FR3056912A1 - Procede d'inactivation virale d'une preparation d'anticorps monoclonaux - Google Patents

Procede d'inactivation virale d'une preparation d'anticorps monoclonaux Download PDF

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Abstract

La présente invention concerne une méthode d'inactivation virale d'une préparation d'anticorps monoclonaux, caractérisée en ce qu'elle comprend une étape de mise en contact de la préparation d'anticorps monoclonaux avec un détergent non ionique, la mise en contact étant réalisée sous agitation dans une poche souple à usage unique, apte à recevoir et à contenir la préparation d'anticorps monoclonaux.

Description

Titulaire(s) : LABORATOIRE FRANÇAIS DU FRACTIONNEMENT ET DES BIOTECHNOLOGIES Société anonyme.
Demande(s) d’extension
Mandataire(s) : PONTET ALLANO & ASSOCIES.
(94/ PROCEDE D'INACTIVATION VIRALE D'UNE PREPARATION D'ANTICORPS MONOCLONAUX.
La présente invention concerne une méthode d'inactivation virale d'une préparation d'anticorps monoclonaux, caractérisée en ce qu'elle comprend une étape de mise en contact de la préparation d'anticorps monoclonaux avec un détergent non ionique, la mise en contact étant réalisée sous agitation dans une poche souple à usage unique, apte à recevoir et à contenir la préparation d'anticorps monoclonaux.
FR 3 056 912 - A1
i
PROCEDE D’INACTIVATION VIRALE D’UNE PREPARATION D’ANTICORPS MONOCLONAUX
DOMAINE TECHNIQUE
La présente invention concerne une méthode d’inactivation virale d’une préparation d’anticorps monoclonaux, ainsi que la préparation d’anticorps monoclonaux viralement inactivée.
ARRIERE-PLAN TECHNOLOGIQUE
Les méthodes d’inactivation virale ont principalement été développées pour la fabrication de produits dérivés du sang. Parmi les méthodes connues, on trouve notamment l’utilisation de pH acides, le traitement par chauffage (pasteurisation), l’utilisation de l’acide caprylique, l’utilisation de traitement solvant détergent (S/D) et l’irradiation aux ultraviolets (UV). De par leur action, ces méthodes permettent d’inactiver les virus et de prévenir de la liaison ou de l’infection des cellules par ces virus. L’activité des protéines recombinantes, en particulier les anticorps monoclonaux est généralement non affectées, car ces méthodes ciblent uniquement les lipides et non les protéines.
L’inactivation virale utilisant de pH acides est une méthode couramment utilisée, au cours de la production d’anticorps monoclonaux.
La pasteurisation, également couramment utilisée, consiste en un chauffage en milieu liquide à 60°C durant 10 heures. Cette méthode est considérée comme efficace vis-à-vis de nombreux virus dont ceux du SIDA et des hépatites.
La technique par solvant détergent (S/D) est la technique de référence adoptée pour les fractions coagulantes. L'action simultanée sur les préparations de facteurs de coagulation, d'un solvant organique, le tri (n-butyl) phosphate (TNBP) et d'un détergent, cholate de sodium, polysorbate 80 (Tween 80), ou octoxynol (Triton X-100), détruit les virus à enveloppe lipidique. Le traitement dure 6 heures à des températures de 24 à 37°C. Le solvant détergent doit ensuite être éliminé par chromatographie d'adsorption, précipitation ou ultrafiltration. De par son mécanisme d’action, le traitement solvant-détergent n’agit que sur les virus enveloppés.
Il est connu d’utiliser, pour mettre en œuvre ces méthodes d’inactivation virale, des cuves en acier inoxydable, équipées d’une double enveloppe, afin de maintenir une température adéquate. L’utilisation de l’acier inoxydable, de par sa neutralité chimique, n’est pas dégradé par les détergents utilisés et permet de garantir la non-adsorption des détergents utilisés sur les parois et par conséquent l’efficacité de la réaction antivirale.
Ces cuves en acier inoxydable présentent néanmoins plusieurs inconvénients. Elles nécessitent un système de thermorégulation, coûteux en énergie et un investissement conséquent selon l’échelle finale d’utilisation. De plus, l’emploi de ces cuves en acier inoxydable demande un nettoyage et une stérilisation de l’équipement entre chaque lot de produit, ce qui a pour conséquence de manière générale, d’allonger la durée de fabrication et d’alourdir la chaîne de fabrication.
Par conséquent, il apparaît nécessaire de disposer d'une méthode d’inactivation virale simple d’utilisation, flexible, économe en énergie, peu coûteuse, permettant de réduire les risques de contaminations croisées et également capable d’inactiver les virus enveloppés contenus dans une préparation d’anticorps monoclonaux.
DESCRIPTION DETAILLEE
De façon surprenante, la Demanderesse a montré que l’inactivation virale d’une préparation d’anticorps monoclonaux peut être réalisée dans des poches souples à usage unique. Malgré le caractère chimiquement non neutre des parois de ces poches, la Demanderesse a mis en évidence de façon surprenante que les détergents non ioniques utilisés ne s’adsorbent pas sur les parois de la poche et permettent une inactivation efficace des virus présents dans la préparation d’anticorps monoclonaux. De plus, la Demanderesse a démontré que, de façon surprenante, les détergents utilisés ne dégradent pas les parois des poches souples et n’entrainent donc pas de relargage de contaminants éventuels. Cette étape d’inactivation virale d’une préparation d’anticorps monoclonaux en poches souples à usage unique permet notamment un gain de temps (absence de nettoyage) et un gain d’énergie (pas de besoin de thermorégulation) par rapport à l’utilisation des cuves en acier inoxydable de l’état de la technique.
La Demanderesse de la présente invention propose donc une nouvelle méthode d’inactivation virale comprenant une étape de mise en contact d’une préparation d’anticorps monoclonaux avec un détergent non ionique, la mise en contact étant réalisée sous agitation dans une poche souple à usage unique.
Un objet de l’invention est donc une méthode d’inactivation virale d’une préparation d’anticorps monoclonaux, caractérisée en ce qu’il comprend une étape de mise en contact de la préparation d’anticorps monoclonaux avec un détergent non ionique, la mise en contact étant réalisée sous agitation dans une poche souple à usage unique, apte à recevoir et à contenir la préparation d’anticorps monoclonaux.
Au sens de la présente invention, on entend par « procédé d’inactivation virale», toute méthode permettant d’inactiver, d’éliminer ou de supprimer certains types de virus potentiellement présents dans la préparation d’anticorps monoclonaux. Avantageusement, les virus inactivés par le procédé selon l’invention sont en particulier les virus enveloppés, tels que les virus apparentés aux virus de la leucémie murine xénotropique (X-MuLV), le complexe diarrhée virale bovine (BDVD), le virus pseudorabique (PRV).
Au sens de la présente invention, le terme « anticorps » se réfère à une molécule d'immunoglobuline ou un fragment d'une molécule d'immunoglobuline ayant la capacité de se lier spécifiquement à un antigène particulier. Le terme anticorps inclut également différents types d'anticorps, par exemple les anticorps humains, les anticorps recombinants, les anticorps monoclonaux, les anticorps humanisés, les anticorps chimériques, les fragments d'anticorps F(ab')2, Fab, scFv, Fv ou encore un mélange de ces anticorps. Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, l’anticorps est obtenu par toute technique bien connue de l’homme du métier. En particulier, l’anticorps peut être obtenu à partir du sérum humain ou à partir de différentes sources, notamment de cellules, plantes ou animaux non humains, ou encore par génie génétique.
Selon un autre aspect particulier de l’invention, les anticorps sont des anticorps recombinants. Le terme anticorps recombinant , tel qu'utilisé ici inclut les anticorps qui sont préparés, exprimés, créés, ou isolés par des moyens recombinants, tels des anticorps isolés d'un animal qui est transgénique pour les gènes d'immunoglobuline d'une autre espèce, les anticorps exprimés en utilisant un vecteur d'expression recombinant transfecté dans une cellule hôte, les anticorps isolés d'une bibliothèque d'anticorps recombinants combinatoires, ou les anticorps préparés, exprimés, créés, ou isolés par n'importe quel autre moyen qui implique l'épissage des séquences de gènes d'immunoglobuline dans d'autres séquences d'ADN.
Selon encore un autre aspect particulier, les anticorps peuvent être chimériques ou humanisés. Selon la présente invention, le terme anticorps chimérique fait référence à un anticorps qui combine des parties d'anticorps non-humain (par exemple, souris, rat lapin), avec des parties d'anticorps humains. Selon la présente invention, le terme anticorps humanisé fait référence à un anticorps, qui conserve uniquement les régions CDRs de liaison à l'antigène de l'anticorps parent, en association avec les régions charpentes (framework) humaines (voir Waldmann, 1991, Science 252:1657). De tels anticorps humanisés ou chimériques contenant les sites de liaison spécifiques de l'anticorps murin sont attendus pour avoir une immunogénicité réduite, quand ils sont administrés in vivo pour le diagnostic, pour des applications prophylactiques ou thérapeutiques selon l'invention.
Selon un autre aspect, les anticorps sont des anticorps humains. Le terme anticorps humain, tel qu'utilisé ici, inclut des anticorps ayant des régions variables et constantes dérivées des séquences d'immunoglobulines germinales humaines. Les anticorps humains selon l'invention peuvent également inclure des résidus acides aminés non codés par des séquences d'immunoglobulines germinales humaines (par exemple, des mutations introduites au hasard, ou par mutagénèse in vitro site-spécifique, ou par mutation somatique in vivo). Des anticorps humains sont généralement générés en utilisant des souris transgéniques portant plutôt des parties du système immunitaire humain que celui de souris. Des anticorps monoclonaux pleinement humains peuvent également être préparés en immunisant des souris transgéniques avec de grandes parties des chaînes lourdes et légères d'immunoglobulines humaines, notamment selon les techniques décrites dans les brevets américains US5,591,669, US5,598,369, US5,545,806, US5,545,807, US6,150,584. Ces animaux ont été génétiquement modifiés de façon à ce qu'il y ait une délétion fonctionnelle dans la production d'anticorps endogènes (par exemple murin). Les animaux sont également modifiés pour contenir toute ou une portion du locus de gène d'immunoglobuline germinale humaine de façon à ce que l'immunisation de ces animaux résulte dans la production d'anticorps pleinement humains dirigés contre l'antigène d'intérêt.
Selon l'immunisation de ces souris (par exemple XenoMouse (Abgenix), souris HuMAb (Medarex/GenPharm)), les anticorps monoclonaux sont préparés selon les techniques d'hybridomes classiques. Ces anticorps monoclonaux ont des séquences d'acides aminés d'immunoglobuline humaine et ainsi ne provoquent pas de réponses d'anticorps humain anti-murins (HAMA) quand ils sont administrés à des humains. Les anticorps humains, comme n'importe quel anticorps selon la présente invention peuvent être des anticorps monoclonaux.
Selon un autre aspect particulier, l'anticorps est un anticorps de longueur totale. Selon encore un autre aspect particulier, cet anticorps de longueur totale comprend une chaîne légère et une chaîne lourde.
Selon un mode de réalisation particulier, l'anticorps est produit dans un mammifère non humain transgénique, en particulier dans une chèvre, un mouton, un bison, un chameau, une vache, un cochon, un lapin, un buffle, un cheval, un rat, une souris ou un lama.
Avantageusement, l’anticorps selon l’invention est un anticorps monoclonal recombinant thérapeutique. Avantageusement, l’anticorps monoclonal recombinant thérapeutique possède une activité thérapeutique et peut être capable soit de neutraliser un antigène soluble (par exemple : toxine, cytokine, virus), soit de cibler spécifiquement un récepteur membranaire en vue de bloquer la liaison entre le ligand et ce récepteur, soit d’avoir un effet cytotoxique.
Au sens de la présente invention, on entend par «apte à recevoir et à contenir la préparation d’anticorps monoclonaux», une poche capable de recevoir et contenir la préparation d’anticorps monoclonaux selon l’invention et qui satisfait aux critères imposés par la Pharmacopée Européenne. De manière avantageuse, une poche est considérée comme étant apte à recevoir et contenir la préparation d’anticorps monoclonaux, si elle présente une résistance mécanique satisfaisante après remplissage de celle-ci avec la préparation d’anticorps monoclonaux et est compatible chimique avec la préparation d’anticorps monoclonaux.
Au sens de la présente invention, on entend par « poche souple », une enveloppe fermée formée d’un matériau, qui peut être déformé, quand il est soumis à la pression ou à un stress, par exemple lors du remplissage ou de l’agitation de la poche. Un tel matériau peut par exemple rester flexible à une température comprise entre 5°C et 60°C, avantageusement à une température comprise entre 15°C et 25°C. Avantageusement, la souplesse de la poche permet d’éviter les risques d’ouverture en cas de chute.
Dans un mode de réalisation avantageux, la poche souple selon l’invention est à usage unique. On entend par « à usage unique », une poche jetable après utilisation et ne servant qu’une seule et unique fois. Au sens de la présente invention, on entend par « utilisation », toute utilisation possible de la poche et avantageusement l’administration par voie intraveineuse des anticorps aux patients en nécessitant. La poche souple à usage unique permet de manière avantageuse de se dispenser des procédés de nettoyage qui sont souvent longs et fastidieux, contrairement à l’utilisation de cuves en acier inoxydable. Ainsi, la poche souple à usage unique permet un gain de temps et de flexibilité au cours du procédé de production de la préparation d’anticorps monoclonaux et est moins coûteuse en termes d’investissement.
Dans un mode de réalisation avantageux, la poche souple (1) selon l’invention est constituée d’un film multicouches de polymères (2) et un moyen d’agitation (3). Par « multicouches », on entend au sens de la présente invention, une succession de couches. De manière avantageuse, le film selon l’invention comprend au moins deux couches, avantageusement au moins trois couches et de manière encore plus avantageuse au moins quatre couches. Dans un mode de réalisation avantageux, le film multicouches de polymères (2) comprend quatre couches de composition différente. Dans un mode de réalisation avantageux, le film multicouches de polymères (2) est constitué de quatre couches différentes en matière plastique. Dans un mode de réalisation avantageux, le film multicouches de polymères (2) est constitué des polymères suivants : polytéréphtalate d'éthylène (PET) ou polyamide (PA) ou copolymère éthylène-alcool vinylique (EVOH) ou polyéthylène (PE) ou un mélange d’au moins 2 desdits polymères. Dans un mode de réalisation avantageux, le film multicouches de polymères (2) comprend : une couche externe constituée de polytéréphtalate d'éthylène (PET), une première couche intermédiaire constituée de polyamide (PA), une seconde couche intermédiaire constituée de copolymère éthylène-alcool vinylique (EVOH) et une couche interne constituée de polyéthylène (PE), ladite couche interne étant directement en contact avec la préparation d’anticorps monoclonaux. Avantageusement, la couche externe constituée de polytéréphtalate d'éthylène joue un rôle de barrière protective transparente, robuste et laissant passer la lumière. Le polyéthylène fournit au film de la robustesse et contribue à la réduction des échanges gazeux au travers du film. Avantageusement, la première couche intermédiaire constituée de polyamide permet d’augmenter la dureté et de renforcer structure de la poche. Cette première couche intermédiaire permet également de réduire les échanges gazeux au travers du film. Avantageusement, la seconde couche intermédiaire constituée de copolymère éthylène-alcool vinylique joue un rôle de barrière principale aux gaz minimisant ainsi la transmission de gaz tels que l’oxygène et le dioxyde de carbone à travers le film. Avantageusement, la couche interne constituée de polyéthylène est directement en contact avec la préparation d’anticorps monoclonaux. Le polyéthylène utilisé dans cette couche interne est conforme à la Pharmacopée usuelle et constitue une couche de contact propre, inerte et hautement résistante chimiquement. Selon un mode de réalisation avantageux, les quatre couches de la membrane multicouches sont assemblées entre elles par une couche adhésive. Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, la poche souple selon l’invention peut être celle décrite dans le brevet EP 1 012 227.
Dans un autre mode de réalisation particulièrement avantageux, la poche souple selon l’invention peut être une poche telle que celle décrite dans le brevet EP 0 941 158. En particulier, la poche selon l’invention peut être constituée d’une structure multicouches comprenant : une couche de noyau d’un copolymère d’éthylène alcool vinylique ayant une teneur en éthylène de 25 à 45 mole pour cent ; une couche intérieure constituée par un homopolymère d’éthylène ou un copolymère d’éthylène et d’une alpha-oléfine, appropriée pour le contact avec une solution et placée sur un premier côté de la couche de noyau ; une couche extérieure placé sur un second côté de la couche de noyau opposée à la couche intérieure, la couche extérieure étant constituée par un polyamide ; et deux couches de lien, une de chaque collée sur le premier et le second côté de la couche de noyau et placée entre la couche intérieure et la couche de noyau et entre la couche extérieure et la couche de noyau ; dans laquelle la couche de noyau, la couche intérieure, la couche extérieure et les couches de lien sont coextrudées par coulage les unes sur les autres et dans laquelle la couche intérieure est plus épaisse que la couche extérieure.
Dans un autre mode de réalisation particulièrement avantageux, la poche souple selon l’invention peut être une poche telle que celle décrite dans le brevet EP 1 426 178. En particulier, la poche selon l’invention peut être constituée d’une structure multicouches comprenant : une couche de noyau d’un copolymère d’alcool vinylique d’éthylène ayant une teneur en éthylène de 25 à 45 mole pour cent en moles ; une couche intérieure composée d’un copolymère d’éthylène et de α-oléfine et placée sur un premier côté de la couche de noyau ; une couche extérieure placée sur un second côté de la couche de noyau opposée à la couche intérieure, la couche extérieure étant composée d’un polymère choisi dans le groupe constitué par des polyamides, des polyesters et des polyoléfines ; et deux couches de lien, une de chaque collée sur le premier et le second côté de la couche de noyau et placée entre la couche intérieure et la couche de noyau et entre la couche extérieure et la couche de noyau, dans laquelle la couche de noyau, la couche intérieure, la couche extérieure et les deux couches de lien sont coextrudées les unes aux autres et dans laquelle la structure possède une fraction soluble dans l’eau à faible masse moléculaire inférieure à 1.0 partie par millier (ppt).
Dans un mode de réalisation avantageux selon l’invention, la poche souple (1) peut être transparente, translucide ou opaque. Avantageusement, la poche souple (1) peut être transparente.
Dans un mode de réalisation avantageux selon l’invention, la poche souple (1) selon l’invention comporte en outre un ou plusieurs orifices d’entrée (4), permettant l’introduction de la préparation d’anticorps monoclonaux lors du remplissage de ladite poche. Avantageusement, la poche souple (1) selon l’invention peut comporter au moins un, avantageusement au moins deux, avantageusement au moins trois, avantageusement au moins quatre, avantageusement au moins cinq, avantageusement au moins six, avantageusement au moins sept orifices d’entrée (4). Dans un mode de réalisation avantageux selon l’invention, la poche souple (1) selon l’invention comporte en outre un ou plusieurs orifices de sortie (7). Avantageusement, la poche souple (1) selon l’invention peut comporter au moins un, avantageusement au moins deux, avantageusement au moins trois, avantageusement au moins quatre, avantageusement au moins cinq, avantageusement au moins six, avantageusement au moins sept orifices de sortie (7).
Dans un mode de réalisation avantageux selon l’invention, l’épaisseur du film multicouches de polymères (2) est comprise entre 100 et 300 pm, avantageusement entre 150 et 250 pm, avantageusement entre 200 et 250 pm. De manière encore plus avantageuse, l’épaisseur du film multicouches de polymères (2) est comprise entre 200 et 225 pm.
Dans un mode de réalisation avantageux selon l’invention, les couches interne et externe ont une épaisseur comprise entre 6 pm et 20 pm.
Dans un mode de réalisation avantageux, la poche souple est équipée d’un moyen d’agitation (3). Avantageusement, le moyen d’agitation (3) est un agitateur.
Avantageusement, l’agitateur est une hélice. Cette hélice peut être couplée avec un dispositif de mise en rotation par lévitation, ledit dispositif de mise en rotation par lévitation pouvant être externe à la poche souple et pouvant lui-même être entraîné en rotation par un rotor moteur.
En particulier, l’agitateur peut être monté en rotation sur un support (5) disposé à l’intérieur de ladite poche souple, sur la couche interne (6) du film multicouches de polymères constituant la poche souple, ladite couche étant directement en contact avec la préparation d’anticorps monoclonaux. Ledit support peut être fixé sur ladite face, par exemple de manière amovible, par exemple au moyen d’une ventouse.
Le dispositif de mise en rotation peut être une pièce du système Flexel® commercialisé par la société Sartorius. Dans un mode de réalisation avantageux, une poche souple selon l’invention peut être la poche Flexel® Bags, commercialisée par la société Sartorius.
D'une manière avantageuse, la durée de l'agitation est supérieure ou égale à 20 minutes, avantageusement supérieure ou égale à 30 minutes, avantageusement supérieure ou égale à 60 minutes et de manière plus avantageuse supérieure ou égale 120 minutes. Avantageusement, chaque poche souple peut être pourvue dudit système d’agitation pour le mélange détergent non-ionique/préparation d’anticorps monoclonaux. Avantageusement, les moyens pour agiter le mélange détergent non-ionique/ préparation d’anticorps monoclonaux sont des moyens agencés pour entraîner une agitation rotation de ladite poche.
Dans un mode de réalisation avantageux, la capacité de contenance de la poche souple à usage unique est comprise entre 5 millilitres et 2000 litres, avantageusement une capacité de contenance maximale comprise entre 50 millilitres et 1500 litres, avantageusement comprise entre 75 millilitres et 1250 litres, avantageusement comprise entre 100 millilitres et 1000 litres, avantageusement comprise entre 200 millilitres et 750 litres, avantageusement comprise entre 300 millilitres et 500 litres, avantageusement comprise entre 400 millilitres et 250 litres, avantageusement comprise entre 500 millilitres et 125 litres, avantageusement comprise entre 750 millilitres et 100 litres, avantageusement comprise entre 1 litres et 75 litres, avantageusement comprise entre 2 litres et 50 litres, avantageusement comprise entre 5 litres et 25 litres Avantageusement, la poche a une capacité de contenance maximale de 75 millilitres. De manière plus avantageuse, la poche a une capacité de contenance maximale de 500 millilitres. De manière encore plus avantageuse, la poche a une capacité de contenance maximale de 50 litres. Dans un autre mode de réalisation selon l’invention, la poche a une capacité de contenance maximale de 2000 litres.
Dans un mode de réalisation avantageux selon l’invention, la méthode comprend une étape de mise en contact de la préparation d’anticorps monoclonaux avec un détergent non ionique dans la poche souple. Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, la durée de la mise en contact est comprise entre 20 minutes et 72 heures, avantageusement comprise entre 60 minutes et 24 heures, avantageusement comprise entre 60 minutes et 2 heures. Avantageusement, la durée de la mise en contact est comprise entre 60 minutes et 90 minutes.
Dans un mode de réalisation avantageux selon l’invention, l’étape de mise en contact de la préparation d’anticorps monoclonaux avec un détergent non ionique est réalisée à une température comprise entre 2°C et 35°C, avantageusement entre 13°C et 35°C, avantageusement entre 20°C et 35°C, avantageusement entre 20°C et 30°C. De manière encore plus avantageuse, l’étape de mise en contact de la préparation d’anticorps monoclonaux avec un détergent non ionique est réalisée à une température ambiante comprise entre 15°C et 25°C.
Dans un mode de réalisation avantageux selon l’invention, la surface de contact entre le film multicouches de polymères et le mélange préparation d’anticorps monoclonaux / détergent non ionique est comprise entre 0,2 cm2/ml_ et 3,5 cm2/ml_, avantageusement entre 0,2 cm2/ml_ et 1,2 cm2/ml_. De manière encore plus avantageuse, la surface de contact entre le film multicouches de polymères et le mélange préparation d’anticorps monoclonaux /détergent non ionique est de 0,2 cm2/ml_.
Dans un mode de réalisation avantageux selon l’invention, le détergent utilisé est un détergent non ionique choisi parmi le polyéthylène glycol sorbitan monolaurate (appelé également polysorbate 20 commercialisé notamment sous le nom de Tween 20®), polyéthylène glycol sorbitan monooléate (appelé également polysorbate 80 ou commercialisé notamment sous le nom Tween 80®), l’éther de polyéthylène glycol et d’octophényle (polyethylene glycol terf-octylphenyl ether) commercialisé sous le nom Triton X-100® ou 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol ou encore tOctylphenoxypolyethoxyethanol, le nonyl phénoxypolyéthoxyléthanol (commercialisé sous le nom NP-40®), l’acide 3-[(3-cholamidopropyl)diméthylammonio]propanesulfonique (commercialisé sous le nom CHAPS®) et le n-dodécyl-p-D-maltoside (appelé également DDM). Avantageusement, le détergent non-ionique utilisé doit être chimiquement compatible avec la poche selon l’invention, et notamment le détergent non-ionique ne doit pas altérer la structure de la poche, c’est-à-dire ne doit pas altérer la transparence de la poche, ne doit pas la colorer, ne doit pas rendre le film laminaire friable ni le fissurer, ne doit pas causer de dommages aux surfaces de la poche comme notamment la décomposer ou la délaminer, ni générer l’apparition de bulles dans le film.
Dans un mode de réalisation particulièrement avantageusement, le détergent non ionique est le polyéthylène glycol terf-octylphényl éther, soit le Triton X-100® Le polyéthylène glycol terf-octylphényl éther (Triton X-100®) présente l’avantage d’être chimiquement compatible avec le film multicouches de polymères, qui constitue la poche souple. En effet, les inventeurs ont montré que le polyéthylène glycol terf-octylphényl éther répondait parfaitement au critère de compatibilité chimique, dans la mesure où il n’est pas adsorbé par le film multicouches de polymères et que ce dernier n’altère pas la structure du film multicouches de polymères, c’est-à-dire que le polyéthylène glycol terf-octylphényl éther n’a pas d’impact négatif sur l’épaisseur ou la transparence du film, ni sur la coloration du film. De plus, aucune dégradation du film n’a été observée, ni même d’altération de la force résistance du film ou des orifices présents sur la poche.
Dans un mode de réalisation avantageux selon l’invention, la concentration finale du détergent non-ionique est supérieure ou égale à 0,7%, avantageusement supérieure ou égale à 0,9%, avantageusement supérieure ou égale à 1%, avantageusement inférieure ou égale à 1,2%, le pourcentage étant exprimé en poids/poids (w/w). De manière encore plus avantageuse, la concentration finale du détergent non-ionique est de 1%, le pourcentage étant exprimé en poids/poids (w/w).
Dans un mode de réalisation avantageux de l’invention, la méthode d’inactivation virale comprend :
a) une étape de mise en contact d’une préparation d’anticorps monoclonaux avec un détergent non ionique, la mise en contact étant réalisée sous agitation dans une poche souple à usage unique, apte à recevoir et à contenir la préparation d’anticorps monoclonaux,
b) une étape d’élimination du détergent non-ionique,
c) une étape de récupération de la préparation d’anticorps monoclonaux viralement inactivée.
Dans un mode de réalisation avantageux de l’invention, l’étape b) d’élimination du détergent non-ionique peut être mise en oeuvre par n’importe quelle méthode bien connue de l’homme du métier. Avantageusement, l’étape b) d’élimination du détergent non-ionique peut être réalisée en utilisant un support de chromatographie, avantageusement en utilisant un support de chromatographie comprenant une résine échangeuse d’ions, de manière avantageuse en utilisant un support de chromatographie comprenant sur une résine échangeuse d’anions ou de cations. L’étape b) de la méthode d’inactivation virale permet d’éliminer directement le détergent non-ionique dans une fraction non-retenue.
Dans un mode de réalisation avantageux de l’invention, l’étape c) de récupération de la préparation d’anticorps monoclonaux viralement inactivée peut être mise en oeuvre par élution de la préparation d’anticorps monoclonaux du support chromatographique.
Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux de l’invention, la méthode d’inactivation virale comprend :
a) une étape de mise en contact de la préparation d’anticorps monoclonaux avec un détergent non ionique, la mise en contact étant réalisée sous agitation dans une poche souple à usage unique, apte à recevoir et à contenir la préparation d’anticorps monoclonaux,
b) une étape d’élimination du détergent non-ionique utilisant un support de chromatographie comprenant un résine échangeuse d’ions,
c) une étape de récupération de la préparation d’anticorps monoclonaux viralement inactivée par élution de la préparation d’anticorps monoclonaux du support de chromatographie.
Dans un mode de réalisation encore plus avantageux de l’invention, la méthode d’inactivation virale comprend :
a) une étape de mise en contact d’une préparation d’anticorps monoclonaux avec le polyéthylène glycol tert-octylphényl éther, la mise en contact étant réalisée sous agitation dans une poche souple à usage unique, apte à recevoir et à contenir la préparation d’anticorps monoclonaux,
b) une étape d’élimination du détergent non-ionique utilisant un support de chromatographie comprenant un résine échangeuse ions,
c) une étape de récupération de la préparation d’anticorps monoclonaux viralement inactivée par élution de la préparation d’anticorps monoclonaux du support de chromatographie.
Dans un mode de réalisation avantageux de l’invention, la méthode d’inactivation permet d’obtenir un facteur de réduction viral supérieur à 3 log, de préférence supérieur à 4 log, de préférence supérieur à 5 log, par rapport à la charge virale initialement présente dans la préparation d’anticorps monoclonaux. Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux de l’invention, la mise en contact de la préparation d’anticorps monoclonaux recombinant avec le polyéthylène glycol tert-octylphényl éther (Triton X-100®) dans la poche souple à usage unique telle que décrit ci-dessus, permet de réduire la charge virale initialement contenue dans la préparation d’anticorps monoclonaux d’un facteur d’au moins 3 log pour les virus enveloppés. Dans un mode de réalisation encore plus avantageux, la mise en contact de la préparation d’anticorps monoclonaux recombinant avec le polyéthylène glycol tert-octylphényl éther (Triton X-100®) dans la poche souple à usage unique telle que décrit ci-dessus, permet de réduire la charge virale initialement contenue dans la préparation d’anticorps monoclonaux d’un facteur d’au moins 4 log pour le virus XMuLV, d’au moins 5 log pour le virus BVDV et d’au moins 5 log pour le virus pseudorabique (PRV).
Un autre aspect de l’invention concerne une préparation d’anticorps monoclonaux viralement inactivée obtenu selon la méthode d’inactivation virale décrite ci-dessus. Dans un mode de réalisation avantageux, la préparation d’anticorps monoclonaux viralement inactivée est obtenue par mise en contact de la préparation d’anticorps monoclonaux avec un détergent non ionique, avantageusement le polyéthylène glycol ferf-octylphényl éther (Triton X-100®), la mise en contact étant réalisée sous agitation dans une poche souple à usage unique, apte à recevoir et à contenir la préparation d’anticorps monoclonaux. Avantageusement, la charge virale présente ladite préparation d’anticorps monoclonaux viralement inactivée est réduite d’un facteur d’au moins 4 log pour les virus enveloppés par rapport à la charge virale initialement contenue dans la préparation d’anticorps monoclonaux.
FIGURES
Figure 1 : Représentation schématique d’un mode de réalisation d’une poche souple selon l’invention.
Figure 2 : Détermination de la concentration de Triton X-100® adsorbée selon l’exemple 2, exprimée en mg/L en fonction du temps d’incubation exprimé en minutes, pour la poche souple selon l’invention et un flacon en verre.
Figure 3 : Détermination de la concentration de Triton X-100® adsorbée selon l’exemple 4, exprimée en mg/L en fonction du temps d’incubation exprimé en minutes, pour la poche souple selon l’invention et un flacon en verre.
EXEMPLES
Exemple 1 : Méthode d’inactivation virale
Cette étude a été réalisée en utilisant des échantillons obtenus à partir des procédés de fabrication de deux anticorps monoclonaux différents mAb A et mAb B. Les échantillons mAb A et mAb B ont été prélevés à partir d’éluats résultants de l’étape de chromatographie d’affinité ayant une résine à base de protéine A. L'efficacité du traitement par le détergent Triton X-100® pour inactiver les virus enveloppés a été évaluée selon les directives ICH et les directives européennes EMEA (ICH Q5A_gVirt_NP_NN_NNPS<_ (2009); EMEA (1996)). La concentration cible de Triton X-100® est de 1%, et les limites spécifiées sont de
0,9 et 1,2%. La concentration en protéines des deux échantillons mAb A et mAb B est inférieure à 10g/L. La méthode d’inactivation virale a été testée pour les virus suivants : virus de la leucémie murine xénotropique (X-MuLV), le complexe diarrhée virale bovine (BDVD), le virus pseudorabique (PRV). Les essais ont été réalisés en utilisant une poche de capacité de 75 ml. Les conditions expérimentales mises en œuvre sont présentées dans le Tableau 1 ci-après.
Paramètres Conditions opératoires à l’échelle industrielle Conditions opératoires minimales pour mAbA Conditions opératoires minimales pour mAbB
Concentration finale en Triton X-100® (% (w/w)) 1 0,7 0,7
Temps d’incubation (heure) > 1 1 1
Température (°C) 20 ±5 14 ± 1°C 14± 1
Agitation Agité Agité Agité
Tableau 1: Conditions expérimentales
Une charge virale de 5% (v/v) a été ajoutée aux échantillons mAb A et mAb B. Un échantillon a été prélevé, afin de déterminer la charge virale initiale contenue dans chacun des échantillons. Les échantillons de mAb A et mAb B chargés ont été mélangés avec du Triton X-100® ayant une concentration finale de 0,7% (w/w) et mis sous agitation dans le système Flexel®.
Les échantillons de mAb A et mAb B traités avec le détergent Triton X-100® ont été prélevés aux différents temps suivants : 0-1 minute, 5 minutes, 30 minutes and 1 heure, puis dilués immédiatement avant la titration. Tous les essais ont été réalisés en utilisant la méthode de mesure de l’infectiosité TCID50 (50% Tissue Culture Infective Dose).
Le témoin négatif est un échantillon chargé dans lequel aucun détergent n’a été ajouté.
Aucun changement statistique n’a été observé dans la mesure de l’infectiosité de l’échantillon de contrôle.
Résultats:
Les résultats sont présentés dans le tableau 2.
Température (°C) Virus Charge virale initiale avant traitement(logl0 TCIDjo/mL) Charge virale dans les fractions collectées après traitement (loglO TCIDjo/mL) Facteur de réduction (log)
T = 0-1 min T = 5 min T = 30min T= lhr
mAb A 17 X-MuLV 6,63 3,83 NT 3,83 1,45 >5,18 i 0,36
Mil X-MuLV 6,19 3,83 3,83 3,83 1,45 >4,74 i 0,32
mAb B Mil X-MuLV 5,76 3,83 3,83 3,83 1,92 3,84 i 0,47
Mil X-MuLV 5,67 3,83 3,83 3,83 1,55 >4,12 i 0,22
Mil BVDV 6,63 3,83 3,83 3,83 1,45 >5,18 i 0,20
Mil BVDV 6,81 3,83 3,83 3,83 1,45 >5,36 i 0,29
Mil PRV 6,72 3,83 3,83 3,83 1,45 >5,27 i 0,24
Mil PRV 6,46 3,83 3,83 3,83 1,45 >5,01 i 0,34
Tableau 2: Facteur de réduction de la charge virale obtenu dans des éluats de 5 chromatographie sur protéine A pour deux anticorps monoclonaux mAb A et mAb B traités avec le Triton X-100®.
On observe une réduction de la charge virale du virus X-MuLV d’un minimum de 4,74 log pour l’échantillon mAb A traité avec le détergent Triton X-100® pendant 1 heure.
On observe une réduction de la charge virale du virus X-MuLV d’un minimum de 3,84 ± 10 0,47 log pour l’échantillon mAb B traité avec le détergent Triton X-100® pendant 1 heure.
On observe une réduction de la charge virale du virus BVDV supérieure à 5,18 ± 0,20 log pour l’échantillon mAb B traité avec le détergent Triton X-100® pendant 1 heure.
On observe une réduction de la charge virale du virus PRV supérieure à 5,01 ± 0,34 log pour l’échantillon mAb B traité avec le détergent Triton X-100® pendant 1 heure.
Ces résultats confirment que la méthode d’inactivation virale est efficace dans la mesure où la réduction de la charge virale observée est supérieure à 4log.
Exemple 2 : Etude du taux d’adsorption du film multicouches de polymères de la poche souple lors du traitement avec le détergent Triton X-100®
Une poche souple à usage unique selon l’invention, présentant une capacité maximale de contenance de 75 ml_, a été remplie avec 63 ml_ de solution de Triton X-100® à une concentration de 1% (w/w). La poche contenant le détergent a été placée sur un agitateur orbital pour créer un mouvement du liquide sans pour autant générer un vortex ou de la mousse. La poche a ensuite été incubée pendant 120 minutes à température ambiante (20 ± 5°C). Des échantillons ont été périodiquement prélevés après 0 min, 30 min, 60 min et 120 min d’incubation et la concentration en Triton X-100® a été mesurée par chromatographie en phase liquide haute performance (HPLC).
Un contrôle négatif a été réalisé en parallèle, en répétant l'expérience dans un flacon en verre de 0,5 litre rempli avec 316 mL d’une solution de Triton X-100® à 1%. L’agitation de la solution a été effectuée à l'aide d'un mélangeur magnétique et d'un barreau d'agitation magnétique. Des échantillons ont été prélevés après 0 et 120 minutes.
Les résultats sont présentés en Figure 2.
Comme présentée en Figure 2, la concentration en Triton X-100® a diminuée de 5% dans la poche et de 3,1% dans le flacon en verre, après plus de 120 minutes d’incubation. Dans les deux cas, la concentration finale en Triton X-100® est comprise dans la gamme de concentration acceptable de 9g/L à 12g/L. Cette expérience montre qu’il n’y a pas d’adsorption significative du Triton X-100® par la poche. Ceci confirme que la poche de l’invention est appropriée pour la mise en oeuvre de l'étape d'inactivation virale utilisant le Triton X-100®
Exemple 3 : Etude de la compatibilité chimique et des relargables pour une poche d’une capacité de 500mL.
Etude de la compatibilité chimique
La résistance mécanique de la poche souple selon l’invention a été évaluée en utilisant une solution de Triton X-100® à une concentration de 20%. La poche contenant le détergent a ensuite été incubée sous agitation pendant 72 heures, à une température de 5°C ± 3°C. La poche utilisée a une capacité de contenance de 500mL, la surface de contact entre le film multicouches de polymères et le détergent est de 1,2 cm2/mL. Préalablement à la mise en contact de la poche avec le détergent, la poche a été irradiée à l’aide de rayons gamma à 25-45 kGy.
Un témoin négatif a également été préparé en remplaçant la solution de Triton X-100® par de l’eau purifiée.
Pour démontrer la compatibilité chimique de poche avec le détergent, un ensemble de tests a été réalisé après incubation avec le détergent. Une inspection visuelle permet d'évaluer l'impact de la solution sur la matière plastique, des critères tels que la transparence, la friabilité du film, la présence de fissure, la présence de bulles, des dommages de surface tels que la décomposition, la délamination ont également été évalués. Une analyse de perte de poids a été réalisée pour mesurer toute diminution potentielle des propriétés de barrière de la poche. Les propriétés mécaniques ont été testées par l'essai à la traction sur le film multicouches de polymères, sur les éléments d'étanchéité ainsi que sur les connexions et comparées aux spécifications. Les conditions d'essai stressées ont été appliquées au moyen d'un essai de chute pour évaluer la résistance mécanique de la poche après mise en contact avec une solution de Triton X-100® à 20%.
L'interaction entre les composants et le détergent a également été évaluée en vérifiant que les dimensions des composants principaux étaient toujours conformes aux spécifications requises après la mise en contact avec la solution d'essai. Enfin, les propriétés spectrales du film ont été vérifiées et comparées au témoin négatif.
Etude de relargables
L’étude de relargables a été réalisée en mettant en contact la poche souple selon l’invention avec une solution de Triton X-100® à une concentration de 1%. La poche contenant le détergent a ensuite été incubée sous agitation pendant 24 heures, à une température de
30°C ± 5°C. La poche utilisée a une capacité de contenance de 500mL.
Un témoin négatif a également été préparé en remplaçant la poche souple par un flacon en verre et un flacon en polytétrafluoroéthylène (PTFE) de même contenance.
L’analyse des impuretés (élément inorganiques) a été réalisée par spectrométrie de masse à plasma à couplage inductif (ICP-MS) pour évaluer la migration des éléments inorganiques dans les matériaux en plastique (35 éléments ont été évalués en accord avec les directives ICH Q3D, EMEA and USP paragraphe <232>). Les relargables organiques volatiles et semi-volatiles ont été analysés en utilisant une chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (GC-MS). Les composés organiques réactifs aux UV ont été analysés en utilisant une chromatographie en phase liquide haute performance couplée à un détecteur de spectres ultraviolets (HPLC-UV), indépendamment de leur poids moléculaire.
Résultats obtenus :
Etude de la compatibilité chimique
Les résultats de l’étude de compatibilité chimique de la poche souple lorsque celle-ci est mise en contact sous agitation avec une solution de Triton X-100® à une concentration de 20%, pendant 72 heures, à une température de 5°C ± 3°C sont présentés dans le tableau
3 ci-après.
Catégorie de test Description du test Résultat du test
N/A Analyse de la perte de poids de la poche Conforme
Catégorie 1 Inspection visuelle de la poche : transparence/opacité Conforme
Inspection visuelle de la poche : modification de la couleur Conforme
Catégorie 2 Epaisseur du film Conforme
Dimension de l’hélice Conforme
Catégorie 3 Résistance à la traction du film Conforme
Catégorie 4 Inspection visuelle de la poche : formation de bulles Conforme
Inspection visuelle de la poche : délamination Conforme
Catégorie 5 Vérification des fuites au niveau des accessoires Conforme
Vérification des fuites au niveau des joints de la poche Conforme
Vérification des fuites au niveau du film Conforme
Vérification des fuites au niveau de l’orifice d’entrée Conforme
Inspection visuelle de la poche : décomposition Conforme
Inspection visuelle de la poche : friabilité Conforme
Inspection visuelle de la poche : cratère/trou Conforme
Tableau 3: Résultats obtenus pour la compatibilité chimique de la poche souple ayant une capacité de 500mL mise en contact avec une solution de Triton X-100® à une concentration de 20%.
Les résultats de l’étude de compatibilité chimique montrent que la poche souple selon l’invention présente une excellente compatibilité chimique lorsqu'elle est exposée à une solution de Triton X-100® à 20% pendant 72 heures à une température de 5 °C ± 3°C.
io
Etude de relargables
Les résultats de l’étude de relargables sont présentés dans le tableau 4 ci-après.
Analyses Méthode Résultats
Impuretés (éléments inorganiques) ICP-MS|OES Du potassium et du zinc ont été détectés à un niveau quantifiable et équivalent à celui observé pour les témoins négatifs
Relargables organiques RP-HPLC-UV Pas de relargables détectés
Relargables organiques GC-MS Deux relargables de type hydrocarbure ont été détectés à une concentration d’environ 1ppm chacun
Tableau 4 : Résultats obtenus pour l’étude de relargables de la poche souple ayant une capacité de 500mL mise en contact avec une solution de Triton X-100® à une concentration de 1%.
Exemple 4 : Etude de répartition de la concentration en Triton X-100® dans une poche d’une capacité de 50L.
Cette étude a été réalisée pour vérifier que la concentration en Triton X-100® est homogène à l’intérieur de la poche souple une fois celle-ci agitée par l’agitateur magnétique. L’adsorption ainsi que l’efficacité de l’agitation ont été vérifiées. L’étude a été réalisée avec de l’eau purifiée. Une poche souple selon l’invention d’une capacité de 50L a été remplie avec 50L d’eau purifiée. Le détergent Triton X-100® à une concentration de 1 % a été ajouté. La poche contenant l’eau et le Triton X-100®a été soumise à une agitation à une vitesse 40 tours/minutes (rpm). Des échantillons ont été prélevés à 0, 30, 60 et 120 minutes d’incubation en un point qui est de 30 mm en dessous de la surface du liquide et au niveau du fond de la poche. De cette façon, la concentration de Triton X-100 a été évaluée à la fois en haut et au fond de la poche.
Aux fins de la présente expérience, est considéré comme le temps T=0, la première apparition d’une solution homogène suite à l’agitation.
Un témoin a été réalisé en parallèle dans une bouteille en verre de borosilicate de 5L avec
2105 g de Triton X-100® à 1% dans de l'eau purifiée. La solution a été agitée en utilisant une barre de plaque de mélange et d'un agitateur magnétique, à une vitesse 100 tours/minutes (rpm). Des échantillons ont été prélevés après 0 et 120 minutes d’incubation.
L'échantillonnage a été effectué en utilisant des flacons en verre stériles de 30mL qui ont 5 été immédiatement stockés à 2-8 °C. La concentration de Triton X-100®a été mesurée par chromatographie en phase liquide haute performance en phase inversée (RP-HPLC).
Résultats obtenus :
Les résultats obtenus sont présentés à la figure 3.
La différence de concentration en Triton X-100® entre la partie haute et le fond de la poche est de 2,7%, ce qui est inférieure à la valeur de 10% pour la différence de concentration en Triton X-100® entre la partie haute et le fond de la poche. Ainsi, la capacité de l’agitateur magnétique à répartir la concentration en Triton X-100® de manière homogène dans la poche a été démontrée.
La concentration de Triton X-100® a été considérée comme stable au cours du temps dans la poche selon l’invention, dans la mesure où la plus grande différence observée entre les concentrations inférieures et supérieures mesurée est de 7,90%, ce qui est compris dans les limites spécifiées allant de 0 à 10%.

Claims (6)

  1. REVENDICATIONS
    1. Méthode d’inactivation virale d’une préparation d’anticorps monoclonaux, caractérisée en ce qu’elle comprend une étape de mise en contact de la préparation d’anticorps
    5 monoclonaux avec un détergent non ionique, la mise en contact étant réalisée sous agitation dans une poche souple à usage unique, apte à recevoir et à contenir la préparation d’anticorps monoclonaux.
  2. 2. Méthode d’inactivation virale selon la revendication 1, dans laquelle la poche souple
    10 est constituée d’un film multicouches de polymères et d’un moyen d’agitation.
  3. 3. Méthode d’inactivation virale selon la revendication 2, dans laquelle le moyen d’agitation est une hélice.
    15
  4. 4. Méthode d’inactivation virale selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle le détergent non ionique est choisi parmi le polyéthylène glycol sorbitan monolaurate, polyéthylène glycol sorbitan monooléate, le polyéthylène glycol tertoctylphényl éther, le nonyl phénoxypolyéthoxyléthanol, l’acide 3-[(3cholamidopropyl)diméthylammonio]propanesulfonique, et le n-dodécyl-p-D20 maltoside.
  5. 5. Méthode d’inactivation virale selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, dans laquelle le détergent non ionique est le polyéthylène glycol fezï-octylphényl éther.
    25
  6. 6. Préparation d’anticorps monoclonaux viralement inactivée obtenue selon la méthode de l’une quelconque des revendications 1 à 5.
    1/2
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