FR3068364A1

FR3068364A1 - Utilisation de souches de sarcocystidae comme vecteurs multirecombinants d'antigenes pour la prevention de maladies infectieuses

Info

Publication number: FR3068364A1
Application number: FR1756278A
Authority: FR
Inventors: Anne-France Boussemart-Prouvost; Edouard Seche; Melanie Cortes; Pascal Breton
Original assignee: VITAMFERO
Current assignee: VITAMFERO
Priority date: 2017-07-03
Filing date: 2017-07-03
Publication date: 2019-01-04
Also published as: EP3649232A1; WO2019008274A1

Abstract

La présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle la fonction d'au moins une protéine essentielle à la virulence est supprimée, caractérisée en qu'elle contient au moins un acide nucléique codant respectivement pour au moins un antigène hétérologue immunogène et les moyens nécessaires à son expression, sous réserve que lorsque ladite souche mutante contient un acide nucléique codant pour un antigène hétérologue immunogène, ladite souche mutante est dépourvue de gène de sélection, ledit au moins un antigène hétérologue immunogène étant un antigène hétérologue immunogène de virus, de parasite ou de bactérie.

Description

UTILISATION DE SOUCHES DE SARCOCYSTIDAE COMME VECTEURS MULTIRECOMBINANTS D’ANTIGENES POUR LA PREVENTION DE MALADIES INFECTIEUSES

Les Apicomplexes sont des parasites majoritairement intracellulaires obligatoires qui possèdent un cycle de vie pouvant faire intervenir plusieurs hôtes. Le phylum de ces parasites se subdivise en plusieurs familles.

Toxoplasma gondii (T. gondii) appartient à la famille des Sarcocystidae. Le chat, hôte définitif, excrète le parasite dans l’environnement sous forme d’oocystes. Les hôtes intermédiaires (i.e. l’ensemble des homéothermes) et définitif peuvent s’infecter en ingérant des oocystes présents sur les aliments. Le parasite se transforme alors en tachyzoïtes qui se disséminent dans l’organisme et qui, sous la pression du système immunitaire, s’enkystent avec un tropisme préférentiel pour le système nerveux central, la rétine ou les muscles. L’ingestion de tissus enkystés est la deuxième cause de contamination des hôtes définitifs et intermédiaires. Récemment, une souche vivante atténuée de Toxoplasma gondii, le parasite responsable de la toxoplasmose a été mise au point par invalidation de deux gènes codant pour les protéines TgMICl et TgMIC3 (Cérède et al., 2005, J. Exp. Med., 201(3) : 453-63). Cette souche, dénommée Toxo miel-3 KO génère une réponse immunitaire forte et spécifique contre Toxoplasma gondii et permet de prévenir les effets d’une infection ultérieure chez la souris (Ismael et al., 2006, J. Infect. Dis., 194(8) : 1176-83) et chez la brebis (Mévelec et al., 2010, Vet. Res., 41(4) :49).

Neospora caninum (N. caninum) est un parasite intracellulaire, responsable de la néosporose. Il appartient également à la famille des Sarcocystidae. Le cycle de vie de Neospora caninum est très proche de celui de T. gondii avec deux phases distinctes : une phase sexuée chez l’hôte final (i.e. les canidés et le chien en particulier) qui conduit à la production d’oocystes éliminés dans les fèces et une phase asexuée chez un hôte intermédiaire (i.e. les ovins, les caprins, les bovins, les équidés, etc...) qui conduit à la production de tachyzoïtes puis de kystes contenant les bradyzoïtes. Plus récemment, il a été obtenu une souche vivante atténuée de Neospora caninum, la souche Neo ncmicl-3 KO, qui a été invalidée pour les gènes ncmicl et ncmic3 par recombinaison homologue. Il a été montré que cette souche mutante possède des propriétés infectieuses et immunogènes conférant aux mammifères une protection vaccinale vis-à-vis des effets délétères de la néosporose.

Les parasites de la famille Sarcocystis tels que Toxoplasma gondii et Neospora caninum peuvent être utilisés pour exprimer des protéines hétérologues provenant d’autres parasites tels que Plasmodium spp, Cryptosporidium parvum ou Leishmania spp.

Ainsi, la souche sauvage RH de Toxoplasmagondii a été utilisée comme vecteur de l’antigène CSP (Protéine Circum Sporozoite) de Plasmodium knowlesi (Di Cristina et al., 1999, Infect Immun., 67(4) : 1677-82). Après intégration aléatoire de la séquence d’intérêt, la souche recombinante a été inoculée à des singes Rhésus et induit chez l’animal une réponse immunitaire humorale spécifique de la protéine CSP. En la souche thermosensible ts-4 HXGPRT de Toxoplasma gondii a été utilisé comme vecteur de l’antigène CSP de Plasmodium yoelii (Charest et al., 2000, J. Immunol., 165(4) : 2084-92). Après intégration aléatoire de la séquence d’intérêt, les parasites recombinants ont été inoculés à la souris induisant une réponse immunitaire humorale spécifique de l’antigène CSP mais insuffisante pour induire une protection contre une infection avec Plasmodium yoelii.

Une souche de Toxoplasma gondii a également été utilisée pour exprimer les gènes gp40, gpl5 et le précurseur gp40/gpl5 de Cryptosporidium parvum, le parasite responsable de la cryptosporidiose (O’Connor et al., Infect. Immun., 2003 71(10) :6027-35 ; O’Connor et al., 2007, Mol Biochem Parasitol., 152(2) :148-58). Les gènes gp40/gpl5, gp40 et gpl5 ont été clonés, placés sous le contrôle d’un promoteur de T. gondii et intégrés de manière aléatoire dans le génome du parasite. Les auteurs ont montré que les parasites recombinants exprimaient les protéines d’intérêt et que la glycosylation de la protéine GP40 exprimée par T. gondii était similaire à la glycosylation de la protéine native. Cependant, les auteurs ont démontré que le clivage de la pré-protéine GP40/GP15 était inefficace dans les tachyzoïtes bien que des enzymes permettant le clivage soient présentes chez le parasite T. gondii. Une autre équipe s’est également intéressée à l’utilisation de Toxoplasma gondii comme vecteur d’antigène de Cryptosporidium parvum et notamment de la protéine de surface immunodominante P23 (Shirafuji et al., 2005, J. Parasitol., 91(2) :476-9). Le poids moléculaire et les propriétés antigéniques de P23 recombinantes sont similaires à ceux de protéine native et des souris immunisées avec des tachyzoïtes lysés exprimant la protéine P23 produisent des anticorps neutralisant dirigés contre C. parvum.

Enfin, T. gondii a été utilisé comme vecteur d’expression de l’antigène Kmpll de Leishmania. La souche recombinante obtenue permet une protection significative des animaux lors d’un challenge avec Z. major (Ramirez et al., 2001, Vaccine, 20:455-61).

Neospora caninum a également été utilisé comme vecteur d’antigènes hétérologues et une souche recombinante de N. caninum exprimant de manière stable l’antigène S AGI de

T. gondii a été construite (Zhang et al., 2010, Vaccine, 60(1) :105-7). Le niveau d’expression, le poids moléculaire et les propriétés antigéniques de la protéine SAG1 exprimée dans N caninum sont similaires à ceux de la protéine SAG1 native et des souris immunisées produisent une réponse immunitaire de type Thl spécifique de SAG1 de T. gondii et sont protégées contre un challenge létal avec T. gondii.

Les méganucléases sont des endonucléases qui reconnaissent des sites d’ADN très spécifiques de 12 à 45 paires de bases (Thierry et Dujon, 1992, Nucleic Acids Res., 20(21) :5625-31). Dans la Nature, les méganucléases sont retrouvées chez des phages, des bactéries, des archaebactéries et chez différents eucaryotes. Les méganucléases induisent au niveau de leur site de restriction, une coupure double brin de l’ADN (Rouet et al., 1994, Mol Cell Biol., 14(12) :8095-106 ; Choulika et al., 1995, Mol. CellBiol., 15(4) :1968-73 ; Elliott et al., 1998, Mol. CellBiol., 18(1) :93-101 ; Donoho et al., 1998, Mol. CellBiol., 18(7) :4070-8 ; Puchta et al., 1993, Nucleic Acids Res., 21(22) :5034-40 ; Rong et Golic, 2000 ; Rong et Golic, 2001, Science, 288(5473) :2013-8). La très haute spécificité de reconnaissance des sites de restriction et les propriétés d’endonucléase qui favorisent la recombinaison homologue, offre des perspectives de développement très importantes en génie génétique.

Des recherches ont été entreprises pour modifier le site de reconnaissance des méganucléases en modifiant les acides aminés qui participent à l’interaction avec l’ADN sans modifier l’efficacité catalytique de la protéine (Seligman et al., 2002, Nucleic Acids Res., 30(17) :38709 ; Sussman et al., 2004, J. Mol. Biol., 342(1) ::31-41 ; Rosen et al., 2006, Nucleic Acids Res., 34(17) :4791-800 ; Doyon et al., 2006, J. Am. Chem. Soc., 128(7) :2477-84). Une méthodologie pour modifier spécifiquement le site de reconnaissance avec l’ADN et basée sur un screening haut-débit a été précédemment décrit (Arnould et al., 2006, J. Mol. Biol., 355(3) :443-58) et a permis d’aboutir à la construction de nombreuses méganucléases aux propriétés différentes et qui peuvent être utilisées dans de nombreuses applications.

La plupart des thérapies géniques sont basées sur des approches de complémentation dans lesquelles un gène défaillant est complété par l’apport d’une copie saine, en utilisant les fonctions de certains virus qui permettent l’intégration aléatoire, dans le génome, du gène correctif entraînant la réparation du défaut génétique (Hacein-Bey-Abina et al., 2008, J. Clin. Invest., 118(9) :3132-42). Cette approche efficace présente cependant de nombreuses limites et notamment la possibilité que le gène correctif s’insère dans un gène endogène ou qu’il provoque l’activation transcriptionnelle de gènes voisins. L’utilisation des méganucléases en thérapie génique va permettre d’intégrer le gène correctif non plus de manière aléatoire mais en remplacement du gène défaillant. Différentes études in vitro réalisées sur cellules embryonnaires ont démontré que les fréquences de recombinaison étaient comprises entre 10'⁵et 10'¹ événements par cellules (Alwin et al., 2005, Mol Ther., 12(4) :610-7). Récemment, des méganucléases dérivées d’I-Crel ont démontré leur efficacité à induire une recombinaison ciblée de gènes endogènes sur deux loci humains différents, XPG et RAG1 (Smith et al., Nucleic Acids Res., 32(22) :el49 ; Arnould et al., 2007, J. Mol. Biol., 371(1) :49-65 ; Grizot et al., 2009, Nucleic Acids Res., 37(16) : 5405-19 ; Grizot et al., 2009, Nucleic Acids Res., 38(6) : 2006-18) avec des taux de recombinaison pouvant atteindre 6%. Ces fréquences de recombinaison peuvent être suffisante pour des stratégies de réparation de gènes.

Les méganucléases peuvent également être utilisées comme agent antiviral notamment pour les virus à ADN double brin ou pour les virus qui impliquent dans leur cycle une étape ADN double brin. Les méganucléases peuvent être utilisées pour cliver spécifiquement l’ADN viral et soit exciser soit éliminer l’ADN viral des cellules de l’hôte. L’un des avantages de cette approche est la possibilité de cibler les formes latentes du virus. Des expériences en utilisant un herpes-virus (HSV-1) contenant un site de reconnaissance I-Scel ont démontré que la réplication virale pouvait être réduite drastiquement dans des cellules transcfectées avec un plasmide d’expression de l’enzyme I-Scel (Galetto et al., 2009, Expert Opin. Biol Ther., 9(10) : 1289-303). De plus, la méganucléases I-Crel modifiée pour spéficiquement reconnaître un site de l’HSVl permet de réduire de 50% la charge virale (Grosse et al., 2011, Mol. Ther., 19(4) :694-702).

Enfin, les méganucléases peuvent être utilisées comme outil de recherche in cellulo. En effet, comme les méganucléases sont des enzymes de restriction très spécifique qui facilite la recombinaison homologue ciblée dans différents types cellulaires et différents espèces (Arnould et al., 2007, J. Mol. Biol., 371(1) :49-65 ; Grizot et al., 2009, Nucleic Acids Res., 37(16) : 5405-19 ; Grizot et al., 2009, Nucleic Acids Res., 38(6) : 2006-18), elles représentent de puissants outils de recherche pour les modifications génétiques in cellulo incluant l’insertion de transgène, les délétions de gènes et la modulation de l’expression des gènes.

Dans la présente invention, nous avons utilisé les propriétés des méganucléases pour modifier spécifiquement des parasites de la famille des Sarcocystidae tels que Toxoplasma gondii et Neospora caninum et pour construire des souches parasitaires exprimant simultanément plusieurs antigènes hétérologues provenant de parasites, de virus ou de bactéries. La présente invention est la première description de l’utilisation des méganucléases chez des parasites mais également la première description de souches de Sarcocystidae exprimant plusieurs antigènes et potentiellement utilisables en tant qu’outil prophylactique.

La présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle la fonction d’au moins une protéine essentielle à la virulence est supprimée, caractérisée en qu’elle contient au moins un acide nucléique codant respectivement pour au moins un antigène hétérologue immunogène et les éléments nécessaires à son expression, sous réserve que lorsque ladite souche mutante contient un acide nucléique codant pour un antigène hétérologue immunogène, ladite souche mutante est dépourvue de gène de sélection.

Par « protéine essentielle à la virulence » on entend une protéine dont la suppression de la fonction permet de réduire significativement la virulence in vivo du parasite de la famille des Sarcocystidae.

Par « antigène hétérologue immunogène » on entend tout peptide ou protéine provenant d’un organisme différent de ladite souche mutante et capable de provoquer une réaction immunitaire.

Un antigène peut correspondre à un épitope ou à plusieurs épitopes, cela peut être une protéine entière hétérologue, une protéine de fusion, un fragment de protéine, un peptide, une polyprotéine, un polypeptide.

L’expression «moyens nécessaire à l'expression» s’entend de tout moyen qui permet d'obtenir une protéine correspondant ici audit antigène hétérologue immunogène, notamment un promoteur, un terminateur de transcription, une origine de réplication, une séquence de Kozak.

Lesdits moyens nécessaires à l’expression sont liés de façon opérationnelle audit acide nucléique codant pour un antigène hétérologue immunogène.

L’expression «liés de façon opérationnelle», fait référence à une juxtaposition desdits moyens nécessaires à l'expression et l’ADN hétérologue, lesquels sont en une relation telle que cela leur permet de fonctionner de façon attendue. Par exemple, il peut exister des bases supplémentaires entre le promoteur et le gène d'intérêt tant que leur relation fonctionnelle est préservée.

Par l’expression « sous réserve que lorsque ladite souche mutante contient un acide nucléique codant pour un antigène hétérologue immunogène, ladite souche mutante est dépourvue de gène de sélection», on entend que dans le cas où une souche mutante selon l’invention comporte seulement un acide nucléique codant pour un antigène, cette souche ne contient pas de gène de sélection.

Cependant, lorsqu’une souche mutante selon l’invention comporte deux acides nucléiques ou plus, codant respectivement pour un antigène hétérologue immunogène, cette souche peut :

- soit contenir un gène de sélection,

- soit ne pas contenir de gène de sélection, et ainsi être dépourvue de gène de sélection.

Par « gène de sélection », on entend tout gène permettant la survie des cellules en présence d’agents normalement toxiques. Un gène de sélection permet d’apporter notamment la résistance à un antibiotique, un antiparasitaire ou un antiviral. Par exemple, le gène cat (chloramphenicol acetyl transferase) permet la résistance au chloramphénicol, le gène dhfr*(Dihydrofolate reductase) permet la résistance à la pyriméthamine, le gène ble permet la résistance à la phléomycine .

On entend également tout gène permettant la mort des cellules en présence d’agents normalement non toxiques. Un gène de contre sélection permet d’apporter la sensibilité à un antibiotique, un antiparasitaire ou un antiviral. Par exemple, le gène TK (Thymidine kinase) permet la sensibilité au ganciclovir.

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle la fonction d’au moins une protéine essentielle à la virulence est supprimée, caractérisée en qu’elle contient au moins un acide nucléique codant respectivement pour au moins un antigène hétérologue immunogène et les éléments nécessaires à son expression, et caractérisée en ce qu’elle est dépourvue de gène de sélection.

Autrement dit dans ce mode de réalisation, une souche mutante selon l’invention comportant un acide nucléique, deux acides nucléiques ou plus, codant chacun respectivement pour un antigène hétérologue immunogène, ne contient pas de gène de sélection.

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae, dans laquelle la fonction de deux protéines essentielles à la virulence sont supprimées, lesdites deux protéines étant les protéines MIC1 et MIC3.

Les protéines MIC1 et MIC3 sont des protéines des micronèmes, organelles sécrétoires des Apicomplexes qui jouent un rôle central dans la reconnaissance et l’adhésion aux cellules hôtes.

Elles sont respectivement codées par les gènes miel et mic3.

La suppression de la fonction des protéines MIC3 et MIC1, conduit à une souche mutante qui possède des propriétés infectieuses et immunogènes conférant aux mammifères une protection vaccinale.

La famille des Sarcocystidae est une famille qui s’inscrit dans le phylum des Apicomplexes , et qui renferme notamment les genres Toxoplasma spp. et Neospora spp..

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae telle que décrite précédemment, ladite souche mutante étant une souche du genre Toxoplasma spp., en particulier une souche de l’espèce Toxoplasma gondii.

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae telle que décrite précédemment, ladite souche mutante étant une souche du genre Neospora spp., en particulier une souche de l’espèce Neospora caninum.

Les protéines sont les effecteurs de l’activité cellulaire. La suppression de la fonction d’une protéine peut résulter de son absence de biosynthèse ou de sa non fonctionnalité. L’origine de ce dysfonctionnement peut être liée à des perturbations survenant lors de la transcription du gène codant la protéine, lors de sa traduction ou encore survenir lors de processus de maturation de la protéine (modifications post-traductionelles). La délétion du gène explique également qu’aucune protéine ne puisse être synthétisée.

Dans la présente invention, on entend par « la fonction de la protéine MIC1 est supprimée », soit l’absence de l’expression de la protéine MIC1, soit l’expression d’une protéine MIC1 non fonctionnelle, par exemple l’expression d’une protéine ne possédant pas la fonction de la protéine MIC1 et ayant une certaine identité de séquence en acides aminés avec celle de la protéine MIC1.

On entend par « la fonction de la protéine MIC3 est supprimée », soit l’absence de l’expression de MIC3, soit l’expression d’une protéine MIC3 non fonctionnelle, par exemple une protéine ne possédant pas la fonction de la protéine MIC3 et ayant une certaine identité de séquence en acides aminés avec celle de la protéine MIC3.

L’absence de l’expression de la protéine MIC1 et de la protéine MIC3 peut résulter de la délétion de la totalité des gènes miel et mic3 codant respectivement pour les protéines MIC1 et MIC3, ou de sa région codante, ou d’une mutation, d’une délétion ou d’une insertion d’un ou plusieurs nucléotides dans la région codante des gènes miel et mic3 entraînant l’absence d’expression des protéines ou des protéines avec peu d’identité de séquence en acides aminés avec les protéines MIC1 et MIC3, ou d’un dysfonctionnement de la région promotrice ou de la région régulatrice en cis ou en trans des gènes miel et mic3, ou d’un dysfonctionnement d’un ou plusieurs facteurs de transcription susceptibles de se lier à ladite région promotrice, ou d’un dysfonctionnement de la traduction de l’ARN messager, ou de quelques modifications épigénétiques bien connues de l’homme de l’art.

Ainsi, la fonction d’une protéine peut être supprimée par l’inhibition de l’expression des gènes.

On entend par « inhibition de l’expression des gènes miel et mic3 », tous les mécanismes qui perturbent la transcription des gènes miel et mic3 en un ARN messager ou tous les mécanismes qui perturbent la traduction des ARN messager en protéines MIC1 et MIC3, ces deux étapes étant nécessaires à la synthèse d’une protéine MIC1 et MIC3 fonctionnelle.

Une protéine MIC1 non fonctionnelle ou une protéine MIC3 non fonctionnelle est une protéine qui ne possède pas la capacité de reconnaître les cellules hôtes ou qui ne permet pas l’adhésion du parasite audites cellules hôtes. Une protéine non fonctionnelle peut résulter d’une délétion ou d’une insertion d’un ou plusieurs acides aminés ou du décalage du cadre de lecture. Dans ce cas de figure, la modification de l’acide nucléique de la région codante ne bloque pas le mécanisme d’expression de la protéine qui peut éventuellement conserver une certaine identité de séquence en acides aminés avec celle de la protéine MIC1 ou celle de la protéine MIC3, mais change le cadre de lecture de l'ARNm correspondant lors de la traduction de la protéine. La non fonctionnalité de la protéine MIC3 et de la protéine MIC1, peut également être la conséquence de modifications post-traductionnelles inopérantes ou insuffisantes (z.e. glycosylation, isoprénylation, phosphorylation, sulfatation, amidation, acétylation, alkylation, etc) et qui lui permettaient d’assurer sa fonction.

La fonction des protéines MIC3 et MIC1, peut également être supprimée de manière indirecte, notamment en altérant ou en supprimant l’expression d’une ou plusieurs autres protéines (notamment d’autres adhésines) qui se lient aux protéines MIC3 et MIC1, pour former un complexe fonctionnel. La déstructuration d’un tel complexe entraîne une perte de fonction des protéines MIC3 et MIC1.

La fonction d’une protéine peut être supprimée par :

- une mutation, une délétion ou une insertion d’un ou plusieurs nucléotides dans la séquence nucléotidique du gène codant pour ladite protéine, ou

- la délétion totale du gène codant pour ladite protéine, ou

- la délétion totale ou partielle de la région promotrice et/ou la délétion totale ou partielle de la séquence codante, ou

- une déstabilisation de l’ARN messager résultant de la transcription du gène codant pour ladite protéine, ou

- une inhibition de la traduction de l’ARN messager du gène codant pour ladite protéine.

Par « mutation d’un ou plusieurs nucléotides », on entend la substitution, permutation ou le remplacement d'un ou plusieurs nucléotides d'une séquence nucléotidique par un ou plusieurs nucléotides non présents dans la séquence sauvage. Par séquence sauvage, on désigne la séquence nucléotidique trouvée à l’état naturel dans la souche sauvage du parasite. La séquence sauvage est par définition dépourvue de toute intervention humaine par le biais du génie génétique.

Par « délétion d’un ou plusieurs nucléotides », on entend la suppression d'un ou plusieurs nucléotides d’une séquence nucléotidique.

Par « insertion d’un ou plusieurs nucléotides », on entend l'addition, l’ajout ou l’intégration d'un ou plusieurs nucléotides dans une séquence nucléotidique.

La mutation, la délétion ou l'insertion d'un ou plusieurs nucléotides peut avoir lieu à l'intérieur d'un ou plusieurs exons du gène correspondant et modifier par conséquent la région codante dudit gène, ou bien avoir lieu à l'intérieur d'un ou plusieurs introns et modifier le site d'épissage d'un intron concerné. Cette modification du site d'épissage change par conséquent le cadre de lecture de l'ARNm et aboutit à la traduction d’une nouvelle protéine dont la séquence en acides aminés diffère de la séquence de la protéine dite sauvage.

On entend par « délétion totale du gène », la délétion de la séquence codante entière (introns et exons), la délétion de la région promotrice et la délétion des régions transcrites non traduites 5’ et 3’, dites 5’ et 3’UTR, le terme «gène» désignant la région promotrice (également appelée promoteur), la séquence codante et les régions 5’ et 3’ UTR.

On entend par « délétion totale de la région promotrice », la suppression de la séquence promotrice totale c’est-à-dire la suppression de la séquence nucléotidique située en amont de la région 5’ UTR transcrite non traduite qui sert de boîtier de régulation de l’expression d’un gène.

La délétion partielle de la région promotrice ou la délétion partielle de la séquence codante correspond à une délétion partielle du gène.

Par délétion partielle de la séquence codante on entend la suppression d’une partie des exons de la séquence codante, suffisante pour altérer la fonction de la protéine exprimée, ou la suppression d’une partie des introns entraînant une altération de l’épissage.

On entend par « délétion partielle de la région promotrice », la suppression d’une partie de la séquence promotrice c’est-à-dire d’une partie de la séquence nucléotidique située en amont de la région 5’ UTR transcrite non traduite qui sert de boîtier de régulation de l’expression d’un gène.

Par « déstabilisation de TARN messager », on entend une diminution de sa durée de demi-vie, c’est-à-dire de la période de temps pendant laquelle un ARN messager est disponible pour permettre sa traduction en une protéine. La stabilisation des ARN messagers est assurée par des éléments cis (les séquences 5’ et 3’ UTR bordant les séquences codantes d’un gène) et des éléments trans, notamment des protéines capables de se lier aux éléments cis. La durée de demi-vie d’un ARN messager peut varier en réponse à divers stimuli tels que des facteurs environnementaux, des facteurs de croissance ou des hormones. Une modification, réalisée in vitro par génie génétique, des séquences nucléotidiques des éléments cis est susceptible de modifier la durée de demi-vie de l’ARN messager.

Par « inhibition de la traduction de l’ARN messager d’un gène », on entend le blocage de la traduction de l'ARN messager en la protéine lui correspondant. Dans ce cas de figure, l'ARN messager d'un gène est présent dans la cellule, alors que la protéine lui correspondant est absente. L'inhibition de la traduction de l'ARN messager d'un gène peut résulter du dysfonctionnement d’un élément de la machinerie traductionnelle, notamment des ribosomes, des ARNs ribosomiques (ARNr) ou des ARNs de transfert (ARNt), ou des aminoacyl-ARNt synthétases.

Ainsi, selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae, dans laquelle la fonction de la protéine MIC1 est supprimée par :

- une mutation, une délétion ou une insertion d’un ou plusieurs nucléotides dans la séquence nucléotidique du gène miel codant pour la protéine MIC1 et/ou dans la séquence promotrice du gène miel, ou

- la délétion totale du gène miel, ou

- la délétion totale ou partielle de la région promotrice et/ou la délétion totale ou partielle de la séquence codante du gène miel, ou

- une déstabilisation de l’ARN messager résultant de la transcription du gène miel, ou

- une inhibition de la traduction de l’ARN messager du gène miel, et dans laquelle la fonction de la protéine MIC3 est supprimée par :

- une mutation, une délétion ou une insertion d’un ou plusieurs nucléotides dans la séquence nucléotidique du gène mic3 codant pour la protéine MIC3 ou dans la séquence promotrice du gène mic3, ou

- la délétion totale du gène mic3, ou

- la délétion totale ou partielle de la région promotrice et/ou la délétion totale ou partielle de la séquence codante du gène mic3, ou

- une déstabilisation de l’ARN messager résultant de la transcription du gène mic3, ou

- une inhibition de la traduction de l’ARN messager du gène mic3.

Selon un mode de réalisation plus particulier, la souche mutante de Sarcocystidae selon la présente invention est une souche dans laquelle la fonction de la protéine MIC1 est supprimée par délétion totale du gène miel, et la fonction de la protéine MIC3 est supprimée par délétion totale du gène mic3.

Dans un mode de réalisation, ladite souche mutante de Sarcocystidae selon l’invention, comporte au moins un acide nucléique codant respectivement pour au moins un antigène hétérologue immunogène de virus, de parasite ou de bactérie.

Ledit virus peut appartenir aux groupes suivant :

• Groupe I, II de la classification de Baltimore comprenant les virus dont le génome est constitué d’ADN susceptible d’infecter un poussin, en particulier un virus naturel appartenant à la famille des Herpesviridae, et plus particulièrement le virus de la maladie Marek chez la poule domestique, • Groupe III, IV et V de la classification de Baltimore comprenant les virus dont le génome est constitué d’ARN simple brin ou double brin et qui sont susceptibles d’affecter un poussin, en particulier des virus appartenant à la famille des Orthomyxoviridae et plus particulièrement les virus Influenza aviaires.

• Groupe VI de la classification de Baltimore comprenant les virus à ARN requérant une rétrotranscription en ADN pour la multiplication virale et susceptibles d’infecter un poussin, en particulier les virus de la famille des Retroviridae, • Groupe VII de la classification de Baltimore comprenant les virus à ADN requérant une rétrotranscription en ARN pour la multiplication virale et susceptibles d’infecter un poussin, en particulier les virus de la famille des

Hepadnaviridae, et plus particulièrement le virus de l’hépatite du canard de Pékin (DHBV).

Ledit virus qui peut être :

- un myxovirus, en particulier le virus Influenza, ou

- un coronavirus, en particulier le virus de la bronchite infectieuse aviaire, ou

- un reovirus, en particulier du virus de l’arthrite virale du poulet, ou

- un picomavirus, en particulier le virus de l’hépatite du caneton,

- un herpesvirus, en particulier le virus de la maladie de Mareck,

- un adénovirus, en particulier le virus de l’entérite hémorragique de la dinde.

Dans un mode de réalisation particulier, ladite souche mutante de Sarcocystidae selon l’invention, comporte au moins un acide nucléique codant pour un antigène hétérologue immunogène de virus, ledit virus étant le virus Influenza.

Ladite bactérie peut appartenir aux groupes suivant :

• Des Coques GRAM positif qui sont susceptibles d’affecter un poussin directement ou par l’un de ces sous-produits, , en particulier des bactéries appartenant au genre Staphylococcus, Streptococcus ou Enteroccoccus \ • Des Coques GRAM négatif qui sont susceptibles d’affecter un poussin directement ou par l’un de ces sous-produits, en particulier des bactéries appartenant au genre Neisseria \ • Des bacilles GRAM positif qui sont susceptibles d’affecter un poussin directement ou par l’un de ces sous-produits, en particulier des bactéries appartenant au genre Listeria, Erysipelothryx, Corynebacterium ou Bacillus \ • Des bacilles GRAM négatif qui sont susceptibles d’affecter un poussin directement ou par l’un de ces sous-produits, en particulier des bactéries appartenant à la famille des Enterobacteriacae. Pseudomonaceae, Vibrionaceae ou appartenant aux genres Escherichia, Brucella, Haemophilus, Pasteurella, Bordetella, Légionella, Ornithobacterium ou Salmonella • Des bactéries de forme spiralées GRAM positives ou négatives qui sont susceptibles d’affecter un poussin directement ou par l’un de ces sous-produits, en particulier des bactéries appartenant au genre Treponema, Leptospira ou Borrelia -, • Des bactéries de type mycoplasme qui sont susceptibles d’affecter un poussin directement ou par l’un de ces sous-produits, en particulier des bactéries appartenant au genre Mycoplasma et Ureaplasma ', • Des bactéries non sus-mentionnées ayant la capacité d’envahir une cellule de poussin, en particulier des bactéries appartenant au genre Chlamydia, Rickettsia ou Mycobacterium.

Plus particulièrement, ladite bactérie peut être une bactérie des genres:

Escherichia spp., en particulier l’espèce Escherichia coli

Clostridium spp. en particulier l’espèce Clostridiumperfringens

- Mycoplasma spp., en particulier T espèce Mycoplasma gallisepticum,

Salmonella spp., en particulier l’espèce Salmonella pullorum, responsable de la salmonellose aviaire.

Pasteurella spp., en particulier l’espèce Pasteurella multocida

Ornithobacterium spp., en particulier l’espèce Ornithobacterium rhinotracheale Chlamydia spp., responsable de la chlamydiose, en particulier Chlamydia abortum

Salmonella Enteritidis est responsable de toxi-infections alimentaires et de gastro-entérites. L’Homme s’infecte par l’intermédiaire de viandes de volailles ou d’œufs contaminés. La poule domestique est l’un des plus importants vecteurs de salmonelles. Elle s’infecte par voie orale. La bactérie colonise ensuite le tube digestif et peut s’implanter durablement dans les ovaires au cours d’une phase transitoire de dissémination systémique.

Le portage long terme dans le tube digestif, notamment dans les cæca, est responsable de la contamination des viandes lors de l’abattage et de la contamination de la coquille d’œuf lors du passage par le cloaque. Le portage des salmonelles dans les ovaires peut être responsable du transfert vertical des salmonelles à l’intérieur de l’œuf. Ce mode de contamination est moins fréquent mais potentiellement plus dangereux car il est difficilement détectable et il n’y a pas de mesure corrective possible.

Dans un mode de réalisation particulier, ladite souche mutante de Sarcocystidae selon l’invention, comporte au moins un acide nucléique codant pour un antigène hétérologue immunogène de bactérie, ladite bactérie étant Chlamydia abortum.

Ledit parasite peut appartenir aux groupes suivant :

• Protozoaires susceptibles d’affecter directement un poussin, en particulier des protozoaires appartenant à l’embranchement des sporozoaires, Rhizoflagellés, des ciliés ou appartenant aux genres Encephalitozoon, Enterocytozoon ou Blastocystis ;

• Némathelminthes susceptibles d’affecter directement un poussin, en particulier des Némathelminthes appartenant au genre Trichuris, Ascaris, Anisakis, Necator, Strongyloïdes, Toxocara, Ancylostoma, Trichinella, Loa, Onchocerca, Wichereria, ou Enterobius ;

• Plathelminthes susceptibles d’affecter directement un poussin, en particulier des Plathelminthes appartenant au genre Fasciola, Paragonimus, Opisthorchis, Sasciolopsis, Dicrocoelium, Clonorchis, Taenia, Diphyllobothrium, Echinococcus, Multiceps, Hymenolepsis et Shistosoma ;

• Arthropodes susceptibles d’être responsable d’une affection ou de la vectorisation d’un agent infectieux vis-à-vis un poussin, en particulier des arthropodes appartenant à Tordre des Anoploures des hétéroptères, des Shiphonaptères, des Diptères, des Brachycères ou des Acariens.

Plus particulièrement, ledit parasite qui peut être :

Eimeria spp., en particulier l’espèce Eimeria acervulina responsable de la coccidiose

- Echinuria spp., en particulier l’espèce Echinuria uncinata responsable de la spirurose Trichostrongylus spp. en particulier l’espèce Trichostrongylus tenuis

Ascaris spp., en particulier 1 ’espèce Ascaridia galli

Cestoda spp. en particulier l’espèce Choanotaenia infundibulum

Leishmania spp., en particulier T espèce Leishmania infantum.

Dans un mode de réalisation particulier, ladite souche mutante de Sarcocystidae selon l’invention, comporte au moins un acide nucléique codant pour un antigène hétérologue immunogène de parasite, ledit parasite étant Leishmania infantum.

La leishmaniose est une maladie grave, engageant le pronostic vital de l’animal, dont le diagnostic n’est pas toujours aisé et dont le traitement est lourd et coûteux. Il s’agit également d’une maladie transmissible à l’homme. Le chien, bien qu’il ne soit pas forcément directement responsable de la contamination humaine, constitue un important réservoir du parasite (y compris les chiens porteurs du parasite mais n’exprimant pas la maladie).

La leishmaniose est une infection due au parasite Leishmania spp. Elle se contracte via des piqûres répétées d’un insecte : le phlébotome.

Selon un mode de réalisation particulier, la souche mutante de Sarcocystidae selon la présente invention est caractérisée en ce qu’elle contient au moins deux acides nucléiques codant respectivement pour au moins deux antigènes hétérologues immunogènes.

Selon un mode de réalisation particulier, la souche mutante de Sarcocystidae selon la présente invention est caractérisée en ce qu’elle contient au moins deux acides nucléiques codant respectivement pour au moins deux antigènes hétérologues immunogènes de virus.

Dans un mode de réalisation particulier, lesdits au moins deux antigènes hétérologues immunogènes de virus sont des antigènes d’un même virus.

Dans un mode de réalisation particulier, lesdits au moins deux antigènes hétérologues immunogènes de virus sont des antigènes hétérologues immunogènes de deux virus distincts.

Selon un mode de réalisation particulier, la souche mutante de Sarcocystidae selon la présente invention est caractérisée en ce qu’elle contient au moins deux acides nucléiques codant respectivement pour au moins deux antigènes hétérologues immunogènes de bactérie.

Dans un mode de réalisation particulier, lesdits au moins deux antigènes hétérologues immunogènes de bactérie sont des antigènes hétérologues immunogènes d’une même espèce de bactérie.

Dans un mode de réalisation particulier, lesdits au moins deux antigènes hétérologues immunogènes de bactérie sont des antigènes hétérologues immunogènes d’espèces de bactéries distinctes.

Par « espèces de bactéries distinctes », on entend qu’il s’agit de deux espèces de bactéries différentes.

Selon un mode de réalisation particulier, la souche mutante de Sarcocystidae selon la présente invention est caractérisée en ce qu’elle contient au moins deux acides nucléiques codant respectivement pour au moins deux antigènes hétérologues immunogènes de parasite.

Dans un mode de réalisation particulier, lesdits au moins deux antigènes hétérologues immunogènes de parasite sont des antigènes hétérologues immunogènes d’une même espèce de parasite.

Dans un mode de réalisation particulier, lesdits au moins deux antigènes hétérologues immunogènes de parasite sont des antigènes hétérologues immunogènes d’espèces de parasites distinctes.

Par « espèces de parasites distinctes », on entend qu’il s’agit de deux espèces de parasites différentes.

Selon un mode de réalisation particulier, la souche mutante de Sarcocystidae selon la présente invention est caractérisée en ce qu’elle contient au moins deux acides nucléiques codant respectivement pour au moins deux antigènes hétérologues immunogènes, dans laquelle au moins l’un desdits au moins deux acides nucléiques est un acide nucléique codant pour antigène hétérologue immunogène de virus et au moins l’un desdits au moins deux acides nucléiques est un acide nucléique codant pour antigène hétérologue immunogène de bactérie.

Selon un mode de réalisation particulier, la souche mutante de Sarcocystidae selon la présente invention est caractérisée en ce qu’elle contient au moins deux acides nucléiques codant respectivement pour au moins deux antigènes hétérologues immunogènes, dans laquelle au moins l’un desdits au moins deux acides nucléiques est un acide nucléique codant pour antigène hétérologue immunogène de virus et au moins l’un desdits au moins deux acides nucléiques est un acide nucléique codant pour antigène hétérologue immunogène de parasite.

Selon un mode de réalisation particulier, la souche mutante de Sarcocystidae selon la présente invention est caractérisée en ce qu’elle contient au moins deux acides nucléiques codant respectivement pour au moins deux antigènes hétérologues immunogènes, dans laquelle au moins l’un desdits au moins deux acides nucléiques est un acide nucléique codant pour antigène hétérologue immunogène de bactérie et au moins l’un desdits au moins deux acides nucléiques est un acide nucléique codant pour antigène hétérologue immunogène de parasite.

Selon un mode de réalisation particulier, la souche mutante de Sarcocystidae selon la présente invention est caractérisée en ce qu’elle contient au moins trois acides nucléiques codant respectivement pour au moins trois antigènes hétérologues immunogènes.

Selon un mode de réalisation particulier, la souche mutante de Sarcocystidae selon la présente invention est caractérisée en ce qu’elle contient au moins trois acides nucléiques codant respectivement pour au moins trois antigènes hétérologues immunogènes de virus.

Selon un mode de réalisation particulier, la souche mutante de Sarcocystidae selon la présente invention est caractérisée en ce qu’elle contient au moins trois acides nucléiques codant respectivement pour au moins trois antigènes hétérologues immunogènes de bactérie.

Selon un mode de réalisation particulier, la souche mutante de Sarcocystidae selon la présente invention est caractérisée en ce qu’elle contient au moins trois acides nucléiques codant respectivement pour au moins trois antigènes hétérologues immunogènes de parasites.

Selon un mode de réalisation particulier, la souche mutante de Sarcocystidae selon la présente invention est caractérisée en ce qu’elle contient au moins trois acides nucléiques codant respectivement pour au moins trois antigènes hétérologues immunogènes, dans laquelle au moins l’un desdits au moins trois acides nucléiques est un acide nucléique codant pour antigène hétérologue immunogène de bactérie et au moins l’un desdits au moins trois acides nucléiques est un acide nucléique codant pour antigène hétérologue immunogène de parasite et au moins l’un desdits au moins trois acides nucléiques est un acide nucléique codant pour antigène hétérologue immunogène de virus.

Selon un mode de réalisation particulier, la souche mutante de Sarcocystidae selon la présente invention est caractérisée en ce qu’elle contient au moins trois acides nucléiques codant respectivement pour au moins trois antigènes hétérologues immunogènes, dans laquelle au moins deux desdits au moins trois acides nucléiques sont des acides nucléiques codant respectivement pour deux antigènes hétérologues immunogènes de virus et au moins un desdits au moins trois acides nucléiques est un acide nucléique codant pour un antigène hétérologue immunogène de parasite.

Selon un mode de réalisation particulier, la souche mutante de Sarcocystidae selon la présente invention est caractérisée en ce qu’elle contient au moins trois acides nucléiques codant respectivement pour au moins trois antigènes hétérologues immunogènes, dans laquelle au moins deux desdits au moins trois acides nucléiques sont des acides nucléiques codant respectivement pour deux antigènes hétérologues immunogènes de parasite et au moins un desdits au moins trois acides nucléiques est un acide nucléique codant pour un antigène hétérologue immunogène de virus.

Selon un mode de réalisation particulier, la souche mutante de Sarcocystidae selon la présente invention est caractérisée en ce qu’elle contient au moins trois acides nucléiques codant respectivement pour au moins trois antigènes hétérologues immunogènes, dans laquelle au moins deux desdits au moins trois acides nucléiques sont des acides nucléiques codant respectivement pour deux antigènes hétérologues immunogènes de bactérie et au moins un desdits au moins trois acides nucléiques est un acide nucléique codant pour un antigène hétérologue immunogène de parasite.

Selon un mode de réalisation particulier, la souche mutante de Sarcocystidae selon la présente invention est caractérisée en ce qu’elle contient au moins trois acides nucléiques codant respectivement pour au moins trois antigènes hétérologues immunogènes, dans laquelle au moins deux desdits au moins trois acides nucléiques sont des acides nucléiques codant respectivement pour deux antigènes hétérologues immunogènes de parasite et au moins un desdits au moins trois acides nucléiques est un acide nucléique codant pour un antigène hétérologue immunogène de bactérie.

Selon un mode de réalisation particulier, la souche mutante de Sarcocystidae selon la présente invention est caractérisée en ce qu’elle contient au moins trois acides nucléiques codant respectivement pour au moins trois antigènes hétérologues immunogènes, dans laquelle au moins deux desdits au moins trois acides nucléiques sont des acides nucléiques codant respectivement pour deux antigènes hétérologues immunogènes de virus et au moins un desdits au moins trois acides nucléiques est un acide nucléique codant pour un antigène hétérologue immunogène de bactérie.

Selon un mode de réalisation particulier, la souche mutante de Sarcocystidae selon la présente invention est caractérisée en ce qu’elle contient au moins trois acides nucléiques codant respectivement pour au moins trois antigènes hétérologues immunogènes, dans laquelle au moins deux desdits au moins trois acides nucléiques sont des acides nucléiques codant respectivement pour deux antigènes hétérologues immunogènes de bactérie et au moins un desdits au moins trois acides nucléiques est un acide nucléique codant pour un antigène hétérologue immunogène de virus.

Selon un mode de réalisation particulier, ladite souche mutante de Sarcocystidae selon la présente invention est une souche dans laquelle ledit au moins un acide nucléique code pour au moins un antigène hétérologue immunogène de virus, ledit antigène hétérologue immunogène étant un antigène hétérologue immunogène du virus Influenza choisi parmi la liste A suivante: la protéine de SEQ ID NO : 211 (fragment N-ter du virus influenza humain), ou la protéine de SEQ ID NO : 214 (fragment N-ter de la protéine M2e du virus influenza du porc), ou la protéine de SEQ ID NO : 212 (fragment N-ter de la protéine M2 du virus influenza aviaire de type I) ou la protéine de SEQ ID NO : 213 (fragment N-ter de la protéine M2 du virus influenza aviaire de type II), la protéine de SEQ ID NO : 209, la protéine de SEQ ID NO : 206, la protéine de SEQ ID NO 253, la protéine de SEQ ID NO : 233 ou la protéine de SEQ ID NO : 255.

La protéine de SEQ ID NO :209 correspond à la fusion, dans l’ordre de deux protéines SEQ ID NO : 211, d’une protéine SEQ ID NO : 214, une protéine SEQ ID NO :212 et une protéine SEQ ID NO : 213, espacée chacune par un linker SEQ ID NO : 215 pour permettre une bonne conformation des protéines de fusion SEQ ID NO : 206 et SEQ ID NO : 253.

Selon un mode de réalisation particulier, ladite souche mutante de Sarcocystidae selon la présente invention est une souche dans laquelle ledit au moins un acide nucléique code pour au moins un antigène hétérologue immunogène de virus, ledit au moins un acide nucléique étant acide nucléique codant pour un antigène hétérologue immunogène du virus Influenza, choisi parmi la liste B suivante: l’acide nucléique SEQ ID NO :172 codant pour la protéine de SEQ ID NO : 211 (fragment N-ter du virus influenza humain), ou l’acide nucléique SEQ ID NO : 191 codant pour la protéine de SEQ ID NO : 214 (fragment N-ter de la protéine M2e du virus influenza du porc), ou l’acide nucléique SEQ ID NO : 173 codant pour la protéine de SEQ ID NO : 212 (fragment N-ter de la protéine M2 du virus influenza aviaire de type I) ou l’acide nucléique SEQ ID NO : 181 codant pour la protéine de SEQ ID NO : 213 (fragment Nter de la protéine M2 du virus influenza aviaire de type II), l’acide nucléique SEQ ID NO :210 codant pour la protéine de SEQ ID NO : 209, l’acide nucléique SEQ ID NO :310 codant pour la protéine de SEQ ID NO : 206, l’acide nucléique SEQ ID NO :311 codant pour la protéine de SEQ ID NO :253, l’acide nucléique SEQ ID NO :312 codant pour la protéine de SEQ ID NO :255 et l’acide nucléique SEQ ID NO :313 codant pour la protéine de SEQ ID NO : 233.

La présente invention concerne également des modes de réalisation dans lesquelles ladite souche mutante de Sarcocystidae comprend deux ou trois acides nucléiques codant respectivement pour deux ou trois antigènes hétérologues immunogènes du virus Influenza, lesdits deux ou trois antigènes hétérologues immunogènes du virus Influenza, étant également choisis parmi la liste A décrite ci-dessus.

La présente invention concerne également des modes de réalisation dans lesquelles ladite souche mutante de Sarcocystidae comprend deux ou trois acides nucléiques codant respectivement pour deux ou trois antigènes hétérologues immunogènes du virus Influenza, lesdits deux ou trois acides nucléiques étant également choisis parmi la liste décrite B cidessus.

Selon un mode de réalisation particulier, ladite souche mutante de Sarcocystidae selon la présente invention est une souche dans laquelle ledit au moins un acide nucléique code pour au moins un antigène hétérologue immunogène de bactérie, ledit antigène hétérologue immunogène de bactérie étant un antigène hétérologue immunogène de la bactérie Chlamydia abortum choisi parmi la liste C suivante : la protéine CP AF de SEQ ID NO : 289 , la protéine MOMP de SEQ ID NO : 297, la protéine PmpG de SEQ ID NO :270, la protéine de fusion de SEQ ID NO : 288, la protéine de fusion de SEQ ID NO : 296 ou la protéine de fusion de SEQ ID NO : 304.

Selon un mode de réalisation particulier, ladite souche mutante de Sarcocystidae selon la présente invention est une souche dans laquelle ledit au moins un acide nucléique code pour au moins un antigène hétérologue immunogène de bactérie, ledit au moins un acide nucléique étant acide nucléique codant pour un antigène hétérologue immunogène de la bactérie Chlamydia abortum, choisi parmi la liste D suivante : l’acide nucléique SEQ ID NO :290 codant pour la protéine CP AF de SEQ ID NO : 289, l’acide nucléique SEQ ID NO :298 codant pour la protéine MOMP de SEQ ID NO : 297, l’acide nucléique SEQ ID NO :271 codant pour la protéine PmpG de SEQ ID NO : 270, l’acide nucléique SEQ ID NO :294 codant pour la protéine de fusion SEQ ID NO :288, l’acide nucléique SEQ ID NO :302 codant pour la protéine de fusion SEQ ID NO :296, l’acide nucléique SEQ ID NO :292 codant pour la protéine de fusion SEQ ID NO :304.

La présente invention concerne également des modes de réalisation dans lesquelles ladite souche mutante de Sarcocystidae comprend deux ou trois acides nucléiques codant respectivement pour deux ou trois antigènes hétérologues immunogènes de la bactérie Chlamydia abortum, lesdits deux ou trois antigènes hétérologues immunogènes de la bactérie Chlamydia abortum étant également choisis parmi la liste C décrite ci-dessus.

La présente invention concerne également des modes de réalisation dans lesquelles ladite souche mutante de Sarcocystidae comprend deux ou trois acides nucléiques codant respectivement pour deux ou trois antigènes hétérologues immunogènes de la bactérie Chlamydia abortum, lesdits deux ou trois acides nucléiques étant également choisis parmi la liste D décrite ci-dessus.

Selon un mode de réalisation particulier, ladite souche mutante de Sarcocystidae selon la présente invention est une souche dans laquelle ledit au moins un acide nucléique code pour au moins un antigène hétérologue immunogène de parasite, ledit antigène hétérologue immunogène de parasite étant un antigène hétérologue immunogène du parasite Leishmania infantum choisi parmi la liste E suivante : la protéine KMP11 de SEQ ID NO : 259, ou la protéine NH36 de SEQ ID NO : 269, ou la protéine CYP1 de SEQ ID NO : 279, ou la protéine de fusion de SEQ ID NO : 257, ou la protéine de fusion de SEQ ID NO : 267, ou la protéine de fusion de SEQ ID NO : 285.

Selon un mode de réalisation particulier, ladite souche mutante de Sarcocystidae selon la présente invention est une souche dans laquelle ledit au moins un acide nucléique code pour au moins un antigène hétérologue immunogène de parasite, ledit au moins un acide nucléique étant acide nucléique codant pour un antigène hétérologue immunogène du parasite Leishmania infantum, choisi parmi la liste F suivante : l’acide nucléique SEQ ID NO :258 codant pour la protéine KMP11 de SEQ ID NO : 259, l’acide nucléique SEQ ID NO:268 codant pour la protéine NH36 de SEQ ID NO : 269, l’acide nucléique SEQ ID NO:278 codant pour la protéine CYP1 de SEQ ID NO : 279, l’acide nucléique SEQ ID NO:265 codant pour la protéine de fusion de SEQ ID NO : 257, l’acide nucléique SEQ ID NO :275 codant pour la protéine de fusion de SEQ ID NO : 267, ou l’acide nucléique SEQ ID NO :277 codant pour la protéine de fusion de SEQ ID NO : 285.

La présente invention concerne également des modes de réalisation dans lesquelles ladite souche mutante de Sarcocystidae comprend deux ou trois acides nucléiques codant respectivement pour deux ou trois antigènes hétérologues immunogènes du parasite Leishmania infantum, lesdits deux ou trois antigènes hétérologues immunogènes du parasite Leishmania infantum, étant également choisis parmi la liste E décrite ci-dessus.

La présente invention concerne également des modes de réalisation dans lesquelles ladite souche mutante de Sarcocystidae comprend deux ou trois acides nucléiques codant respectivement pour deux ou trois antigènes hétérologues immunogènes du parasite Leishmania infantum, lesdits deux ou trois acides nucléiques étant également choisis parmi la liste F décrite ci-dessus.

Selon un mode particulier de réalisation, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae, dans laquelle ladite souche mutante est une souche de Toxoplasma gondii dans laquelle la fonction de la protéine MIC1 est supprimée par une délétion totale de gène miel codant pour la protéine MIC1 et la fonction de la protéine MIC3 est supprimée par une délétion totale du gène mic3 codant pour la protéine MIC3, et contenant un acide nucléique de séquence SEQ ID NO : 311 codant pour un antigène hétérologue immunogène du virus Influenza de séquence SEQ ID NO : 253 ou contenant un acide nucléique de séquence SEQ ID NO :310 codant pour un antigène hétérologue immunogène du virus Influenza de séquence SEQ ID NO : 206 ou contenant un acide nucléique de séquence SEQ ID NO : 312 codant pour un antigène hétérologue immunogène du virus Influenza de séquence SEQ ID NO : 255, ladite souche étant dépourvue de gène de sélection.

Selon un mode particulier de réalisation, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae, dans laquelle ladite souche mutante est une souche de Toxoplasma gondii dans laquelle la fonction de la protéine MIC1 est supprimée par une délétion totale de gène miel codant pour la protéine MIC1 et la fonction de la protéine MIC3 est supprimée par une délétion totale du gène mie 3 codant pour la protéine MIC3, et contenant deux acides nucléiques de séquence SEQ ID NO : 311 et SEQ ID NO : 310 codant respectivement pour deux antigènes hétérologues immunogènes du virus Influenza de séquence SEQ ID NO : 253, et de séquence SEQ ID NO : 206, ladite souche étant dépourvue de gène de sélection.

Selon un mode particulier de réalisation, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae, dans laquelle ladite souche mutante est une souche de Toxoplasma gondii dans laquelle la fonction de la protéine MIC1 est supprimée par une délétion totale de gène miel codant pour la protéine MIC1 et la fonction de la protéine MIC3 est supprimée par une délétion totale du gène mie3 codant pour la protéine MIC3, et contenant deux acides nucléiques de séquence SEQ ID NO : 312 et SEQ ID NO : 310 codant respectivement pour deux antigènes hétérologues immunogènes du virus Influenza de séquence de séquence SEQ ID NO : 255 et de séquence SEQ ID NO : 206 ou contenant deux acides nucléiques de séquence SEQ ID NO : 312 et SEQ ID NO : 311 codant respectivement pour deux antigènes hétérologues immunogènes du virus Influenza de séquence de séquence SEQ ID NO : 255 et de séquence SEQ ID NO : 253 ladite souche étant dépourvue de gène de sélection ou ladite souche contenant un gène de sélection étant en particulier un gène de sélection conférant une résistance à la pyriméthamine et une sensibilité au ganciclovir, et plus particulièrement de séquence SEQ ID NO :134.

Selon un mode particulier de réalisation, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae, dans laquelle ladite souche mutante est une souche de Neospora caninum dans laquelle la fonction de la protéine MIC1 est supprimée par une délétion totale de gène miel codant pour la protéine MIC1 et la fonction de la protéine MIC3 est supprimée par une délétion totale du gène mic3 codant pour la protéine MIC3, et contenant un acide nucléique de séquence SEQ ID NO : 311 codant pour un antigène hétérologue immunogène du virus Influenza de séquence SEQ ID NO : 253 ou contenant un acide nucléique de séquence SEQ ID NO :310 codant pour un antigène hétérologue immunogène du virus Influenza de séquence SEQ ID NO : 206 ou contenant un acide nucléique de séquence SEQ ID NO : 312 codant pour un antigène hétérologue immunogène du virus Influenza de séquence SEQ ID NO : 255 ladite souche étant dépourvue de gène de sélection.

Selon un mode particulier de réalisation, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae, dans laquelle ladite souche mutante est une souche de Neospora caninum dans laquelle la fonction de la protéine MIC1 est supprimée par une délétion totale de gène miel codant pour la protéine MIC1 et la fonction de la protéine MIC3 est supprimée par une délétion totale du gène mic3 codant pour la protéine MIC3, et contenant deux acides nucléiques de séquence SEQ ID NO : 312 et SEQ ID NO : 310 codant respectivement pour deux antigènes hétérologues immunogènes du virus Influenza de séquence de séquence SEQ ID NO : 255 et de séquence SEQ ID NO : 206 ou contenant deux acides nucléiques de séquence SEQ ID NO : 312 et SEQ ID NO : 311 codant respectivement pour deux antigènes hétérologues immunogènes du virus Influenza de séquence de séquence SEQ ID NO : 255 et de séquence SEQ ID NO : 253 ladite souche étant dépourvue de gène de sélection ou ladite souche contenant un gène de sélection étant en particulier un gène de sélection conférant une résistance à la pyriméthamine et une sensibilité au ganciclovir, et plus particulièrement de séquence SEQ ID NO :134.

Selon un mode particulier de réalisation, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae, dans laquelle ladite souche mutante est une souche de Toxoplasma gondii dans laquelle la fonction de la protéine MIC1 est supprimée par une délétion totale de gène miel codant pour la protéine MIC1 et la fonction de la protéine MIC3 est supprimée par une délétion totale du gène mic3 codant pour la protéine MIC3, et contenant un acide nucléique de séquence SEQ ID NO : 265 codant pour un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID : 257 ou contenant un acide nucléique de séquence SEQ ID NO : 275 codant pour un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID : 267 ou contenant un acide nucléique de séquence SEQ ID NO : 277 codant pour un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID : 285 ladite souche étant dépourvue de gène de sélection.

Selon un mode particulier de réalisation, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae, dans laquelle ladite souche mutante est une souche de Toxoplasma gondii dans laquelle la fonction de la protéine MIC1 est supprimée par une délétion totale de gène miel codant pour la protéine MIC1 et la fonction de la protéine MIC3 est supprimée par une délétion totale du gène mic3 codant pour la protéine MIC3, et contenant deux acides nucléiques de séquence SEQ ID NO : 265 et de séquence SEQ ID NO : 275 codant respectivement pour un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID : 257 et un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID : 267 ou contenant deux acides nucléiques de séquence SEQ ID NO : 265 et de séquence SEQ ID NO : 277 codant respectivement pour un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID : 257 et un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID : 285 ou contenant deux acides nucléiques de séquence SEQ ID NO : 275 et de séquence SEQ ID NO : 277 codant respectivement pour un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID : 267 et un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID : 285 ladite souche étant dépourvue de gène de sélection ou ladite souche contenant un gène de sélection étant en particulier un gène de sélection conférant une résistance à la pyriméthamine et une sensibilité au ganciclovir, et plus particulièrement de séquence SEQ ID NO :134.

Selon un mode particulier de réalisation, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae, dans laquelle ladite souche mutante est une souche de Toxoplasma gondii dans laquelle la fonction de la protéine MIC1 est supprimée par une délétion totale de gène miel codant pour la protéine MIC1 et la fonction de la protéine MIC3 est supprimée par une délétion totale du gène mie 3 codant pour la protéine MIC3, et contenant trois acides nucléiques de séquence SEQ ID NO : 265, de séquence SEQ ID NO : 275 et de séquence SEQ ID NO : 277, codant respectivement pour un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID : 257, un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID : 267, et un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID : 285, ladite souche étant dépourvue de gène de sélection ou ladite souche contenant un gène de sélection étant en particulier un gène de sélection conférant une résistance à la pyriméthamine et une sensibilité au ganciclovir, et plus particulièrement de séquence SEQ ID NO :134.

Selon un mode particulier de réalisation, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae, dans laquelle ladite souche mutante est une souche de Neospora caninum dans laquelle la fonction de la protéine MIC1 est supprimée par une délétion totale de gène miel codant pour la protéine MIC1 et la fonction de la protéine MIC3 est supprimée par une délétion totale du gène mie 3 codant pour la protéine MIC3, et contenant un acide nucléique de séquence SEQ ID NO : 265 codant pour un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID : 257 ou contenant un acide nucléique de séquence SEQ ID NO : 275 codant pour un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID : 267 ou contenant un acide nucléique de séquence SEQ ID NO : 277 codant pour un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID : 285 ladite souche étant dépourvue de gène de sélection.

Selon un mode particulier de réalisation, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae, dans laquelle ladite souche mutante est une souche de Neospora caninum dans laquelle la fonction de la protéine MIC1 est supprimée par une délétion totale de gène miel codant pour la protéine MIC1 et la fonction de la protéine MIC3 est supprimée par une délétion totale du gène mie 3 codant pour la protéine MIC3, et contenant deux acides nucléiques de séquence SEQ ID NO : 265 et de séquence SEQ ID NO : 275 codant respectivement pour un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID : 257 et un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID : 267 ou contenant deux acides nucléiques de séquence SEQ ID NO : 265 et de séquence SEQ ID NO : 277 codant respectivement pour un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID : 257 et un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID : 285 ou contenant deux acides nucléiques de séquence SEQ ID NO : 275 et de séquence SEQ ID NO : 277 codant respectivement pour un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID : 267 et un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID : 285 ladite souche étant dépourvue de gène de sélection ou ladite souche contenant un gène de sélection étant en particulier un gène de sélection conférant une résistance à la pyriméthamine et une sensibilité au ganciclovir, et plus particulièrement de séquence SEQ ID NO :I34.

Selon un mode particulier de réalisation, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae, dans laquelle ladite souche mutante est une souche de Toxoplasma gondii dans laquelle la fonction de la protéine MIC1 est supprimée par une délétion totale de gène miel codant pour la protéine MIC1 et la fonction de la protéine MIC3 est supprimée par une délétion totale du gène mie3 codant pour la protéine MIC3, et contenant un acide nucléique de séquence SEQ ID NO : 294 codant pour un antigène hétérologue immunogène de Chlamydia abortus de séquence SEQ ID : 288 ou contenant un acide nucléique de séquence SEQ ID NO : 302 codant pour un antigène hétérologue immunogène de Chlamydia abortus de séquence SEQ ID : 296 ou contenant un acide nucléique de séquence SEQ ID NO : 292 codant pour un antigène hétérologue immunogène de Chlamydia abortus de séquence SEQ ID : 304 ladite souche étant dépourvue de gène de sélection.

Selon un mode particulier de réalisation, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae, dans laquelle ladite souche mutante est une souche de Neospora caninum dans laquelle la fonction de la protéine MIC1 est supprimée par une délétion totale de gène miel codant pour la protéine MIC1 et la fonction de la protéine MIC3 est supprimée par une délétion totale du gène mic3 codant pour la protéine MIC3, et contenant un acide nucléique de séquence SEQ ID NO : 294 codant pour un antigène hétérologue immunogène de Chlamydia abortus de séquence SEQ ID : 288 ou contenant un acide nucléique de séquence SEQ ID NO : 302 codant pour un antigène hétérologue immunogène de Chlamydia abortus de séquence SEQ ID : 296 ou contenant un acide nucléique de séquence SEQ ID NO : 292 codant pour un antigène hétérologue immunogène de Chlamydia abortus de séquence SEQ ID : 304 ladite souche étant dépourvue de gène de sélection.

La présente invention concerne également un procédé d’obtention d’une souche mutante de Sarcocystidae, dans laquelle ladite souche mutante est une souche de Toxoplasma gondii ou de Neospora caninum dans laquelle la fonction de la protéine MIC1 est supprimée par une délétion totale de gène miel codant pour la protéine MIC1 et la fonction de la protéine MIC3 est supprimée par une délétion totale du gène mic3 codant pour la protéine MIC3, ladite souche étant dépourvue de gène de sélection et contenant au moins un acide nucléique codant respectivement pour au moins un antigène hétérologue immunogène comprenant :

- une étape A de délétion totale du gène mic3, une étape B de délétion totale du gène miel, les étapes A et B pouvant être réalisée dans un ordre A suivi de B ou B suivi de A, puis

- une étape C de modification génétique de la souche avec l’insertion aléatoire d’au moins un plasmide comportant un acide nucléique codant pour un antigène hétérologue immunogène, et un gène de sélection,

- une étape D de validation de la souche ayant intégrée le plasmide de l’étape C par PCR et/ou immunofluorescence et/ou profil de résistance,

- une étape E de suppression du gène de sélection par une méganucléase, en particulier la méganucléase I-Crel

- une étape F de validation de la souche comportant la suppression du gène de sélection de l’étape E par PCR et/ou immunofluorescence et/ou profil de résistance.

La méganucléase est une endonucléase qui reconnaît un site d’ADN très spécifique de 12 à 45 paires de bases. Une méganucléase induit au niveau de son site de restriction, une coupure double brin de l’ADN. Les méganucléases I-Scel et I-Crel sont décrites.

L’étape C est réalisée par pression de sélection, les parasites sont cultivés en présence d’une drogue (pyriméthamine) auquel le parasite est sensible. Seuls les parasites ayant intégré le plasmide pourront avoir une croissance normale en présence de la drogue.

L’étape E est réalisée par pression de sélection (contre-sélection), les parasites sont cultivés en présence d’une drogue (ganciclovir) auquel le parasite est sensible (dû à l’insertion du gène TK). Seuls les parasites ayant perdu la cassette de sélection DHFR*TY-TK SEQ ID NO : 134 suite à l’action de la méganucléase pourront avoir une croissance normale en présence de la drogue.

Dans un mode particulier, la présente invention concerne un procédé d’obtention d’une souche mutante de Sarcocystidae, dans laquelle ladite souche mutante est une souche de Toxoplasma gondii ou de Neospora caninum.

dans laquelle la fonction de la protéine MIC1 est supprimée par une délétion totale de gène miel codant pour la protéine MIC1 et la fonction de la protéine MIC3 est supprimée par une délétion totale du gène mie 3 codant pour la protéine MIC3, ladite souche étant dépourvue de gène de sélection et contenant au moins un acide nucléique codant respectivement pour au moins un antigène hétérologue immunogène comprenant :

- une étape A comprenant ou constituée de la délétion du gène mic3 par recombinaison homologue et insertion d’une cassette de sélection encadrée par deux sites de recombinaison spécifique identiques , suivi de l’excision de ladite cassette de sélection par une enzyme permettant la recombinaison spécifique, ladite enzyme étant en particulier la Cre-recombinase, suite à laquelle un seul des deux sites de recombinaison spécifique encadrant la cassette reste intégré au locus dudit gène mic3 délété, une étape B comprenant ou constituée de la délétion du gène miel par recombinaison homologue et insertion d’une cassette de sélection encadrée par deux sites de recombinaison spécifique identiques, suivi de l’excision de ladite cassette de sélection par une enzyme permettant la recombinaison spécifique, ladite enzyme étant en particulier la Cre-recombinase, suite à laquelle un seul des deux sites de recombinaison spécifique encadrant la cassette reste intégré au locus dudit gène miel délété les deux sites de recombinaison spécifique encadrant la cassette de sélection insérée au locus du gène miel étant différents des deux sites de recombinaison spécifique encadrant la cassette de sélection insérée au locus du gène mic3, les étapes A et B pouvant être réalisée dans un ordre A suivi de B ou B suivi de A, puis

A la suite des étapes A et B, la souche mutante de Sarcocystidae, comporte la délétion totale du gène mie 3 et la délétion totale du gène miel.

Par action d’une enzyme permettant une recombinaison spécifique, il est donc obtenu une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle les deux gènes miel et mic3 sont délétés, contenant deux sites de recombinaison spécifique d’une enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, lesdits sites de recombinaison spécifique étant au locus respectif de chacun des susdits gènes délétés, le site de recombinaison spécifique de l’enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment de la Cre-recombinase, au locus du gène miel délété étant différent de celui au locus du gène mie3 délété.

Par « enzyme permettant une recombinaison spécifique », on entend enzyme catalysant la recombinaison d'ADN dans un sens défini, entre des sites spécifiques déterminés par des séquences propres à chaque enzyme. Elle permettent notamment l'excision, l’insertion, l'inversion ou la translocation d’une séquence nucléotidique flanquée de sites spécifiques. Comme exemple d’enzyme permettant une recombinaison spécifique, on peut citer par exemple la Cre recombinase, la FLP recombinase, la Tre recombinase, les protéines RecA et Hin recombinase (bactérie).

La Cre recombinase est une topoisomerase dérivée du bactériophage PI, cette enzyme est fonctionnelle chez les parasites. L’utilisation possible de plusieurs sites lox n’interagissant pas entre eux permet d’envisager plusieurs délétions.

Comme exemples de sites de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase (sites lox), on peut citer de manière non exhaustive, les sites loxP, loxN, lox2272, lox71, lox66, lox511, lox5171 etloxM2.

Selon un mode particulier de réalisation, ladite enzyme permettant une recombinaison spécifique est la Cre-recombinase, et lesdites sites de recombinaison spécifique sont choisis parmi les sites loxN SEQ ID NO : 5 et loxP SEQ ID NO : 12.

Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae telle que décrite précédemment, pour son utilisation comme médicament, en particulier comme vaccin.

Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae telle que décrite précédemment, pour son utilisation comme immunostimulant.

On entend par « immunostimulant », que ladite souche mutante, contenant éventuellement un ADN hétérologue codant pour un antigène hétérologue immunogène, permet de stimuler les défenses immunitaires (comme un vaccin, par exemple).

Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne une composition pharmaceutique comprenant une souche mutante de Sarcocystidae telle que décrite précédemment, et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne une composition pharmaceutique comprenant une souche mutante de Sarcocystidae telle que décrite précédemment, et comprenant au moins un produit choisi parmi : un adjuvant, un stabilisant ou un conservateur, ou un mélange de ceux-ci.

Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne une composition pharmaceutique comprenant une souche mutante de Sarcocystidae telle que décrite précédemment, formulée sous forme de dose unitaire variant de 10² à 10⁹ tachyzoïtes d’une souche mutante telle que définie précédemment.

Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne une composition vaccinale comprenant une souche mutante de Sarcocystidae telle que décrite précédemment, et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae telle que décrite précédemment pour son utilisation dans la prévention de pathologies d’origine virale, parasitaire ou bactérienne chez un mammifère, ledit mammifère étant choisi parmi les ovidés, les caprins, les porcins, les bovins, les équidés, les camélidés, les canidés ou les félidés, ou chez un oiseau.

La présente invention concerne également une souche mutante de Sarcocystidae selon l’invention, comportant au moins un acide nucléique codant pour un antigène hétérologue immunogène de virus, pour utilisation dans la prévention de la pathologie associée audit virus.

Dans un mode particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae selon l’invention, comportant au moins un acide nucléique codant pour un antigène hétérologue immunogène de virus Influenza, pour utilisation dans la prévention de la grippe aviaire.

La présente invention concerne également une souche mutante de Sarcocystidae selon l’invention, comportant au moins un acide nucléique codant pour un antigène hétérologue immunogène de parasite, pour utilisation dans la prévention de la pathologie associée audit parasite.

Dans un mode particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae selon l’invention, comportant au moins un acide nucléique codant pour un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum, pour utilisation dans la prévention de la leishmaniose.

La présente invention concerne également une souche mutante de Sarcocystidae selon l’invention, comportant au moins un acide nucléique codant pour un antigène hétérologue immunogène de bactérie, pour utilisation dans la prévention de la pathologie associée à la dite bactérie.

Dans un mode particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae selon l’invention, comportant au moins un acide nucléique codant pour un antigène hétérologue immunogène de Chlamydia abortum, pour utilisation dans la prévention de la chlamydiose.

DESCRIPTIONS DES FIGURES

Figure 1 : cette figure est une représentation schématique de recombinaison par le système Cre/loxP appliqué au gène X encadré par les sites loxP identiques

Figure 2-A : cette figure est une représentation schématique du plasmide pNcMIC3-K0CAT-GFP loxN. Ce plasmide de 10063 paires de bases comprend le gène de sélection codant pour la protéine chimérique CAT-GFP placé sous le contrôle du promoteur de Ι’α-tubuline de Toxoplasma gondii pour permettre l’expression du gène dans le parasite. Cette cassette de sélection est encadrée par deux sites loxN identiques de même orientation, ajoutés par PCR. De part et d’autre de la cassette, les régions homologues et flanquée par les régions homologues des séquences flanquant le gène ncmic3.

Figure 2-B : cette figure est une représentation schématique du plasmide pNcMICl-KOCAT-GFP loxP. Ce plasmide de 10069 paires de bases comprend le gène de sélection codant pour la protéine chimérique CAT-GFP placé sous le contrôle du promoteur de Ι’α-tubuline de Toxoplasma gondii pour permettre l’expression du gène dans le parasite. Cette cassette de sélection est encadrée par deux sites loxP identiques de même orientation, ajoutés par PCR. De part et d’autre de la cassette, les régions homologues et flanquée par les régions homologues des séquences flanquant le gène tgmic3.

Figure 2-C : cette figure est une représentation schématique du plasmide pTSAGl- Cre Recombinase. Ce plasmide de 4 694 paires de bases comprend le gène codant pour la protéine CRE-Recombinase placé sous le contrôle du promoteur de sagl de Toxoplasma gondii pour permettre l’expression du gène dans le parasite. En aval du gène codant la Cre Recombinase, la séquence 3’UTR du gène sagl de Toxoplasma gondii est insérée pour stabiliser l’ARNm codant la protéine Cre Recombinase.

Figure 3-A : cette figure illustre les 4 étapes pour obtenir la souche Neo ncmicl-3 KO 2G. La première étape de recombinaison homologue permet l’intégration du gène codant pour l’enzyme CAT-GFP au locus du gène mic3. Une sélection par le chloramphénicol permet d’amplifier la souche simple mutante Neo ncmic3 KO. Dans une seconde étape, le gène codant pour la protéine CAT-GFP est supprimé par action de la Cre Recombinase. La troisième étape permet l’intégration du gène codant pour l’enzyme CAT-GFP au locus du gène miel. Une sélection par le chloramphénicol permet d’amplifier la souche simple mutante Neo ncmicl-3 KO. Enfin, dans une dernière étape, le gène codant pour la protéine CAT-GFP est supprimé par action de la Cre Recombinase.

Figure 3-B : cette figure représente les profils électrophorétiques des produits PCR obtenus respectivement avec la souche sauvage NC-1 de Neospora caninum, la souche Neo ncmic3 KO, la souche Neo ncmic3 KO 2G, la souche Neo ncmicl-3 KO et la souche Neo ncmicl-3 KO 2G en utilisant les jeux d’amorces des PCR du Tableau 3.

Figure 3-C : cette figure représente les résultats des séquençages obtenus sur la souche Neo ncmic7-3 KO 2G et conforme que les gènes miel et mic3 ont été supprimés et remplacés respectivement par des cicatrices LoxP et LoxN.

Figure 4-A : cette figure illustre l’analyse par immunofluorescence de la détection de la protéine MIC3 obtenue respectivement avec la souche sauvage NC-1 de Neospora caninum et souche Neo ncmicl-3 KO 2G en utilisant un anticorps spécifiquement dirigé contre la protéine MIC3.

Figure 4-B : cette figure illustre l’analyse par immunofluorescence de la détection de la protéine CATGFP obtenue respectivement avec la souche sauvage NC-1 de Neospora caninum et les souches mutantes de Neospora caninum en utilisant la fluorescence intrinsèque de la protéine CATGFP. Cette figure permet de mettre en évidence la présence de la protéine CATGFP ou l’absence de la protéine CATGFP suite à l’action de la Cre Recombinase.

Figure 5-A : cette figure est une représentation schématique du plasmide pTgMIC3-KOCAT-GFP loxP. Ce plasmide de 9 931 paires de bases comprend le gène de sélection codant pour la protéine chimérique CAT-GFP placé sous le contrôle du promoteur de Ι’α-tubuline de Toxoplasma gondii pour permettre l’expression du gène dans le parasite. Cette cassette de sélection est encadrée par deux sites loxP identiques de même orientation, ajoutés par PCR. De part et d’autre de la cassette, les régions homologues et flanquée par les régions homologues des séquences flanquant le gène tgmic3.

Figure 5-B : cette figure est une représentation schématique du plasmide pTgMICl-KOCAT-GFP loxN. Ce plasmide de 10 285 paires de bases comprend le gène de sélection codant pour la protéine chimérique CAT-GFP placé sous le contrôle du promoteur de Ι’α-tubuline de Toxoplasma gondii pour permettre l’expression du gène dans le parasite. Cette cassette de sélection est encadrée par deux sites loxN identiques de même orientation, ajoutés par PCR. De part et d’autre de la cassette, les régions homologues et flanquée par les régions homologues des séquences flanquant le gène tgmic3.

Figure 6-A : cette figure illustre les 4 étapes pour obtenir la souche Toxo tgmicl-3 KO 2G. La première étape de recombinaison homologue permet l’intégration du gène codant pour l’enzyme CAT-GFP au locus du gène mic3. Une sélection par le chloramphénicol permet d’amplifier la souche simple mutante Toxo tgmic3 KO. Dans une seconde étape, le gène codant pour la protéine CAT-GFP est supprimé par action de la Cre Recombinase. La troisième étape permet l’intégration du gène codant pour l’enzyme CAT-GFP au locus du gène miel. Une sélection par le chloramphénicol permet d’amplifier la souche simple mutante Toxo tgmicl-3 KO. Enfin, dans une dernière étape, le gène codant pour la protéine CAT-GFP est supprimé par action de la Cre Recombinase.

Figure 6-B : cette figure représente les profils électrophorétiques des produits PCR obtenus respectivement avec la souche sauvage RH de Toxoplasma gondii, la souche Toxo tgmic3KO, la souche Toxo tgmicri KO 2G, la souche Toxo tgmicl-3 KO et la souche finale Toxo tgmic7-3 KO 2G en utilisant les jeux d’amorces des PCR du Tableau 7.

Figure 6-C : cette figure représente les résultats des séquençages obtenus sur la souche Toxo tgmic7-3 KO 2G et conforme que les gènes miel et mic3 ont été supprimés et remplacés respectivement par des cicatrices LoxN et LoxP.

Figure 7 : cette figure illustre l’analyse par immunofluorescence de la détection des protéines MIC1, MIC3 ou CAT-GFP obtenus respectivement avec la souche sauvage RH de Toxoplasma gondii, la souche Toxo tgmic3 KO, la souche Toxo tgmic3 KO 2G, la souche Toxo tgmicl-3 KO et la souche Toxo tgmicl_3 KO 2G en utilisant un anticorps spécifiquement dirigé contre la protéine MIC1, MIC3 ou directement avec les propriétés fluorescentes intrinsèques de la protéine CAT-GFP.

Figure 8 : cette figure est une représentation schématique du plasmide pTgRoplôKOGral5nKI-CAT-GFP lox2272. Ce plasmide de 12721 paires de bases comprend le gène de sélection codant pour la protéine chimérique CAT-GFP placé sous le contrôle du promoteur de Ι’α-tubuline de Toxoplasma gondii pour permettre l’expression du gène dans le parasite. Cette cassette de sélection est encadrée par deux sites lox2272 identiques de même orientation, ajoutés par PCR. En aval de cette cassette a été intégré la cassette d’expression permettant de coder la protéine Gral5HAII. Puis de part et d’autre de ces cassettes ont été insérées les régions homologues flanquant le gène tgroplô.

Figure 9-A : cette figure illustre les 2 étapes pour obtenir la souche Toxo micl-3 KO ropl6 KO GRA15n KI-2G. La première étape de recombinaison homologue permet l’intégration du gène codant pour l’enzyme CAT-GFP et le gène gralSIIHA au locus du gène ropl6. Line sélection par le chloramphénicol permet d’amplifier la souche mutante Toxo micl3 KO ropl6 KO GRA15n Kl. Dans une seconde étape, le gène codant pour la protéine CATGFP est supprimé par action de la Cre Recombinase pour obtenir la souche Toxo micl3 KO ropl6 KO GRA15_n KI-2G.

Figure 9-B : cette figure représente les profils électrophorétiques des produits PCR obtenus respectivement avec les souches Toxo micl-3 KO 2G, Toxo micl-3 KO ropl6 KO GRA15n Kl et Toxo micl-3 KO ropl6 KO GRA15_n Kl 2G.

Figure 9-C : cette figure représente les résultats des séquençages obtenus sur la souche Toxo micl-3 KO ropl6 KO GRA15n Kl 2G et confirme que les gènes ropl6 et cat-gfp ont été supprimés et remplacés par la cicatrice Lox2272 et le gène gralSHAII.

Figure 10 : cette figure illustre l’analyse par immunofluorescence de la détection de la protéine GRA15 (via le tag HA) obtenu respectivement avec les souches Toxo micl3 KO ropl6 KO GRA15n Kl et Toxo micl-3 KO ropl6 KO GRA15n KI-2G en utilisant un anticorps spécifiquement dirigé contre le tag HA. Cette figure illustre également la suppression de la cassette CATGFP avec la disparition de la fluorescence GFP pour la souche Toxo micl-3 KO ropl6 KO GRA15_n KI-2G.

Figure 11-A : cette figure illustre la position des amorces nucléiques utilisées dans la présente invention pour détecter la présence des trois gènes ricmic3, ncmicf cat-gfp dans les souches sauvages et/ou des souches mutantes de Neo ncmic3 KO et/ou Neo ncmic3 KO 2G et/ou Neo ncmicl-3 KO et/ou Neo ncmicl-3 KO 2G de Neospora caninum. Les chiffres représentent la numérotation des séquences d’amorces (SEQ ID NO :x) définies dans la présente demande.

Figure 11-B : cette figure illustre la position des amorces nucléiques utilisées dans la présente invention pour détecter la présence des trois gènes tgmic3, tgmicf cat-gfp dans les souches sauvages et/ou des souches mutantes de Toxo tgmic3 KO et/ou Toxo tgmic3 KO 2G et/ou Toxo tgmicl-3 KO et/ou Toxo tgmicl-3 KO 2G de Toxoplasma gondii. Les chiffres représentent la numérotation des séquences d’amorces (SEQ ID NO :x) définies dans la présente demande.

Figure 11-C : cette figure illustre la position des amorces nucléiques utilisées dans la présente invention pour détecter la présence des trois gènes tgroplô, gralSII, cat-gfp dans les souches sauvages et/ou des souches mutantes de Toxo micl-3 KO rop!6 KO Gral5II Kl de Toxoplasma gondii. Les chiffres représentent la numérotation des séquences d’amorces (SEQ ID NO :x) définies dans la présente demande.

Figure 12 cette figure est une représentation schématique du plasmide pUC18 4G2 Icrel. Ce plasmide de 8364 paires de bases comprend le gène de sélection codant pour la protéine chimérique DHFR*-TY-TK placé sous le contrôle du promoteur de DHFR de Toxoplasma gondii pour permettre l’expression du gène dans le parasite. Cette cassette de sélection est encadrée par deux sites Icrel identiques avec une orientation inversée, ajoutés par PCR. De part et d’autre de cette cassette, des séquences permettant la validation de la recombinaison ont également été insérés par PCR (αβ en amont et βγ en aval). Enfin une cassette d’expression permettant l’expression d’un futur transgène a été inséré, cette cassette d’expression se compose d’un promoteur boosté (fusion du promoteur de sagl et de l’atubuline de Toxoplasma gondii et d’un 3’UTR de sagl de Toxoplasma gondii.

Figure 13 : Mécanisme d’action de la méganucléase I-Crel et obtention de souches dépourvues de gènes de sélection

Figure 14 : cette figure est une représentation schématique du plasmide pTgsagl Icrel αβγ. Ce plasmide de 4166 paires de bases comprend le gène codant la méganucléase I-Crel placé sous le contrôle du promoteur de Ι’α-tubuline de Toxoplasma gondii pour permettre l’expression du gène dans le parasite. Le plasmide contient également la séquence αβγ, matrice qui permettra de favoriser la recombinaison entre les parties αβ et βγ après coupure par la méganucléase I-Crel.

Figure 15 cette figure est une représentation schématique du plasmide pUC18 4G2 Icrel M2e. Ce plasmide de 9796 paires de bases comprend le gène codant la protéine de fusion SAGlM2e placé sous le contrôle du promoteur de Ι’α-tubuline de Toxoplasma gondii pour permettre l’expression du gène dans le parasite.

Figure 16 cette figure est une représentation schématique du plasmide pUC18 4G2 Icrel M2eGPI. Ce plasmide de 9874 paires de bases comprend le gène codant la protéine de fusion SAGlM2eGPI placé sous le contrôle du promoteur de Ι’α-tubuline de Toxoplasma gondii pour permettre l’expression du gène dans le parasite.

Figure 17 cette figure est une représentation schématique du plasmide pUC18 4G2 Icrel HA. Ce plasmide de 10030 paires de bases comprend le gène codant la protéine de fusion SAG1HAGPI placé sous le contrôle du promoteur de Ι’α-tubuline de Toxoplasma gondii pour permettre l’expression du gène dans le parasite.

Figure 18 : cette figure représente les profils électrophorétiques des produits PCR obtenus pour les souches Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e et Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e avec les mix : « Mix M2e », « Mix M2eGPI ou M2e », « Mix Gène d’intérêt » et « Mix DHFR*TYTK ».

Figure 19: cette figure illustre l’analyse par immunofluorescence de la détection de la protéine M2e obtenue respectivement avec les souches Toxo tgmicl-3 KO - 2G , Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e et Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e Icrel en utilisant un anticorps spécifiquement dirigé contre la protéine M2e.

Figure 20 : cette figure représente les profils électrophorétiques des produits PCR obtenus pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e Icrel et Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e Icrel avec les mix : « Mix M2e », « Mix M2eGPI ou M2e », « Mix Gène d’intérêt », « Mix DHFR*TYTK » et Mix Icrel M2eGPI ou M2e.

Figure 21 : cette figure représente les profils électrophorétiques des produits PCR obtenus pour les souches Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI et Neo ncmicl-3 KO - 2G M2eGPI avec les mix : « Mix M2eGPI ou M2e », « Mix Gène d’intérêt » et « Mix DHFR*TYTK ».

Figure 22: cette figure illustre l’analyse par immunofluorescence de la détection de la protéine M2e obtenue respectivement avec les souches Toxo tgmicl-3 KO - 2G , Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI et Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI Icrel en utilisant un anticorps spécifiquement dirigé contre la protéine M2e.

Figure 23 : cette figure représente les profils électrophorétiques des produits PCR obtenus pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI Icrel avec les mix : «Mix M2eGPI ou M2e », « Mix Gène d’intérêt », « Mix DHFR*TYTK » et « Mix Icrel M2eGPI ou M2e ».

Figure 24 : cette figure représente les profils électrophorétiques des produits PCR obtenus pour les souches Toxo tgmicl-3 KO - 2G HA et Neo ncmicl-3 KO - 2G HA avec les mix : « Mix HA», « Mix Gène d’intérêt » et « Mix DHFR*TYTK ».

Figure 25: cette figure illustre l’analyse par immunofluorescence de la détection de la protéine HA obtenue respectivement avec les souches Toxo tgmicl-3 KO - 2G , Toxo tgmicl3 KO - 2G HA et Toxo tgmicl-3 KO - 2G HA Icrel en utilisant un anticorps spécifiquement dirigé contre la protéine HA.

Figure 26 : cette figure représente les profils électrophorétiques des produits PCR obtenus pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G HA Icrel avec les mix : « Mix HA », « Mix Gène d’intérêt », « Mix DHFR*TYTK » et Mix Icrel HA.

Figure 27 : cette figure représente les profils électrophorétiques des produits PCR obtenus pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA avec les mix : « Mix M2eGPI ou M2e » , « Mix HA», « Mix Gène d’intérêt » , « Mix DHFR*TYTK » et « Mix Icrel M2eGPI ou M2e »..

Figure 28: cette figure illustre l’analyse par immunofluorescence de la détection des protéines M2e et HA obtenue respectivement avec les souches Toxo tgmicl-3 KO - 2G et

Toxo lgmic\-3 KO - 2G M2eGPI HA en utilisant un anticorps spécifiquement dirigé contre les protéines M2e et HA.

Figure 29 : cette figure représente les profils électrophorétiques des produits PCR obtenus pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA Icrel_avec les mix : « Mix M2eGPI ou M2e » « Mix HA », « Mix Gène d’intérêt », Mix Icrel HA et « Mix Icrel M2eGPI ou M2e ».

Figure 30: cette figure illustre l’analyse par immunofluorescence de la détection des protéines M2e et HA obtenue respectivement avec les souches Toxo tgmicl-3 KO - 2G, Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA et Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA crel en utilisant un anticorps spécifiquement dirigé contre les protéines M2e et HA.

Figure 31 : cette figure représente les profils électrophorétiques des produits PCR obtenus pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e HA avec les mix : « Mix M2e », « Mix M2eGPI ou M2e » , « Mix HA», « Mix Gène d’intérêt » , « Mix DHFR*TYTK » et « Mix Icrel M2eGPI ou M2e ».

Figure 32: cette figure illustre l’analyse par immunofluorescence de la détection des protéines M2e et HA obtenue respectivement avec les souches Toxo tgmicl-3 KO - 2G et Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e HA en utilisant un anticorps spécifiquement dirigé contre les protéines M2e et HA.

Figure 33: cette figure illustre l’analyse par immunofluorescence de la détection de la protéine M2e obtenue respectivement avec les souches Neo ncmicl-3 KO - 2G , Neo ncmicl3 KO - 2G M2e et Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e Icrel en utilisant un anticorps spécifiquement dirigé contre la protéine M2e.

Figure 34: cette figure illustre l’analyse par immunofluorescence de la détection de la protéine M2e obtenue respectivement avec les souches Neo ncmicl-3 KO - 2G et Neo ncmicl-3 KO - 2G M2eGPI en utilisant un anticorps spécifiquement dirigé contre la protéine M2e.

Figure 35: cette figure illustre l’analyse par immunofluorescence de la détection de la protéine HA obtenue respectivement avec les souches Neo ncmicl-3 KO - 2G et Neo ncmicl3 KO - 2G HA en utilisant un anticorps spécifiquement dirigé contre la protéine HA.

Figure 36: cette figure illustre l’analyse par immunofluorescence de la détection des protéines M2e et HA obtenue respectivement avec les souches Neo ncmicl-3 KO - 2G, Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e Icrel et Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e HA en utilisant un anticorps spécifiquement dirigé contre les protéines M2e et HA.

Figure 37: cette figure est une représentation schématique du plasmide pUC18 4G2 Icrel Kmpll. Ce plasmide de 8665 paires de bases comprend le gène codant la protéine Kmpll placé sous le contrôle du promoteur de Ι’α-tubuline de Toxoplasma gondii pour permettre l’expression du gène dans le parasite.

Figure 38 : cette figure est une représentation schématique du plasmide pUC18 4G2 Icrel Nh36. Ce plasmide de 9643 paires de bases comprend le gène codant la protéine Nh36 placé sous le contrôle du promoteur de Τα-tubuline de Toxoplasma gondii pour permettre l’expression du gène dans le parasite.

Figure 39 : cette figure est une représentation schématique du plasmide pUC18 4G2 Icrel Cypl. Ce plasmide de 8917 paires de bases comprend le gène codant la protéine Cypl placé sous le contrôle du promoteur de Τα-tubuline de Toxoplasma gondii pour permettre l’expression du gène dans le parasite.

Figure 40 : cette figure représente les profils électrophorétiques des produits PCR obtenus respectivement avec la souche ToxoKO 2G (1), la souche ToxoKO 2G Kmpll ou Kmpll Icrel (2), la souche ToxoKO 2G Nh36 ou Nh36 Icrel (3), la souche ToxoKO 2G Cypl ou Cypl Icrel (4), la souche ToxoKO 2G Kmpll Nh36 ou Kmpll Nh36 Icrel (5), la souche ToxoKO 2G Kmpll Cypl ou Kmpll Cypl Icrel (6) et la souche ToxoKO 2G Kmpll Cypl Nh36 (7) en utilisant le jeu d’amorces des PCR du Tableau 29.

Figure 41: cette figure représente les profils électrophorétiques des produits PCR obtenus respectivement avec la souche ToxoKO 2G, la souche ToxoKO 2G Kmpll ou Kmpll Icrel, la souche ToxoKO 2G Nh36 ou Nh36 Icrel, la souche ToxoKO 2G Cypl ou Cypl Icrel, la souche ToxoKO 2G Kmpll Nh36 ou Kmpll Nh36 Icrel et la souche ToxoKO 2G Kmpll Cypl ou Kmpl 1 Cypl Icrel en utilisant le jeu d’amorces des PCR du Tableau 29.

Figure 42 : cette figure illustre l’analyse par immunofluorescence de la détection des protéines Kmpll, Nh36 ou Cypl obtenue respectivement avec la souche ToxoKO 2G, la souche ToxoKO 2G Kmpl 1 ou Kmpl 1 Icrel, la souche ToxoKO 2G Nh36 ou Nh36 Icrel, la souche ToxoKO 2G Cypl ou Cypl Icrel , la souche ToxoKO 2G Kmpll Nh36 ou Kmpll Nh36 Icrel et la souche ToxoKO 2G Kmpll Cypl ou Kmpll Cypl Icrel en utilisant un anticorps spécifiquement dirigé contre chaque tag (Myc, V5 et HA) associé à chaque protéine (respectivement Kmpl 1, Nh36 et Cypl).

Figure 43 : cette figure illustre l’analyse par immunofluorescence de la détection des protéines Kmpll, Nh36 ou Cypl en cytométrie en flux obtenus respectivement avec la souche ToxoKO 2G, la souche ToxoKO 2G Kmpll Nh36 Icrel, la souche ToxoKO 2G Kmpll Cypl Icrel et la souche ToxoKO 2G Kmpll Cypl Nh36 en utilisant un anticorps spécifiquement dirigé contre chaque tag (Myc, V5 et HA) associé à chaque protéine (respectivement Kmpl 1, Nh36 et Cypl).

Figure 44 : cette figure représente les profils électrophorétiques des produits PCR obtenus respectivement avec la souche NeoKO 2G (1), la souche NeoKO 2G Nh36 (2), la souche NeoKO 2G Cypl (3) et la souche NeoKO 2G Cypl Nh36 (4) en utilisant le jeu d’amorces des PCR du Tableau 29.

Figure 45 : cette figure illustre l’analyse par immunofluorescence de la détection des protéines Nh36 et/ou Cypl obtenue respectivement avec la souche NeoKO 2G, la souche NeoKO 2G Nh36, la souche NeoKO 2G Cypl et la souche NeoKO 2G Cypl Nh36 en utilisant un anticorps spécifiquement dirigé contre chaque tag (V5 et HA) associé à chaque protéine (respectivement Nh36 et Cypl).

Figure 46 : cette figure est une représentation schématique du plasmide pUC18 4G2 Icrel CP AF. Ce plasmide de 10210 paires de bases comprend le gène codant la protéine CP AF placé sous le contrôle du promoteur de Ι’α-tubuline de Toxoplasma gondii pour permettre l’expression du gène dans le parasite.

Figure 47 : cette figure est une représentation schématique du plasmide pUC18 4G2 Icrel MOMP. Ce plasmide de 9556 paires de bases comprend le gène codant la protéine MOMP placé sous le contrôle du promoteur de Γα-tubuline de Toxoplasma gondii pour permettre l’expression du gène dans le parasite.

Figure 48 : cette figure est une représentation schématique du plasmide pUC18 4G2 Icrel PmpG. Ce plasmide de 9760 paires de bases comprend le gène codant la protéine PmpG placé sous le contrôle du promoteur de Ι’α-tubuline de Toxoplasma gondii pour permettre l’expression du gène dans le parasite.

Figure 49 : cette figure représente les profils électrophorétiques des produits PCR obtenus respectivement avec la souche ToxoKO 2G (1), la souche ToxoKO 2G CP AF (2), la souche ToxoKO 2G MOMP (3) et la souche ToxoKO 2G PmpG (4) en utilisant les jeux d’amorces des PCR du Tableau 29.

Figure 50 : cette figure illustre l’analyse par immunofluorescence de la détection des protéines CP AF, MOMP et PmpG obtenue respectivement avec la souche ToxoKO 2G (A, B et C), la souche ToxoKO 2G CP AF (A), la souche ToxoKO 2G MOMP (B) et la souche ToxoKO 2G PmpG (C) en utilisant un anticorps spécifiquement dirigé contre chaque tag (V5, myc et VSV) associé à chaque protéine (respectivement CP AF, MOMP et PmpG).

Figure 51 : cette figure illustre l’analyse par Western Blot de la détection de la protéine PmpG obtenue respectivement avec la souche ToxoKO 2G (1) et la souche ToxoKO 2G PmpG (2) en utilisant un anticorps spécifiquement dirigé contre le Tag VSV associé à la protéine PmpG.

Figure 52: cette figure représente les profils électrophorétiques des produits PCR obtenus respectivement avec la souche NeoKO 2G et la souche NeoKO 2G MOMP en utilisant les jeux d’amorces des PCR du Tableau 29.

Figure 53 : cette figure illustre l’analyse par immunofluorescence de la détection de la protéine MOMP obtenue respectivement avec la souche NeoKO 2G et la souche NeoKO 2G MOMP en utilisant un anticorps spécifiquement dirigé contre le tag myc associé à MOMP.

Figure 54 : la figure 54 illustre le taux de survie des souris les 24 jours suivant l’injection des souches vaccinales (aucune mortalité n’a été observée après J24). - en abscisse nombre de jours suite à l’injection des souches vaccinales réalisée au jour 0,- en ordonnée : pourcentage de survie des souris. Des souris n’ayant reçu aucun tachyzoïtes servent de témoins et ont un taux de survie de 100 %.

Figure 55 : la figure 55 illustre le dosage des anticorps de type IgG &nlï-Toxoplasma gondii dans le sérum des souris. Le dosage des anticorps de type IgG &n\À-Toxoplasma gondii dans le sérum a été réalisé avant l’injection et 34 jours après que les souris aient reçu 100 tachyzoïtes de la souche vaccinale selon son lot.

Figure 56 : la figure 56 illustre le dosage des anticorps de type IgG anti-M2e dans le sérum des souris. Le dosage des anticorps de type IgG anti-M2e dans le sérum a été réalisé 34 jours après que les souris aient reçu 100 tachyzoïtes de la souche vaccinale selon son lot. Les souris issues du lot 1 servent de témoins négatifs.Figure 57: la figure 57 illustre la production d’IFN-γ après différentes restimulations de splénocytes de souris 34 jours après la vaccination. Les stimulations ont été réalisées avec de l’extrait total de la souche Toxo micl-3 KO 2G (A) ou des protéines HA ou du mix petptides M2e (B).

Exemple 1 : Construction de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G

L’haploïdie du génome de Neospora caninum lors de la phase proliférative permet l’invalidation d’un gène en une seule recombinaison homologue.

Culture des parasites

Tous les tachyzoïtes de la souche de Neospora caninum utilisés ont été produits en fibroblastes humains (HFF Hs27 ATCC CRL-1634)) cultivés en milieu minimal de Dulbecco (DMEM) supplémenté par 10% de sérum de veau fœtal (SVF), 2mM glutamine, 100 U/mL de pénicilline et 100 U/mL de streptomycine. Ils ont été récoltés après lyse mécanique des cellules hôtes par 3 passages en seringue 25G.

Construction des plasmides • Plasmide pNcMIC3-KO-CAT-GFP loxN

Le plasmide pNcMic3KO-CAT-GFP loxN SEQ ID NO : 1 contient une cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO :6 comprenant le gène de sélection cat-gfp SEQ ID NO : 2 codant pour la protéine de fusion CAT-GFP permettant à la fois la résistance au chloramphénicol (CAT) et une fluorescence verte (GFP : Green Fluorescent Protein), sous le contrôle du promoteur de Ι’α-tubuline de Toxoplasma gondii SEQ ID NO :3 pour permettre l’expression du gène dans le parasite. En aval du gène cat-gfp SEQ ID :2, la séquence 3’UTR du gène sagl de Toxoplasma gondii SEQ ID NO : 4 est insérée. Cette séquence a pour objectif de stabiliser l’ARNm codant la protéine de fusion CAT/GFP. Cette cassette de sélection SEQ ID NO :6 est encadrée par deux sites loxN SEQ ID NO :5 identiques de même orientation..

Pour obtenir ce plasmide, la cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO :6 a été amplifiée par PCR sur le plasmide pT230 CAT-GFP SEQ ID NO :9 avec les amorces cat-gfp LoxN For SEQ ID NO :7 et catgfp loxN rev SEQ ID NO :8 (2380pb), digérée par les enzymes de restriction Clal et Xbal (2348 pb) et clonée dans le plasmide pNcMic3KO-DHFR SEQ ID NO :10 digéré par Clal et Xbal (7715 pb).

Le plasmide alors obtenu est le plasmide pNcMic3KO-CAT-GFP loxN SEQ ID NO : 1.

Les séquences des amorces figurent dans le Tableau 1 ci-dessous. Le plasmide pNcMic3KOCAT-GFP loxN contient donc une cassette CAT-GFP SEQ ID NO :6 encadrée par une séquence 5’HR du gène Ncmic3 SEQ ID NO : 98 et une séquence 3’HR du gène Ncmic3 SEQ ID NO : 97.

Tableau 1 : liste des amorces utilisées pour la construction du plasmide pNcMIC3-KO-CATGFP loxN catgfp loxN For SEQ ID NO : 7

TCCGCTCTCAGAGAATCGATGAAGCTTATAACTTCGTATAGT ATACCTTATACGAAGTTATGATATGCATGTCCGCGTTCGTGA AATCTC ClalLoxN catgfp loxN rev SEQ ID NO :8

ATACGTAAACTTCTAGATCCATAACTTCGTATAAGGTATACT ATACGAAGTTATCCCTCGGGGGGGCAAGAATTGTGTTAACCG Xbal loxN GTTCGA • Plasmide pNcMIC 1 -KO-CAT-GFP lox

Le plasmide pNcMiclKO-CAT-GFP loxP SEQ ID NO : 11 contient une cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO : 6 comprenant le gène de sélection cat-gfp SEQ ID NO : 2 codant pour une protéine de fusion CAT-GFP permettant à la fois la résistance au chloramphénicol (CAT) et une fluorescence verte (GFP : Green Fluorescent Protein), sous le contrôle du promoteur de Ι’α-tubuline de Toxoplasma gondii SEQ ID NO : 3 pour permettre l’expression du gène dans le parasite. En aval de la séquence codant CAT-GFP, la séquence 3’UTR du gène sagl de Toxoplasma gondii SEQ ID NO : 4 est insérée. Cette séquence a pour objectif de stabiliser l’ARNm codant la protéine de fusion CAT/GFP. Cette cassette de sélection SEQ ID NO :6 est encadrée par deux sites loxP SEQ ID NO : 12 identiques de même orientation.

Pour obtenir ce plasmide, la cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO :6 a été amplifiée par PCR sur le plasmide pT230 CAT-GFP SEQ ID NO :9 avec les amorces CN10 SEQ ID NO :13 et CN11 SEQ ID NO :14 permettant l’ajout des sites loxP SEQ ID NO :12 (2394 pb), digérée par les enzymes de restriction HindlII et BamHI (2339 pb) et clonée dans le plasmide pT230-ble SEQ ID NO : 37 digéré par HindlII et BamHI (293 lpb). Le plasmide alors obtenu est le plasmide pT230 CAT-GFP loxP SEQ ID NO : 113.

La région 3 HR du gène ncmicl a été amplifiée par PCR à partir de l’ADN génomique de la souche NC-1 de Neospora caninum. Pour l’amplification, les amorces 3 HR NCmicl F Kpnl et 3 HR NCmicl R HindlII (SEQ ID NO: 114 et SEQ ID NO: 115) permettent l’amplification de la région 3 HR du gène ncmicl et la création de deux sites de restrictions qui ont été utilisés pour cloner le fragment 3HR en amont de la cassette de sélection CAT-GFP dans le pT230 CAT-GFP ΙοχΡ SEQ ID NO : 113. Le plasmide obtenu est dénommé pNcmicl-3HR CATGFP loxP SEQ ID NO : 118.

La région 5 HR du gène ncmicl a été amplifiée par PCR à partir de l’ADN génomique de la souche NC-1 de Neospora caninum. Pour l’amplification, les amorces 5 HR NCmicl F BamHI et 5 HR NCmicl R Notl (SEQ ID NO: 116 et SEQ ID NO: 117) permettent l’amplification de la région 5’UTR du gène ncmicl et la création de deux sites de restrictions qui ont été utilisés pour cloner le fragment 5HR en aval de la cassette de sélection CAT-GFP dans le plasmide pNcmicl-3HR CATGFP loxP SEQ ID NO : 118 (BamHI -Notl).

Le plasmide alors obtenu est le plasmide pNcMiclKO-CAT-GFP loxP SEQ ID NO : 11. Le plasmide pNcMiclKO-CAT-GFP loxP contient donc une cassette CAT-GFP SEQ ID NO :6 encadrée par une séquence 5’HR du gène Ncmicl SEQ ID NO : 96 et une séquence 3’HR du gène Ncmicl SEQ ID NO : 95.

Les séquences des amorces figurent dans le Tableau 2 ci-dessous.

Tableau 2 : liste des amorces utilisées pour la construction du plasmide pNcmicl KO

CATGFP loxP

Construction duplasmidepNcmicl KO CATGFPloxP
CN10	SEQIDNO : 13 GCGGC’C A AGCTT. 1T AA CTTCGTA T. U TGTA TGCTA TA CG A AGrL4rGATATGCATGTCCGCgttcgtgaaatctctgatcaagcgg	HindlII. loxP
CN11	SEQ ID NO : 14 cgacgcacgctgtcactcaacttgctGCT AGA4 CTA G7 GG ATCC. 1T AA CTTCGTA TAGCA TACA TTATACGAAGTTA /CCCTCGGGGG GGCAAGAATT	Spel, BamHI, loxP
3 HR NCmicl Kpnl	F SEQIDNO: 114 CGCGGTACCAGGCAGAAGTAAAGAAGGTTCCTC	Kpnl
3 HR NCmicl HindlII	R SEQIDNO: 115 CGCAAGCTTTGATCACGCAAGAAAAGAAGC	HindlII
5 HR NCmicl BamHI	F SEQIDNO: 116 CGCGGATCCCATTTGTAGATACGGTTGCACAC	BamHI
5 HR NCmicl Notl	R SEQIDNO: 117 CGCGCGGCCGCACATTCAGACGGCAGAACTCTG	Notl

• Plasmide pTSAGl- Cre Recombinase

Le plasmide pT-SAGl-Cre-Recombinase SEQ ID NO :15 a été construit pour exprimer de manière transitoire dans les parasites Toxoplasma gondii et Neospora caninum, et leurs dérivés modifiés génétiquement le gène codant la protéine Cre Recombinase dérivée du bactériophage PI (Brecht et al., 1999, Gene, 234(2) :239-47).

Le plasmide pT-SAGl-Cre-Recombinase SEQ ID NO :15 dérive du plasmide pUC18 (plasmide commercial).qui contient une cassette d’expression de la Cre Recombinase du bactériophage Pl.

Dans le plasmide pT-SAGl-Cre-Recombinase SEQ ID NO: 15, le gène codant la Cre Recombinase SEQ ID NO :16 est placé sous la dépendance du promoteur du gène sagl de Toxoplasma gondii SEQ ID NO : 17, ce qui permet l’expression de la protéine Cre Recombinase dans les parasites Toxoplasma gondii transfectés. En aval du gène codant la Cre Recombinase, la séquence 3’UTR du gène sagl de Toxoplasma gondii SEQ ID NO :4 est insérée. Cette séquence a pour objectif de stabiliser l’ARNm codant la protéine Cre Recombinase.

L’absence de cassette de sélection spécifique ne permet pas une intégration stable du matériel génétique transfecté mais seulement une expression transitoire de la Cre Recombinase.

Construction de la souche Neomicl-3 KO - 2G

La construction de la souche vivante atténuée de seconde génération, dénommée Neo ncmicf3 KO - 2G, est faite en 4 étapes distinctes :

1. Délétion par recombinaison homologue du gène Ncmic3 et son remplacement par la cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO :6 encadrée par des séquences LoxN SEQ IDNO :5.

Pour obtenir cette souche, la souche sauvage NC-1 de Neospora caninum est électroporée avec le plasmide pNcMIC3-KO-CAT-GFP lox N SEQ ID NO :1. 20 pg de plasmide purifié puis linéarisé par Kpnl sont ajoutés à 10⁷ parasites mis en suspension dans le milieu d’électroporation CYTOMIX contenant de l’ATP (3 mM) et du Glutathion (3 mM) (Van den Hoff étal., Nucleic Acid Research, Junll; 20(11):2902), et l’électroporation a été réalisée en cuvette d’écart 4 mm, dans un volume de 800 pL sur un appareil BioRad (Paramètres : 2000V, 50 ohms, 25 pF, avec deux chocs électriques). Après électroporation, les tachyzoïtes sont déposés sur une monocouche de cellules HFF en culture. Pour la sélection des mutants, le milieu de culture est remplacé et supplémenté par l’agent de sélection (chloramphénicol 20 pM), heures après l’électroporation. 10 à 15 jours après sélection, les parasites sont sousclonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF et les clones d’intérêt sont identifiés par PCR après avoir effectué une extraction d’ADN génomique au DNAzol des clones d’intérêt. La souche obtenue est dénommée Neo ttcmic3 KO.

Dans cette souche, le gène mic3 a été délété et remplacé par la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène mic3 délété contenant la cassette de sélection CATGFP est la SEQ ID NO : 101. Le gène miel n’étant pas délété, la séquence du gène miel SEQ ID NO :106 est présente dans le génome de la souche.

2. Suppression de la cassette de sélection SEQ ID NO :6 : la souche Neo ncmic3 KO obtenue est électroporée avec le plasmide pT-SAGl-CRE-Recombinase SEQ ID NO :15.

L’enzyme exprimée transitoirement va permettre l’excision de la cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO :6. Le protocole d’électroporation est similaire au protocole précédent. Après électroporation, les tachyzoïtes sont déposés sur une monocouche de cellules HFF en culture. Après 2 à 7 jours de culture, les parasites sont sous-clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF et les clones d’intérêt sont identifiés par PCR après avoir effectué une extraction d’ADN génomique au DNAzol des clones d’intérêt. La souche obtenue est dénommée Neo ttcmic3 KO - 2G.

Dans cette souche, le gène mic3 a été délété et la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 a été excisé. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène mic3 délété contenant un seul site lox P SEQ ID NO : 12, est la SEQ ID NO : 18. Le gène miel n’étant pas délété, la séquence du gène miel SEQ ID NO :106 est présente dans le génome de la souche.

3. Délétion par recombinaison homologue du gène ncmicl et son remplacement par la cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO :6 encadrée par des séquences LoxP SEQ IDNO :12.

Pour obtenir cette souche, la souche Neo ncmic3 KO - 2G est électroporée avec le plasmide pNcMICl-KO-CAT-GFP lox P SEQ ID NO :11 linéarisé par Kpnl, selon le protocole précédemment décrit. Après électroporation, les tachyzoïtes sont déposés sur une monocouche de cellules HFF en culture. Pour la sélection des mutants, le milieu de culture est remplacé et supplémenté par l’agent de sélection (chloramphénicol 20 μΜ), 24 heures après l’électroporation. 10 à 15 jours après sélection, les parasites sont sous-clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF et les clones d’intérêt sont identifiés par PCR après avoir effectué une extraction d’ADN génomique des clones d’intérêt. La souche obtenue est dénommée Neo ncmicl-3 KO

Dans cette souche, le gène mic3 a été délété et la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 a été excisé. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène mic3 délété contenant un seul site lox P SEQ ID NO : 12, est la SEQ ID NO : 18. Dans cette souche, le gène miel a été délété et remplacé par la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène miel délété contenant la cassette de sélection CATGFP est la SEQ ID NO : 102.

4. Suppression de la cassette de sélection SEQ ID NO :6 : la souche Neo Ncmicl-3 KO obtenue est électroporée avec le plasmide pT-SAGl-CRE-Recombinase SEQ ID NO :15.

L’enzyme exprimée transitoirement va permettre l’excision de la cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO :6. Après électroporation, les tachyzoïtes sont déposés sur une monocouche de cellules HFF en culture. Après 2 à 7 jours de culture, les parasites sont sous-clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF et les clones d’intérêt sont identifiés par PCR après avoir effectué une extraction d’ADN génomique au DNAzol des clones d’intérêt. La souche obtenue est dénommée Neo ncmicl-3 KO - 2G.

Dans cette souche, le gène mic3 a été délété et la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 a été excisé. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène mic3 délété contenant un seul site lox P SEQ ID NO : 12, est la SEQ ID NO : 18.

Dans cette souche, le gène miel a été délété et la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 a été excisé. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène miel délété contenant un seul site lox P SEQ ID NO : 12, est la SEQ ID NO : 91.

Validation de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G par PCR

Pour valider la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G des analyses PCR sont effectuées à partir de l’ADN génomique extrait au DNAzol à partir d’un culot parasitaire constitué de 10⁷ parasites. Les amorces utilisées pour les PCR sont décrites dans la Figure 8-A et sont détaillées dans le Tableau 3 ci-dessous. Les produits PCR sont analysés par électrophorèse sur gel d’agarose (Figure 3-B). Leur taille attendue et leur taille observée sont également décrites dans le Tableau 4 ci-dessous. Pour plus de clarté sur la figure 3-B, seules les 3 étapes de la réalisation sont représentées (ncmic3, ncmic3KO CATGFP et ncmic3KO loxN (2G) ou ncmicl, ncmiclKO CATGFP et ncmiclKO loxP(2G)), les résultats obtenus sont conformes aux tailles attendues

Tableau 3 : liste des amorces utilisées pour la validation des souches.

		Amorce F	Séquence		Amorce R	Séquence
Ncmic3 (mixl)	C	Ne mic3 F	SEQ ID NO :22 TTTCCCTTCTAAACACAGTCG	d	Ne mic3 R	SEQ ID NO :23 CCTTCAGTGGTTCTCCATGAGT
Validation KO 5’Ncmic3 (mix2)	i	Integ NCmic3 F	SEQ ID NO :24 GAAAGTGTCAGTGGTAGAGACTGC	j	ORF CATGFP R	SEQ ID NO :25 CCGTTTGGTGGATGTCTTCT
Validation KO 3’Ncmic3 (mix3)	k	ORF CATGFP F	SEQ ID NO :26 GCATCGACTTCAAGGAGGAC	1	Integ NCmic3 R	SEQ ID NO :27 TGTTTACAGGTGATCCAGAAAAGG
Cicatrice Ncmic3 (mix4)	g	AF3	SEQ ID NO :32 GTCATCGACCGCCGGAACTAGTAGT	h	AF4	SEQ ID NO : 33 GCAGAGGTTCTGCGTATCTAACACGG
Ncmicl (mix5)	a	Ne mie 1 F	SEQ ID NO :20 ACCCGGAGAATTATCGCCTA	b	Ne miel R	SEQIDNO :21 TTCTCCAGGCACTCACCT
Validation KO 5’Ncmicl(mix6)	m	Integ NCmicl F	SEQ ID NO :28 CCGAGCAAGTTAGCAAGTCC	j	ORF CATGFP R	SEQ ID NO :25 CCGTTTGGTGGATGTCTTCT
Validation KO 3’Ncmicl(mix7)	k	ORF CATGFP F	SEQ ID NO :26 GCATCGACTTCAAGGAGGAC	n	Integ NCmicl R	SEQ ID NO :29 CTTGTCCGTCACATCGTTTG
Cicatrice Ncmicl (mix8)	e	ncmicl crelox FB	SEQ ID NO :30 GGCGACATACTGCATTGGAT	f	ncmicl crelox RB	SEQ ID NO :31 GATCGGAGTCTGTCCCTCAA

Tableau 4 : Taille attendue des amplicons (en paires de base) des différentes PCR de validation de la construction des souches KO de Neospora caninum

	NC-1	Neo ncmic3 KO	Neo ncmic3 KO loxN	Neo ncmicl-3 KO loxP	Neo ncmicl-3 KO 2G
Ncmic3 (mixl)	850			-
Validation KO 5’Ncmic3(mix2)		2960
Validation KO 3’Ncmic3 (mix3)		3668
Cicatrice Ncmic3 (mix4)	2163	2575	276	276	276
Ncmicl (mix5)	701	701	701
Validation KO 5’Ncmicl (mix6)				3359
Validation KO 3'Ncmicl (mix7)				3421
Cicatrice Ncmic 1 (mix8)	3161	3161	3161	2560	261

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces c SEQ ID NO :22 et d SEQ ID NO :23 (mix 1) permettent de mettre en évidence une bande à 850 paires de bases pour la souche NC-1, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène Ncmic3 SEQ ID NO : 105 dans cette souche. Cette bande n’est pas détectée dans les souches Neo Ncmic3 KO, Neo Ncmic3 KO - 2G, Neo Ncmicl-3 KO et Neo TVcmicl-3 KO - 2G confirmant la suppression du gène dans ces souches.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces i SEQ ID NO :24 et j SEQ ID NO :25 et les amorces k SEQ ID NO :26 et 1 SEQ ID NO :27 (mix Ncmic3) permettent de mettre en évidence respectivement une bande à 2960 et 3668 paires de bases pour la souche Neo Ncmic3 KO, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène de sélection cat-gfp dans cette souche à la place du gène Ncmic3. Cette bande n’est pas détectée dans les souches NC-1, Neo Ncmic3 KO - 2G, Neo Ncmicl-3 KO et Neo TVcmicl-3 KO - 2G confirmant l’absence du gène de sélection cat-gfp SEQ ID NO :2 au locus Ncmic 3 dans ces souches.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces g SEQ ID NO :32 et h SEQ ID NO :33 (cicatrice Ncmic3) permettent de mettre en évidence différentes bandes conformément à la taille de bande attendue. Une bande à 2163 paires de bases pour la souche NC-1, confirme la présence du gène Ncmic3 SEQ ID NO : 105 dans cette souche. Une bande de 2575 paires de bases est mise en évidence pour la souche Neo Ncmic3 KO confirmant la présence de la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 à la place du gène Ncmic3. Enfin une bande de 276 paires de bases est mise en évidence pour les souches Neo Ncmic3 KO - 2G Neo Ncmicl-3 KO et Neo ALmicI -3 KO - 2G confirmant la suppression du gène de sélection cat-gfp SEQ ID NO :2 dans ces souches, laissant une cicatrice loxN SEQ ID NO :5 dans le génome.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces a SEQ ID NO :20 et b SEQ ID NO :21 (mix Ncmicl) permettent de mettre en évidence une bande à 644 paires de bases pour les souches NC-1, Neo Ncmic3 KO, Neo Ncmic3 KO - 2G, conformément aux tailles de bandes attendues et confirmant la présence du gène Ncmicl SEQ ID NO :106 dans ces souches. Ces bandes ne sont pas détectées dans les souches Neo Ncmicl-3 KO et Neo ALmicI -3 KO - 2G confirmant la suppression du gène dans ces souches.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces m SEQ ID NO :28 et j SEQ ID NO :25 et les amorces k SEQ ID NO :26 et n SEQ ID NO :29 (mix Ncmicl) permettent de mettre en évidence respectivement une bande à 3359 et 3421 paires de bases pour la souche Neo Ncmicl-3 KO, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène de sélection cat-gfp SEQ ID NO :2 dans cette souche à la place du gène Ncmicl. Cette bande n’est pas détectée dans les souches sauvage NC-1 de N. caninum, Neo Ncmic 3 KO, Neo Ncmic3 KO - 2G, et Neo Acmicl-3 KO - 2G confirmant l’absence du gène de sélection at-gfp SEQ ID NO :2 au locus Ncmic 1 dans ces souches.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces SEQ ID NO :30 et f SEQ ID NO :31 (cicatrice Ncmicl) permettent de mettre en évidence différentes bandes conformément à la taille de bande attendue. Une bande à 2182 paires de bases pour les souches NC-1, Neo Ncmic3 KO, Neo Ncmic3 KO - 2G confirme la présence du gène Ncmicl dans ces souches. Une bande de 2560 paires de bases est mise en évidence pour la souche Neo Ncmicl-3 KO confirmant la présence de la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 à la place du gène Ncmicl. Enfin une bande de 261 paires de bases est mise en évidence pour la souche Neo Acmicl-3 KO - 2G confirmant la suppression du gène de sélection cat-gfp SEQ ID NO :2 dans cette souche, laissant une cicatrice loxP SEQ ID NO : 12 dans le génome.

Les produits PCR « cicatrice » (mix 4 et 8) ont été séquencés et les séquençages ont confirmés que :

• le gène ncmic 3 SEQ ID NO : 105 a été supprimé et que la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 a bien été supprimée par action de la Cre-Recombinase laissant une cicatrice LoxN SEQ ID NO :5 conforme à la séquence attendue (Figure 3C).

• le gène ncmicl SEQ ID NO : 106 a été supprimé et que la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 a bien été supprimée par action de la Cre-Recombinase laissant une cicatrice LoxP SEQ ID NO : 12 conforme à la séquence attendue (Figure 3C).

Validation de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2Gpar immunofluorescence

Les tachyzoïtes cultivés 24h sur lamelles en verre recouvertes d’une monocouche de cellules HFF. Les cellules infectées ont été lavés 2 fois en PBS1X, et fixés par du formaldéhyde 4% pendant 30 min. Après 3 lavages en PBS1X, les cellules HFF infectées ont été perméabilisées avec 0,1% de Triton X-100 dans du PBS1X pendant 5 min. Après 3 lavages au PB S IX, une étape de saturation est effectuée avec une solution de PBS 1X/SVF 10% pendant 30 min.. Les cellules ont ensuite été incubées avec l'anticorps primaire dilué dans 2% SVF pendant 1 heure, lavées 3 fois au PBSIX puis incubées avec un anticorps secondaire dilué dans une solution de PBS/SVF 2% pendant 1 heure. Après 2 lavages au PBSIX, les lamelles en verre sont montés sur lame avec de l’Immu-Mount™ et observées au microscope à fluorescence.

L’anticorps primaire Tgmic3 permet une reconnaissance de la protéine Ncmic3, il permet de détecter l’expression de la protéine NcMIC3 SEQ ID NO : 118 dans le parasite (anticorps de lapin anti-mic3 : mAb anti-MIC3 s3) et l’anticorps secondaire commercial utilisé est l’Alexa fluor® 594 chèvre anti-lapin (Life technologies réf. A-l 1012).

Les résultats montrent qu'aucune fluorescence n’est détectable au pôle apical du parasite révélant l’absence des protéines MIC3 (Figure 4-A).

L’anticorps primaire Tgmicl ne permet pas une reconnaissance de la protéine NcMICl SEQ IDNO : 119.

Les résultats montrent que les parasites expriment une fluorescente verte reflétant l’expression de la protéine CATGFP SEQ ID NO : 120 suite à la réalisation des délétions de gènes (Neo ncmic3 KO et Neo ncmicl-3 KO) alors qu’après action de la Cre recombinase, les souches Neo ncmic3 KO - 2G et Neo ncmicl-3 KO - 2G ne sont plus fluorescentes (suppression de de la cassette CATGFP SEQ ID NO :6) (Figure 4-B).

Exemple 2 : Construction de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G

L’haploïdie du génome de Toxoplasma gondii lors de la phase proliférative permet l’invalidation d’un gène en une seule recombinaison homologue.

Culture des parasites

Tous les tachyzoïtes de la souche de Toxoplasma gondii utilisés ont été produits en fibroblastes humains (HFF Hs27 ATCC CRL-1634)) cultivés en milieu minimal de Dulbecco (DMEM) supplémenté par 10% de sérum de veau fœtal (SVF), 2mM glutamine, 100 U/mL de pénicilline et 100 U/mL de streptomycine. Ils ont été récoltés après lyse mécanique des cellules hôtes et 3 passages en seringue 25G.

Construction des plasmides • Plasmide pTgMIC3-KO-CAT-GFP loxP

Le plasmide pTgMIC3-KO-CAT-GFP Lox P SEQ ID NO : 34 (Figure 5A) a été construit pour supprimer le gène codant la protéine TgMIC3 de Toxoplasma gondii (référence ATCC : souche RH Pra310) par recombinaison homologue.

Le plasmide pTgMic3KO-CAT-GFP loxP SEQ ID NO : 34 contient une cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO : 6 comprenant un gène de sélection cat-gfp SEQ ID NO : 2 codant pour une protéine de fusion CAT-GFP permettant à la fois la résistance au chloramphénicol (CAT) et une fluorescence verte (GFP : Green Fluorescent Protein), sous le contrôle du promoteur de Ι’α-tubuline de Toxoplasma gondii SEQ ID NO : 3. En aval du gène cat-gfp SEQ ID NO :2, la séquence 3’UTR du gène sagl de Toxoplasma gondii SEQ ID NO : 4 est insérée. La SEQ ID NO :6 a été amplifiée à partir du plasmide pT230 CAT-GFP SEQ ID NO : 9 en utilisant les amorces SEQ ID NO : 35 et SEQ ID NO : 36 qui permettent l’ajout des sites loxP (SEQ ID NO : 12) et des sites de restrictions HindlII et Spel. La séquence nucléotidique amplifiée par PCR (2389 pb) a ensuite été cloné dans le plasmide pT230TUB Ble SEQ ID NO : 37 par digestion enzymatique avec les enzymes de restriction HindlII et Spel. Le plasmide obtenu est dénommé pCATGFP loxP SEQ ID NO : 38.

La région 3’HR du gène Tgmic3 SEQ ID NO : 39 a été obtenu par la double digestion enzymatique du plasmide pmic3KO-2 SEQ ID NO : 40 avec les enzymes de restriction Kpnl et HindlII (2145pb), puis cloné dans le plasmide pCATGFP loxP SEQ ID NO : 38 digéré par Kpnl et HindlII (523 8pb). Le plasmide obtenu est dénommé p3’UTRmic3-CATGFP loxP SEQIDNO : 4L

La région 5’HR du gène Tgmic3 SEQ ID NO : 42 a été amplifiée par PCR à partir de l’ADN génomique de la souche RH de T. gondii. Pour l’amplification, les amorces SEQ ID NO : 43 et SEQ ID NO : 44 permettent l’amplification de la région 5’UTR du gène Tgmic3 et la création de deux sites de restrictions (2568pb / sites Spel et Xbal). Ces sites de restrictions ont été utilisés pour cloner le fragment 5HR digéré par Spel et Xbal (2548pb) dans le plasmide p3’UTRmic3-CATGFP loxP SEQ ID NO : 38 en aval de la cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO : 6 au niveau du site Spel du plasmide précédemment décrit (7383pb) pour obtenir le plasmide pTgMic3KO-CAT-GFP loxP SEQ ID NO : 34.

Les séquences des amorces figurent dans le Tableau 5 ci-après.

Tableau 5 : Séquences des amorces utilisées pour la construction du plasmide pTgMIC3KO-CAT-GFP loxP .

Construction duplasmidepTgmic3KO CAT-GFPloxP
SEQIDNO : 35	GCGGCC A AGCTT. 1T AA CTTCGTA TAA TGTA TGCTA TA CGA	HindlIL loxP
A GTTA '/G AT ATGCATGTCCGCgttcgtgaaatctctgatcaagcgg
SEQ ID NO : 36	cgacgcacgctgtcactcaacttgctGCTAGA4CL4GrGGATCCAL4A CTTCGTA TAGCA TACA TTATACGAAGTTA 7CCCTCGG	Spel, BamHI, loxP
SEQ ID NO : 43	GGGATCCACTAGTTTACGTATCGCGACTAGCAGCAAG TTGAGTGACAGCG	BamHI, Spel, SnaBI, NruI
SEQ ID NO : 44	GCTGCAGTCTAGAGATATCCACGTGGAATTCCTCTTGG GAAGAACAAT	PstI, Xbal, EcoRV Pmll

• Plasmide pTgMIC 1 -KO-CAT-GFP loxN

Le plasmide pTgMIC 1-KO-CAT-GFP loxN SEQ ID NO : 45 (Figure 5-B) a été construit pour supprimer le gène codant la protéine TgMICl de Toxoplasma gondii par recombinaison homologue.

Le plasmide pTgMiclKO-CAT-GFP loxN SEQ ID NO : 45 contient une cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO : 6 comprenant le gène de sélection cat-gfp SEQ ID NO : 2 codant pour la protéine de fusion CAT-GFP permettant à la fois la résistance au chloramphénicol (CAT) et une fluorescence verte (GFP : Green Fluorescent Protein), sous le contrôle du promoteur de Ι’α-tubuline de Toxoplasma gondii SEQ ID NO : 3. En aval du gène cat-gfp SEQ ID NO :2, la séquence 3’UTR du gène sagl de Toxoplasma gondii SEQ ID NO : 4 a été insérée.

La SEQ ID NO :6 a été amplifiée à partir du plasmide pT230 CAT-GFP SEQ ID NO : 9 en utilisant les amorces SEQ ID NO : 46 et SEQ ID NO : 47 qui permettent l’ajout des sites loxN (SEQ ID NO : 5) et des sites de restrictions Clal et Xbal. La séquence nucléotidique amplifiée par PCR a ensuite été clonée dans le plasmide pNcMic3K0-DHFR SEQ ID NO : 10 digéré par Clal et Xbal (7715 pb) par digestion enzymatique avec les enzymes de restriction Clal et Xbal.

Le plasmide obtenu est dénommé pNCmic3KO CATGFP LoxN SEQ ID NO : 48.

Le fragment 5HR tgmicl SEQ ID NO : 49 a été amplifié par PCR avec les amorces SEQ ID NO : 50 et SEQ ID NO : 51 (2364pb), les sites de restriction Kpnl et Clal ont été ajoutés par PCR. Le fragment amplifié est digéré par les enzymes de restriction Kpnl et Clal (2337pb) et cloné dans le plasmide pNCmic3KO CATGFP LoxN SEQ ID NO : 48 (voir exemple 1 pour l’obtention du plasmide pNCmic3KO CATGFP LoxN) digéré par Kpnl et Clal (7740pb) pour remplacer le fragment 5HR ncmic3 (fragment digéré par Kpnl et Clal). Le plasmide obtenu est dénommé pTgmiclKO5HR-NCmic3KO3HR CATGFP LoxN SEQ ID NO : 111

Puis le fragment 3HR tgmicl SEQ ID NO : 52 a été amplifié par PCR avec les amorces SEQ ID NO : 53 et SEQ ID NO : 54 (2750pb), les sites de restriction Xbal et Notl ont été ajoutés par PCR. Le fragment amplifié est digéré par les enzymes de restriction Xbal et Notl (2720 pb) puis cloné dans le plasmide pTgmiclKO5HR-NCmic3KO3HR CATGFP LoxN SEQ ID NO : 111 digéré par les enzymes de restriction Xbal et Notl (7565 pb) pour remplacer le fragment 3HR ncmic3 (fragment digéré par Xbal et NotI).Le plasmide obtenu est dénommé pTgmiclKO CAT-GFP LoxN SEQ ID NO : 45

Les amorces utilisées pour les PCR sont détaillées dans le tableau 6 ci-dessous.

Tableau 6 : Amorces permettant la Construction du plasmide pTgmic3KO CAT-GFP loxP

Construction duplasmidepTgmic3KO CAT-GFPloxP
SEQ ID NO : 46	TCCGCTCTCAGAGAATCGATGAAGCTTATAACTTCG TATAGTATACCTTATACGAAGTTATGATATGCATGT CCGCGTTCGTGAAATCTC	Clal LoxN
SEQ ID NO : 47	ATACGTAAACTTCTAGATCCATAACTTCGTATAAGG TATACTATACGAAGTTATCCCTCGGGGGGGCAAGAA TTGTGTTAACCGGTTCGA	Xbal loxN
SEQ ID NO : 50	GTAGCAAGGTACCACAAGCTAAAGAAACTAGTGCC TCTTCTAAA		5HR tgmic IFor Kpnl
SEQ ID NO : 51	TAAACGGGCTGATCGATGCAGGTAAATTCTATAGCC GGGT		5HR tgmic 1 Rev Clal
SEQ ID NO : 53	TAAACGGGCTGATCGATGCAGGTAAATTCTATAGCC GGGT		3HR tgmic IFor Xbal
SEQ ID NO : 54	AAAAACTCGGTGGCGGCCGCATAAAGAAGAGCAAG GAAAA		3HR tgmic lrev Notl

• Plasmide pTSAGl- Cre Recombinase

Le plasmide pT-SAGl-Cre-Recombinase SEQ ID NO : 15 a été construit pour exprimer de manière transitoire dans les parasites Toxoplasma gondii et Neospora caninum et leurs dérivés modifiés génétiquement le gène codant la protéine Cre Recombinase dérivée du bactériophage PI (Brecht et al., 1999, même référence que précédemment).

Le plasmide pT-SAGl-Cre-Recombinase SEQ ID NO : 15 dérive du plasmide pUC18 (plasmide commercial) qui contient une cassette d’expression de la Cre Recombinase du bactériophage Pl. Dans le plasmide pT-SAGl-Cre-Recombinase SEQ ID NO : 15, le gène codant la Cre Recombinase SEQ ID NO :16, est placé sous la dépendance du promoteur du gène sagl de Toxoplasma gondii SEQ ID NO :17, ce qui permet l’expression de la protéine Cre Recombinase dans les parasites Toxoplasma gondii transfectés. En aval du gène codant la Cre Recombinase SEQ ID NO :16, la séquence 3’UTR du gène sagl de Toxoplasma gondii SEQ ID NO :4 est insérée. Cette séquence a pour objectif de stabiliser l’ARNm codant la protéine Cre Recombinase.

Construction de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G

La construction de la souche vivante atténuée de seconde génération, dénommée Toxo tgmicl-3 KO - 2G, est faite en 4 étapes distinctes (Figure 6-A) :

1. Délétion par recombinaison homologue du gène Tgmic3 et son remplacement par la cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO :6 encadrée par des séquences LoxP SEQ IDNO :12.

Pour obtenir cette souche, la souche sauvage de Toxoplasma gondii RH (référence ATCC : PRA-310) est électroporée avec le plasmide pTgMIC3-KO-CAT-GFP loxP SEQ ID NO :34. 20 pg de plasmide purifié puis linéarisé par Kpnl sont ajoutés à 10⁷parasites mis en suspension dans le milieu d’électroporation CYTOMIX contenant de l’ATP (3 mM) et du Glutathion (3 mM) (Van den Hoff et al., Nucleic Acid Research, Jun 11 ; 20(11):2902), et l’électroporation a été réalisée en cuvette d’écart 4 mm, dans un volume de 800 pL sur un appareil BioRad (Paramètres : 2000V, 50 ohms, 25 pF, avec deux chocs électriques). Après électroporation, les tachyzoïtes sont déposés sur une monocouche de cellules HFF en culture. Pour la sélection des mutants, le milieu de culture est remplacé et supplémenté par l’agent de sélection (chloramphénicol 20 pM), 24 heures après l’électroporation. 10 à 15 jours après sélection, les parasites sont sous-clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF et les clones d’intérêt sont identifiés par PCR après avoir effectué une extraction d’ADN génomique au DNAzol des clones d’intérêt. La souche obtenue est dénommée Toxo tgmic3 KO.

Dans cette souche, le gène mic3 a été délété et remplacé par la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène mic3 délété contenant la cassette de sélection CATGFP est la SEQ ID NO : 103. Le gène miel n’étant pas délété, la séquence du gène miel SEQ ID NO : 108 est présente dans le génome de la souche.

2. Suppression de la cassette de sélection SEQ ID NO :6: la souche Toxo tgmic3 KO obtenue est électroporée avec le plasmide pT-SAGl-CRE-Recombinase SEQ ID NO :15.

L’enzyme exprimée transitoirement va permettre l’excision de la cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO :6. Le protocole d’électroporation est similaire au protocole précédent. Après électroporation, les tachyzoïtes sont déposés sur une monocouche de cellules HFF en culture. Après 2 à 7 jours de culture, les parasites sont sous-clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF et les clones d’intérêt sont identifiés par PCR après avoir effectué une extraction d’ADN génomique au DNAzol des clones d’intérêt. La souche obtenue est dénommée Toxo tgmic3 KO - 2G.

Dans cette souche, le gène mic3 a été délété et la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 a été excisée. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène mic3 délété contenant un seul site lox P SEQ ID NO : 12, est la SEQ ID NO : 19. Le gène miel n’étant pas délété, la séquence du gène miel SEQ ID NO : 108 est présente dans le génome de la souche.

3. Délétion par recombinaison homologue du gène tgmicl et son remplacement par la cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO :6 encadrée par des séquences Lox N SEQ ID NO :5. Pour obtenir cette souche, la souche Toxo tgmic3 KO - 2G est électroporée avec le plasmide pTgMICl-KO-CAT-GFP lox N SEQ ID NO :45 linéarisé par Pcil, selon le protocole précédemment décrit. Après électroporation, les tachyzoïtes sont déposés sur une monocouche de cellules HFF en culture. Pour la sélection des mutants, le milieu de culture est remplacé et supplémenté par l’agent de sélection (chloramphénicol 20 μΜ), 24 heures après l’électroporation. 10 à 15 jours après sélection, les parasites sont sous-clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF et les clones d’intérêt sont identifiés par PCR après avoir effectué une extraction d’ADN génomique des clones d’intérêt. La souche obtenue est dénommée Toxo tgmicl-3 KO.

Dans cette souche, le gène mic3 a été délété et la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 a été excisée. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène mic3 délété contenant un seul site lox P SEQ ID NO : 12, est la SEQ ID NO : 19.

Dans cette souche, le gène miel a été délété et remplacé par la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène miel délété contenant la cassette de sélection CATGFP est la SEQ ID NO : 104.

4. Suppression de la cassette de sélection SEQ ID NO :6: la souche Toxo tgmicl-3 KO obtenue est électroporée avec le plasmide pT-SAGl-CRE-Recombinase SEQ ID NO :15. L’enzyme exprimée transitoirement va permettre l’excision de la cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO :6. Après électroporation, les tachyzoïtes sont déposés sur une monocouche de cellules HFF en culture. Après 2 à 7 jours de culture, les parasites sont sous-clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF et les clones d’intérêt sont identifiés par PCR après avoir effectué une extraction d’ADN génomique au DNAzol des clones d’intérêt. La souche obtenue est dénommée Toxo tgmicl-3 KO - 2G.

Dans cette souche, le gène miel a été délété et la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 a été excisée. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène miel délété contenant un seul site lox N SEQ ID NO : 5, est la SEQ ID NO : 92.

Validation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G par PCR

Pour valider la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G des analyses PCR sont effectuées à partir de l’ADN génomique extrait au DNAzol à partir d’un culot parasitaire constitué de 10⁷ parasites. Les amorces utilisées pour les PCR sont décrites dans la Figure 11-B et sont détaillées dans le Tableau 7 ci-dessous. Les produits PCR sont analysés par électrophorèse sur gel d’agarose (Figure 6-B). Leur taille attendue et leur taille observée sont également décrites dans le Tableau 8 ci-dessous. Pour plus de clarté sur la figure 6-B, seules les 3 étapes de la réalisation sont représentées (tgmic3, tgmic3KO CATGFP et tgmic3KO loxP (2G) ou tgmicl, tgmiclKO CATGFP et tgmiclKO loxN(2G)), les résultats obtenus sont conformes aux tailles attendues.

Tableau 7 : liste des amorces utilisées pour la validation des souches.

Tgmic3 (mixl)	5	TgMIC3 For	SEQ ID NO 61 : CCTCCGATGTGACTTTTGGT	6	TgMIC3 Rev	SEQ ID NO 62 : GATCCTCGGAGCAAGTCAAC
Validation KO 5’Tgmic3(mi x2)	1 3	CN58	SEQ ID NO 63 : ATACGAAGGGATTCGACGTG	j	ORF CATGFP R	SEQ ID NO 25 : CCGTTTGGTGGATGTCTTCT
Validation KO 3’Tgmic3 (mix3)	k	ORF CATGF PF	SEQ ID NO 26 : GCATCGACTTCAAGGAGGAC	1 4	HR Mic3 RL	SEQ ID NO 64 ATATGCGGATGAGTGCTCGAA TT
Cicatrice Tgmic3 (mix4)	9	Tgmic3 loxNF	SEQ ID NO 65 : GTGTGGAGACTTTTTACTTCGT GTTAC	1 0	Tgmic3 loxNR	SEQ ID NO 66 : CCTCCGATGTGACTTTTGGT
Tgmicl (mix5)	3	TgMICl For	SEQ ID NO 55 : ATGCGCGCTATAAAGAATCG	4	TgMICIR ev	SEQ ID NO 56 : AGAAACAACGCCTGGCCCAT
Validation KO 5’Tgmicl(mi x6)	1 1	tgmicl K 0 integ F	SEQ ID NO 57 : GTGCGATGACGTGGCTTCTCTATC ATGTGT	j	ORF CATGFP R	SEQ ID NO 25 : CCGTTTGGTGGATGTCTTCT
Validation KO 3’Tgmicl (mix7)	k	ORF CATGF PF	SEQ ID NO 26 : GCATCGACTTCAAGGAGGAC	1 2	tgmiclKO integ R	SEQ ID NO 58 : GATTCGCTTCGTCACTTCTGGTACG GATGC
Cicatrice Tgmicl (mix8)	7	Tgmicl loxNF	SEQ ID NO 59 : CCCGTCTAGCAAGACCTCAA	8	Tgmicl loxNR	SEQ ID NO 60 : TCGGTGCTGCTCAGTAATTG
Tableau i		aille attendue des amplicons (en paires de base) des différentes PCR de

validation de la construction des souches KO de Toxoplasma gondii

	RH	Toxo tgmic3 KO	Toxo tgmic3 KO- 2G	Toxo tgmicl-3 KO	Toxo tgmicl-3 KO- 2G
Tgmic3 (mixl)	808	-	-	-	-
Validation KO 5’Tgmic3(mix2)		3253
Validation KO 3’Tgmic3 (mix3)		3309
Cicatrice Tgmic3 (mix4)	1596	2525	226	226	226
Tgmicl (mix5)	608	608	608	-	-
Validation KO 5’Tgmicl (mix6)				3040
Validation KO 3 ’Tgmic 1 (mix7)				3593
Cicatrice Tgmicl(mix8)	4198	4198	4198	3129	830

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces 5 SEQ ID NO :61 et 6 SEQ ID NO : 62 (mix 1) permettent de mettre en évidence une bande à 808 paires de bases pour la souche RH, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène Tgmic 3 dans cette souche. Cette bande n’est pas détectée dans les souches Toxo tgmic3 KO, Toxo tgmic3 KO - 2G, Toxo tgmicl-3 KO et Toxo tgmicl-3 KO - 2G confirmant la suppression du gène dans ces souches.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces 13 SEQ ID NO :63 et j SEQ ID NO :25, et les amorces k SEQ ID NO :26 et 14 SEQ ID NO :64 (mix 2 et 3) permettent de mettre en évidence respectivement une bande à 3253 et 3537 paires de bases pour la souche Toxo tgmic3 KO, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène de sélection cat-gfp SEQ ID NO :2 dans cette souche à la place du gène Tgmic3 SEQ ID NO : 107. Cette bande n’est pas détectée dans les souches RH, Toxo tgmic3 KO - 2G, Toxo tgmicl-3 KO et Toxo tgmicl-3 KO - 2G confirmant l’absence du gène de sélection cat-gfp SEQ ID NO :2 au locus Tgmic 3 dans ces souches.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces 9 SEQ ID NO :65 et 10 SEQ ID NO :66 (mix 4) permettent de mettre en évidence différentes bandes conformément à la taille de bande attendue. Une bande à 1596 paires de bases pour la souche RH, confirme la présence du gène Tgmic3 SEQ ID NO : 107 dans cette souche. Une bande de 2525 paires de bases est mise en évidence pour la souche Toxo tgmic3 KO confirmant la présence de la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 à la place du gène Tgmic3. Enfin une bande de 226 paires de bases est mise en évidence pour les souches Toxo tgmic3 KO - 2G, Toxo tgmicl-3 KO et Toxo tgmicl-3 KO - 2G confirmant la suppression du gène de sélection catgfp SEQ ID NO :2 dans ces souches, laissant une cicatrice loxP SEQ ID NO :12 dans le génome.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces 3 SEQ ID NO :55 et 4 SEQ ID NO :56 (mix 5) permettent de mettre en évidence une bande à 608 paires de bases pour les souches RH, Toxo tgmic3 KO et Toxo tgmic3 KO - 2G, conformément aux tailles de bandes attendues et confirmant la présence du gène Tgmic 1 SEQ ID NO : 108 dans ces souches. Ces bandes ne sont pas détectées dans les souches Toxo tgmicl-3 KO et Toxo tgmicl-3 KO - 2G confirmant la suppression du gène dans ces souches.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces 11 SEQ ID NO :57 et j SEQ ID NO :25, et les amorces k SEQ ID NO :26 et 12 SEQ ID NO :58 (mix 6 et 7) permettent de mettre en évidence respectivement une bande à 3040 et 3593 paires de bases pour la souche Toxo tgmicl-3 KO, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène de sélection cat-gfp SEQ ID NO :2 dans cette souche à la place du gène tgmic3 SEQ ID NO : 107. Cette bande n’est pas détectée dans les souches sauvage RH de T. gondii (référence ATCC : PRA-310), Toxo tgmic3 KO, Toxo tgmic3 KO - 2G, et Toxo tgmicl-3 KO - 2G confirmant l’absence du gène de sélection cat-gfp SEQ ID NO :2 au locus Tgmicl dans ces souches.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces 7 SEQ ID NO :59 et 8 SEQ ID NO :60 (mix 8) permettent de mettre en évidence différentes bandes conformément à la taille de bande attendue. Une bande à 4198 paires de bases pour les souches RH, Toxo tgmic3 KO et Toxo tgmic3 KO - 2G confirme la présence du gène Tgmicl SEQ ID NO : 108 dans ces souches. Une bande de 3129 paires de bases est mise en évidence pour la souche Toxo tgmicl-3 KO confirmant la présence de la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 à la place du gène Tgmicl. Enfin une bande de 830 paires de bases est mise en évidence pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G confirmant la suppression du gène de sélection cat-gfp SEQ ID NO :2 dans cette souche, laissant une cicatrice loxN SEQ ID NO :5 dans le génome.

• le gène Tgmic3 SEQ ID NO : 107 a été supprimé et que la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 a bien été supprimée par action de la Cre-Recombinase laissant une cicatrice LoxP SEQ ID NO :12 conforme à la séquence attendue (Figure 6-C).

• le gène Tgmicl SEQ ID NO : 108 a été supprimé et que la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 a bien été supprimée par action de la CRE-Recombinase laissant une cicatrice LoxN SEQ ID NO :5 conforme à la séquence attendue (Figure 6-C).

Validation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G par immunofluorescence

Les tachyzoïtes sont cultivés 24h sur lamelles en verre recouvertes d’une monocouche de cellules HFF. Les cellules infectées ont été lavés 2 fois en PB SIX, et fixés par du formaldéhyde 4% pendant 30 min. Après 3 lavages en PBSIX, les cellules HFF infectées ont été perméabilisées avec 0,1% de Triton X-100 dans du PBS1X pendant 5 min. Après 3 lavages au PBS IX, une étape de saturation est effectuée avec une solution de PBS 1X/SVF 10% pendant 30 min. Les cellules ont ensuite été incubées avec l'anticorps primaire dilué dans 2% SVF pendant 1 heure, lavées 3 fois au PBS1X puis incubées avec un anticorps secondaire dilué dans une solution de PBS/SVF 2% pendant 1 heure. Après 2 lavages au PBSIX, les lamelles en verre sont montés sur lame avec de l’Immu-Mount™ et observés au microscope à fluorescence.

L’anticorps primaire Tgmic3 utilisé est un anticorps qui permet de détecter l’expression de la protéine TgMIC3 SEQ ID NO : 121 dans le parasite (anticorps de lapin anti-mic3 : rnAb antiMIC3 s3) et l’anticorps secondaire commercial utilisé est l’Alexa fluor® 594 chèvre anti-lapin (Life technologies réf. A-l 1012).

L’anticorps primaire Tgmicl utilisé est un anticorps qui permet de détecter l’expression de la protéine TgMICl SEQ ID NO : 122 dans le parasite (anticorps de souris anti-miel : mAb anti-MICl T104F8E12) et l’anticorps secondaire commercial utilisé est l’Alexa fluor® 594 chèvre anti-souris, Life technologies réf. A-l 1005).

Les résultats montrent qu'aucune fluorescence n’est détectable au pôle apical du parasite révélant l’absence des protéines MIC1 et MIC3 dans des tachyzoïtes Toxo tgmicl-3 KO - 2G alors qu'une fluorescence au pôle apical du parasite de la souche sauvage démontre 1’ expression des protéines MIC1 et MIC3 (figure 7).

Les résultats montrent que les parasites expriment une fluorescente verte reflétant l’expression de la protéine CATGFP SEQ ID NO : 120 suite à la réalisation des délétions de gènes (Toxo tgmic3 KO et Toxo tgmicl-3 KO) alors qu’après action de la Cre recombinase, les souches Toxo tgmic3 KO - 2G et Toxo tgmicl-3 KO - 2G ne sont plus fluorescentes (suppression de de la cassette CATGFP) (Figure 7).

Exemple 3 : Construction de la souche Toxo tgmicl-3 KO roplô KO Gral5II Kl

Matériel et méthode

Culture des parasites

Tous les tachyzoïtes de la souche de Toxoplasma gondii utilisés ont été produits en fibroblastes humains (HFF) cultivés en milieu minimal de Dulbecco (DMEM) supplémenté par 10% de sérum de veau fœtal (SVF), 2mM glutamine, lOOU/mL de pénicilline et 100 U/mL de streptomycine. Ils ont été récoltés après lyse mécanique des cellules hôtes et 3 passages en seringue 25G.

Construction du plasmide

Le plasmide pTgRopl6KO-Gral5_nKI-CAT-GFP lox2272 SEQ ID NO : 67 (Figure 8) contient la cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO : 6 comprenant le gène de sélection cat-gfp SEQ ID NO : 2, codant pour la protéine de fusion CAT-GFP conférant une résistance au chloramphénicol (CAT) et une fluorescence verte (GFP), sous le contrôle du promoteur de Ι’α-tubuline de Toxoplasma gondii SEQ ID NO : 3 pour permettre l’expression du gène dans le parasite. En aval du gène de sélection SEQ ID NO : 2, la séquence 3’UTR du gène sagl de Toxoplasma gondii SEQ ID NO : 4 est insérée. Cette séquence a pour objectif de stabiliser l’ARNm codant la protéine de fusion CAT-GFP.

La cassette de sélection SEQ ID NO : 6 est encadrée par deux sites Lox2272 SEQ ID NO : 68, sites de reconnaissance spécifiquement reconnus par la Cre Recombinase et qui seront utilisés ultérieurement pour supprimer la cassette de sélection CAT-GFP.

En aval du deuxième site Lox2272, une cassette d’expression du gène gra/5//SEQ ID NO : 69 a été cloné. Cette cassette d’expression est constituée du promoteur de gralSn amplifié à partir de l‘ADN génomique de la souche ME49 et du gène gra/5//SEQ ID NO : 70 amplifié à partir de l‘ADN génomique de la souche ME49, incluant un tag HA en 3’ SEQ ID NO : 72 pour faciliter la localisation et de la séquence 3’UTR du gène sagl de T gondii SEQ ID NO :4 amplifié à partir de l’ADN génomique de la souche RH. Ce plasmide permet donc la réalisation simultanée d’un mutant roplôKO lox2272 CATGFP lox2272 et l’insertion de gral5IIHA au locus ropl6.

Le plasmide pTgROP16-KO-CAT-tdTomato SEQ ID NO : 73 contient une cassette CATtdTomato SEQ ID NO : 125 - encadrée par une séquence 5’HR du gène Tgroplô SEQ ID NO : 99 et une séquence 3’HR du gène Tgroplô SEQ ID NO : 100.

Le clonage a été fait à partir du plasmide pTgROP16-KO-CAT-tdTomato SEQ ID NO : 73 digéré par les enzymes SphI et Agel (6073pb). Ce clonage a nécessité 4 PCR indépendantes.

La première PCR a permis l’amplification à partir du plasmide pCATGFP lox P SEQ ID NO : 38, d’une cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO : 6 comportant le promoteur aTubuline, le gène de sélection cat-gfp et la région 3’UTR de sagl de T gondii, avec ajout du site lox2272 SEQ ID NO : 68 avec les amorces tub F Agel SEQ ID NO : 74 et 3 UTR lox2272 R SEQ ID NO : 75 (2090pb).

La deuxième PCR a permis l’amplification à partir du plasmide pT230 2G gral5II SEQ ID NO :76, du promoteur gral5II SEQ ID NO : 71 avec ajout en 5’ du site lox2272 SEQ ID NO : 68 avec les amorces pGral5 F lox2272 SEQ ID NO : 77 et P Gral5 R SEQ ID NO : 78 (1975pb).

La troisième PCR a permis l’amplification à partir du plasmide pT230 2G gral5II SEQ ID NO :76, du gène gral5II HA avec le 3’UTR de sagl SEQ ID NO : 79 (2092 pb) avec les amorces Gral5F SEQ ID NO 126et UTR sagl ropl6 R SEQ ID NO 127 .

Les amorces utilisées pour la construction de ce plasmide sont répertoriées dans le tableau 9 ci-dessous.

Tableau 9 : Amorces utilisées pour la construction du plasmide pT230 2G Gral5II

tub F Agel	SEQ ID NO : 74 : GTGATCCTGGTTGGACCGGT
3 UTR lox2272 R	SEQ ID NO : 75 : ATAACTTCGTATAAAGTATCCTATACGAAGTTATCGGTTCGACTAGAACAACTG
pGral5 F lox2272	SEQ ID NO : 77 : CTTTATACGAAGTTATGGATCCACTAGTTGACTGCC
P Gral5 R	SEQ ID NO : 78 : GTCACCATTGTTGAATGC
Gral5F	SEQ ID NO 126 : GCATTCAACAATGGTGAC
UTR sagl ropl6 R	SEQ ID NO 127 : CGAATTTCGGGAGTTCTCGGGGGGGCAAGAATTGTG
Ropl6F	SEQ ID NO : 81 : GAACTCCCGAAATTCGTCAA
Ropl6R SphI	SEQ ID NO : 82 : AATACACGCGACCGCATGC

La dernière PCR a permis l’amplification d’une partie de 3’Ropl6 SEQ ID NO : 80 avec les amorces Ropl6F SEQ ID NO : 81 et Ropl6R SphI SEQ ID NO : 82 (570pb) sur le plasmide pTgroplôKO CAT-tdTomato SEQ ID NO : 73 comme matrice.

Les 4 fragments de PCR amplifiés ont été directement clonés dans le vecteur pTgroplô KO CAT-tdTomato SEQ ID NO : 73 digéré par Agel et SphI grâce au kit In-Fusion® de Ozyme (In-Fusion® HD Cloning Kit - Clonetech). La technologie de clonage In-Fusion® permet le clonage en une étape sans purification ou digestion d’un ou de plusieurs produits de PCR dans un vecteur linéarisé. Des extrémités complémentaires aux extrémités des fragments adjacents sont ajoutées par PCR. La réaction se fait selon les recommandations du constructeur. Le plasmide obtenu est dénommé pTgRopl6KO-Gral5nKI-CAT-GFP lox2272 SEQ ID NO : 67. Le plasmide dénommé pTgRopl6KO-Gral5_nKI-CAT-GFP lox2272 SEQ ID NO : 67 contient donc une cassette CAT- GFP SEQ ID NO : 6 et une cassette d’expression de gralSHAII SEQ ID NO : 69 , encadrées par une séquence 5’HR du gène Tgroplô SEQ ID NO : 99 et une séquence 3’HR du gène Tgroplô SEQ ID NO : 100.

Construction de la souche Toxo tgmicl-3 KO rop!6 KO Gral5II Kl -2G

La construction de la souche vivante atténuée de seconde génération, dénommée Toxo tgmicl-3 KO ropl6 KO Gral5II Kl -2G, est faite en 2 étapes distinctes :

1. Délétion par recombinaison homologue du gène roplô et son remplacement par la cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO : 6 encadrée par des séquences Lox2272 SEQ ID NO : 38 et la cassette gral5IISEQ ID NO :69.

Pour obtenir cette souche, la souche Toxo tgmic3 KO - 2G est électroporée avec le plasmide pTgRopl6KO-Gral5_nKI-CAT-GFP lox 2272 SEQ ID NO : 67 (20 pg ) linéarisé par Pcil, selon le protocole précédemment décrit. Après électroporation, les tachyzoïtes sont déposés sur une monocouche de cellules HFF en culture. Pour la sélection des mutants, le milieu de culture est remplacé et supplémenté par l’agent de sélection (chloramphénicol 20 μΜ), 24 heures après l’électroporation. 10 à 15 jours après sélection, les parasites sont sous-clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF et les clones d’intérêt sont identifiés par PCR après avoir effectué une extraction d’ADN génomique des clones d’intérêt. La souche obtenue est dénommée Toxo tgmicl-3 KO roplô KO Gral5II Kl.

Dans cette souche, le gène roplô a été délété et remplacé par la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 et la cassette d’expression de gra!5HAII SEQ ID NO :69 . Ainsi, la séquence théorique au locus du gène roplô délété contenant la cassette de sélection CATGFP et la cassette d’expression de gral5HAII est la SEQ ID NO : 112.

Dans cette souche, le gène mic3 a été délété et la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 a été excisé. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène mic3 délété contenant un seul site lox P SEQ ID NO : 12, est la SEQ ID NO : 19.

Dans cette souche, le gène miel a été délété et la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 a été excisé. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène miel délété contenant un seul site lox N SEQ ID NO : 5, est la SEQ ID NO : 92.

2. Suppression de la cassette de sélection: la souche Toxo tgmicl-3 KO roplô KO Gral5II Kl obtenue est électroporée avec le plasmide pT-SAGl-CRE-Recombinase SEQ ID NO : 15 (Figure 2-C). L’enzyme exprimée transitoirement va permettre l’excision de la cassette de sélection CAT-GFP. Après électroporation, les tachyzoïtes sont déposés sur une monocouche de cellules HFF en culture. Après 2 à 7 jours de culture, les parasites sont sous-clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF et les clones d’intérêt sont identifiés par PCR après avoir effectué une extraction d’ADN génomique au DNAzol des clones d’intérêt. La souche obtenue est dénommée Toxo tgmicl-3 KO roplô KO Gral5II Kl -2G.

Dans cette souche, le gène ropl6 a été délété et remplacé par la cassette d’expression de gral5HAII SEQ ID NO :69 et la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 a été excisé. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène ropl6 délété contenant la cassette un seul site lox 2272 SEQ ID NO : 68 et la cassette d’expression de gral5HAII est la SEQ ID NO : 93.

Validation de la souche Toxo tgmicl-3 KO rop!6 KO Gral5II Kl -2G par PCR

Pour valider la souche Toxo tgmicl-3 KO ropl6 KO Gral5II Kl 2G des analyses PCR sont effectuées à partir de l’ADN génomique extrait au DNAzol à partir d’un culot parasitaire constitué de 10⁷ parasites. Les amorces utilisées pour les PCR sont décrites dans la Figure 1 ΙΟ et sont détaillées dans le Tableau 10 ci-dessous. Les produits PCR sont analysés par électrophorèse sur gel d’agarose (Figure 9-B). Leur taille attendue et leur taille observée sont également décrites dans le Tableau 11 ci-dessous.

Tableau 10 : liste des amorces utilisées pour la validation de la souche Toxo tgmicl-3 KO rop 16 KO Gral5II Kl 2G.

		Amorce F	Séquence		Amorce R	Séquence
Tgroplô (mixl)	Rgl	AGD rop 16CDS F	SEQ ID NO: 83 GTTTGAGGAAGCGCAAAAAG	Rg2	AGD rop 16CDS R	SEQ ID NO: 84 TGCTGTGATTTCGCAAGTTC
Validation KO en amont (mix2)	Rg3	Rop 16KO valid 5F1	SEQ ID NO: 85 ACCCCCTGACCCCTTGTCTG	Rg4	Amont ropl6R	SEQ ID NO: 86 TCGTCGTGGTATTCACTCCA
Validation KO en aval (mix3)	Rg5	Gral5 qPCR 2F	SEQ ID NO: 87 CACGTACACAACCCATCTCG	Rg6	Aval ropl6R	SEQ ID NO: 88 AAAACGAATGCGAAGGAAGA
Cicatrice roplôKO gral5 loxP (mix4)	Rg7	cicroplô loxF	SEQ ID NO: 89 CAGTACCAGCCACGTTAGCA	Rg8	cicroplô loxGraR	SEQ ID NO: 90 CAAGCAATCTGTGGCAAAAA
Gral5I/II (mix5)		Gral5I/II F	SEQ ID NO: 109 GTGCAAAGCCAACTTCCACT		Gral5I/II F	SEQIDNO: 110 GGACCTGGATCAGAGATCGT

Tableau 11 : Taille attendue des amplicons (en paires de base) des différentes PCR de validation de la construction de la souche Toxo tgmicl-3 KO ropl6 KO Gral5II Kl 2G

	Toxo tgmicl-3 KO-2G	Toxo tgmicl-3 KO roplô KO Gral5IIKI	Toxo tgmicl-3 KO roplô KO Gral5II Kl-2G
Tgroplô (mixl)	1682	-	-
Validation KO 5’Tgropl6 (mix2)		2759
Validation KO 3’ Tgroplô (mix3)		2870	2870
Cicatrice roplôKO gral51oxP (mix4)		2550	321
Gral5I/II (mix5)	560	560 et 308	560 et 308

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces rgl SEQ ID NO: 83 et rg2 SEQ ID NO: 84 (mix 1) permettent de mettre en évidence une bande à 1682 paires de bases pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène Tgroplô dans cette souche. Cette bande n’est pas détectée dans les souches Toxo tgmicl-3 KO ropl6 KO Gral5II Kl et Toxo tgmicl-3 KO ropl6 KO Gral5II Kl -2G confirmant la suppression du gène dans ces souches.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces rg3 SEQ ID NO: 85et rg4 SEQ ID NO: 86 (mix 2) permettent de mettre en évidence une bande à 2759 paires de bases pour la souche Toxo tgmicl-3 KO ropl6 KO Gral5II Kl, conformément à la taille des bandes attendues et confirmant la suppression du gène Tgroplô dans cette souche et l’insertion du gène de sélection CATGFP et gral5II à la place du gène Tgroplô. Cette bande n’est pas détectée dans les souches Toxo tgmicl-3 KO - 2G et Toxo tgmicl-3 KO ropl6 KO Gral5II Kl -2G.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces rg5 SEQ ID NO: 87 et rg6 SEQ ID NO: 88 (mix 3) permettent de mettre en évidence une bande à 2870 paires de bases pour les souches Toxo tgmicl-3 KO ropl6 KO Gral5II Kl et Toxo tgmicl-3 KO ropl6 KO Gral5II Kl -2G, conformément à la taille des bandes attendues et confirmant la suppression du gène Tgroplô dans cette souche et l’insertion du gène gral5II à la place du gène Tgroplô. Cette bande n’est pas détectée dans la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces rg7 SEQ ID NO: 89 et rg8 SEQ ID NO: 90 (mix 4) permettent de mettre en évidence une bande de 2550 paires de bases pour la souche Toxo tgmicl-3 KO rop!6 KO Gral5II Kl confirmant la présence de la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO : 6 à la place du gène Tgroplô. Enfin une bande de 321 paires de bases est mise en évidence pour la souche Toxo tgmicl-3 KO ropl6 KO Gral5II Kl -2G confirmant la suppression du gène de sélection cat-gfp SEQ ID NO : 2 dans cette souche, laissant une cicatrice lox2272 SEQ ID NO : 68 dans le génome. Aucune bande n’est pas détectée dans la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G.

Le produit PCR « cicatrice » obtenue pour la souche Toxo tgmicl-3 KO ropl6 KO Gral5II Kl -2G (321 paires de bases) a été séquencé et les séquençages ont confirmés que :

• le gène Tgroplô a été supprimé et que la cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO : 6 a bien été supprimée par action de la Cre-Recombinase laissant une cicatrice Lox2272 SEQ ID NO : 68 conforme à la séquence attendue (Figure 9-C).

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces SEQ ID NO: 109 et SEQ ID NO: 110 (mix 5) permettent de mettre en évidence une bande à 560 paires de bases pour les souches Toxo tgmicl-3 KO - 2G, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène TggralS dans cette souche. Une bande supplémentaire à 308 paires de bases est détectée dans les souches Toxo tgmicl-3 KO ropl6 KO Gral5II Kl et Toxo tgmicl-3 KO ropl6 KO Gral5II Kl -2G confirmant la présence du gène gralSHAII dans ces souches.

Validation de la souche Toxo tgmicl-3 KO roplô KO Gral5II Kl -2G par immunofluorescence

Les tachyzoïtes sont cultivés 24h sur lamelles en verre recouvertes d’une monocouche de cellules HFF. Les cellules infectées ont été lavés 2 fois en PB SIX, et fixés par du formaldéhyde 4% pendant 30 min. Après 3 lavages en PBS1X, les cellules HFF infectées ont été perméabilisées avec 0,1% de Triton X-100 dans du PBS1X pendant 5 min. Après 3 lavages au PBS IX, une étape de saturation est effectuée avec une solution de PBS 1X/SVF 10% pendant 30 min. Les cellules ont ensuite été incubées avec l'anticorps primaire dilué dans 2% S VF pendant 1 heure, lavées 3 fois au PB SIX puis incubées avec un anticorps secondaire dilué dans une solution de PBS/SVF 2% pendant 1 heure. Après 2 lavages au PBSIX, les lamelles en verre sont montés sur lame avec de l’Immu-Mount™ et observés au microscope à fluorescence.

L’anticorps primaire utilisé est l’anticorps de souris anti-HA qui permet de détecter l’expression de la protéine GRA15n-HA SEQ ID NO : 123 dans le parasite. L’anticorps secondaire est l’anticorps secondaire commercial : Alexa fluor® 594 chèvre anti lapin (Life Technologies A-l 1012). Les anticorps sont dilués au 1/1000 dans du PBS SVF 2%.

Pour la souche sauvage Toxo tgmicl-3 KO 2G, aucune fluorescence rouge n’est observé au pôle apical du parasite révélant ainsi l’absence de la protéine GRA15n-HA. Au contraire, pour la souche Toxo tgmicl-3 KO ropl6 KO gral5II Kl, une fluorescence rouge est observé démontrant la protéine GRA15n-HA. La souche Toxo tgmicl-3 KO ropl6 KO gral5II Kl exprime une fluorescente verte reflétant l’expression de la protéine CATGFP SEQ ID NO : 120 alors qu’après action de la Cre recombinase, la souche Toxo tgmicl-3 KO ropl6 KO gra!5II Kl lox2272 n’est plus fluorescente (Figure 10).

Exemple 4 : Construction d’un plasmide permettant l’intégration et l’expression de transgènes au sein de souches de Toxoplasma gondii et Neospora caninum sans persistance d’une cassette de sélection.

L’objectif de cette expérience est de construire un plasmide qui permette l’intégration dans le génome de Toxoplasma gondii ou dans celui de Neospora caninum d’un transgène hétérologue d’origine parasitaire, virale, bactérienne ou tumorale, son expression et sans persistance d’une cassette de sélection.

Le plasmide dénommé pUC18 4G2 ICrel SEQ ID NO : 128 (Figure 12) est constitué :

• D’une cassette d’expression constitué du promoteur de I’a-Tub8 SEQ ID NO : 130 (Soldati et al., 1995 Mol Cell Biol. 1995 Jan;15(l):87-93) - fusion d’une partie du promoteur de Tgsagl et Tgtub), d’un site de clonage multiple MCS SEQ ID NO : 131 pour permettre l’intégration future de transgène hétérologue et de la séquence 3’UTR du gène Tgsagl SEQ ID NO : 132 qui doit permettre de stabiliser l’ARNm du gène hétérologue.

• D’une cassette de sélection dhfr*-ty-tk SEQ ID NO : 134 comprend un gène de fusion dhfr*-ty-tk SEQ ID NO : 135 codant la protéine de fusion DHFR*TYTK SEQ ID NO : 136, placée sous la dépendance du promoteur du gène dhfr de T gondii SEQ ID NO : 137 et en aval de la séquence 3’UTR du gène dhfr de T gondii SEQ ID NO : 138. La cassette de sélection est entourée par deux sites ICrel SEQ ID NO : 139, site de reconnaissance de la méganucléase I-Crel. Une séquence nucléotidique αβ de 102 paires de bases SEQ ID NO : 140 est ajoutée en amont de la cassette de sélection et une séquence nucléotidique βγ de 100 paires de bases SEQ ID NO : 141 en aval. Ces deux séquences doivent permettre après action de la méganucléases I-Crel de favoriser la réparation de l’ADN par recombinaison homologue entre les deux séquences β SEQ ID NO : 142 pour aboutir à une séquence αβγ non fonctionnelle SEQ ID NO : 143, en lieu et place de la cassette de sélection. La cassette de sélection dhfr*-ty-tk SEQ ID NO : 134 doit permettre la sélection positive des parasites ayant intégré le transgène par action de la pyriméthamine et la sélection négative des parasites dont la cassette de sélection aura été supprimée suite à l’action de la méganucléase I-Crel, par action du ganciclovir (figure 13).

Construction de la cassette d’expression

La cassette d’expression Tub8MCS 3UTR SEQ ID NO : 129 comporte le promoteur de l’aTub8 SEQ ID NO : 130 , un site de clonage multiple SEQ ID NO : 131 et la séquence 3’UTR du gène sagl SEQ ID NO : 132.

Pour cela, le promoteur de I’a-Tub8 SEQ ID NO : 130 a été amplifié par PCR avec les amorces K7mcsl SEQ ID NO : 144 et K7mcs2 SEQ ID NO : 145 sur le pTUB8TY TAIL SEQ ID NO : 146. La taille de l’amplicon obtenu est de 540 paires de bases SEQ ID NO : 147 composé du promoteur de I’a-Tub8 SEQ ID NO : 130 et d’une partie du futur site de clonage multiple SEQ ID NO : 148 (EcoRI, Pmel, Dral, ΑΑΠ, Notl, Ncol, Pacl, Asel).

La séquence 3’UTR du gène sagl SEQ ID NO : 132 a été obtenue par PCR avec les amorces K7mcs3 SEQ ID NO : 149 et K7mcs4 SEQ ID NO : 150. La taille de l’amplicon obtenu est de 395 paires de bases SEQ IDNO : 151.

Les deux fragments PCR ont été fusionnés par PCR chevauchante avec les amorces K7mcsl SEQ ID NO : 144 et K7mcs4 SEQ ID NO : 150. L’amplicon obtenu (914pb) SEQ ID NO : 152 a été séquencé puis digéré par Kpnl et Sacl (902pb) et clonée dans le pUC18 SEQ ID NO : 153 après digestion enzymatique par Kpnl Sacl (2682 paires de bases).

Tableau 12 : liste des amorces utilisées pour la Construction de la cassette d’expression

	1
K7mcs 1	PT UB8 MCS 4 F	SEQ ID NO : 144 AAAGGTACCTCTAGAAGTATA CTATTCGAAAAACTAGTATCG ATAAGCTTGAACAC	K7mcs 2	Tub8 Ter R	SEQ ID NO : 145 AACTTAAGAATTTTGTTTAAACAGGG
K7mcs 3	MCS 3UTR TER F	SEQ ID NO : 149 TTTAAACAAAATTCTTAAGTT GCGGC	K7mcs 4	MCS 3UTR TER R	SEQ IDNO : 150 TTTGAGCTCTCTAGAATTTAAATCCTA GG

Le plasmide obtenu est appelé pUC 18 -Tub8MCS 3UTR SEQ ID NO : 133

Construction de la cassette de sélection

La cassette de sélection dhfr*-ty-tk a été réalisée à partir de 3 fragments PCR :

• L’amplification du premier fragment PCR SEQ ID NO : 154 a été effectuée sur le plasmide pUC18DHFR* SEQ ID NO : 155 (Donald & Roos 1993) avec les amorces Dhtkl SEQ ID NO : 156 et Dhtk2 SEQ ID NO : 157 (674pb) et permet l’amplification de la fin de la séquence codante de DHFR* SEQ ID NO : 158 et d’ajouter la séquence codant le TY SEQ ID NO : 159 en 3’.

• La deuxième PCR SEQ ID NO : 160 a été effectuée sur une séquence synthétisée du gène codant la Thymidine Kinase de l’Human herpes virus 1 (TK) SEQ ID NO : 161 avec les amorces Dhtk3 SEQ ID NO : 162 et Dhtk4 SEQ ID NO : 163 (1161pb) et permet l’amplification de la séquence codante de la Thymidine Kinase avec ajout de la séquence codant le TY SEQ ID NO : 159 en 5’.

• L’amplification du troisième fragment de PCR SEQ ID NO : 164 a été effectuée sur pUC18DHFR* SEQ ID NO : 155 avec les amorces Dhtk5 SEQ ID NO : 165 et Dhtk6 SEQ ID NO : 166 (363pb) et permet l’amplification de la fin de la séquence codante de la Thymidine Kinase SEQ ID NO : 167 et du 3’UTR de DHFR* SEQ ID NO : 168.

Les deuxième et troisième fragments de PCR (respectivement SEQ ID NO : 160 et SEQ ID NO : 164) sont fusionnés par PCR chevauchante SEQ ID NO : 169 avec les amorces Dhtk3 SEQ ID NO : 162 et Dhtk6 SEQ ID NO : 166 (150lpb). Enfin le premier fragment SEQ ID NO : 154 digéré par BamHI et BglII (646pb) et la fusion des deux autres PCR SEQ ID NO : 169 digéré par BamHI et Xbal (1474pb) sont clonés dans le plasmide pUC18DHFR* SEQ ID NO : 155 digéré par BglII et Xbal (5258pb).

Tableau 13 : liste des amorces utilisées pour la Construction de la cassette de sélection


Dhtkl	AF DHFRint BglF	SEQ IDNO : 156 CTGAGAAGGGCGTGAAGATC	Dhtk2	AF DHFR TY R	SEQ IDNO : 157 GTCAAGTGGATCCTGGTTAGTATGGAC CTCGACAGCCATCTCCATCTGGATTCG
Dhtk3	TY HSVTK F	SEQ IDNO : 162 GAGGTCCATACTAACCAGGATCC ACTTGACATGGCTTCGTACCCCTG CCATCA	Dhtk4	HSVTK stop TAAR	SEQ IDNO : 163 TTAGTTAGCCTCCCCCATCTCCC
Dhtk5	AFHSVT K3UTRD HFRF	SEQ IDNO : 165 GGGAGATGGGGGAGGCTAACTAA CGGAAATACAGAAGCTGCCCGTC TCT	Dhtk6	AF 3UTRD HFR XbaR	SEQ IDNO : 166 TTTTTCTAGAATCCTGCAAGTGCATAG AAGGAA

Le plasmide obtenu est appelé plasmide pUC18 DHFR*TYTK SEQ ID NO : 170.

Construction du plasmide pUC18 4G2

La cassette d’expression Tub8MCS 3UTR SEQ ID NO : 129 obtenue par digestion du pUC 18 -Tub8MCS 3UTR SEQ ID NO : 133 avec l’enzyme Xbal (890pb) a ensuite été clonée dans le plasmide pUC18 DHFR*TYTK SEQ ID NO : 170 digéré par Xbal et déphosphorylé (7378pb). Le plasmide obtenu plasmide pUC18 4G2 SEQ ID NO : 171 présente la cassette d’expression Tub8MCS 3UTR transcrite en sens inverse par rapport à la cassette DHFR*TYTK.

Construction du plasmide final pUC18 4G2 ICrel

Le plasmide final pUC18 4G2 ICrel SEQ ID NO : 128 présente en amont et en aval de la cassette de sélection dhfr*-ty-tk SEQ ID NO : 134 des séquences permettant l’action de la méganucléase I-Crel.

La séquence αβ Icrel SEQ ID NO : 182 est ajoutée en amont de la cassette de sélection dhfr*ty-tk SEQ ID NO : 134. Pour cela deux fragments sont amplifiés par PCR (respectivement 142 pb :SEQ ID NO : 174 et 153 pb : SEQ ID NO : 175) avec les amorces Icrell SEQ ID NO : 176 et IcreI2 SEQ ID NO : 177 sur le pTsaglI-Crel αβγ SEQ ID NO : 178 (pour le fragment de 142pb) et IcreI3 SEQ ID NO : 179 et IcreI4 SEQ ID NO : 180 sur le pUC18 DHFR*TYTK SEQ ID NO : 170 (pour le fragment de 153pb). Les deux fragments PCR ont été directement clonés dans le plasmide pUC18 4G2 digéré par les enzymes de restriction Pmi I et KasI (7990pb) avec la technique In-Fusion de Ozyme.

La séquence Icrel βγ SEQ ID NO : 183 est ajoutée en aval de la cassette de sélection dhfr*-tytk SEQ ID NO : 134. Pour cela deux fragments sont amplifiés par PCR (respectivement 546 pb :SEQ ID NO : 184 et 133 pb : SEQ ID NO : 185) avec les amorces IcreI5 SEQ ID NO : 186 et IcreI6 SEQ ID NO : 187 sur le pTIcreI300 SEQ ID NO : 188 (546pb) et IcreI7 SEQ ID NO : 189 et IcreI8 SEQ ID NO : 190 sur le pTsaglI-Crel αβγ SEQ ID NO : 178 (133pb) permettent l’ajout de la séquence Icrel βγ SEQ ID NO : 183 dans le plasmide précédemment décrit digéré par les enzymes de restriction Nsil et Avril (7734pb).

Tableau 14 : liste des amorces utilisées pour la Construction du plasmide final pUC18 4G2

ICrel


1er ei 1	PC R oz4 g mn 1 F	SEQ IDNO : 176 AATACCGCATCAGGCGCCTAGAACCTGTTA	1er ei 2	oz4g mn lier elr	SEQ IDNO : 177 AAAACGTCGTGAGACAGTTTGGTGAGATATCTTCA AAAGATATATAGC
AAAATAT
1er ei 3	oz4 g mn 2 Icre IF	SEQ IDNO : 179 GTCTCACGACGTTTTGAACCCAGAAGCrrCGC	1er ei 4	oz4g mn 2R	SEQ IDNO : 180 CGGATATGGTTACACGTG
CAGGCTGTAAAT
1er ei 5	oz 4g 3F	SEQ IDNO : 186 CGCCTCCGTCCCATGCAT	1er ei 6	OZ 4g 3 cre R	SEQ IDNO : 187 CCAAACTGTCTCACGACGTT
1er ei 7	OZ 4g4 Fier ei	SEQ IDNO : 189 CGTGAGACAGTTTGGCTAAAAATTTATTTTAA ATAATCTTAT	1er ei 8	oz 4g4 R avril	SEQ IDNO : 190 GAGGCGCGCCAACCTAGGAGGGCCCGGGCGCCAT GGC

Le plasmide final obtenu est nommé pUC18 4G2 ICrel SEQ ID NO : 128.

Exemple 5 : Construction d’un plasmide d’expression de la méganucléase I-Crel dans les souches Toxoplasma gondii et Neospora caninum.

Le plasmide ptsaglI-Crel αβγ SEQ ID NO : 178 (Figure 14) a été construit pour permettre l’expression transitoire de la méganucléase I-Crel SEQ ID NO : 193 dans les parasites Toxoplasma gondii et Neospora caninum. Il possède également la séquence αβγ SEQ ID NO : 143, matrice qui permettra de favoriser la recombinaison entre les parties αβ SEQ ID NO : 182 et βγ SEQ ID NO : 183 après coupure par la méganucléase I-Crel.

Le gène I-crel codant la méganucléase I-Crel SEQ ID NO : 194 est placé sous la dépendance du promoteur du gène sagl de Toxoplasma gondii SEQ ID NO : 17. La protéine méganucléase I-Crel SEQ ID NO : 193 sera donc exprimée dans les parasites transfectés. En aval du gène codant la méganucléase I-Crel, la séquence 3’UTR du gène sagl de Toxoplasma gondii SEQ ID NO : 4 est insérée. Cette séquence a pour objectif de stabiliser l’ARNm codant la méganucléase I-Crel.

La séquence codant la méganucléase I-Crel SEQ ID NO : 193 nous a été fournie dans le plasmide pCLS2220 SEQ ID NO : 197 par la société Cellectis. Le fragment de PCR SEQ ID NO : 198 (537pb) amplifié avec les amorces IcreI9 SEQ ID NO : 199 et IcrelO SEQ ID NO : 200 digéré par les enzymes Nsil et Pacl (524pb) est cloné dans le plasmide pTsaglCre recombinase SEQ ID NO : 15 digéré par les enzymes Nsil et Pacl (en lieu et place de la CRE recombinase - 3642pb). Le plasmide obtenu est nommé ptsagl I-Crel SEQ ID NO : 201.

La séquence matrice αβγ SEQ ID NO : 143 a été amplifiée par PCR SEQ ID NO : 202 (170pb) sur une séquence synthétisée αβγ avec les amorces Icrel 11 SEQ ID NO : 203 et Icrel 12 SEQ ID NO : 204 et clonée directement dans le ptsaglI-Crel SEQ ID NO : 201 digéré par Notl et Sacl (4145 pb) avec la technique In-Fusion de Ozyme.

Tableau 15 : liste des amorces utilisées pour la Construction du plasmide plasmide ptsagllCrel αβγ


Icrei 9	sagl ICrel For	SEQ IDNO : 199 AGTATGCATCCCAAGAAGAAGAGGAAGGT GGCCAATACCAAATATAACAAAGAGTTCCT GC	Icrei 10	ICre I rev	SEQ ID NO : 200 CTTTAATTAATCGGCCGCCGGGG AGG
Icrei 11	ABF	SEQ ID NO :203 CACTAGTTCTAGAGCTAGAACCTGTTAAAAA	Icrei 12	BGR	SEQ ID NO : 204 GGGAACAAAAGCTGGAGGGCCC
TATAATCCA	GGGCGCCATGGCA

Exemple 6 : Construction de plasmides permettant l’intégration et l’expression de transgènes du virus Influenza dans des souches de Toxoplasma gondii et Neospora caninum sans persistance d’une cassette de sélection.

L’objectif de cette expérience est de construire des plasmides qui permettent l’intégration dans le génome de Toxoplasma gondii ou dans celui de Neospora caninum d’un transgène hétérologue du virus Influenza son expression et sans persistance d’une cassette de sélection.

• Plasmide pUC18 4G2 ICrel - M2eGPI

Le plasmide pUC18 4G2 ICrel - M2eGPI SEQ ID NO : 205 (Figure 15) permet la production d’une protéine de fusion saglM2eGPI SEQ ID NO : 206, comprenant :

> une grande partie de la protéine SAG1 SEQ ID NO : 207 de Toxoplasma gondii codée par la séquence SEQ ID NO : 208, > une répétition de 5 M2e du virus A'Tnfluenza espacée par des linkers (Lee et al, 2015, PLoS ONE 10(9): e0137822. doi:10.1371/journal.pone.0137822) SEQ ID NO : 209. Chaque fragment M2e constitue le domaine extracellulaire (fragment Nter) de la protéine M2 d’une origine spécifique. La séquence nucléotidique des 5 M2e reliés SEQ ID NO : 210 permet de coder deux M2e d’origine humaine SEQ ID NO : 211 codés par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 172 , un M2e d’origine aviaire de souche de type I SEQ ID NO : 212 codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 173 , un M2e d’origine aviaire de souche de type II SEQ ID NO : 213 codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 181 et un M2e d’origine porcine SEQ ID NO : 214 codés par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 191. Entre chaque M2e, un linker de séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 215 est inséré, ce même linker est codé respectivement par les séquences nucléotidiques SEQ ID NO :192, SEQ ID NO : 195, SEQ ID NO :196 et SEQ ID NO :220. La séquence nucléotidique de cette répétition de 5 M2e a été optimisée pour Toxoplasma gondii.

> un Tag V5 SEQ ID NO : 216 codée par la séquence SEQ ID NO : 217 > et en C terminal, une séquence d’ancrage en GPI de la protéine S AGI SEQ ID NO : 218 de Toxoplasma gondii codée par la séquence SEQ ID NO : 219.

L’amplification de 3 fragments PCR a été nécessaire pour cette construction :

• L’amplification de la séquence codante de sagl a été effectuée sur l’ADN génomique de Toxoplasma gondii avec les amorces da SEQ ID NO : 222 et db SEQ ID NO : 223 (PCR : SEQ ID NO : 221 - 906pb).

• L’amplification de la séquence d’ADN codant pour la répétition des 5 fragments M2e de 5 types de virus influenza et contenant un tag V5a été effectuée à partir d’un gène synthétique optimisée pour son expression chez Toxoplasma gondii. avec les amorces de SEQ ID NO : 225 et dd SEQ ID NO : 226 (PCR : SEQ ID NO : 224 : 588 pb) • L’amplification de la séquence d’ADN codant pour l’ancrage GPI a été effectuée sur l’ADN génomique de Toxoplasma gondii avec les amorces de SEQ ID NO : 228 et df SEQ ID NO : 229 (PCR : SEQ ID NO : 227 ; 98pb).

Tableau 16 : liste des amorces utilisées pour la Construction du plasmide pUC18 4G2

ICrel - M2eGPI

	Amor ce F	Séquence		Amor ce R	Séquence
D a	Ozsa gl 4G F	SEQ ID NO :222 CTTGAATTCCCTGTTTAAACGACAAAATGTTTCC GAAGGCAGTG	d b	Sagl M2e R	SEQ ID NO :223 TCAGCAAGGACCTAGGTGCAGCCCCGGCA A
d c	M2e F	SEQ ID NO :225 CCTAGGTCCTTGCTGACTGA	d d	Oz M2e GPI R	SEQ ID NO :226 GGCTGTTCCCGCAGCCGTAGAATCGAGAC CGAGGA
d e	oZ GPIF	SEQ ID NO :228 GCTGCGGGAACAGCCAGTCA	d f	oZ GPI R	SEQ ID NO :229 ACCATGGAAGCGGCCGCTTACGCGACACA AGCTGCGAT

Les fragments de PCR ont été directement clonés dans le plasmide pUC18 4G2 ICrel SEQ ID NO : 128 digéré par les enzymes Pmel et Notl (8344pb) avec la technique In-Fusion de Ozyme.

• Construction du plasmide pUC18 4G2 Icrel M2e

Le plasmide pUC18 4G2 ICrel - M2e SEQ ID NO : 244 (Figure 16) permettra la production d’une protéine de fusion saglM2e SEQ ID NO : 253, comprenant :

> une grande partie de la protéine SAG1 SEQ ID NO : 207 de Toxoplasma gondii codée par la séquence SEQ ID NO : 208, > une répétition de 5 M2e du virus A'Tnfluenza espacée par des linkers (Lee et al) SEQ ID NO : 209 .Chaque fragment M2e constitue le domaine extracellulaire (fragment Nter) de la protéine M2. La séquence nucléotidique des 5 M2e reliés SEQ ID NO : 210 se compose de deux M2e d’origine humaine SEQ ID NO : 211, un M2e d’origine aviaire de souche de type I SEQ ID NO : 212, un M2e d’origine aviaire de souche de type II SEQ ID NO : 213 et un M2e d’origine porcine SEQ ID NO : 214. Entre chaque M2e, un linker SEQ ID NO : 215 est inséré La séquence nucléotidique de cette répétition de 5 M2e a été optimisée pour Toxoplasma gondii.

> un Tag V5 SEQ ID NO : 216 codée par la séquence SEQ ID NO : 217.

L’amplification de 2 fragments PCR a été nécessaire pour cette construction :

• L’amplification de la séquence codante de sagl a été effectuée sur l’ADN génomique de Toxoplasma gondii avec les amorces da SEQ ID NO : 222 et db SEQ ID NO : 223 (PCR : SEQ ID NO : 221 ; 906pb).

• L’amplification de la séquence d’ADN codant pour la répétition des 5 fragments M2e de 5 types de virus influenza et contenant un tag V5 a été effectuée à partir d’un gène synthétique optimisée pour son expression chez Toxoplasma gondii. avec les amorces de SEQ ID NO : 225 et dg SEQ ID NO : 231 (PCR : SEQ ID NO : 230 ; 593 pb)

Tableau 17 : liste des amorces utilisées pour la Construction du plasmide pUC18 4G2 ICrel M2e

	Amor ce F	Séquence		Amor ce R	Séquence
D a	Ozsag 1 4G F	SEQ ID NO :222 CTTGAATTCCCTGTTTAAACGACAAAATGTTTCCGAA GGCAGTG	d b	Sagl M2e R	SEQ ID NO :223 TCAGCAAGGACCTAGGTGCAGCCCC GGCAA
de	M2e F	SEQ ID NO :225 CCTAGGTCCTTGCTGACTGA	d g	Oz M2e R	SEQ ID NO :231 ACCATGGAAGCGGCCGCTTACGTAG AATC

Les fragments de PCR ont été directement clonés dans le plasmide pUC18 4G2 ICrel SEQ ID NO : 205 digéré par les enzymes Pmel et Notl (8344pb) avec la technique In-Fusion de Ozyme.

• Plasmide pUC18 4G2 ICrel - HA

Le plasmide pUC18 4G2 ICrel - HA SEQ ID NO : 232 (Figure 17) permet la production d’une protéine de fusion saglHA SEQ ID NO : 255, comprenant :

> une grande partie de la protéine SAG1 SEQ ID NO : 207 de Toxoplasma gondii codée par la séquence SEQ ID NO : 208, > la tête de la protéine HA SEQ ID NO : 233 a été effectuée à partir d’un gène synthétique optimisée pour son expression chez Toxoplasma gondii SEQ ID NO : 235 et sélectionnée à partir de la souche d’origine : A/Swan/hungary/4999/2006 H5N1 (Kapcynski et al., 2015) SEQ ID NO : 234.

> un Tag myc SEQ ID NO : 236 codée par la séquence SEQ ID NO : 237 > et en C terminal, une séquence d’ancrage en GPI de la protéine S AGI SEQ ID NO :

218 de Toxoplasma gondii codée par la séquence SEQ ID NO : 219.

• L’amplification de la séquence codante de sagl a été effectuée sur T ADN génomique de Toxoplasma gondii avec les amorces da SEQ ID NO : 222 et db SEQ ID NO : 223 (PCR : SEQ ID NO : 221 ; 906pb).

• L’amplification de la séquence d’ADN codant pour la tête de la protéine HA avec ajout d’un tag myc SEQ ID NO : 238 (722pb) a été effectuée à partir d’un gène synthétique avec les amorces di SEQ ID NO : 239 et dj SEQ ID NO : 240 (PCR : SEQ ID NO : 238 : 722 pb) • L’amplification de la séquence d’ADN codant pour l’ancrage GPI avec ajout du tag myc SEQ ID NO : 241 a été effectuée sur T ADN génomique de Toxoplasma gondii avec les amorces dk SEQ ID NO : 242 et df SEQ ID NO : 243 (PCR : SEQ ID NO : 241 ; 121pb).

Tableau 18 : liste des amorces utilisées pour la Construction du plasmide pUC18 4G2

ICrel - HA

	Amorce F	Séquence		Amorce R	Séquence
D a	Ozsagl 4GF	SEQ ID NO :222 CTTGAATTCCCTGTTTAAACGACAAAAT GTTTCCGAAGGCAGTG	d b	Oz sag 1 tete HA r	SEQ ID NO :223 CGTCCAAGTCCCTAGGTGCAGCCCCGGCA AACTCC
di	Oz Tete HA F	SEQIDNO :239 CCTAGGGACTTGGACGGAGTGAAG	dj	Oz tete HA myc R	SEQ ID NO :240 TCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTCGTTTCCA TACTCAAGCTTAGATTT
d k	Oz myc GPI F	SEQ ID NO :242 AACTCATCTCAGAAGAGGATCTGGCTGC GGGAACAGCCAGT	df	oZ GPI R	SEQ ID NO :243 ACCATGGAAGCGGCCGCTTACGCGACAC AAGCTGCGAT

Exemple 7 : Construction de souches Toxo tgmicl-3 K0-2G exprimant un ou plusieurs antigènes du virus Influenza et ne comportant pas de gène de sélection

Souches de Toxoplasma gondii

La souche utilisée dans le présent exemple est une souche atténuée de Toxoplasma gondii, dénommée Toxo tgmic7-3 KO 2G. Elle a été obtenue par la délétion par recombinaison homologue de deux gènes de virulence : les gènes miel et mic3.

Les tachyzoïtes de la souche Toxo tgmic7-3 KO 2G sont produits sur fibroblastes humains (HFF Hs27 ATCC CRL-1634)) cultivés en milieu minimal de Dulbecco (DMEM) supplémenté par 10% de sérum de veau fœtal (SVF), 2mM glutamine, lOOU/mL de pénicilline et lOOU/mL de streptomycine. Ils ont été récoltés après lyse mécanique des cellules hôtes et 3 passages en seringue 25G.

Construction des souches - protocole

La construction de chaque souche vaccinale contenant un ou plusieurs antigènes se fait à chaque étape avec un protocole identique. Le protocole expérimental est dans un premier temps détaillé ici puis appliqué pour chaque construction de souche vaccinale, celui-ci comporte plusieurs étapes :

a- Electroporation et sélection de la souche d’intérêt avec le plasmide exprimant un antigène du virus de la grippe : souches Toxo tgmicl-3 KO - 2G Influenza

Les parasites Toxo tgmicl-3 KO - 2G sont électroporés avec 20pg de plasmide pUC18 4G2 ICrel - Influenza linéarisé. Après électroporation, les tachyzoïtes sont soumis à une pression de sélection par l’agent de sélection (Pyriméthamine ΙμΜ). 10 à 15 jours après sélection et passages successifs sur cellules HFF, les parasites sont sous-clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF puis amplifiés en plaques 24 puits sur une monocouche de cellules HFF.

b- Validation de la souche ayant intégré le plasmide par PCR

Pour valider une souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Influenza, des analyses PCR sont effectuées à partir de l’ADN génomique extrait au DNAzol à partir d’un culot parasitaire constitué de 10⁷ parasites. Les amorces sont détaillées dans le Tableau 19 ci-dessous. Les produits PCR sont analysés par électrophorèse sur gel d’agarose. Leurs tailles attendues sont également décrites dans le Tableau 20 ci-dessous. Plusieurs mix sont possibles et les PCR sont réalisées en fonction des souches testées.

Tableau 19 : liste des amorces utilisables pour la validation des souches.

Mix M2e	M2e F	SEQ ID NO : 245 CCTAGGTCCTTGCTGACTGA	oz M2e R	SEQ ID NO : 246 ACCATGGAAGCGGCCGCTTACGTAGAATC
Mix M2eGPI ou M2e	M2e F	SEQ ID NO : 245 CCTAGGTCCTTGCTGACTGA	oz M2e GPI R	SEQ ID NO : 247 GGCTGTTCCCGCAGCCGTAGAATCGAGACCG AGGA
Mix HA	oz te te HA F	SEQIDNO : 239 CCTAGGGACTTGGACGGAGTG AAG	Seq HA RI	SEQ ID NO : 248 AGTCTCTGGTTCAGAGTGGA
Influenza	seq TU B MC SF	SEQ ID NO : 249 AACCCGCGCAGAAGACATCC	seq 3utr MCS R	SEQ ID NO : 250 ATGGGGCACATGCTGCACGAA
dhfr*tyt K	Dhf rint Bgl IIF	SEQIDNO : 251 CTGAGAAGGGCGTGAAGATC	qPC R TK R	SEQ ID NO : 252 ACACCCGCCAGTAAGTCATC

Tableau 20 : Taille attendue des amplicons (en paires de base) des différentes PCR de validation de la construction des souches Toxo tgmicl-3 KO - 2G Influenza

	Mix	Mix M2eGPI ouM2e	Mix	Gène d’intérêt	DHFR* TYTK
Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e	588	593	-	1641	945
Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e GPI	-	593	-	1719	945
Toxo tgmicl-3 KO - 2G HA	-	-	506	1875	945
Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e HA	588	593	506	1641/ 1 8 7 5	945
Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e GPI HA		593	506	1719/ 1 8 7 5	945

c- Validation de la souche ayant intégré le plasmide par immunofluorescence

Les tachyzoïtes sont cultivés 24h sur lamelles en verre recouvertes d’une monocouche de cellules HFF. Les cellules infectées ont été lavés 2 fois en PB SIX, et fixés par du formaldéhyde 4% pendant 30 min. Après 3 lavages en PBS1X, les cellules HFF infectées ont été perméabilisées avec 0,1% de Triton X-100 dans du PBS1X pendant 5 min. Après 3 lavages au PBS IX, une étape de saturation est effectuée avec une solution de PBS 1X/SVF 10% pendant 30 min. Les cellules ont ensuite été incubées avec l'anticorps primaire dilué dans 2% SVF pendant 1 heure, lavées 3 fois au PBS1X puis incubées avec un anticorps secondaire dilué dans une solution de PBS/SVF 2% pendant 1 heure. Après 2 lavages au PBSIX, les lamelles en verre sont montées sur lame avec de l’Immu-Mount™ et observés au microscope à fluorescence.

L’anticorps primaire M2 utilisé est un anticorps commercial (Antiinfluenza A virus M2 Protein antibody [14C2] ab5416) qui permet de détecter l’expression de la protéine de fusion SaglM2e SEQ ID NO : 253 ou SaglM2eGPI SEQ ID NO : 206 dans le parasite ou la vacuole parasitophore, l’anticorps primaire HA utilisé est un anticorps commercial (Anti-influenza A virus (H5N1/HA1) antibody [2B7]) abl35382) qui permet de détecter l’expression de la protéine de fusion SaglHA SEQ ID NO : 255 dans le parasite et enfin l’anticorps secondaire commercial utilisé est l’Alexa fluor® 594 goat anti-mouse.

d- Validation de la souche ayant intégré le plasmide par analyse du profil de résistance

Le profil d’antibiorésistance est analysé pour les clones validés en PCR et immunofluorescence. Les tachyzoïtes (de 1.10⁵ à 5.10⁵) sont cultivés 5 jours sur une monocouche de cellules HFF. Les parasites Toxo tgmicl-3 KO - 2G Influenza ayant intégré un plasmide pUC18 4G2 ICrel - Influenza linéarisé doivent être résistants à la pyriméthamine (ΙμΜ - grâce à la présence du gène DHFR*) et sensible au ganciclovir (50μΜ - à cause de la présence du gène TK). Ce profil de résistance est validé en cultivant les parasites sur fibroblastes humains (HFF Hs27 ATCC CRL-1634)) cultivés en milieu minimal de Dulbecco (DMEM) supplémenté par 10% de sérum de veau fœtal (SVF), 2mM glutamine, 100 U/mL de pénicilline et 100 U/mL de streptomycine, supplémenté ou non de la pyriméthamine ou du ganciclovir.

Les souches validées par PCR, immunofluorescence et ayant le bon profil d’antibiorésistance sont nommées Toxo tgmicl-3 KO - 2G Influenza (Toxo tgmicl-3 KO

- 2G M2e, Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI, Toxo tgmicl-3 KO - 2G HA ,Τοχο tgmicl-3 KO - 2G M2e HA ou Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA).

e- Electroporation de la Toxo tgmicl-3 KO - 2G Influenza avec un plasmide pTsagl ΚτεΙαβγ et contre sélection de la souche ayant perdu la cassette de sélection DHFR*-TY-TK : souches Toxo tgmicl-3 KO - 2G Influenza Icrel

Les parasites Toxo tgmicl-3 KO - 2G Influenza sont électroporés avec 20pg de plasmide pTsaglIcrel αβγ circulaire SEQ ID NO : 178. Après électroporation, les tachyzoïtes sont soumis à une pression de sélection par l’agent de sélection (Ganciclovir 50μΜ). 10 à 15 jours après sélection et passages successifs sur cellules HFF, les parasites sont sous-clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF puis amplifiés en plaques 24 puits sur une monocouche de cellules HFF.

f- Validation de la souche ayant perdu la cassette de sélection DHFR*-TY-TK par PCR

Pour valider une souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Influenza Icrel, des analyses PCR sont effectuées à partir de l’ADN génomique extrait au DNAzol à partir d’un culot parasitaire constitué de 10⁷ parasites. Les amorces utilisées pour les PCR sont détaillées dans les tableaux 19 (point b) et 21 ci-dessous. Les premières PCR sont identiques aux PCR faites pour la validation des souches Toxo tgmicl-3 KO - 2G Influenza, la deuxième série de PCR permet de valider la suppression de la cassette DHFR*-TY-TK et la présence de la cicatrice αβγ. Les produits PCR sont analysés par électrophorèse sur gel d’agarose. Leurs tailles attendues sont également décrites dans le Tableau 22 ci-dessous. Plusieurs mixs sont possibles et les PCR sont réalisées en fonction des souches testées.

Tableau 21 : liste des amorces utilisables pour la validation des souches.

Mix Icrel M2e ou M2eGPI	M2e F	SEQ ID NO :245 CCTAGGTCCTTGCTGACTGA	MCI	SEQ ID NO :254 TGAAATACCGCACAGATGCG
Mix Icrel HA	oz te te HAF	SEQ ID NO :239 CCTAGGGACTTGGACGGAGTGAAG	MCI	SEQ ID NO :254 TGAAATACCGCACAGATGCG

Tableau 22 : Taille attendue des amplicons (en paires de base) des différentes PCR de validation de la construction des souches Toxo tgmicl-3 KO - 2G Influenza (voir point b pour les 5 premiers mixs).

	Mix	Mix M2eGPI ou M2e	Mix HA	Gène d’intérêt	DHFR* TYTK	Mix Icrel M2e ou M2eGPI	Mix Icrel HA
Toxo tgmicl-3 KO - 2 G M2e Icrel	588	593	-	1641	-	1114	-
Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e GPI Icrel	-	593	-	1719	-	1192	-
Toxo tgmicl-3 KO - 2G HA Icrel	-	-	506	1875	-	-	1348
Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e HA	588	593	506	1641/1875	945	1114	-
Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e HA Icrel	588	593	506	1641/1875	-	1114	1348
Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e GPI HA	-	593	506	1719/1875	945	1192	-
Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e GPI HA Icrel		593	506	1719/1875		1192	1348

g- Validation de la souche ayant perdu la cassette de sélection DHFR*-TY-TK par immunofluorescence

La validation des souches par immunofluorescence se fait suivant le protocole précédemment décrit (point c).

h- Validation de la souche ayant perdu la cassette de sélection DHFR*-TY-TK par analyse du pro fil de résistance

Les parasites Toxo tgmicl-3 KO - 2G Influenza ayant perdu la cassette de sélection DHFR*TY-TK doivent être sensibles à la pyriméthamine (ΙμΜ - grâce à la suppression du gène DHFR*) et résistants au ganciclovir (50μΜ - grâce à la suppression du gène TK). Ce profil de résistance est validé en cultivant les parasites sur fibroblastes humains (HFF Hs27 ATCC CRL-1634) en milieu minimal de Dulbecco (DMEM) supplémenté par 10% de sérum de veau fœtal (SVF), 2mM glutamine, lOOU/mL de pénicilline et lOOU/mL de streptomycine, supplémenté ou non de la pyriméthamine ou du ganciclovir.

Les souches validées par par PCR, immunofluorescence et ayant le bon profil d’antibiorésistance sont nommées Toxo tgmicl-3 KO - 2G Influenza Icrel (Toxo tgmicl3 KO - 2G M2e Icrel, Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI Icrel, Toxo tgmicl-3 KO - 2G HA Icrel, Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e HA Icrel ou Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA Icrel).

Résultats - Construction des souches exprimant un antigène du virus Influenza et ne comportant pas de gène de sélection

A. Construction de la souche Toxo tgmic/-3 KO - 2GM2e Icrel

1. Construction de la souche Toxo tgmic/-3 KO - 2GM2e

L’électroporation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G avec le plasmide pUC18 4G2 ICrel M2e SEQ ID NO : 244 a été réalisée selon le protocole décrit (point a). Les clones obtenus résistants à la pyriméthamine sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence du gène d’interet M2e et l’expression de la protéine.

Validation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e par PCR

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO : 245 et oz M2e R SEQ ID NO : 246 (Mix M2e) permettent de mettre en évidence une bande à 588 paires de bases pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène M2e dans cette souche (figure 18). Cette bande n’est pas détectée dans la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO :245 et oz M2eGPI R SEQ ID NO : 247 (Mix M2eGPI ou M2e) permettent de mettre en évidence une bande à 593 paires de bases pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène M2e dans cette souche. En effet, cette PCR permet de différencier l’insertion du plasmide pUC18 4G2 ICrel - M2eGPI (PCR négative) de l’insertion du plasmide pUC18 4G2 ICrel - M2e (PCR positive à 588pb) (figure 18). Cette bande n’est pas détectée dans la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO : 250 (Mix Gène d’intérêt) permettent de mettre en évidence une bande à 1641 paires de bases pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène M2e dans cette souche. Cette bande n’est pas détectée dans la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ, (figure 18)

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces Dhfir int Bgl II F SEQ ID NO :251 et qPCR TK R SEQ ID NO : 252 (Mix DHFR*TYTK) permettent de mettre en évidence une bande à 945 paires de bases pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène DHFR*TYTK dans cette souche. Cette bande n’est pas détectée dans la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ, (figure 18)

La souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e est validée par PCR.

Validation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e par immunofluorescence

Les résultats montrent qu’avec l’anticorps anti M2e aucune fluorescence n’est détectable pour le parasite Toxo tgmicl-3 KO - 2G, alors qu’une fluorescence est détectée dans les parasites et dans les vacuoles parasitophores de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine M2e. (figure 19)

La souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e est validée par immunofluorescence.

Validation de la souche ayant intégré le plasmide par analyse du profil de résistance Les tachyzoïtes (de 1.10^{2 * * 5} à 5.10⁵) sont cultivés 5 jours sur une monocouche de cellules HFF (fibroblastes humains HFF Hs27 ATCC CRL-1634) en présence de pyriméthamine (ΙμΜ) ou de ganciclovir (50μΜ).

La souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (ΙμΜ - pas de gène DHFR*) mais elle se multiplie et lyse le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50μΜ - possible qu’en cas d’absence du gène TK).

La souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (ΙμΜ - grâce à la présence du gène DHFR*) alors qu’elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50μΜ - à cause de la présence du gène TK). Ce profil de résistance (sensible au ganciclovir et résistance à la pyriméthamine) permet de confirmer l’intégration du plasmide pUC18 4G2 ICrel - M2e SEQ ID NO : 244 dans la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e.

L’ensemble des résultats permet de valider la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e.

2. Construction de la souche Toxo tgmic/-3 KO - 2GM2e Icrel

L’électroporation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e avec le plasmide pTsaglIcrel αβγ circulaire SEQ ID NO : 178 a été réalisée selon le protocole décrit (point e).

Les clones obtenus résistants au ganciclovir sont sélectionnés et analysés par PCR et

Immunofluorescence pour valider la présence du gène d’interet M2e et l’expression de la protéine M2e et pour valider la suppression de la cassette de résistance DHFR*TYTK.

Validation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e Icrelpar PCR

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO :245 et oz M2e R SEQ ID NO : 246 (Mix M2e) permettent de mettre en évidence une bande à 588 paires de bases pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e Icrel, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène M2e dans cette souche (figure 20). Cette bande n’est pas détectée dans la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO :245 et oz M2eGPI R SEQ ID NO : 247 (Mix M2eGPI ou M2e) permettent de mettre en évidence une bande à 593 paires de bases pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e Icrel, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène M2e dans cette souche(figure 20). Cette bande n’est pas détectée dans la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO : 250 (Mix Gène d’intérêt) permettent de mettre en évidence une bande à 1641 paires de bases pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e Icrel, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène M2e dans cette souche (figure 20).Cette bande n’est pas détectée dans la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces Dhfir int Bgl II F SEQ ID NO :251 et qPCR TK R SEQ ID NO : 252 (Mix DHFR*TYTK) ne mettent pas en évidence de bande à 945 paires de bases pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e Icrel, conformément à ce qui est attendu et confirmant la suppression de la cassette DHFR*TYTK dans cette souche, (figure 20). Cette bande n’est pas non plus détectée dans la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO :245 et MCI SEQ ID NO : 254 (Mix Icrel M2eGPI ou M2e) permettent de mettre en évidence une bande à 1114 paires de bases pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e Icrel, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène M2e et la suppression de la cassette DHFR*TYTK dans cette souche (figure 20). Cette bande n’est pas détectée dans la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

La souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e Icrel est validée par PCR.

Validation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e Icrelpar immunofluorescence Les résultats montrent qu’avec l’anticorps anti M2e aucune fluorescence n’est détectable pour le parasite Toxo tgmicl-3 KO - 2G, alors qu’une fluorescence est détectée dans les parasites et dans les vacuoles parasitophores de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e Icrel obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine M2e. (figure 19)

La souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e Icrel est validée par immunofluorescence.

Validation de la souche ayant perdu la cassette de sélection DHFR*-TY-TK par analyse du profil de résistance

Les tachyzoïtes (de 1.10⁵ à 5.10⁵) sont cultivés 5 jours sur une monocouche de cellules HFF (fibroblastes humains HFF Hs27 ATCC CRL-1634) en présence de pyriméthamine (ΙμΜ) ou de ganciclovir (50μΜ).

Alors que la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (ΙμΜ - grâce à la présence du gène DHFR*) et qu’elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50μΜ - à cause de la présence du gène TK), la souche Toxo tgmicl3 KO - 2G M2e Icrel n’est plus capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (ΙμΜ - grâce à la perte du gène DHFR*) alors qu’elle est redevenue capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50μΜ - grâce à la perte du gène TK). Ce profil de résistance (résistance au ganciclovir et sensible à la pyriméthamine) permet de confirmer la suppression de la cassette DHFR*TYTK suite à l’action de la méganucléase I-Crel.

L’ensemble des résultats permet de valider la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e Icrel.

B. Construction de la souche Toxo tgmic/-3 KO - 2GM2eGPIIcrel

1. Construction de la souche Toxo tgmic/-3 KO - 2GM2eGPI

L’électroporation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G avec le plasmide pUC18 4G2 ICrel M2eGPI SEQ ID NO : 205 a été réalisée selon le protocole décrit (point a). Les clones obtenus résistants à la pyriméthamine sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence du gène d’intérêt M2eGPI et l’expression de la protéine.

Validation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPIpar PCR

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO : 245 et oz M2eGPI R SEQ ID NO : 247 (Mix M2eGPI ou M2e) permettent de mettre en évidence une bande à 593 paires de bases pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène M2eGPI dans cette souche, (figure 21).Cette bande n’est pas détectée dans la souche Toxo tgmicl-3 KO 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO :245 et oz M2e R SEQ ID NO : 246 (Mix M2e) ne permettent pas de mettre en évidence une bande à 588 paires de bases pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI, conformément à ce qui est attendu. En effet, cette PCR permet de différencier l’insertion du plasmide pUC18 4G2 ICrel - M2eGPI (PCR négative) de l’insertion du plasmide pUC18 4G2 ICrel - M2e (PCR positive à 588pb). Cette bande n’est pas détectée dans la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO : 250 (Mix Gène d’intérêt) permettent de mettre en évidence une bande à 1719 paires de bases pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène M2eGVl dans cette souche (figure 21).Cette bande n’est pas détectée dans la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces Dhfir int Bgl II F SEQ ID NO :251 et qPCR TK R SEQ ID NO : 252 (Mix DHFR*TYTK) permettent de mettre en évidence une bande à 945 paires de bases pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène DHFR*TYTK dans cette souche (figure 21).Cette bande n’est pas détectée dans la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

La souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI est validée par PCR.

Validation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPIpar immunofluorescence

Les résultats montrent qu’avec l’anticorps anti M2e aucune fluorescence n’est détectable pour le parasite Toxo tgmicl-3 KO - 2G, alors qu’une fluorescence est détectée sur la membrane des parasites de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine M2eGPI. (figure 22)

La souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI est validée par immunofluorescence.

La souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (ΙμΜ - grâce à la présence du gène DHFR*) alors qu’elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50μΜ - à cause de la présence du gène TK). Ce profil de résistance (sensible au ganciclovir et résistance à la pyriméthamine) permet de confirmer l’intégration du plasmide pUC18 4G2 ICrel - M2eGPI SEQ ID NO : 205 dans la souche Toxo tgmicl-3 KO 2G M2eGPI.

L’ensemble des résultats permet de valider la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI.

2. Construction de la souche Toxo tgmic/-3 KO - 2GM2eGPIIcrel

L’électroporation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI avec le plasmide pTsaglIcrel αβγ circulaire SEQ ID NO : 178 a été réalisée selon le protocole décrit (point e). Les clones obtenus résistants au ganciclovir sont sélectionnés et analysés par PCR et

Immunofluorescence pour valider la présence du gène d’intérêt M2eGPI et l’expression de la protéine M2eGPI et pour valider la suppression de la cassette de résistance DHFR*TYTK.

Validation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI Icrelpar PCR

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO :245 et oz M2eGPI R SEQ ID NO : 247 (Mix M2eGPI ou M2e) permettent de mettre en évidence une bande à 593 paires de bases pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène M2eGPI dans cette souche (figure 23). Cette bande n’est pas détectée dans la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO :245 et oz M2e R SEQ ID NO : 246 (Mix M2e) ne permettent pas de mettre en évidence une bande à 588 paires de bases pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI, conformément à ce qui est attendu (figure 23). En effet, cette PCR permet de différencier l’insertion du plasmide pUC18 4G2 ICrel - M2eGPI (PCR négative) de l’insertion du plasmide pUC18 4G2 ICrel M2e (PCR positive à 588pb). Cette bande n’est pas détectée dans la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO : 250 (Mix Gène d’intérêt) permettent de mettre en évidence une bande à 1719 paires de bases pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène M2eGVl dans cette souche (figure 23). Cette bande n’est pas détectée dans la souche Toxo tgmicl-3 KO 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces Dhfr int Bgl II F SEQ ID NO :251 et qPCR TK R SEQ ID NO : 252 (Mix DHFR*TYTK) ne mettent pas en évidence de bande à 945 paires de bases pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI Icrel, conformément à ce qui est attendu et confirmant la suppression de la cassette DHFR*TYTK dans cette souche (figure 23). Cette bande n’est pas non plus détectée dans la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO :245 et MCI SEQ ID NO : 254 (Mix Icrel M2eGPI ou M2e) permettent de mettre en évidence une bande à 1192 paires de bases pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI Icrel, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène M2eGVl et la suppression de la cassette DHFR*TYTK dans cette souche (figure 23). Cette bande n’est pas détectée dans la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

La souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI Icrel est validée par PCR.

Validation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI Icrel par immunofluorescence

Les résultats montrent qu’avec l’anticorps anti M2e aucune fluorescence n’est détectable pour le parasite Toxo tgmicl-3 KO - 2G, alors qu’une fluorescence est détectée pour les parasites Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI Icrel obtenue. La localisation de la protéine semble membranaire (dû à l’ancrage GPI) alors que pour la version M2e, la localisation semble dans la vacuole parasitophore et dans le parasite. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine M2eGPI. (figure 22)

La souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI Icrel est validée par immunofluorescence.

Alors que la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (ΙμΜ - grâce à la présence du gène DHFR*) et qu’elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50μΜ - à cause de la présence du gène TK, la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI Icrel n’est plus capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (ΙμΜ - grâce à la perte du gène DHFR*) alors qu’elle est redevenue capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50μΜ - grâce à la perte du gène TK). Ce profil de résistance (résistance au ganciclovir et sensible à la pyriméthamine) permet de confirmer la suppression de la cassette DHFR*TYTK suite à l’action de la méganucléase I-Crel.

L’ensemble des résultats permet de valider la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI Icrel.

C. Construction de la souche Toxo tgmic/-3 KO - 2G HA Icrel

1. Construction de la souche Toxo tgmic/-3 KO - 2G HA

L’électroporation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G avec le plasmide pUC18 4G2 ICrel HA SEQ ID NO : 232 a été réalisée selon le protocole décrit (point a). Les clones obtenus résistants à la pyriméthamine sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence du gène d’intérêt HA et l’expression de la protéine.

Validation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G HA par PCR

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces oz tete HA F SEQ ID NO :239 et Seq HA R I SEQ ID NO : 248 (Mix HA) permettent de mettre en évidence une bande à 506 paires de bases pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G HA, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène HA dans cette souche (figure 24). Cette bande n’est pas détectée dans la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO : 250 (Mix Gène d’intérêt) permettent de mettre en évidence une bande à 1875 paires de bases pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G HA, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène HA dans cette souche (figure 24). Cette bande n’est pas détectée dans la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces Dhfir int Bgl II F SEQ ID NO :25I et qPCR TK R SEQ ID NO : 252 (Mix DHFR*TYTK) permettent de mettre en évidence une bande à 945 paires de bases pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G HA, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène DHFR*TYTK dans cette souche (figure 24). Cette bande n’est pas détectée dans la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

La souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G HA est validée par PCR.

Validation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G HA par immunofluorescence

Les résultats montrent qu’avec l’anticorps anti HA aucune fluorescence n’est détectable pour le parasite Toxo tgmicl-3 KO - 2G, alors qu’une fluorescence est détectée sur la membrane des parasites de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G HA obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine HA. (figure 25)

La souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G HA est validée par immunofluorescence.

Validation de la souche ayant intégré le plasmide par analyse du pro fil de résistance Les tachyzoïtes (de 1.10⁵ à 5.10⁵) sont cultivés 5 jours sur une monocouche de cellules HFF (fibroblastes humains HFF Hs27 ATCC CRL-1634) en présence de pyriméthamine (ΙμΜ) ou de ganciclovir (50μΜ).

La souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G HA est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (ΙμΜ - grâce à la présence du gène DHFR*) alors qu’elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50μΜ - à cause de la présence du gène TK). Ce profil de résistance (sensible au ganciclovir et résistance à la pyriméthamine) permet de confirmer l’intégration du plasmide pUC18 4G2 ICrel - HA SEQ ID NO : 232 dans la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G HA.

L’ensemble des résultats permet de valider la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G HA.

2. Construction de la souche Toxo tgmic/-3 KO - 2G HA Icrel

L’électroporation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G HA avec le plasmide pTsaglIcrel αβγ circulaire SEQ ID NO : 178 a été réalisée selon le protocole décrit (point e). Les clones obtenus résistants au ganciclovir sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence du gène d’intérêt HA et l’expression de la protéine HA et pour valider la suppression de la cassette de résistance DHFR*TYTK.

Validation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G HA Icrelpar PCR

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces oz tete HA F SEQ ID NO :239 et Seq HA R I SEQ ID NO : 248 (Mix HA) permettent de mettre en évidence une bande à 506 paires de bases pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G HA, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène HA dans cette souche (figure 26). Cette bande n’est pas détectée dans la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO : 250 (Mix Gène d’intérêt) permettent de mettre en évidence une bande à 1875 paires de bases pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G HA,

100 conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène HA dans cette souche (figure 26). Cette bande n’est pas détectée dans la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces Dhfr int Bgl II F SEQ ID NO :251 et qPCR TK R SEQ ID NO : 252 (Mix DHFR*TYTK) ne mettent pas en évidence de bande à 945 paires de bases pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G HA Icrel, conformément à ce qui est attendu et confirmant la suppression de la cassette DHFR*TYTK dans cette souche (figure 26). Cette bande n’est pas non plus détectée dans la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces oz tete HAF SEQ ID NO :239 et MCI SEQ ID NO : 254 (Mix Icrel HA) permettent de mettre en évidence une bande à 1348 paires de bases pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G HA Icrel, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène HA et la suppression de la cassette DHFR*TYTK dans cette souche. Cette bande n’est pas détectée dans la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

La souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G HA Icrel est validée par PCR.

Validation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G HA Icrelpar immunofluorescence

Les résultats montrent qu’avec l’anticorps anti HA aucune fluorescence n’est détectable pour le parasite Toxo tgmicl-3 KO - 2G, alors qu’une fluorescence est détectée pour les parasites Toxo tgmicl-3 KO - 2G HA Icrel obtenue. La localisation de la protéine semble bien membranaire (dû à l’ancrage GPI). Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine HA. (figure 25)

La souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G HA Icrel est validée par immunofluorescence.

La souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (ΙμΜ - pas de gène DHFR*) mais elle se

101 multiplie et lyse le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50μΜ - possible qu’en cas d’absence du gène TK).

Alors que la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G HA est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (ΙμΜ - grâce à la présence du gène DHFR*) et qu’elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50μΜ - à cause de la présence du gène TK, la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G HA Icrel n’est plus capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (ΙμΜ - grâce à la perte du gène DHFR*) alors qu’elle est redevenue capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50μΜ - grâce à la perte du gène TK). Ce profil de résistance (résistance au ganciclovir et sensible à la pyriméthamine) permet de confirmer la suppression de la cassette DHFR*TYTK suite à l’action de la méganucléase I-Crel.

L’ensemble des résultats permet de valider la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G HA Icrel.

Résultats - Construction des souches exprimant plusieurs antigènes du virus Influenza et comportant ou non ungène de sélection

A. Construction de la souche Toxo tgmic/-3 KO - 2GM2eGPIHA Icrel

1. Construction de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA

L’électroporation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI Icrel avec le plasmide pUC18 4G2 ICrel - HA SEQ ID NO : 232 a été réalisée selon le protocole décrit (point a). Les clones obtenus résistants à la pyriméthamine sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence du gène d’intérêt HA et l’expression de la protéine.

Validation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA par PCR

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO :245 et oz M2eGPI R SEQ ID NO : 247 (Mix M2eGPI ou M2e) permettent de mettre en évidence une bande à 593 paires de bases pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène M2eGPI dans cette souche (figure 27). Cette bande est détectée dans la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI Icrel confirmant la présence de ce gène dans la souche de départ.

102

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO :245 et oz M2e R SEQ ID NO : 246 (Mix M2e) ne permettent pas de mettre en évidence une bande à 588 paires de bases pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA, conformément à ce qui est attendu. En effet, cette PCR permet de différencier l’insertion du plasmide pUC18 4G2 ICrel - M2eGPI (PCR négative) de l’insertion du plasmide pUC18 4G2 ICrel - M2e (PCR positive à 588pb). Cette bande n’est pas détectée dans la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI Icrel confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces oz tete HA F SEQ ID NO :239 et Seq HA R I SEQ ID NO : 248 (Mix HA) permettent de mettre en évidence une bande à 506 paires de bases pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène HA dans cette souche (figure 27).. Cette bande n’est pas détectée dans la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI ICrel confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO : 250 (Mix Gène d’intérêt) permettent de mettre en évidence respectivement une bande à 1875 paires de bases conformément à la taille de bande attendue pour HA et une bande à 1719 paires de bases conformément à la taille de bande attendue pour M2e GPI pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA, confirmant la présence des gènes HA et M2eGPI dans cette souche (figure 27). Ces bandes ne sont pas détectées dans la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ et la souche électroporée Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI Icrel ne présente que la bande à 1719 paires de bases conformément à la taille de bande attendue pour M2e GPI.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces Dhfir int Bgl II F SEQ ID NO :251 et qPCR TK R SEQ ID NO : 252 (Mix DHFR*TYTK) permettent de mettre en évidence une bande à 945 paires de bases pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène DHFR*TYTK dans cette souche (figure 27). Cette bande n’est pas détectée dans la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI Icrel confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

La souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA est validée par PCR.

103

Validation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA par immunofluorescence Les résultats montrent qu’avec l’anticorps anti HA aucune fluorescence n’est détectable pour le parasite Toxo tgmicl-3 KO - 2G, alors qu’une fluorescence est détectée sur la membrane des parasites de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine HA. (figure 28)

Les résultats montrent qu’avec l’anticorps anti M2e aucune fluorescence n’est détectable pour le parasite Toxo tgmicl-3 KO - 2G, alors qu’une fluorescence est détectée pour les parasites Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI Icrel et la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA obtenue. La localisation de la protéine semble membranaire (dû à l’ancrage GPI) alors que pour la version M2e, la localisation semble dans la vacuole parasitophore et dans le parasite. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine M2eGPI. (figure 28)

La souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA est validée par immunofluorescence.

Validation de la souche ayant intégré le plasmide par analyse du profil de résistance Les tachyzoïtes (de 1.10⁵ à 5.10⁵) sont cultivés 5 jours sur une monocouche de cellules HFF (fibroblastes humains HFF Hs27 ATCC CRL-1634) en présence de pyriméthamine (ΙμΜ) ou de ganciclovir (50μΜ).

La souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI Icrel est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (ΙμΜ - pas de gène DHFR*) mais elle se multiplie et lyse le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50μΜ - possible qu’en cas d’absence du gène TK).

La souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (ΙμΜ - grâce à la présence du gène DHFR*) alors qu’elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50μΜ - à cause de la présence du gène TK). Ce profil de résistance (sensible au ganciclovir et résistance à la pyriméthamine) permet de confirmer l’intégration du plasmide pUC18 4G2 ICrel - HA SEQ ID NO : 232 dans la souche Toxo tgmicl-3 KO 2G M2eGPI HA.

L’ensemble des résultats permet de valider la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA.

2. Construction de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI HAIcrel

L’électroporation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA avec le plasmide pTsaglIcrel αβγ circulaire SEQ ID NO : 178 a été réalisée selon le protocole décrit (point e).

104

Les clones obtenus résistants au ganciclovir sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence des gènes d’intérêt M2eGPI et HA et l’expression des protéines M2eGPI et HA et pour valider la suppression de la cassette de résistance DHFR*TYTK.

Validation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA Icrelpar PCR

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO :245 et oz M2eGPI R SEQ ID NO : 247 (Mix M2eGPI ou M2e) permettent de mettre en évidence une bande à 593 paires de bases pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA Icrel, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène M2eGPI dans cette souche (figure 29). Cette bande est détectée dans la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI Icrel confirmant la présence de ce gène dans la souche de départ.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO :245 et oz M2e R SEQ ID NO : 246 (Mix M2e) ne permettent pas de mettre en évidence une bande à 588 paires de bases pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA Icrel, conformément à ce qui est attendu. En effet, cette PCR permet de différencier l’insertion du plasmide pUC18 4G2 ICrel - M2eGPI (PCR négative) de l’insertion du plasmide pUC18 4G2 ICrel - M2e (PCR positive à 588pb). Cette bande n’est pas détectée dans la souche Toxo tgmicl-3 KO 2G M2eGPI Icrel confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces oz tete HA F SEQ ID NO :239 et Seq HA R I SEQ ID NO : 248 (Mix HA) permettent de mettre en évidence une bande à 506 paires de bases pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA Icrel, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène HA dans cette souche (figure 29). Cette bande n’est pas détectée dans la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI ICrel confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO : 250 (Mix Gène d’intérêt) permettent de mettre en évidence respectivement une bande à 1875 paires de bases conformément à la taille de bande attendue pour HA et une bande à 1719 paires de bases conformément à la taille de bande attendue pour M2e GPI pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA Icrel, confirmant la présence des gènes HA et M2eGPI dans cette souche (figure 29). Ces bandes ne sont pas détectées dans la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ et la souche électroporée Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA

105 présente les deux bandes (à 1719 et 1875 paires de bases) conformément à la taille de bande attendue pour M2e GPI et HA.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces Dhfr int Bgl II F SEQ ID NO :251 et qPCR TK R SEQ ID NO : 252 (Mix DHFR*TYTK) ne mettent pas en évidence de bande à 945 paires de bases pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA Icrel, conformément à ce qui est attendu et confirmant la suppression de la cassette DHFR*TYTK dans cette souche (figure 29). Cette bande n’est pas non plus détectée dans la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI Icrel confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO :245 et MCI SEQ ID NO : 254 (Mix Icrel M2eGPI ou M2e) permettent de mettre en évidence une bande à 1192 paires de bases pour les souches Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI Icrel, et Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA Icrel conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène A72eGPI et la suppression de la cassette DHFR*TYTK dans ces souches (figure 29). Cette bande n’est pas détectée dans la souche Toxo tgmicl-3 KO 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces oz tete ELAF SEQ ID NO :239 et MCI SEQ ID NO : 254 (Mix Icrel HA) permettent de mettre en évidence une bande à 1348 paires de bases pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA Icrel, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène HA et la suppression de la cassette DHFR*TYTK dans cette souche (figure 29). Cette bande n’est pas détectée dans la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI Icrel confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

La souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA Icrel est validée par PCR.

Validation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA Icrel par immunofluorescence

Les résultats montrent qu’avec l’anticorps anti HA aucune fluorescence n’est détectable pour le parasite Toxo tgmicl-3 KO - 2G, alors qu’une fluorescence est détectée sur la membrane des parasites de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA et de la souche obtenue Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA Icrel. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine HA. (figure 30)

Les résultats montrent qu’avec l’anticorps anti M2e aucune fluorescence n’est détectable pour le parasite Toxo tgmicl-3 KO - 2G, alors qu’une fluorescence est détectée pour les parasites Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA et la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA Icrel

106 obtenue. La localisation de la protéine semble membranaire (dû à l’ancrage GPI) alors que pour la version M2e, la localisation semble dans la vacuole parasitophore et dans le parasite. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine M2eGPI. (figure 30)

La souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA Icrel est validée par immunofluorescence.

Alors que la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (ΙμΜ - grâce à la présence du gène DHFR*) et qu’elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50μΜ - à cause de la présence du gène TK, la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA Icrel n’est plus capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (ΙμΜ - grâce à la perte du gène DHFR*) alors qu’elle est redevenue capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50μΜ - grâce à la perte du gène TK). Ce profil de résistance (résistance au ganciclovir et sensible à la pyriméthamine) permet de confirmer la suppression de la cassette DHFR*TYTK suite à l’action de la méganucléase I-Crel.

L’ensemble des résultats permet de valider la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA Icrel.

B. Construction de la souche Toxo tgmic/-3 KO - 2GM2e HA Icrel

1. Construction de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e HA

L’électroporation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e Icrel avec le plasmide pUC18 4G2 ICrel - HA SEQ ID NO : 232 a été réalisée selon le protocole décrit (point a). Les clones

107 obtenus résistants à la pyriméthamine sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence du gène d’intérêt HA et l’expression de la protéine.

Validation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e HA par PCR

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO :245 et oz M2eGPI R SEQ ID NO : 247 (Mix M2eGPI ou M2e) permettent de mettre en évidence une bande à 593 paires de bases pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e HA, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène M2e dans cette souche (figure 31). Cette bande est détectée dans la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e Icrel confirmant la présence de ce gène dans la souche de départ.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO :245 et oz M2e R SEQ ID NO : 246 (Mix M2e) permettent de mettre en évidence une bande à 588 paires de bases pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e HA, conformément à ce qui est attendu. En effet, cette PCR permet de différencier l’insertion du plasmide pUC18 4G2 ICrel - M2eGPI (PCR négative) de l’insertion du plasmide pUC18 4G2 ICrel - M2e (PCR positive à 588pb) (figure 31). Cette bande est détectée dans la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e Icrel confirmant la présence de ce gène dans la souche de départ.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces oz tete HA F SEQ ID NO :239 et Seq HA R I SEQ ID NO : 248 (Mix HA) permettent de mettre en évidence une bande à 506 paires de bases pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e HA, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène HA dans cette souche (figure 31). Cette bande n’est pas détectée dans la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e ICrel confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO : 250 (Mix Gène d’intérêt) permettent de mettre en évidence respectivement une bande à 1875 paires de bases conformément à la taille de bande attendue pour HA et une bande à 1641 paires de bases conformément à la taille de bande attendue pour M2e pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e HA, confirmant la présence des gènes HA et M2e dans cette souche (figure 31). Ces bandes ne sont pas détectées dans la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ et la souche électroporée Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e Icrel ne présente que la bande à 1641 paires de bases conformément à la taille de bande attendue pour M2e.

108

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces Dhfr int Bgl II F SEQ ID NO :25I et qPCR TK R SEQ ID NO : 252 (Mix DHFR*TYTK) permettent de mettre en évidence une bande à 945 paires de bases pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e HA, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène DHFR*TYTK dans cette souche (figure 31). Cette bande n’est pas détectée dans la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e Icrel confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

La souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e HA est validée par PCR.

Validation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e HA par immunofluorescence

Les résultats montrent qu’avec l’anticorps anti HA aucune fluorescence n’est détectable pour le parasite Toxo tgmicl-3 KO - 2G, alors qu’une fluorescence est détectée sur la membrane des parasites de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e HA obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine HA. (figure 32)

Les résultats montrent qu’avec l’anticorps anti M2e aucune fluorescence n’est détectable pour le parasite Toxo tgmicl-3 KO - 2G, alors qu’une fluorescence est détectée pour les parasites Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e Icrel et la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e HA obtenue. La localisation de la fluorescence semble être dans la vacuole parasitophore et dans le parasite (alors que pour la version M2eGPI, la localisation de la protéine semble membranaire). Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine M2e. (figure 32)

La souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e HA est validée par immunofluorescence.

La souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e Icrel est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (ΙμΜ - pas de gène DHFR*) mais elle se multiplie et lyse le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50μΜ - possible qu’en cas d’absence du gène TK).

La souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e HA est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (ΙμΜ - grâce à la présence du gène DHFR*) alors qu’elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50μΜ - à cause de la présence du gène TK). Ce profil de résistance (sensible au ganciclovir et résistance à la pyriméthamine) permet de confirmer l’intégration du

109 plasmide pUC18 4G2 ICrel - HA SEQ ID NO : 232 dans la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e HA.

L’ensemble des résultats permet de valider la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e HA.

2. Construction de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e HAIcrel

L’électroporation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e HA avec le plasmide pTsaglIcrel αβγ circulaire SEQ ID NO : 178 a été réalisée selon le protocole décrit (point e). Les clones obtenus résistants au ganciclovir sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence des gènes d’intérêt M2e et HA et l’expression des protéines M2e et HA et pour valider la suppression de la cassette de résistance DHFR*TYTK.

Validation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e HA Icrelpar PCR

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO :245 et oz M2eGPI R SEQ ID NO : 247 (Mix M2eGPI ou M2e) permettent de mettre en évidence une bande à 593 paires de bases pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e HA Icrel, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène M2e dans cette souche. Cette bande est détectée dans la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e HA confirmant la présence de ce gène dans la souche de départ.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO :245 et oz M2e R SEQ ID NO : 246 (Mix M2e) permettent de mettre en évidence une bande à 588 paires de bases pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eHA Icrel, conformément à ce qui est attendu. En effet, cette PCR permet de différencier l’insertion du plasmide pUC18 4G2 ICrel - M2eGPI (PCR négative) de l’insertion du plasmide pUC18 4G2 ICrel - M2e (PCR positive à 588pb). Cette bande n’est pas détectée dans la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e ICrel confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces oz tete HA F SEQ ID NO :239 et Seq HA R I SEQ ID NO : 248 (Mix HA) permettent de mettre en évidence une bande à 506 paires de bases pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e HA Icrel, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène HA dans cette souche. Cette bande n’est pas détectée dans la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e ICrel confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO : 250 (Mix Gène d’intérêt) permettent de mettre en

110 évidence respectivement une bande à 1875 paires de bases conformément à la taille de bande attendue pour HA et une bande à 1641 paires de bases conformément à la taille de bande attendue pour M2e pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e HA Icrel, confirmant la présence des gènes HA et M2e dans cette souche. Ces bandes ne sont pas détectées dans la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ et la souche électroporée Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e HA présente les deux bandes (à 1641 et 1875 paires de bases) conformément à la taille de bande attendue pour M2e et HA.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces Dhfr int Bgl II F SEQ ID NO :251 et qPCR TK R SEQ ID NO : 252 (Mix DHFR*TYTK) ne mettent pas en évidence de bande à 945 paires de bases pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e HA Icrel, conformément à ce qui est attendu et confirmant la suppression de la cassette DHFR*TYTK dans cette souche. Cette bande n’est pas non plus détectée dans la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e Icrel confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO :245 et MCI SEQ ID NO : 254 (Mix Icrel M2eGPI ou M2e) permettent de mettre en évidence une bande à 1114 paires de bases pour les souches Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e Icrel, et Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e HA Icrel conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène M2e et la suppression de la cassette DHFR*TYTK dans ces souches. Cette bande n’est pas détectée dans la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces oz tete ELAF SEQ ID NO :239 et MCI SEQ ID NO : 254 (Mix Icrel HA) permettent de mettre en évidence une bande à 1348 paires de bases pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e HA Icrel, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène HA et la suppression de la cassette DHFR*TYTK dans cette souche. Cette bande n’est pas détectée dans la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e Icrel confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

La souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e HA Icrel est validée par PCR.

Validation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e HA Icrel par immunofluorescence

Les résultats montrent qu’avec l’anticorps anti HA aucune fluorescence n’est détectable pour le parasite Toxo tgmicl-3 KO - 2G et la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e Icrel , alors qu’une fluorescence est détectée sur la membrane des parasites de la souche Toxo tgmicl-3

111

KO - 2G M2e HA Icrel obtenue et la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e HA. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine HA.

Les résultats montrent qu’avec l’anticorps anti M2e aucune fluorescence n’est détectable pour le parasite Toxo tgmicl-3 KO - 2G, alors qu’une fluorescence est détectée pour les parasites Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e HA et la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e HA obtenue. La localisation de la fluorescence semble être dans la vacuole parasitophore et dans le parasite (alors que pour la version M2eGPI, la localisation de la protéine semble membranaire). Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine M2e.

La souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e HA Icrel est validée par immunofluorescence.

Alors que la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e HA est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (ΙμΜ - grâce à la présence du gène DHFR*) et qu’elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50μΜ - à cause de la présence du gène TK), la souche Toxo tgmicl3 KO - 2G M2e HA Icrel n’est plus capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (ΙμΜ - grâce à la perte du gène DHFR*) alors qu’elle est redevenue capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50μΜ - grâce à la perte du gène TK). Ce profil de résistance (résistance au ganciclovir et sensible à la pyriméthamine) permet de confirmer la suppression de la cassette DHFR*TYTK suite à l’action de la méganucléase I-Crel.

L’ensemble des résultats permet de valider la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e HA Icrel.

112

Exemple 8 : Construction d’une souche Neo ncmicl-3 K0-2G exprimant un ou plusieurs antigènes du virus Influenza et ne comportant pas de gène de sélection

Souches de Neospora caninum

La souche utilisée dans le présent exemple est une souche atténuée de Neospora caninum NCI dénommée Neo ncmic7-3 KO 2G. Elle a été obtenue par la délétion par recombinaison homologue de deux gènes de virulence : les gènes miel et mic3.

Les tachyzoïtes de la souche Neo ncmic7-3 KO 2G sont produits sur fibroblastes humains (HFF Hs27 ATCC CRL-1634)) cultivés en milieu minimal de Dulbecco (DMEM) supplémenté par 10% de sérum de veau fœtal (SVF), 2mM glutamine, lOOU/mL de pénicilline et lOOU/mL de streptomycine. Ils ont été récoltés après lyse mécanique des cellules hôtes et 3 passages en seringue 25G.

Construction des souches - protocole

a- Electroporation et sélection de la souche d’intérêt avec le plasmide exprimant un antigène du virus de la grippe : souches Neo ncmicl-3 KO - 2G Influenza

Les parasites Neo ncmicl-3 KO - 2G sont électroporés avec 20pg de plasmide pUC18 4G2 ICrel - Influenza linéarisé. Par «plasmide pUC18 4G2 ICrel - Influenza», on entend le plasmide pUC18 4G2 ICrel - M2e SEQ ID NO : 244, ou le plasmide pUC18 4G2 ICrel M2eGPI SEQ ID NO : 205 ou le plasmide pUC18 4G2 ICrel - HA SEQ ID NO : 232. Après électroporation, les tachyzoïtes sont soumis à une pression de sélection par l’agent de sélection (Pyriméthamine 4μΜ). 10 à 15 jours après sélection et passages successifs sur cellules HFF, les parasites sont sous-clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF puis amplifiés en plaques 24 puits sur une monocouche de cellules HFF.

b- Validation de la souche ayant intégré le plasmide par PCR

Pour valider une souche Neo ncmicl-3 KO - 2G Influenza, des analyses PCR sont effectuées selon le même protocole que celui utilisé dans l’exemple 7 - point b. Les tailles attendues sont également décrites dans le Tableau 23 ci-dessous.

113

Tableau 23 : Taille attendue des amplicons (en paires de base) des différentes PCR de validation de la construction des souches Neo ncmicl-3 KO - 2G Influenza

	Mix M2e	Mix M2eGPI ou M2e	Mix HA	Gène d’intérêt	DHFR* TYTK
Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e	588	593	-	1641	945
Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e GPI	-	593	-	1719	945
Neo ncmicl-3 KO - 2G HA	-	-	506	1875	945
Neo ncmic 1 -3 KO - 2G M2e HA	588	593	506	1641 / 1875	945
Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e GPI HA	-	593	506	1719/ 1875	945

c- Validation de la souche ayant intégré le plasmide par immunofluorescence

La validation des souches par immunofluorescence se fait suivant le protocole précédemment décrit (point c- exemple 7).

Le profil d’antibiorésistance est analysé pour les clones validés en PCR et immunofluorescence. Les tachyzoïtes (de 1.10⁵ à 5.10⁵) sont cultivés 5 jours sur une monocouche de cellules HFF. Les parasites Neo ncmicl-3 KO - 2G Influenza ayant intégré un plasmide pUC18 4G2 ICrel - Influenza linéarisé doivent être résistants à la pyriméthamine (4μΜ - grâce à la présence du gène DHFR*) et sensible au ganciclovir (50μΜ - à cause de la présence du gène TK). Ce profil de résistance est validé en cultivant les parasites sur fibroblastes humains (HFF Hs27 ATCC CRL-1634)) cultivés en milieu minimal de Dulbecco (DMEM) supplémenté par 10% de sérum de veau fœtal (SVF), 2mM glutamine, 100 U/mL de pénicilline et 100 U/mL de streptomycine, supplémenté ou non de la pyriméthamine ou du ganciclovir.

Les souches validées par PCR, immunofluorescence et ayant le bon profil d’antibiorésistance sont nommées Neo ncmicl-3 KO - 2G Influenza (Neo ncmicl-3 KO 2G M2e, Neo ncmicl-3 KO - 2G M2eGPI, Neo ncmicl-3 KO - 2G HA ,Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e HA ou Neo ncmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA).

e- Electroporation de la Neo ncmicl-3 KO - 2G Influenza avec un plasmide pTsaglIcrelaPy et contre sélection de la souche ayant perdu la cassette de sélection DHFR*-TY-TK : souches Neo ncmicl-3 KO - 2G Influenza Icrel

Le protocole est identique à celui décrit dans le point protocole - e de l’exemple 6.

114 f- Validation de la souche ayant perdu la cassette de sélection DHFR*-TY-TK par PCR Pour valider une souche Neo ncmicl-3 KO - 2G Influenza Icrel, des analyses PCR sont effectuées selon le même protocole que celui utilisé dans l’exemple 7 - point b et f. Les tailles attendues sont également décrites dans le Tableau xx ci-dessous. Plusieurs mix sont possibles et les PCR sont réalisées en fonction des souches testées.

Tableau 24 : Taille attendue des amplicons (en paires de base) des différentes PCR de validation de la construction des souches Neo ncmicl-3 KO - 2G Influenza.

	Mix M2e	Mix M2eGPI ou M2e	Mix HA	Gène d’intérêt	DHFR* TYTK	Mix Icrel M2e ou M2eGPI	Mix Icrel HA
Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e Icrel	588	593	-	1641	-	1114	-
Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e GPI Icrel	-	593	-	1719	-	1192	-
Neo ncmic 1 -3 KO - 2G HA Icrel	-	-	506	1875	-	-	1348
Neo ncmic 1 -3 KO - 2G M2e HA	588	593	506	1641/1875	945	1114	-
Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e HA Icrel	588	593	506	1641/1875	-	1114	1348
Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e GPI HA	-	593	506	1719/1875	945	1192	-
Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e GPI HA Icrel	-	593	506	1719/1875	-	1192	1348

Les parasites Neo ncmicl-3 KO - 2G Influenza ayant perdu la cassette de sélection DHFR*TY-TK SEQ ID NO: 134 doivent être sensibles à la pyriméthamine (4μΜ - grâce à la suppression du gène DHFR*) et résistants au ganciclovir (50μΜ - grâce à la suppression du gène TK). Ce profil de résistance est validé en cultivant les parasites sur fibroblastes humains (HFF Hs27 ATCC CRL-1634) en milieu minimal de Dulbecco (DMEM) supplémenté par 10% de sérum de veau fœtal (SVF), 2mM glutamine, 100 U/mL de pénicilline et 100 U/mL de streptomycine, supplémenté ou non de la pyriméthamine ou du ganciclovir.

Les souches validées par PCR, immunofluorescence et ayant le bon profil d’antibiorésistance sont nommées Neo ncmicl-3 KO - 2G Influenza Icrel (Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e Icrel, Neo ncmicl-3 KO - 2G M2eGPI Icrel, Neo ncmicl-3 KO - 2G HA

115

Icrel, Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e HA Icrel ou Neo ncmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA

Icrel).

D. Construction de la souche Neo ncmic/-3 KO - 2GM2e Icrel

1. Construction de la souche Neo ncmic/-3 KO - 2GM2e

L’électroporation de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G avec le plasmide pUC18 4G2 ICrel M2e SEQ ID NO : 244 a été réalisée selon le protocole décrit (point a). Les clones obtenus résistants à la pyriméthamine sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence du gène d’intérêt M2e et l’expression de la protéine.

Validation de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e par PCR

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO :245 et oz M2e R SEQ ID NO : 246 (Mix M2e) permettent de mettre en évidence une bande à 588 paires de bases pour la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène M2e dans cette souche (figure 18). Cette bande n’est pas détectée dans la souche Neo ncmic7-3 KO - 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO :245 et oz M2eGPI R SEQ ID NO : 247 (Mix M2eGPI ou M2e) permettent de mettre en évidence une bande à 593 paires de bases pour la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène M2e dans cette souche (figure 18). En effet, cette PCR permet de différencier l’insertion du plasmide pUC18 4G2 ICrel M2eGPI SEQ ID NO :205 (PCR négative) de l’insertion du plasmide pUC18 4G2 ICrel M2e SEQ ID NO :244 (PCR positive à 588pb). Cette bande n’est pas détectée dans la souche Neo ncmic7-3 KO - 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO : 250 (Mix Gène d’intérêt) permettent de mettre en évidence une bande à 1641 paires de bases pour la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène M2e dans cette

116 souche (figure 18). Cette bande n’est pas détectée dans la souche Neo ncmic7-3 KO - 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces Dhfr int Bgl II F SEQ ID NO :251 et qPCR TK R SEQ ID NO : 252 (Mix DHFR*TYTK) permettent de mettre en évidence une bande à 945 paires de bases pour la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène DHFR*TYTK dans cette souche (figure 18). Cette bande n’est pas détectée dans la souche Neo ncmic7-3 KO - 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ, (figure XX)

La souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e est validée par PCR.

Validation de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e par immunofluorescence

Les résultats montrent qu’avec l’anticorps anti M2e aucune fluorescence n’est détectable pour le parasite Neo ncmic7-3 KO - 2G, alors qu’une fluorescence est détectée dans les parasites et dans les vacuoles parasitophores de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine M2e. (figure 33)

La souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e est validée par immunofluorescence.

Validation de la souche ayant intégré le plasmide par analyse du profil de résistance Les tachyzoïtes (de 1.10⁵ à 5.10⁵) sont cultivés 5 jours sur une monocouche de cellules HFF (fibroblastes humains HFF Hs27 ATCC CRL-1634) en présence de pyriméthamine (4μΜ) ou de ganciclovir (50μΜ).

La souche Neo ncmicl-3 KO - 2G est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (4μΜ - pas de gène DHFR*) mais elle se multiplie et lyse le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50μΜ - possible qu’en cas d’absence du gène TK).

La souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (4μΜ - grâce à la présence du gène DHFR*) alors qu’elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50μΜ - à cause de la présence du gène TK). Ce profil de résistance (sensible au ganciclovir et résistance à la pyriméthamine) permet de confirmer l’intégration du plasmide pUC18 4G2 ICrel - M2e SEQ ID NO : 244 dans la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e.

L’ensemble des résultats permet de valider la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e.

117

2. Construction de la souche Neo ncmic/-3 KO - 2GM2e Icrel

L’électroporation de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e avec le plasmide pTsaglIcrel αβγ circulaire SEQ ID NO : 178 a été réalisée selon le protocole décrit (point e). Les clones obtenus résistants au ganciclovir sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence du gène d’intérêt M2e et l’expression de la protéine M2e et pour valider la suppression de la cassette de résistance DHFR*TYTK.

Validation de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e Icrelpar PCR

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO :245 et oz M2e R SEQ ID NO : 246 (Mix M2e) permettent de mettre en évidence une bande à 588 paires de bases pour la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e Icrel, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène M2e dans cette souche (figure 20). Cette bande n’est pas détectée dans la souche Neo ncmic7-3 KO - 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO :245 et oz M2eGPI R SEQ ID NO : 247 (Mix M2eGPI ou M2e) permettent de mettre en évidence une bande à 593 paires de bases pour la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e Icrel, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène M2e dans cette souche (figure 20). Cette bande n’est pas détectée dans la souche Neo ncmic7-3 KO - 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO : 250 (Mix Gène d’intérêt) permettent de mettre en évidence une bande à 1641 paires de bases pour la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e Icrel, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène M2e dans cette souche (figure 20). Cette bande n’est pas détectée dans la souche Neo ncmic7-3 KO - 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces Dhfir int Bgl II F SEQ ID NO :251 et qPCR TK R SEQ ID NO : 252 (Mix DHFR*TYTK) ne mettent pas en évidence de bande à 945 paires de bases pour la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e Icrel, conformément à ce qui est attendu et confirmant la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO : 134 dans cette souche (figure 20). Cette bande n’est pas non plus détectée dans la souche Neo ncmic7-3 KO - 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO :245 et MCI SEQ ID NO : 254 (Mix Icrel M2eGPI ou M2e) permettent de mettre en évidence une

118 bande à 1114 paires de bases pour la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e Icrel, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène M2e et la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO : 134 dans cette souche (figure 20). Cette bande n’est pas détectée dans la souche Neo ncmic7-3 KO - 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

La souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e Icrel est validée par PCR.

Validation de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e Icrelpar immunofluorescence

Les résultats montrent qu’avec l’anticorps anti M2e aucune fluorescence n’est détectable pour le parasite Neo ncmic7-3 KO - 2G, alors qu’une fluorescence est détectée dans les parasites et dans les vacuoles parasitophores de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e Icrel obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine M2e. (figure 33)

La souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e Icrel est validée par immunofluorescence.

Les tachyzoïtes (de 1.10⁵ à 5.10⁵) sont cultivés 5 jours sur une monocouche de cellules HFF (fibroblastes humains HFF Hs27 ATCC CRL-1634) en présence de pyriméthamine (4μΜ) ou de ganciclovir (50μΜ).

Alors que la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (4μΜ - grâce à la présence du gène DHFR*) et qu’elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50μΜ - à cause de la présence du gène TK), la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e Icrel n’est plus capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (4μΜ - grâce à la perte du gène DHFR*) alors qu’elle est redevenue capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50μΜ - grâce à la perte du gène TK). Ce profil de résistance (résistance au ganciclovir et sensible à la pyriméthamine) permet de confirmer la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO : 134 suite à l’action de la méganucléase I-Crel.

119

L’ensemble des résultats permet de valider la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e Icrel.

E. Construction de la souche Neo ncmic/-3 KO - 2GM2eGPIIcrel

1. Construction de la souche Neo ncmic/-3 KO - 2GM2eGPI

L’électroporation de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G avec le plasmide pUC18 4G2 ICrel M2eGPI SEQ ID NO : 205 a été réalisée selon le protocole décrit (point a). Les clones obtenus résistants à la pyriméthamine sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence du gène d’interet M2eGPI et l’expression de la protéine M2eGPI SEQ ID NO :206.

Validation de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2eGPIpar PCR

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO :245 et oz M2eGPI R SEQ ID NO : 247 (Mix M2eGPI ou M2e) permettent de mettre en évidence une bande à 593 paires de bases pour la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2eGPI, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène M2eGPI dans cette souche (figure 21). Cette bande n’est pas détectée dans la souche Neo ncmic7-3 KO 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO :245 et oz M2e R SEQ ID NO : 246 (Mix M2e) ne permettent pas de mettre en évidence une bande à 588 paires de bases pour la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2eGPI, conformément à ce qui est attendu . En effet, cette PCR permet de différencier l’insertion du plasmide pUC18 4G2 ICrel - M2eGPI SEQ ID NO :205 (PCR négative) de l’insertion du plasmide pUC18 4G2 ICrel - M2e SEQ ID NO :244 (PCR positive à 588pb). Cette bande n’est pas détectée dans la souche Neo ncmic7-3 KO - 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO : 250 (Mix Gène d’intérêt) permettent de mettre en évidence une bande à 1719 paires de bases pour la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2eGPI, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène M2eGPI dans cette souche (figure 21). Cette bande n’est pas détectée dans la souche Neo ncmic7-3 KO 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces Dhfir int Bgl II F SEQ ID NO :25I et qPCR TK R SEQ ID NO : 252 (Mix DHFR*TYTK) permettent de mettre en évidence une bande à 945 paires de bases pour la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2eGPI,

120 conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène DHFR*TYTK dans cette souche (figure 21). Cette bande n’est pas détectée dans la souche Neo ncmic7-3 KO - 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

La souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2eGPI est validée par PCR.

Validation de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2eGPIpar immunofluorescence

Les résultats montrent qu’avec l’anticorps anti M2e aucune fluorescence n’est détectable pour le parasite Neo ncmic7-3 KO - 2G, alors qu’une fluorescence est détectée sur la membrane des parasites de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2eGPI obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine M2eGPI SEQ ID NO :206. (figure 34)

La souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2eGPI est validée par immunofluorescence.

Validation de la souche ayant intégré le plasmide par analyse du profil de résistance Les tachyzoïtes (de 1.10^{2 * * 5} à 5.10⁵) sont cultivés 5 jours sur une monocouche de cellules HFF (fibroblastes humains HFF Hs27 ATCC CRL-1634) en présence de pyriméthamine (4μΜ) ou de ganciclovir (50μΜ).

La souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2eGPI est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (4μΜ - grâce à la présence du gène DHFR*) alors qu’elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50μΜ - à cause de la présence du gène TK). Ce profil de résistance (sensible au ganciclovir et résistance à la pyriméthamine) permet de confirmer l’intégration du plasmide pUC18 4G2 ICrel - M2eGPI SEQ ID NO : 205 dans la souche Neo ncmicl-3 KO 2G M2eGPI.

L’ensemble des résultats permet de valider la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2eGPI.

2. Construction de la souche Neo ncmic/-3 KO - 2GM2eGPIIcrel

L’électroporation de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2eGPI avec le plasmide pTsaglIcrel αβγ circulaire SEQ ID NO : 178 a été réalisée selon le protocole décrit (point e). Les clones obtenus résistants au ganciclovir sont sélectionnés et analysés par PCR et

Immunofluorescence pour valider la présence du gène d’intérêt A72eGPI et l’expression de la

121 protéine M2eGPI SEQ ID NO :206 et pour valider la suppression de la cassette de résistance DHFR*TYTK SEQ ID NO : 134.

Validation de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2eGPI Icrelpar PCR

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO :245 et oz M2eGPI R SEQ ID NO : 247 (Mix M2eGPI ou M2e) permettent de mettre en évidence une bande à 593 paires de bases pour la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2eGPI, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène M2eGPI dans cette souche. Cette bande n’est pas détectée dans la souche Neo ncmic7-3 KO - 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO :245 et oz M2e R SEQ ID NO : 246 (Mix M2e) ne permettent pas de mettre en évidence une bande à 588 paires de bases pour la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2eGPI, conformément à ce qui est attendu. En effet, cette PCR permet de différencier l’insertion du plasmide pUC18 4G2 ICrel - M2eGPI SEQ ID NO :205 (PCR négative) de l’insertion du plasmide pUC18 4G2 ICrel - M2e SEQ ID NO :244 (PCR positive à 588pb). Cette bande n’est pas détectée dans la souche Neo ncmic7-3 KO - 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO : 250 (Mix Gène d’intérêt) permettent de mettre en évidence une bande à 1719 paires de bases pour la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2eGPI, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène M2eGVl dans cette souche. Cette bande n’est pas détectée dans la souche Neo ncmic7-3 KO - 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces Dhfir int Bgl II F SEQ ID NO :251 et qPCR TK R SEQ ID NO : 252 (Mix DHFR*TYTK) ne mettent pas en évidence de bande à 945 paires de bases pour la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2eGPI Icrel, conformément à ce qui est attendu et confirmant la suppression de la cassette DHFR*TYTK dans cette souche. Cette bande n’est pas non plus détectée dans la souche Neo ncmic7-3 KO 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO :245 et MCI SEQ ID NO : 254 (Mix Icrel M2eGPI ou M2e) permettent de mettre en évidence une bande à 1192 paires de bases pour la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2eGPI Icrel, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène M2eGVl et la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO : 134 dans cette souche. Cette bande

122 n’est pas détectée dans la souche Neo ncmic7-3 KO - 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

La souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2eGPI Icrel est validée par PCR.

Validation de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2eGPI Icrel par immunofluorescence

Les résultats montrent qu’avec l’anticorps anti M2e aucune fluorescence n’est détectable pour le parasite Neo ncmic7-3 KO - 2G, alors qu’une fluorescence est détectée pour les parasites Neo ncmicl-3 KO - 2G M2eGPI Icrel obtenue. La localisation de la protéine semble membranaire (dû à l’ancrage GPI) alors que pour la version M2e, la localisation semble dans la vacuole parasitophore et dans le parasite. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine M2eGPI SEQ ID NO :206.

La souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2eGPI Icrel est validée par immunofluorescence.

Alors que la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2eGPI est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (4μΜ - grâce à la présence du gène DHFR*) et qu’elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50μΜ - à cause de la présence du gène TK, la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2eGPI Icrel n’est plus capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (4μΜ - grâce à la perte du gène DHFR*) alors qu’elle est redevenue capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50μΜ - grâce à la perte du gène TK). Ce profil de résistance (résistance au ganciclovir et sensible à la pyriméthamine) permet de confirmer la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO : 134 suite à l’action de la méganucléase I-Crel.

123

L’ensemble des résultats permet de valider la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2eGPI Icrel.

F. Construction de la souche Neo ncmic/-3 KO - 2G HA Icrel

3. Construction de la souche Neo ncmic/-3 KO - 2G HA

L’électroporation de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G avec le plasmide pUC18 4G2 ICrel HA SEQ ID NO : 232 a été réalisée selon le protocole décrit (point a). Les clones obtenus résistants à la pyriméthamine sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence du gène d’intérêt HA et l’expression de la protéine SEQ ID NO :255.

Validation de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G HA par PCR

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces oz tete HA F SEQ ID NO :239 et Seq HA R I SEQ ID NO : 248 (Mix HA) permettent de mettre en évidence une bande à 506 paires de bases pour la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G HA, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène HA dans cette souche (figure 24). Cette bande n’est pas détectée dans la souche Neo ncmic7-3 KO - 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO : 250 (Mix Gène d’intérêt) permettent de mettre en évidence une bande à 1875 paires de bases pour la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G HA, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène HA dans cette souche (figure 24). Cette bande n’est pas détectée dans la souche Neo ncmic7-3 KO - 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces Dhfr int Bgl II F SEQ ID NO :251 et qPCR TK R SEQ ID NO : 252 (Mix DHFR*TYTK) permettent de mettre en évidence une bande à 945 paires de bases pour la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G HA, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène DHFR*TYTK dans cette souche (figure 24). Cette bande n’est pas détectée dans la souche Neo ncmic7-3 KO - 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

La souche Neo ncmicl-3 KO - 2G HA est validée par PCR.

124

Validation de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G HA par immunofluorescence

Les résultats montrent qu’avec l’anticorps anti HA aucune fluorescence n’est détectable pour le parasite Neo ncmic7-3 KO - 2G, alors qu’une fluorescence est détectée sur la membrane des parasites de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G HA obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine HA SEQ ID NO :255. (figure 35)

La souche Neo ncmicl-3 KO - 2G HA est validée par immunofluorescence.

Validation de la souche ayant intégré le plasmide par analyse du profil de résistance Les tachyzoïtes (de 1.10^{4 5} à 5.10⁵) sont cultivés 5 jours sur une monocouche de cellules HFF (fibroblastes humains HFF Hs27 ATCC CRL-1634) en présence de pyriméthamine (4μΜ) ou de ganciclovir (50μΜ).

La souche Neo ncmicl-3 KO - 2G HA est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (4μΜ - grâce à la présence du gène DHFR*) alors qu’elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50μΜ - à cause de la présence du gène TK). Ce profil de résistance (sensible au ganciclovir et résistance à la pyriméthamine) permet de confirmer l’intégration du plasmide pUC18 4G2 ICrel - HA SEQ ID NO : 232 dans la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G HA.

L’ensemble des résultats permet de valider la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G HA.

4. Construction de la souche Neo ncmic/-3 KO - 2G HA Icrel

L’électroporation de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G HA avec le plasmide pTsaglIcrel αβγ circulaire SEQ ID NO : 178 a été réalisée selon le protocole décrit (point e). Les clones obtenus résistants au ganciclovir sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence du gène d’intérêt HA et l’expression de la protéine HA SEQ ID NO :255 et pour valider la suppression de la cassette de résistance DHFR*TYTK SEQ ID NO : 134.

125

Validation de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G HA Icrelpar PCR

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces oz tete HA F SEQ ID NO :239 et Seq HA R I SEQ ID NO : 248 (Mix HA) permettent de mettre en évidence une bande à 506 paires de bases pour la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G HA, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène HA dans cette souche. Cette bande n’est pas détectée dans la souche Neo ncmic7-3 KO - 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO : 250 (Mix Gène d’intérêt) permettent de mettre en évidence une bande à 1875 paires de bases pour la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G HA, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène HA dans cette souche. Cette bande n’est pas détectée dans la souche Neo ncmic7-3 KO - 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces Dhfr int Bgl II F SEQ ID NO :251 et qPCR TK R SEQ ID NO : 252 (Mix DHFR*TYTK) ne mettent pas en évidence de bande à 945 paires de bases pour la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G HA Icrel, conformément à ce qui est attendu et confirmant la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO : 134 dans cette souche. Cette bande n’est pas non plus détectée dans la souche Neo ncmic7-3 KO - 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces oz tete HAF SEQ ID NO :239 et MCI SEQ ID NO : 254 (Mix Icrel HA) permettent de mettre en évidence une bande à 1348 paires de bases pour la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G HA Icrel, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène HA et la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO : 134 dans cette souche. Cette bande n’est pas détectée dans la souche Neo ncmic7-3 KO - 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

La souche Neo ncmicl-3 KO - 2G HA Icrel est validée par PCR.

Validation de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G HA Icrelpar immunofluorescence

Les résultats montrent qu’avec l’anticorps anti HA aucune fluorescence n’est détectable pour le parasite Neo ncmic7-3 KO - 2G, alors qu’une fluorescence est détectée pour les parasites Neo ncmicl-3 KO - 2G HA Icrel obtenue. La localisation de la protéine semble bien membranaire (dû à l’ancrage GPI). Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine HA SEQ ID NO :255.

La souche Neo ncmicl-3 KO - 2G HA Icrel est validée par immunofluorescence.

126

Alors que la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G HA est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (4μΜ - grâce à la présence du gène DHFR*) et qu’elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50μΜ - à cause de la présence du gène TK, la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G HA Icrel n’est plus capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (4μΜ - grâce à la perte du gène DHFR*) alors qu’elle est redevenue capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50μΜ - grâce à la perte du gène TK). Ce profil de résistance (résistance au ganciclovir et sensible à la pyriméthamine) permet de confirmer la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO : 134 suite à l’action de la méganucléase I-Crel.

L’ensemble des résultats permet de valider la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G HA Icrel.

Résultats - Construction des souches exprimant plusieurs antigènes du virus Influenza et comportant ou non un de gène de sélection

C. Construction de la souche Neo ncmic/-3 KO - 2GM2eGPIHA Icrel

1. Construction de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA

L’électroporation de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2eGPI Icrel avec le plasmide pUC18 4G2 ICrel - HA SEQ ID NO : 232 a été réalisée selon le protocole décrit (point a). Les clones obtenus résistants à la pyriméthamine sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence du gène d’intérêt HA et l’expression de la protéine.

127

Validation de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA par PCR

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO :245 et oz M2eGPI R SEQ ID NO : 247 (Mix M2eGPI ou M2e) permettent de mettre en évidence une bande à 593 paires de bases pour la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène M2eGPI dans cette souche. Cette bande est détectée dans la souche Neo ncmic7-3 KO - 2G M2eGPI Icrel confirmant la présence de ce gène dans la souche de départ.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO :245 et oz M2e R SEQ ID NO : 246 (Mix M2e) ne permettent pas de mettre en évidence une bande à 588 paires de bases pour la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA, conformément à ce qui est attendu. En effet, cette PCR permet de différencier l’insertion du plasmide pUC18 4G2 ICrel - M2eGPI SEQ ID NO :205 (PCR négative) de l’insertion du plasmide pUC18 4G2 ICrel - M2e SEQ ID NO :244 (PCR positive à 588pb). Cette bande n’est pas détectée dans la souche Neo ncmic7-3 KO - 2G M2eGPI Icrel confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces oz tete HA F SEQ ID NO :239 et Seq HA R I SEQ ID NO : 248 (Mix HA) permettent de mettre en évidence une bande à 506 paires de bases pour la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène HA dans cette souche. Cette bande n’est pas détectée dans la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2eGPI ICrel confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO : 250 (Mix Gène d’intérêt) permettent de mettre en évidence respectivement une bande à 1875 paires de bases conformément à la taille de bande attendue pour HA et une bande à 1719 paires de bases conformément à la taille de bande attendue pour M2e GPI pour la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA, confirmant la présence des gènes HA et M2eGPI dans cette souche. Ces bandes ne sont pas détectées dans la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ et la souche électroporée Neo ncmicl-3 KO - 2G M2eGPI Icrel ne présente que la bande à 1719 paires de bases conformément à la taille de bande attendue pour M2e GPI.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces Dhfir int Bgl II F SEQ ID NO :251 et qPCR TK R SEQ ID NO : 252 (Mix DHFR*TYTK) permettent de mettre en évidence une bande à 945 paires de bases pour la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène

128

DHFR*TYTK dans cette souche. Cette bande n’est pas détectée dans la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2eGPI Icrel confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

La souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA est validée par PCR.

Validation de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA par immunofluorescence Les résultats montrent qu’avec l’anticorps anti HA aucune fluorescence n’est détectable pour le parasite Neo ncmic7-3 KO - 2G, alors qu’une fluorescence est détectée sur la membrane des parasites de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine HA SEQ ID NO :255.

Les résultats montrent qu’avec l’anticorps anti M2e aucune fluorescence n’est détectable pour le parasite Neo ncmic7-3 KO - 2G, alors qu’une fluorescence est détectée pour les parasites Neo ncmicl-3 KO - 2G M2eGPI Icrel et la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA obtenue. La localisation de la protéine semble membranaire (dû à l’ancrage GPI) alors que pour la version M2e, la localisation semble dans la vacuole parasitophore et dans le parasite. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine M2eGPI SEQ ID NO :206.

La souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA est validée par immunofluorescence.

La souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2eGPI Icrel est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (4μΜ - pas de gène DHFR*) mais elle se multiplie et lyse le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50μΜ - possible qu’en cas d’absence du gène TK).

La souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (4μΜ - grâce à la présence du gène DHFR*) alors qu’elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50μΜ - à cause de la présence du gène TK). Ce profil de résistance (sensible au ganciclovir et résistance à la pyriméthamine) permet de confirmer l’intégration du plasmide pUC18 4G2 ICrel - HA SEQ ID NO : 232 dans la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA.

L’ensemble des résultats permet de valider la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA.

129

2. Construction de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA Icrel

L’électroporation de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA avec le plasmide pTsaglIcrel αβγ circulaire SEQ ID NO : 178 a été réalisée selon le protocole décrit (point e). Les clones obtenus résistants au ganciclovir sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence des gènes d’intérêt M2eGPI et HA et l’expression des protéines M2eGPI SEQ ID NO :206 et HA SEQ ID NO :255 et pour valider la suppression de la cassette de résistance DHFR*TYTK SEQ ID NO : 134.

Validation de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA Icrelpar PCR

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO :245 et oz M2eGPI R SEQ ID NO : 247 (Mix M2eGPI ou M2e) permettent de mettre en évidence une bande à 593 paires de bases pour la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA Icrel, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène M2eGPI dans cette souche. Cette bande est détectée dans la souche Neo ncmic7-3 KO - 2G M2eGPI Icrel confirmant la présence de ce gène dans la souche de départ.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO :245 et oz M2e R SEQ ID NO : 246 (Mix M2e) ne permettent pas de mettre en évidence une bande à 588 paires de bases pour la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA Icrel, conformément à ce qui est attendu. En effet, cette PCR permet de différencier l’insertion du plasmide pUC18 4G2 ICrel - M2eGPI SEQ ID NO :205 (PCR négative) de l’insertion du plasmide pUC18 4G2 ICrel - M2e SEQ ID NO :244 (PCR positive à 588pb). Cette bande n’est pas détectée dans la souche Neo ncmic7-3 KO - 2G M2eGPI Icrel confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces oz tete HA F SEQ ID NO :239 et Seq HA R I SEQ ID NO : 248 (Mix HA) permettent de mettre en évidence une bande à 506 paires de bases pour la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA Icrel, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène HA dans cette souche. Cette bande n’est pas détectée dans la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2eGPI ICrel confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO : 250 (Mix Gène d’intérêt) permettent de mettre en évidence respectivement une bande à 1875 paires de bases conformément à la taille de bande attendue pour HA et une bande à 1719 paires de bases conformément à la taille de bande attendue pour M2e GPI pour la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA Icrel, confirmant

130 la présence des gènes HA et M2eGPI dans cette souche. Ces bandes ne sont pas détectées dans la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ et la souche électroporée Neo ncmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA présente les deux bandes (à 1719 et 1875 paires de bases) conformément à la taille de bande attendue pour M2e GPI et HA.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces Dhfir int Bgl II F SEQ ID NO :251 et qPCR TK R SEQ ID NO : 252 (Mix DHFR*TYTK) ne mettent pas en évidence de bande à 945 paires de bases pour la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA Icrel, conformément à ce qui est attendu et confirmant la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO : 134 dans cette souche. Cette bande n’est pas non plus détectée dans la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2eGPI Icrel confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO :245 et MCI SEQ ID NO : 254 (Mix Icrel M2eGPI ou M2e) permettent de mettre en évidence une bande à 1192 paires de bases pour les souches Neo ncmicl-3 KO - 2G M2eGPI Icrel, et Neo ncmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA Icrel conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gene A/2cGPI et la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO : 134 dans ces souches. Cette bande n’est pas détectée dans la souche Neo ncmic7-3 KO 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces oz tete ELAF SEQ ID NO :239 et MCI SEQ ID NO : 254 (Mix Icrel HA) permettent de mettre en évidence une bande à 1348 paires de bases pour la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA Icrel, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène HA et la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO : 134 dans cette souche. Cette bande n’est pas détectée dans la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2eGPI Icrel confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

La souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA Icrel est validée par PCR.

Validation de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA Icrel par immunofluorescence

Les résultats montrent qu’avec l’anticorps anti HA aucune fluorescence n’est détectable pour le parasite Neo ncmic7-3 KO - 2G, alors qu’une fluorescence est détectée sur la membrane des parasites de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA et de la souche obtenue Neo

131 ncmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA Icrel. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine HA SEQ ID NO :255.

Les résultats montrent qu’avec l’anticorps anti M2e aucune fluorescence n’est détectable pour le parasite Neo ncmic7-3 KO - 2G, alors qu’une fluorescence est détectée pour les parasites Neo ncmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA et la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA Icrel obtenue. La localisation de la protéine semble membranaire (dû à l’ancrage GPI) alors que pour la version M2e, la localisation semble dans la vacuole parasitophore et dans le parasite. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine M2eGPI SEQ ID NO :206.

La souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA Icrel est validée par immunofluorescence.

Alors que la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (4μΜ - grâce à la présence du gène DHFR*) et qu’elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50μΜ - à cause de la présence du gène TK, la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA Icrel n’est plus capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (4μΜ - grâce à la perte du gène DHFR*) alors qu’elle est redevenue capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50μΜ - grâce à la perte du gène TK). Ce profil de résistance (résistance au ganciclovir et sensible à la pyriméthamine) permet de confirmer la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO : 134 suite à l’action de la méganucléase I-Crel.

L’ensemble des résultats permet de valider la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA Icrel.

132

D. Construction de la souche Neo ncmic/-3 KO - 2GM2e HA Icrel

1. Construction de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e HA

L’électroporation de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e Icrel avec le plasmide pUC18 4G2 ICrel - HA SEQ ID NO : 232 a été réalisée selon le protocole décrit (point a). Les clones obtenus résistants à la pyriméthamine sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence du gène d’intérêt HA et l’expression de la protéine.

Validation de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e HA par PCR

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO :245 et oz M2eGPI R SEQ ID NO : 247 (Mix M2eGPI ou M2e) permettent de mettre en évidence une bande à 593 paires de bases pour la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e HA, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène M2e dans cette souche (figure 31). Cette bande est détectée dans la souche Neo ncmic7-3 KO - 2G M2e Icrel confirmant la présence de ce gène dans la souche de départ.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO :245 et oz M2e R SEQ ID NO : 246 (Mix M2e) permettent de mettre en évidence une bande à 588 paires de bases pour la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e HA, conformément à ce qui est attendu (figure 31). En effet, cette PCR permet de différencier l’insertion du plasmide pUC18 4G2 ICrel - M2eGPI SEQ ID NO :205 (PCR négative) de l’insertion du plasmide pUC18 4G2 ICrel - M2e SEQ ID NO :244 (PCR positive à 588pb). Cette bande est détectée dans la souche Neo ncmic7-3 KO - 2G M2e Icrel confirmant la présence de ce gène dans la souche de départ.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces oz tete HA F SEQ ID NO :239 et Seq HA R I SEQ ID NO : 248 (Mix HA) permettent de mettre en évidence une bande à 506 paires de bases pour la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e HA, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène HA dans cette souche (figure 31). Cette bande n’est pas détectée dans la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e ICrel confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO : 250 (Mix Gène d’intérêt) permettent de mettre en évidence respectivement une bande à 1875 paires de bases conformément à la taille de bande attendue pour HA et une bande à 1641 paires de bases conformément à la taille de bande attendue pour M2e pour la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e HA, confirmant la présence

133 des gènes HA et M2e dans cette souche (figure 31). Ces bandes ne sont pas détectées dans la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ et la souche électroporée Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e Icrel ne présente que la bande à 1641 paires de bases conformément à la taille de bande attendue pour M2e.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces Dhfr int Bgl II F SEQ ID NO :251 et qPCR TK R SEQ ID NO : 252 (Mix DHFR*TYTK) permettent de mettre en évidence une bande à 945 paires de bases pour la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e HA, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène DHFR*TYTK dans cette souche. Cette bande n’est pas détectée dans la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e Icrel confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

La souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e HA est validée par PCR.

Validation de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e HA par immuno fluorescence

Les résultats montrent qu’avec l’anticorps anti HA aucune fluorescence n’est détectable pour le parasite Neo ncmic7-3 KO - 2G, alors qu’une fluorescence est détectée sur la membrane des parasites de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e HA obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine HA SEQ ID NO :255. (figure 36)

Les résultats montrent qu’avec l’anticorps anti M2e aucune fluorescence n’est détectable pour le parasite Neo ncmic7-3 KO - 2G, alors qu’une fluorescence est détectée pour les parasites Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e Icrel et la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e HA obtenue. La localisation de la fluorescence semble être dans la vacuole parasitophore et dans le parasite (alors que pour la version M2eGPI, la localisation de la protéine semble membranaire). Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine M2e SEQ ID NO :253. (figure 36)

La souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e HA est validée par immunofluorescence.

Validation de la souche ayant intégré le plasmide par analyse du profil de résistance

La souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e Icrel est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (4μΜ - pas de gène DHFR*) mais elle se multiplie et lyse le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50μΜ - possible qu’en cas d’absence du gène TK).

134

La souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e HA est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (4μΜ - grâce à la présence du gène DHFR*) alors qu’elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50μΜ - à cause de la présence du gène TK). Ce profil de résistance (sensible au ganciclovir et résistance à la pyriméthamine) permet de confirmer l’intégration du plasmide pUC18 4G2 ICrel - HA SEQ ID NO : 232 dans la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e HA.

L’ensemble des résultats permet de valider la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e HA.

2. Construction de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e HA Icrel

L’électroporation de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e HA avec le plasmide pTsaglIcrel αβγ circulaire SEQ ID NO : 178 a été réalisée selon le protocole décrit (point e). Les clones obtenus résistants au ganciclovir sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence des gènes d’intérêt M2e et HA et l’expression des protéines M2e SEQ ID NO :253 et HA SEQ ID NO :255 et pour valider la suppression de la cassette de résistance DHFR*TYTK SEQ ID NO : 134.

Validation de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e HA Icrelpar PCR

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO :245 et oz M2eGPI R SEQ ID NO : 247 (Mix M2eGPI ou M2e) permettent de mettre en évidence une bande à 593 paires de bases pour la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e HA Icrel, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène M2e dans cette souche. Cette bande est détectée dans la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e HA confirmant la présence de ce gène dans la souche de départ.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO :245 et oz M2e R SEQ ID NO : 246 (Mix M2e) permettent de mettre en évidence une bande à 588 paires de bases pour la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2eHA Icrel, conformément à ce qui est attendu. En effet, cette PCR permet de différencier l’insertion du plasmide pUC18 4G2 ICrel - M2eGPI SEQ ID NO :205 (PCR négative) de l’insertion du plasmide pUC18 4G2 ICrel - M2e SEQ ID NO :244 (PCR positive à 588pb). Cette bande n’est pas détectée dans la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e ICrel confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces oz tete HA F SEQ ID NO :239 et Seq HA R I SEQ ID NO : 248 (Mix HA) permettent de mettre en évidence une

135 bande à 506 paires de bases pour la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e HA Icrel, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène HA dans cette souche. Cette bande n’est pas détectée dans la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e ICrel confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO : 250 (Mix Gène d’intérêt) permettent de mettre en évidence respectivement une bande à 1875 paires de bases conformément à la taille de bande attendue pour HA et une bande à 1641 paires de bases conformément à la taille de bande attendue pour M2e pour la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e HA Icrel, confirmant la présence des gènes HA et M2e dans cette souche. Ces bandes ne sont pas détectées dans la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ et la souche électroporée Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e HA présente les deux bandes (à 1641 et 1875 paires de bases) conformément à la taille de bande attendue pour M2e et HA.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces Dhfr int Bgl II F SEQ ID NO :251 et qPCR TK R SEQ ID NO : 252 (Mix DHFR*TYTK) ne mettent pas en évidence de bande à 945 paires de bases pour la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e HA Icrel, conformément à ce qui est attendu et confirmant la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO : 134 dans cette souche. Cette bande n’est pas non plus détectée dans la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e Icrel confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO :245 et MCI SEQ ID NO : 254 (Mix Icrel M2eGPI ou M2e) permettent de mettre en évidence une bande à 1114 paires de bases pour les souches Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e Icrel, et Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e HA Icrel conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène M2e et la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO : 134 dans ces souches. Cette bande n’est pas détectée dans la souche Neo ncmic7-3 KO - 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces oz tete ELAF SEQ ID NO :239 et MCI SEQ ID NO : 254 (Mix Icrel HA) permettent de mettre en évidence une bande à 1348 paires de bases pour la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e HA Icrel, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène HA et la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO : 134 dans cette souche. Cette bande n’est pas détectée dans la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e Icrel confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

La souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e HA Icrel est validée par PCR.

136

Validation de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e HA Icrel par immunofluorescence

Les résultats montrent qu’avec l’anticorps anti HA aucune fluorescence n’est détectable pour le parasite Neo ncmic7-3 KO - 2G et la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e Icrel , alors qu’une fluorescence est détectée sur la membrane des parasites de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e HA Icrel obtenue et la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e HA. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine HA SEQ ID NO :255.

Les résultats montrent qu’avec l’anticorps anti M2e aucune fluorescence n’est détectable pour le parasite Neo ncmic7-3 KO - 2G, alors qu’une fluorescence est détectée pour les parasites Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e HA et la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e HA obtenue. La localisation de la fluorescence semble être dans la vacuole parasitophore et dans le parasite (alors que pour la version M2eGPI, la localisation de la protéine semble membranaire). Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine M2e SEQ ID NO :253.

La souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e HA Icrel est validée par immunofluorescence.

Alors que la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e HA est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (4μΜ - grâce à la présence du gène DHFR*) et qu’elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50μΜ - à cause de la présence du gène TK), la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e HA Icrel n’est plus capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (4μΜ - grâce à la perte du gène DHFR*) alors qu’elle est redevenue capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50μΜ - grâce à la perte du gène TK). Ce profil de résistance (résistance au ganciclovir et sensible à la pyriméthamine) permet de confirmer la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO : 134 suite à l’action de la méganucléase I-Crel.

137

L’ensemble des résultats permet de valider la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e HA Icrel.

Exemple 9 : Construction de plasmides permettant l’intégration et l’expression de transgènes du parasite Leishmania infantum dans des souches de Toxoplasma gondii et Neospora caninum sans persistance d’une cassette de sélection.

L’objectif de cette expérience est de construire des plasmides qui permettent l’intégration dans le génome de Toxoplasma gondii ou dans celui de Neospora caninum d’un transgène hétérologue du parasite Leishmania infantum son expression et sans persistance d’une cassette de sélection.

• Plasmide pUC18 4G2 ICrel - Kmpll

Le plasmide pUC18 4G2 ICrel - Kmpll SEQ ID NO : 256 (figure 37) permet la production d’une protéine de fusion Kmpl 1-tag Myc SEQ ID NO : 257, comprenant :

> la séquence du gène kmpll de Leishmania infantum SEQ ID NO : 258 codant pour la protéine Kmpl 1 SEQ ID NO : 259 > un tag Myc SEQ ID NO : 260 codée par la séquence SEQ ID NO : 261

Une PCR a été nécessaire pour l’amplification des ces fragments pour cette construction avec les amorces MC7 SEQ ID NO : 262 et MC8 SEQ ID NO : 263 (PCR : SEQ ID NO : 264 329 pb) (Tableau 25). L’amplification de cette séquence a été effectué à partir d’un gène synthétique codant pour Kmpl 1 et a une taille de 329 pb SEQ ID NO : 264.

Tableau 25 : Amorces MC7 et MC8

Amor ce F	Séquence	Amor ce R	Séquence
MC7	SEQ ID NO :262 AAACGACAAAATGGCCACCACG TACGAGG	MC8	SEQ IDNO 263 CCGCGGCCGCTTACAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTCCTTGG ACGGGTACTGCGCAG

138

Le fragment de PCR digéré par les enzymes Pmel et Notl (325 pb, SEQ ID NO : 265) a été directement clonés dans le plasmide pUC18 4G2 ICrel SEQ ID NO : 128 digéré par les enzymes Pmel et Notl (8344pb).

• Plasmide pUC18 4G2 ICrel - Nh36

Le plasmide pUC18 4G2 ICrel - Nh36 SEQ ID NO : 266 (figure 38) permet la production d’une protéine de fusion Nh36-tag V5 SEQ ID NO : 267, comprenant :

> la séquence du gène nh36 de Leishmania infantum SEQ ID NO : 268 codant pour la protéine Nh36 SEQ ID NO : 269 > un tag V5 SEQ ID NO : 270 codée par la séquence SEQ ID NO : 271

Une PCR a été nécessaire pour l’amplification des ces fragments pour cette construction avec les amorces MC9 SEQ ID NO : 272 et MC 10 SEQ ID NO : 273 (PCR : SEQ ID NO : 274 1007 pb) (Tableau 26). L’amplification de cette séquence a été effectué à partir d’un gène synthétique codant pour Nh36 et a une taille de 1007 pb SEQ ID NO : 274.

Tableau 26 : Amorces MC9 et MC 10

Amo rce F	Séquence	Amo rce R	Séquence
MC9	SEQ ID NO :272 AAACGACAAAATGCCGCGCA AGATTATTCTC	MCI 0	SEQIDNO 273 CAGCGGCCGCTTACGTAGAATCGAGACCGAGGAGAGGGTTAGGGATAG GCTTACCTTGAGGATCGCCGATGCGC

Le fragment de PCR digéré par les enzymes Pmel et Notl (1003 pb, SEQ ID NO : 275) a été directement clonés dans le plasmide pUC18 4G2 ICrel SEQ ID NO : 128 digéré par les enzymes Pmel et Notl (8344pb).

• Plasmide pUC18 4G2 ICrel - Cypl

Le plasmide pUC18 4G2 ICrel - Cypl SEQ ID NO : 276 (figure 39) permet la production d’une protéine de fusion Cypl-tag HA SEQ ID NO : 277, comprenant :

> la séquence du gène cypl de Leishmania infantum SEQ ID NO : 278 codant pour la protéine Cypl SEQ ID NO : 279

139 > un tag HA SEQ ID NO : 280 codée par la séquence SEQ ID NO : 281

Une PCR a été nécessaire pour l’amplification des ces fragments pour cette construction avec les amorces MC11 SEQ ID NO : 282 et MC12 SEQ ID NO : 283 (PCR : SEQ ID NO : 284 581 pb) (Tableau 27). L’amplification de cette séquence a été effectué à partir d’un gène synthétique codant pour Cypl et a une taille de 581 pb SEQ ID NO : 284.

Tableau 27 : Amorces MCI 1 et MC 12

Amor ce F	Séquence	Amor ce R	Séquence
MCI 1	SEQ ID NO :xx AAACGACAAAATGTCTTACACGCC GCACTAC	MCI 2	SEQIDNO xx CAGCGGCCGCTTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAAAGCT GTCCGCAGGCAGC

Le fragment de PCR digéré par les enzymes Pmel et Notl (577 pb, SEQ ID NO : 285) a été directement clonés dans le plasmide pUC18 4G2 ICrel SEQ ID NO : 128 digéré par les enzymes Pmel et Notl (8344pb).

Exemple 10 : Construction d’une souche Toxo tgmicl-3 KO-2G exprimant un ou plusieurs antigènes du parasite Leishmania infantum et ne comportant pas de gène de sélection

Souches de Toxoplasma gondii

Les tachyzoïtes de la souche Toxo tgmic7-3 KO 2G sont produits sur fibroblastes humains (HFF Hs27 ATCC CRL-1634)) cultivés en milieu minimal de Dulbecco (DMEM) supplémenté par 10% de sérum de veau fœtal (SVF), 2mM glutamine, lOOU/mL de pénicilline et lOOU/mL de streptomycine. Ils ont été récoltés après lyse mécanique des cellules hôtes par 3 passages en seringue 25G.

Construction des souches - protocole

La construction de chaque souche vaccinale contenant un ou plusieurs antigènes se fait à chaque étape avec un protocole identique. Le protocole expérimental est dans un premier

140 temps détaillé ici puis appliqué pour chaque construction de souche vaccinale, celui-ci comporte plusieurs étapes :

a- Electroporation et sélection de la souche d’intérêt avec le plasmide exprimant un antigène du parasite Leishmania infantum : souches Toxo tgmicl-3 KO - 2G Leishmania

Les parasites Toxo tgmicl-3 KO - 2G sont électroporés avec 20pg de plasmide pUC18 4G2 ICrel - Leishmania linéarisé. Par « plasmide pUC18 4G2 ICrel - Leishmania », on entend le plasmide pUC18 4G2 ICrel - Kmpll SEQ ID NO :256, le plasmide pUC18 4G2 ICrel Nh36 SEQ ID NO :266, ou le plasmide pUC18 4G2 ICrel - Cypl.

Après électroporation, les tachyzoïtes sont soumis à une pression de sélection par l’agent de sélection (Pyriméthamine ΙμΜ). 10 à 15 jours après sélection et passages successifs sur cellules HFF, les parasites sont sous-clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF puis amplifiés en plaques 24 puits sur une monocouche de cellules HFF.

b- Validation de la souche ayant intégré le plasmide par PCR

Pour valider une souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Leishmania, c’est-à-dire une souche de T. gondii ayant intégré un ou plusieurs plasmides pUC18 4G2 ICrel - Leishmania, des analyses PCR sont effectuées à partir de l’ADN génomique extrait au DNAzol à partir d’un culot parasitaire constitué de 10⁷ parasites. Les amorces utilisées pour les PCR sont détaillées dans le Tableau 28 (point f). Les produits PCR sont analysés par électrophorèse sur gel d’agarose. Leurs tailles attendues sont également décrites dans le Tableau xx (point f). Plusieurs mix sont possibles et les PCR sont réalisées en fonction des souches testées.

c- Validation de la souche ayant intégré le plasmide par immunofluorescence

Les tachyzoïtes sont cultivés 24h sur lamelles en verre recouvertes d’une monocouche de cellules HFF. Les cellules infectées ont été lavés 2 fois en PB SIX, et fixés par du formaldéhyde 4% pendant 30 min. Après 3 lavages en PBS1X, les cellules HFF infectées ont été perméabilisées avec 0,1% de Triton X-100 dans du PBS1X pendant 5 min. Après 3 lavages au PBS IX, une étape de saturation est effectuée avec une solution de PBS 1X/SVF 10% pendant 30 min. Les cellules ont ensuite été incubées avec l'anticorps primaire dilué dans 2% SVF pendant 1 heure, lavées 3 fois au PBS1X puis incubées avec un anticorps secondaire dilué dans une solution de PBS/SVF 2% pendant 1 heure. Après 2 lavages au PBSIX, les lamelles en verre sont montées sur lame avec de l’Immu-Mount™ et observées au microscope à fluorescence.

141

Les anticorps primaires utilisés sont : un anticorps commercial dirigé contre le tag Myc couplé en C-ter à Kmpll (Myc epitope Tag antibody (Myc.A7), réf : MA1-21316, Thermo Scientific ou c-Myc Tag Antibody, réf SAB4301136, Sigma-Aldrich) qui permet de détecter l’expression de la protéine Kmpll-c-Myc SEQ ID NO : 257, un anticorps commercial dirigé contre le tag V5 couplé en C-ter à Nh36 (V5 epitope Tag antibody (E10/V4RR), réf : MA15253 ou PA1-993, Thermo Scientific ou V5 epitope Tag Antibody Alexa Fluor®488 conjugate (2F11F7), réf : 37-7500-A488) qui permet de détecter l’expression de la protéine Nh36-V5 SEQ ID NO : 267, un anticorps commercial dirigé contre le tag HA couplé en C-ter à Cypl (Anti-HA antibody, réf : 26183 ou 71-5500, ou HA Epitope Tag Antibody, Alexa Fluor® 594 conjugate (16B12), réf : A21-288, Thermo Scientific) qui permet de détecter l’expression de la protéine Cypl-HA SEQ ID NO : 277 et enfin les anticorps secondaires commerciaux utilisés sont l’Alexa fluor® 594 goat anti-mouse ou anti-rabbit (réf : A-l 1005 ou A-11012), l’Alexa fluor® 488 goat anti-mouse ou anti-rabbit (réf : A-l 1001 ou A-27012 et l’Alexa fluor® 430 goat anti-rabbit (Réf : A-l 1063, Thermo Scientific).

Le profil d’antibiorésistance est analysé pour les clones validés en PCR et immunofluorescence. Les tachyzoïtes (de 1.10⁵ à 5.10⁵) sont cultivés 5 jours sur une monocouche de cellules HFF. Les parasites Toxo tgmicl-3 KO - 2G Leishmania infantum ayant intégré un plasmide pUC18 4G2 ICrel - Leishmania linéarisé doivent être résistants à la pyriméthamine (ΙμΜ - grâce à la présence du gène DHFR*) et sensible au ganciclovir (50μΜ - à cause de la présence du gène TK). Ce profil de résistance est validé en cultivant les parasites sur fibroblastes humains (HFF Hs27 ATCC CRL-1634) cultivés en milieu minimal de Dulbecco (DMEM) supplémenté par 10% de sérum de veau fœtal (SVF), 2mM glutamine, 100 U/mL de pénicilline et 100 U/mL de streptomycine, supplémenté ou non de la pyriméthamine ou du ganciclovir.

Les souches validées par PCR, immunofluorescence et ayant le bon profil d’antibiorésistance sont nommées Toxo tgmicl-3 KO - 2G Leishmania (Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll, Toxo tgmicl-3 KO - 2G Nh36, Toxo tgmicl-3 KO - 2G Cypl, Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll Nh36, Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll Cypl, Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll Cypl Nh36).

142 e- Electroporation de la Toxo tgmicl-3 KO - 2G Leishmania avec un plasmide pTsagl Icrelajjy et contre sélection de la souche ayant perdu la cassette de sélection DHFR*-TY-TK : souches Toxo tgmicl-3 KO - 2G Leishmania Icrel

Les parasites Toxo tgmicl-3 KO - 2G Leishmania sont électroporés avec 20pg de plasmide pTsaglIcrel αβγ circulaire SEQ ID NO : 178. Après électroporation, les tachyzoïtes sont soumis à une pression de sélection par l’agent de sélection (Ganciclovir 50μΜ). Dix à quinze jours après sélection et passages successifs sur cellules HFF, les parasites sont sous-clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF puis amplifiés en plaques 24 puits sur une monocouche de cellules HFF.

Pour valider une souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Leishmania Icrel, des analyses PCR sont effectuées à partir de l’ADN génomique extrait au DNAzol à partir d’un culot parasitaire constitué de 10⁷ parasites. Les amorces utilisées pour les PCR sont détaillées dans le Tableau 29 ci-dessous. Les premières PCR sont identiques aux PCR faites pour la validation des souches Toxo tgmicl-3 KO - 2G Leishmania, la deuxième série de PCR permet de valider la suppression de la cassette DHFR*-TY-TK et la présence de la cicatrice αβγ SEQ ID NO : 143, et ainsi de vérifier l’absence de l’insertion du plasmide pTsaglIcrel αβγ. Les produits PCR sont analysés par électrophorèse sur gel d’agarose. Leurs tailles attendues sont également décrites dans le Tableau 30 ci-dessous. Plusieurs mixs sont possibles et les PCR sont réalisées en fonction des souches testées.

Tableau 29 : liste des amorces utilisables pour la validation des souches.

Gène d’intérêt	seq TUB MCSF	SEQ ID NO : 249 AACCCGCGCAGAAGACATCC	seq 3utr MCS R	SEQ ID NO : 250 ATGGGGCACATGCTGCACGAA
Mix Icrel Gène d’intérêt et cicatrice	MC4	SEQ ID NO : 286 TCGTAGAGAACAAGCACTCG	MCI	SEQ ID NO : 254 TGAAATACCGCACAGATGCG

143

Tableau 30 : Taille attendue des amplicons (en paires de base) des différentes PCR de validation de la construction des souches Toxo tgmicl-3 KO - 2G Influenza.

	Gène d’intérêt	Mix Icrel Gène d’intérêt et cicatrice
Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpl 1	510	5843
Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpl 1 Icrel	510	999
Toxo tgmicl-3 KO - 2G Nh36	1188	6521
Toxo tgmicl-3 KO - 2G Nh36 Icrel	1188	1677
Toxo tgmicl-3 KO - 2G Cypl	762	6095
Toxo tgmicl-3 KO - 2G Cypl Icrel	762	1251
Toxo tgmicl-3 KO - 2GKmpll Nh36	510/1188	999/6521
Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpl 1 Nh36 Icrel	510/1188	999/1677
Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpl 1 Cypl	510/762	999/6095
Toxo tgmicl-3 KO - 2GKmpll Cypl Icrel	510/762	999/1251
Toxo tgmicl-3 KO - 2GKmpll Cypl Nh36	510/762/1188	999/1251/6521

Les parasites Toxo tgmicl-3 KO - 2G Leishmania ayant perdu la cassette de sélection DHFR*-TY-TK SEQ ID NO : 134 doivent être sensibles à la pyriméthamine (ΙμΜ - grâce à la suppression du gène DHFR*) et résistants au ganciclovir (50μΜ - grâce à la suppression du gène TK). Ce profil de résistance est validé en cultivant les parasites sur fibroblastes humains (HFF Hs27 ATCC CRL-1634) en milieu minimal de Dulbecco (DMEM) supplémenté par 10% de sérum de veau fœtal (SVF), 2mM glutamine, 100 U/mL de pénicilline et 100 U/mL de streptomycine, supplémenté ou non de la pyriméthamine ou du ganciclovir.

Les souches validées par PCR, immunofluorescence et ayant le bon profil d’antibiorésistance sont nommées Toxo tgmicl-3 KO - 2G Leishmania Icrel (Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll Icrel, Toxo tgmicl-3 KO - 2G Nh36 Icrel, Toxo tgmicl-3 KO - 2G Cypl Icrel, Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll Nh36 Icrel, Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll Cypl Icrel).

144

Résultats - Construction des souches exprimant un antigène du parasite Leishmania et ne comportant pas de gène de sélection

A. Construction de la souche Toxo tgmic/-3 KO - 2G Kmpll Icrel

1. Construction de la souche Toxo tgmic/-3 KO - 2G Kmpll

L’électroporation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G avec le plasmide pUC18 4G2 ICrel Kmpl 1 SEQ ID NO : 256 a été réalisée selon le protocole décrit (point a). Les clones obtenus résistants à la pyriméthamine sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence du gène d’intérêt kmpll et l’expression de la protéine Kmpll SEQ ID NO :259.

Validation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll par PCR

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO : 250 (Mix Gène d’intérêt) permettent de mettre en évidence une bande à 510 paires de bases pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène kmpll dans cette souche. Cette bande n’est pas détectée dans la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ, (figure 40)

La souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll est validée par PCR.

Validation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll par immunofluorescence

Les résultats montrent qu’avec l’anticorps anti Myc aucune fluorescence n’est détectable pour le parasite Toxo tgmicl-3 KO - 2G, alors qu’une fluorescence est détectée dans les parasites et dans les vacuoles parasitophores de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpl 1 obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine Kmpl 1-Myc SEQ ID NO :257. (figure 42)

La souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll est validée par immunofluorescence.

145 multiplie et lyse le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50μΜ - possible qu’en cas d’absence du gène TK).

La souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (ΙμΜ - grâce à la présence du gène DHFR*) alors qu’elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50μΜ - à cause de la présence du gène TK). Ce profil de résistance (sensible au ganciclovir et résistance à la pyriméthamine) permet de confirmer l’intégration du plasmide pUC18 4G2 ICrel - Kmpll SEQ ID NO : 256 dans la souche Toxo tgmicl-3 KO 2G Kmpll.

L’ensemble des résultats permet de valider la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll.

2. Construction de la souche Toxo tgmic/-3 KO - 2G Kmpll Icrel

L’électroporation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll avec le plasmide pTsaglIcrel αβγ circulaire SEQ ID NO : 178 a été réalisée selon le protocole décrit (point e). Les clones obtenus résistants au ganciclovir sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence du gène d’intérêt kmpll et l’expression de la protéine Kmpl 1 et pour valider la suppression de la cassette de résistance DHFR*TYTK.

Validation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll Icrelpar PCR

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO : 250 (Mix gène d’intérêt) permettent de mettre en évidence une bande à 510 paires de bases pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll Icrel, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène kmpll dans cette souche. Cette bande n’est pas détectée dans la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ, (figure 40).

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces MC4 SEQ ID NO :286 et MCI SEQ ID NO : 254 (Mix Icrel Gène d’intérêt et cicatrice) permettent de mettre en évidence une bande à 999 paires de bases pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll Icrel, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène kmpll et la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO : 134 dans cette souche. Cette bande n’est pas détectée dans la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ, (figure 41).

La souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll est validée par PCR.

146

Validation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll Icrelpar immunofluorescence Les résultats montrent qu’avec l’anticorps anti Myc aucune fluorescence n’est détectable pour le parasite Toxo tgmicl-3 KO - 2G, alors qu’une fluorescence est détectée dans les parasites et dans les vacuoles parasitophores de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll Icrel obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine Kmpll SEQ ID NO :259. (figure 42)

La souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll Icrel est validée par immunofluorescence.

Alors que la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpl 1 est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (ΙμΜ - grâce à la présence du gène DHFR*) et qu’elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50μΜ - à cause de la présence du gène TK), la souche Toxo tgmicl3 KO - 2G Kmpll Icrel n’est plus capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (ΙμΜ - grâce à la perte du gène DHFR*) alors qu’elle est redevenue capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50μΜ - grâce à la perte du gène TK). Ce profil de résistance (résistance au ganciclovir et sensible à la pyriméthamine) permet de confirmer la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO : 134 suite à l’action de la méganucléase I-Crel.

L’ensemble des résultats permet de valider la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll Icrel.

147

B. Construction de la souche Toxo tgmic/-3 KO - 2G Nh36Icrel

1. Construction de la souche Toxo tgmic/-3 KO - 2G Nh36

L’électroporation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G avec le plasmide pUC18 4G2 ICrel Nh36 SEQ ID NO : 266 a été réalisée selon le protocole décrit (point a). Les clones obtenus résistants à la pyriméthamine sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence du gène d’intérêt nh36 et l’expression de la protéine Nh36 SEQ ID NO 269.

Validation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Nh36 par PCR

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO : 250 (Mix Gène d’intérêt) permettent de mettre en évidence une bande à 1188 paires de bases pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Nh36, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène nh36 dans cette souche. Cette bande n’est pas détectée dans la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ, (figure 40)

La souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Nh36 est validée par PCR.

Validation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2GNh36 par immunofluorescence

Les résultats montrent qu’avec l’anticorps anti V5, aucune fluorescence n’est détectable pour le parasite Toxo tgmicl-3 KO - 2G, alors qu’une fluorescence est détectée sur les parasites de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Nh36 obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine Nh36. (figure 42)

La souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Nh36 est validée par immunofluorescence.

Validation de la souche ayant intégré le plasmide par analyse du pro fil de résistance

148

La souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Nh36 est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (ΙμΜ - grâce à la présence du gène DHFR*) alors qu’elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50μΜ - à cause de la présence du gène TK). Ce profil de résistance (sensible au ganciclovir et résistance à la pyriméthamine) permet de confirmer l’intégration du plasmide pUC18 4G2 ICrel - Nh36 SEQ ID NO : 266 dans la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Nh36.

L’ensemble des résultats permet de valider la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Nh36.

2. Construction de la souche Toxo tgmic/-3 KO - 2G Nh36Icrel

L’électroporation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Nh36 avec le plasmide pTsaglIcrel αβγ circulaire SEQ ID NO : 178 a été réalisée selon le protocole décrit (point e). Les clones obtenus résistants au ganciclovir sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence du gène d’intérêt nh36 et l’expression de la protéine Nh36 et pour valider la suppression de la cassette de résistance DHFR*TYTK SEQ IDNO :134.

Validation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Nh36 Icrelpar PCR

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO : 250 (Mix gène d’intérêt) permettent de mettre en évidence une bande à 1188 paires de bases pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Nh36 Icrel, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène nh36 dans cette souche. Cette bande n’est pas détectée dans la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ, (figure 40).

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces MC4 SEQ ID NO :286 et MCI SEQ ID NO : 254 (Mix Icrel Gène d’intérêt et cicatrice) permettent de mettre en évidence une bande à 1677 paires de bases pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Nh36 Icrel, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène nh36 et la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO : 134 dans cette souche. Cette bande n’est pas détectée dans la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ (figure 41).

La souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll est validée par PCR.

149

Validation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Nh3 6 Icrel par immunofluorescence Les résultats montrent qu’avec l’anticorps anti V5 aucune fluorescence n’est détectable pour le parasite Toxo tgmicl-3 KO - 2G, alors qu’une fluorescence est détectée dans les parasites et dans les vacuoles parasitophores de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2GNh36 Icrel obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine Nh36 SEQ ID NO :269. (figure 42)

La souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Nh36 Icrel est validée par immunofluorescence.

Alors que la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Nh36 est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (ΙμΜ - grâce à la présence du gène DHFR*) et qu’elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50μΜ - à cause de la présence du gène TK), la souche Toxo tgmicl3 KO - 2G Nh36 Icrel n’est plus capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (ΙμΜ - grâce à la perte du gène DHFR*) alors qu’elle est redevenue capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50μΜ - grâce à la perte du gène TK). Ce profil de résistance (résistance au ganciclovir et sensible à la pyriméthamine) permet de confirmer la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO : 134 suite à l’action de la méganucléase I-Crel.

L’ensemble des résultats permet de valider la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Nh36 Icrel.

150

C. Construction de la souche Toxo tgmic/-3 KO - 2G Cypl Icrel

1. Construction de la souche Toxo tgmic/-3 KO - 2G Cypl

L’électroporation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G avec le plasmide pUC18 4G2 ICrel Cypl SEQ ID NO : 276 a été réalisée selon le protocole décrit (point a). Les clones obtenus résistants à la pyriméthamine sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence du gène d’intérêt cypl et l’expression de la protéine Cypl SEQ ID NO :279.

Validation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Cypl par PCR

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO : 250 (Mix Gène d’intérêt) permettent de mettre en évidence une bande à 762 paires de bases pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Cypl, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène cypl dans cette souche. Cette bande n’est pas détectée dans la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ, (figure 40)

La souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Cypl est validée par PCR.

Validation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Cypl par immunofluorescence

Les résultats montrent qu’avec l’anticorps anti tag HA, aucune fluorescence n’est détectable pour le parasite Toxo tgmicl-3 KO - 2G, alors qu’une fluorescence est détectée sur les parasites de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Cypl obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine Cypl SEQ ID NO :279. (figure 42)

La souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Cypl est validée par immunofluorescence.

La souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Cypl est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (ΙμΜ - grâce à la présence du gène

151

DHFR*) alors qu’elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50μΜ - à cause de la présence du gène TK). Ce profil de résistance (sensible au ganciclovir et résistance à la pyriméthamine) permet de confirmer l’intégration du plasmide pUC18 4G2 ICrel - Cypl SEQ ID NO : 276 dans la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Cypl.

L’ensemble des résultats permet de valider la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Cypl.

2. Construction de la souche Toxo tgmic/-3 KO - 2G Cypl Icrel

L’électroporation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Cypl avec le plasmide pTsaglIcrel αβγ circulaire SEQ ID NO : 178 a été réalisée selon le protocole décrit (point e). Les clones obtenus résistants au ganciclovir sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence du gène d’intérêt cypl et l’expression de la protéine Cypl et pour valider la suppression de la cassette de résistance DHFR*TYTK.

Validation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Cypl Icrelpar PCR

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO : 250 (Mix gène d’intérêt) permettent de mettre en évidence une bande à 762 paires de bases pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Cypl Icrel, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène cypl dans cette souche. Cette bande n’est pas détectée dans la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ, (figure 40).

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces MC4 SEQ ID NO :286 et MCI SEQ ID NO : 254 (Mix Icrel Gène d’intérêt et cicatrice) permettent de mettre en évidence une bande à 1677 paires de bases pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Cypl Icrel, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène cypl et la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO : 134 dans cette souche. Cette bande n’est pas détectée dans la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ (figure 41).

La souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Cypl est validée par PCR.

Validation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Cypl Icrelpar immunofluorescence

Les résultats montrent qu’avec l’anticorps anti V5 aucune fluorescence n’est détectable pour le parasite Toxo tgmicl-3 KO - 2G, alors qu’une fluorescence est détectée dans les parasites et dans les vacuoles parasitophores de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Cypl Icrel obtenue.

152

Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine Cypl SEQ ID NO :279. (figure 42)

La souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Cypl Icrel est validée par immunofluorescence.

Alors que la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Cypl est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (ΙμΜ - grâce à la présence du gène DHFR*) et qu’elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50μΜ - à cause de la présence du gène TK), la souche Toxo tgmicl3 KO - 2G Cypl Icrel n’est plus capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (ΙμΜ - grâce à la perte du gène DHFR*) alors qu’elle est redevenue capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50μΜ - grâce à la perte du gène TK). Ce profil de résistance (résistance au ganciclovir et sensible à la pyriméthamine) permet de confirmer la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO : 134 suite à l’action de la méganucléase I-Crel.

L’ensemble des résultats permet de valider la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Cypl Icrel.

Résultats - Construction des souches exprimant plusieurs antigènes du parasite Leishmania infantum et comportant ou non un gène de sélection

A. Construction de la souche Toxo tgmic/-3 KO - 2G Kmpll Nh36Icrel

1. Construction de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpl 1 Nh36

L’électroporation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpl 1 Icrel avec le plasmide pUC18 4G2 ICrel - Nh36 SEQ ID NO : 266 a été réalisée selon le protocole décrit (point a). Les clones obtenus résistants à la pyriméthamine sont sélectionnés et analysés par PCR et

153

Immunofluorescence pour valider la présence des gènes d’intérêt kmpll et nh36 et l’expression des protéines Kmpl 1 SEQ ID NO :259 et Cypl SEQ ID NO .219.

Validation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll Nh36par PCR

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO : 250 (Mix Gène d’intérêt) permettent de mettre en évidence respectivement une bande à 510 paires de bases conformément à la taille de bande attendue pour kmpll et une bande à 1188 paires de bases conformément à la taille de bande attendue pour nh36 pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll Nh36, confirmant la présence des gènes kmpll et nh36 dans cette souche. Ces bandes ne sont pas détectées dans la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G confirmant l’absence de ces gènes dans la souche de départ et la souche électroporée Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll Icrel ne présente que la bande à 510 paires de bases conformément à la taille de bande attendue pour kpmll. (figure 40)

La souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll Nh36 est validée par PCR.

Validation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll Nh36 par immunofluorescence

Les résultats montrent qu’avec l’anticorps anti V5 aucune fluorescence n’est détectable pour les parasites Toxo tgmicl-3 KO - 2G et Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll, alors qu’une fluorescence est détectée sur les parasites de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpl 1 Nh36 obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine Nh36 couplé à l’épitope V5 SEQ ID NO :267. (figure 42)

Les résultats montrent qu’avec l’anticorps anti Myc aucune fluorescence n’est détectable pour le parasite Toxo tgmicl-3 KO - 2G, alors qu’une fluorescence est détectée pour les parasites Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll Icrel et la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll Nh36 obtenue, (figure 42)

Les résultats montrent qu’après un double marquage avec les anticorps anti Myc et anti V5 aucune fluorescence n’est détectable pour le parasite Toxo tgmicl-3 KO - 2G, alors que 2 fluorescences sont détectées pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll Nh36 obtenue, (figure 42)

La souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll Nh36 est validée par immunofluorescence.

154

La souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll Icrel est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (ΙμΜ - pas de gène DHFR*) mais elle se multiplie et lyse le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50μΜ - possible qu’en cas d’absence du gène TK).

La souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll Nh36 est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (ΙμΜ - grâce à la présence du gène DHFR*) alors qu’elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50μΜ - à cause de la présence du gène TK). Ce profil de résistance (sensible au ganciclovir et résistance à la pyriméthamine) permet de confirmer l’intégration du plasmide pUC18 4G2 ICrel - Nh36 SEQ ID NO : 266 dans la souche Toxo tgmicl-3 KO 2GKmpll Nh36.

L’ensemble des résultats permet de valider la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll Nh36.

2. Construction de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpl 1 Nh36 Icrel

L’électroporation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpl 1 Nh36 avec le plasmide pTsaglIcrel αβγ circulaire SEQ ID NO : 178 a été réalisée selon le protocole décrit (point e). Les clones obtenus résistants au ganciclovir sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence des gènes d’intérêt kmpll et nh36 et l’expression des protéines Kmpll SEQ ID NO : 259 et Nh36 SEQ ID NO : 269 et pour valider la suppression de la cassette de résistance DHFR*TYTK SEQ ID NO : 134.

Validation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll Nh36 Icrelpar PCR

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO : 250 (Mix Gène d’intérêt) permettent de mettre en évidence respectivement une bande à 510 paires de bases conformément à la taille de bande attendue pour kmpll et une bande à 1188 paires de bases conformément à la taille de bande attendue pour nh36 pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpl 1 Nh36 Icrel, confirmant la présence des gènes kmpll et nh36 dans cette souche. Ces bandes ne sont pas détectées dans la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G confirmant l’absence de ces gènes dans la souche de départ et

155 la souche électroporée Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpl 1 Nh36 présente les deux bandes (à 510 et 1188 paires de bases) conformément à la taille de bande attendue pour kmpll et nh36. (figure 40)

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces MC4 SEQ ID NO :286 et MCI SEQ ID NO : 254 (Mix Icrel Gène d’intérêt et cicatrice) permettent de mettre en évidence une bande à 999 paires de bases pour les souches Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpl 1 Icrel, et Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll Nh36 Icrel conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène kmpll et la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO : 134 dans ces souches (figure 41). Cette bande n’est pas détectée dans la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ. Cependant la bande attendue à 1677 paires de base confirmant la présence du gène nh36 et la suppression de la cassette DHFR*TYTK n’a pas été observée.

La souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll Nh36 Icrel est partiellement validée par PCR.

Validation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll Nh36 Icrel par immunofluorescence

Les résultats montrent qu’avec l’anticorps anti Myc aucune fluorescence n’est détectable pour le parasite Toxo tgmicl-3 KO - 2G, alors qu’une fluorescence est détectée sur les parasites de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpl 1 Nh36 et de la souche obtenue Toxo tgmicl-3 KO 2G Kmpll Nh36 Icrel. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine Kmpl 1 SEQ ID NO :259. (figure 42)

Les résultats montrent qu’avec l’anticorps anti V5 aucune fluorescence n’est détectable pour le parasite Toxo tgmicl-3 KO - 2G, alors qu’une fluorescence est détectée pour les parasites Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll Nh36 et la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll Nh36 Icrel obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine Nh36 SEQ ID NO :269. (figure 42)

Les résultats montrent qu’après un double marquage avec les anticorps anti Myc et anti V5 aucune fluorescence n’est détectable pour le parasite Toxo tgmicl-3 KO - 2G, alors que 2 fluorescences sont détectées pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll Nh36 Icrel obtenue, (figure 42)

La souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll Nh36 Icrel est validée par immunofluorescence.

156

Alors que la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll Nh36 est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (ΙμΜ - grâce à la présence du gène DHFR*) et qu’elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50μΜ - à cause de la présence du gène TK), la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll Nh36 Icrel n’est plus capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (ΙμΜ - grâce à la perte du gène DHFR*) alors qu’elle est redevenue capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50μΜ - grâce à la perte du gène TK). Ce profil de résistance (résistance au ganciclovir et sensible à la pyriméthamine) permet de confirmer la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO : 134 suite à l’action de la méganucléase I-Crel.

L’ensemble des résultats permet de valider la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll Nh36 Icrel.

B. Construction de la souche Toxo tgmic/-3 KO - 2G Kmpll Cypl Icrel

1. Construction de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpl 1 Cypl

L’électroporation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpl 1 Icrel avec le plasmide pUC18 4G2 ICrel - Cypl SEQ ID NO : 276 a été réalisée selon le protocole décrit (point a). Les clones obtenus résistants à la pyriméthamine sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence des gènes d’intérêt kmpll et cypl et l’expression des protéines Kmpl 1 SEQ ID NO : 259 et Cypl SEQ ID NO .219.

Validation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll Cypl par PCR

157 évidence respectivement une bande à 510 paires de bases conformément à la taille de bande attendue pour kmpll et une bande à 762 paires de bases conformément à la taille de bande attendue pour cypl pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll Cypl, confirmant la présence des gènes Kmpll et Cypl dans cette souche. Ces bandes ne sont pas détectées dans la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G confirmant l’absence de ces gènes dans la souche de départ et la souche électroporée Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll Icrel ne présente que la bande à 510 paires de bases conformément à la taille de bande attendue pour kpmll. (figure 40)

La souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll Cypl est validée par PCR.

Validation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2 G Kmpll Cypl par immunofluorescence

Les résultats montrent qu’avec l’anticorps anti tag HA aucune fluorescence n’est détectable pour les parasites Toxo tgmicl-3 KO - 2G et Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll, alors qu’une fluorescence est détectée sur les parasites de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpl 1 Cypl obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine Cypl couplé à l’épitope HA SEQ ID NO :277. (figure 42)

Les résultats montrent qu’avec l’anticorps anti Myc aucune fluorescence n’est détectable pour le parasite Toxo tgmicl-3 KO - 2G, alors qu’une fluorescence est détectée pour les parasites Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll Icrel et la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll Cypl obtenue, (figure 42)

Les résultats montrent qu’après un double marquage avec les anticorps anti Myc et anti Tag HA aucune fluorescence n’est détectable pour le parasite Toxo tgmicl-3 KO - 2G, alors que 2 fluorescences sont détectées pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll Cypl obtenue, (figure 42)

La souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll Cypl est validée par immunofluorescence.

158

La souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll Cypl est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (ΙμΜ - grâce à la présence du gène DHFR*) alors qu’elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50μΜ - à cause de la présence du gène TK). Ce profil de résistance (sensible au ganciclovir et résistance à la pyriméthamine) permet de confirmer l’intégration du plasmide pUC18 4G2 ICrel - Cypl SEQ ID NO : 276 dans la souche Toxo tgmicl-3 KO 2GKmpll Cypl.

L’ensemble des résultats permet de valider la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll Cypl.

2. Construction de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpl 1 Cypl Icrel

L’électroporation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpl 1 Cypl avec le plasmide pTsaglIcrel αβγ circulaire SEQ ID NO : 178 a été réalisée selon le protocole décrit (point e). Les clones obtenus résistants au ganciclovir sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence des gènes d’intérêt kmpll et cypl et l’expression des protéines Kmpll SEQ ID NO : 259 et Cypl SEQ ID NO : 279 et pour valider la suppression de la cassette de résistance DHFR*TYTK SEQ ID NO : 134.

Validation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll Cypl Icrelpar PCR

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO : 250 (Mix Gène d’intérêt) permettent de mettre en évidence respectivement une bande à 510 paires de bases conformément à la taille de bande attendue pour kmpll et une bande à 762 paires de bases conformément à la taille de bande attendue pour cypl pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll Cypl Icrel, confirmant la présence des gènes kmpll et cypl dans cette souche. Ces bandes ne sont pas détectées dans la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G confirmant l’absence de ces gènes dans la souche de départ et la souche électroporée Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpl 1 Cypl présente les deux bandes (à 510 et 762 paires de bases) conformément à la taille de bande attendue pour kmpll et cypl. (figure 40)

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces MC4 SEQ ID NO :286 et MCI SEQ ID NO : 254 (Mix Icrel Gène d’intérêt et cicatrice) permettent de mettre en évidence une bande à 999 paires de bases pour les souches Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll Icrel, et Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll Cypl Icrel conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène kmpll et la suppression de la cassette

159

DHFR*TYTK SEQ ID NO : 134 dans ces souches (figure 41). Cette bande n’est pas détectée dans la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ. Cependant la bande attendue à 1251 paires de base confirmant la présence du gène cypl et la suppression de la cassette DHFR*TYTKn’a pas été observée.

La souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll Cypl Icrel est partiellement validée par PCR.

Validation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll Cypl Icrel par immunofluorescence

Les résultats montrent qu’avec l’anticorps anti Myc aucune fluorescence n’est détectable pour le parasite Toxo tgmicl-3 KO - 2G, alors qu’une fluorescence est détectée sur les parasites de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpl 1 Cypl et de la souche obtenue Toxo tgmicl-3 KO 2G Kmpll Cypl Icrel. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine Kmpl 1 SEQ ID NO :259. (figure 42)

Les résultats montrent qu’avec l’anticorps anti tag HA aucune fluorescence n’est détectable pour le parasite Toxo tgmicl-3 KO - 2G, alors qu’une fluorescence est détectée pour les parasites Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpl 1 Cypl et la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpl 1 Cypl Icrel obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine Cypl SEQ ID NO :279. (figure 42)

Les résultats montrent qu’après un double marquage avec les anticorps anti Myc et anti tag HA aucune fluorescence n’est détectable pour le parasite Toxo tgmicl-3 KO - 2G, alors que 2 fluorescences sont détectées pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll Cypl Icrel obtenue, (figure 42)

La souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll Cypl Icrel est validée par immunofluorescence.

160 multiplie et lyse le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50μΜ - possible qu’en cas d’absence du gène TK).

Alors que la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll Cypl est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (ΙμΜ - grâce à la présence du gène DHFR*) et qu’elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50μΜ - à cause de la présence du gène TK), la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll Cypl Icrel n’est plus capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (ΙμΜ - grâce à la perte du gène DHFR*) alors qu’elle est redevenue capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50μΜ - grâce à la perte du gène TK). Ce profil de résistance (résistance au ganciclovir et sensible à la pyriméthamine) permet de confirmer la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO : 134 suite à l’action de la méganucléase I-Crel.

L’ensemble des résultats permet de valider la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll Cypl Icrel.

C. Construction de la souche Toxo tgmic/-3 KO - 2G Kmpll Cypl Nh36

L’électroporation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll Cypl Icrel avec le plasmide pUC18 4G2 ICrel - Nh36 SEQ ID NO : 266a été réalisée selon le protocole décrit (point a). Les clones obtenus résistants à la pyriméthamine sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence des gènes d’intérêt kmpll, cypl et nh36 et l’expression des protéines Kmpll SEQ ID NO :259, Cypl SEQ ID NO : 279 etNh36 SEQ ID NO : 269.

Validation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll Cypl Nh36par PCR

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO : 250 (Mix Gène d’intérêt) permettent de mettre en évidence respectivement une bande à 510 paires de bases conformément à la taille de bande attendue pour kmpll, une bande à 762 paires de bases conformément à la taille de bande attendue pour cypl et une bande à 1188 paires de bases conformément à la taille de bande attendue pour nh36 pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpl 1 Cypl Nh36, confirmant la présence des gènes kmpll, cypl et nh36 dans cette souche. Ces bandes ne sont pas détectées dans la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G confirmant l’absence de ces gènes dans la souche de départ et la souche électroporée Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll Cypl Icrel ne présente que

161 les bandes à 510 et 762 paires de bases conformément à la taille de bande attendue pour kpmll et cypl. (figure 40)

La souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll Cypl Nh36 est validée par PCR.

Validation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll Cypl Nh36 par immunofluorescence

Les résultats montrent qu’avec l’anticorps anti tag HA aucune fluorescence n’est détectable pour les parasites Toxo tgmicl-3 KO - 2G, alors qu’une fluorescence est détectée sur les parasites de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2GKmpll Cypl obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine Cypl couplé à l’épitope HA SEQ ID NO :277.

Les résultats montrent qu’avec l’anticorps anti V5 aucune fluorescence n’est détectable pour le parasite Toxo tgmicl-3 KO - 2G et Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll Cypl Icrel, alors qu’une fluorescence est détectée pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll Cypl Nh36 obtenue.

Les résultats montrent qu’avec l’anticorps anti Myc aucune fluorescence n’est détectable pour le parasite Toxo tgmicl-3 KO - 2G, alors qu’une fluorescence est détectée pour les parasites Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll Cypl Icrel et la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll Cypl Nh36 obtenue.

Dans un même temps, chaque antigène (Kmpll, Cypl et Nh36) a été marqué avec leur anticorps spécifique (respectivement anti Myc, anti tag HA et anti V5) couplé à des fluorochromes différents. Les fluorescences ont été analysées en FAC S. Les résultats montrent qu’aucune fluorescence n’est détectable pour le parasite Toxo tgmicl-3 KO - 2G, alors que 3 fluorescences sont détectées pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpl 1 Cypl Nh36 obtenue, (figure 43)

La souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll Cypl Nh36 est validée par immunofluorescence.

162

La souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll Cypl Icrel est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (ΙμΜ - pas de gène DHFR*) mais elle se multiplie et lyse le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50μΜ possible qu’en cas d’absence du gène TK).

La souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpl 1 Cypl Nh36 est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (ΙμΜ - grâce à la présence du gène DHFR*) alors qu’elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50μΜ - à cause de la présence du gène TK). Ce profil de résistance (sensible au ganciclovir et résistance à la pyriméthamine) permet de confirmer l’intégration du plasmide pUC18 4G2 ICrel - Nh36 SEQ ID NO : 266 dans la souche Toxo tgmicl-3 KO 2GKmpll Cypl Nh36.

L’ensemble des résultats permet de valider la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Kmpll Cypl Nh36.

Exemple 11 : Construction d’une souche Neo ncmicl-3 K0-2G exprimant un ou plusieurs antigènes du parasite Leishmania infantum et ne comportant pas de gène de sélection

Souches de Neospora caninum

Les tachyzoïtes de la souche Neo ncmic7-3 KO 2G sont produits sur fibroblastes humains (HFF Hs27 ATCC CRL-1634)) cultivés en milieu minimal de Dulbecco (DMEM) supplémenté par 10% de sérum de veau fœtal (SVF), 2mM glutamine, lOOU/mL de pénicilline et lOOU/mL de streptomycine. Ils ont été récoltés après lyse mécanique des cellules hôtes par 3 passages en seringue 25G.

Construction des souches - protocole

163 temps détaillé ici puis appliqué pour chaque construction de souche vaccinale, celui-ci comporte plusieurs étapes :

a- Electroporation et sélection de la souche d’intérêt avec le plasmide exprimant un antigène du parasite Leishmania infantum : souches Neo ncmicl-3 KO - 2GLeishmania

Les parasites Neo ncmicl-3 KO - 2G sont électroporés avec 20pg de plasmide pUC18 4G2 ICrel - Leishmania linéarisé. Par « plasmide pUC18 4G2 ICrel - Leishmania », on entend le plasmide pUC18 4G2 ICrel - Kmpll SEQ ID NO :256, le plasmide pUC18 4G2 ICrel Nh36 SEQ ID NO :266, ou le plasmide pUC18 4G2 ICrel - Cypl. Après électroporation, les tachyzoïtes sont soumis à une pression de sélection par l’agent de sélection (Pyriméthamine 4μΜ). 10 à 15 jours après sélection et passages successifs sur cellules HFF, les parasites sont sous-clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF puis amplifiés en plaques 24 puits sur une monocouche de cellules HFF.

b- Validation de la souche ayant intégré le plasmide par PCR

Pour valider une souche Neo ncmicl-3 KO - 2G Leishmania, des analyses PCR sont effectuées selon le même protocole que celui utilisé dans l’exemple 10 - point b. Les tailles attendues sont également décrites dans le Tableau 31 ci-dessous.

Tableau 31 : Taille attendue des amplicons (en paires de base) des différentes PCR de validation de la construction des souches Neo ncmicl-3 KO - 2GLeishmania

	Gène d’intérêt Leishmania
Neo ncmicl-3 KO - 2GNh36	1188
Neo ncmicl-3 KO - 2G Cypl	762
Neo ncmicl-3 KO - 2G Cypl Nh36	1188/762

c- Validation de la souche ayant intégré le plasmide par immunofluorescence

La validation des souches par immunofluorescence se fait suivant le protocole précédemment décrit (point c- exemple 10).

Le profil d’antibiorésistance est analysé pour les clones validés en PCR et immunofluorescence. Les tachyzoïtes (de 1.10⁵ à 5.10⁵) sont cultivés 5 jours sur une monocouche de cellules HFF. Les parasites Neo ncmicl-3 KO - 2G Leishmania ayant intégré

164 un plasmide pUC18 4G2 ICrel - Leishmania linéarisé doivent être résistants à la pyriméthamine (4μΜ - grâce à la présence du gène DHFR*) et sensible au ganciclovir (50μΜ

- à cause de la présence du gène TK). Ce profil de résistance est validé en cultivant les parasites sur fibroblastes humains (HFF Hs27 ATCC CRL-1634)) cultivés en milieu minimal de Dulbecco (DMEM) supplémenté par 10% de sérum de veau fœtal (SVF), 2mM glutamine, 100 U/mL de pénicilline et 100 U/mL de streptomycine, supplémenté ou non de la pyriméthamine ou du ganciclovir.

Les souches validées par PCR, immunofluorescence et ayant le bon profil d’antibiorésistance sont nommées Neo ncmicl-3 KO - 2G Leishmania (Neo ncmicl-3 KO

- 2G Nh36, Neo ncmicl-3 KO - 2G Cypl ou Neo ncmicl-3 KO - 2G Cypl Nh36).

e- Electroporation de la Neo ncmicl-3 KO - 2G Leishmania avec un plasmide pTsaglIcrelaPy et contre sélection de la souche ayant perdu la cassette de sélection DHFR*-TY-TK : souches Neo ncmicl-3 KO - 2G Leishmania Icrel

Pour valider une souche Neo ncmicl-3 KO - 2G Leishmania Icrel, des analyses PCR sont effectuées selon le même protocole que celui utilisé dans l’exemple 10 - point b et f. Les tailles attendues sont également décrites dans le Tableau 32 ci-dessous. Plusieurs mix sont possibles et les PCR sont réalisées en fonction des souches testées.

Tableau 32 : Taille attendue des amplicons (en paires de base) des différentes PCR de validation de la construction des souches Neo ncmicl-3 KO - 2GLeishmania.

	Gène d’intérêt Leishmania	Mix Icrel Gène d’intérêt et cicatrice
Neo ncmicl-3 KO - 2GNh36	1188	6521
Neo ncmicl-3 KO - 2G Cypl	762	6095
Neo ncmicl-3 KO - 2G Cypl Icrel	762	1251
Neo ncmicl-3 KO - 2G Cypl Nh36	762/1188	1677
Neo ncmicl-3 KO - 2G Cypl Nh36 Icrel	762/1188	1251/1677

165 g- Validation de la souche ayant perdu la cassette de sélection DHFR*-TY-TK par immunofluorescence

Les parasites Neo ncmicl-3 KO - 2G Leishmania ayant perdu la cassette de sélection DHFR*-TY-TK doivent être sensibles à la pyriméthamine (4μΜ - grâce à la suppression du gène DHFR*) et résistants au ganciclovir (50μΜ - grâce à la suppression du gène TK). Ce profil de résistance est validé en cultivant les parasites sur fibroblastes humains (HFF Hs27 ATCC CRL-1634) en milieu minimal de Dulbecco (DMEM) supplémenté par 10% de sérum de veau fœtal (SVF), 2mM glutamine, 100 U/mL de pénicilline et 100 U/mL de streptomycine, supplémenté ou non de la pyriméthamine ou du ganciclovir.

Les souches validées par PCR, immunofluorescence et ayant le bon profil d’antibiorésistance sont nommées Neo ncmicl-3 KO - 2G Leishmania Icrel ( Neo ncmicl-3 KO - 2G Cypl Icrel ou Neo ncmicl-3 KO - 2G Cypl Nh36 ICrel).

Résultats - Construction des souches exprimant un antigène du parasite Leishmania infantum et ne comportant pas de gène de sélection

A. Construction de la souche Neo ncmic/-3 KO - 2G Nh36Icrel

1. Construction de la souche Neo ncmic/-3 KO - 2G Nh36

L’électroporation de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G avec le plasmide pUC18 4G2 ICrel Nh36 SEQ ID NO :266 a été réalisée selon le protocole décrit (point a). Les clones obtenus résistants à la pyriméthamine sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence du gène d’intérêt nh36 et l’expression de la protéine.

Validation de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G Nh36 par PCR

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO : 250 (Mix Gène d’intérêt Leishmania) permettent de mettre en évidence une bande à 1188 paires de bases pour la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G

166

Nh36, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène nh36 dans cette souche. Cette bande n’est pas détectée dans la souche Neo ncmic7-3 KO - 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ, (figure 44)

La souche Neo ncmicl-3 KO - 2G Nh36 est validée par PCR.

Validation de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G Nh36 par immunofluorescence

Les résultats montrent qu’avec l’anticorps anti V5 aucune fluorescence n’est détectable pour le parasite Neo ncmic7-3 KO - 2G, alors qu’une fluorescence est détectée dans les parasites et dans les vacuoles parasitophores de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G Nh36 obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine Nh36 SEQ ID NO :269. (figure 45)

La souche Neo ncmicl-3 KO - 2G Nh36 est validée par immunofluorescence.

La souche Neo ncmicl-3 KO - 2G Nh36 est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (4μΜ - grâce à la présence du gène DHFR*) alors qu’elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50μΜ - à cause de la présence du gène TK). Ce profil de résistance (sensible au ganciclovir et résistance à la pyriméthamine) permet de confirmer l’intégration du plasmide pUC18 4G2 ICrel - Nh36 SEQ ID NO : 266 dans la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G Nh36.

L’ensemble des résultats permet de valider la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G Nh36.

2. Construction de la souche Neo ncmic/-3 KO - 2G Nh36Icrel

L’électroporation de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G Nh36 avec le plasmide pTsaglIcrel αβγ circulaire SEQ ID NO : 178 a été réalisée selon le protocole décrit (point e).

167

Immunofluorescence pour valider la présence du gène d’intérêt nh36 et l’expression de la protéine Nh36 SEQ ID NO :269 et pour valider la suppression de la cassette de résistance DHFR*TYTK SEQ ID NO : 134.

Validation de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G Nh36 Icrelpar PCR

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO : 250 (Mix Gène d’intérêt Leishmania) permettent de mettre en évidence une bande à 1188 paires de bases pour la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G Nh36 Icrel, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène nh36 dans cette souche. Cette bande n’est pas détectée dans la souche Neo ncmic7-3 KO - 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces MC4 SEQ ID NO :286 et MCI SEQ ID NO : 254 (Mix Icrel Gène d’intérêt et cicatrice) permettent de mettre en évidence une bande à 1677 paires de bases pour la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G Nh36 Icrel, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène nh36 et la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO : 134 dans cette souche. Cette bande n’est pas détectée dans la souche Neo ncmic7-3 KO - 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

La souche Neo ncmicl-3 KO - 2G Nh36 Icrel est validée par PCR.

Validation de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G Nh36 Icrelpar immunofluorescence Les résultats montrent qu’avec l’anticorps anti V5 aucune fluorescence n’est détectable pour le parasite Neo ncmic7-3 KO - 2G, alors qu’une fluorescence est détectée dans les parasites et dans les vacuoles parasitophores de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G Nh36 Icrel obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine Nh36 SEQ ID NO :269 La souche Neo ncmicl-3 KO - 2G Nh36 Icrel est validée par immunofluorescence.

La souche Neo ncmicl-3 KO - 2G est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (4μΜ - pas de gène DHFR*) mais elle se

168 multiplie et lyse le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50μΜ - possible qu’en cas d’absence du gène TK).

Alors que la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G Nh36 est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (4μΜ - grâce à la présence du gène DHFR*) et qu’elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50μΜ - à cause de la présence du gène TK), la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G Nh36 Icrel n’est plus capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (4μΜ - grâce à la perte du gène DHFR*) alors qu’elle est redevenue capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50μΜ - grâce à la perte du gène TK). Ce profil de résistance (résistance au ganciclovir et sensible à la pyriméthamine) permet de confirmer la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO : 134 suite à l’action de la méganucléase I-Crel.

L’ensemble des résultats permet de valider la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G Nh36 Icrel.

B. Construction de la souche Neo ncmic/-3 KO - 2G Cypl Icrel

1. Construction de la souche Neo ncmic/-3 KO - 2G Cypl

L’électroporation de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G avec le plasmide pUC18 4G2 ICrel Cypl SEQ ID NO :276 a été réalisée selon le protocole décrit (point a). Les clones obtenus résistants à la pyriméthamine sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence du gène d’intérêt cypl et l’expression de la protéine Cypl SEQ ID NO :279.

Validation de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G Cypl par PCR

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO : 250 (Mix Gène d’intérêt Leishmania) permettent de mettre en évidence une bande à 762 paires de bases pour la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G Cypl, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène cypl dans cette souche. Cette bande n’est pas détectée dans la souche Neo ncmic7-3 KO - 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ, (figure 44)

La souche Neo ncmicl-3 KO - 2G Cypl est validée par PCR.

169

Validation de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G Cypl par immunofluorescence

Les résultats montrent qu’avec l’anticorps anti tag HA aucune fluorescence n’est détectable pour le parasite Neo ncmic7-3 KO - 2G, alors qu’une fluorescence est détectée dans les parasites et dans les vacuoles parasitophores de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G Cypl obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine Cypl SEQ ID NO :279. (figure 45)

La souche Neo ncmicl-3 KO - 2G Cypl est validée par immunofluorescence.

La souche Neo ncmicl-3 KO - 2G Cypl est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (4μΜ - grâce à la présence du gène DHFR*) alors qu’elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50μΜ - à cause de la présence du gène TK). Ce profil de résistance (sensible au ganciclovir et résistance à la pyriméthamine) permet de confirmer l’intégration du plasmide pUC18 4G2 ICrel - Cypl SEQ ID NO : 276 dans la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G Cypl.

L’ensemble des résultats permet de valider la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G Cypl.

2. Construction de la souche Neo ncmic/-3 KO - 2G Cypl Icrel

L’électroporation de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G Cypl avec le plasmide pTsaglIcrel αβγ circulaire SEQ ID NO : 178 a été réalisée selon le protocole décrit (point e). Les clones obtenus résistants au ganciclovir sont sélectionnés et analysés par PCR et

Immunofluorescence pour valider la présence du gène d’intérêt cypl et l’expression de la protéine Cypl SEQ ID NO :279 et pour valider la suppression de la cassette de résistance DHFR*TYTK SEQ ID NO : 134.

170

Validation de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G Cypl Icrelpar PCR

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO : 250 (Mix Gène d’intérêt Leishmania) permettent de mettre en évidence une bande à 762 paires de bases pour la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G Cypl Icrel, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène cypl dans cette souche. Cette bande n’est pas détectée dans la souche Neo ncmic7-3 KO - 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces MC4 SEQ ID NO :286 et MCI SEQ ID NO : 254 (Mix Icrel Gène d’intérêt et cicatrice) permettent de mettre en évidence une bande à 1251 paires de bases pour la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G Cypl Icrel, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène cypl et la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO : 134 dans cette souche. Cette bande n’est pas détectée dans la souche Neo ncmic7-3 KO - 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

La souche Neo ncmicl-3 KO - 2G Cypl Icrel est validée par PCR.

Validation de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G Cypl Icrelpar immunofluorescence

Les résultats montrent qu’avec l’anticorps anti tag HA aucune fluorescence n’est détectable pour le parasite Neo ncmic7-3 KO - 2G, alors qu’une fluorescence est détectée dans les parasites et dans les vacuoles parasitophores de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G Cypl Icrel obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine Cypl SEQ ID NO :279.

La souche Neo ncmicl-3 KO - 2G Cypl Icrel est validée par immunofluorescence.

171

Alors que la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G Cypl est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (4μΜ - grâce à la présence du gène DHFR*) et qu’elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50μΜ - à cause de la présence du gène TK), la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G Cypl Icrel n’est plus capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (4μΜ - grâce à la perte du gène DHFR*) alors qu’elle est redevenue capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50μΜ - grâce à la perte du gène TK). Ce profil de résistance (résistance au ganciclovir et sensible à la pyriméthamine) permet de confirmer la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO : 134 suite à l’action de la méganucléase I-Crel.

L’ensemble des résultats permet de valider la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G Cypl Icrel.

Résultats - Construction des souches exprimant plusieurs antigènes du parasite Leishmania infantum et comportant ou non un de gène de sélection

A. Construction de la souche Neo ncmic/-3 KO - 2G Cypl Nh36Icrel

1. Construction de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G Cypl Nh36

L’électroporation de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G Cypl Icrel avec le plasmide pUC18 4G2 ICrel - Nh36 SEQ ID NO : 266 a été réalisée selon le protocole décrit (point a). Les clones obtenus résistants à la pyriméthamine sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence des gènes d’intérêt cypl et nh36 et l’expression des protéines Cypl SEQ ID NO :279 etNh36 SEQ ID NO :269.

Validation de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G Cypl Nh36 par PCR

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO : 250 (Mix Gène d’intérêt Leishmania) permettent de mettre en évidence respectivement une bande à 762 paires de bases conformément à la taille de bande attendue pour cypl et une bande à 1188 paires de bases conformément à la taille de bande attendue pour nh36 pour la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G Cypl Nh36, confirmant la présence des gènes cypl et nh36 dans cette souche. Ces bandes ne sont pas détectées dans la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ et la

172 souche électroporée Neo ncmicl-3 KO - 2G Cypl Icrel ne présente que la bande à 762 paires de bases conformément à la taille de bande attendue pour cypl. (figure 44)

La souche Neo ncmicl-3 KO - 2G Cypl Nh36 est validée par PCR.

Validation de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G Cypl Nh36 par immunofluorescence

Les résultats montrent qu’avec l’anticorps anti tag HA aucune fluorescence n’est détectable pour le parasite Neo ncmic7-3 KO - 2G, alors qu’une fluorescence est détectée sur les parasites de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G Cypl Nh36 obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine Cypl SEQ ID NO :279. (figure 45)

Les résultats montrent qu’avec l’anticorps anti V5 aucune fluorescence n’est détectable pour le parasite Neo ncmic7-3 KO - 2G, alors qu’une fluorescence est détectée pour les parasites Neo ncmicl-3 KO - 2G Cypl Icrel et la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G Cypl Nh36 obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine Nh36 SEQ ID NO :269. (figure 45)

Les résultats montrent qu’après un double marquage avec les anticorps anti tag HA et anti V5 aucune fluorescence n’est détectable pour le parasite Neo ncmicl-3 KO - 2G, alors que 2 fluorescences sont détectées pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Cypl Nh36 obtenue, (figure 45)

La souche Neo ncmicl-3 KO - 2G Cypl Nh36 est validée par immunofluorescence.

La souche Neo ncmicl-3 KO - 2G Cypl Icrel est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (4μΜ - pas de gène DHFR*) mais elle se multiplie et lyse le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50μΜ - possible qu’en cas d’absence du gène TK).

La souche Neo ncmicl-3 KO - 2G Cypl Nh36 est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (4μΜ - grâce à la présence du gène DHFR*) alors qu’elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50μΜ - à cause de la présence du gène TK). Ce profil de résistance (sensible au ganciclovir et résistance à la pyriméthamine) permet de confirmer l’intégration du

173 plasmide pUC18 4G2 ICrel -Nh36 SEQ ID NO : 266 dans la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G Cypl Nh36.

L’ensemble des résultats permet de valider la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G Cypl Nh36.

2. Construction de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G Cypl Nh36 Icrel

L’électroporation de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G Cypl Nh36 avec le plasmide pTsaglIcrel αβγ circulaire SEQ ID NO : 178 a été réalisée selon le protocole décrit (point e). Les clones obtenus résistants au ganciclovir sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence des gènes d’intérêt cypl et nh36 et l’expression des protéines Cypl SEQ ID NO :279 et Nh36 SEQ ID NO :269 et pour valider la suppression de la cassette de résistance DHFR*TYTK SEQ ID NO : 134.

Validation de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G Cypl Nh36 Icrelpar PCR

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO : 250 (Mix Gène d’intérêt Leishmania) permettent de mettre en évidence respectivement une bande à 762 paires de bases conformément à la taille de bande attendue pour cypl et une bande à 1188 paires de bases conformément à la taille de bande attendue pour nh36 pour la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G Cypl Nh36 Icrel, confirmant la présence des gènes cypl et nh36 dans cette souche. Ces bandes ne sont pas détectées dans la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ et la souche électroporée Neo ncmicl-3 KO - 2G Cypl Nh36 présente les deux bandes (à 762 et 1188 paires de bases) conformément à la taille de bande attendue pour cypl et nh36.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces MC4 SEQ ID NO :xx et MCI SEQ ID NO : xx (Mix Icrel Gène d’intérêt et cicatrice) permettent de mettre en évidence deux bande à 1251 et 1677 paires de bases pour la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G Cypl Nh36 Icrel, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence des gènes cypl et nh36 et la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO : 134 dans cette souche. La bande à 1677 n’est pas détectée dans la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G Cypl Nh36 confirmant l’absence de la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO : 134 dans cette souche.

La souche Neo ncmicl-3 KO - 2G Cypl Nh36 Icrel est validée par PCR.

174

Validation de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G Nh36 Cypl Icrel par immunofluorescence

Les résultats montrent qu’avec l’anticorps anti tag HA aucune fluorescence n’est détectable pour le parasite Neo ncmic7-3 KO - 2G, alors qu’une fluorescence est détectée sur les parasites de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G Cypl Nh36 Icrel obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine Cypl SEQ ID NO :279.

Les résultats montrent qu’avec l’anticorps anti V5 aucune fluorescence n’est détectable pour le parasite Neo ncmic7-3 KO - 2G, alors qu’une fluorescence est détectée pour les parasites Neo ncmicl-3 KO - 2G Cypl Icrel et la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G Cypl Nh36 Icrel obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine Nh36 SEQ ID NO :269.

Les résultats montrent qu’après un double marquage avec les anticorps anti tag HA et anti V5 aucune fluorescence n’est détectable pour le parasite Neo ncmicl-3 KO - 2G, alors que 2 fluorescences sont détectées pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Cypl Nh36 Icrel obtenue.

La souche Neo ncmicl-3 KO - 2G Cypl Nh36 Icrel est validée par immunofluorescence.

Alors que la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G Cypl Nh36 est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (4μΜ - grâce à la présence du gène DHFR*) et qu’elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50μΜ - à cause de la présence du gène TK), la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G Cypl Nh36 Icrel n’est plus capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (4μΜ - grâce à la perte du gène DHFR*) alors qu’elle est redevenue capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50μΜ - grâce à la perte du gène TK). Ce profil de résistance

175 (résistance au ganciclovir et sensible à la pyriméthamine) permet de confirmer la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO : 134 suite à l’action de la méganucléase I-Crel.

L’ensemble des résultats permet de valider la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G Cypl Nh36 Icrel.

Exemple 12 : Construction de plasmides permettant l’intégration et l’expression de transgènes de la bactérie Chlamydia abortus dans des souches de Toxoplasma gondii et Neospora caninum sans persistance d’une cassette de sélection.

L’objectif de cette expérience est de construire des plasmides qui permettent l’intégration dans le génome de Toxoplasma gondii ou dans celui de Neospora caninum d’un transgène hétérologue du virus Chlamydia abortus, son expression et sans persistance d’une cassette de sélection.

• Plasmide pUC18 4G2 CPAE

Le plasmide pUC18 4G2 ICrel - CP AF SEQ ID NO : 287 (figure 46) permet la production d’une protéine de fusion CP AF tag V5 SEQ ID NO : 288, comprenant :

> une partie de la protéine CP AF SEQ ID NO : 289 de Chlamydia abortus codée par la séquence SEQ ID NO : 290, > un tag V5 SEQ ID NO : 270 codée par la séquence SEQ ID NO : 271

Le fragment cpaf-V5 a été obtenu à partir d’une digestion par les enzymes Pmel et Notl sur un gène synthétique optimisé pour son expression chez Toxoplasma gondii (SEQ ID NO : 293) Cette séquence digérée a une de taille de 1870 pb SEQ ID NO : 294.

Le fragment cpaf-V5 digéré (SEQ ID NO : 294) a été directement cloné dans le plasmide pUC18 4G2 ICrel SEQ ID NO : 128 digéré par les enzymes Pmel et Notl (8344pb).

176 • Plasmide pUC18 4G2 MOMP

Le plasmide pUC18 4G2 ICrel - MOMP SEQ ID NO : 295 (figure 47) permet la production d’une protéine de fusion MOMP tag myc SEQ ID NO : 296, comprenant :

> la protéine MOMP SEQ ID NO : 297 de Chlamydia abortus codée par la séquence SEQ ID NO : 298, > un tag myc SEQ ID NO : 260 codée par la séquence SEQ ID NO : 261

Le fragment momp-myc a été obtenu à partir d’une digestion par les enzymes Pmel et Notl sur un gène synthétique optimisé pour son expression chez Toxoplasma gondii (SEQ ID NO : 301)

Cette séquence digérée a une de taille de 1216 pb SEQ ID NO : 302.

Le fragment momp-myc digéré (SEQ ID NO : 302) a été directement clonés dans le plasmide pUC18 4G2 ICrel SEQ ID NO : 128 digéré par les enzymes Pmel et Notl (8344pb).

• Plasmide pUC18 4G2 PmpG

Le plasmide pUC18 4G2 ICrel - PmpG SEQ ID NO : 303 (figure 48) permet la production d’une protéine de fusion PmpG tag VSV SEQ ID NO : 304, comprenant :

> Une partie protéine PmpG SEQ ID NO : 305 de Chlamydia abortus codée par la séquence SEQ ID NO : 306, > un tag VSV SEQ ID NO : 299 codée par la séquence SEQ ID NO : 300

Le fragmentpmpG-VSV a été obtenu à partir d’une digestion par les enzymes Pmel et Notl sur un gène synthétique optimisé pour son expression chez Toxoplasma gondii (SEQ ID NO : 291) Cette séquence digérée a une de taille de 1420 pb SEQ ID NO : 292.

Le fragmentpmpG-VSV digéré (SEQ ID NO : 292) a été directement cloné dans le plasmide pUC18 4G2 ICrel SEQ ID NO : 128 digéré par les enzymes Pmel et Notl (8344pb).

177

Exemple 13 : Construction d’une souche Toxo tgmicl-3 K0-2G exprimant un ou plusieurs antigènes de la bactérie Chlamydia abortus et ne comportant pas de gène de sélection

Souches de Toxoplasma gondii

Les tachyzoïtes de la souche Toxo tgmic7-3 KO 2G sont produits sur fibroblastes humains (HFF Hs27 ATCC CRL-1634)) cultivés en milieu minimal de Dulbecco (DMEM) supplémenté par 10% de sérum de veau fœtal (SVF), 2mM glutamine, 100 U/mL de pénicilline et 100 U/mL de streptomycine. Ils ont été récoltés après lyse mécanique des cellules hôtes par 3 passages en seringue 25G.

Construction des souches - protocole

a- Electroporation et sélection de la souche d’intérêt avec le plasmide exprimant un antigène de la bactérie Chlamydia abortus : souches Toxo tgmicl-3 KO - 2G Chlamydia

Les parasites Toxo tgmicl-3 KO - 2G sont électroporés avec 20pg de plasmide pUC18 4G2 ICrel - Chlamydia linéarisé. Par « de plasmide pUC18 4G2 ICrel - Chlamydia », on entend le plasmide pUC18 4G2 ICrel - CP AF, le plasmide pUC18 4G2 ICrel - MOMP ou le plasmide pUC18 4G2 ICrel - PmpG. Après électroporation, les tachyzoïtes sont soumis à une pression de sélection par l’agent de sélection (Pyriméthamine ΙμΜ). 10 à 15 jours après sélection et passages successifs sur cellules HFF, les parasites sont sous-clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF puis amplifiés en plaques 24 puits sur une monocouche de cellules HFF.

178 b- Validation de la souche ayant intégré le plasmide par PCR

Pour valider une souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Chlamydia, des analyses PCR sont effectuées selon le même protocole que celui utilisé dans l’exemple 10 - point b. Les tailles attendues sont également décrites dans le Tableau 33 ci-dessous.

Tableau 33 : Taille attendue des amplicons (en paires de base) des différentes PCR de validation de la construction des souches Toxo tgmicl-3 KO - 2G Chlamydia

	Gène d’intérêt Chlamydia
Toxo tgmicl-3 KO - 2G CPAF	2055
Toxo tgmicl-3 KO - 2G MOMP	1401
Toxo tgmicl-3 KO - 2G PmpG	1605

c- Validation de la souche ayant intégré le plasmide par immunofluorescence

d- Validation de la souche ayant intégré le plasmide par Western Blot

Le western blot a été réalisé soit sur des extraits protéiques de parasites (40 pg équivalents à 2.107 parasites), soit à partir de protéines purifiées en système procaryote (1 pg).

Pour l’obtention d’extraits protéiques de parasite, un culot a été repris dans 19 pl de tampon DNase IX en tampon PB S (phosphate buffered saline, Sigma), et 1 pl de DNase, avant une incubation à 37 °C durant 20 min. A Tissu de cette incubation, le tampon Laemmli 4X (BioRad) a été ajouté, avant une nouvelle incubation de 5 min à 100 °C. Après 5 min dans la glace, les échantillons ont été déposés sur gel SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) contenant 12 ou 14% d’acrylamide pré-coulés (Miniprotean® TGXTM BioRad), et un marqueur de taille a également été déposé (Page ruler prestained protein ladder, Thermo Scientific) pour suivre la migration. Après migration des échantillons pendant environ 35 min à 200 volts (générateur PowerPacTM) en tampon TGS (Tris glycine SDS Buffer, BioRad), le gel a été déposé sur une membrane de nitrocellulose (TransBlot® TurboTM Blotting System Transfer Pack, BioRad) pour un transfert actif grâce au TransBlot® TurboTM (BioRad). Après transfert, la membrane a été colorée au rouge Ponceau pour vérifier le transfert des protéines. La membrane a ensuite été rincée à l’eau milliQ avant d’être saturée avec du TBS (tris-buffered saline) lX/Tween 0,05% - BSA 3% pendant 1 h sous agitation à température ambiante. L’anticorps primaire (Rabbit anti Tag

179

VSV-V référence V4888 - Sigma) a ensuite été ajouté, après dilution en TBS lX/Tween 0,05% - BSA 3%, et la membrane a été incubée pendant 1 h sous agitation à température ambiante. Après lavages avec du TBS lX/Tween 0,05%, la membrane a été incubée avec l’anticorps secondaire couplé à la phosphatase alcaline (Goat anti Rabbit référence A3687 Sigma)), dilué en TBS lX/Tween 0,05% - BSA 3%, pendant 1 h sous agitation à température ambiante. La révélation a été réalisée avec le NBT/BCIP (Promega) selon les recommandations du fournisseur. La réaction a été stoppée par ajout d’eau milliQ, et la membrane a été séchée sur papier Whatman.

e- Validation de la souche ayant intégré le plasmide par analyse du profil de résistance

Le profil d’antibiorésistance est analysé pour les clones validés en PCR et immunofluorescence. Les tachyzoïtes (de 1.10⁵ à 5.10⁵) sont cultivés 5 jours sur une monocouche de cellules HFF. Les parasites Toxo tgmicl-3 KO - 2G Chlamydia ayant intégré un plasmide pUC18 4G2 ICrel - Chlamydia linéarisé doivent être résistants à la pyriméthamine (ΙμΜ - grâce à la présence du gène DHFR*) et sensible au ganciclovir (50μΜ - à cause de la présence du gène TK). Ce profil de résistance est validé en cultivant les parasites sur fibroblastes humains (HFF Hs27 ATCC CRL-1634)) cultivés en milieu minimal de Dulbecco (DMEM) supplémenté par 10% de sérum de veau fœtal (SVF), 2mM glutamine, lOOU/mL de pénicilline et lOOU/mL de streptomycine, supplémenté ou non de la pyriméthamine ou du ganciclovir.

Les souches validées par PCR, immunofluorescence et ayant le bon profil d’antibiorésistance sont nommées Toxo tgmicl-3 KO - 2G Chlamydia (Toxo tgmicl-3 KO - 2G CP AF, Toxo tgmicl-3 KO - 2G MOMP ou Toxo tgmicl-3 KO - 2G PmpG).

f- Electroporation de la Toxo tgmicl-3 KO - 2G Chlamydia avec un plasmide pTsaglIcrelaPy et contre sélection de la souche ayant perdu la cassette de sélection DHFR*-TY-TK : souches Toxo tgmicl-3 KO - 2G Chlamydia Icrel

g- Validation des souches Toxo tgmicl-3 KO - 2G Chlamydia Icrel ayant perdu la cassette de sélection DHFR*-TY-TK par PCR

Pour valider une souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Chlamydia Icrel, des analyses PCR sont effectuées selon le même protocole que celui utilisé dans l’exemple 10 - point b et f. Les

180 tailles attendues sont également décrites dans le Tableau 34 ci-dessous. Plusieurs mix sont possibles et les PCR sont réalisées en fonction des souches testées.

Tableau 34 : Taille attendue des amplicons (en paires de base) des différentes PCR de validation de la construction des souches Toxo tgmicl-3 KO - 2G Chlamydia et Toxo tgmicl-3 KO - 2G Chlamydia Icrel.

	Gène d’intérêt Chlamydia	Mix Icrel Gène d’intérêt Chlamydia et cicatrice
Toxo tgmicl-3 KO - 2G CPAF	2055	7388
Toxo tgmicl-3 KO - 2G MOMP	1401	6734
Toxo tgmicl-3 KO - 2G PmpG	1605	6938
Toxo tgmicl-3 KO - 2G CPAF Icrel	2055	2544
Toxo tgmicl-3 KO - 2G MOMP Icrel	1401	1890
Toxo tgmicl-3 KO - 2G PmpG ICrel	1605	2094

h- Validation de la souche ayant perdu la cassette de sélection DHFR*-TY-TK par immunofluorescence

i- Validation de la souche ayant perdu la cassette de sélection DHFR*-TY-TK par analyse du profil de résistance

Les parasites Toxo tgmicl-3 KO - 2G Chlamydia Icrel ayant perdu la cassette de sélection DHFR*-TY-TK SEQ ID NO : 134 doivent être sensibles à la pyriméthamine (ΙμΜ - grâce à la suppression du gène DHFR*) et résistants au ganciclovir (50μΜ - grâce à la suppression du gène TK). Ce profil de résistance est validé en cultivant les parasites sur fibroblastes humains (HFF Hs27 ATCC CRL-1634) en milieu minimal de Dulbecco (DMEM) supplémenté par 10% de sérum de veau fœtal (SVF), 2mM glutamine, 100 U/mL de pénicilline et 100 U/mL de streptomycine, supplémenté ou non de la pyriméthamine ou du ganciclovir.

181

Les souches validées par PCR, immunofluorescence et ayant le bon profil d’antibiorésistance sont nommées Toxo tgmicl-3 KO - 2G Chlamydia Icrel ( Toxo tgmicl-3 KO - 2G CPAF Icrel, Toxo tgmicl-3 KO - 2G MOMP Icrel ou Toxo tgmicl-3 KO - 2G PmpG ICrel).

Résultats - Construction des souches exprimant un antigène de la bactérie Chamydia abortus et ne comportant pas de gène de sélection

A. Construction de la souche Toxo tgmic/-3 KO - 2G CPAFIcrel

1. Construction de la souche Toxo tgmic/-3 KO - 2G CPAF

L’électroporation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G avec le plasmide pUC18 4G2 ICrel CPAF SEQ ID NO :287 a été réalisée selon le protocole décrit (point a). Les clones obtenus résistants à la pyriméthamine sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence du gène d’intérêt cpaf et l’expression de la protéine CPAF SEQ ID NO : 290.

Validation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G CPAF par PCR

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO : 250 (Mix Gène d’intérêt Chlamydia) permettent de mettre en évidence une bande à 2055 paires de bases pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G CPAF, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène cpaf dans cette souche. Cette bande n’est pas détectée dans la souche Toxo tgmic7-3 KO - 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ, (figure 49)

La souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G CPAF est validée par PCR.

Validation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G CPAFpar immunofluorescence

Les résultats montrent qu’avec l’anticorps anti V5 aucune fluorescence n’est détectable pour le parasite Toxo tgmic7-3 KO - 2G, alors qu’une fluorescence est détectée dans les parasites et dans les vacuoles parasitophores de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G CPAF obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine CPAF SEQ ID NO :289. (figure 50)

La souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G CPAF est validée par immunofluorescence.

182

La souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G CP AF est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (ΙμΜ - grâce à la présence du gène DHFR*) alors qu’elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50μΜ - à cause de la présence du gène TK). Ce profil de résistance (sensible au ganciclovir et résistance à la pyriméthamine) permet de confirmer l’intégration du plasmide pUC18 4G2 ICrel - CP AF SEQ ID NO : 287 dans la souche Toxo tgmicl-3 KO 2G CPAF.

L’ensemble des résultats permet de valider la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G CPAF.

2. Construction de la souche Toxo tgmic/-3 KO - 2G CPAFIcrel

L’électroporation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G CPAF avec le plasmide pTsaglIcrel αβγ circulaire SEQ ID NO : 178 a été réalisée selon le protocole décrit (point e). Les clones obtenus résistants au ganciclovir sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence du gène d’intérêt cpaf et l’expression de la protéine CPAF SEQ ID NO :289 et pour valider la suppression de la cassette de résistance DHFR*TYTK SEQ ID NO : 134.

Validation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G CPAF Icrelpar PCR

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO : 250 (Mix Gène d’intérêt Chlamydia) permettent de mettre en évidence une bande à 2055 paires de bases pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G CPAF Icrel, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène cpaf dans cette souche. Cette bande n’est pas détectée dans la souche Toxo tgmic7-3 KO - 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces MC4 SEQ ID NO :286 et MCI SEQ ID NO : 254 (Mix Icrel Gène d’intérêt et cicatrice) permettent de mettre en

183 évidence une bande à 2544 paires de bases pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G CP AF Icrel, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène cpaf et la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO : 134 dans cette souche. Cette bande n’est pas détectée dans les souches Toxo tgmic7-3 KO - 2G et Toxo tgmicl-3 KO - 2G CPAF confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

La souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G CPAF Icrel est validée par PCR.

Validation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G CPAF Icrelpar immunofluorescence Les résultats montrent qu’avec l’anticorps anti V5 aucune fluorescence n’est détectable pour le parasite Toxo tgmic7-3 KO - 2G, alors qu’une fluorescence est détectée dans les parasites et dans les vacuoles parasitophores de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G CPAF Icrel obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine CPAF SEQ ID NO :289.

La souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G CPAF Icrel est validée par immunofluorescence.

Alors que la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G CPAF est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (ΙμΜ - grâce à la présence du gène DHFR*) et qu’elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50μΜ - à cause de la présence du gène TK), la souche Toxo tgmicl3 KO - 2G CPAF Icrel n’est plus capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (ΙμΜ - grâce à la perte du gène DHFR*) alors qu’elle est redevenue capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50μΜ - grâce à la perte du gène TK). Ce profil de résistance (résistance au ganciclovir et sensible à la pyriméthamine) permet de confirmer la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO : 134 suite à l’action de la méganucléase I-Crel.

184

L’ensemble des résultats permet de valider la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G CP AF Icrel.

B. Construction de la souche Toxo tgmic/-3 KO - 2GMOMP Icrel

1. Construction de la souche Toxo tgmic/-3 KO - 2GM0MP

L’électroporation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G avec le plasmide pUC18 4G2 ICrel MOMP SEQ ID NO :295 a été réalisée selon le protocole décrit (point a). Les clones obtenus résistants à la pyriméthamine sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence du gène d’intérêt momp et l’expression de la protéine MOMP SEQ ID NO :297.

Validation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2GM0MP par PCR

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO : 250 (Mix Gène d’intérêt Chlamydia) permettent de mettre en évidence une bande à 1401 paires de bases pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G MOMP, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène momp dans cette souche. Cette bande n’est pas détectée dans la souche Toxo tgmic7-3 KO - 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ, (figure 49)

La souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G MOMP est validée par PCR.

Validation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2GM0MP par immunofluorescence

Les résultats montrent qu’avec l’anticorps anti tag Myc aucune fluorescence n’est détectable pour le parasite Toxo tgmic7-3 KO - 2G, alors qu’une fluorescence est détectée dans les parasites et dans les vacuoles parasitophores de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G MOMP obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine MOMP SEQ ID NO :297. (figure 50)

La souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G MOMP est validée par immunofluorescence.

185

La souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G MOMP est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (ΙμΜ - grâce à la présence du gène DHFR*) alors qu’elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50μΜ - à cause de la présence du gène TK). Ce profil de résistance (sensible au ganciclovir et résistance à la pyriméthamine) permet de confirmer l’intégration du plasmide pUC18 4G2 ICrel - MOMP SEQ ID NO : 295 dans la souche Toxo tgmicl-3 KO 2GM0MP.

L’ensemble des résultats permet de valider la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G MOMP.

2. Construction de la souche Toxo tgmic/-3 KO - 2GMOMP Icrel

L’électroporation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G MOMP avec le plasmide pTsaglIcrel αβγ circulaire SEQ ID NO : 178 a été réalisée selon le protocole décrit (point e). Les clones obtenus résistants au ganciclovir sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence du gène d’intérêt momp et l’expression de la protéine MOMP SEQ ID NO :297 et pour valider la suppression de la cassette de résistance DHFR*TYTK SEQ ID NO : 134.

Validation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2GM0MP Icrelpar PCR

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO : 250 (Mix Gène d’intérêt Chlamydia) permettent de mettre en évidence une bande à 1401 paires de bases pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G MOMP Icrel, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène momp dans cette souche. Cette bande n’est pas détectée dans la souche Toxo tgmic7-3 KO 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces MC4 SEQ ID NO :286 et MCI SEQ ID NO : 254 (Mix Icrel Gène d’intérêt et cicatrice) permettent de mettre en évidence une bande à 1890 paires de bases pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G MOMP Icrel, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène momp et la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO : 134 dans cette souche. Cette bande

186 n’est pas détectée dans les souches Toxo tgmic7-3 KO - 2G et Toxo tgmicl-3 KO - 2G MOMP confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

La souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G MOMP Icrel est validée par PCR.

Validation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G MOMP Icrel par immunofluorescence

Les résultats montrent qu’avec l’anticorps anti tag Myc aucune fluorescence n’est détectable pour le parasite Toxo tgmic7-3 KO - 2G, alors qu’une fluorescence est détectée dans les parasites et dans les vacuoles parasitophores de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G MOMP Icrel obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine MOMP SEQ ID NO :297.

La souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G MOMP Icrel est validée par immunofluorescence.

Alors que la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G MOMP est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (ΙμΜ - grâce à la présence du gène DHFR*) et qu’elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50μΜ - à cause de la présence du gène TK), la souche Toxo tgmicl3 KO - 2G MOMP Icrel n’est plus capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (ΙμΜ - grâce à la perte du gène DHFR*) alors qu’elle est redevenue capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50μΜ - grâce à la perte du gène TK). Ce profil de résistance (résistance au ganciclovir et sensible à la pyriméthamine) permet de confirmer la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO : 134 suite à l’action de la méganucléase I-Crel.

187

L’ensemble des résultats permet de valider la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G MOMP Icrel.

C. Construction de la souche Toxo tgmic/-3 KO - 2G PmpG Icrel

1. Construction de la souche Toxo tgmic/-3 KO - 2G PmpG

L’électroporation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G avec le plasmide pUC18 4G2 ICrel PmpG SEQ ID NO :303 a été réalisée selon le protocole décrit (point a). Les clones obtenus résistants à la pyriméthamine sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence du gène d’intérêtpmpG et l’expression de la protéine PmpG SEQ ID NO :305.

Validation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G PmpG par PCR

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO : 250 (Mix Gène d’intérêt Chlamydia) permettent de mettre en évidence une bande à 1605 paires de bases pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G PmpG, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène pmpG dans cette souche. Cette bande n’est pas détectée dans la souche Toxo tgmic7-3 KO - 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ, (figure 49)

La souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G PmpG est validée par PCR.

Validation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G PmpG par immunofluorescence

Les résultats montrent qu’avec l’anticorps anti tag VSV aucune fluorescence n’est détectable pour le parasite Toxo tgmic7-3 KO - 2G, alors qu’une fluorescence est détectée dans les parasites et dans les vacuoles parasitophores de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G PmpG obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine PmpG SEQ ID NO :305.

La souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G PmpG est validée par immunofluorescence.

Validation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G PmpG par Western Blot

Les résultats montrent qu’avec l’anticorps anti tag VSV aucune bande n’est détectable pour le parasite Toxo tgmic7-3 KO - 2G, alors qu’une bande à la taille attendue est détectée pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G PmpG obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine PmpG SEQ ID NO :305 (figure 52).

188

La souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G PmpG est validée par Western Blot.

La souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G PmpG est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (ΙμΜ - grâce à la présence du gène DHFR*) alors qu’elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50μΜ - à cause de la présence du gène TK). Ce profil de résistance (sensible au ganciclovir et résistance à la pyriméthamine) permet de confirmer l’intégration du plasmide pUC18 4G2 ICrel - PmpG SEQ ID NO : 303 dans la souche Toxo tgmicl-3 KO 2G PmpG.

L’ensemble des résultats permet de valider la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G PmpG.

2. Construction de la souche Toxo tgmic/-3 KO - 2G PmpG Icrel

L’électroporation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G PmpG avec le plasmide pTsaglIcrel αβγ circulaire SEQ ID NO : 178 a été réalisée selon le protocole décrit (point e). Les clones obtenus résistants au ganciclovir sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence du gène d’intérêt pmpG et l’expression de la protéine PmpG SEQ ID NO : 305 et pour valider la suppression de la cassette de résistance DHFR*TYTK SEQ ID NO : 134.

Validation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G PmpG Icrelpar PCR

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO : 250 (Mix Gène d’intérêt Chlamydia) permettent de mettre en évidence une bande à 1605 paires de bases pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G PmpG Icrel, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène pmpg dans cette souche. Cette bande n’est pas détectée dans la souche Toxo tgmic7-3 KO 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

189

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces MC4 SEQ ID NO :286 et MCI SEQ ID NO : 254 (Mix Icrel Gène d’intérêt et cicatrice) permettent de mettre en évidence une bande à 2094 paires de bases pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G PmpG Icrel, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène PmpG et la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO : 134 dans cette souche. Cette bande n’est pas détectée dans les souches Toxo tgmic7-3 KO - 2G et Toxo tgmicl-3 KO - 2G PmpG confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

La souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G PmpG Icrel est validée par PCR.

Validation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G PmpG Icrelpar immunofluorescence Les résultats montrent qu’avec l’anticorps anti tag VSV aucune fluorescence n’est détectable pour le parasite Toxo tgmic7-3 KO - 2G, alors qu’une fluorescence est détectée dans les parasites et dans les vacuoles parasitophores de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G PmpG Icrel obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine PmpG SEQ IDNO :305.

La souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G PmpG Icrel est validée par immunofluorescence.

Validation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G PmpG par Western Blot

Les résultats montrent qu’avec l’anticorps anti tag VSV aucune bande n’est détectable pour le parasite Toxo tgmic7-3 KO - 2G, alors qu’une bande à la taille attendue est détectée pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G PmpG obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine PmpG SEQ ID NO :305.

La souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G PmpG est validée par Western Blot.

190

Alors que la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G PmpG est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (ΙμΜ - grâce à la présence du gène DHFR*) et qu’elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50μΜ - à cause de la présence du gène TK), la souche Toxo tgmicl3 KO - 2G PmpG Icrel n’est plus capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (ΙμΜ - grâce à la perte du gène DHFR*) alors qu’elle est redevenue capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50μΜ - grâce à la perte du gène TK). Ce profil de résistance (résistance au ganciclovir et sensible à la pyriméthamine) permet de confirmer la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO : 134 suite à l’action de la méganucléase I-Crel.

L’ensemble des résultats permet de valider la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G PmpG Icrel.

Exemple 14 : Construction d’une souche Neo ncmicl-3 KO-2G exprimant un ou plusieurs antigènes de la bactérie Chlamydia abortus et ne comportant pas de gène de sélection

Souches de Neospora caninum

Les tachyzoïtes de la souche Neo ncmic7-3 KO 2G sont produits sur fibroblastes humains (HFF Hs27 ATCC CRL-1634)) cultivés en milieu minimal de Dulbecco (DMEM) supplémenté par 10% de sérum de veau fœtal (FBS), 2mM glutamine, lOOU/mL de pénicilline et lOOU/mL de streptomycine. Ils ont été récoltés après lyse mécanique des cellules hôtes et 3 passages en seringue 25G.

Construction des souches - protocole

191 a- Electroporation et sélection de la souche d’intérêt avec le plasmide exprimant un antigène de la bactérie Chlamydia abortus : souches Neo ncmicl-3 KO - 2G Chlamydia

Les parasites Neo ncmicl-3 KO - 2G sont électroporés avec 20pg de plasmide pUC18 4G2 ICrel - Chlamydia linéarisé. Par « de plasmide pUC18 4G2 ICrel - Chlamydia », on entend le plasmide pUC18 4G2 ICrel - CPAF, le plasmide pUC18 4G2 ICrel - MOMP ou le plasmide pUC18 4G2 ICrel - PmpG. Après électroporation, les tachyzoïtes sont soumis à une pression de sélection par l’agent de sélection (Pyriméthamine 4μΜ). 10 à 15 jours après sélection et passages successifs sur cellules HFF, les parasites sont sous-clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF puis amplifiés en plaques 24 puits sur une monocouche de cellules HFF.

b- Validation de la souche ayant intégré le plasmide par PCR

Pour valider une souche Neo ncmicl-3 KO - 2G Chlamydia, des analyses PCR sont effectuées selon le même protocole que celui utilisé dans l’exemple 10 - point b. Les tailles attendues sont également décrites dans le Tableau 35 ci-dessous.

Tableau 35 : Taille attendue des amplicons (en paires de base) des différentes PCR de validation de la construction des souches Neo ncmicl-3 KO - 2G Chlamydia

	Gène d’intérêt Chlamydia
Neo ncmicl-3 KO - 2G MOMP	1401

c- Validation de la souche ayant intégré le plasmide par immunofluorescence

Le profil d’antibiorésistance est analysé pour les clones validés en PCR et immunofluorescence. Les tachyzoïtes (de 1.10⁵ à 5.10⁵) sont cultivés 5 jours sur une monocouche de cellules HFF. Les parasites Neo ncmicl-3 KO - 2G Chlamydia ayant intégré un plasmide pUC18 4G2 ICrel - Chlamydia linéarisé doivent être résistants à la pyriméthamine (4μΜ - grâce à la présence du gène DHFR*) et sensible au ganciclovir (50μΜ - à cause de la présence du gène TK). Ce profil de résistance est validé en cultivant les parasites sur fibroblastes humains (HFF Hs27 ATCC CRL-1634)) cultivés en milieu minimal de Dulbecco (DMEM) supplémenté par 10% de sérum de veau fœtal (SVF), 2mM glutamine,

192 lOOU/mL de pénicilline et lOOU/mL de streptomycine, supplémenté ou non de la pyriméthamine ou du ganciclovir.

Les souches validées par PCR, immunofluorescence et ayant le bon profil d’antibiorésistance sont nommées Neo ncmicl-3 KO - 2G Chlamydia (Neo ncmicl-3 KO - 2G MOMP).

e- Electroporation de la Neo ncmicl-3 KO - 2G Chlamydia avec un plasmide pTsaglIcrelaPy et contre sélection de la souche ayant perdu la cassette de sélection DHFR*-TY-TK : souches Neo ncmicl-3 KO - 2G Chlamydia Icrel

Le protocole est identique à celui décrit dans le point protocole - e de l’exemple 7.

Pour valider une souche Neo ncmicl-3 KO - 2G Chlamydia Icrel, des analyses PCR sont effectuées selon le même protocole que celui utilisé dans l’exemple 10 - point b et f. Les tailles attendues sont également décrites dans le Tableau 36 ci-dessous. Plusieurs mix sont possibles et les PCR sont réalisées en fonction des souches testées.

Tableau 36 : Taille attendue des amplicons (en paires de base) des différentes PCR de validation de la construction des souches Neo ncmicl-3 KO - 2G Chlamydia.

	Gène d’intérêt Chlamydia	Mix Icrel Gène d’intérêt et cicatrice
Neo ncmicl-3 KO - 2G MOMP	1401	6734
Neo ncmicl-3 KO - 2G MOMP Icrel	1401	1890

h- Validation de la souche ayant perdu la cassette de sélection DHFR*-TY-TK par analyse du profil de résistance

Les parasites Neo ncmicl-3 KO - 2G Chlamydia ayant perdu la cassette de sélection DHFR*TY-TK doivent être sensibles à la pyriméthamine (4μΜ - grâce à la suppression du gène

193

DHFR*) et résistants au ganciclovir (50μΜ - grâce à la suppression du gène TK). Ce profil de résistance est validé en cultivant les parasites sur fibroblastes humains (HFF Hs27 ATCC CRL-1634) en milieu minimal de Dulbecco (DMEM) supplémenté par 10% de sérum de veau fœtal (SVF), 2mM glutamine, lOOU/mL de pénicilline et lOOU/mL de streptomycine, supplémenté ou non de la pyriméthamine ou du ganciclovir.

Les souches validées par PCR, immunofluorescence et ayant le bon profil d’antibiorésistance sont nommées Neo ncmicl-3 KO - 2G Chlamydia Icrel ( Neo ncmicl3 KO - 2G MOMP Icrel).

Résultats - Construction des souches exprimant un antigène de la bactérie Chlamydia abortus ne comportant pas de gène de sélection

A. Construction de la souche Neo ncmic/-3 KO - 2GMOMP Icrel

1. Construction de la souche Neo ncmic/-3 KO - 2GM0MP

L’électroporation de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G avec le plasmide pUC18 4G2 ICrel MOMP SEQ ID NO :295 a été réalisée selon le protocole décrit (point a). Les clones obtenus résistants à la pyriméthamine sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence du gène d’intérêt momp et l’expression de la protéine MOMP SEQ ID NO :297.

Validation de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2GM0MP par PCR

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO : 250 (Mix Gène d’intérêt Chlamydia) permettent de mettre en évidence une bande à 1401 paires de bases pour la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G MOMP, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène momp dans cette souche. Cette bande n’est pas détectée dans la souche Neo ncmic7-3 KO - 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ, (figure 52)

La souche Neo ncmicl-3 KO - 2G MOMP est validée par PCR.

Validation de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2GM0MP par immunofluorescence

Les résultats montrent qu’avec l’anticorps anti Myc aucune fluorescence n’est détectable pour le parasite Neo ncmic7-3 KO - 2G, alors qu’une fluorescence est détectée dans les parasites et

194 dans les vacuoles parasitophores de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G MOMP obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine MOMP SEQ ID NO :297. (figure 53)

La souche Neo ncmicl-3 KO - 2G MOMP est validée par immunofluorescence.

Validation de la souche ayant intégré le plasmide par analyse du pro fil de résistance Les tachyzoïtes (de 1.10⁵ à 5.10⁵) sont cultivés 5 jours sur une monocouche de cellules HFF (fibroblastes humains HFF Hs27 ATCC CRL-1634) en présence de pyriméthamine (4μΜ) ou de ganciclovir (50μΜ).

La souche Neo ncmicl-3 KO - 2G MOMP est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (4μΜ - grâce à la présence du gène DHFR*) alors qu’elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50μΜ - à cause de la présence du gène TK). Ce profil de résistance (sensible au ganciclovir et résistance à la pyriméthamine) permet de confirmer l’intégration du plasmide pUC18 4G2 ICrel - MOMP SEQ ID NO : 295 dans la souche Neo ncmicl-3 KO 2GM0MP.

L’ensemble des résultats permet de valider la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G MOMP.

2. Construction de la souche Neo ncmic/-3 KO - 2GMOMP Icrel

L’électroporation de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G MOMP avec le plasmide pTsaglIcrel αβγ circulaire SEQ ID NO : 178 a été réalisée selon le protocole décrit (point e exemple 10). Les clones obtenus résistants au ganciclovir sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence du gène d’intérêt momp et l’expression de la protéine MOMP SEQ ID NO :297 et pour valider la suppression de la cassette de résistance DHFR*TYTK SEQ ID NO : 134.

Validation de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G MOMP Icrelpar PCR

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO : 250 (Mix Gène d’intérêt Chlamydia) permettent de mettre en évidence une bande à 1401 paires de bases pour la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G

195

MOMP Icrel, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène momp dans cette souche. Cette bande n’est pas détectée dans la souche Neo ncmic7-3 KO 2G confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces MC4 SEQ ID NO :286 et MCI SEQ ID NO : 254 (Mix Icrel Gène d’intérêt et cicatrice) permettent de mettre en évidence une bande à 1890 paires de bases pour la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G MOMP Icrel, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène momp et la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO : 134 dans cette souche. Cette bande n’est pas détectée dans les souches Neo ncmic7-3 KO - 2G et Neo ncmicl-3 KO - 2G MOMP confirmant l’absence de ce gène dans la souche de départ.

La souche Neo ncmicl-3 KO - 2G MOMP Icrel est validée par PCR.

Validation de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2GM0MP Icrelpar immunofluorescence Les résultats montrent qu’avec l’anticorps anti Myc aucune fluorescence n’est détectable pour le parasite Neo ncmic7-3 KO - 2G, alors qu’une fluorescence est détectée dans les parasites et dans les vacuoles parasitophores de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G MOMP Icrel obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine MOMP SEQ ID NO :297.

La souche Neo ncmicl-3 KO - 2G MOMP Icrel est validée par immunofluorescence.

Alors que la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G MOMP est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (4μΜ - grâce à la présence du gène DHFR*) et qu’elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50μΜ - à cause de la présence du gène TK), la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G MOMP Icrel n’est plus capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (4μΜ - grâce à la perte du gène DHFR*) alors qu’elle est redevenue capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de

196 ganciclovir (50μΜ - grâce à la perte du gène TK). Ce profil de résistance (résistance au ganciclovir et sensible à la pyriméthamine) permet de confirmer la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO : 134 suite à l’action de la méganucléase I-Crel.

L’ensemble des résultats permet de valider la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G MOMP Icrel.

Exemple 15 : Etude d’innocuité et d’immunogénicité des souches Toxo tgmicl-3 KO- 2G exprimant un ou plusieurs antigènes du virus Influenza dans un modèle murin

L’objectif de cette expérimentation est de déterminer si la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G exprimant des antigènes du virus Influenza permet l’obtention d’une réponse immunitaire humorale et cellulaire envers les antigènes viraux ciblés.

Matériel et méthode

Production de parasites Toxo tgmicl-3 KO - 2G exprimant un ou plusieurs antigènes du virus Influenza

Les souches Toxo tgmicl-3 KO - 2G exprimant un ou plusieurs antigènes du virus Influenza sont produits en fibroblastes humains (HFF Hs27 ATCC CRL-1634) cultivés en milieu minimal de Dulbecco (DMEM) supplémenté par 10% de sérum de veau fœtal (SVF), 2mM glutamine, lOOU/mL de pénicilline et lOOU/mL de streptomycine.. Les tachyzoïtes ont été récoltés après lyse mécanique des cellules hôtes par 3 passages en seringue 25G. Les parasites ont été énumérés sur cellule de Malassez et dilués dans du milieu DMEM pour atteindre une concentration de 500 parasites par mL.

Animaux

Au total 64 souris SWISS femelles de 6 semaines ont été inclues dans l’étude. Les animaux ont été hébergés et manipulés, dans le strict respect des normes éthiques en vigueur en France et des normes d’élevage imposées par la règlementation européenne. L’alimentation et l’eau

197 de boisson ont été distribuées ad-libitum durant toute la durée de l’expérimentation.

Après une période de 15 jours d’acclimatation, les souris ont été identifiées individuellement et réparties aléatoirement en 7 groupes.

Lot 1 : Toxo tgmicl-3 KO - 2G (n=10)

Lot 2 : Toxo tgmicl-3 KO - 2G pUC18 4G2 Icrel (n=10)

Lot 3 : Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPIIcrel (n=10)

Lot 4 : Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e Icrel (n=10)

Lot 5 : Toxo tgmicl-3 KO - 2G HA Icrel (n=10*)

Lot 6 : Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPIHA (n=10)

Lot 7 : naïf (n=4)

A JO, 100 tachyzoïtes ont été injectés en intra-péritonéal dans un volume de 200 pL de DMEM. Les animaux ont ensuite été suivis et sacrifiés environ 7 semaines post-injection (J52) et les rates ont été prélevées. Avant (J-l) et 34 jours post-injection, du sang a été prélevé par voie rétro-orbitale et laissé à température ambiante pour une durée minimum de 30 minutes. Le sérum a été obtenu par conservation des surnageants d’une centrifugation à 3 000 g durant 10 minutes. Les séra préparés ont été conservés à -20°C.

Dosage IgG par ELISA

Une plaque 96 puits a été adsorbée avec différentes protéines à 10 pg/mL (protéine recombinante HA 95-101 (Pro Sci), un mix de 4 peptides M2e synthétiques à 10 pg/mL (Anaspec) correspondant aux 4 M2e présents dans la construction de la protéine de fusion saglM2e ou de l’extrait protéique de Toxo tgmicl-3 KO - 2G (10 pg/ml) dilué en tampon carbonate pH 9,6 pendant une nuit à 4 °C. Après lavages en PBS lX/Tween 0,05%, la plaque a été saturée avec du PBS lX/Tween 0,05% - BSA 4% pendant lh30 à 37 °C. Ensuite, pour le titrage, les dilutions sériées 2 de 2 en, en PBS lX/Tween 0,05% des sera murins à tester ont été déposées. Après 1 h d’incubation à 37 °C, la plaque a été lavée, puis l’anticorps secondaire (IgG anti-mouse IgG couplé à la phosphatase alcaline) est ajouté et dilué au 1/30 000 en PBS lX/Tween 0,05%, avant une nouvelle incubation à 37 °C durant lh30. Après lavages, le pNPP a été utilisé à une concentration de 1 mg/ml dilué en tampon DEA-HCL pour la révélation, et la plaque a été incubée 1 h à 37 °C. L’absorbance à 405 nm de chaque puits avec une contre lecture à 620 nm a été lue via le lecteur de plaque Nanoquant Infinité M200 PRO (TECAN).

198

Dosage par ELISA d’IFN-v sécrété par des splénocytes stimulés in vitro

Après chaque prélèvement, la rate a été broyée sur un tamis 100 pm placé au-dessus d’un tube Falcon de 50 ml avec ajout de 5 ml de milieu RPMI. Le broyât a ensuite été centrifugé 10 min à 400 g. Le culot a été repris dans 300 μΐ de RPMI, puis 1 ml de tampon de lyse a été ajouté. Le tube a été incubé 3 min à 4 °C, et la réaction a été stoppée avec ajout de PBS 1X/SVF 2% en excès, puis les cellules ont été centrifugées 10 min à 400 g. Les culots de cellules obtenus ont ensuite été repris dans 5 ml de milieu de stimulation. Les cellules ont été dénombrées sur cellule de Malassez en présence de bleu trypan qui colore les cellules mortes.

Les cellules ont été mises en culture en plaques 96 puits à raison de 5.10⁵ cellules/puit. Différents stimulants ont pu être ajoutés : des extraits antigèniques de Toxo tgmicl-3 KO 2G (10 pg/ml), de la protéine recombinante HA 95-101 (Pro Sci - 10 pg/ml), un mix de 4 peptides M2e synthétiques à 10 pg/mL (Anaspec) correspondant aux 4 M2e présents dans la construction de la protéine de fusion saglM2e ou de la concanavaline A (5 pg/ml) qui sert de témoin positif. Les plaques ont été mises en culture en étuve à 37 °C, 5% de CO2 pour 72 h.

Le dosage d’IFN-γ a été réalisé sur les surnageants de culture des splénocytes en présence de différents stimulants. Le dosage a été effectué par un test ELISA selon le protocole du kit « Mouse IFN-γ ELISA Ready-set-go® (Ebiosciences).

Résultats

Survie et signes cliniques

Il est observé qu’en fonction des souches parasitaires, il y a des fortes disparités dans le taux de survie engendré chez les souris SWISS (tableau 37), avec notamment aucune survie pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G HA Icrel (n=10) et une survie totale pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA. La plupart des souris ont présenté des signes cliniques tels que le poil ébouriffé, un gonflement de l’abdomen et une prostration à l’exception des souris n’ayant pas reçu de souches parasitaires.

Tableau 37 : pourcentage de survie suite à la vaccination.

	Naïves	Toxo tgmicl-3 KO -2G	Toxo tgmic 1 -3 KO - 2G pue 4 G2 Icrel	Toxo tgmic 1 -3 KO - 2G M2eGPI Icrel	Toxo tgmic 1 -3 KO - 2G M2e Icrel	Toxo tgmic 1 -3 KO - 2G HA Icrel	Toxo tgmic 1- 3 KO -2G M2eGPI HA
survie	100%	0%	90%	30%	50%	0%	100%

199

Evaluation de la réponse humorale adaptative envers le vecteur Toxo tgmicl-3 KO - 2G

Le dosage des IgG sériques dirigés contre les protéines de Toxo tgmicl-3 KO - 2G permet d’observer très nettement que les sera issus des souris avant injection ne produisent pas d’anticorps spécifiques de cette souche. Concernant les sera prélevés 34 jours après l’injection, une forte augmentation de l’absorbance synonyme de la séroconversion des souris suite à la vaccination par Toxo tgmicl-3 KO - 2G a été observée. Au total, en fonction des lots, entre 78% et 100% des souris sont séroconverties pour la toxoplasmose, (figure 54 et tableau 38).

Tableau 38 : pourcentage de séroconversion suite à la vaccination.

	Naïves	Toxo tgmic 1- 3 KO -2G	Toxo tgmic 1 -3 KO - 2G pue 4 G2 Icrel	Toxo tgmic 1 -3 KO - 2G M2eGPI Icrel	Toxo tgmic 1 -3 KO - 2G M2e Icrel	Toxo tgmic 1 -3 KO - 2G HA Icrel	Toxo tgmic 1 -3 KO -2G M2eGPI HA
IgG +	0%	-	78% (7/9)	100%	100%	-	100%

Evaluation de la réponse humorale adaptative envers les antigènes d’Influenza

Le dosage des IgG sériques dirigés contre HA n’a pas permis de mettre en évidence une production d’anticorps spécifiquement dirigé contre HA pour la souche vaccinée avec la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2GM2eGPI HA.

Alors que suite à une injection d’une souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G exprimant M2e ou M2eGPI, il est observé une production d’anticorps spécifique de l’antigène M2e exprimé par les souches Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI Icrel, Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2e Icrel et Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA (figure 55).

Evaluation de la réponse cellulaire spécifique de Toxo tgmicl-3 KO - 2G ou des antigènes d’Influenza

Afin d’évaluer la mise en place d’une réponse immunitaire cellulaire, l’IFN-γ (cytokine indiquant la mise en place d’une réponse de type Thl) sécrété dans les surnageants de culture des splénocytes suite à divers stimuli, a été dosé 72 h après la mise en culture.

Pour l’ensemble des souris vaccinées avec Toxo tgmicl-3 KO - 2G pUC4G 2 Icrel, ou Toxo tgmicl-3 KO - 2G Influenza, des concentrations importantes d’IFN-γ sont mesurées lorsque les cellules sont stimulées avec des extraits antigèniques de Toxo tgmicl-3 KO - 2G , par rapport aux souris non vaccinées (figure 56).

200

Concernant les cellules restimulées avec M2e, aucune production d’IFN-γ n’est détectable pour l’ensemble des souris, qu’elles soient naïves, vaccinées avec Toxo tgmicl-3 KO - 2G pUC18 4G2 Icrel ou avec Toxo tgmicl-3 KO - 2G Influenza.

Pour les cellules restimulées avec HA, une production significativement élevée d’IFN-γ est observée pour le lot Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI HA(figure 57), alors qu’aucune production d’IFN-γ n’est détectée pour les lots n’exprimant pas HA.

Il a donc été observé la mise en place d’une réponse immunitaire humorale vis-à-vis de la construction M2e mais également d’une réponse immunitaire cellulaire vis-à-vis de la construction HA suite à une vaccination avec des souches Toxo tgmicl-3 KO - 2G Influenza.

Claims

1. Souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle les fonctions des deux protéines MIC1 et MIC3 essentielles à la virulence sont supprimées respectivement par une délétion totale du gène miel codant pour la protéine MIC1 et par une délétion totale du gène mie3 codant pour la protéine MIC3, caractérisée en qu’elle contient au moins un acide nucléique codant respectivement pour au moins un antigène hétérologue immunogène et les moyens nécessaires à son expression, sous réserve que lorsque ladite souche mutante contient un acide nucléique codant pour un antigène hétérologue immunogène, ladite souche mutante est dépourvue de gène de sélection, ledit au moins un antigène hétérologue immunogène étant un antigène hétérologue immunogène de virus, de parasite ou de bactérie.

2. Souche mutante de Sarcocystidae selon la revendication 1, dans laquelle ladite souche mutante est une souche du genre Toxoplasma spp., en particulier une souche de l’espèce Toxoplasma gondii.

3. Souche mutante de Sarcocystidae selon la revendication 1, dans laquelle ladite souche mutante est une souche du genre Neospora spp., en particulier une souche de l’espèce Neospora caninum.

4. Souche mutante de Sarcocystidae selon l’une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu’elle contient au moins deux acides nucléiques codant respectivement pour au moins deux antigènes hétérologues immunogènes, en particulier au moins deux acides nucléiques codant respectivement pour au moins deux antigènes hétérologues immunogènes de virus, ou en particulier au moins deux acides nucléiques codant respectivement pour au moins deux antigènes hétérologues immunogènes de bactérie, en particulier au moins deux acides nucléiques codant respectivement pour au moins deux antigènes hétérologues immunogènes de parasites.

5. Souche mutante de Sarcocystidae selon l’une des revendications 1 à 4, dans laquelle ledit au moins un antigène hétérologue immunogène est un antigène du virus Influenza choisi parmi

202 la protéine de SEQ ID NO : 211 (fragment N-ter du virus influenza humain), ou la protéine de SEQ ID NO : 214 (fragment N-ter de la protéine M2e du virus influenza du porc), ou la protéine de SEQ ID NO : 212 (fragment N-ter de la protéine M2 du virus influenza aviaire de type I) ou la protéine de SEQ ID NO : 213 (fragment N-ter de la protéine M2 du virus influenza aviaire de type II), la protéine de SEQ ID NO : 209, la protéine de SEQ ID NO : 206, la protéine de SEQ ID NO 253, la protéine de SEQ ID NO : 233 ou la protéine de SEQ ID NO : 255, ou ledit au moins un antigène hétérologue immunogène est un antigène de la bactérie Chlamydia abortum choisi parmi la protéine CPAF de SEQ ID NO : 289 , la protéine MOMP de SEQ ID NO : 297, la protéine PmpG de SEQ ID NO :270, la protéine de fusion de SEQ ID NO : 288, la protéine de fusion de SEQ ID NO : 296 ou la protéine de fusion de SEQ ID NO : 304 ou ledit au moins un antigène hétérologue immunogène est un antigène du parasite Leishmania infantum choisi parmi la protéine KMP11 de SEQ ID NO : 259, ou la protéine NH36 de SEQ ID NO : 269, ou la protéine CYP1 de SEQ ID NO : 279, ou la protéine de fusion de SEQ ID NO : 257, ou la protéine de fusion de SEQ ID NO : 267, ou la protéine de fusion de SEQ ID NO : 285.

6. Souche mutante de Sarcocystidae selon l’une des revendications 1 à 2 et 4 à 5, dans laquelle ladite souche mutante est une souche de Toxoplasma gondii dans laquelle la fonction de la protéine MIC1 est supprimée par une délétion totale du gène miel codant pour la protéine MIC1 et la fonction de la protéine MIC3 est supprimée par une délétion totale du gène mic3 codant pour la protéine MIC3, ladite souche étant dépourvue de gène de sélection, et contenant un acide nucléique de séquence SEQ ID NO : 311 codant pour un antigène hétérologue immunogène du virus Influenza de séquence SEQ ID NO : 253, ou contenant un acide nucléique de séquence SEQ ID NO :310 codant pour un antigène hétérologue immunogène du virus Influenza de séquence SEQ ID NO : 206, ou contenant un acide nucléique de séquence SEQ ID NO : 312 codant pour un antigène hétérologue immunogène du virus Influenza de séquence SEQ ID NO : 255, ou contenant deux acides nucléiques de séquence SEQ ID NO : 311 et SEQ ID NO : 310 codant respectivement pour deux antigènes hétérologues immunogènes du virus Influenza de séquence SEQ ID NO : 253, et de séquence SEQ ID NO : 206,

203 > ou contenant deux acides nucléiques de séquence SEQ ID NO : 312 et SEQ ID NO : 310 codant respectivement pour deux antigènes hétérologues immunogènes du virus Influenza de séquence de séquence SEQ ID NO : 255 et de séquence SEQ ID NO : 206, ou contenant deux acides nucléiques de séquence SEQ ID NO : 312 et SEQ ID NO : 311 codant respectivement pour deux antigènes hétérologues immunogènes du virus Influenza de séquence de séquence SEQ ID NO : 255 et de séquence SEQ ID NO : 253, ou contenant un acide nucléique de séquence SEQ ID NO : 265 codant pour un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID : 257, ou contenant un acide nucléique de séquence SEQ ID NO : 275 codant pour un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID : 267, ou contenant un acide nucléique de séquence SEQ ID NO : 277 codant pour un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID : 285, ou contenant deux acides nucléiques de séquence SEQ ID NO : 265 et de séquence SEQ ID NO : 275 codant respectivement pour un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID : 257 et un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID : 267, ou contenant deux acides nucléiques de séquence SEQ ID NO : 265 et de séquence SEQ ID NO : 277 codant respectivement pour un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID : 257 et un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID : 285, ou contenant deux acides nucléiques de séquence SEQ ID NO : 275 et de séquence SEQ ID NO : 277 codant respectivement pour un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID : 267 et un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID : 285, ou contenant trois acides nucléiques de séquence SEQ ID NO : 265, de séquence SEQ ID NO : 275 et de séquence SEQ ID NO : 277, codant respectivement pour un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID : 257, un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID : 267, et un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID : 285.

204 •

7. Souche mutante de Sarcocystidae selon l’une des revendications 1 et 3 à 5, dans laquelle ladite souche mutante est une souche de Neospora caninum dans laquelle la fonction de la protéine MIC1 est supprimée par une délétion totale du gène miel codant pour la protéine MIC1 et la fonction de la protéine MIC3 est supprimée par une délétion totale du gène mic3 codant pour la protéine MIC3, ladite souche étant dépourvue de gène de sélection et contenant un acide nucléique de séquence SEQ ID NO : 311 codant pour un antigène hétérologue immunogène du virus Influenza de séquence SEQ ID NO : 253, ou contenant un acide nucléique de séquence SEQ ID NO :310 codant pour un antigène hétérologue immunogène du virus Influenza de séquence SEQ ID NO : 206, ou contenant un acide nucléique de séquence SEQ ID NO : 312 codant pour un antigène hétérologue immunogène du virus Influenza de séquence SEQ ID NO : 255, ou contenant deux acides nucléiques de séquence SEQ ID NO : 312 et SEQ ID NO : 310 codant respectivement pour deux antigènes hétérologues immunogènes du virus Influenza de séquence de séquence SEQ ID NO : 255 et de séquence SEQ ID NO : 206, ou contenant deux acides nucléiques de séquence SEQ ID NO : 312 et SEQ ID NO : 311 codant respectivement pour deux antigènes hétérologues immunogènes du virus Influenza de séquence de séquence SEQ ID NO : 255 et de séquence SEQ ID NO : 253, ou contenant un acide nucléique de séquence SEQ ID NO : 265 codant pour un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID : 257, ou contenant un acide nucléique de séquence SEQ ID NO : 275 codant pour un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID : 267, ou contenant un acide nucléique de séquence SEQ ID NO : 277 codant pour un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID : 285, ou contenant deux acides nucléiques de séquence SEQ ID NO : 265 et de séquence SEQ ID NO : 275 codant respectivement pour un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID : 257 et un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID : 267, ou contenant deux acides nucléiques de séquence SEQ ID NO : 265 et de séquence SEQ ID NO : 277 codant respectivement pour un antigène hétérologue immunogène de Leishmania

205 . infantum de séquence SEQ ID : 257 et un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID : 285, ou contenant deux acides nucléiques de séquence SEQ ID NO : 275 et de séquence SEQ ID NO : 277 codant respectivement pour un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID : 267 et un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID : 285, ou contenant un acide nucléique de séquence SEQ ID NO : 294 codant pour un antigène hétérologue immunogène de Chlamydia abortus de séquence SEQ ID : 288, ou contenant un acide nucléique de séquence SEQ ID NO : 302 codant pour un antigène hétérologue immunogène de Chlamydia abortus de séquence SEQ ID : 296, ou contenant un acide nucléique de séquence SEQ ID NO : 292 codant pour un antigène hétérologue immunogène de Chlamydia abortus de séquence SEQ ID : 304.

8. Procédé d’obtention d’une souche mutante de Sarcocystidae selon l’une des revendications

1 à 7, dans laquelle ladite souche mutante est une souche de Toxoplasma gondii ou de Neospora caninum dans laquelle la fonction de la protéine MIC1 est supprimée par une délétion totale du gène miel codant pour la protéine MIC1 et la fonction de la protéine MIC3 est supprimée par une délétion totale du gène mic3 codant pour la protéine MIC3 ladite souche étant dépourvue de gène de sélection et contenant au moins un acide nucléique codant respectivement pour au moins un antigène hétérologue immunogène comprenant :

une étape A de délétion totale du gène mic3, une étape B de délétion totale du gène miel, les étapes A et B pouvant être réalisée dans un ordre A suivi de B ou B suivi de A, puis

- une étape C de modification génétique de la souche avec l’insertion aléatoire d’ au moins un plasmide comportant un acide nucléique codant pour un antigène hétérologue immunogène, et un gène de sélection,

206

- une étape E de suppression du gène de sélection par une méganucléase, en particulier la méganucléase Icrel

9. Procédé d’obtention d’une souche mutante de Sarcocystidae selon la revendication 8 dans laquelle :

une étape A comprenant ou constituée de la délétion du gène mic3 par recombinaison homologue et insertion d’une cassette de sélection encadrée par deux sites de recombinaison spécifique identiques , suivi de l’excision de ladite cassette de sélection par une enzyme permettant la recombinaison spécifique, ladite enzyme étant en particulier la Cre-recombinase, suite à laquelle un seul des deux sites de recombinaison spécifique encadrant la cassette reste intégré au locus dudit gène mie 3 délété, une étape B comprenant ou constituée de la délétion du gène miel par recombinaison homologue et insertion d’une cassette de sélection encadrée par deux sites de recombinaison spécifique identiques, suivi de l’excision de ladite cassette de sélection par une enzyme permettant la recombinaison spécifique, ladite enzyme étant en particulier la Cre-recombinase, suite à laquelle un seul des deux sites de recombinaison spécifique encadrant la cassette reste intégré au locus dudit gène miel délété les deux sites de recombinaison spécifique encadrant la cassette de sélection insérée au locus du gène miel étant différents des deux sites de recombinaison spécifique encadrant la cassette de sélection insérée au locus du gène mic3 les étapes A et B pouvant être réalisée dans un ordre A suivi de B ou B suivi de A, puis

207 ' - une étape D de validation de la souche ayant intégrée le plasmide de l’étape C par PCR et/ou immunofluorescence et/ou profil de résistance,

10. Souche mutante de Sarcocystidae selon l’une des revendications 1 à 7 pour son utilisation comme médicament, en particulier comme vaccin ou immunostimulant.

11. Souche mutante de Sarcocystidae selon l’une des revendications 1 à 7 pour son utilisation dans la prévention de pathologies d’origine virale, parasitaire ou bactérienne chez un mammifère, ledit mammifère étant choisi parmi les ovidés, les caprins, les porcins, les bovins, les équidés, les camélidés, les canidés ou les félidés, ou chez un oiseau, en particulier pour son utilisation dans la prévention de la grippe aviaire, en particulier pour son utilisation dans la prévention de la leishmaniose, en particulier pour son utilisation dans la prévention de la chlamydiose.