FR3060755A1 - Methode de diagnostic d'une peau presentant des signes de secheresse - Google Patents

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Virginie PIFFAUT
Aude FOUCHER
Nukhet Cavusoglu
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Abstract

La présente invention concerne une méthode de diagnostic d'une peau présentant des signes de sécheresse, basée sur la mesure du niveau d'expression du gène codant la LCN1. La présente invention porte également sur une méthode de traitement cosmétique de la peau. La présente invention concerne également une méthode d'identification de composé permettant la réduction et/ou le ralentissement de la progression des signes de sécheresse d'une peau ainsi qu'un kit.

Description

® RÉPUBLIQUE FRANÇAISE
INSTITUT NATIONAL DE LA PROPRIÉTÉ INDUSTRIELLE © N° de publication :
(à n’utiliser que pour les commandes de reproduction)
©) N° d’enregistrement national
060 755
62670
COURBEVOIE © Int Cl8 : G 01 N 33/68 (2017.01)
DEMANDE DE BREVET D'INVENTION
A1
(§) Date de dépôt : 16.12.16. (© Demandeur(s) : L'OREAL Société anonyme— FR.
(30) Priorité :
@ Inventeur(s) : KANANI SANDRA, PIFFAUT
VIRGINIE, FOUCHERAUDE, CAVUSOGLU NUKHET
(43) Date de mise à la disposition du public de la et DONOVAN MARK.
demande : 22.06.18 Bulletin 18/25.
(© Liste des documents cités dans le rapport de
recherche préliminaire : Se reporter à la fin du
présent fascicule
(© Références à d’autres documents nationaux (© Titulaire(s) : L'OREAL Société anonyme.
apparentés :
©) Demande(s) d’extension : (© Mandataire(s) : LAVOIX.
METHODE DE DIAGNOSTIC D'UNE PEAU PRESENTANT DES SIGNES DE SECHERESSE.
FR 3 060 755 - A1
La présente invention concerne une méthode de diagnostic d'une peau présentant des signes de sécheresse, basée sur la mesure du niveau d'expression du gène codant la LCN1. La présente invention porte également sur une méthode de traitement cosmétique de la peau. La présente invention concerne également une méthode d'identification de composé permettant la réduction et/ou le ralentissement de la progression des signes de sécheresse d'une peau ainsi qu'un kit.
Figure FR3060755A1_D0001
Méthode de diagnostic d’une peau présentant des signes de sécheresse
La présente invention concerne des méthodes de diagnostic de sécheresse de la peau.
Différents désordres physiologiques, d'agressions environnementales, telles que la pollution ou les radiations comme les rayons ultraviolets, de facteurs extrinsèques, comme le tabac, de variations de l'organisation, de la densité de l'hypoderme, consécutivement à une modification de la masse corporelle, une grossesse, un état d'obésité, la cellulite, ou bien encore de désorganisation des constituants de la matrice extracellulaire fragilisent l'ensemble de la peau qui tend à devenir sèche, que ce soit du fait d'une perte d'hydratation la peau ou du fait d'une perte de lipides (perturbation de la fonction barrière) qui entraîne une évaporation d'eau plus importante et donc une déshydratation.
De ce qui précède, on comprend l'importance de trouver des biomarqueurs permettant de détecter la sécheresse de la peau et en particulier lorsque celle-ci n’est pas encore visible, afin de pouvoir réduire et/ou ralentir la progression de ces signes de sécheresse de la peau. Il existe un besoin important de biomarqueurs spécifiques de la sécheresse, afin de permettre de réagir de manière adaptée chez un sujet donné.
La présente invention a pour objet de satisfaire à ce besoin.
La demanderesse a découvert de manière surprenante que l’expression du gène codant la Lipocaline-1 (LCN1), au niveau de la peau, est corrélée à la présence de signes de sécheresse de la peau.
La Lipocaline-1 (LCN1) est une petite protéine sécrétée de 20 kDa. LCN1 appartient à la superfamille des calicynes et la famille des lipocalines connues pour se lier et transporter de petites molécules lipophiles telles que le rétinol et l’acide rétinoïque.
Ainsi, selon un premier de ses aspects, l'invention a pour objet une méthode de diagnostic, préférentiellement in vitro, d’une peau présentant des signes de sécheresse, chez un sujet, ladite méthode comprenant les étapes suivantes :
a) mesurer le niveau d’expression du gène codant la LCN1, en particulier le niveau d'expression protéique du gène codant la LCN1, dans un échantillon de peau dudit sujet, et
b) éventuellement, sur la base du niveau d’expression du gène codant la LCN1 mesuré à l’étape a), déterminer si la peau dudit sujet présente des signes de sécheresse.
La présente invention concerne également une méthode de traitement cosmétique d’une peau présentant des signes de sécheresse chez un sujet, ladite méthode comprenant les étapes suivantes :
a) mesurer le niveau d’expression du gène codant la LCN1, dans un échantillon de peau dudit sujet;
b) déduire de l’étape a) si la peau dudit sujet présente des signes de sécheresse ;
c) si la peau est identifiée comme présentant des signes de sécheresse à l’étape b), traiter ladite peau avec une composition cosmétique permettant la réduction et/ou le ralentissement de la progression des signes de sécheresse de la peau.
Dans le contexte de la peau, le terme sécheresse de la peau, couvre à la fois une déshydratation de la peau (perte d'eau) et une perte de lipides de la peau (entraînant généralement elle-même une déshydratation).
Par « signes de sécheresse de la peau >>, on entend ici toutes les modifications de la peau intervenant avec la perte d’eau et/ou de lipides de la peau et qui ne sont parfois pas visibles aux stades précoces, et en particulier les sensations de tiraillement et un toucher rêche. En particulier on entend ici la sécheresse de la peau du visage et de préférence des joues.
La LCN1 est une protéine connue sous plusieurs isoformes dont les séquences en acides aminés sont connues et notamment la séquence ayant pour code d’accession GenBank : AAH74926.1 (version du 23 septembre 2014). La séquence de l’ARNm codant la LGN1 est également connue de l’homme du métier et notamment accessible avec le code d’accession NGBI : NM 002297.3 (version du 12 juin 2016).
Par « niveau d’expression du gène codant la LCN1 >> on entend le niveau d'expression en ARN messager (ARNm) du gène codant la LCN1 et/ou le niveau d’expression de la protéine LCN1.
Préférentiellement, le niveau d’expression de la protéine LCN1 est mesuré à l’aide d’au moins un ligand spécifique de la protéine LCN1, comme par exemple un anticorps, de préférence monoclonal, un fragment Fab, un scFv ou un nanocorps, spécifique de cette protéine. Le niveau d’expression peut alors être mesuré par n’importe quelle méthode connue de l’homme du métier, comme par exemple par un test ELISA, de préférence une test ELISA en sandwich mettant en œuvre un anticorps de capture, spécifique de la protéine LCN1 et un anticorps de détection, également spécifique de la protéine LCN1. En particulier, la mesure du niveau d’expression de la protéine LCN1 peut être effectuée à l’aide d’un système miniaturisé tel qu’une puce microfluidique, comme celle décrite dans la demande internationale WO2011/126249, cette puce contenant des ligands spécifiques de la protéine LCN1. La puce peut ensuite être analysée au moyen d'un lecteur adapté pour déterminer si des protéines LCN1 se sont liées audit ligand et conclure quant à la présence et la quantité de LCN1 dans l’échantillon de peau.
Préférentiellement, le niveau d'expression en ARNm du gène codant la LCN1 est mesuré à l’aide d’une séquence nucléotidique complémentaire de l’ARNm du gène codant la LCN1 et s'hybridant spécifiquement à l’ARNm du gène codant la LCN1 ou, un fragment de celle-ci s'hybridant spécifiquement à l’ARNm du gène codant la LCN1, cette séquence ou ce fragment comprenant 5 à 50 nucléotides, préférentiellement 10 à 20 nucléotides, ou à l’aide d’un couple d’amorces ou d’une sonde de 10 à 60 nucléotides, préférentiellement 15 à 30 nucléotides comprenant ladite séquence ou ledit fragment. Le niveau d’expression peut alors être mesuré par n’importe quelle méthode connue de l’homme du métier, par exemple par une PCR quantitative.
Dans le cadre de l'invention, les termes «hybrider» ou «hybridation», comme bien connu de l'homme du métier, se réfèrent à la liaison d'une molécule d'acide nucléique à une séquence nucléotidique particulière dans des conditions appropriées, notamment dans des conditions stringentes.
Le terme «conditions stringentes», tel qu'utilisé ici correspond à des conditions qui sont appropriées pour produire des paires de liaison entre les acides nucléiques ayant un niveau déterminé de complémentarité, tout en étant impropre à la formation de paires entre les acides nucléiques de liaison ayant une complémentarité inférieure audit niveau déterminé. Les conditions stringentes sont dépendantes des conditions d'hybridation et de lavage. Ces conditions peuvent être modifiées selon les méthodes connues de l'homme de l'art. Généralement, des conditions de haute stringence sont une température d’hybridation environ 5°C inférieure à la température de fusion (Tm), de préférence proche de la Tm des brins parfaitement appariés par bases. Les procédures d'hybridation sont bien connues dans la technique.
Les conditions de haute stringence impliquent généralement l'hybridation à une température d’environ 50°C à environ 68°C dans unesolution 5x SSC/5x solution de Denhardt /1,0% SDS, et un lavage dans une solution 0,2x SSC/0,1% SDS à une température comprise entre environ 60°C et environ68°C.
Selon un mode de réalisation préféré, l’échantillon de peau du sujet utilisée dans les méthodes de diagnostic et de traitement cosmétique selon l’invention, est un échantillon prélevé, de préférence de manière non-invasive, sur la peau du sujet, préférentiellement sur le visage du sujet, en particulier sur la joue du sujet. Préférentiellement l’échantillon de peau est issu du stratum corneum.
Le stratum corneum est la couche la plus éloignée de l'épiderme, et comprend la surface de la peau. Elle est composée principalement de cellules mortes.
Selon un mode de réalisation, les méthodes selon l’invention comprennent une étape de prélèvement de l’échantillon de peau du sujet. Cette étape est préférentiellement effectuée de manière non invasive, et en particulier ne nécessite pas d’anesthésie locale. Selon un mode de réalisation préféré, l’étape de prélèvement de l’échantillon est effectuée en frottant la surface de la peau ou en utilisant une surface adhésive telle qu’un disque D-squame®.
Par « sujet >> on comprend un être humain, de préférence âgé de 20 à 90 ans, préférentiellement de 35 à 80 ans, de 45 à 80 ans et encore plus préférentiellement de 60 à 80 ans. De préférence, le sujet est une femme.
Dans un mode de réalisation particulier, l'étape (b) est réalisée après comparaison du niveau d’expression du gène codant la LCN1 obtenu avec une valeur de référence. Dans un mode de réalisation, la valeur de référence est déterminée par la valeur moyenne du niveau d’expression du gène codant la LCN1 dans une population déterminée, par exemple une population dans une tranche d’âge déterminée et/ou ayant un type de peau défini (caucasien, asiatique, etc..). Dans un mode de réalisation particulier la valeur de référence est déterminée par la valeur moyenne du niveau d’expression du gène codant la LCN1 chez des femmes âgées de 60 à 80 ans. Dans une autre forme de réalisation, la valeur de référence est la valeur seuil optimale déterminée par analyse ROC. Conformément à l’invention une valeur de référence peut être déterminée par une pluralité d'échantillons, de préférence plus de 50, 100, 200 , 300 ou 500 échantillons.
Le terme «comparaison» fait référence au fait de déterminer si le niveau d’expression du gène codant la LCN1 est essentiellement identique à une valeur de référence ou diffère de celle-ci. De préférence, le niveau d’expression du gène codant la LCN1 est considéré comme différent d'une valeur de référence si la différence observée est statistiquement significative. Si la différence n’est pas statistiquement significative, le niveau d’expression du gène codant la LCN1 et la valeur de référence sont essentiellement identiques.
Sur la base de cette comparaison, on peut déterminer si la peau présente des signes de sécheresse. Typiquement, la peau est considérée comme présentant des signes de sécheresse lorsque le niveau d’expression du gène codant la LCN1 est significativement inférieur à la valeur de référence et la peau n’est pas considérée comme présentant des signes de sécheresse lorsque le niveau d’expression du gène codant la LCN1 est essentiellement identique ou significativement supérieur à la valeur de référence.
Par « composition cosmétique permettant la réduction et/ou le ralentissement de la progression des signes de sécheresse de la peau» on comprend toute composition cosmétique connue de l’homme du métier permettant de réduire et/ou de ralentir la progression des signes de sécheresse de la peau.
L’invention porte également sur une méthode d’identification d'un composé permettant la réduction et/ou le ralentissement de la progression des signes de sécheresse d’une peau, ladite méthode comprenant les étapes suivantes :
a) mesurer le niveau d’expression du gène codant la LCN1, dans un échantillon de peau exposé audit composé candidat;
b) comparer ledit niveau d’expression au niveau d’expression dans un échantillon de ladite peau non exposé audit composé ;
c) identifier ledit composé candidat comme un composé permettant la réduction et/ou le ralentissement de la progression des signes de sécheresse d’une peau lorsqu'une augmentation du niveau d’expression du gène codant la LCN1 dans l’échantillon de peau qui a été exposé audit composé candidat est détectée, par rapport au niveau d’expression du gène codant la LCN1 dans l’échantillon de peau qui n’a pas été exposée au composé candidat.
Selon un mode de réalisation préféré l’échantillon de peau utilisé dans la méthode d’identification de composé permettant la réduction et/ou le ralentissement de la progression des signes de sécheresse de la peau selon l’invention est une culture de cellules de peau, une culture d’épiderme, une peau complète reconstruite, un expiant de peau humaine, ou un échantillon de peau d’un sujet tel que défini précédemment.
Préférentiellement les méthodes selon l’invention comprennent une étape de traitement de l’échantillon afin de préparer la mesure du niveau d’expression du gène codant la LCN1. Par exemple l’échantillon traité est un extrait protéique soluble. En particulier si l’échantillon de peau a été obtenu en utilisant une surface adhésive telle qu’un disque D-squame® l’extrait protéique soluble peut être obtenu par un système d’extraction de protéines tel que celui décrit dans la demande internationale WO2015/009085 qui permet de mettre en contact les échantillons D-squames avec un volume minimal de tampon d’extraction et ainsi d’obtenir un extrait protéique soluble.
La présente invention porte également sur un kit comprenant :
a) un moyen pour la mesure de l’expression du gène codant la LCN1 dans un échantillon de peau, et
b) une notice d’instructions.
Par « moyen pour la mesure de l’expression du gène codant la LCN1» on entend un ligand spécifique de la protéine LCN1, comme par exemple un anticorps, de préférence monoclonal, un fragment Fab, un scFv ou un nanocorps, spécifique de cette protéine ou encore une puce microfluidique, comme celle décrite dans la demande internationale WO2011/126249, cette puce contenant des ligands spécifiques de la protéine LCN1. On entend alternativement une séquence nucléotidique complémentaire de l’ARNm du gène codant la LCN1 et s'hybridant spécifiquement à l’ARNm du gène codant la LCN1 ou, un fragment de celle-ci s'hybridant spécifiquement à l’ARNm du gène codant la LCN1, cette séquence ou ce fragment comprenant 5 à 50 nucléotides, préférentiellement 10 à 20 nucléotides, ou un couple d’amorces ou une sonde de 10 à 60 nucléotides, préférentiellement 15 à 30 nucléotides comprenant ladite séquence ou ledit fragment.
De préférence le moyen pour la mesure de l'expression du gène codant la LCN1 est au moins un ligand spécifique de la LCN1, en particulier un couple d'anticorps de capture et de détection spécifiques de la protéine LCN1.
Selon un mode de réalisation, le kit selon l’invention, comprend en outre un moyen de prélever l’échantillon de peau tel qu’un disque D-squame®.
La présente invention concerne en outre l’utilisation d’un kit selon l’invention pour identifier un composé permettant la réduction et/ou le ralentissement de la progression des signes de sécheresse d’une peau.
La présente invention sera illustrée par l’exemple suivant.
Exemple :
Le niveau de sécheresse visible de la peau a été évalué sur les joues de 376 femmes 5 âgées de 36 à 75 ans. Le niveau d’expression protéique du gène codant la LCN1 a également été évalué sur les joues de ces femmes, grâce à un prélèvement D-squame dont l’extrait protéique soluble a été analysé par un test ELISA réalisé sur une puce.
L’analyse statistique univariée des résultats obtenus montre une corrélation entre la 10 présence de ces signes de sécheresse et l’expression de la protéine LCN1.
Tableau 1 :
signes cliniques exactitude sensibilité spécificité valeur seuil (en ng/ml)
sécheresse 49% 69% 43% 72,23

Claims (10)

  1. REVENDICATIONS
    1, - Méthode de diagnostic d’une peau présentant des signes de sécheresse, chez un sujet, ladite méthode comprenant une étape de mesure du niveau d’expression du gène codant la LCN1, dans un échantillon de peau dudit sujet.
  2. 2, - Méthode de traitement cosmétique d’une peau présentant des signes de sécheresse chez un sujet, ladite méthode comprenant les étapes suivantes :
    a) mesurer le niveau d’expression du gène codant la LCN1, dans un échantillon de peau dudit sujet;
    b) déduire de l’étape a) si la peau dudit sujet présente des signes de sécheresse;
    c) si la peau est identifiée comme présentant des signes de sécheresse à l’étape b), traiter ladite peau avec une composition cosmétique permettant la réduction et/ou le ralentissement de la progression des signes de sécheresse de la peau.
  3. 3, - Méthode d’identification d’un composé permettant la réduction et/ou le ralentissement de la progression des signes de sécheresse d’une peau, ladite méthode comprenant les étapes suivantes :
    a) mesurer le niveau d’expression du gène codant la LCN1, dans un échantillon de peau exposé audit composé candidat;
    b) comparer ledit niveau d’expression mesuré à l’étape a) au niveau d’expression du gène codant la LCN1 dans un échantillon de peau non exposé audit composé ;
    c) identifier ledit composé candidat comme un composé permettant la réduction et/ou le ralentissement de la progression des signes de sécheresse d’une peau lorsqu'une augmentation du niveau d’expression du gène codant la LCN1 dans l’échantillon de peau qui a été exposé audit composé candidat est détectée, par rapport au niveau d’expression du gène codant la LCN1 dans l’échantillon de peau qui n’a pas été exposé au composé candidat.
  4. 4, - Méthode selon la revendication 3, dans laquelle ledit échantillon de peau est une culture de cellules de peau, une culture d’épiderme, une peau complète reconstruite, un expiant de peau humaine, ou un échantillon de peau d’un sujet.
  5. 5. - Méthode selon l’une des revendications 1 à 4, dans laquelle l’échantillon de peau est prélevé en utilisant un disque D-squame®.
  6. 6. - Méthode selon l’une des revendications 1 à 5, dans laquelle le niveau d’expression du gène codant la LCN1 est déterminé par le niveau d'expression en ARNm dudit gène ou par mesure du niveau d’expression de la protéine codée par ledit gène, de préférence par mesure du niveau d'expression de la protéine codée par ledit gène.
  7. 7. - Méthode selon la revendication 6, dans laquelle le niveau d’expression de la protéine codée par le gène codant la LCN1 est mesuré à l’aide d’au moins un ligand spécifique de la protéine LCN1.
  8. 8. - Kit comprenant :
    a) un moyen pour la détection, dans un échantillon de peau, de l’expression du gène codant la LCN1, et
    b) une notice d’instructions.
  9. 9. - Kit selon la revendication 8 dans lequel le moyen pour la détection, dans un échantillon de peau, de l’expression du gène codant la LCN1 est au moins un ligand spécifique de la LCN1, de préférence un couple d'anticorps de capture et de détection spécifiques de la protéine LCN1.
  10. 10. - Utilisation d’un kit selon l’une des revendications 8 à 9 pour l’identification d’un composé permettant la réduction et/ou le ralentissement de la progression des signes de sécheresse d’une peau.
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