : p.212-68) d’utiliser la micro- fluidique afin de cultiver des cellules de foie dans un environnement tridimensionnel et sous perfusion continue de nutriments et molécules toxiques. Les analyses réalisées a posteriori permettent de quantifier la toxicité des molécules testées de façon plus précise et plus sûre que dans les conditions de culture en 2D et sans perfusion. Les résultats obtenus en 3D étaient en effet plus proches de ceux observés chez l’animal de laboratoire.
Par ailleurs, dans la publication intitulée « High-Content Quantification of Single-Cell Immune Dynamics » (Cell Reports, Volume 15, 2016), Junkin et al. divulguent un dispositif micro-fluidique dans lequel plusieurs tests biologiques peuvent être réalisés en parallèle, et dans lequel les cellules sont placées sous perfusion de sorte à réaliser des analyses dynamiques. Le système micro-fluidique est couplé à un microscope de fluorescence afin d’observer en temps réel la réponse de plusieurs cellules individualisées, c’est-à-dire isolées les unes des autres. Ces dispositifs micro-fluidiques tentent d’améliorer les conditions d’analyse de la réponse immunitaire d’une culture cellulaire. Mais ces améliorations ne sont pas suffisantes pour être en accord avec les attentes du marché, qui souhaite obtenir un dispositif peu coûteux, permettant la réalisation d’analyses complexes, et fournissant des résultats rapides et fiables.
Objet de l'invention
Un objet de l’invention consiste à proposer une puce micro-fluidique permettant de connaître la réponse d’un échantillon cellulaire en réalisant des analyses complexes associant un environnement cellulaire plus physiologique et une détection multiparamétriques de biomarqueurs en continue et en fournissant un résultat utilisable plus rapidement qu’avec les solutions proposées par l’art antérieur.
La puce est remarquable en ce qu’elle comporte :
• un premier puits destiné à recevoir un échantillon biologique, le substrat définissant des parois latérales et au moins une paroi de fond ou de sommet du premier puits, le premier puits débouchant à la surface d’une face du substrat,
• un premier canal d’entrée destiné à alimenter le premier puits avec un premier liquide, le premier canal d’entrée se terminant par une première entrée débouchant dans le premier puits,
• un premier canal de sortie ayant une première extrémité formée par une première sortie du premier puits pour évacuer le premier liquide,
• une première chambre d’analyse possédant une première entrée d’analyse connectée au premier puits au moyen du premier canal de sortie et une sortie d’évacuation débouchant dans la première chambre d’analyse et distincte de la première entrée d’analyse, la première chambre d’analyse possédant un fond formé par le substrat,
en ce que la première entrée et la première sortie du premier puits définissent un premier axe différent et non parallèle à un deuxième axe défini par la première entrée d’analyse et la sortie d’évacuation de la première chambre d’analyse, et en ce que la première chambre d’analyse est fermée par une paroi d’analyse comportant des éléments de captation configurés pour capturer au moins un biomarqueur du premier liquide circulant dans la première chambre d’analyse, la paroi d’analyse étant montée de manière amovible par rapport au substrat.
De manière avantageuse, le premier puits est fermé au moyen d’une couche de couverture distincte de la paroi d’analyse de manière à pouvoir démonter la paroi d’analyse indépendamment de la couche de couverture.
Dans un développement, la couche de couverture est montée de manière amovible par rapport à la face du substrat.
Dans un mode de réalisation particulier, la couche de couverture définit au moins un orifice traversant formant un anneau entourant la sortie du premier canal de sortie, l’anneau défini dans la couche de couverture formant complètement ou partiellement les parois latérales de la première chambre d’analyse, la face du substrat formant une paroi de fond de la première chambre d’analyse.
Dans une configuration préférentielle, les parois latérales de la première chambre d’analyse sont partiellement formées dans le substrat, la première chambre d’analyse étant formée par une première cavité débouchant sur la face du substrat, la couche de couverture définissant un anneau entourant la première cavité et formant partiellement les parois latérales de la première chambre d’analyse.
Dans un mode de réalisation alternatif, les parois latérales du premier canal de sortie sont formées par une rainure dans la face du substrat, la couche de couverture refermant le premier puits et le premier canal de sortie jusqu’à la première chambre d’analyse.
Dans une configuration avantageuse, le premier canal de sortie est défini par une rainure formée dans la couche de couverture qui referme le premier puits. De manière préférée, un canal additionnel est connecté au premier canal de sortie entre la sortie du premier puits et la première chambre d’analyse. Le canal additionnel est avantageusement formé par une rainure additionnelle dans la face du substrat et/ou dans la couche de couverture.
Il est avantageux de prévoir que la première chambre d’analyse comporte des première et deuxième entrées d’analyse définissant respectivement des première et deuxième directions d’introduction de liquide dans la première chambre d’analyse. Les première et deuxième entrées d’analyse sont agencées de sorte que les première et deuxième directions d’introduction de liquide soient sécantes dans la première chambre d’analyse.
Préférentiellement, la puce comporte une évacuation reliée à la sortie d’évacuation de la première chambre d’analyse et des premier et deuxième septums configurés pour fermer de manière étanche le premier canal d’entrée et l’évacuation.
Dans un autre développement, la distance séparant la paroi d’analyse et le fond de la première chambre d’analyse est inférieure à 2 mm.
L’invention a également pour objet un laboratoire sur puce qui est compact tout est restant particulièrement efficace.
Le Laboratoire sur puce micro-fluidique est remarquable en ce qu’il comporte :
• une puce micro-fluidique selon l’un des modes de réalisation précédents, la puce micro-fluidique comportant une couche de couverture refermant le premier puits et une paroi d’analyse refermant la première chambre d’analyse de manière amovible, la paroi d’analyse étant munie d’éléments de captation configurés pour capturer au moins un biomarqueur du liquide circulant dans la première chambre d’analyse et issu du premier puits ;
• un générateur de flux connecté au premier canal d’entrée de la puce micro- fluidique, le générateur de flux étant configuré pour émettre au moins un premier flux de liquide destiné à traverser au moins le premier puits rempli par un échantillon cellulaire et la chambre d’analyse, le premier flux de liquide ayant un débit compris entre 0,1mI_/itiίh et 2 mL/min de sorte que le flux de liquide qui s’écoule dans la première chambre d’analyse soit laminaire dans au moins une moitié de la première chambre d’analyse comportant la sortie d’évacuation.
Dans un développement, le générateur de flux est connecté à un canal additionnel de la puce micro-fluidique et dans lequel le générateur de flux est configuré pour :
• appliquer un premier flux sur le premier canal d’entrée de manière à alimenter le premier puits pendant une première période, le premier flux comportant un premier liquide comprenant au moins des nutriments,
• appliquer un flux additionnel sur le canal additionnel, le flux additionnel comportant des réactifs configurés pour réagir avec des biomarqueurs caractéristiques d’une réponse cellulaire de l’échantillon biologique contenu dans le premier puits, les éléments de captation étant configurés pour capter et/ou réagir avec les biomarqueurs.
L’invention a également pour objet un procédé de réalisation d’une puce qui est facile à mettre en œuvre.
Le procédé est remarquable en ce qu’il comporte les étapes successives suivantes :
- fournir une puce micro-fluidique selon l’un des modes de réalisation précédents,
- refermer le premier puits au moyen d’une couche de couverture qui forme au moins partiellement les parois latérales de la première chambre d’analyse,
- refermer la première chambre d’analyse au moyen d’une paroi d’analyse comportant des éléments de captation configurés pour capturer des constituants du liquide circulant dans la première chambre d’analyse.
Un autre objet de l’invention consiste à proposer un procédé d’analyse d’une culture cellulaire au moyen d’une puce micro-fluidique. Le procédé permet de réaliser des analyses complexes, de manière rapide et efficace, afin de connaître la réponse d’une culture cellulaire face à plusieurs types de stimuli (substance chimique, biochimique, biologique, pharmaceutique, stress mécanique, rayonnement, matériau, etc.).
Pour cela, le procédé d’analyse d’une culture cellulaire comporte :
• fournir une puce micro-fluidique comportant :
o un premier puits rempli par un échantillon cellulaire émettant une première réponse cellulaire contenant au moins un biomarqueur;
o une première chambre d’analyse possédant une première entrée d’analyse connectée fluidiquement au premier puits au moyen d’un premier canal de sortie et une sortie d’évacuation débouchant dans la première chambre d’analyse et distincte de la première entrée d’analyse,
o des éléments de captation disposés sur une paroi de la première chambre d’analyse, les éléments de captation étant configurés pour capturer au moins un biomarqueur représentatif de la première réponse cellulaire circulant depuis le premier puits jusqu’à la première chambre d’analyse ;
• appliquer un premier flux de liquide alimentant le premier puits de sorte que la première réponse cellulaire soit emmenée depuis le premier puits jusqu’à la sortie d’évacuation à travers la première chambre d’analyse, ledit au moins un biomarqueur circulant dans la première chambre d’analyse pour être capté par les éléments de captation,
• analyser les éléments de captation.
Selon un mode de réalisation particulier de l’invention, le procédé comporte la fourniture d’au moins un réactif de révélation configuré pour réagir avec ledit au moins un biomarqueur représentatif de la première réponse cellulaire capté par les éléments de captation, ledit au moins un réactif de révélation traversant la première chambre d’analyse simultanément ou postérieurement au passage dudit au moins un biomarqueur dans la première chambre d’analyse, l’analyse des éléments de captation étant réalisée en recherchant ledit au moins un réactif de révélation. De manière préférée, le procédé comporte appliquer un deuxième flux sur une entrée additionnelle de la puce micro-fluidique, l’entrée additionnelle débouchant dans le premier canal de sortie par une première jonction se trouvant entre le premier puits et la première chambre d’analyse de sorte que le deuxième flux pénètre dans la première chambre d’analyse, le deuxième flux comportant ledit au moins un réactif de révélation de sorte que ledit au moins un réactif de révélation soit dépourvu de contact avec l’échantillon cellulaire.
Selon un mode de réalisation spécifique, le procédé comporte le remplissage du premier canal de sortie, après la première jonction, alternativement par le premier flux comportant ledit au moins un biomarqueur et par le deuxième flux comportant ledit au moins un réactif de révélation.
Selon un mode de réalisation alternatif, la première jonction est associée à un mélangeur configuré pour mélanger le premier flux avec le deuxième flux dans le premier canal de sortie après la première jonction.
Dans un autre développement, la puce micro-fluidique comporte un deuxième puits comportant un échantillon cellulaire additionnel émettant une deuxième réponse cellulaire avec au moins un biomarqueur additionnel, le deuxième puits étant connecté fluidiquement à la première chambre d’analyse par un deuxième canal de sortie rejoignant le premier canal de sortie avant la première chambre d’analyse, le générateur de flux alimentant les premier et deuxième puits de manière à emmener le biomarqueur et le biomarqueur additionnel représentatifs respectivement des première et deuxième réponses cellulaires dans la première chambre d’analyse et délivrer des premier et deuxième flux laminaires à l’intérieure de la première chambre d’analyse, le biomarqueur et le biomarqueur additionnel étant présents respectivement dans les premier et deuxième flux laminaires.
Dans un mode de réalisation particulier, le premier puits est rempli par l’échantillon cellulaire avant la fermeture du premier puits par une couche de couverture, la couche de couverture formant au moins partiellement les parois latérales de la première chambre d’analyse.
De manière avantageuse, la première chambre d’analyse est fermée au moyen d’une paroi d’analyse comportant les éléments de captation.
Préférentiellement, le procédé d’analyse comporte le démontage de la paroi d’analyse pour réaliser l’analyse des éléments de captation hors de la première chambre d’analyse.
Dans un mode de réalisation particulier, la puce est définie dans un substrat A, le substrat A définissant un fond et une paroi latérale du premier puits et une rainure formant le premier canal de sortie et dans lequel le procédé d’analyse comporte la fermeture de manière étanche du premier puits et du premier canal de sortie au moyen d’un couche de couverture amovible.
Selon un mode de réalisation alternatif, la couche de couverture définit une ouverture formant un anneau fermé autour de la première chambre d’analyse et dans lequel le procédé comporte, après l’installation de la couche de couverture, l’installation d’une surface d’analyse fermant la première chambre d’analyse de manière étanche, la surface d’analyse comportant les éléments de captation.
Selon un mode de réalisation spécifique, les parois latérales du premier canal de sortie sont au moins partiellement formées dans la couche de couverture.
Description sommaire des dessins
D'autres avantages et caractéristiques ressortiront plus clairement de la description qui va suivre de modes particuliers de réalisation de l'invention donnés à titre d'exemples non limitatifs et représentés aux dessins annexés, dans lesquels :
- la figure 1 représente une puce micro-fluidique selon un premier mode de réalisation, - la figure 2 représente une puce micro-fluidique selon un deuxième mode de réalisation,
- la figure 3 représente une vue éclatée d’une puce micro-fluidique selon un mode de réalisation de l’invention,
- la figure 4 représente un laboratoire sur puce micro-fluidique utilisant la puce de la figure 3 après assemblage des différentes pièces, ainsi qu’un générateur de flux, le flux étant schématisé par des flèches au niveau des entrées.
- la figure 5 représente un autre mode de réalisation d’une puce micro-fluidique,
- les figures 6 et 7 représentent d’autres modes de réalisation d’une puce micro- fluidique.
Description détaillée
Une puce micro-fluidique peut avantageusement être utilisée dans le cadre d’analyses biomédicales et/ou biologiques, par exemple pour comprendre l’impact de stress chimiques, biologiques et/ou mécaniques sur le système immunitaire. Il est également possible de suivre l’impact d’un matériau ou d’un rayonnement.
Comme illustré sur les différentes figures, la puce micro-fluidique 1 comporte au moins un premier puits 2a destiné à recevoir un échantillon biologique composé en partie de cellules vivantes, par exemple : des tissus, une biopsie, des organoïdes et/ou une culture cellulaire eucaryote ou procaryote. A titre d’exemple, il est considéré que la puce 1 est associée à une culture cellulaire dans la suite de la description. Le premier puits 2a comporte un fond, une paroi latérale et un sommet. Le premier puits 2a est un puits de culture cellulaire, c’est-à-dire qu’il est destiné à contenir des cellules à analyser ou qu’il est destiné à contenir des cellules d’une culture cellulaire.
Le premier puits 2a possède une première entrée qui débouche dans le premier puits 2a ainsi qu’une première sortie qui débouche dans le premier puits 2a et distincte de la première entrée. Ainsi, il est possible d’avoir un flux de liquide qui traverse le premier puits 2a pour se rapprocher des conditions in-vivo. Le premier puits 2a est réalisé dans un substrat A qui définit les parois latérales du puits et avantageusement le fond et/ou le sommet du puits 2a. Selon les modes de réalisation, le substrat A peut être formé par un seul matériau ou par plusieurs matériaux, par exemple par un empilement de plusieurs couches différentes. Le substrat A est préférentiellement monobloc.
La puce micro-fluidique 1 comporte encore une première chambre d’analyse 3a possédant une première entrée d’analyse. La première chambre d’analyse 3a est destinée à l’analyse de molécules présentes dans le liquide provenant du puits 2a et représentatives de la réponse cellulaire.
La puce micro-fluidique 1 comporte un premier canal d’entrée 4a destiné à alimenter le premier puits 2a. Le premier canal d’entrée 4a débouche dans le premier puits 2a au moyen de la première entrée. Le premier canal d’entrée 4a est destiné à être connecté à un générateur de flux qui alimente la puce micro-fluidique 1 avec un liquide ou plusieurs liquides différents. Le premier canal d’entrée 4a se termine par la première entrée.
La puce comporte encore un premier canal de sortie 5a destiné à évacuer le premier liquide hors du puits 2a. Le premier canal de sortie 5a possède une première extrémité formée par la première sortie du puits 2a. Le canal d’entrée 4a, le premier puits 2a et le premier canal de sortie 5a sont montés en série selon l’écoulement du fluide.
La première chambre d’analyse 3a est connectée au premier puits 2a au moyen du premier canal de sortie 5a. La première chambre d’analyse 3a possède une première entrée d’analyse disposée à une première extrémité de la chambre 3a et une première sortie d’évacuation qui est disposée à distance de la première entrée d’analyse. La première entrée d’analyse et la première sortie d’évacuation définissent l’écoulement du liquide à l’intérieur de la première chambre d’analyse 3a. De manière avantageuse, la première sortie d’évacuation est disposée à une extrémité opposée à la première entrée d’analyse. La première chambre d’analyse 3a est dissociée du premier puits 2a pour faciliter l’analyse et éventuellement ne pas perturber les cellules présentes dans le premier puits 2a avec des produits réactifs utilisés pour observer et/ou analyser la réponse cellulaire. La chambre d’analyse 3a reçoit le liquide issu du puits 2a et comportant des éléments représentatifs de la réponse cellulaire ou biomarqueurs au moyen du premier canal de sortie 5a de sorte que la chambre d’analyse 3a reçoive en continu une information représentative de la réponse cellulaire. Préférentiellement, la chambre d’analyse 3a est séparée du premier puits 2a par un canal de sortie qui représente un volume de liquide inférieur à 100mί de sorte que l’information produite par le premier puits 2a arrive rapidement dans la chambre d’analyse 3a. Cette configuration permet de suivre, dans le temps, la réaction des cellules se trouvant dans le puits 2a en limitant la perturbation introduite par l’analyse de la réponse cellulaire.
La chambre d’analyse 3a est refermée par une paroi d’analyse 6. La paroi d’analyse 6 est en contact avec le liquide qui traverse la chambre d’analyse et qui provient du puits 2a. La paroi d’analyse 6 présente une surface d’analyse sur laquelle sont installés des dispositifs de captation ou sondes 6a qui capturent certains éléments du liquide qui circulent dans la chambre d’analyse 3a afin de permettre leur détection.
Le puits 2a possède des dimensions réduites afin de réduire la quantité de cellules utilisées ainsi que la quantité de réactifs à utiliser. Cependant, pour obtenir ou mesurer un signal suffisant pour réaliser les analyses, il faut prévoir une configuration de puits 2a qui facilite la stimulation des cellules et/ou la récupération des produits issus de la réaction des cellules sans avoir besoin d’appliquer une pression importante dans la puce et notamment dans le puits 2a. De manière avantageuse, le volume du premier puits 2a est inférieur à 1 mL ce qui permet de limiter l’encombrement du puits sans pénaliser la mesure. De manière également avantageuse, le volume du premier puits 2a est supérieur à 5mI. Il est particulièrement avantageux d’utiliser un puits permettant l’installation d’un support de culture cellulaire tridimensionnel afin de se rapprocher des conditions in- vivo. Outre l’organisation tridimensionnelle des cellules qui est plus physiologique, l’avantage des supports de culture ou matrices tridimensionnels est d’augmenter la surface de culture par unité de volume du puits. Cela permet d’avoir plus de cellules sécrétant des biomarqueurs donc plus de biomarqueurs par unité de volume, et ainsi de diminuer la limite de détection de la réponse cellulaire. Il est particulièrement avantageux d’utiliser un support texturé ou poreux pour augmenter la surface de culture. Chacune des trois dimensions du puits 2a est supérieure à IOOmΐti et de préférence inférieure à 10mm. La hauteur du puits est avantageusement supérieure ou égale au rayon hydraulique du puits.
Les inventeurs proposent de placer judicieusement l’entrée en liquide et la sortie en liquide pour assurer un écoulement homogène dans la majorité du puits afin d’avoir une réponse cellulaire proche des conditions in-vivo.
Le premier canal d’entrée définit une première direction d’écoulement du liquide. Le premier canal de sortie définit une deuxième direction d’écoulement. Les inventeurs ont observé que pour avoir une plus grande efficacité dans la stimulation de la culture cellulaire, il est intéressant de prévoir que les première et deuxième directions d’écoulement ne soient pas alignées. Ainsi, les nutriments et les molécules à tester sont mieux répartis à l’intérieur du premier puits 2a.
Lorsque les canaux d’entrée et de sortie possèdent un axe de révolution, les directions d’écoulement sont définies par les axes de révolution.
Le décalage des directions d’écoulement permet de limiter les zones de stagnation de liquide dans le puits 2, c’est-à-dire les volumes morts. La proportion de l’échantillon biologique fonctionnant dans un état statique est réduite ce qui améliore la qualité du signal cellulaire obtenu. Cette configuration permet d’assurer que les produits provenant de l’entrée soient mis en présence de la majorité des cellules. Avantageusement, l’entrée et la sortie du premier puits 2a définissent un premier axe différent et non parallèle d’un deuxième axe défini par l’entrée et la sortie de la chambre d’analyse 3a. L’entrée et la sortie du puits 2a sont avantageusement agencées pour que le flux à l’intérieur du puits 2a se déplace majoritairement selon un axe longitudinal du puits, par exemple, son axe de révolution. Dans cette configuration, les cellules disposées dans le puits 2a se trouvent en contact avec le flux de liquide ce qui permet notamment une meilleure réponse cellulaire et donc une analyse plus fiable avec une faible quantité de cellules utilisées.
Cette configuration permet de coupler un puits de culture cellulaire tridimensionnelle 2 avec une chambre d’analyse 3a bidimensionnelle. La chambre d’analyse 3a présente un rapport entre le volume de chambre et la surface des parois latérales de la chambre 3a qui est nettement plus important que le rapport entre le volume du puits et la surface des parois latérales du puits 2a. Cette configuration maximise la surface des parois de sommet et fond de la chambre d’analyse par unité de volume. Ceci permet d’optimiser l’utilisation d’une surface d’analyse en favorisant le contact des molécules à détecter avec les dispositifs de captation 6a présents sur la surface d’analyse. Le principal avantage d’une surface d’analyse plane ou sensiblement plane est la compatibilité avec les instruments de détection optiques classiques. De plus, une telle analyse en surface facilite la possibilité de multiplexage de la détection, c’est-à-dire la possibilité de multiplier le nombre de molécules différentes détectées en multipliant le nombre de dispositifs de captation 6a différents présents sur la surface d’analyse.
La première entrée et la première sortie peuvent déboucher dans une paroi de fond, de sommet ou sur une paroi latérale du premier puits 2a à proximité du fond ou du sommet.
Le fond du puits 2a est séparé du sommet du puits 2a par une première distance selon l’axe longitudinal. Il est avantageux de prévoir que la première entrée soit séparée de la première sortie d’une distance au moins égale à la moitié de la première distance selon l’axe longitudinal. Pour faciliter la stimulation des cellules et la récupération de la réponse cellulaire, de manière encore plus avantageuse, l’entrée est séparée de la sortie d’une distance au moins égale à 75% de la première distance selon l’axe longitudinal.
De manière préférentielle, la première sortie vient en contact d’une paroi de fond ou de sommet du puits 2a lorsque ce dernier est fermé. En alternative, la première sortie est formée dans une paroi de sommet ou de fond et préférentiellement selon un axe non perpendiculaire à l’axe longitudinal.
Dans un mode de réalisation particulier, la première sortie et la première entrée sont disposées sur des parois latérales du puits 2a. Ce mode de réalisation est particulièrement avantageux pour observer la culture cellulaire par microscopie.
Dans un mode de réalisation avantageux, l’entrée en liquide est réalisée dans le fond du puits 2a. Il est avantageux d’avoir un canal d’entrée 4a dont l’axe longitudinal est non parallèle, par exemple perpendiculaire à l’axe longitudinal du canal de sortie 5a. Cependant, ce mode de réalisation rend plus difficile l’observation de la culture cellulaire par voie optique.
Dans un mode de réalisation avantageux, dans un plan de coupe perpendiculaire à la hauteur du puits 2a, le puits présente des dimensions transversales comprises entre IOOmiti et 10mm pour limiter le volume du puits 2a et l’encombrement du puits 2a. Le volume du puits 2a étant réduit, il en va de même de la quantité de cellules.
De manière avantageuse, le puits 2a est une cavité ayant un volume de révolution. La section de la cavité peut être carrée, rectangulaire, circulaire, ovoïde ou quelconque. La section est observée selon un premier plan qui est avantageusement parallèle à la surface supérieure et/ou inférieure du substrat qui définit le puits. Avantageusement, le puits 2 est un cylindre circulaire droit ce qui fournit une configuration plus proche des conditions in-vivo. Dans un mode de réalisation particulier, les parois du puits 2a ou au moins une partie des parois du puits 2a sont recouvertes par un revêtement configuré pour permettre l’adhésion des cellules et les maintenir à l’intérieur du puits 2a. Selon les configurations, seules les parois latérales sont recouvertes de revêtement configuré pour permettre l’adhésion des cellules ou en alternative les parois latérales et le sommet sont recouverts par le revêtement. Il est encore possible de prévoir que le fond soit également recouvert de revêtement permettant l’adhésion des cellules.
En alternative ou en complément, les cellules sont mises en culture dans un ou plusieurs supports tridimensionnels placés à l’intérieur du puits 2a de manière à créer une structure de culture cellulaire tridimensionnelle. Les supports tridimensionnels peuvent être des matrices ou des gels en fonction du type de cellules étudiées. Le fait de réaliser des cultures cellulaires tridimensionnelles permet de s’approcher des conditions in vivo, et donc de se rapprocher de la réponse réelle d’un organisme vivant.
La première chambre d’analyse 3a comporte un fond, des parois latérales et un sommet. La première chambre d’analyse 3a collecte le liquide qui sort du puits 2a et les constituants de ce liquide sont capturés sur la surface d’analyse 6a. Le ou les constituants sont représentatifs de la réponse cellulaire, c’est-à-dire de la réponse de la culture cellulaire.
Préférentiellement, la chambre d’analyse 3a est configurée pour présenter une largeur plus importante que celle du canal de sortie 5a qui provient du puits 2a.
L’augmentation de la largeur est mesurée selon une direction perpendiculaire à l’axe de transit du flux de liquide dans la chambre d’analyse 3a et de préférence selon une direction horizontale en fonctionnement.
Dans un mode de réalisation particulier, la profondeur de la chambre d’analyse 3a est identique à la profondeur du canal de sortie 5a. La profondeur est mesurée perpendiculairement au fond de la chambre d’analyse et/ou à la surface d’analyse. Dans une alternative de réalisation, la profondeur de la chambre d’analyse 3a est supérieure à la profondeur du canal de sortie 5a. Dans un autre mode de réalisation, la profondeur de la chambre d’analyse 3a est inférieure à la profondeur du canal de sortie 5a.
Dans un mode de réalisation particulier, le fond de la première chambre d’analyse 3a est coplanaire avec le fond du premier canal de sortie 5a ce qui facilite l’obtention d’un flux laminaire dans la chambre d’analyse. En alternative, le fond de la chambre 3a présente un obstacle, par exemple une marche ou rampe qui facilite la mise en contact de liquide avec la surface d’analyse. La marche ou rampe est définie de manière à ce que le flux de liquide rencontre un obstacle qui force le flux de liquide à se rapprocher de la paroi opposée de la chambre d’analyse 3a, c’est-à-dire la surface d’analyse qui contient les dispositifs de captation 6a.
Lorsque la chambre d'analyse 3a comporte des première et deuxième entrées d’analyse ou au moins deux entrées d’analyse comme cela est illustré à la figure 5, il est particulièrement avantageux de prévoir que deux entrées soient configurées pour introduire deux flux de liquide dans la chambre d'analyse 3a selon deux directions d’introduction sécantes. De cette manière, les deux flux de liquide se croisent à l'intérieur de la chambre 3a. De manière avantageuse, les deux entrées sont alimentées par un même canal et fournissent le même liquide qui comporte préférentiellement les biomarqueurs représentatifs de la réponse cellulaire et/ou un réactif de révélation.
En alternative, les deux liquides sont différents. Il est par exemple possible de prévoir un flux de liquide comprenant des biomarqueurs et un flux du liquide comprenant un réactif de révélation.
Ce croisement des flux a pour effet d'augmenter l'épaisseur et la largeur du flux de liquide dans la chambre analyse 3a et ainsi faciliter un contact entre le liquide qui contient la réponse cellulaire et la surface d'analyse qui est configurée pour capter des éléments représentatifs de la réponse cellulaire. Il est particulièrement avantageux d’utiliser cette configuration lorsque l'épaisseur de la chambre d'analyse 3a est supérieure à l'épaisseur du canal de sortie 5a et/ou lorsque la largeur de la chambre d’analyse 3a est supérieure à la largeur du canal de sortie 5a.
Dans un mode de réalisation particulier illustré aux figures 1 , 2 et 5, le premier puits 2a et la première chambre d’analyse 3a sont formés dans un substrat A. La première chambre d’analyse 3a est formée par une cavité débouchant sur une face du substrat A.
Dans un mode de réalisation particulier, le puits 2a ne possède pas de fond ou de sommet formé par le substrat A de manière à former une cavité borgne dans le substrat. Dans cette configuration, il est plus facile d’insérer un support tridimensionnel recevant la culture cellulaire. Le puits 2 est refermé au moyen d’une paroi de couverture 8, avantageusement de manière étanche. En d’autres termes, le premier puits 2a est formé dans un substrat A et il comporte un sommet amovible formé par une couche de couverture 8 recouvrant une face du substrat A. Le puits 2a peut être rempli facilement puis refermé par la couche de couverture 8.
Dans l’exemple de réalisation illustré aux différentes figures, si le substrat A comporte plusieurs puits, la couche de couverture 8 est commune à tous les puits 2 car cela facilite la réalisation de la puce 1. Cependant, il est également possible de prévoir que chaque puits 2 soit refermé par une couche de couverture 8 spécifique afin de s’adapter à la culture cellulaire ou qu’une même couche de couverture 8 soit utilisable pour plusieurs puits 2. Selon les modes de réalisation, une couche de couverture 8 referme un ou plusieurs puits 2.
En alternative, la couche de couverture 8 est utilisée pour fermer le ou les puits, mais elle n’est pas retirée pour remplir les puits. Il est alors possible d’injecter la culture cellulaire à travers la couche de couverture 8, par exemple au moyen d’une seringue. Une telle configuration permet de faciliter la fabrication de la puce et surtout son utilisation. Dans encore un autre mode de réalisation, le puits 2 possède un fond et une paroi latérale formés dans un substrat A. Le puits est fermé par une couche de couverture 8 distincte du substrat A et non amovible. Les cellules et leur support de culture sont alors mis en place dans le puits 2 au moyen des canaux d’entrée 4 et/ou de sortie 5 ou par injection au travers de la couche de couverture 8 du puits 2, par exemple à l’aide d’une seringue.
De manière avantageuse, la puce micro-fluidique 1 est formée de manière monolithique dans un substrat qui définit le premier puits 2a, le canal d’entrée 4a, le canal de sortie 5a et éventuellement la première chambre d’analyse 3a. Il est également avantageux de former le canal reliant la sortie de la chambre d’analyse 3a avec une évacuation 7 à l’intérieur du substrat A.
Afin de garantir la fiabilité des mesures, la puce micro-fluidique 1 est réalisée dans un matériau biocompatible qui permet une viabilité et une fonctionnalité cellulaire optimales s’approchant des conditions in vivo. Le matériau de la puce micro-fluidique 1 peut être choisi parmi le polyméthacrylate de méthyle, le polydiméthylsiloxane, le polyétheréthercetone, le copolymère cyclo-oléfine, le polycarbonate, le polystyrène, un mélange contenant de l’Exo-1 ,7,7-trimethylbicyclo[2.2.1]hept-2-yl acrylate et du tricyclodecane dimethanol diacrylate par exemple le MED610™, l’inox, le verre, etc. Il peut également être réalisé dans un matériau d’impression 3D ayant la propriété d’être biocompatible, tel que le MED610™.
Dans une configuration non illustrée, le canal de sortie 5a est complètement formé dans le substrat. En alternative, dans la configuration illustrée, le canal de sortie 5a n’est pas fermé dans sa partie supérieure et le substrat A définit avantageusement une rainure qui relie la partie sommitale du puits 2 avec la chambre d’analyse 3a. La couche de couverture 8 referme le premier canal de sortie 5a.
De manière avantageuse, la couche de couverture 8 est recouverte d’un matériau adhésif de manière à se fixer facilement contre la face du substrat A. Selon les modes de réalisation, le matériau adhésif peut recouvrir ou non le puits 2a. Si le matériau adhésif recouvre le puits 2a, le matériau adhésif est biocompatible car il vient en contact de la culture cellulaire.
Dans un mode de réalisation avantageux, la couche de couverture 8 referme le puits 2a et le canal de sortie 5a. La couche de couverture 8 définit une ouverture d’accès à la chambre d’analyse 3. Avantageusement, la couche de couverture 8 forme un anneau fermé autour de la paroi latérale de la première chambre d’analyse 3a. La couche de couverture 8 recouvre continûment le puits 2a, le canal de sortie 5a et le tour de la chambre d’analyse 3 ce qui facilite l’installation de la paroi d’analyse 6 qui vient refermer la chambre d’analyse 3a de manière étanche. La paroi d’analyse 6 forme le sommet de la chambre d’analyse 3a qui présente la surface d’analyse avec les dispositifs de captation 6a. Dans une configuration particulière non illustrée, la couche de couverture 8 définit une rainure non traversante qui forme le fond de la première chambre d’analyse 3a.
Dans un mode de réalisation préférentiel illustré aux figures 6 et 7, le substrat A comporte un trou qui est préférentiellement borgne pour définir le puits 2a. En revanche, le substrat A ne définit pas ou pas complètement les parois latérales de la première chambre d’analyse 3a. Ces dernières sont formées au moyen de la couche de couverture 8. Dans le mode de réalisation illustré, le fond du puits 2a, les parois latérales du puits 2a, le fond et parois latérales du canal 5a ainsi que le fond de la chambre d’analyse 3a sont formés dans le substrat A.
Dans le mode de réalisation de la figure 7, l’épaisseur de la chambre d’analyse 3a est définie par l’épaisseur de la couche de couverture 8.
De manière avantageuse et illustrée sur les figures 6 et 7, le canal de sortie 5a s’évase au moment de rentrer dans la chambre d’analyse 3a. Le canal de sortie 5a possède des parois latérales qui autorisent un élargissement du flux avant de rentrer dans la chambre d’analyse 3a. Préférentiellement, l’élargissement du canal de sortie 5a est réalisé de manière à ce qu’il atteigne la largeur de la chambre d’analyse 3a définie par les parois latérales de la couche de couverture 8. La fin du canal de sortie 5a est formée par la fin de la rainure dans le substrat A de sorte que le liquide atteigne la surface du substrat A. La marche ou la rampe formée par la fin de la rainure permet de forcer le liquide à mouiller la surface d’analyse et ainsi à faciliter la mesure. Il est particulièrement avantageux de prévoir que la surface d’analyse 6 vienne en face du canal de sortie 5a pour faciliter la mise en place d’un flux de liquide laminaire dans la chambre d’analyse 3a.
Le fond de la chambre d’analyse 3a est alors disposé sur au moins deux plans différents dont l’un correspond à la face supérieure du substrat A.
Comme illustré aux figures 6 et 7, la chambre d’analyse 3a est formée en déposant la couche de couverture 8 sur le substrat A. Il est donc possible de moduler simplement les caractéristiques de la chambre d’analyse 3a en modulant les dimensions de l’ouverture formée dans la couche de couverture 8 et/ou en modulant l’épaisseur de la couche de couverture 8. Cette configuration est particulièrement avantageuse car elle permet de limiter le volume mort dans la chambre d’analyse 3a.
Dans un mode de réalisation particulier non illustré, la couche de couverture 8 est disposée sur la surface du substrat A afin de fermer le puits 2a et le canal de sortie 5a. La couche de couverture 8 est monobloc et possède une cavité borgne qui permet de définir la chambre d’analyse 3a.
La paroi d’analyse 6 définit la surface d’analyse avec ses éléments de captation ou sondes 6a configurés pour capturer des constituants du liquide circulant dans la première chambre d’analyse 3a. La paroi d’analyse 6 est montée de manière amovible. La surface d’analyse qui contient les sondes 6a est séparée du substrat A par la couche de couverture 8 pour faire l’analyse de la réponse cellulaire. L’installation et le retrait de la paroi d’analyse 6 peuvent alors être réalisés sans perturber le puits 2a, c’est-à-dire en évitant d’enlever la couche de couverture 8 qui referme le puits 2a. La surface d’analyse est recouverte par les éléments de captation. Les éléments de captation 6a sont configurés pour fixer un ou plusieurs biomarqueurs, c’est-à-dire les composants du fluide provenant du puits 2a et représentatifs de la réponse cellulaire que l’on souhaite analyser. Les éléments de captation 6a peuvent également être configurés pour fixer le réactif de révélation et permettre ainsi un contrôle positif de révélation. La surface d'analyse peut comporter des zones avec des contrôles positifs de révélation et/ou des zones avec des capteurs spécifiques des biomarqueurs, ainsi que des repères de positionnement visibles lors de l’acquisition du signal ou de la mesure.
Le biomarqueur est une caractéristique biologique mesurable liée à un processus. Le biomarqueur peut être une molécule produite sécrétée ou modifiée par les cellules de l’échantillon cellulaire. Le biomarqueur peut être une molécule chimique, un fragment d’ADN, d’ARN, un métabolite, un sucre, un lipide, une protéine ou un fragment de protéine qui est spécifique de la réponse cellulaire. Les sondes 6a peuvent comporter par exemples des anticorps, des protéines, des lipides, des aptamères, des sucres, des peptides, des fragments d’immunoglobuline ou des oligonucléotides. Dans la chambre d’analyse 3, les constituants de la réponse cellulaire détectés ou biomarqueurs sont préférentiellement des cytokines. Détecter les cytokines en continu permet d’en établir un profil cinétique. Il est avantageux d’installer plusieurs sondes 6a qui réagissent au(x) même(s) biomarqueur(s) pour améliorer la qualité de l’analyse.
En utilisant une paroi d’analyse 6 amovible par rapport au reste de la chambre d’analyse 3, il est possible d’adapter la détection à la réaction cellulaire en cours d’expérience. L’utilisation d’une paroi 6 amovible est particulièrement avantageuse lorsque la surface d’analyse comporte plusieurs sondes de détection différentes qui sont configurées pour distinguer différents éléments de la réponse cellulaire, c’est-à- dire réagir à des biomarqueurs différents ou une sécrétion cellulaire. La paroi d’analyse 6 amovible permet une ouverture de la chambre pour changer la surface d’analyse 6 et éventuellement les sondes 6a. Par exemple, si la réponse cellulaire évolue dans le temps, il est possible de changer les sondes de la surface d’analyse afin d’adapter les sondes à la réponse, par exemple en fonction de la nature des cytokines ou de leur concentration de sorte que la mesure puisse suivre la dynamique de la réponse cellulaire. On évite ainsi la saturation du signal.
Il est également possible que les sondes 6a se dégradent dans le temps. Afin de suivre la réponse cellulaire sur une période relativement longue, il est avantageux de remplacer la paroi d’analyse 6 comportant des sondes usées par une nouvelle paroi d’analyse 6 comportant des sondes neuves.
En utilisant une paroi d’analyse amovible, il est possible d’installer et de démonter la surface d’analyse sans perturber les cellules présentes dans le puits 2a.
Dans une alternative de réalisation, la paroi d’analyse 6a est fixée à la couche de couverture 8. La paroi d’analyse 6a et la couche de couverture 8 peuvent être formées dans des matériaux identiques ou différents.
Si la puce comporte plusieurs chambres d’analyse, il est avantageux que la couche de couverture 8 forme un anneau continu autour de chaque chambre d’analyse 3. Préférentiellement, la couche de couverture 8 vient en contact direct avec le substrat A. La couche de couverture 8 forme un élément d’étanchéité en assurant une continuité de recouvrement entre le puits, le canal de sortie et le tour de la chambre d’analyse. La couche de couverture 8 forme également un joint d’étanchéité en accommodant la surface du substrat et la surface de la paroi d’analyse 6.
Dans un mode de réalisation, la couche de couverture 8 définit une ouverture qui correspond exactement à la forme de chaque ouverture qui existe dans le substrat et qui définit une chambre d’analyse 3a afin de ne pas perturber le flux de liquide qui se déplace depuis l’entrée de la chambre d’analyse 3a vers la sortie de la chambre d’analyse 3a. La hauteur de la chambre d’analyse 3a est définie au moins en partie par l’épaisseur de la couche de couverture 8. Pour assurer une diffusion homogène du flux dans la chambre d’analyse 3a, la hauteur de la paroi latérale de la chambre d’analyse 3a peut être inférieure à la moitié de la différence entre la largeur de la chambre d’analyse 3a et la largeur du canal de sortie 5a. De manière encore plus avantageuse, l’épaisseur de la couche de couverture 8 est choisie de sorte que la distance séparant la paroi d’analyse 6 et le fond de la première chambre d’analyse 3a soit inférieure à 2 mm.
Dans un mode de réalisation avantageux, la rainure formée par le canal 5a et la chambre d’analyse 3a appartiennent à un même plan depuis la sortie du puits 2 jusqu’à la sortie de la chambre d’analyse 3a.
La couche de couverture 8 peut être transparente aux longueurs d’onde optiques pour pouvoir observer les cultures cellulaires présentes dans les puits 2 par microscopie optique, telle que la microscopie de fluorescence lorsque la couche de couverture 8 recouvre les puits 2.
Selon les modes de réalisation, la paroi d’analyse 6 peut être déposée directement sur la couche de couverture 8 ou ces deux couches sont séparées par au moins une couche de liaison 9. La couche de liaison 9 permet une meilleure connexion mécanique entre la paroi d’analyse 6 et la couche de couverture 8.
Pour former un joint efficace, le matériau formant la couche de couverture 8 ou la couche de liaison 9 peut être choisi parmi le polyéthylène, le polytétrafluoroéthylène, le polyuréthane, un tissu de verre imprégné de polytétrafluoroéthylène, le silicone, le polydiméthylsiloxane. Il est également possible d’utiliser un adhésif de type acrylique. La couche de liaison 9 peut être formée par un gel, une pâte, une mousse.
Pour favoriser le contact entre le liquide issu du puits 2 et la surface d’analyse, l’épaisseur de l’ensemble formé par la couche de couverture 8 et l’élément de liaison 9 doit être inférieure ou égale à la différence entre le rayon ou demi-largeur de la chambre d’analyse 3a et le rayon ou demi-largeur du canal 5a.
Il est avantageux de prévoir que la paroi qui comporte le revêtement réactif ou la paroi opposée à la paroi qui comporte le revêtement réactif soit transparente au signal d’analyse de manière à faciliter la mesure en cours de réaction. De cette manière, il est possible d’effectuer une mesure en cours de réaction.
Il est avantageux d’appliquer une pression sur la paroi d’analyse amovible afin d’améliorer l’étanchéité de la puce 1. La pression peut être appliquée par un système de compression mécanique tel que des pinces, des aimants ou électro-aimants, une aspiration, un système pneumatique.
Afin de faciliter l’analyse des constituants de la réponse cellulaire dans la première chambre d’analyse 3a, les inventeurs ont observé qu’il est particulièrement avantageux d’utiliser un réactif de révélation. Le réactif de révélation va réagir avec certains constituants émis par la culture cellulaire afin de fixer des marqueurs sur les constituants qui seront fixés sur les sondes 6a de la première chambre d’analyse 3a. Le réactif de révélation peut également réagir avec les sondes elles-mêmes pour permettre, par exemple, un contrôle positif ou une calibration interne de révélation.
Différents modes de réalisation sont envisageables pour faire réagir les constituants de réponse cellulaire issue du puits avec un réactif de révélation.
Les constituants de réponse cellulaire ou biomarqueurs présents dans le liquide et qui ressortent du puits 2a sont capturés par les sondes 6a de la surface d'analyse.
Dans une configuration, la capture des biomarqueurs provoque un signal d’analyse ce qui permet de suivre la réponse cellulaire. Cependant, dans de très nombreux cas de figure, la capture des biomarqueurs ne provoque pas de signal d’analyse et un réactif de révélation spécifique est ajouté et utilisé comme élément de suivi du biomarqueur caractéristique de la réponse cellulaire qui doit être suivi. Afin d’améliorer le suivi de la réponse cellulaire, il est particulièrement avantageux d’introduire le réactif de révélation avant que le liquide ne s’introduise dans la chambre d’analyse 3a, c’est-à-dire avant l’entrée de la chambre d’analyse, soit en mélangeant le réactif de révélation au liquide sortant du puits, soit en alternant les flux de réactifs et de liquide sortant du puit. En variante, le réactif de révélation est ajouté sur la surface d’analyse après avoir séparé la paroi d’analyse du reste de la chambre d’analyse 3a.
Il est possible de réaliser l’analyse de la réponse cellulaire directement dans la chambre d’analyse 3a, si le réactif de révélation se fixe sur le biomarqueur lui-même fixé sur les sondes 6a et induit un signal analysable et sous réserve qu’au moins une partie de la chambre soit transparente au signal induit. Dans les autres cas, il est avantageux de prévoir une extraction de la paroi d’analyse hors de la chambre d’analyse 3a pour faire l’analyse des éléments de captation 6a.
Si le réactif de révélation est introduit dans la puce, il est avantageux d’introduire le réactif de révélation après la sortie du puits 2a pour ne pas perturber la culture cellulaire. La puce comporte avantageusement un canal additionnel qui est connecté à la première canalisation de sortie 5a entre la sortie du premier puits 2a et la première chambre d’analyse 3a au niveau d’une première jonction. De cette manière, le réactif de révélation peut être mélangé au liquide qui sort du premier puits 2a sans gêner la culture cellulaire.
Le réactif de révélation peut être mis en contact avec des biomarqueurs par mélange ou par fourniture alternative des biomarqueurs puis du réactif de révélation dans la chambre d’analyse.
Afin de permettre les analyses en temps réel par microscopie, la paroi présentant la surface d’analyse peut être transparente aux longueurs d’ondes optiques. Elle peut également être réalisée dans un matériau non auto-fluorescent pour permettre l’utilisation de la microscopie de fluorescence comme technique d’analyse. La paroi d’analyse est, de préférence, réalisée en verre, en plastique ou en matériau composite et recouverte ou non d’une couche fine métallique, de polymère ou de fonctionnalisation chimique.
Il est encore possible de prévoir que la mesure de la réponse cellulaire ne puisse pas être réalisée directement dans la chambre d’analyse 3a. Ce cas de figure peut se produire lorsque la paroi 6 de la chambre n’est pas transparente au rayonnement utilisé pour effectuer la mesure ou lorsque le rayonnement utilisé pour effectuer la mesure peut détériorer les biomarqueurs qui se trouvent dans la chambre 3a de sorte que la première mesure fausse les mesures à suivre.
Dans tous ces cas de figure, il est avantageux de retirer la paroi d’analyse 6 qui comporte le revêtement réactif de la chambre 3a, de mettre une nouvelle paroi d’analyse 6 avec un revêtement réactif et de placer le revêtement réactif mis en contact avec le liquide contenant les biomarqueurs dans un dispositif de mesure par exemple par voie optique, par luminescence, par absorbance ou par fluorescence.
De manière avantageuse, la puce comporte un canal additionnel 4b/5b connecté au premier canal de sortie 5a entre la sortie du premier puits 2a et la première chambre d’analyse 3a. Le canal de sortie 5a est destiné à être alimenté par un flux additionnel qui est avantageusement un liquide qui contient un réactif de révélation.
Comme indiqué plus haut, le canal de sortie 5a peut être défini dans le substrat A. Il est également possible de prévoir que les parois du canal de sortie 5a soient formées partiellement ou complètement dans la couche de couverture 8. Il peut en être de même pour le canal additionnel 5b.
Avantageusement, le canal additionnel 4b/5b comporte un deuxième canal d’entrée 4b connecté au premier canal de sortie 5a par l’intermédiaire d’un dissipateur d’énergie mécanique et d’un deuxième canal de sortie 5b. Le premier canal de sortie 5a et le deuxième canal de sortie 5b se rejoignent avant d’atteindre la chambre d’analyse 3a. De manière préférentielle, le dissipateur d’énergie mécanique est configuré pour définir une perte de charge égale à plus ou moins 20% à la perte de charge définie par le premier puits 2a. Selon les modes de réalisation, les liquides provenant du premier canal de sortie 5a et du deuxième canal de sortie 5b se mélangent ou non.
Il est particulièrement avantageux de prévoir que le dissipateur d’énergie mécanique soit formé par un deuxième puits 2b identique au premier puits 2a. Lorsque la puce 1 comporte des premier et deuxième canaux d’entrée 4a et 4b, des premier et deuxième puits 2a, 2b ainsi que des premier et deuxième canaux de sortie 5a et 5b, il est avantageux de prévoir que les premier et deuxième canaux d’entrée 4a et 4b définissent un premier plan parallèle et décalé d’un deuxième plan défini par les premier et deuxième canaux de sortie 5a, 5b.
Selon un mode de réalisation particulier, la puce micro-fluidique comporte un mélangeur (non représenté) qui est configuré pour mélanger au moins deux flux de liquide laminaires en amont du mélangeur et délivrer un flux laminaire en sortie du mélangeur. Le mélangeur est avantageusement disposé entre la sortie du premier puits 2a et l’entrée de la chambre d’analyse 3a. Le mélangeur comporte une première entrée alimentée par le premier puits 2a et une deuxième entrée alimentée par le deuxième puits 2b ou par une entrée distincte de l’entrée alimentant le premier puits 2a. Le mélangeur est configuré pour mélanger deux flux présents en entrée et ressortir au moins un flux en sortie. Le flux de sortie correspond au mélange des flux d’entrée.
Comme illustré aux figures 1 , 2, 3, 4, 5, 6 et 7, la puce micro-fluidique 1 peut comporter une pluralité de puits de culture cellulaire notés 2a, 2b, 2c et 2d qui sont reliés à une ou plusieurs chambres d’analyse ici deux chambres 3a et 3b. L’entrée de chaque puits 2 est connectée à un canal d’entrée 4 et la sortie de chaque puits 2 est connectée à un canal de sortie 5. Une chambre d’analyse 3 peut être connectée à un ou plusieurs puits 2 différents par l’intermédiaire de un à plusieurs canaux de sortie 5. Les puits 2 occupant une surface réduite, il est possible de réaliser une quantité importante de puits 2 dans une faible surface ce qui facilite la réalisation d’un dispositif d’analyse compact. La miniaturisation des puits permet également la multiplication du nombre de puits par dispositifs et ainsi la multiplication du nombre d’échantillons biologiques analysés par analyse.
Selon un premier mode de réalisation particulier illustré aux figures 1 et 5, une puce micro-fluidique 1 comporte des premier, deuxième et troisième canaux d’entrée 4a, 4b et 4c connectés respectivement à des premier, deuxième et troisième puits 2a, 2b et 2c montés fluidiquement en parallèle. Les premier, deuxième et troisième puits 2a, 2b et 2c sont respectivement connectés à des premier, deuxième et troisième canaux de sortie 5a, 5b et 5c. Dans un mode de réalisation, un des puits peut être remplacé par un canal additionnel. Dans le mode de réalisation illustré, il est avantageux de prévoir que le puits 2b soit remplacé par le canal additionnel.
Les premier et deuxième canaux de sortie 5a et 5b se rejoignent avant d’atteindre la première chambre d’analyse 3a. Les deuxième et troisième canaux de sortie 5b et 5c se rejoignent avant d’atteindre la deuxième chambre d’analyse 3b. Les deux chambres d’analyse sont montées fluidiquement en parallèles entre les puits 2a, 2b et 2c et une évacuation 7.
Dans le mode de réalisation illustré aux figures 1 et 5, les trois canaux de sortie sont connectés à un même canal transversal duquel partent les entrées des deux chambres d’analyse 3a et 3b. La première chambre d’analyse 3a est connectée pour recevoir le liquide du premier canal de sortie 5a et le liquide du deuxième canal de sortie 5b. La deuxième chambre d’analyse 3b est connectée pour recevoir le liquide du troisième canal de sortie 5c et le liquide du deuxième canal de sortie 5b. Dans cette configuration, lorsque la pression appliquée dans les trois puits 2a, 2b et 2c est identique, la première chambre 3a reçoit un flux provenant du premier puits 2a et un flux provenant du deuxième puits 2b. La deuxième chambre 3b reçoit un flux provenant du troisième puits 2c et un flux provenant du deuxième puits 2b. L’information contenue dans le deuxième canal de sortie 5b est présente dans les deux chambres montées en parallèle.
Dans l’exemple illustré, les deux chambres d’analyse 3a et 3b possèdent une sortie qui est finalement reliée à l’évacuation 7.
Les chambres d’analyse 3 et l’évacuation 7 hors du substrat sont avantageusement situées dans deux plans parallèles différents.
Selon un mode de réalisation alternatif de la puce micro-fluidique qui est représenté aux figures 2, 3, 4, 6 et 7, une puce 1 peut comprendre quatre entrées 4a, 4b, 4c et 4d connectées respectivement à quatre puits 2a, 2b, 2c et 2d de culture cellulaire. La puce 1 comporte également deux chambres d’analyse 3a et 3b connectées chacune à deux puits 2 de culture cellulaire. Les premier et deuxième puits 2a et 2b sont connectés à la première chambre d’analyse 3a alors que les troisième et quatrième puits 2c et 2d sont connectés à la deuxième chambre d’analyse 3b. Là encore, un ou deux puits peuvent être remplacés par des canaux additionnels pour fournir des réactifs.
Les deux chambres d’analyse 3a/3b sont finalement connectées à une évacuation 7 afin de permettre l’évacuation des produits analysés. Dans le mode de réalisation illustré, l’évacuation 7 est commune.
Dans les modes de réalisation illustrés aux différentes figures, la puce micro-fluidique 1 comporte une pluralité de puits 2 qui sont chacun connectés à un canal d’entrée 4. Chaque puits 2 possède son canal de sortie 5. Les canaux de sortie 5 de plusieurs puits 2 se rejoignent avant d’entrer dans une chambre d’analyse 3. Au moins une chambre d’analyse 3 est connectée à au moins deux puits 2 de la puce micro- fluidique 1.
Dans les modes de réalisation avantageux illustrés, les sorties des puits 2 sont connectées ensemble avant d’atteindre la chambre d’analyse 3 de sorte que les différents flux en provenance de la pluralité de puits 2 entrent dans la chambre d’analyse 3 par une même entrée. En utilisant un flux laminaire dans la chambre d’analyse 3, il est possible d’avoir dans la même chambre d’analyse 3 plusieurs flux de liquides issus de plusieurs puits 2 sans qu’ils ne se mélangent. Il est particulièrement avantageux d’avoir un nombre de Reynolds inférieur à 100 pour réduire encore plus la probabilité de mélange des liquides dans la chambre d’analyse. De manière avantageuse, au moins deux liquides issus de au moins deux puits différents sont présents dans la chambre d’analyse.
En plaçant judicieusement des sondes 6a à plusieurs endroits de la chambre d’analyse 3 sur la surface d’analyse selon une direction perpendiculaire au flux de liquide à l’intérieur de la chambre 3, il est possible d’analyser les différents biomarqueurs issus des puits 2. Les différents biomarqueurs sont présents en même temps dans la chambre d’analyse 3 et sont séparés les uns des autres selon une direction perpendiculaire à l’axe qui relie l’entrée et la sortie de la chambre 3, c’est-à- dire selon une direction perpendiculaire à l’axe de circulation du liquide dans la chambre d’analyse 3. Il est particulièrement avantageux de placer plusieurs sondes 6a sur la surface d’analyse selon une direction perpendiculaire à la direction d’écoulement dans la chambre d’analyse 3 pour analyser séparément les différentes réponses cellulaires.
Dans cette configuration, il est possible de réaliser l’analyse de plusieurs échantillons cellulaires placés dans différents puits 2 avec une seule chambre d’analyse 3 sans que les réponses cellulaires ne se mélangent. Chaque flux de liquide circule depuis l’entrée jusqu’à la sortie et transporte des biomarqueurs caractéristiques de la réponse de l’échantillon cellulaire d’un puits 2.
La surface d’analyse est analysée par un dispositif de mesure qui peut alors mesurer les différentes réponses cellulaires sur la même surface d’analyse.
En alternative, il est également possible d’avoir une chambre d’analyse connectée à un seul puits lui-même alimenté par un seul canal d’entrée. De manière particulièrement avantageuse, les canaux d’entrée 4 sont fermés par un septum. Dans ce mode de réalisation non illustré, le premier canal d’entrée 4a possède une première extrémité qui débouche dans le premier puits 2a et une deuxième extrémité qui est fermée par une membrane étanche. La membrane étanche est configurée pour former un septum qui peut être percé par exemple par une aiguille. Lorsque l’aiguille est retirée, la membrane est de nouveau étanche. Cette configuration permet de conserver l’étanchéité de la première entrée 4a et donc d’éviter de contaminer le premier puits 2a. La stérilité de la culture cellulaire peut être maintenue malgré de multiples étapes de connexion/déconnexion de la puce 1 avec un générateur de flux. L’étanchéité dans le reste de la puce peut être obtenu avec d’autres moyens.
Une membrane étanche peut également être utilisée comme septum au niveau de la ou des sorties 7. Dans ce cas, une ou plusieurs aiguilles peuvent être utilisées pour traverser le septum et assurer la communication fluidique avec un réservoir qui récupère les liquides.
Lorsque les entrées et les évacuations sont fermées par un septum, la puce micro- fluidique est étanche. Cette configuration permet de déplacer en toute sécurité la zone de culture et la zone d’analyse qui forment un élément monobloc.
Le générateur de flux permet d’injecter un ou plusieurs liquides dans les différentes entrées de la puce 1 aux moyens d’aiguilles qui traversent chaque septum.
La puce micro-fluidique 1 est avantageusement associée à un générateur de flux, par exemple une pompe, pour former un laboratoire sur puce. La pompe est préférentiellement configurée pour que les flux de liquide dans les chambres d’analyse 3 soient laminaires. Avantageusement, les flux de liquide entre la sortie du puits 2 et l’entrée dans la chambre d’analyse 3 sont également laminaires. De préférence, le générateur de flux est configuré pour que les flux de liquide entre la sortie du puits 2 et la sortie de la chambre d’analyse 3 présentent un nombre de Reynolds inférieur à 100. Il est encore plus avantageux de prévoir que le flux dans les puits 2 soit également laminaire.
Pour assurer un transport efficace des éléments présents dans le liquide depuis les puits 2 vers la surface d’analyse, les conditions d’écoulement du fluide sont configurées pour favoriser un transport des liquides par convection plutôt que par diffusion. Il est avantageux de choisir des conditions d’écoulement de sorte que le nombre de Peclet dans la canalisation reliant le puits 2 à la chambre d’analyse 3 et avantageusement dans la chambre d’analyse 3 soit inférieur à 1 . Le nombre de Peclet est un nombre sans dimension qui représente le rapport du temps caractéristique du transfert par convection sur le temps caractéristique du transfert par diffusion.
Le laboratoire sur puce est avantageusement configuré pour que le débit de liquide soit compris entre 0,1//L/min et 2ml_/min ce qui permet un écoulement laminaire dans la ou les chambres d’analyse 3. En utilisant un tel flux, la fixation des biomarqueurs sur les sondes est mieux réalisée. De préférence, le débit de liquide est compris entre 0,1 /L/min et 1 mL/min. La valeur du débit de liquide correspond avantageusement à une valeur moyenne, par exemple une valeur moyenne sur une minute. Il est également possible d’utiliser un flux de liquide sous la forme d’impulsions dont la valeur de débit est comprise entre 1 ml_/min et 5mL/min, de préférence dont la valeur est supérieure à 4ml_/min. Les impulsions ont des durées inférieures à 10 secondes.
Les marqueurs caractéristiques de la modification de la réponse des cellules, dans le temps, se retrouvent dans le flux de liquide qui quitte le puits 2 et qui entre dans la chambre d’analyse 3. Avec un tel flux, la modification de la réponse des cellules peut être suivie en temps réel dans la chambre d’analyse 3 et notamment entre la sortie et l’entrée de la chambre d’analyse 3.
Le générateur de flux est connecté à la puce 1 afin de faire transiter un fluide depuis le puits 2 vers la chambre d’analyse 3. Le générateur de flux peut être un contrôleur de pression, un pousse-seringue ou une pompe (non représenté). Le générateur de flux peut être configuré pour alimenter en continu la puce en fluide ou alors de manière périodique ou apériodique.
Dans le cadre d’une alimentation en continu, un débit de liquide est présent en continu à travers le puits 2a et la chambre d’analyse 3a. Le débit est non nul et peut être variable dans le temps. Le débit peut évoluer de manière périodique ou apériodique. Dans les autres modes de réalisation, le débit évolue avec une période à débit nul et une période à débit non nul. Durant la période à débit non nul, le débit peut être constant ou variable.
Le générateur de flux est configuré pour délivrer au moins un liquide choisi parmi un liquide d’alimentation comportant des nutriments, un liquide de croissance, une molécule à tester par exemple un stimuli chimique ou biologique qui peut être un médicament. Il est encore possible de fournir des réactifs de révélation. Les molécules à tester peuvent par exemple être des molécules chimiques ou biochimiques, de sorte à observer l’impact de ces molécules sur la réponse cellulaire. Les réactifs de révélation peuvent par exemple être des marqueurs fluorescents afin d’utiliser la microscopie de fluorescence lors des analyses.
Dans un mode de réalisation particulier, le puits 2a est alimenté en continu par un premier flux de liquide. Le premier flux de liquide peut contenir des nutriments. Le premier flux de liquide peut être complété par un deuxième flux de liquide dont la composition diffère du premier flux de liquide.
Lorsque la composition du liquide change dans le temps à l’entrée du puits 2a, il est possible de prévoir que le premier flux comporte, pendant une première période, un flux comportant majoritairement des nutriments. Pendant une deuxième période, le flux comporte des molécules à analyser. De préférence, les molécules à tester sont apportées au moyen d’un liquide qui contient un milieu de culture. Le milieu de culture contient des nutriments, mais il peut également contenir des sels et des tampons. Il est également possible de prévoir que le milieu de culture contienne des réactifs prédéfinis si l’on souhaite analyser directement les cellules. Le débit en liquide peut être constant indépendamment de la composition du liquide.
Le fait d’alimenter les cultures cellulaires par un flux continu permet d’améliorer la nutrition des cultures cellulaires par rapport à un apport nutritionnel statique. Les conditions expérimentales s’approchent donc des conditions in vivo.
Il est également possible de faire varier la concentration en stimuli biologiques ou chimiques afin de simuler les conditions d’exposition cellulaire suite à l’administration d’un médicament ou d’un autre produit. La concentration en stimuli peut augmenter durant une première phase puis diminuer durant une deuxième phase.
Les cultures cellulaires sont soumises à des stimuli chimique, biochimique, physique ou mécanique afin d’évaluer leur réponse, c’est-à-dire, leur viabilité ou mortalité ainsi que la nature des molécules ou biomarqueurs qu’elles sécrètent. Dans l’étude d’un stimulus mécanique, la pression et/ou le débit peuvent évoluer dans le temps et la composition chimique est constante ou variable.
Le laboratoire sur puce est donc très intéressant, car il permet d’analyser en temps réel les sécrétions cellulaires et permet de réaliser de véritables études cinétiques, proches des conditions in vivo. Par ailleurs, la surface étendue de la chambre d’analyse 3a permet de détecter un grand nombre de biomarqueurs à moindre coût.
Ce type de laboratoire sur puce est particulièrement avantageux car il permet d’utiliser de très nombreux procédés d’analyse différents. Dans le cas où la puce comporte plusieurs puits montés en parallèle, il est possible de choisir indépendamment l’alimentation des différents puits tant dans la composition, le débit et révolution temporelle de ces deux paramètres. Les analyses peuvent être réalisées en parallèle ce qui permet de gagner du temps.
Il est possible d’alimenter tous les puits avec la même solution. En alternative, il est possible de dissocier le fluide alimentant les puits entre au moins deux puits de manière à comparer la réaction cellulaire entre les puits. Par exemple, il est possible de comparer la réponse cellulaire entre un flux comportant des stimuli chimiques et/ou biologiques et un flux dépourvu des stimuli chimiques et/ou biologiques. Il est encore possible de changer la concentration en nutriments, la concentration en stimuli chimiques et/ou biologiques entre les puits pour déterminer l’influence de ces différents paramètres sur la réponse cellulaire.
De manière générale, le procédé d’analyse de la réponse cellulaire d’un échantillon biologique peut se présenter de la manière suivante.
Le procédé comporte une première étape de fourniture d’une puce microfluidique 1. Il est possible d’utiliser la puce décrite ci-dessus, mais il est également possible d’utiliser une puce différente.
La puce micro-fluidique 1 comporte un premier puits 2a rempli par un échantillon cellulaire émettant une première réponse cellulaire. L’échantillon cellulaire peut être déposé manuellement, à l’aide d’une pipette ou micropipette, dans le premier puits 2a.
La puce comporte encore un premier canal d’entrée 4a destiné à alimenter le premier puits 2a. Le premier canal d’entrée débouchant dans une entrée du premier puits 2a.
La puce comporte également une première chambre d’analyse 3a possédant une première entrée d’analyse connectée fluidiquement au premier puits 2a au moyen d’un premier canal de sortie 5a et une sortie d’évacuation débouchant dans la première chambre d’analyse 3a et distincte de la première entrée d’analyse.
La puce comporte encore des éléments de captation 6a disposés sur une paroi de la première chambre d’analyse 3, les éléments de captation 6a étant configurés pour capturer au moins un biomarqueur représentatif de la première réponse cellulaire circulant depuis le premier puits 2a jusqu’à la sortie d’évacuation de la première chambre d’analyse 3a.
Le procédé comporte encore la fourniture d’un générateur de flux configuré pour appliquer un premier flux de liquide alimentant le premier puits 2a de sorte que la première réponse cellulaire soit emmenée depuis le premier puits 2a jusqu’à la sortie d’évacuation à travers la première chambre d’analyse 3a. Ensuite, le biomarqueur est déplacé depuis le premier puits 2a jusqu’à la sortie d’évacuation de la première chambre d’analyse de sorte que ledit au moins un biomarqueur soit capté par les éléments de captation 6a. les éléments de captation 6a sont analysés pour suivre la réponse cellulaire de l’échantillon cellulaire.
Le générateur de flux est configuré pour appliquer des flux de liquide au moins au premier canal d’entrée 4a.
De manière avantageuse, le puits est rempli d'un liquide qui contient des nutriments avant d’introduire la culture cellulaire dans le puits. Dans un mode de réalisation particulier, les canaux d’entrées 4 de la puce sont connectés au générateur de flux et le générateur de flux est configuré pour qu’un liquide alimente le puits 2 avec un premier liquide qui comporte avantageusement des nutriments. Dans un mode d'organisation particulier, le générateur de flux est configuré pour remplir complètement le puits sans remplir la chambre d'analyse. De manière avantageuse, le générateur est configuré pour remplir une pluralité de puits avec un même débit pour chaque puits.
Une fois le puits rempli par un liquide, une culture cellulaire est introduite dans le puits. Par exemple une matrice de culture cellulaire est introduite dans le puits. Il est particulièrement avantageux d’introduire la culture cellulaire dans le puits après avoir rempli le puits par un fluide ce qui évite de laisser la culture cellulaire à l'air libre et donc un dessèchement de la culture cellulaire. De manière avantageuse, au moins les canaux 4 sont remplis avant d’introduire la culture cellulaire dans les puits. Dans un cas de figure, la fermeture du puits 2 est réalisée simultanément avec la mise en place d'un premier élément d'étanchéité autour de la chambre d'analyse 3. L'élément d'étanchéité laisse accessible la chambre d'analyse 3.
Dans un procédé d’utilisation particulier, la fermeture du puits 2 est réalisée avant la mise en place des cellules dans le puits 2. Les cellules seront alors mise en place dans le puits 2 par injection au moyen du canal d’entrée 4 ou au travers de la couche de couverture 8, par exemple, grâce à une seringue.
La chambre d'analyse 3 peut être ensuite refermée au moyen de la paroi d’analyse 6. Une fois la chambre analyse 3 fermée de manière étanche, le générateur de flux peut remplir la chambre d'analyse 3 avec le liquide. Préférentiellement, le générateur de flux remplit la chambre d'analyse 3 à partir d'un flux qui provient du puits 2. De manière avantageuse, le générateur de flux est configuré pour remplir le puits 2 puis la chambre d'analyse 3 jusqu'à l'évacuation 7.
Le procédé d’analyse comporte avantageusement une étape d’alimentation du premier puits 2a comportant la culture cellulaire avec un premier liquide ayant une première composition et comportant des nutriments. Le premier puits 2a est alimenté avec un premier débit et une première pression.
Dans une deuxième étape, le premier puits 2a peut être alimenté avec un deuxième liquide comportant une deuxième composition. Le premier puits 2 est alimenté avec un deuxième débit et une deuxième pression, au moins un paramètre choisi parmi la deuxième composition, le deuxième débit et la deuxième pression étant respectivement différent de la première composition, du premier débit et de la première pression. La culture cellulaire émet des biomarqueurs en réponse au deuxième liquide. L’alimentation en premier et deuxième liquides est configurée pour que les biomarqueurs atteignent la chambre d’analyse 3. Les biomarqueurs sont captés par les sondes 6a et il est possible de comparer la différence de réponse entre le premier liquide et le deuxième liquide pour une même culture cellulaire dans une même puce. En faisant évoluer la pression et/ou le débit, il est possible de simuler un stress mécanique sur la culture cellulaire. En modifiant la composition du milieu nutritif, il est possible de simuler un stress chimique. Cependant, il est particulièrement avantageux de rajouter au moins une molécule au deuxième liquide c’est-à-dire la molécule à étudier. En alternative, la molécule à étudier est présente en continu. Les constituants du premier liquide et du deuxième peuvent être identiques et avec des concentrations différentes.
Les biomarqueurs représentatifs de la réponse cellulaire contenue dans le liquide issu des puits de culture cellulaire sont ensuite capturés sur les sondes 6a présentes dans la chambre d’analyse 3. Si nécessaire, un réactif de révélation est mis en contact avec les biomarqueurs capturés sur les sondes 6a pour mettre en évidence un signal analysable.
Avantageusement, le procédé comporte la fourniture d’au moins un réactif de révélation configuré pour réagir avec le ou les biomarqueurs représentatifs de la première réponse cellulaire captés par les éléments de captation 6a. Le réactif de révélation traverse la première chambre d’analyse 3a simultanément ou postérieurement au passage de la première réponse cellulaire dans la première chambre d’analyse 3a. L’analyse des éléments de captation 6a est réalisée en recherchant le réactif de révélation.
Lorsque la puce micro-fluidique comporte une pluralité de puits par exemple au moins deux, trois ou quatre puits, il est possible d’utiliser différemment les canaux d’entrée de la puce.
Dans une configuration, un premier puits 2a est rempli par des cellules et un deuxième puits 2b n’est pas rempli par des cellules. Le premier puits 2a est soumis à un premier flux de liquide comportant des nutriments et éventuellement à des stimuli chimiques ou biologiques. Le deuxième puits 2b devient alors une entrée additionnelle qui débouche dans le premier canal de sortie 5a par une première jonction se trouvant entre le premier puits 2a et la première chambre d’analyse 3a. Celle-ci est soumis à un deuxième flux de réactifs de révélation. Le deuxième flux pénètre dans la chambre d’analyse 3 sans être en contact de l’échantillon cellulaire.
Afin que la chambre d’analyse 3a soit alimentée à la fois par des réactifs issus de l’entrée additionnel ou du puits 2b et par le liquide issu du puits de culture cellulaire 2a, différentes réalisations sont possibles. Les sorties du premier puits 2a et du deuxième puits 2b se rejoignent au niveau de la première jonction dans un mélangeur afin que le deuxième flux de réactifs se mélange au premier flux de biomarqueurs dans le canal de sortie 5a après la première jonction. En sortie, le mélangeur délivre un liquide correspondant au mélange des deux flux. Il n’y a alors aucun risque que les réactifs ou le débit d’injection des réactifs perturbent les cellules du premier puits 2a.
En alternative, la chambre d’analyse est alimentée alternativement par le puits 2a puis par le puits 2b afin que toutes les sondes voient alternativement le liquide contenant les biomarqueurs de la réponse cellulaire et le liquide contenant les réactifs de révélation.
Par exemple, si la puce comporte trois puits comme cela est illustré aux figures 1 et 5, il est possible d’associer un puits et son canal d’entrée à un flux de réactif. Les deux autres puits sont remplis par des cultures cellulaires. Les sorties des puits contenant des cultures cellulaires se rejoignent chacune avec la sortie du puits associée au réactif de révélation. Là encore, il est possible de prévoir que plusieurs puits contiennent des cellules et que ces puits soient alimentés avec des compositions différentes. Le flux de réactifs est introduit dans le puits central et les puits d’extrémités comportent les cultures cellulaires.
Le puits contenant la culture cellulaire est alimenté par un liquide de nutriments. Après un premier temps d’attente, la culture cellulaire est également alimentée par la molécule à étudier. Simultanément à l’injection de la molécule à étudier ou postérieurement à l’injection, le réactif de révélation est appliqué sur le deuxième canal d’entrée afin que le réactif de révélation s’introduise dans la chambre d’analyse par mélange ou succession avec le liquide issu des puits de culture cellulaire. De manière avantageuse, cet enchaînement d’étapes est réalisé par le générateur de flux qui comporte un circuit de commande. Cette configuration est particulièrement avantageuse lorsque le réactif de révélation est préjudiciable à la culture cellulaire.
Dans un autre mode de réalisation, les deux puits 2a et 2b sont remplis par des cultures cellulaires. Comme précédemment, un flux de liquide comportant des nutriments est appliqué dans chacun des puits 2. Le flux de liquide d’au moins l’un des puits 2 est ensuite modifié afin d’appliquer une molécule à étudier dans chacun des puits 2. Il est envisageable d’appliquer la molécule à étudier dans un seul des puits.
Le réactif de révélation peut être appliqué sur la surface d’analyse hors de la puce après retrait de la paroi d’analyse. Ce mode de réalisation est particulièrement avantageux en combinaison avec la puce illustrée à la figure 2 où deux puits sont utilisés pour alimenter une même chambre d’analyse. Le mode de réalisation illustré aux figures 1 et 5 permet de comparer des conditions différentes en utilisant la condition appliquée dans le puits 2b comme référence.
Le puits 2b peut également être avantageusement associé à l’apport de réactif, les puits 2a et 2c étant alors utilisés pour étudier des conditions opératoires de stimulation des cultures cellulaire. Chaque chambre d’analyse reçoit le même réactif et une réponse cellulaire spécifique provenant du puits 2a ou du puits 2c. En alternative, le puits 2b reçoit la culture cellulaire et les puits 2a et 2c sont associés à des réactifs différents et/ou les deux chambres d’analyse possèdent des sondes 6a différentes.
La puce permet également de fournir deux cultures cellulaires différentes dans deux puits différents dont les sorties se rejoignent ou non dans une même chambre d’analyse. Les deux puits sont soumis aux mêmes flux de liquide, préférentiellement de manière simultanée. Il est alors possible d’observer la réponse des deux cultures différentes.
Il est encore possible de prévoir que deux puits soient remplis par deux cultures différentes et que chaque culture soit soumise à des flux de liquide différents. L’intégration sur une même puce permet de s’assurer que les autres conditions étudiées soient identiques par exemple en ce qui concerne la température, l’humidité et/ou l’atmosphère Dans un mode de réalisation avantageux, le puits est maintenu à une température de consigne, par exemple au moyen d'un incubateur. La température de consigne est avantageusement comprise entre 20 et 45°C, préférentiellement égale à 37°C. Dans un mode de réalisation particulier, l'incubateur est configuré pour appliquer la température de consigne lors du remplissage du puits et lors du remplissage de la chambre d'analyse. En alternative, l'incubateur est configuré pour appliquer la température de consigne une fois que la culture cellulaire est introduite dans le puits. L’incubateur peut également être configuré pour assurer une atmosphère contrôlée avec 5% volumique de C02 et au moins 90% volumique d’humidité. Afin d'avoir des conditions d'études les plus proches des conditions in vivo, Il est particulièrement avantageux de prévoir que le générateur de flux alimente le puits et la chambre d'analyse lorsque la puce est à la température de consigne.

Claims

Revendications
1. Puce micro-fluidique (1) comportant un substrat (A) définissant :
• un premier puits (2a) destiné à recevoir un échantillon biologique, le substrat (A) définissant des parois latérales et au moins une paroi de fond ou de sommet du premier puits (2a), le premier puits (2a) débouchant à la surface d’une face du substrat (A), le premier puits (2a) étant fermé au moyen d’une couche de couverture (8),
• un premier canal d’entrée (4a) destiné à alimenter le premier puits (2a) avec un premier liquide, le premier canal d’entrée (4a) se terminant par une première entrée débouchant dans le premier puits (2a),
• un premier canal de sortie (5a) ayant une première extrémité formée par une première sortie du premier puits (2a) pour évacuer le premier liquide,
• une première chambre d’analyse (3a) possédant une première entrée d’analyse connectée au premier puits (2a) au moyen du premier canal de sortie (5a) et une sortie d’évacuation débouchant dans la première chambre d’analyse (3a) et distincte de la première entrée d’analyse,
puce micro-fluidique dans laquelle la première entrée et la première sortie du premier puits (2a) définissent un premier axe différent et non parallèle à un deuxième axe défini par la première entrée d’analyse et la sortie d’évacuation de la première chambre d’analyse (3a),
caractérisée en ce que la première chambre d’analyse (3a) est fermée par une paroi d’analyse (6) comportant des éléments de captation (6a) configurés pour capturer au moins un biomarqueur du premier liquide circulant dans la première chambre d’analyse (3a), la paroi d’analyse (6) étant montée de manière amovible par rapport au substrat (A) et par rapport à la couche de couverture (8) de manière à pouvoir démonter la paroi d’analyse (6) indépendamment de la couche de couverture (8).
2. Puce micro-fluidique (1 ) selon la revendication 1 , dans laquelle la couche de couverture (8) est montée de manière amovible par rapport à la face du substrat (A).
3. Puce micro-fluidique (1) selon l’une des revendications 1 et 2, dans laquelle la couche de couverture (8) définit au moins un orifice traversant formant un anneau entourant la sortie du premier canal de sortie (5a), l’anneau défini dans la couche de couverture (8) formant complètement ou partiellement les parois latérales de la première chambre d’analyse (3a), la face du substrat (A) formant une paroi de fond de la première chambre d’analyse (3a).
4. Puce micro-fluidique (1 ) selon l’une des revendications 1 à 3, dans laquelle les parois latérales de la première chambre d’analyse (3a) sont partiellement formées dans le substrat (A), la première chambre d’analyse (3a) étant formée par une première cavité débouchant sur la face du substrat (A), la couche de couverture (8) définissant un anneau entourant la première cavité et formant partiellement les parois latérales de la première chambre d’analyse (3a).
5. Puce micro-fluidique (1 ) selon l’une des revendications précédentes dans laquelle les parois latérales du premier canal de sortie (5a) sont formées par une rainure dans la face du substrat (A), la couche de couverture (8) refermant le premier puits (2a) et le premier canal de sortie (5a) jusqu’à la première chambre d’analyse (3a).
6. Puce micro-fluidique (1 ) selon l’une des revendications précédentes dans laquelle le premier canal de sortie (5a) est défini par une rainure formée dans la couche de couverture (8) qui referme le premier puits (2a).
7. Puce micro-fluidique (1 ) selon l’une quelconques des revendications précédentes comportant un canal additionnel (4b, 5b) connecté au premier canal de sortie (5a) entre la sortie du premier puits (2a) et la première chambre d’analyse (3a), le canal additionnel (4b, 5b) étant avantageusement formé par une rainure additionnelle dans la face du substrat (A) et/ou dans la couche de couverture (8).
8. Puce micro-fluidique (1 ) selon l’une quelconque des revendications précédentes dans laquelle la première chambre d’analyse (3a) comporte des première et deuxième entrées d’analyse définissant respectivement des première et deuxième directions d’introduction de liquide dans la première chambre d’analyse (3a).
9. Puce micro-fluidique (1 ) selon l’une quelconque des revendications précédentes comportant une évacuation (7) reliée à la sortie d’évacuation de la première chambre d’analyse (3a) et des premier et deuxième septums configurés pour fermer de manière étanche le premier canal d’entrée (4a) et l’évacuation (7).
10. Puce micro-fluidique (1 ) selon l’une quelconque des revendications précédentes dans laquelle la distance séparant la paroi d’analyse (6) et le fond de la première chambre d’analyse (3a) est inférieure à 2 mm.
11. Laboratoire (20) sur puce micro-fluidique comportant :
• une puce micro-fluidique (1 ) selon l’une quelconque des revendications précédentes, la puce micro-fluidique comportant une paroi d’analyse (6) refermant la première chambre d’analyse (3a) de manière amovible, la paroi d’analyse (6) étant munie d’éléments de captation (6a) configurés pour capturer au moins un biomarqueur du liquide circulant dans la première chambre d’analyse (3a) et issu du premier puits (2a) ;
• un générateur de flux connecté au premier canal d’entrée (4a) de la puce micro-fluidique (1), le générateur de flux étant configuré pour émettre au moins un premier flux de liquide destiné à traverser au moins le premier puits (2a) rempli par un échantillon cellulaire et la chambre d’analyse (3), le premier flux de liquide ayant un débit compris entre 0,1 /L/min et 2 mL/min de sorte que le flux de liquide qui s’écoule dans la première chambre d’analyse (3a) soit laminaire dans au moins une moitié de la première chambre d’analyse (3a) comportant la sortie d’évacuation.
12. Laboratoire (20) sur puce micro-fluidique selon la revendication précédente dans lequel le générateur de flux est connecté à un canal additionnel (4b) de la puce micro-fluidique et dans lequel le générateur de flux est configuré pour :
• appliquer un premier flux sur le premier canal d’entrée (4a) de manière à alimenter le premier puits (2a) pendant une première période, le premier flux comportant un premier liquide comportant au moins des nutriments,
• appliquer un flux additionnel sur le canal additionnel (4b) comportant des réactifs configurés pour réagir avec des biomarqueurs caractéristiques d’une réponse cellulaire de l’échantillon biologique contenu dans le premier puits (2a), les éléments de captation (6a) étant configurés pour capter et/ou réagir avec les biomarqueurs.
13. Procédé de réalisation d’une puce micro-fluidique comportant les étapes successives suivantes :
- fournir une puce micro-fluidique (1) selon la revendication 1 , - refermer le premier puits (2a) au moyen d’une couche de couverture (8) qui forme au moins partiellement les parois latérales de la première chambre d’analyse (3a),
- refermer la première chambre d’analyse (3a) au moyen d’une paroi d’analyse (6) comportant des éléments de captation (6a) configurés pour capturer des biomarqueurs du liquide circulant dans la première chambre d’analyse (3a).
14. Procédé d’analyse d’un échantillon cellulaire comportant :
• fournir une puce micro-fluidique (1) comportant :
o un premier puits (2a) rempli par un échantillon cellulaire émettant une première réponse cellulaire contenant au moins un biomarqueur;
o une première chambre d’analyse (3a) dépourvue d’échantillon cellulaire et possédant une première entrée d’analyse connectée fluidiquement au premier puits (2a) au moyen d’un premier canal de sortie (5a) et une sortie d’évacuation débouchant dans la première chambre d’analyse (3a) et distincte de la première entrée d’analyse,
o des éléments de captation (6a) disposés sur une paroi de la première chambre d’analyse (3), les éléments de captation (6a) étant configurés pour capturer ledit au moins un biomarqueur circulant depuis le premier puits (2a) jusqu’à la première chambre d’analyse (3a);
• appliquer un premier flux de liquide alimentant le premier puits (2a) de sorte que la première réponse cellulaire soit emmenée depuis le premier puits (2) jusqu’à la sortie d’évacuation à travers la première chambre d’analyse (3a), ledit au moins un biomarqueur circulant dans la première chambre d’analyse pour être capté par les éléments de captation (6a),
• analyser les éléments de captation (6a),
dans lequel un substrat (A) monobloc définit au moins partiellement le premier puits (2a) et dans lequel les éléments de captation (6a) sont montés amovibles par rapport à la première chambre d’analyse (3a).
15. Procédé d’analyse selon la revendication précédente comportant la fourniture d’au moins un réactif de révélation configuré pour réagir avec ledit au moins un biomarqueur représentatif de la première réponse cellulaire capté par les éléments de captation (6a), ledit au moins un réactif de révélation traversant la première chambre d’analyse (3a) simultanément ou postérieurement au passage dudit au moins un biomarqueur dans la première chambre d’analyse (3a), l’analyse des éléments de captation (6a) étant réalisée en recherchant ledit au moins un réactif de révélation.
16. Procédé d’analyse selon la revendication précédente comportant appliquer un deuxième flux sur une entrée additionnelle de la puce micro-fluidique (1 ), l’entrée additionnelle débouchant dans le premier canal de sortie (5a) par une première jonction se trouvant entre le premier puits (2a) et la première chambre d’analyse (3a) de sorte que le deuxième flux pénètre dans la première chambre d’analyse (3a), le deuxième flux comportant ledit au moins un réactif de révélation de sorte que ledit au moins un réactif de révélation soit dépourvu de contact avec l’échantillon cellulaire.
17. Procédé d’analyse selon la revendication précédente comportant le remplissage du premier canal de sortie (5a), après la première jonction, alternativement par le premier flux comportant ledit au moins un biomarqueur et par le deuxième flux comportant ledit au moins un réactif de révélation.
18. Procédé d’analyse selon la revendication 16 dans lequel, la première jonction est associée à un mélangeur configuré pour mélanger le premier flux avec le deuxième flux dans le premier canal de sortie (5a) après la première jonction.
19. Procédé d’analyse selon l’une quelconque des revendications 14 à 18, dans lequel la puce micro-fluidique (1 ) comporte un deuxième puits (2b) comportant un échantillon cellulaire additionnel émettant une deuxième réponse cellulaire comportant un biomarqueur additionnel, le deuxième puits (2b) étant connecté fluidiquement à la première chambre d’analyse (3a) par un deuxième canal de sortie (5b) rejoignant le premier canal de sortie (5a) avant la première chambre d’analyse (3a), un générateur de flux alimentant les premier et deuxième puits (2a, 2b) de manière à emmener le biomarqueur et le biomarqueur additionnel représentatifs respectivement des première et deuxième réponses cellulaires dans la première chambre d’analyse (3a) et délivrer des premier et deuxième flux laminaires à l’intérieure de la première chambre d’analyse (3a), le biomarqueur et le biomarqueur additionnel étant présents respectivement dans les premier et deuxième flux laminaires.
20. Procédé d’analyse selon l’une quelconque des revendications 14 à 19, dans lequel le premier puits (2a) est rempli par l’échantillon cellulaire avant la fermeture du premier puits (2a) par une couche de couverture (8), la couche de couverture (8) formant au moins partiellement les parois latérales de la première chambre d’analyse (3a).
21. Procédé d’analyse selon l’une quelconque des revendications 14 à 20, dans lequel la première chambre d’analyse (3a) est fermée au moyen d’une paroi d’analyse (6) comportant les éléments de captation (6a).
22. Procédé d’analyse selon la revendication précédente, comportant le démontage de la paroi d’analyse (6) pour réaliser l’analyse des éléments de captation (6a) hors de la première chambre d’analyse (3a).
23. Procédé d’analyse selon la revendication précédente, dans lequel la puce (1 ) est définie dans un substrat (A), le substrat (A) définissant un fond et une paroi latérale du premier puits (2) et une rainure formant le premier canal de sortie (5a) et dans lequel le procédé d’analyse comporte la fermeture de manière étanche du premier puits (2) et du premier canal de sortie (5a) au moyen d’un couche de couverture (8) amovible.
24. Procédé d’analyse selon la revendication précédente, dans lequel la couche de couverture (8) définit une ouverture (8a) formant un anneau fermé autour de la première chambre d’analyse (3a) et dans lequel le procédé comporte, après l’installation de la couche de couverture (8), l’installation d’une surface d’analyse (6a) fermant la première chambre d’analyse (3a) de manière étanche, la surface d’analyse (6) comportant les éléments de captation (6a).
25. Procédé d’analyse selon l’une quelconques des revendications 22 à 24, dans lequel les parois latérales du premier canal de sortie (5a) sont au moins partiellement formées dans la couche de couverture (8).
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