FR3060561A1 - Nanoparticules organiques contenant un complexe metal-bis(dithiolene) et leurs utilisations. - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne l'utilisation d'un complexe métal-bis(dithiolène ) de formule (I) suivante : dans laquelle : - M représente un métal choisi dans le groupe constitué du nickel, du palladium, du platine, de l'or, du fer, du cobalt, du rhodium et de l'iridium, - R1, R2, R3 et R4, identiques ou différents, représentent un groupe hydrophile ou un groupe hydrophobe, et - z est égal à 0, -1 ou -2, pour la libération photothermique contrôlée de principes actifs.
Description
Titulaire(s) : CENTRE NATIONAL DE LA
RECHERCHE SCIENTIFIQUE Etablissement public,UNIVERSITE DE RENNES 1 Etablissement public, ECOLE NATIONALE SUPERIEURE DE CHIMIE DE RENNES Etablissement public.
Demande(s) d’extension
Mandataire(s) : LAVOIX.
154/ NANOPARTICULES ORGANIQUES CONTENANT UN COMPLEXE METAL-BIS(DITHIOLENE) ET LEURS UTILISATIONS.
_ La présente invention concerne l'utilisation d'un complexe métal-bis(dithiolène) de formule (I) suivante:
FR 3 060 561 - A1
(i) dans laquelle:
- M représente un métal choisi dans le groupe constitué du nickel, du palladium, du platine, de l'or, du fer, du cobalt, du rhodium et de l'iridium,
- R^ R2, R3 et R4, identiques ou différents, représentent un groupe hydrophile ou un groupe hydrophobe, et
- z est égal à 0, -1 ou -2, pour la libération photothermique contrôlée de principes actifs.
NANOPARTICULES ORGANIQUES CONTENANT UN COMPLEXE MÉTALBIS(DITHIOLÈNE) ET LEURS UTILISATIONS
La présente invention a pour objet de nouvelles nanoparticules organiques contenant un complexe métal-bis(dithiolène), ainsi que leurs utilisations, notamment pour la libération photothermique contrôlée de principes actifs.
Au cours des deux dernières décades, grâce au développement rapide des nanotechnologies, de nombreuses nanoparticules encapsulant des principes actifs, encore appelés nanovecteurs, ont été développées dans le but d’accroître l’efficacité thérapeutique et réduire les effets secondaires indésirables. L’encapsulation de principes actifs dans les nanovecteurs permet de diminuer la concentration de médicament sous forme libre au sein de l’organisme, de limiter les problèmes de solubilité et de stabilité des principes actifs, de diminuer leur clairance rapide, et, en particulier, leur manque de sélectivité, qui est responsable de la cytotoxicité et des effets secondaires indésirables lors du traitement. Les nanovecteurs qui permettent de transporter directement des principes actifs dans les zones à traiter offrent la possibilité de réduire les effets secondaires généralement observés chez les patients et d’accroitre l’efficacité des traitements médicamenteux. Cependant, le développement des nanovecteurs biocompatibles capables de délivrer à la demande des principes actifs de façon spécifique dans les zones à traiter reste un challenge.
Les nanovecteurs utilisés pour la libération contrôlée sont habituellement formulés, de façon à libérer le médicament/principe actif en réponse à des stimuli internes ou externes. Aujourd’hui, différents stimuli, tels que l’hydrophobicité, le pH, la température, des réactions enzymatiques, les champs magnétiques et la lumière ont été exploités pour faire de la délivrance contrôlée de principes actifs à partir de nanoparticules.
Parmi ces stimuli, la lumière est un moyen simple, efficace et facile à mettre en oeuvre pour libérer à la demande des principes actifs encapsulés au sein de nanoparticules. De plus, avec un rayonnement lumineux, il est plus aisé de contrôler spatialement et temporellement l’intensité du stimulus. Des lasers qui permettent d’obtenir des faisceaux fins et d’intensité variable sont couramment utilisés pour contrôler la perméabilité de nanovecteurs photosensibles.
Les rayonnements proche-infrarouge (NIR) offrent de nombreux avantages en raison de leur nature non invasive, une haute résolution spatiale et une pénétration des tissus en profondeur avec un minimum de dommages. Les rayonnements NIR sont donc de plus en plus utilisés dans les nouvelles photothérapies ainsi que pour la délivrance contrôlée de principes actifs. Les rayonnements NIR entre 800 nm et
400 nm correspondent à la fenêtre biologique, là où la peau, les organes, le sang et l'eau absorbent le moins. Dans cette zone d’énergie, les tissus sont moins endommagés et la pénétration laser augmentée.
Les agents photothermiques capables de convertir les rayonnements procheîo infrarouge en chaleur apparaissent de plus en plus comme une alternative intéressante pour faire de la délivrance contrôlée de principes actifs de façon contrôlée et non-invasive. En effet, sous irradiation NIR, l’agent photothermique libère de la chaleur, ce qui permet de moduler la perméabilité des nanoparticules organiques, dans lesquelles ils sont encapsulés, et donc de contrôler la libération des principes actifs.
A ce jour, la plupart de ces biotechnologies fondées sur les effets photothermiques reposent sur l'utilisation de nanoparticules d’or et de dérivés de porphyrine et de cyanine. Les cyanines et les porphyrines souffrent d’une photoinstabilité marquée sous irradiation et les nanoparticules d'or, en plus d’un manque de biodégradabilité et de clairance par le corps, sont aussi connues pour subir des changements de morphologie sous irradiation laser conduisant à la diminution de leur efficacité photothermique. En plus, les nanostructures d’or et les dérivés de porphyrine et de cyanine produisent de l’oxygène singulet sous irradiation NIR, ce qui provoque une dénaturation des principes actifs coencapsulés.
Par conséquent, il existe actuellement un besoin pour de nouveaux agents photothermiques sensibles à la lumière permettant de développer des nanovecteurs photoactivables efficaces pour la délivrance contrôlée de principes actifs.
La présente invention a pour but de fournir de nouveaux systèmes, thermiquement, chimiquement et photochimiquement stables, efficaces pour la délivrance contrôlée de principes actifs.
Un autre but de la présente invention consiste à disposer de systèmes ne produisant pas d’oxygène singulet, ce qui permet de conserver l’intégrité chimique et l’efficacité des principes actifs lors de la libération.
Ainsi, la présente invention concerne l’utilisation d’un complexe métalbis(dithiolène) de formule (I) suivante :
(I) dans laquelle :
- M représente un métal choisi dans le groupe constitué du nickel, du palladium, du platine, de l’or, du fer, du cobalt, du rhodium et de l’iridium,
- Rb R2, R3 et R4, identiques ou différents, représentent un groupe hydrophile ou un groupe hydrophobe, et
- z est égal à 0, -1 ou -2, pour la libération photothermique contrôlée de principes actifs.
Selon l’invention, le terme libération photothermique contrôlée (ou PTCR pour PhotoThermal Control Release, en anglais) désigne la libération contrôlée de médicaments ou principes actifs par un stimulus photothermique, c’est-à-dire suite à la conversion d’une irradiation laser en chaleur par un agent photothermique.
La présente invention est basée sur les propriétés des complexes de formule (I) susmentionnée, en les utilisant comme agent photoactif.
Complexes de formule (I)
Ces complexes sont de forts absorbeurs NIR chimiquement et photothermiquement stables. Ils présentent des coefficients d’absorption élevés (environ 30 000 M1.cm1) avec des maxima d’absorption dans le proche infrarouge de 600 nm à 1 600 nm en fonction de la nature de M et des groupements R1; R2, R3 et R4.
Ces complexes sont non luminescents, ce qui signifie que l’énergie absorbée est libérée dans l’environnement sous forme de chaleur.
A ce jour, les complexes métal-bis(dithiolène) n’ont jamais été utilisés pour faire de la délivrance contrôlée de principes actifs à partir de nanovecteurs organiques. La présente invention est basée sur les propriétés des complexes métal-bis(dithiolène) qui peuvent être efficacement co-encapsulés avec des principes actifs au sein de nanoparticules organiques telles que des liposomes, des nanoparticules de polymères, des nanocapsules lipidiques ou encore des virus (capside vide). Sous irradiation proche infrarouge, ces complexes sont capables de convertir efficacement les rayonnements NIR en chaleur ce qui permet de moduler la perméabilité des nanovecteurs organiques et donc de contrôler, de façon temporelle et spatiale, la libération des principes actifs.
Les propriétés photothermiques des complexes métal-bis(dithiolène) qui sont stables chimiquement et thermiquement n’ont pas été encore exploitées pour faire de la délivrance contrôlée de principes actifs à partir de nanoparticules organiques. Ces complexes apparaissent comme une alternative intéressante aux systèmes déjà décrits, reposant sur l’utilisation, soit de nanoobjets inorganiques difficilement éliminables par l’organisme ou encore de molécules organiques difficilement fonctionnalisables et instables sous irradiation laser. D’autre part, ces complexes ne produisent pas d’oxygène singulet, contrairement aux autres systèmes décrits, ce qui permet de conserver l’intégrité chimique et l’efficacité des principes actifs lors de la libération. L’utilisation de rayonnements proche-infrarouge (autour de 700-1 000 nm) permet également d’envisager une meilleure pénétration au sein des milieux biologiques, ce qui permettra de traiter des zones plus profondes dans les organismes. Il est également possible d’adapter de façon simple la longueur d’onde NIR en fonction de la nature du métal et des ligands dithiolène utilisés.
Selon un mode de réalisation, dans la formule (I), R2 et R4 peuvent former ensemble, avec les atomes de carbone qui les portent, un (hétéro)cycle comprenant de 5 à 8 atomes de carbone, et éventuellement au moins un hétéroatome, notamment N ou S.
Selon un mode de réalisation, dans la formule (I), M est Au, Pt, Ni, Fe, Co, Rh ou Ir. De préférence, M est Pt ou Ni, et préférentiellement, M est Ni.
Dans la formule (I), selon la nature de M, z est 0, -1 ou -2.
Selon un mode de réalisation, les complexes utilisés selon l’invention répondent à la formule (1-1 ) suivante :
dans laquelle les groupes Ri, R2, R3 et R4 sont tels que définis ci-dessus dans la formule (I).
Comme indiqué ci-dessus, les groupes R1; R2, R3 et R4, identiques ou différents, sont des groupes hydrophiles ou des groupes hydrophobes.
Lorsque les groupes R1; R2, R3 et R4 sont des groupes hydrophiles, identiques ou différents, ceux-ci peuvent être choisis dans le groupe constitué des sucres, des peptides hydrophiles, des polyéthylène glycols, des acides, des ammoniums, des zwitterions et des groupes hydroxylés. Selon un autre mode de réalisation, les groupes Rb R2, R3 et R4, identiques ou différents, peuvent être des groupes comprenant au moins un substituant choisi dans le groupe constitué des sucres, des peptides hydrophiles, des polyéthylène glycols, des acides, des ammoniums quaternaires, des zwitterions et des groupes hydroxylés.
Parmi les sucres, on peut citer par exemple le glucose, le fructose, le saccharose, le lactose et leurs dérivés acétates.
Parmi les peptides hydrophiles, on peut citer par exemple l'aspartame, l’acide pyro-glutamique, les polypeptides de lysine, hystidine, asparagine, glutamine, arginine, sérine, thréonine et a-sulfo-p-alanine.
Parmi les polyéthylène glycols, on peut citer par exemple le diéthylène glycol, le triéthylène glycol, le dodécaéthylène glycol, l’hexadécaethylène glycol ou le PEG 2000.
Parmi les acides, on peut citer par exemple les acides carboxyliques, les acides sulfoniques et les acides carboxyliques activés /V-hydroxysuccinimide.
Parmi les ammoniums quaternaires, on peut citer par exemple NH4 + ou bien des ammoniums quaternaires de structure générale NR4 +, avec des groupes alkyles courts tels que des groupes méthyle, butyle ou benzyle. Parmi les zwitterions, on peut citer par exemple des dérivés bétaïne ou sulfobétaïne obtenus par alkylation par la 1,3-propanesultone de fragments amine.
Lorsque les groupes Rb R2, R3 et R4 sont des groupes hydrophobes, identiques ou différents, ceux-ci peuvent être choisis dans le groupe constitué des peptides hydrophobes, des cholestérols, des groupes alkyles, linéaires ou ramifiés, comprenant de 1 à 20 atomes de carbone, et des groupes alcoxyles, linéaires ou ramifiés, comprenant de 1 à 20 atomes de carbone. Selon un autre mode de réalisation, les groupes Rb R2, R3 et R4, identiques ou différents, peuvent être des groupes comprenant au moins un substituant choisi dans le groupe constitué des peptides hydrophobes, des cholestérols, des groupes alkyles, linéaires ou ramifiés, comprenant de 1 à 20 atomes de carbone, et des groupes alcoxyles, linéaires ou ramifiés, comprenant de 1 à 20 atomes de carbone.
les complexes utilisés selon l’invention
Selon un mode de réalisation, répondent à la formule (I-2) suivante :
(I-2)
- z et M sont tels que définis ci-dessus dans la formule (I),
- Ra est H ou un groupe Rb tel que défini ci-dessous, et
- Rb est choisi parmi l’un des groupes suivants :
. un groupe alkyle ou alcoxylé, linéaire ou ramifié, comprenant de 1 à 20 atomes de carbone ;
. OH, . un groupe de formule -((CH2-CH2)2-O)n-CH3, n représentant un nombre entier compris entre 1 et 50 ;
. un groupe de formule (II) suivante :
(II) dans laquelle R’ est un groupe alkyle ou un groupe alkaryle comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, et est de préférence un groupe méthyle ou un groupe benzyle ; ou R’ est un groupe alkylamine comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, un groupe alkylammmonium comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, un groupe imidazole, un groupe carboxamide comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, une guanidine comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, ou encore un groupe hydroxyle ;
. un groupe de formule (III) suivante :
. un groupe de formule (IV) suivante :
OAc OAc
(iv)
Parmi les composés de formule (I-2), on peut citer les composés spécifiques suivants :
décrit dans la demande FR 2 682 678.
Parmi les composés de formule (I-2), on peut citer les composés de formule (1-2-1) suivante :
R
R dans laquelle :
- M et z sont tels que définis ci-dessus dans la formule (I),
- n est un nombre entier compris entre 1 et 50, de préférence compris entre 1 et 6, et préférentiellement égal à 3, et
- Ra est H ou un groupe de formule -O-[(CH2-CH2)2-O]n-CH3, n étant tel que défini ci-dessus.
Parmi les composés de formule (1-2-1), on peut citer les composés spécifiques suivants :
décrits dans l’article : Water-soluble nickel-bis(dithiolene) complexes as photothermal agents, K. MEBROUK, F. CHOTARD, C. LE GOFF-GAILLARD, Y. ARLOT-BONNEMAINS, M. FOURMIGUE, F. CAMEREL, Chem. Commun. 2015, 51, 5268-5270.
ou encore le composé suivant :
Selon un mode de réalisation, les complexes utilisés selon l’invention répondent à la formule (1-3) suivante :
îo dans laquelle :
- z et M sont tels que définis ci-dessus dans la formule (I),
- Rc est un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, comprenant de 1 à 20 atomes de carbone, et
- Rd est H ou un groupe ORC, Rc étant tel que défini ci-dessus.
De préférence, dans la formule (1-3), M est Ni, Pt ou Au, et z=0.
Parmi les composés de formule (1-3), on peut citer les composés spécifiques suivants :
ÔC12H25 OC12H25 OC12H25 0^12^25 ces deux composés étant décrits dans l’article : Discotic liquid crystals of transition métal complexes 25: influence of the central métal on columnar mesomorphism and ττ-acceptor properties of the octa-alkoxy-substituted bis(diphenyldithiolene)metal complexes, K. OTHA, K., Y. INAGAKI-OKA, H.
HASEBE, I. YAMAMOTO, Polyhedron 2000, 19, 267-274;
ou encore le composé suivant :
OC12H25 OC12H25 décrit dans l’article : Probing magnetic interactions in columnar phases of a 5 paramagnetic gold dithiolene complex, R. PEROCHON, P. DAVIDSON, S.
ROUZIERE, F. CAMEREL, L. PIEKARA-SADY, T. GUIZOUARN, M. FOURMIGUE,
J. Mater. Chem. 2011,2/, 1416-1422; ou encore les composés suivants :
n= 1,4, 8, 12 ces composés étant décrits dans les articles : (1) Amphiphilic paramagnetic neutral gold dithiolene complexes. R. PEROCHON, L. PIEKARA-SADY, W. JURGA, R. CLERAC, M. FOURMIGUE, Dation Trans. 2009, 3052-3061; et (2) Molecular Alloys of Neutral Gold/Nickel Dithiolene Complexes in Single-Component
Semiconductors, K. MEBROUK, W. KADDOUR, P. AUBAN-SENZIER, C.
PASQUIER, O. JEANNIN, F. CAMEREL, M. FOURMIGUE, Inorg. Chem. 2015, 54, 7454-7460.
Selon un mode de réalisation, les complexes utilisés répondent à la formule (I-4) suivante : _ selon l’invention
Ar-C(O)-X
Ar-C(O)-X‘
X-C(O)-Ar
X-C(O)-Ar (I-4) dans laquelle :
- z et M sont tels que définis ci-dessus dans la formule (I), et M est de préférence Ni, et z est de préférence égal à 0,
- X est -NH- ou -O-, et
- Ar est un groupe phényle, éventuellement substitué par au moins un substituant notamment choisi parmi les groupes alcoxyles comprenant de 1 à 20 atomes de carbone.
Parmi les composés de formule (I-4), on peut citer les composés spécifiques îo suivants :
tels que décrits dans l’article : Room-temperature columnar mesophases of nickel-bis(dithiolene) metallomesogens, S. DEBNATH, H. F. SROUR, B. DONNIO, Marc FOURMIGUE, F. CAMEREL, FISC Adv. 2012, 2, 4453-4462.
Parmi les complexes utilisés selon l’invention, on peut également citer les
décrits dans l’article : Near-infrared chiro-optical effects in metallogels, S. DEBNATH, J.-F. BERGAMINI, F. ARTZNER, C. MERIADEC, F. CAMEREL, M. FOURMIGUE, Chem. Commun. 2012, 48, 2283-2285.
îo ou encore les composés suivants :
décrits dans l’article : Photothermal Control of the Gélation Properties of Nickel Bis(dithiolene) Metallogelators under Near-infrared Irradiation, K. MEBROUK,
S. DEBNATH, M. FOURMIGUE, F. CAMEREL, Langmuir2014, 30, 8592-8597.
Selon un mode de réalisation, les complexes utilisés selon l’invention répondent à la formule (I-5) suivante :
dans laquelle :
- z et M sont tels que définis ci-dessus dans la formule (I), et
- Re est un groupe -S-Rf ou un groupe Rf,
Rf étant choisi parmi l’un des groupes suivants :
. un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, comprenant de 1 à 20 atomes de carbone ;
. un groupe de formule -((CH2-CH2)2-O)n-CH3, n représentant un nombre entier compris entre 1 et 50 ;
. un groupe de formule (II) suivante :
(II) dans laquelle R’ est tel que défini ci-dessus un groupe de formule (III) suivante :
un groupe de formule (IV) suivante :
OAc OAc
(iv)
Parmi les composés de formule (I-5), on peut citer le composé spécifique suivant :
4O's^bsx^'s'
3 décrit dans l’article : Water-soluble nickel-bis(dithiolene) complexes as photothermal agents, K. MEBROUK, F. CHOTARD, C. LE GOFF-GAILLARD, Y. ARLOT-BONNEMAINS, M. FOURMIGUE, F. CAMEREL, Chem. Commun. 2015, 51, 5268-5270.
Selon un mode de réalisation, les complexes utilisés selon l’invention répondent à la formule (I-6) ou (l-6-bis) suivante :
/ \
dans laquelle :
- z et M sont tels que définis ci-dessus dans la formule (I), et
- Rg et Rg’, identiques ou différents, sont choisis parmi l’un des groupes suivants :
. un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, comprenant de 1 à 20 atomes de carbone ;
. un groupe de formule -((CH2-CH2)2-O)n-CH3, n représentant un nombre entier compris entre 1 et 50 ;
. un groupe de formule (II) suivante :
(II) dans laquelle R’ est tel que défini ci-dessus, et est de préférence un groupe alkyle ou un groupe alkaryle comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, et préférentiellement un groupe méthyle ou un groupe benzyle ; un groupe de formule (III) suivante :
un groupe de formule (IV) suivante :
OAe Ûâc
De préférence, dans la formule (I-6), z=0 et M est Ni.
(iv)
Parmi les composés de formule (I-6), on peut citer les composés de formule (1-6-1) suivante :
(1-6-1) dans laquelle Rg est un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, comprenant de 1 à 20 atomes de carbone.
Parmi les composés de formule (1-6-1), on peut citer les composés spécifiques suivants :
CzH, s=C X
-... y J] y./ || y... c s—\ Il Il Z-® CB^17 bBH17
CU i* u
12*^25 ^12^25 ,S-^N ÿil |^|
C«_«
12**25
ÇigH;
16n33 'S
S=Z || Ni î| \=S
tels que décrits dans l’article : High photothermal activity within neutral nickeldithiolene complexes derived from imidazolium-based ionic liquids, K. MEBROUK,
F. CAMEREL, O. JEANNIN, B. HEINRICH, B. DONNIO, M. FOURMIGUÉ, Inorg.
Chem. 2016, 55, 1296-1303.
Nanoparticules organiques
Selon un mode de réalisation, le complexe métal-bis(dithiolène) tel que défini îo ci-dessus est encapsulé dans une nanoparticule organique, notamment choisie dans le groupe constitué des liposomes, des nanoparticules de polymères, des nanoparticules lipidiques et des capsides virales.
De préférence, la nanoparticule organique est un liposome, une nanoparticule lipidique, une capside virale ou une nanoparticule de polymères.
Selon l’invention, le terme « encapsulé >> signifie que le complexe de formule (I) susmentionné est contenu dans une nanoparticule. Le complexe est encapsulé au sein des nanoparticules organiques par des interactions primaires hydrophiles et hydrophobes.
Selon l’invention, le terme « nanoparticule organique >> désigne un objet d’une taille finie, de préférence comprise entre 5 nm et 1 000 nm, formé par l’agrégation de molécules organiques ou de polymères organiques.
Selon un mode de réalisation préféré, les nanoparticules organiques selon l’invention ont une taille comprise entre 5 nm et 1 000 nm, c’est-à-dire un diamètre compris entre 5 nm et 1 000 nm.
Selon l’invention, le terme « liposomes >> désigne des vésicules phospholipides renfermant un cœur hydrophile. Les phospholipides sont des unités amphiphiles constituées d’une tête hydrophile (sel de phosphate d’ammonium quaternaire) et d’une queue hydrophobe (chaînes alcanes). En solution dans l’eau, les parties hydrophobes interagissent entre elles de façon à orienter les parties hydrophiles vers le milieu aqueux.
Parmi les formulations liposomales pouvant être utilisées selon l’invention, on peut citer par exemple les formulations suivantes :
- HSPC (L-a-phosphatidylcholine hydrogénée (soja) - L-a-phosphatidylcholine, hydrogenated (Soy)'j, DSPG (sel sodique de 1,2-distéaroyl-sn-glycéro-3phosphoglycérol) et cholestérol,
- EPC (Egg PC - lécithine - phosphatidylcholine d’œuf) et cholestérol,
- HSPC, cholestérol et DSPE-PEG2000 (1,2-distéaroyl-sn-glycéro-3phosphoéthanolamine-N-[amino(polyéthylène glycol)-2000] (sel d’ammonium)),
- DSPC, cholestérol et DSPE-PEG2000,
- DSPC et cholestérol,
- EPG (phosphatidylglycérol d’œuf) et DMPC (1,2-dimyristoyl-sn-glycéro-3phosphatidylcholine),
- DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine), DPPG (sel sodique de
1,2-dipalmitoyl-sn-glycéro-3-phosphoglycérol), cholestérol et trioléine,
- DOPC, DPPG, cholestérol et trioléine,
- Egg Sphingomyéline et cholestérol,
- archaeolipides (PEG2000-tetraether et FA-PEG5000-tetraether)
Selon l’invention, le terme « nanoparticule de polymères >> désigne des nanoparticules à base de polymères hydrophobes ou de co-polymères à blocs amphiphiles pouvant appartenir, par exemple, à la famille des poly(esters), polyacrylates, polystyrènes, polyéthylène glycols ou polycarbonates.
De préférence, ces nanoparticules de polymères sont :
- biocompatibles et non toxiques,
- biodégradables (les molécules résultantes de sa décomposition, après la libération du médicament encapsulé, sont tenues d’être non toxiques),
- furtives pour ne pas être reconnues dès le départ par le système réticuloendothélial (RES) et donc éliminées par les cellules de RES responsables de la destruction des corps considérés comme étrangers,
- adaptées pour transporter une grande quantité de principe actif, qui doit être libéré de manière contrôlée sur son site d'action.
Pour répondre à ces besoins, les nanoparticules sont souvent formulées à partir d’un co-polymère à blocs amphiphile tel que le poly(éthylène glycol)-b/ocpoly(lactique-co-glycolique) (PEG-b-PLGA) ou le poly(éthylène glycol)-b/ocpoly(malate de benzyle) (PEG-b-PMLABe).
Selon un mode de réalisation, la partie hydrophobe (PLGA ou PMLABe) forme le cœur de la nanoparticule, tandis que la partie hydrophile (PEG) forme une couronne hydrophile permettant d’assurer la solubilité et d’augmenter sa furtivité visà-vis du RES.
Parmi les nanoparticules polymériques pouvant être utilisées selon l’invention, on peut citer par exemple les nanoparticules à base des polymères suivants :
- poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA)
- poly(s-caprolactone) (PCL)
- poly(méthyl méthacrylate) (PMMA)
- PEG-b-PLGA
- PEG-b-PLA (acide polylactique)
- Biotine-PEG-b-PMLABe (polyéthylèneglycol-b-poly(benzyl malate))
- FolicAcid- PEG-b-PMLABe
Selon l’invention, le terme « nanoparticule lipidique » désigne des nanoparticules colloïdales sphériques d’un diamètre variant de préférence de 5 nm à 1 000 nm formées par l’agrégation de lipides.
De préférence, les lipides sont choisis parmi les acides gras, les acylglycérols, les phosphoglycérides, les sphingolipides, les glycolipides, les polycétides, les stérols et les prénols.
Selon l’invention, le terme « capside virale » désigne une structure compacte de nature protéique qui entoure un génome viral, l'acide nucléique (ADN ou ARN).
De préférence, ces capsides virales sont choisies parmi les virus CCMV (cowpea chlorotic mottle virus), CPMV (cowpea mosaic virus), RCNMV (red clover necrotic mosaic virus), TMV (tobacco mosaic virus) et les bactériophages MS2, Οβ ou M13.
La présente invention concerne également une nanoparticule organique, notamment choisie dans le groupe constitué des liposomes, des nanoparticules de polymères, des nanoparticules lipidiques et des capsides virales, encapsulant au moins un complexe métal-bis(dithiolène) de formule (I) telle que définie ci-dessus.
De préférence, les nanoparticules organiques sont choisies parmi les liposomes et les nanoparticules de polymères.
Selon un mode de réalisation, les nanoparticules organiques selon l’invention contiennent en outre au moins un principe actif.
Parmi les principes actifs utilisés selon l’invention, on peut citer les principes actifs anti-inflammatoires, anticoagulants, anesthésiques, anticancéreux, antalgiques, antipyrétiques ou psychotropes.
En particulier, le principe actif (ou médicament) peut être choisi parmi les molécules suivantes : cisplatine, doxorubicine, paclitaxel, amphotéricine B, daunorubicine, vertéporfine, cytarabine, morphine, vincristine, mitoxantrone, topotécan, vinorelbine, lurtotécan, amikacine ou insuline.
Le choix du principe actif pouvant être encapsulé peut être fait selon l’invention en fonction de la nature de la nanoparticule organique.
Par exemple, dans le cas d’une nanoparticule de polymères, si le cœur de la nanoparticule de polymères est hydrophobe, des médicaments solubles dans les solvants organiques mais également dans l’eau devront être utilisés avec ce type de système. En effet lors de la formulation, le complexe de formule (I) et le médicament seront encapsulés dans le cœur par interaction hydrophobe avec le polymère. Lors de l’irradiation laser, la montée en température, due à l’effet photothermique des agents photoactifs (complexes), va augmenter la perméabilité ou créer des « brèches » dans les nanoparticules, provoquant ainsi un échange entre le cœur et le milieu extérieur hydrophile. Les principes actifs, étant aussi solubles dans l’eau, vont pouvoir se libérer du cœur de la nanoparticule et exercer leur action au niveau des cellules cancéreuses. Les agents photoactifs hydrophobes restent quant à eux piégés dans la nanoparticule car ils ne possèdent aucune interaction favorable avec l’environnement extérieur hydrophile.
Tous les liposomes sont plus ou moins thermosensibles, selon leur température de transition de phase (Tm) solide-liquide. Au-dessous de leur Tm, les liposomes sont dans leur état solide, la membrane lipidique est ordonnée et condensée, empêchant le médicament encapsulé d’être libéré dans îo l’environnement. Sous irradiation, lorsque la montée en température, due à l’effet photothermique, dépasse la Tm, l’enveloppe lipidique subit une transition de phase solide (ordonnée)-liquide (désordonnée). Ce changement de propriété conduit à l’augmentation de la perméabilité de la paroi, facilitant ainsi la libération des principes actifs. Lorsque l’irradiation laser est stoppée et que la température repasse au-dessous de la Tm, la membrane retourne dans son état solide et la libération du médicament est freinée. Cette technique permet de maîtriser la délivrance du médicament en fonction du temps d’irradiation. Le principe de libération sera le même pour le capsules lipidiques et les capsides virales.
Un autre facteur qui gouverne la vitesse de libération des principes actifs est la composition de la paroi lipidique.
La présente invention concerne également l’utilisation de la nanoparticule organique telle que définie ci-dessus, pour la libération photothermique contrôlée du principe actif.
La présente invention concerne également un procédé de libération photothermique contrôlée d’un principe actif, comprenant une étape d’irradiation à une longueur d’onde comprise entre 600 nm et 1 600 nm, d’une nanoparticule organique telle que définie ci-dessus.
L’étape d’irradiation est effectuée à une longueur d’onde qui est dans la bande d’absorption du complexe.
EXEMPLES
Exemple 1 : Préparation de nanoparticules à base de PEG42 ô-PMLABe73
Le poly(éthylène glycol)-b-poly(benzyle malate) (PEG42-ô-PMLABe73) est un copolymère à bloc amphiphile, permettant de préparer des nanoparticules stables, pouvant encapsuler des principes actifs ou des agents fluorescents. De plus, comme la plupart des polymères dérivés du poly(acide malique) (PMLA), il possède l’avantage d’être biocompatible, non-toxique et (bio)dégradable. La préparation de ces nanoparticules à base de PEG42-b-PMLABe73 se fait en 2 étapes. La première consiste à synthétiser le PEG42-b-PMLABe73 et la seconde est l’auto-assemblage du copolymère à bloc pour donner les nanoparticules de polymères désirées.
Le PEG42-b-PMLABe73 a été obtenu en 4 étapes selon le procédé décrit cidessous en suivant les protocoles décrits par Cammas et al. (S. Cammas, I. Renard, V. Langlois, Ph. Guérin, Polymer, 37(18), 4215-4220, 1996 ; Z.W. Huang, V. Laurent, G. Chetouani, J.Y. Ljubimova, E. Holler, T. Benvegnu, P. Loyer, S. Cammas-Marion, International Journal of Pharmaceutics, 423, 84-92, 2012) :
COOH
H,N—CH
I
CH2
I
COOH
II
Acide aspartique
NaBr, H2SO4
COOH
N2—CH
CO2CH2C6H5
Br «'•CH
CH2
I
COOH
H2O/CH2C12(1:1)/ pH = 7.2, 45°C, (2:1)
CO2CH2C6HS Br «CH KY cn2
COO ©
MeO-PEG42
ch2
I
COOH h2o THF, TFAA o°c
CO2CH2C6H5
HC—,0 μ /1
Il ( H H2 || \
O-C4-C-C —C-O-J-!
'1 'n
CO2CH2CgH5
MeO-PEG42-PMLABe
Le produit de départ, l’acide aspartique 11 (Sigma-Aldrich), est mis en présence de bromure de sodium (Sigma-Aldrich), d’acide sulfurique 2N (SigmaAldrich) et de nitrite de sodium (Sigma-Aldrich). Cette réaction permet de transformer dans un premier temps, la fonction amine de 11 en sel de diazonium 12, qui est ensuite substitué par un atome de brome, pour donner après recristallisation dans l’acétonitrile, l’acide (F?S)-bromosuccinique 13. Dans la seconde étape, le dérivé bromé 13 réagit avec de l’anhydride trifluoroacétique (TFAA, Sigma-Aldrich)) dans le THF anhydre (Sigma-Aldrich) à 0°C pour former, après déshydratation et cyclisation, l’intermédiaire réactionnel anhydride 14, sur lequel est ajouté de l’alcool benzylique (Sigma-Aldrich) après évaporation sous vide du THF et de l’acide trifluoroacétique formé. Dans cette troisième étape, l’alcool benzylique attaque par substitution nucléophile, soit en position 2, soit en position 5 du composé anhydride 14. L’attaque nucléophile est privilégiée en position 2 car c’est la plus électrophile, du fait de la proximité avec l’atome de brome. Par conséquent, l’acide (RS)-3benzyloxycarbonyl-3-bromopropanoïque 15 est obtenu en majorité par rapport à l’acide (RS)-2-bromo-3-benzyloxycarbonylpropanoïque 16 avec un ratio de (2:1). Le produit brut contenant 15 et 16 est ensuite solubilisé dans un mélange eau/dichlorométhane (1/1, pH = 7,2) et chauffé à 45°C pour obtenir, après cyclisation intramoléculaire, le (RS)-4-benzyloxycarbonyl-2-oxetanone (MLABe) 17. Lors de cette étape, la fonction carboxylate (-COO à pH = 7,4) fait une substitution intramoléculaire du brome, formant ainsi le produit désiré 17 avec un rendement de 20%, après purification par chromatographie sur silice et distillation sous vide. La dernière étape consiste à utiliser le bloc PEG comme amorceur de polymérisation du MLABe. Pour cela, le monomère MLABe 17, solubilisé dans du THF, est transféré sur une solution d’a-méthyl-eo-carboxylate-PEG42 de potassium (MeOPEG42-COO K+) (Iris Biotech) en présence d’éther couronne (6-crown-12, SigmaAldrich) dans du THF. La fonction carboxylate de la chaîne PEG attaque en position 4 du MLABe 17, amorçant la polymérisation anionique par ouverture de cycle. La nouvelle fonction carboxylate formée 18 peut attaquer une autre molécule de MLABe et le procédé continue ainsi de suite. La réaction de polymérisation est complète, lorsque la bande vc=0 (~ 1850 cm'1) caractéristique du dérivé lactone 17 a disparu du spectre Infra-Rouge (IR). Par cette méthode, le copolymère à bloc PEG42-b-PMLABe73 19 a été obtenu avec une masse molaire de 17 880 g/mol, déterminée par RMN 1H.
Une fois le polymère 19 synthétisé, les nanoparticules sont préparées par nanoprécipitation. Cette méthode décrite par Fessi et ses collaborateurs (Thioune, O., Fessi, H., Devissaguet, J.P., Puisieux, F., Int. J. Pharm. 1997, 146, 233-238) repose sur l’auto-assemblage du co-polymère dans un mélange eau/solvant organique.
Pour cela, le PEG42-ô-PMLABe73 (5 mg) est dissous dans 1 mL de THF puis rapidement additionné dans 2 mL d’eau distillée sous forte agitation. Le mélange est ensuite agité à température ambiante pendant 10 min. Lors de ce procédé, les parties hydrophobes du polymère (PMLABe) vont s’agréger, en laissant les parties hydrophiles (PEG42) en contact avec l’eau. Cette agglomération permet de former des nanoparticules de PEG42-ô-PMLABe73. Le THF est ensuite évaporé sous vide (évaporateur rotatif) et le volume final est ajusté à 2 mL par ajout d’eau, si nécessaire. La solution contenant les nanoparticules est analysée par diffusion dynamique de la lumière (DLS) et zétamétrie.
Les mesures réalisées par DLS révèlent que les nanoparticules de PEG42-ôPMLABe73 possèdent un diamètre hydrodynamique moyen de 93 nm avec un indice de polydispersité (Ip) de 0,14. Un Ip inférieur à 0,25 indique que les nanoparticules en suspension ont une répartition en taille homogène. De plus, ces résultats montrent que les nanoparticules de polymères de PEG42-ô-PMLABe73 ont un diamètre favorable à une accumulation par l’effet « Enhanced Perméation and Rétention » (EPR) (< 150 nm) au sein des tumeurs. La zétamétrie confirme quant à elle la stabilité des nanoparticules en solution, car elles possèdent un potentiel zêta négatif de -25 mV.
Exemple 2 : Préparation de liposomes à base d’Egg PC-PEG2000-DSPE
Comme décrit ci-dessus, ces nanoparticules lipidiques thermosensibles sont particulièrement intéressantes pour la libération photothermique contrôlée de principes actifs. En s’inspirant des différents travaux décrits précédemment, des liposomes à base d’Egg PC-PEG2OOo-DSPE ont été synthétisés. L’Egg PC, connu aussi sous le nom de lécithine, est un lipide provenant du jaune d’œuf et peut être utilisé sous sa forme naturelle ou synthétique. Le PEG2000-DSPE protège les nanovecteurs lipidiques d’une clairance rapide par le système réticulo-endothélial. De plus, il permet de réduire fortement les forces de Van der Waals et d’augmenter les interactions répulsives (stérique et électrostatique) entre liposomes. Cela permet de les désagréger et de les stabiliser en solution. Les produits de départ Egg PC (Avanti Polar Lipids) et PEG2000-DSPE (NOF, SUNBRIGHT) sont commerciaux
Une formulation d’Egg PC-PEG2ooo-DSPE avec un rapport massique de 9:1 a été préparée, qui permet d’obtenir des suspensions de nanovecteurs lipidiques stables.
Pour cela, deux solutions distinctes d’Egg PC et de PEG2000-DSPE ont été préparées dans du chloroforme à des concentrations de 10 mg/mL. Dans un ballon, 1,8 mL de la solution d’Egg PC (soit 18 mg) sont ajoutés puis 0,2 mL de la solution de PEG2000-DSPE (soit 2 mg) est additionné. Le mélange Egg PC plus PEG2000DSPE (9:1 massique) est agité pendant 30 min à température ambiante. Le chloroforme est ensuite éliminé sous pression réduite, pour former un film lipidique sur la paroi du ballon. Ce film est séché à l’aide d’une rampe à vide pendant 3 heures dans le but d’éliminer toute trace résiduelle de chloroforme. Il est ensuite hydraté par addition de 2 mL d’eau puis conservé 48 h au frigo, le film se décolle au fur et à mesure de la paroi. Après les 48 h d’hydratation, le film en suspension dans l’eau est exposé à cinq cycles de sonication (5 min d’ultra-sons suivies de 5 min de pause, fréquence 35 kHz). Les liposomes en suspension sont filtrés par centrifugation afin d’éliminer les lipides libres en solution qui n’auraient pas formés de liposomes. Pour cela, des filtres (Amicon Ultra 2 ml 50K) retenant les liposomes et laissant passer les lipides libres sont utilisés. Les liposomes sont ensuite redispersés dans de l’eau pour atteindre un volume final de 2 mL.
Pour confirmer la formation des liposomes, des mesures de DLS ont été réalisées selon le même protocole que pour les nanoparticules de PEG42-ÔPMLABe73. La taille de ces liposomes est de 87 nm avec un Ip de 0,29. L’indice de polydispersité des liposomes est plus élevé que celui des nanoparticules (Ip = 0,14).
Exemple 3 : Préparation du complexe hydrophile [Ni(dphedt)2]°-(PEG)8 (NÎ8PEG)
Les composés tosylate d'éther monométhylique de triéthylèneglycol (Tanaka, M.; Yoshiaka, K.; Hiraka, Y.; Fujimaki, M.; Kawahara M.; Niwa, O. Langmuir, 2013, 29, 13111-13120), 4,4'-Dihydroxybenzil 8 (Horie, H.; Takagi, A.; Hasebe, H.; Ozawa, T.; Ohta, K. J. Mater. Chem. 2001, 11, 1063-1071) et 3,3',4,4'-féfrahydroxybenzil 8’ (Ichihara, M.; Miida, M.; Mohr, B. Ohta, K. J. Porphyrins and phthalocyanines 2006, 10, 1145-1155) ont été synthétisés comme précédemment décrit.
Synthèse du composé 9’ :
OH
OH
K2CO3 (1,68 g,
12,2 mmol) a été ajouté à une solution de 3,3',4,4'-fefrahydroxybenzil 8’ (0,417 g, 1,52 mmol) dissout dans du DMF (5 ml_) et le mélange a été agité pendant 10 min. Le tosylate d'éther monométhylique de triéthylèneglycol îo (2,32 g, 3,14 mmol) a été lentement ajouté et le mélange a été agité pendant 50 h à
100°C. Après refroidissement à température ambiantes le DMF a été évaporé sous pression réduite. Le résidu a été dissous dans une solution aqueuse de HCl 0,5 M (50 ml) et extrait avec du DCM (3 x 50 ml). Les extraits organiques combinés ont été lavés avec une solution aqueuse de HCl 0,5 M (2 x 50 ml) et de la saumure (2 x 50 15 ml), séchés avec du Na2SO4 et concentrés pour donner un produit brut sous la forme d'une huile orange / marron. Le produit brut a été purifié par chromatographie sur colonne de gel de silice avec du DCM / MeOH 95:5 comme éluant pour donner le produit 9' sous la forme d'une huile orange (975 mg, 75% de rendement).
1H RMN (300 MHz, CDCI3) : δ (ppm) 7,57 (d, 2H, J = 2,0 Hz, CHAr), 7,43 (dd, 20 2H, J = 8,5, 2,0 Hz, CHAr), 6,89 (d, 2H, J = 8,5 Hz, CHAr), 4,19-4,23 (m, 8H, CH2),
3,90-3,86 (m, 8H, CH2), 3,71-3,75 (m, 8H, CH2), 3,67-3,60 (m, 16H, CH2), 3,55-3,50 (m, 8H, CH2), 3,36 (s, 6H, CH3), 3,35 (s, 6H, CH3).
13C RMN (75 MHz, CDCI3) : δ (ppm) 193,39 (C=O), 154,59 (CAr), 148,94 (CAr), 126,46 (CAr), 126,25 (CHAr), 112,98 (CHAr), 112,26 (CHAr), 71,85 (CH2), 71,84 (CH2), 25 70,87, (CH2), 70,82 (CH2), 70,60 (CH2), 70,48 (CH2), 69,44 (CH2), 69,27 (CH2),
68,71 (CH2), 68,56 (CH2), 58,96 (CH).
Anal. Cale, pour C42H660i8, H2O : C, 57,52 ; H, 7,82 ; O, 34.66 ; Trouvé C, 56,91 ; H, 7,85 ; O, 34,52.
Synthèse du composé 3
o ,o (ii) Nid- 6H2O DMI 90°C
DMI 110°C
P4S10 (907 mg, 2,04 mmol) a été ajouté au composé 9' (798 mg, 0,928 mmol) dissous dans de la 1,3-diméthyl-2-imidazolidinone (DMI) (10 ml) et le mélange résultant a été agité pendant 2 heures à 110°C sous atmosphère de N2. NiCI2.6H2O (110 mg, 0,464 mmol) dissous dans l'eau (1 ml_) a ensuite été ajouté et le mélange a été chauffé à 90 ° C pendant 2 heures. La DMI et l’eau ont été évaporées sous pression réduite. Le résidu a été purifié par chromatographie sur colonne de gel de silice avec un mélange DCM / EtOH 94:6 comme éluant pour donner le produit 3 sous forme de solide cireux vert foncé (320 mg, 37% de rendement).
1H RMN (300 MHz, CDCI3) : δ (ppm) 6,98 (d, 4H, J = 2,0 Hz, CHAr), 6,92 (dd, 4H, J = 8,5, 2,0 Hz, CHAr), 6,79 (d, 4H, J = 8,5 Hz, CHAr), 4,18-4,15 (m, 8H,CH2), 4,04-4,00 (m, 8H, CH2), 3,90-3,86 (m, 8H, CH2), 3,81-3,64 (m, 56H, CH2), 3,573,51 (m, 16H, CH2), 3,38 (s, 12H, CH3), 3,36 (s, 12H, CH3).
13C RMN (75 MHz, CDCI3) : δ (ppm) 180,37 (CS), 149,66 (CAr), 148,41 (CAr), 134,77 (CAr), 122,32 (CHAr), 114,90 (CHAr), 113,45 (CHAr), 71,87 (CH2), 70,80 (CH2),
70,75 (CH2), 70,61 (CH2), 70,49 (CH2), 69,54 (CH2), 69,49 (CH2), 68,65 (CH2), 68,54 (CH2), 58,96 (CH).
Anal. Cale, pour C84H132NiO32S4, 2H2O : C, 53,75 ; H, 7,30 ; S, 6.83 ; Trouvé C, 53,94 ; H, 7,32 ; S, 6,73.
m/z + Na attendu : 1861,68303 m/z + Na trouvé : 1861,6848
UV-Vis-NIR (H2O): 940 nm (ε = 36650 L.mol1.cm1)
220 nm (ε = 132300 L. mol-1 .cm-1)
UV-Vis-NIR (DCM): 948 nm (ε = 36000 L.mol1.cm1)
308 nm (ε = 130800 L.mol1 .cm1)
Exemple 4 : Préparation du complexe [Ni(dphedt)2]0-(OC12H25)4 (NI4C12)
Un mélange de 4,4'-dihydroxybenzil 8 (3,26 g, 13,5 mmol), de 1bromododécane (10,0 g, 40,5 mmol) et de carbonate de potassium en poudre (7,46 g, 54 mmol) a été agité dans du DMF (80 ml_) pendant 50 h À 110°C. Après refroidissement à température ambiante, le DMF a été évaporé sous pression réduite. Le mélange résultant a été extrait avec du CH2CI2. Les phases organiques ont été combinées, rincées plusieurs fois à l'eau, séchées sur du sulfate de magnésium anhydre et concentrées sous pression réduite, ce qui a donné un produit brut qui a été purifié par chromatographie sur colonne de gel de silice (éluant : éther de pétrole / CH2CI2 50/50) pour obtenir un solide jaune (5,57 g, 70%).
1H RMN (300 MHz, CDCI3) : δ (ppm) 7,96 (m, 4H, CHAr), 7,03 (m, 4H, CHAr),
4,11 (t, 4H, J = 6,5 Hz, OCH2), 1,87-1,32 (m, 40H, CH2), 0,95 (t, 6 H, J = 6,3 Hz, CH3).
13C RMN (75 MHz, CDCI3) : δ (ppm) 193,57 (C=O), 164,59 (CAr), 132,17 (2 CHAr), 126,00 (CAr), 114,68 (2 CHAr), 68,60 (CH2), 45,33 (CH2), 31,93 (CH2), 29,64 (CH2), 29,59 (CH2), 29,56 (CH2), 29,36 (CH2), 29,33 (CH2), 29,02 (CH2), 25,90 (CH2), 22,70 (CH2), 13,89 (CH3).
Synthèse du composé 11 ÎNi4Ci?) :
| ()P4Sio | i^ï | ||||
| DM1 1 10°C | ï| ni lï | ||||
| (ii) NiCI2 6H2O DMI 90°C | o | Ό | 0^12^25 |
Un mélange de 4,4'-bis(dodécyloxy) benzil 10 (2,90 g, 5 mmoles) et de pentasulfure de phosphore (4,44 g, 10 mmol) dans 5 ml de 1,3-diméthyl-2imidazolidinone (DMI) a été chauffé à 110°C pendant2 h. Le mélange réactionnel a été refroidi à 60°C. Une solution de chlorure de nckel hexahydraté (594 mg, 2,5 mmol) dans de l'eau (3 ml) a été ajoutée au mélange réactionnel et mise à réagir à 90 °C pendant 2 h à l'air. De l’éthanol a été ajoutéau mélange et le précipité formé a été filtré, lavé avec de l'éthanol et séché sous vide. La purification du produit a été effectuée par chromatographie sur gel de silice, en éluant avec de l'éther de pétrole et du CH2CI2 (7:3 %v/v). Des cristaux bruns en forme d'aiguille ont été obtenus par diffusion lente de MeOH sur une solution du produit dissous dans du CH2CI2(58%).
1H RMN (300 MHz, CDCI3): δ (ppm) 7.32 (d, 8H, J = 9 Hz, CHAr), 6,79 (d, 8H,
J = 9 Hz, CHAr), 3,96 (t, 8H, J = 6 Hz, CH2), 1,79 (qt, 8H, J=6Hz, CH2), d 1,27-1,47 (m, 72H, CH2), 0,89 (t, 12H, J = 6Hz, CH3).
13C RMN (75 MHz, CDCI3): δ (ppm) 180,43 (4 CS), 159,85 (4 CAr), 134,19 (2
CHAr), 130,34 (CAr), 114,31 (2 CHAr), 68,10 (CH2), 31,91 (CH2), 29,65 (CH2), 29,63 (CH2), 29,59 (CH2), 29,56 (CH), 29,39 (CH2), 29,34 (CH2), 29,21 (CH2), 26,03 (CH2), 22,68 (CH2), 14,11 (CH3).
Anal. cale, pour CyeHneNiC^ : C 71,28, H 9,13. Trouvé : C 70,84, H 9,12. UV-Vis-NIR (DCM): 933 nm (ε =31300 Lmol Lcm’1)
Exemple 5 : Préparation du complexe [Ni(dphedt)2]°-(OC12H25)8 (Ni8C12)
Synthèse du composé 10’ :
Un mélange de 3,3'4,4'-tétrahydroxybenzil 8' (3,04 g, 11 mmol), de 1bromododécane (11,0 g, 44 mmol) et de carbonate de potassium en poudre (5,68 g, 44 mmol) dans du DMF (75mL) a été agité pendant 50 h à 110°C. Après refroidissement à température ambiante, le DMF a été évaporé sous pression réduite. Le résidu a été extrait avec du CH2CI2 (3 x 20 mL). Les phases organiques ont été combinées, rincées plusieurs fois avec de l'eau, séchées sur du sulfate de magnésium anhydre et concentrées sous pression réduite, pour donner un produit brut qui a ensuite été purifié par chromatographie sur colonne de gel de silice (éluant : éther de pétrole / CH2CI2 70/30). Le produit a été isolé sous forme d’une poudre blanche (7,04 g, 67%).
1H RMN (300 MHz, CDCI3) : δ (ppm) 7,55 (d2H, , J = 8,4 Hz, CHAr), 7,42 (dd, 2H, J = 8,4 Hz, 2,1 Hz, CHAr), 6,84 (d, 2H, J = 8,4 Hz, CHAr), 4,05 (t, 8H, J = 6 Hz, OCH2), 1,84 (qt, 8 H, J = 6 Hz, CH2), 1,46 (m, 8H, CH2), 1,26 (m, 64H, CH2), 0,88 (t, 12H, J=6 Hz, CH3).
13C RMN (75 MHz, CDCI3) : δ (ppm) 193,81 (C=O), 154,90 (CAr), 140,22 (CAr), 126,14 (CHAr), 126,10 (CAr), 112,05 (CHAr), 111,44 (CHAr), 69,15 (CH2), 69,12 (CH2), 69,06 (CH2), 31,91 (CH2), 29,69 (CH2), 29,66 (CH2), 29,64 (CH2), 29,61 (CH2), 29,57 (CH2), 29,37 (CH2), 29,35 (CH2), 29,32 (CH2), 29,02 (CH2), 28,87 (CH2), 25,96 (CH2), 25,89 (CH2), 22,68 (CH2), 14,12 (CH3).
Synthèse du composé 11 ’ (Ni8Ci?) :
| θθ12Μ25 | OC-I2H25 | OC-12 | H26 | |||||
| ^12^25^^ | Ci2H25O. | xoc12h25 | ||||||
| T l | (i) F4S]0 | ί I | ||||||
| DMI 110 C | Λ | |||||||
| - | T | \ / |ï Ni | ||||||
| ipp | '0 | (ii) NiCl2 6H2O | -s s-^ | |||||
| DMI 90°C | ||||||||
| C12H25O | C12H25° | *^ΟΟ12Η25 | ||||||
| θθ12Ηί5 | OC12H25 | oc12 | h2S | |||||
| 10' | 11' |
Un mélange de 500 mg (0,5 mmol) de 10’ et de pentasulfure de phosphore (352 mg, 1,6 mmol) dans 5 ml de 1,3-diméthyl-2-imidazolidinone (DMI) a été chauffé à 110°C pendant 2 h. Le mélange réactionnel a été lefroidi à 60°C. Une solution de chlorure de nickel (NiCI2, 6H2O, 70 mg, 0,25 mmol) dans de l'eau (1 ml) a été ajoutée au mélange réactionnel et le mélange a été chauffé à 90 °C pendant 2 h à îo l'air. Après refroidissement, de l’éthanol a été ajouté au mélange et le précipité formé a été filtré, lavé avec de l'éthanol et séché sous vide. La purification du produit a été effectuée par chromatographie sur gel de silice en éluant avec un mélange éther de pétrole / CH2CI2 (8:2) pour obtenir un solide vert foncé (282 mg,
56%).
1H RMN (300 MHz, CDCI3) : δ (ppm) 7,02 (dd, 4H, J = 8,4 Hz, 2,1 Hz, CHAr),
6,86 (d, 4H, J = 2,1 Hz, CHAr), 6,77 (d, 4H, J = 8,4 Hz, CHAr), 3,98 (t, 8H, J = 6 Hz, OCH2), 3,77 (t, 8H, J = 6,6 Hz, CH2), 1,82 (qt8 H, , J = 5,55 Hz, CH2), 1,69 (qt, 8H, J= 5,55 Hz, CH2), 1,37 (m, 144H, CH2), 0,88 (td, 24H, J= 6,9 Hz, 1,8 Hz, CH3).
13C RMN (75 MHz, CDCI3) : δ (ppm) 180,58 (CS), 149,98 (CAr), 148,55 (CAr),
134,47 (CAr), 121,95 (CHAr), 114,31 (CHAr), 112,81 (CHAr), 69,12 (CH2), 31,93 (CH2),
29,76 (CH2), 29,67 (CH2), 29,45 (CH2), 29,41 (CH2), 29,39 (CH2), 29,31 (CH2), 29,06 (CH2), 26,00 (CH2), 22,69 (CH2), 14,11 (CH3).
Anal. cale, pour C124H2i2NiO8S4 : C 73,80, H 10,59. Trouvé : C 73,54, H 10,07 UV-Vis-NIR (DCM) : 933 nm (ε =47100 L.moU.crri1).
Exemple 6 : Encapsulation des complexes de Ni-bis(dithiolène)
Selon le type de nanovecteur utilisé, des complexes de Ni-bis(dithiolène) 30 hydrophiles comme hydrophobes peuvent être encapsulés. Les NPs-PEG42-ô3060561
PMLABe73 sont constituées d’un cœur hydrophobe de PMLABe, entouré par une couronne hydrophile de PEG. Par conséquent des tentatives d’encapsulation de Nibis(dithiolène) lipophile tel que le complexe 11 [Ni(dphedt)2]0-(OC12H25)4 (Ni4C12) ont été menées. Les nanovecteurs lipidiques ont quant à eux la capacité d’encapsuler les deux types de molécules. En effet, les complexes dithiolène hydrophobes seraient encapsulés dans la bicouche lipidique tandis que ceux hydrophiles se retrouveraient dans le cœur du liposome. De ce fait, le complexe hydrophile [Ni(dphedt)2]°-(PEG)8 3 (NÎ8PEG) et son analogue hydrophobe 11’ [Ni(dphedt)2]°(OCi2H25)8 (Nî8C12) ont été choisis pour l’encapsulation dans les liposomes Egg PCPEG2OOo-DSPE.
Exemple 6.1 : Préparation et caractérisation des NPs-PEG42-b-PMLABe73Ni4C12
Dans le cas des nanoparticules de polymères, 5 mg de PEG42-b-PMLABe73 sont solubilisés dans 944 pL de THF et 56 pL d’une solution de 11 dans du THF à une concentration de 9 mg/mL sont ensuite additionnés, afin que la quantité de complexe représente 10 % de la masse de polymère (10 % / polymère), soit 0,5 mg. Cette solution (polymère + complexe dans le THF) est ensuite additionnée rapidement dans 2 mL d’eau sous forte agitation. Le mélange est agité à température ambiante pendant 10 min, puis le THF est évaporé sous vide (évaporateur rotatif). Le volume final est ajusté à 2 mL par ajout d’eau, afin d’obtenir une solution verte de NPs-PEG42-b-PMLABe73-Ni4C12 ([C]poiymère = 2.5 mg/mL, [Cjcompiexe = 250 pg/mL). La suspension est ensuite centrifugée puis le filtrat et le concentré, sont analysés par spectroscopie UV-Vis-NIR. L’absence de bande NIR dans le filtrat démontre que la totalité du complexe de Ni-bis(dithiolène) est encapsulée. Le complexe 11 encapsulé dans les NPs-PEG42-b-PMLABe73 (NPsNi4Ci2) et mis en suspension dans l’eau, a un maximum d’absorption à 914 nm et un coefficient d’extinction d’environ 10 200 L.mol1 .cm1. Il faut noter que ces valeurs sont inférieures à celle du complexe 11 libre en solution dans le dichlorométhane (Àmax = 933 nm et ε = 31 300 L.mol'1 .cm'1).
Les mesures par DLS ont révélé la présence de nanoobjets avec une taille moyenne de 114 nm et un Ip de 0,18. Du fait de l’encapsulation de complexe de Nibis(dithiolène), le diamètre des NPs-Ni4Ci2 est supérieur à celui des nanoparticules polymériques vides (93 nm) précédemment préparées. L’indice de polydispersité (0,18) et le potentiel zêta négatif (-27 mV) indiquent que les nanoparticules sont homogènes et qu’elles ne forment pas d’agrégat en solution.
L’imagerie par microscopie électronique en transmission (TEM) a également été mise en oeuvre afin de déterminer visuellement la forme des nanoparticules et de comparer leur taille à celle obtenue par DLS. Pour cela, une goutte de la suspension des NPs-Ni4C12 a été déposée sur une grille en cuivre recouverte d'une membrane de carbone. Après 10 min d’absorption sur la grille, l’excès de solution est éliminé à l’aide de papier absorbant. Ensuite, une goutte d’agent de contraste (acide phosphotungstique, 0,1 v% dans l’eau) est ajoutée sur la grille et après 30 s d’absorption, l’excès est à nouveau éliminé. Une fois la grille bien sèche, l’échantillon est placé sous le faisceau d'électron. Le microscope utilisé est un JEOL 2010 LaB6 fonctionnant à 80 kV. La caméra sur laquelle les images ont été enregistrées est une caméra CCD (Charge Coupled Device) GATAN Orius 200D.
Les images obtenues montrent des nanoparticules sphériques ayant un diamètre de 63,4 ± 22,1 nm. Cette valeur est inférieure à celle mesurée par DLS (114 nm) car du fait de l’absence de solvant, il n’y a pas de couche de diffusion autour des nanoparticules lors des mesures par TEM. Les mesures par spectroscopie UV-Vis-NIR, par DLS et par TEM démontrent bien la formation de NPs-Ni4C12.
La stabilité de ces nanoparticules dans le temps a été étudiée. Pour cela, une suspension de NPs-Ni4C12 a été suivie par DLS. Après 2 mois de suivi, la taille des nanoparticules est constante avec un diamètre hydrodynamique autour de 110 nm. Cette régularité dans les résultats est un signe de la bonne stabilité des nanoparticules en suspension dans l’eau.
La stabilité de ces nanoparticules sous irradiation laser a également été testée. Dans ce but, une suspension de ces nouvelles nanoparticules a été irradiée par intermittence. Cette étude met tout d’abord en évidence l’effet photothermique des NPs-Ni4Ci2, avec une élévation de température supérieure à 85°C. Il faut aussi noter la constance de l’effet photothermique même après plusieurs cycles d’irradiation. En s’appuyant sur ces résultats, l’efficacité photothermique (η) des NPs-Ni4Ci2 a été déterminée en utilisant l’équation décrite par Roper et ses collaborateurs (Roper, D. K.; Ahn, W.; Hoepfner, M. J. Phys. Chem. C 2007, 111, 3636-3641).
De cette façon, le η calculé est de 26%. De plus, la taille des nanoparticules après exposition laser reste la même. Tous ces résultats mettent en avant que les
NPs-Ni4C12 sont stables à la fois dans le temps et sous irradiation laser, tout en possédant une bonne efficacité photothermique.
Exemple 6.2 : Préparation et caractérisation des liposomes (Lp) Lp-Ni8C12 et Lp-NÎ8PEG
Les nanovecteurs lipidiques peuvent encapsuler soit un complexe hydrophobe tel que le [Ni(dphedt)2]0-(OCi2H25)811’, dans leur bicouche lipidique (Lp-Ni8Ci2), soit un complexe hydrophile tel que le [Ni(dphedt)2]°-(PEG)8 3, dans leur cœur aqueux (Lp-NÎ8PEG).
Dans le cas des Lp-Ni8Ci2, l’objectif a été d’encapsuler, dans un premier temps, 5% du complexe par rapport à la masse en lipide (5% / lipide), soit 1 mg de Ni8Ci2. Pour cela, 1 mL d’une solution à 1 mg/mL du complexe 11’ dans le chloroforme (soit 1 mg), est ajouté au milieu contenant 1,8 mL d’une solution de Egg PC à 10 mg/mL (soit 18 mg) et 0,2 mL d’une solution de PEG2000-DSPE à 10 mg/mL (soit 2 mg), toutes deux préparées dans du chloroforme. Le mélange est agité pendant 30 min puis le chloroforme est éliminé sous pression réduite. Le film lipidique Egg PC-PEG2000-DSPE-Ni8C12 obtenu est séché à la rampe à vide pendant 3 heures puis hydraté avec 2 mL d’eau. Après 48h d’hydratation, la suspension est passée aux ultrasons 5 fois pendant 5 min (fréquence 35 kHz). La solution est ensuite centrifugée à travers un filtre (Millipore Amicon 10K) afin d’éliminer l’excès de produit non encapsulé. Le concentré est redissous dans 2 mL d’eau pour offrir une suspension de Lp-Ni8C12 de couleur verte.
La préparation des nanovecteurs Lp-Ni8PEG se différencie quant à elle, par le fait que le film lipidique est cette fois-ci constitué uniquement de Egg PC-PEG2000DSPE, puis hydraté avec 2 mL d’une solution à 4 mg/mL en NÎ8PEG dans l’eau, soit 40% par rapport à la masse de lipide. Après 48h d’hydratation, la suite de la procédure est identique à celle des Lp-Ni8Ci2. Ainsi une suspension de Lp-Ni8PEG de couleur verte a été obtenue.
Dans les deux cas, le filtrat et le concentré ont été dosés par spectroscopie UV-Vis-NIR, afin de déterminer le taux d’encapsulation des complexes 11’ et 3 dans les nanovecteurs lipidiques.
En ce qui concerne les Lp-Ni8Ci2, le spectre d’absorption UV-Vis-NIR du filtrat ne montre aucune bande d’absorption dans le NIR, contrairement à celui du concentré après dilution par 10. Par conséquent, la totalité du complexe 11’ a été encapsulé, soit 5% / lipide ([C]LiPide = 10 mg/mL et [C]COmPiexe = 500 pg/mL). Ces mesures UV-Vis-NIR du concentré contenant les Lp-Ni8C12 en suspension dans l’eau montrent que le complexe Ni8C12 encapsulé a un maximum d’absorption à 986 nm (Amax = 0.384, dilution par 10) et un ε de 14 193 L.mol1 .cm1. En revanche, lors de la détermination de l’encapsulation du complexe NÎ8PEG 3, les mesures UV-VisNIR, après une dilution par 20, montrent une bande d’absorption dans le NIR, à la fois dans le filtrat et dans le concentré. En effet, le complexe libre en solution se retrouve dans le filtrat tandis que celui encapsulé est dans le concentré. Ces résultats indiquent que la totalité du complexe 3 n’a pas été encapsulée. En utilisant, le ε déterminé pour le NÎ8PEG libre en solution (ε ~ 14200 L.mol'1 .cm'1) et le spectre d’absorption du filtrat (Amax = 0.737, dilution par 20), il est déterminé que 27% / lipide de NÎ8PEG initialement introduit n’est pas encapsulé. Par conséquent, 13% / lipide du complexe NÎ8PEG est encapsulé ([C]LiPide = 10 mg/mL et [C]COmPiexe = 1,3 mg/mL). En s’appuyant sur ce résultat et sur le spectre d’absorption du concentré (Amax = 0,394, dilution par 20), il en est déduit que la suspension de Lp-Ni8PEG a un maximum d’absorption à 936 nm avec un ε d’environ 10 400 L.mol'1.cm1, ce qui est comparable au complexe 3 libre en solution.
Des essais pour introduire une plus grande quantité de complexe NÎ8C12 11’ ont été réalisés. En utilisant la même technique de préparation que celle décrite cidessus, des Lp-Ni8C12 ont été préparés en introduisant initialement différentes quantités de complexe allant de 5% à 30% par rapport à la masse de lipide. L’exploitation des résultats obtenus, par spectroscopie UV-Vis-NIR, indique que la quantité maximale de complexe NÎ8C12 encapsulée est de 5% par rapport à la masse de lipide. Par conséquent, les lots de Lp-Ni8C12 seront par la suite préparés en ajoutant initialement 5% du complexe 11’ par rapport à la masse de lipide. En ce qui concerne les Lp-Ni8PEG, 13% par rapport à la masse de lipide, sur les 40% initialement introduit ont été encapsulés (quantité suffisante pour avoir un effet photothermique).
Des mesures DLS des deux suspensions ont été réalisées afin de déterminer le diamètre hydrodynamique des Lp-Ni8Ci2 et des Lp-Ni8PEG. Les liposomes contenant dans leur bicouche lipidique les complexes Ni8Ci2 ont une taille de 180 nm avec un lp de 0,29 tandis que les nanoparticules lipidiques encapsulant dans leur cœur hydrophile le complexe NÎ8PEG ont une taille de 90 nm et un lp de 0,30. La localisation du complexe dans le liposome est à l’origine de la différence de taille entre les Lp-Ni8C12 et Lp-Ni8PEG. En effet, les complexes
NÎ8PEG, qui sont à l’intérieur du liposome n’ont pas d’influence sur la paroi, par conséquent les Lp-Ni8PEG ont une taille proche de celle des Lp vides (87 nm). En revanche, les complexes Ni8C12 s’insèrent dans la paroi lipidique du liposome lors de sa formation, entraînant l’augmentation de taille du liposome.
Des images par TEM des Lp-Ni8C12 ont été obtenues. Les observations révèlent que les liposomes déposés sur la grille ont une taille de 37 ± 6.3 nm. Ce diamètre, plus faible que celui mesuré par DLS, est dû au fait que les Lp-Ni8Ci2 sont sous forme sèche. En effet, en l’absence de solvant, le « gonflement » de la bicouche lipidique est faible. De plus, sous cette forme, les Lp-Ni8Ci2 ont tendance à s’agréger et à perdre leur forme sphérique, du fait de leur structure fragile. Par conséquent, dans le cas des liposomes, les mesures par DLS du diamètre hydrodynamique donnent une taille plus proche de la réalité car elles prennent en compte l’interaction de la bicouche lipidique avec le milieu.
Suite à la caractérisation des Lp-Ni8Ci2 et des Lp-Ni8PEG par spectroscopie UV-Vis-NIR, DLS et TEM, des analyses de stabilité dans le temps ont été réalisées. Pour cela, deux nouveaux lots de Lp-Ni8C12 et Lp-Ni8PEG ont été préparés et l’évolution du diamètre hydrodynamique a été suivie pendant 75 jours. Dans les deux cas, la taille des liposomes varie peu au cours du temps. Ces résultats signifient qu’ils sont stables au cours du temps.
L’effet photothermique a été mesuré sur des solutions par irradiation sur différents intervalles de temps par intermittence. Les deux solutions possèdent un effet photothermique stable après 4 cycles d’irradiation et les mesures DLS n’indiquent aucune modification de taille après l’exposition laser. Tous ces résultats mettent en avant la stabilité dans le temps et sous irradiation de ces liposomes photoactifs. Les mesures d’efficacité photothermique (/7) révèlent que 25% de l’énergie laser est convertie en chaleur dans le cas des Lp-Ni8Ci2.
Cette valeur est comparable à celle des NPs-Ni4Ci2 (26%). En ce qui concerne les Lp-Ni8PEG, le η est de 14%.
En conclusion, les nanovecteurs lipidiques et polymériques des exemples 6.1 et 6.2 possèdent des propriétés photoactives intéressantes. De plus, la simplicité de leur préparation et leur petite taille, privilégiant une accumulation par effet EPR dans le cas d’un traitement de tumeur, en font des candidats potentiels à la libération photothermique contrôlée de principes actifs (PTCR).
Exemple 7 : Complexes Ni-bis(dithiolène) et l’oxygène singulet
L’oxygène singulet est un réactif suffisamment agressif pour détériorer les molécules présentes dans son environnement. Par conséquent, ce type de phénomène est à éviter pour des applications en PTCR, puisque le médicament encapsulé risque d’être endommagé et donc de perdre de son activité. Pour mettre en évidence la formation d’oxygène singulet lors de l’irradiation du complexe Nibis(dithiolène), une molécule sensible à la production de 1O2 a été employée. Le composé qui a été choisi est le 1,3-diphénylisobenzofurane (DPBF). Cette molécule fluorescente réagit rapidement avec l’oxygène singulet pour donner, par cycloaddition [4 + 2] et réarrangement, le o-dibenzoylbenzène. Lors de cette réaction, une perte de fluorescence est observée, du fait de la faible émission du produit d’arrivée :
Dans le but de déterminer la formation ou non d’oxygène singulet par les complexes Ni-bis(dithiolène), l’expérience suivante a été réalisée : 1 mL d’une solution à 1.6x104 M de Ni8C12 dans le toluène a été ajouté dans une cuve de fluorescence contenant 1 mL d’une solution à 2x105 M de DPBF dans le toluène. Le mélange est agité et une mesure avant irradiation est effectuée. La cuve est ensuite irradiée (940 nm, 5 W/cm2) pendant 15 min puis une nouvelle mesure est faite.
Aucune perte significative de la fluorescence n’a été observée, signe de la stabilité du DPBF. Par conséquent, les complexes Ni-bis(dithiolène) ne produisent pas d’oxygène singulet lors de leur irradiation.
Ceci a permis de s’assurer que des études d’encapsulation pouvaient être menées, sans risquer de détériorer le principe actif lors d’applications en PTCR.
Exemple 8 : Étude de la cytotoxicité des nanoparticules encapsulant des complexes nickel-bis(dithiolène)
La cytotoxicité des NPs-Ni4C12, des Lp-Ni8C12 et des Lp-Ni8PEG a été déterminée in vitro à l’aide de tests MTT, sur deux types de lignées cellulaires (HeLa et MDA). Pour cela, des cellules HeLa et MDA ont été incubées pendant 24h avec les nanoparticules. Les résultats montrent que la présence de complexes hydrophobes au sein des liposomes ou des nanoparticules de polymères (NPsNÎ4C12 et Lp-Ni8C12) n’augmente pas leur cytotoxicité. Les liposomes et les nanoparticules de polymère, avec ou sans complexe, sont cytotoxiques à une concentration supérieure à 50 pg/mL. Par contre, les Lp-Ni8PEG sont plus toxiques que les liposomes seuls. L’hypothèse est que le complexe NÎ8PEG est libéré du liposome et passe dans le milieu de culture, du fait de ses propriétés hydrophiles, induisant ainsi une cytotoxicité supplémentaire.
Exemple 9 : Libération photothermique contrôlée de carboxyfluorescéine ou de doxorubicine
Préparation et étude de la libération des NPs-PEG42-b-PMLABe7s-Ni4Ci2-Dox
Le principe actif ou le fluorophore devant être encapsulé dans les nanoparticules de polymères de l’exemple 1 doit être à la fois hydrophobe pour permettre l’encapsulation dans le polymère lipophile et qu’il présent un certain caractère hydrophile pour permettre sa libération dans l’eau. Si une de ces règles n’est pas respectée, alors soit la molécule a un taux d’encapsulation faible, soit elle ne sera que peu libérée.
Afin d’obtenir les NPs-PEG42-b-PMLABe73-Ni4Ci2-Dox (NPs-Ni4Ci2-Dox) désirées, une solution mère de Dox,HCI est tout d’abord préparée dans un mélange THF/NEt3 (6 mL THF + 23 pL NEt3) : Dox : 10 mg + 4 mL de THF/NEt3. [Dox]so,ution mère = 2,5 mg/mL. Ensuite, 5 mg de MeOPEG42-b-PMLABe73 sont solubilisés dans 744 pL de THF, 56 pL de la solution mère ([Ni4C12]SO|Ution mère = 9 mg/mL) de complexe dans le THF (10 % / polymère, soit 0,5 mg de Ni4C12) et 200 μΙ_ de la solution de Dox (10 % / polymère, soit 0,5 mg, [Dox]initiaiement introduite = 0,25 mg/mL) sont ensuite additionnés.
Cette solution (polymère + Complexe + Dox dans le THF) est ensuite additionnée rapidement dans 2 mL d’eau ultra-pure sous forte agitation. Le mélange est agité à température ambiante pendant 10 min puis le THF est évaporé sous vide (évaporateur rotatif). Le volume final est ajusté à 2 mL par ajout d’eau ultra-pure, si nécessaire. La solution est orange/verte. La solution est centrifugée dans un MicroCon pour éliminer la Dox libre : 15 000 g pendant 5 min puis 1 000 g pendant îo 1 min. Le surnageant est éliminé et le concentré est dilué avec de l’eau ultra-pure pour obtenir 2 mL de solution finale.
Le taux d’encapsulation de ces NPs-Ni4Ci2-Dox est déterminé en mesurant l’absorbance de la Dox à 485 nm par spectroscopie UV-Vis. En premier lieu, une courbe d’étalonnage de la Dox libre dans un mélange eau/DMF (20/80) est réalisée comme suit : 500pL de la solution mère de Dox dans le THF/NEt3 est évaporée sous vide. Puis 1mL de la préparation eau/DMF (20/80) y est ajouté. A partir de cette solution concentrée ([Dox] = 1,25 mg/mL), plusieurs dilutions sont préparées par ajout du mélange eau/DMF (20/80) et l’absorbance à 485 nm des différents échantillons de Dox libre (V = 400 pL) est ensuite mesurée par spectroscopie UV20 Vis à 485 nm à l’aide d’une plaque multi-puits. Une fois la courbe d’étalonnage réalisée, 80 pL de la suspension de NPs-Ni4C12-Dox sont dilués avec 320 pL de DMF afin de détruire les nanoparticules, libérant ainsi la totalité de la Dox encapsulée. L’absorbance mesurée est de 0,22. En extrapolant sur la courbe d’étalonnage, la concentration déterminée en Dox encapsulée est donc de 73,4 pg/mL soit 29% de la Dox initialement introduite a été encapsulé, c’est-à-dire 3% par rapport à la masse de polymère. De plus, les résultats DLS montrent que l’encapsulation de la Dox a peu d’influence sur la taille finale des nanoparticules (Tableau 1).
| NPs-Ni4C12 | NPs-Ni4C12-Dox | |
| Diamètre (nm) | 110 | 100 |
| lp | 0,20 | 0,22 |
| Aspect Sol. | Verte | Orange/Verte |
| % massique de Dox encapsulé | - | 29 |
Tableau 1 : Comparaison des résultats obtenus par DLS à partir des NPsNi4C12 et des NPs-Ni4C12-Dox.
La libération de la Dox a ensuite été étudiée à l’aide d’un boudin de dialyse de seuil de coupure de 3500 Daltons, c’est à dire laissant passer les molécules ayant une masse molaire inférieure à 3500 g/mol et retenant les autres. Pour cela, un tube de dialyse est plongé dans un bêcher d’eau pendant 30 min puis rincé avec de l’eau propre. Il est ensuite découpé à la taille désiré puis mis en place sur un cône Eppendorf de 100 pL qui a été découpé à 2,9 cm de la base. La membrane de dialyse est maintenue sur le cône à l’aide de Parafilm. Le système est ensuite introduit dans une cuve UV ou de fluorescence possédant une ouverture circulaire et contenant 2,7 mL d’eau.
En amont, des NPs-PEG42-ô-PMLABe73-Ni4Ci2-Dox sont préparées mais ne sont pas centrifugées de suite. En effet, 500 pL de la solution sont prélevés puis centrifugés tandis que le reste de la suspension, en présence de Dox libre, est congelé afin d’éviter la possible libération à température ambiante. Cette manipulation permet de pouvoir réutiliser plusieurs fois la suspension, en la décongelant, puis en prélevant la quantité souhaitée de nos NPs-PEG42-ôPMLABe73-Ni4C12-Dox, qui est ensuite centrifugée. Après filtration des 500 pL, le concentré est réhydraté avec 150 pL d’eau ultra-pure, puis additionné dans le système de dialyse. Dès l’ajout, une mesure correspondant au t0 est réalisée. Il y a un échange qui se fait entre l’eau de la cuve UV et le système de dialyse. Ainsi la Dox libérée passe à travers la membrane, puisqu’elle a une masse molaire inférieure à 3500 g/mol, tandis que les nanoparticules sont retenues. Du fait de sa bande d’absorption caractéristique à 485 nm, le pourcentage de Dox libérée est mesuré par spectroscopie UV-Vis-NIR.
Le pourcentage de Dox libérée est mesuré selon cette équation :
% floï Libéré = x 100
Afinai est obtenue par ajout d’une goutte de DMF dans le système de dialyse, permettant de détruire les nanoparticules et de libérer la Dox restante.
En utilisant cette technique, la libération de la Dox au cours du temps a été étudiée de différentes façons. La première a été de mesurer la libération de Dox sans irradiation, la seconde a fait appel à une irradiation prolongée de 15 min à t0 et la dernière a consisté à exposer notre échantillon à des paliers d’irradiation de 2 min toutes les 30 min (Figure 1).
La Figure 1a représente le pourcentage de Dox libérée par une suspension de NPs-PEG42-b-PMLABe-Ni4C12-Dox (NPs-Ni4C12-Dox), sans et avec irradiation initiale de 15 min (940 nm, 5 W/cm2). Dans la Figure 1a, la courbe en trait plein correspond aux nanoparticules sans irradiation et la courbe en trait pointillé correspond aux nanoparticules avec irradiation.
La Figure 1b représente le pourcentage de Dox libérée par une suspension de NPs-PEG42-b-PMLABe-Ni4C12-Dox (NPs-Ni4C12-Dox), sous exposition laser par intermittence (940 nm, 5 W/cm2, 2 min ON, 30 min OFF). Dans la Figure 1b, la courbe en trait plein correspond aux nanoparticules avec irradiation initiale pendant 15 minutes et la courbe en trait pointillé correspond aux nanoparticules avec irradiation par paliers de 2 minutes.
Au bout de 18 heures, sans irradiation, la quantité de Dox libérée est inférieure à 5%. Les NPs-PEG42-b-PMLABe73-Ni4Ci2-Dox libèrent donc peu d’anticancéreux sans stimulus externe. A l’inverse, l’irradiation d’une suspension de NPs-Ni4Ci2-Dox pendant 15 min, entraîne la libération de plus de 30% de la Dox encapsulée (Figure 1a). Il faut noter qu’après 18h, la quantité de Dox libérée n’augmente pas. Cela confirme la plus grande affinité de la DOX pour les milieux hydrophobes. Cela peut aussi venir du fait que le volume d’eau extérieur n’est pas suffisant pour être largement supérieur à la solubilité de la Dox en milieu aqueux. Ce type de système est intéressant dans le cas où le principe actif doit être libéré rapidement et dans une région précise.
Un troisième test a été réalisé. Cette fois-ci la suspension est irradiée par intermittence pendant 2 min toutes les 30 min (Figure 1b). De cette façon, les 30% d’anticancéreux libérés sont atteints au bout de 3 h au lieu de 30 min. Par conséquent, ce système permet une libération de la Dox plus lente. Il faut noter tout de même que la moitié du produit (15%) est libérée dès les deux premières minutes d’irradiation, puis ensuite la quantité relâchée est moindre. L’exposition laser augmente, probablement de façon irréversible, la perméabilité des nanoparticules de polymères. En effet, lors des périodes de non-irradiation, la libération de la Dox continue à se faire avec une cinétique plus rapide que le lot de NPs-Ni4C12-Dox n’ayant pas été irradié.
Préparation et étude du relargacie des Lp-Ni8Ci2-CF
Le complexe Ni8Ci2 est hydrophobe et ne risque pas de passer en solution avec la molécule libérée, permettant ainsi de concentrer l’effet photothermique sur le liposome. Deuxièmement, il est situé dans les parois, laissant ainsi le cœur hydrophile du liposome libre pour les molécules à encapsuler. Le dernier point avantageux est leur plus grande efficacité photothermique. Dans le cas des LpNi8Ci2, la molécule à encapsuler est la 6-carboxyfluorescéine (CF). Cette molécule est un agent fluorescent hydrophile qui sera encapsulé dans le cœur du liposome afin d’obtenir les Lp-Ni8C12-CF.
Pour cela, une solution saturée de carboxyfluorescéine (50 mM) dans l’eau est tout d’abord préparée puis filtrée sur célite. Le filtrat est récupéré et stocké. En parallèle, un film lipidique-Ni8C12 est préparé de la même manière que pour les LpNi8C12 puis une fois bien sec, il est hydraté avec la solution saturée de carboxyfluorescéine récupérée. Après 48h d’hydratation, la suspension est passée cinq fois aux ultrasons puis congelée.
La libération a été suivie par émission de fluorescence, en utilisant exactement le même système de dialyse pour l’étude de la libération de la DOX à partir des nanoparticules de polymères. Ainsi, notre suspension de Lp-Ni8Ci2-CF est décongelée et 100 pL sont prélevés pour être centrifugée dans des MicroCon. Cette étape permet d’éliminer la 6-carboxyfluorescéine non-encapsulée et de récupérer notre concentré de Lp-Ni8Ci2-CF. Ce dernier est repris avec 150 pL d’eau puis ajouté dans le cône de dialyse.
Le pourcentage de CF libéré est calculé à l’aide de l’équation suivante :
% CF libéré = nombre de cowpsmsim~ — nombre de covnsfn
-x 100 nombre de conpstst:tîl
Le nombre de coups est représentatif de la fluorescence émise par la solution. Plus il est élevé plus le milieu est émissif. Le nombre de coupstotai est lui obtenu en ajoutant, lors de la dernière mesure, du Triton-X. C’est un détergent permettant de détruire les liposomes et de libérer le reste de CF encapsulée.
Trois expériences de délivrance de carboxyfluorescéine ont été menées sur nos suspensions de Lp-N8C12-CF. La première est réalisée sans irradiation laser, la seconde avec une irradiation initiale de 15 min à t0 et la dernière est mise en oeuvre par exposition laser pendant 1,3 ou 5 min toute les 10 min. Les résultats mettent en évidence que sans irradiation 80% de la 6-carboxyfluorescéine est libérée au bout de 16 h tandis qu’après exposition laser pendant 15 min la même quantité de CF est libérée en 1 h. Le stimulus laser permet donc de libérer rapidement et en bonne quantité la molécule désirée.
En s’appuyant sur ces premiers résultats, une expérience de libération fractionnée a été réalisée (Figure 2).
La Figure 2 représente le pourcentage de CF libérée par une suspension de Lp-Ni8C12-CF sous exposition laser (940 nm, 5 W/cm2) pendant différents intervalles de temps. La courbe avec les ronds représente la libération de CF pour des nanoparticules non irradiées, la courbe avec les carrés correspond à la libération de CF pour des nanoparticules irradiées initialement pendant 15 min et la courbe avec les triangles représente la libération de CF pour des nanoparticules irradiées à différents intervalles de temps donnés.
Lors des 30 premières minutes de non-irradiation, la cinétique de libération est en adéquation avec celle des Lp-Ni8C12-CF non-irradiés. Ensuite, la suspension est irradiée pendant différents intervalles de temps. Les résultats indiquent que la libération de CF est proportionnelle au temps d’irradiation. Effectivement, plus le temps d’irradiation est long, plus le pourcentage libéré est important. De plus, contrairement au système NPs-Ni4Ci2, les Lp-Ni8Ci2 ont une perméabilité réversible. En effet, lors de l’irradiation, la porosité du liposome augmente, entraînant la libération de CF qui se traduit par une montée subite de la fluorescence. Puis dès que le laser est éteint, la température du milieu diminue et le liposome retrouve sa perméabilité de départ et donc sa cinétique de libération d’origine.
En conclusion, les Lp-Ni8Ci2 peuvent être utilisés pour libérer de façon contrôlée les molécules désirées. Ce relargage peut se faire selon deux cinétiques bien différentes, qui sont dépendantes de la durée d’irradiation. Le principal avantage des Lp-Ni8C12 est leur perméabilité réversible. De tels systèmes sont très intéressants pour des thérapies contre le cancer. En effet, une haute dose d’anticancéreux, encapsulés dans nos Lp-Ni8C12, peut être injectée tout en évitant les effets secondaires indésirables. Puis sous irradiation par intermittence, l’anticancéreux peut être libéré, dans une zone précise et en plusieurs petites fractions dans le temps, évitant ainsi au patient de multiples injections à faible dose. L’ensemble de ces résultats démontrent que les Lp-Ni8C12 comme les NPs-Ni4C12 sont de bons candidats pour la libération photothermique contrôlée de médicament.
Claims (10)
- REVENDICATIONS1. Utilisation d’un complexe métal-bis(dithiolène) de formule (I) suivante :(I) dans laquelle :- M représente un métal choisi dans le groupe constitué du nickel, du palladium, du platine, de l’or, du fer, du cobalt, du rhodium et de l’iridium,- Rb R2, R3 et R4, identiques ou différents, représentent un groupe hydrophile ou un groupe hydrophobe, et- z est égal à 0, -1 ou -2, pour la libération photothermique contrôlée de principes actifs.
- 2. Utilisation selon la revendication 1, dans laquelle, dans la formule (I), M est Ni.
- 3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle, dans la formule (I), les groupes R1; R2, R3 et R4, identiques ou différents, sont des groupes hydrophiles choisis dans le groupe constitué des sucres, des peptides hydrophiles, des polyéthylène glycols, des acides, des ammoniums, des zwitterions et des groupes hydroxylés, ou les groupes R1; R2, R3 et R4, identiques ou différents, sont des groupes comprenant au moins un substituant choisi dans le groupe constitué des sucres, des peptides hydrophiles, des polyéthylène glycols, des acides, des ammoniums quaternaires, des zwitterions et des groupes hydroxylés.
- 4. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle, dans la formule (I), les groupes Rb R2, R3 et R4, identiques ou différents, sont des groupes hydrophobes choisis dans le groupe constitué des peptides hydrophobes, des cholestérols, des groupes alkyles, linéaires ou ramifiés, comprenant de 1 à 20 atomes de carbone, et des groupes alcoxyles, linéaires ou ramifiés, comprenant de 1 à 20 atomes de carbone, ou les groupes Ri, R2, R3 et R4, identiques ou différents, sont des groupes comprenant au moins un substituant choisi dans le groupe constitué des peptides hydrophobes, des cholestérols, des groupes alkyles, linéaires ou ramifiés, comprenant de 1 à 20 atomes de carbone, et des groupes alcoxyles, linéaires ou ramifiés, comprenant de 1 à 20 atomes de carbone.
- 5. Utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, dans laquelle le complexe métal-bis(dithiolène) est encapsulé dans une nanoparticule organique, notamment choisie dans le groupe constitué des liposomes, des nanoparticules de polymères, des nanoparticules lipidiques et des capsides virales.
- 6. Utilisation selon la revendication 5, dans laquelle la nanoparticule organique est un liposome, une nanoparticule lipidique, une capside virale ou une nanoparticule de polymères.
- 7. Nanoparticule organique, notamment choisie dans le groupe constitué des liposomes, des nanoparticules de polymères, des nanoparticules lipidiques et des capsides virales, encapsulant au moins un complexe métal-bis(dithiolène) de formule (I) suivante :dans laquelle :- M représente un métal choisi dans le groupe constitué du nickel, du palladium, du platine, de l’or, du fer, du cobalt, du rhodium et de l’iridium,- R1; R2, R3 et R4, identiques ou différents, représentent un groupe hydrophile ou un groupe hydrophobe, et- z est égal à 0, -1 ou -2.
- 8. Nanoparticule organique selon la revendication 7, contenant en outre au moins un principe actif.
- 9. Utilisation de la nanoparticule organique selon la revendication 8, pour la libération photothermique contrôlée du principe actif.5
- 10. Procédé de libération photothermique contrôlée d’un principe actif, comprenant une étape d’irradiation à une longueur d’onde comprise entre 600 nm et 1 600 nm, d’une nanoparticule organique selon la revendication 8.
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