FR3054039A1 - Biocapteur pour detecter la presence de bacteries - Google Patents

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Abstract

La présente invention concerne un biocapteur pour détecter la présence et/ou mesurer la concentration d'au moins un agent biologique, comprenant un support sur lequel est disposé un code à barres dont au moins une zone est fonctionnalisée par au moins un aptamère apte à immobiliser sélectivement ledit agent biologique, ledit aptamère étant lui-même lié, directement ou non, à une molécule colorante via une liaison chimique labile qui est apte à se rompre lors de l'immobilisation de l'agent biologique par ledit aptamère, et ladite molécule colorante étant non luminescente sous sa forme liée à l'aptamère et luminescente, de préférence fluorescente, sous sa forme non liée à l'aptamère.

Description

Titulaire(s) : UNIVERSITE DE MONTPELLIER Etablissement public, CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE (CNRS) Etablissement public.
Demande(s) d’extension
Mandataire(s) : CABINET NONY.
BIOCAPTEUR POUR DETECTER LA PRESENCE DE BACTERIES.
FR 3 054 039 - A1 (5/) La présente invention concerne un biocapteur pour detecter la présence et/ou mesurer la concentration d'au moins un agent biologique, comprenant un support sur lequel est disposé un code à barres dont au moins une zone est fonctionnalisée par au moins un aptamère apte à immobiliser sélectivement ledit agent biologique, ledit aptamère étant lui-même lié, directement ou non, à une molécule colorante via une liaison chimique labile qui est apte à se rompre lors de l'immobilisation de l'agent biologique par ledit aptamère, et ladite molécule colorante étant non luminescente sous sa forme liée à l'aptamère et luminescente, de préférence fluorescente, sous sa forme non liée à l'aptamère.
Figure FR3054039A1_D0001
i
La présente invention concerne un biocapteur pour détecter la présence et/ou mesurer la concentration d’au moins un agent biologique, en particulier de bactéries, ainsi qu’un procédé pour analyser la contamination par au moins un agent biologique dans un environnement mettant en œuvre ledit biocapteur.
Dans le domaine hospitalier, il existe des dispositifs permettant de détecter la présence de bactéries, basés sur la recherche de bactéries dans les échantillons d’un patient, en culture et antibiogramme, mais aussi basés sur des méthodes comme la PCR et les galeries API. On peut ainsi citer les tests rapides de détection de pathogène Singlepath® commercialisés par la société MERCK et les kits de détection de bactéries commercialisés par la société ZAYHO.
Toutefois, ces dispositifs nécessitent un temps d’incubation et de mise en culture de l’échantillon allant de 24h à 48h, ce qui retarde la détection de l’infection et diffère donc le traitement efficace du patient avec des conséquences qui peuvent être graves pour celui-ci. En outre, ces dispositifs doivent être stockés entre 2°C et 8°C avant utilisation et ne peuvent en général détecter qu’une seule espèce de bactéries.
Dans le domaine agroalimentaire, il existe des dispositifs de détection de la présence de bactéries au sein d’emballages alimentaires, mettant en œuvre un code à barres dynamique, c’est-à-dire capable de se modifier en présence de métabolites bactériens (cf. notamment US 2002/0072079 et US 2004/0018641).
Ces dispositifs ne permettent toutefois de détecter la présence de bactéries que de manière indirecte et pas de manière immédiate.
En outre, les dispositifs de l’état de la technique ne permettent pas de renseigner de manière immédiate sur la concentration en un agent biologique dans un échantillon, en particulier ils ne permettent pas de déterminer si la dose infectieuse est dépassée ou non, à savoir si la quantité suffisante d’agent pathogène pour provoquer une maladie est dépassée ou non.
Il existe donc un besoin pour un dispositif permettant de pallier les déficiences des dispositifs de détection de bactéries de l’état de la technique.
La présente invention vise ainsi à fournir un dispositif pour détecter la présence et/ou mesurer la concentration d’au moins un agent biologique ne présentant pas les limites des dispositifs existants.
En particulier, la présente invention vise à fournir un dispositif permettant de détecter la présence d’au moins un agent biologique, et de préférence plusieurs agents biologiques différents, de manière plus rapide que les dispositifs de l’état de la technique, voire de manière immédiate.
La présente invention vise également à fournir un dispositif permettant de renseigner sur la concentration en au moins un agent biologique, et de préférence en plusieurs agents biologiques différents, dans un échantillon de manière plus rapide que les dispositifs de l’état de la technique, voire de manière immédiate.
Figures
La figure 1 illustre l’élaboration du biocapteur selon l’invention. Le biocapteur - code barre 2D dynamique permet de détecter 5 agents pathogènes.
La figure 2 illustre l’utilisation du biocapteur à partir de fluides corporels. Les informations reçues via l’application mobile dédiée peuvent permettre : 1. L’identification des agents pathogènes présents dans l’échantillon, 2. L’estimation de la quantité correspondante, 3. L’antibiogramme spécifique pour chaque agent pathogène, 4. La détermination de la dose infectieuse et 5. La localisation.
Biocapteur
Selon un premier objet, la présente invention concerne un biocapteur pour détecter la présence et/ou mesurer la concentration d’au moins un agent biologique, comprenant un support sur lequel est disposé un code à barres dont au moins une zone est fonctionnalisée par au moins un aptamère apte à immobiliser sélectivement ledit agent biologique, ledit aptamère étant lui-même lié, directement ou non, à une molécule colorante via une liaison chimique labile qui est apte à se rompre lors de l’immobilisation de l’agent biologique par ledit aptamère, et ladite molécule colorante étant non luminescente sous sa forme liée à l’aptamère et luminescente, de préférence fluorescente, sous sa forme non liée à l’aptamère.
Dans le cadre de la présente invention, on entend par « aptamère » un oligonucléotide synthétique capable de fixer sélectivement un ligand contenu dans l’agent biologique ciblé (typiquement présent à la surface de l’agent biologique ciblé), c’est-à-dire l’agent biologique que l’on souhaite détecter à l’aide du biocapteur de l’invention.
Les aptamères sont en général des composés synthétiques, isolés in vitro à partir de banques combinatoires d'un grand nombre de composés de séquence aléatoire par une méthode de sélection itérative appelée SELEX.
Le principe de fonctionnement du dispositif selon l’invention est basé sur un phénomène colorimétrique, qui permet de signaler la détection de l’agent biologique ciblé de manière simple, directe et immédiate.
La surface du dispositif selon l’invention comprend un code à barres dont au moins une zone est apte à libérer une molécule colorante lorsque ladite zone entre en contact avec l’agent biologique ciblé et que celui-ci est immobilisé par les aptamères.
Le dispositif de la présente invention est donc spécifique à au moins un agent biologique, c’est-à-dire qu’il ne détecte que le ou les agents biologiques qu’il est destiné à détecter, à savoir le ou les agents biologiques ciblés.
L’immobilisation de l’agent biologique sur les aptamères provoque la rupture d’une liaison labile qui relie l’aptamère à une molécule colorante. C’est la libération de cette molécule colorante, qui n’était pas luminescente sous sa forme liée à l’aptamère mais devient luminescente, de préférence fluorescente, lorsqu’elle est libérée, qui provoque le phénomène colorimétrique, qui apparaît uniquement dans une zone correspondant à la zone fonctionnalisée par l’aptamère.
L’apparition de cette luminescence modifie donc l’information codée par le code à barres et la lecture du code à barres ainsi modifié à l’aide d’un moyen de lecture approprié permet alors de lire l’information modifiée par rapport à l’information codée par le code à barres initial, traduisant la détection de l’agent biologique.
Tout type de modification d’information peut être envisagé. A ce titre on peut citer l’identification des bactéries, la localisation des foyers infectieux, l’antibiogramme correspondant à chaque type de bactéries ou encore l’estimation de la quantité présente (supérieure ou inférieure à la dose infectieuse).
Selon un mode de réalisation, il est en outre possible de mesurer à l’aide d’un moyen de lecture approprié l’intensité de la luminescence générée par la molécule colorante, et par comparaison avec une valeur de référence prédéterminée, on peut déterminer si la concentration d’agent biologique dans l’échantillon contrôlé est supérieure à une quantité correspondant à une dose infectieuse spécifique.
Le dispositif de la présente invention permet donc de détecter la présence et/ou mesurer la concentration d’au moins un agent biologique en temps réel, c’est-à-dire sans incubation préalable de l’échantillon à contrôler et sans traitement préalable, comme par exemple une lyse dans le cas de bactéries.
Avec un dispositif de détection rapide, les agents biologiques tels que les bactéries peuvent être identifiés avant qu’ils n’incubent et/ou prolifèrent et peuvent être traités avec les traitements appropriés.
En outre, le dispositif de la présente invention présente l’avantage de ne pas nécessiter de stockage spécifique en matière de température. En d’autres termes, le dispositif de la présente invention est stable thermiquement à température ambiante (de l’ordre de 20°C).
Des modes de réalisation de l’invention vont maintenant être détaillés.
Le dispositif de l’invention présente l’avantage de pouvoir être mis en œuvre sur une grande variété de supports, qu’ils soient rigides ou souples.
Selon un mode de réalisation, le support est un support souple, de préférence en papier ou en plastique.
Selon un autre mode de réalisation, le support est un support rigide, par exemple en verre.
De préférence, le support est revêtu d’une couche d’alumine sur laquelle est disposé le code à barres.
Le dépôt d’une couche d’alumine peut être réalisé par toute technique connue de l’homme du métier, telle que celle décrite dans les exemples ci-après.
L’épaisseur de la couche d’alumine varie typiquement de 500 nm à 10 pm et est par exemple de 1 pm.
L’utilisation de la couche d’alumine présente plusieurs avantages :
- Tout d’abord une augmentation de la surface d’échange, grâce à l’adaptation de la taille des pores selon le type d’application,
- mais aussi une meilleure adhérence de la fonctionnalisation chimique pour la fixation des ligands (Aptamères). Cela est dû à la présence de liaisons hydroxydes libres (-OH) au niveau de cette surface, qui va faciliter l’immobilisation des aptamères. Ainsi, le taux de liaison hydroxydes disponible peut atteindre environ 80% pour le biocapteur.
L’utilisation de la couche d’alumine présente encore les avantages suivants :
- La couche d’alumine a une stabilité thermique, de sorte qu’elle ne nécessite aucun stockage spécifique après sa fabrication,
- elle est biocompatible, c’est-à-dire qu’elle ne dégrade pas le matériel biologique avec lequel on l’utilise, et enfin,
- le coût de fabrication de la couche d’alumine est relativement faible.
Le dispositif de l’invention présente l’avantage de pouvoir être mis en œuvre avec une grande variété de code à barres, qu’ils soient à 1 ou 2 dimensions.
En outre, une ou plusieurs zones du code à barres peuvent être fonctionnalisées avec un seul ou plusieurs aptamères différents, afin de pouvoir détecter un seul ou plusieurs agents biologiques différents.
Selon un mode de réalisation, le code à barres est un code à barres à 1 dimension, composé d’un assemblage de bandes noires et de bandes blanches parallèles, dans lesquelles au moins une zone d’au moins une bande blanche est fonctionnalisée par au moins un aptamère.
De préférence, la totalité d’au moins une bande blanche est fonctionnalisée par au moins un aptamère.
Selon des variantes de ce mode de réalisation, deux, trois, quatre, voire cinq bandes blanches ou plus peuvent être fonctionnalisées avec des aptamères différents, de manière à détecter deux, trois, quatre, voire cinq agents biologiques différents ou plus.
Selon un autre mode de réalisation, le code à barres est un code à barres à 2 dimensions, composé d’un assemblage de pixels noirs et de pixels blancs, dans lesquels au moins un pixel blanc est fonctionnalisé par au moins un aptamère.
Ce type de code à barres présente l’avantage de contenir davantage d’informations, tel que l’identification des bactéries, la localisation des foyers infectieux, l’antibiogramme correspondant à chaque type de bactéries et l’estimation de la quantité présente (supérieure ou inférieure à la dose infectieuse).
Selon des variantes de ce mode de réalisation, deux, trois, quatre, voire cinq pixels blancs ou plus peuvent être fonctionnalisés avec des aptamères différents, de manière à détecter deux, trois, quatre, voire cinq agents biologiques différents, ou plus.
Les aptamères mis en œuvre dans le dispositif de l’invention peuvent être de toute nature, du moment qu’ils sont aptes à immobiliser l’agent biologique que l’on souhaite détecter, qu’ils peuvent être fixés sur le support du dispositif et qu’ils peuvent être liés à une molécule colorante via une liaison labile.
Partant des aptamères décrits dans la littérature et dans les bases de données, l’homme du métier sera capable de les modifier pour permettre leur fixation sur le support du dispositif et leur liaison avec une molécule colorante, ce grâce à des techniques classiques de fonctionnalisation de surface et de couplage covalent.
De préférence, l’aptamère est un brin d’ARN ou d’ADN, dont l’extrémité 3’ est de préférence modifiée pour porter une fonction -COOH.
Cette modification permet de fixer l’aptamère sur le support du dispositif de manière aisée, c’est-à-dire avec des techniques usuelles de greffage sur un support.
Selon un mode de réalisation, l’aptamère est lié de manière covalente à la zone du code à barres via un premier espaceur, de préférence un espaceur de formule -S-(CH2) n-C(O)- où n est compris de 2 à 6 et dans lequel l’atome de soufre est lié de manière covalente au support et l’atome de carbone du groupe C(O) est lié de manière covalente à un atome d’azote de l’aptamère.
Ce type de greffage peut être réalisé en utilisant des techniques connues de l’homme du métier, telles que décrites dans les exemples détaillés ci-après.
Un des avantages du dispositif de l’invention est qu’il permet de détecter tout agent biologique, du moment qu’il existe un aptamère spécifique audit agent biologique.
Il suffit en effet de faire varier l’aptamère de la zone fonctionnalisée pour cibler un agent biologique particulier.
L’agent biologique est typiquement choisi dans le groupe constitué par les bactéries, les prions, les virus, les mycotoxines et les peptides.
Selon un mode de réalisation préféré, l’agent biologique est une bactérie et l’aptamère est apte à fixer sélectivement au moins une protéine membranaire de ladite bactérie, choisis par exemple parmi les lipopolysaccharides (LPS) et les peptidoglycanes (PPG).
Le dispositif de l’invention est particulièrement adapté à la détection d’infections nosocomiales dans le milieu hospitalier, ou encore à la détection de contaminations bactériennes dans le milieu agroalimentaire, détection d’agent pathogène dans l’eau dans les réseaux de distribution d’eau potable, les rivières, les lacs ou encore les piscines.
De préférence, l’agent biologique est une bactérie choisie dans le groupe constitué par Escherichia coli, Pseudomonas aeroginosa, Acinetobacter haitmannii, Staphylococcus aitreits. Clostridium difficile, Clostridium hotulinum, Streptococcus pneumoniae, Treponema pallidum, Salmonella gastroenteretis, Listeria monocytogenes et Légionella spp.
Dans le dispositif de l’invention, la libération de la molécule colorante signale la détection de l’agent biologique ciblé.
Cette molécule colorante n’est pas luminescente lorsqu’elle est encore liée à l’aptamère, ce qui signifie que la zone du dispositif qui est fonctionnalisée avec l’aptamère ne génère aucun phénomène colorimétrique si elle n’est pas en présence de l’agent biologique ciblé.
En revanche, lorsqu’elle est libérée, elle devient luminescente et génère un phénomène colorimétrique que l’on peut visualiser par un moyen de lecture approprié, tel qu’une caméra ou un appareil photo.
Ce fonctionnement assure la détection directe et instantanée de l’agent biologique ciblé.
De préférence, la molécule colorante possède une bande d’absorption luminescente comprise de 600 nm à 700 nm, de préférence de 640 nm à 670 nm, et une bande d’émission luminescente comprise de 600 nm à 700 nm, de préférence de 665 nm à 675 nm.
La libération de la molécule colorante peut être déclenchée selon divers mécanismes.
Selon un mode de réalisation préféré, la molécule colorante est liée de manière covalente à l’aptamère via un second espaceur, de préférence un espaceur comprenant une liaison chimique labile qui est apte à se rompre lors de l’immobilisation de l’agent biologique par l’aptamère.
Dans le cas de la détection de bactéries responsables d’infections nosocomiales, un mode de libération préféré de l’invention se base sur la résistance aux antibiotiques des bactéries, en particulier sur la résistance aux antibiotiques de type β-lactame.
Les bactéries résistantes aux antibiotiques de type β-lactame ont la capacité de libérer des β-lactamase lorsqu’elles sont en présence desdits antibiotiques, ce qui altère la structure de ces antibiotiques et les rend inopérants.
De préférence, le second espaceur est un radical divalent comprenant un motif β-lactame, par exemple un motif céphalosporine.
Procédé de fabrication du biocapteur
Le dispositif de la présente invention peut être fabriqué par des techniques engendrant de faibles coûts de production.
Le dispositif de la présente invention peut être aisément miniaturisé et il peut être réalisé de manière à être à usage unique et donc détruit après utilisation.
Un procédé de fonctionnalisation de support adapté à la fabrication d’un biocapteur selon l’invention est décrit dans les exemples détaillés ci-après.
Ce procédé comprend les étapes suivantes : préparation du support et revêtement par une couche d’alumine, suivie de l’activation de la couche d’alumine pour permettre le greffage des aptamères, puis greffage du complexe aptamère-molécule colorante sur la couche d’alumine activée ou bien greffage de l’aptamère sur la couche d’alumine activée suivi du greffage de la molécule colorante sur l’aptamère ainsi greffé.
Ces étapes de modification de surface (revêtement, activation, fonctionnalisation, greffage, couplage, etc) utilisent des techniques connues de l’homme du métier.
Ce procédé peut être mis en œuvre pour fonctionnaliser une zone prédéterminée d’un code à barres, tel qu’illustré dans les exemples détaillés ci-après, afin de préparer un biocapteur selon l’invention.
Procédé pour analyser une contamination
Selon un autre objet, la présente invention concerne un procédé pour analyser la contamination par au moins un agent biologique dans un environnement, comprenant au moins les étapes consistant à :
disposer d’un biocapteur selon l’invention, mettre en présence le biocapteur avec l’environnement à analyser, dans des conditions propices à l’immobilisation du ou des agents biologiques éventuellement présents dans ledit environnement par les aptamères du biocapteur, lire le biocapteur ainsi revêtu, dans des conditions d’illumination propices à la luminescence de la molécule colorante sous sa forme non liée à l’aptamère, de manière à acquérir l’information codée par le code à barres du biocapteur ainsi revêtu, et générer à partir de l’information acquise une information concernant la présence éventuelle d’au moins un agent biologique dans l’environnement.
Par « environnement à analyser », on entend le milieu dans lequel on souhaite détecter la présence de l’agent biologique ciblé.
Dans le cas de la détection d’une contamination bactérienne chez un patient, le dispositif de l’invention est typiquement mis en œuvre à partir de fluides corporels tels que prioritairement la sueur, l’urine, ou la salive ou encore le sang. Le dispositif de l’invention n’est donc pas nécessairement invasif puisqu’il peut être mis en œuvre sur un échantillon autre que du sang.
L’environnement à analyser peut donc être un échantillon de fluides corporels d’un patient tels que le sang, la sueur, l’urine, ou la salive.
Dans le cas de la détection d’une contamination bactérienne dans un produit agroalimentaire, il peut s’agir de l’atmosphère gazeuse contenue dans un emballage alimentaire ou bien d’un échantillon prélevé sur ou dans le produit alimentaire.
ίο
Lors de la mise en présence du biocapteur avec l’environnement à analyser, on s’assure que les conditions sont propices à l’immobilisation du ou des agents biologiques éventuellement présents dans ledit environnement par les aptamères du biocapteur.
L’utilisation du biocapteur peut être réalisée à température ambiante. Les réponses sont typiquement obtenues en moins de 15 à 20 minutes.
Lors de la mise en présence du biocapteur et de l’environnement à analyser, si celui-ci contient des agents biologiques ciblés par ledit biocapteur, ceux-ci sont immobilisés sur les aptamères spécifiques à ces agents biologiques, ce qui provoque la libération de molécules colorantes dans les zones correspondant aux zones de fonctionnalisation par les aptamères.
L’étape suivante consiste donc à lire le biocapteur ainsi revêtu, dans des conditions d’illumination propices à la luminescence de la molécule colorante sous sa forme non liée à l’aptamère, de manière à acquérir l’information codée par le code à barres du biocapteur ainsi revêtu.
L’homme du métier sera capable d’adapter les conditions d’illumination pour activer la luminescence de la molécule colorante.
Selon un mode de réalisation préféré, la luminescence de la molécule colorante n’est décelable que sous une illumination plus importante que la lumière du jour ou l’éclairage artificiel d’intérieur.
Selon ce mode, la luminescence de la molécule colorante est typiquement activée au moyen d’un flash, typiquement un flash d’appareil photo ou de téléphone portable. L’homme du métier sera capable d’adapter la molécule colorante en fonction de la longueur d’onde du flash pour tirer profit de sa luminescence.
Outre les conditions de luminescence, il est également nécessaire de recueillir l’image du code à barres, typiquement au moyen d’une caméra ou d’un appareil photo, typiquement de l’appareil photo d’un téléphone portable (smartphone).
Le dispositif de la présente invention est donc facilement mis en œuvre, c’està-dire qu’il ne requiert aucune technique d’analyse particulière : un simple contrôle à l’aide d’un flash et d’une caméra ou d’un appareil photo est suffisant pour analyser la réponse du biocapteur.
Le mode de lecture du biocapteur de l’invention, utilisant la luminescence et de préférence la fluorescence, présente l’avantage d’être discret et confidentiel puisque seul l’utilisateur muni d’une source lumineuse et d’un moyen de lecture adaptés, typiquement un smartphone équipé d’un flash et de l’application dédiée, est apte à décrypter l’information codée dans le code à barres du biocapteur.
Dans le domaine médical, par exemple dans le cas de la détection d’une contamination bactérienne chez un patient, ce mode de lecture permet au personnel médical de ne pas alarmer le patient en cas d’infection.
Comme déjà décrit plus haut, l’analyse de l’image du code à barres permet d’accéder à diverses informations, telles que la présence ou non d’un agent biologique ciblé et l’atteinte ou non d’une dose infectieuse en fonction de l’intensité de la luminescence mesurée, ainsi que toute autre information intégrée dans le code à barres telles que la localisation de l’infection détectée, l’identification des agents pathogènes, l’estimation de la quantité des agents pathogènes pour déterminer si la dose infectieuse est dépassée ou non ou la programmation d’un antibiogramme en fonction du type de bactéries identifiées.
Ainsi, plusieurs modes de lecture du code à barres peuvent être envisagés, selon les modes de réalisation de l’invention :
- étape de lecture où le code à barres modifié code lui-même pour une information renseignant sur la présence d’un agent biologique ciblé,
- étape de lecture suivie d’une comparaison avec le code à barres initial pour identifier les zones du code à barres qui apparaissent modifiées, permettant de conclure sur la présence ou non d’agents biologiques ciblés, ou
- étape de lecture suivie d’une étape de mesure du contraste des zones du code à barres qui apparaissent modifiées et comparaison avec des valeurs d’étalonnage, permettant de conclure sur la concentration en agents biologiques ciblés.
Selon un autre objet, la présente invention concerne l’utilisation d’un biocapteur selon l’invention pour analyser la contamination par au moins un agent biologique dans un environnement.
Le biocapteur de l’invention est adapté pour détecter la contamination par au moins un agent biologique chez un patient dans un milieu hospitalier, dans une denrée alimentaire, dans le domaine agricole ou horticole, ou dans le domaine du traitement de l’eau.
Le biocapteur de l’invention est particulièrement adapté à la détection de la contamination bactérienne chez un patient, par analyse de ses fluides corporels tels que son sang, sa sueur, son urine, ou sa salive.
Le biocapteur de l’invention est en outre particulièrement adapté à la détermination du dépassement d’une dose infectieuse.
Selon un autre objet, la présente invention concerne un dispositif pour analyser la contamination par au moins un agent biologique dans un environnement, comprenant au moins un biocapteur selon l’invention.
Dans toute la description, y compris les revendications, les expressions « compris entre ... et ...» et « allant de ... à ... » doivent se comprendre bornes incluses, sauf si le contraire est spécifié.
La présente invention est en outre illustrée, sans y être limitée, par les exemples ci-après.
EXEMPLES
Exemple 1 - Protocole général de fixation des aptamères et du colorant
Matériel
- Agitateur et plaque (Vortex)
- Balance de précision
- Plaque chauffante
Machine de traitement de surface Corona
Réactifs
- acide 3-mercaptopropionique (MPA), Sigma Aldrich
- N-hydroxysuccinimide (NHS), Sigma Aldrich
- l-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl) carbodiimide (EDC), Sigma Aldrich
- eau déionisée et eau distillée, IES
- [céphalosporine]-[ATTO], Sigma Aldrich (référence : C0682000 - 97875)
Etape 1 - Préparation du support • Evaporation thermique d’aluminium sous vide
Un creuset rempli d’aluminium métallique a été chauffé jusqu’à évaporation de l’aluminium. En regard du creuset, un substrat de papier a été placé de manière à condenser les vapeurs d’aluminium sur ledit substrat.
Une couche d’aluminium d’épaisseur d’environ 1 pm a été obtenue.
• Anodisation
Dans une cuve remplie d’acide phosphorique 15%, à une température de 0°C - 5°C, le substrat revêtu d’une couche d’aluminium obtenu à l’étape précédente a été placé à l’anode d’un générateur de courant continu, la cathode du système étant en platine (inerte au milieu).
Une tension comprise entre 80V - 120V a été appliquée et le substrat a été immergé pendant une durée comprise de 600 s à 900 s pour former une couche d’alumine en surface du dépôt d’aluminium. Pour 600 s : épaisseur = 425 nm - 450 nm et taille des pores = 81 nm - 96 nm. Pour 900 s : épaisseur = 800 nm - 950 nm et taille des pores = 81 nm - 96nm.
• Nettoyage du support
Le support a ensuite été nettoyé en le plongeant dans de l’eau déionisée à 70°C pendant 1 minute, puis dans de l’eau déionisée à 20°C pendant 1 minute.
• Traitement de surface (effet Corona)
La surface d’alumine du support nettoyé a ensuite été traitée par effet Corona pendant 30 secondes. Ce traitement permet d’améliorer la mouillabilité et la tension de surface (adhérence) de la surface d’alumine et permet en outre de la protéger contre la corrosion.
Etape 2 : Activation de la surface du support
Il est nécessaire d’activer la surface externe de la couche d’alumine du support pour préparer le greffage des aptamères.
Une méthode classique d’auto-assemblage moléculaire (self-assembly monolayer), notamment décrite dans Wu et al. (PLOS ONE 2012, 7(11), 1-9) ou dans Braiek et al. (Biosensors 2012, 2, 417-426) a été utilisée pour revêtir la surface externe de la couche d’alumine du support de groupements labiles -O-succinimide.
Pour cela, du MPA (30 μΐ d’une solution à lOOmM) a d’abord été déposé sur la surface d’alumine, puis le support ainsi revêtu a été laissé en agitation (agitateur plaque vortex) pendant 1 heure à température ambiante.
La couche d’alumine, initialement greffée de groupements -OH, se retrouve ainsi greffée de groupements -S-CH2CH2-C(O)-OH.
Après lavage à l’eau distillée de la surface ainsi fonctionnalisée, 30 μΐ d’un mélange de EDC/NHS (solution à lOOmM en EDC et à 50mM en NHS, préalablement préparée et agitée pendant 1 heure) a été déposé sur la surface, puis le support ainsi revêtu a été laissé en agitation (agitateur plaque vortex) pendant 1 heure à température ambiante.
La couche d’alumine se retrouve ainsi greffée de groupements -S-CH2CH2-C(O)-O-succinimide, la chaîne -S-CH2CH2-C(O)- correspondant à un premier espaceur.
Etape 3
Première variante : Fixation successive des aptamères et du colorant
Selon une première variante, dite « linéaire », on fixe dans un premier temps les aptamères sur le support, puis le colorant est greffé aux aptamères.
Des solutions aqueuses d’aptamères (concentration de lpmol/ml en aptamère) ont été préparées.
En fonction du type de bactérie que l’on souhaite détecter, on utilise un aptamère associé.
Le tableau ci-après indique un aptamère (monobrin d’ADN) associé :
Souche de bactérie Aptamère
Escherichia coli 5 CGC GTC CCC CGC CGG GCG CGC GCC AGG ATC GAC 3’
ATCC 8739 (SEQ ID NO : 1)
Escherichia coli 0157 H7 5’CTT CTG CCC GCC TCC TTC CTA GCC GGA TCG CGC TGG CCA GAT GAT ATA AAG GGG TCA GCC CCC CAG GAG ACG AGA TAG GCG GAC ACT 3’ (SEQ ID NO : 2)
Staphylococcus 5’TCC CTA CGG CGC TAA CGC CAC CGT GCT ACA ACT CGG
aureus ATT3’ (SEQ ID NO : 3)
Les extrémités 3’ des aptamères mis en œuvre sont de préférence préalablement modifiées en groupements -COOH, par une technique connue de l’homme du métier.
Pour fonctionnaliser une zone spécifique de la surface du support, on peut utiliser un masque adapté aux dimensions du support et présentant au moins une ouverture qui coïncide à la zone du support que l’on souhaite fonctionnaliser lorsque le masque est superposé sur le support. Ce masque peut présenter plusieurs ouvertures qui correspondent aux différentes zones à fonctionnaliser, par un même aptamère ou de préférence par des aptamères différents de manière à pouvoir immobiliser différents agents infectieux.
Ainsi, lorsque l’on souhaite fonctionnaliser une ou plusieurs zones avec un ou plusieurs aptamères, on superpose un masque adapté aux dimensions du support et présentant autant d’ouvertures que de zones à fonctionnaliser, puis on dépose par tout moyen connu de l’homme du métier la ou les solutions d’aptamères dans la ou les ouvertures correspondantes, et ce lors d’une même étape.
Alternativement à l’utilisation d’un masque, d’autres techniques connues de l’homme du métier peuvent également être utilisées, comme l’impression jet d’encre. On fournit pour cela des solutions d’aptamères comme encres de l’imprimante à jet d’encre et on imprime successivement les zones du support à fonctionnaliser.
Quelque soit la technique employée, après le dépôt d’un ou plusieurs aptamères, le support ainsi revêtu est ensuite laissé en agitation (agitateur plaque vortex) pendant 30 minutes à température ambiante, puis l’agitation est arrêtée et le support est placé sous une hotte aspirante pendant 30 minutes.
Une molécule d’aptamère (monobrin d’ADN) se fixe ainsi par un groupement -NH2 porté par une de ses bases (adénine, guanine ou cytosine) à un groupement -S-CH2CH2-C(O)-O-succinimide. Il y a formation d’une liaison amide -C(O)-NH- et départ d’une molécule de N-hydroxysuccinimide.
Le dépôt des solutions d’aptamères peut être répété encore 1 à 2 fois de manière à optimiser le taux de greffage, puis le support est laissé toute une nuit à température ambiante et est enfin rincé à l’eau distillée.
Après la fixation des aptamères sur le support, le colorant est ensuite greffé aux aptamères.
Le colorant est de préférence fourni sous la forme d’un précurseur, contenant un premier motif correspondant au colorant et un second motif correspondant à un deuxième espaceur, ces deux motifs étant liés de manière covalente.
A titre de précurseur de colorant, on utilise de préférence le composé [céphalosporine]-[ATTO] (Sigma Aldrich), dans lequel le motif [céphalosporine] désigne le deuxième espaceur et comporte un groupement -NH2 libre, et le motif [ATTO] désigne le colorant.
La fixation du composé [céphalosporine]-[ATTO] est réalisée en déposant d’abord, sur une zone spécifique du support préalablement fonctionnalisée en aptamères, de l’agent de couplage EDC (10 pL) qui permet d’activer le groupement -COOH libre de l’extrémité 3’ des aptamères. Le support est mis en agitation faible sur plaque vortex pendant environ 30 minutes et 20 μΐ de complexe [céphalosporine]-[ATTO] sont déposés sur ladite zone.
Le colorant est ainsi fixé sur l’aptamère par création d’une liaison peptidique entre le groupement -NH2 libre du motif [céphalosporine] et le groupement -COOH libre de l’extrémité 3’ des aptamères.
Deuxième variante : Fixation en une étape de l’aptamère et du colorant
Selon une deuxième variante, dite «convergente», on greffe d’abord le colorant sur l’aptamère, puis ce complexe est ensuite fixé sur le support.
Cette variante peut être adaptée de la première variante, en réalisant d’abord, hors du support, le couplage de l’aptamère et du colorant.
A titre d’aptamère, on utilise de préférence les aptamères décrits ci-dessus, dont les extrémités 3’ sont préférentiellement préalablement modifiées en groupements -COOH, par une technique connue de l’homme du métier.
A titre de colorant, on utilise de préférence le composé [céphalosporine][ATTO] décrit ci-dessus.
Le couplage entre un aptamère et le colorant [céphalosporine]-[ATTO] peut être réalisé par couplage peptidique selon une méthode connue de l’homme du métier.
Le complexe aptamère-[céphalosporine]-[ATTO] peut ensuite être greffée sur la surface du support, préalablement fonctionnalisée en groupements -S-CH2CH2-C(O)-Osuccinimide par une méthode similaire à celle employée dans la première variante.
Exemple 2 - Réalisation d’un biocapteur code-barres 2D
Un biocapteur code-barres 2D a été réalisé en utilisant le protocole de l’Exemple 1.
En premier lieu, les supports d’alumine sont réalisés.
Puis, les pixels du code-barres sont imprimés, en laissant vierges les zones destinées à être fonctionnalisées par les aptamères et le colorant.
Enfin, les aptamères ont été greffés sur les zones spécifiques prédéterminées.
Un biocapteur capable de détecter à la fois Escherichia coli ATCC 8739 et Staphylococcus aureus a notamment été préparé en utilisant les aptamères décrits ci-dessus et le colorant [céphalosporine]-[ATTO],
Exemple 3 - Mise en œuvre d’un biocapteur code-barres 2D
Quatre biocapteurs code-barres 2D identiques, fabriqués à l’Exemple 2 et capables de détecter Escherichia coli ATCC 8739 et Staphylococcus aureus, ont été testés en appliquant sur chacun des codes-barres 2D :
- un échantillon témoin comprenant uniquement du sérum physiologique, un échantillon n°l comprenant Escherichia coli ATCC 8739 selon une concentration de 106 cfu dans du sérum physiologique, un échantillon n°2 comprenant Staphylococcus aureus selon une concentration de 104 cfu dans du sérum physiologique, ou un échantillon n°3 comprenant Escherichia coli ATCC 8739 selon une concentration de 106 cfu et la Staphylococcus aureus selon une concentration de 104 cfu du sérum physiologique.
Après application des échantillons, à l’œil nu, aucune différence de code n’était décelable.
Les codes-barres 2D des trois biocapteurs ont été pris en photo avec un smartphone équipé d’un flash (longueur d’ondes de 640 nm à 670 nm).
Sur la photo du code-barres de l’échantillon témoin, aucune différence n’a été identifiée avec le code initial.
En revanche, sur la photo du code-barres de l’échantillon n°l, le code est apparu modifié par rapport au code initial, la zone fonctionnalisée par l’aptamère spécifique à Escherichia coli ATCC 8739 est apparue colorée.
De même, sur la photo du code-barres de l’échantillon n°2, le code est apparu modifié par rapport au code initial, la zone fonctionnalisée par l’aptamère spécifique à Staphylococcus aureus est apparue colorée.
Quant à la photo du code-barres de l’échantillon n°3, le code est également apparu modifié par rapport au code initial, les zones fonctionnalisées par l’aptamère spécifique à Escherichia coli ATCC 8739 et par l’aptamère spécifique à Staphylococcus aureus ont toutes les deux apparues colorées.
La comparaison du code pris en photo par le smartphone avec un code de référence, de préférence enregistré dans le smartphone, a donc permis de déterminer la présence ou non d’une bactérie dans l’échantillon, ainsi que le type de bactérie.
La mesure du contraste de la couleur qui apparaît sur la photo du code, comparée à des valeurs d’étalonnage préalablement enregistrées, a en outre permis de déterminer la concentration de bactéries dans chacun des échantillons n°l, n°2 et n°3.

Claims (16)

  1. REVENDICATIONS
    1. Biocapteur pour détecter la présence et/ou mesurer la concentration d’au moins un agent biologique, comprenant un support sur lequel est disposé un code à barres dont au moins une zone est fonctionnalisée par au moins un aptamère apte à immobiliser sélectivement ledit agent biologique, ledit aptamère étant lui-même lié, directement ou non, à une molécule colorante via une liaison chimique labile qui est apte à se rompre lors de l’immobilisation de l’agent biologique par ledit aptamère, et ladite molécule colorante étant non luminescente sous sa forme liée à l’aptamère et luminescente, de préférence fluorescente, sous sa forme non liée à l’aptamère.
  2. 2. Biocapteur selon la revendication 1, dans lequel le support est un support souple, de préférence en papier ou en plastique.
  3. 3. Biocapteur selon l’une des revendications 1 ou 2, dans lequel le support est revêtu d’une couche d’alumine sur laquelle est disposé le code à barres.
  4. 4. Biocapteur selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel le code à barres est un code à barres à 1 dimension, composé d’un assemblage de bandes noires et de bandes blanches parallèles, dans lesquelles au moins une zone d’au moins une bande blanche est fonctionnalisée par au moins un aptamère.
  5. 5. Biocapteur selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel le code à barres est un code à barres à 2 dimensions, composé d’un assemblage de pixels noirs et de pixels blancs, dans lesquels au moins un pixel blanc est fonctionnalisé par au moins un aptamère.
  6. 6. Biocapteur selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel l’aptamère apte à immobiliser sélectivement ledit agent biologique est un brin d’ARN ou d’ADN, dont l’extrémité 3’ est de préférence modifiée pour porter une fonction -COOH.
  7. 7. Biocapteur selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel l’aptamère est lié de manière covalente à la zone du code à barres via un premier espaceur, de préférence un espaceur de formule -S-(CH2)n-C(O)- où n est compris de 2 à 6 et dans lequel l’atome de soufre est lié de manière covalente au support et l’atome de carbone du groupe C(O) est lié de manière covalente à un atome d’azote de l’aptamère.
  8. 8. Biocapteur selon l’une quelconque des revendications 1 à 7, dans lequel l’agent biologique est choisi dans le groupe constitué par les bactéries, les prions et les virus, les mycotoxines et les peptides.
  9. 9. Biocapteur selon l’une quelconque des revendications 1 à 8, dans lequel l’agent biologique est une bactérie et l’aptamère est apte à fixer sélectivement au moins une protéine membranaire de ladite bactérie, choisis par exemple parmi les lipopolysaccharides (LPS) et les peptidoglycanes (PPG).
  10. 10. Biocapteur selon l’une quelconque des revendications 1 à 9, dans lequel l’agent biologique est une bactérie choisie dans le groupe constitué par Escherichia coli, Pseudomonas aeroginosa, Acinetobacter baumannii, Staphylococcus aureus, Clostridium difficile, Clostridium botulinum, Streptococcus pneumoniae, Treponema pallidum, Salmonella gastroenteretis, Listeria monocytogenes et Légionella spp.
  11. 11. Biocapteur selon l’une quelconque des revendications 1 à 10, dans lequel la molécule colorante possède une bande d’absorption luminescente comprise de 600 nm à 700 nm, de préférence de 640 nm à 670 nm, et une bande d’émission luminescente comprise de 600 nm à 700 nm, de préférence de 665 nm à 675 nm.
  12. 12. Biocapteur selon l’une quelconque des revendications 1 à 11, dans lequel la molécule colorante est lié de manière covalente à l’aptamère via un second espaceur, de préférence un espaceur comprenant une liaison chimique labile qui est apte à se rompre lors de l’immobilisation de l’agent biologique par l’aptamère, par exemple une liaison chimique labile apte.à se rompre en présence d’une β-lactamase.
  13. 13. Biocapteur selon la revendication 12, dans lequel le second espaceur est un radical divalent comprenant un motif β-lactame, par exemple un motif céphalosporine.
  14. 14. Procédé pour analyser la contamination par au moins un agent biologique 5 dans un environnement, comprenant au moins les étapes consistant à :
    - disposer d’un biocapteur selon l’une quelconque des revendications 1 à 13, mettre en présence le biocapteur avec l’environnement à analyser, dans des conditions propices à l’immobilisation du ou des agents biologiques éventuellement présents dans ledit environnement par les aptamères du
    10 biocapteur,
    - lire le biocapteur ainsi revêtu, dans des conditions d’illumination propices à la luminescence de la molécule colorante sous sa forme non liée à l’aptamère, de manière à acquérir l’information codée par le code à barres du biocapteur ainsi revêtu, et
  15. 15 - générer à partir de l’information acquise une information concernant la présence éventuelle d’au moins un agent biologique dans l’environnement.
    15. Utilisation d’un biocapteur selon l’une quelconque des revendications 1 à 13 pour analyser la contamination par au moins un agent biologique dans un
    20 environnement.
  16. 16. Dispositif pour analyser la contamination par au moins un agent biologique dans un environnement, comprenant au moins un biocapteur selon l’une quelconque des revendications 1 à 13.
    172
    Support en Alumine nanoporeuse
    I Fonctionnalisation et immobilisation | des aptamères
    Su DDort fonctionnalisé
    BiocapteurCode barre 2D dynamique
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