CA3030613A1 - Biocapteur pour detecter la presence de bacteries - Google Patents

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Brice Sorli
Morgane NEDELEC
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Universite de Montpellier I
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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite de Montpellier I
AxLR SATT du Languedoc Roussillon SAS
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Abstract

La présente invention concerne un biocapteur pour détecter la présence et/ou mesurer la concentration d'au moins un agent biologique, comprenant un support sur lequel est disposé un code à barres dont au moins une zone est fonctionnalisée par au moins un aptamère apte à immobiliser sélectivement ledit agent biologique, ledit aptamère étant lui-même lié, directement ou non, à une molécule colorante apte soit à produire de la couleur, soit à changer de couleur suite à l'immobilisation de l'agent biologique par ledit aptamère.

Description

BIOCAPTEUR POUR DETECTER LA PRESENCE DE BACTERIES
La présente invention concerne un bio capteur pour détecter la présence et/ou mesurer la concentration d'au moins un agent biologique, en particulier de bactéries, ainsi qu'un procédé pour analyser la contamination par au moins un agent biologique dans un environnement mettant en oeuvre ledit biocapteur.
Dans le domaine hospitalier, il existe des dispositifs permettant de détecter la présence de bactéries, basés sur la recherche de bactéries dans les échantillons d'un patient, .. en culture et antibiogramme, mais aussi basés sur des méthodes comme la PCR
et les galeries API. On peut ainsi citer les tests rapides de détection de pathogène Singlepath0 commercialisés par la société MERCK et les kits de détection de bactéries commercialisés par la société ZAYHO.
Toutefois, ces dispositifs nécessitent un temps d'incubation et de mise en culture .. de l'échantillon allant de 24h à 48h, ce qui retarde la détection de l'infection et diffère donc le traitement efficace du patient avec des conséquences qui peuvent être graves pour celui-ci. En outre, ces dispositifs doivent être stockés entre 2 C et 8 C avant utilisation et ne peuvent en général détecter qu'une seule espèce de bactéries.
Dans le domaine agroalimentaire, il existe des dispositifs de détection de la présence de bactéries au sein d'emballages alimentaires, mettant en oeuvre un code à barres dynamique, c'est-à-dire capable de se modifier en présence de métabolites bactériens.
Ces dispositifs ne permettent toutefois de détecter la présence de bactéries que de manière indirecte et pas de manière immédiate.
Par ailleurs, les documents US2002/0072079 et US2004/018641 divulguent des détecteurs de contamination permettant d'identifier une contamination comprenant : un premier indice codé pour identifier un produit, un second indice codé pour identifier une condition indicative d'une contamination, un indicateur de contamination associé à un premier et à un deuxième code à barres et des moyens pour changer l'apparence de l'indicateur en présence d'une condition de contamination, dans lesquels les moyens pour changer l'apparence de l'indicateur modifient l'apparence du premier et du deuxième indice codé.
2 PCT/EP2017/067636 Toutefois, ces documents ne font pas état d'une génération de couleur ou d'un changement colorimétrique par le biais de la présence d'une molécule colorante liée à un aptamère.
En outre, les dispositifs de l'état de la technique ne permettent pas de renseigner de manière immédiate sur la concentration en un agent biologique dans un échantillon, en particulier ils ne permettent pas de déterminer si la dose infectieuse est dépassée ou non, à
savoir si la quantité suffisante d'agent pathogène pour provoquer une maladie est dépassée ou non.
Il existe donc un besoin pour un dispositif permettant de pallier les déficiences des dispositifs de détection de bactéries de l'état de la technique.
La présente invention vise ainsi à fournir un dispositif pour détecter la présence et/ou mesurer la concentration d'au moins un agent biologique ne présentant pas les limites des dispositifs existants.
En particulier, la présente invention vise à fournir un dispositif permettant de détecter la présence d'au moins un agent biologique, et de préférence plusieurs agents biologiques différents, de manière plus rapide que les dispositifs de l'état de la technique, voire de manière immédiate.
La présente invention vise également à fournir un dispositif permettant de renseigner sur la concentration en au moins un agent biologique, et de préférence en plusieurs agents biologiques différents, dans un échantillon de manière plus rapide que les dispositifs de l'état de la technique, voire de manière immédiate.
Figures La figure 1 illustre l'élaboration du biocapteur selon l'invention. Le biocapteur ¨ code barre 2D dynamique permet de détecter 5 agents pathogènes.
La figure 2 illustre l'utilisation du biocapteur à partir de fluides corporels. Les informations reçues via l'application mobile dédiée peuvent permettre : 1.
L'identification des agents pathogènes présents dans l'échantillon, 2. L'estimation de la quantité
correspondante, 3. L'antibiogramme spécifique pour chaque agent pathogène, 4.
La détermination de la dose infectieuse et 5. La localisation.
3 PCT/EP2017/067636 La figure 3 illustre l'évolution visuelle d'un code à barres 2D par changement de teinte de couleur avant et après révélation d'une bactérie cible par un biocapteur selon l'invention (Example 4.1).
La figure 4 illustre l'évolution visuelle d'un code à barres 1D par changement .. de teinte de couleur avant et après révélation d'une bactérie cible par un biocapteur selon l'invention (Example 4.2).
Biocapteur Selon un premier objet, la présente invention concerne un biocapteur pour détecter la présence et/ou mesurer la concentration d'au moins un agent biologique, comprenant un support sur lequel est disposé un code à barres dont au moins une zone est fonctionnalisée par au moins un aptamère apte à immobiliser sélectivement ledit agent biologique, ledit aptamère étant lui-même lié, directement ou non, à une molécule colorante apte soit à produire de la couleur, soit à changer de couleur suite à
l'immobilisation de l'agent biologique par ledit aptamère, éventuellement par activation par flash comme détaillé plus loin dans la description.
Selon un mode de réalisation particulier, la molécule colorante est liée directement ou non via une liaison labile.
Principe de fonctionnement Le principe de fonctionnement du dispositif selon l'invention est basé sur un phénomène colorimétrique, qui permet de signaler la détection de l'agent biologique ciblé
de manière simple, directe et immédiate.
Le dispositif de la présente invention est spécifique à au moins un agent biologique, c'est-à-dire qu'il ne détecte que le ou les agents biologiques qu'il est destiné à
détecter, à savoir le ou les agents biologiques ciblés.
La surface du dispositif selon l'invention comprend selon un mode de réalisation particulier un code à barres dont au moins une zone est apte à produire une couleur ou .. changer de couleur après que ladite zone ait été mise en contact avec l'agent biologique ciblé
et que celui-ci ait été immobilisé par les aptamères.
4 PCT/EP2017/067636 Comme cela est détaillé ci-après, la génération de la couleur ou le changement de couleur peut être lié à la libération par l'agent biologique d'enzymes particulières, provoquées par la liaison agent biologique-aptamère.
Selon une première variante, cette attaque d'enzymes particulières peut être provoquer la rupture d'une liaison labile présente entre la molécule colorante et l'aptamère.
Selon une deuxième variante, cette attaque d'enzymes particulières peut engendrer une génération de couleur ou un changement de couleur de la molécule colorante.
Selon une troisième variante, cette attaque d'enzymes particulières peut être la source de ces deux phénomènes à la fois, à savoir la rupture d'une liaison labile présente entre la molécule colorante et l'aptamère et une génération de couleur ou un changement de couleur de la molécule colorante.
Ainsi comme illustré dans les exemples, les inventeurs ont mis en évidence qu'une liaison molécule colorante-aptamère comportant un motif13-lactame était détériorée par suite de libération de 13-lactamase suite à l'immobilisation de deux types de bactéries (voir la mise en oeuvre dans l'exemple 3) sur l'aptamère, provoquant la libération de la molécule colorante et par suite permettant une génération de couleur et la formation d'un code barre 2D indiquant la présence des bactéries correspondantes.
Dès lors, selon cette variante particulière, la surface du dispositif selon l'invention comprend un code à barres dont au moins une zone est apte à
libérer une molécule colorante lorsque ladite zone entre en contact avec l'agent biologique ciblé
et que celui-ci est immobilisé par les aptamères.
Une autre variante, basée sur le même principe, permet de remplacer la molécule antibiotique par un autre type de molécule, capable d'être attaquée par des enzymes différentes. On peut par exemple citer le couple lactose/I3-galactosidase, au sein duquel la 13-galactosidase peut-être sécrétée notamment par E.coli. On peut également citer l'utilisation d'a-amylase, une enzyme fongique, produite notamment par Thermomyces lanuginosus, capable d'attaquer des polysaccharides, notamment afin de les rendre fermentescibles.
Les inventeurs ont également illustré dans les exemples la variante selon laquelle la molécule colorante n'est pas libérée mais est apte à générer une couleur ou un changement de couleur de ladite molécule colorante suite à l'immobilisation d'une bactérie sur l'aptamère (exemples 4 et 5).
5 PCT/EP2017/067636 Liaison molécule colorante-aptamère Selon la première variante de l'invention exposée ci-dessus, la molécule colorante peut par exemple être libérée après que l'agent biologique ait été
immobilisé par l'aptamère. Dans ce cas la molécule colorante est reliée à l'aptamère, par exemple via un .. second espaceur comme cela sera détaillé ci-après, et la molécule colorante peut être fixée à
ce second espaceur par le biais d'une liaison labile.
Selon la deuxième variante de l'invention exposée ci-dessus, la molécule colorante peut ne pas être libérée après que l'agent biologique ait été
immobilisé par l'aptamère mais peut toutefois changer de couleur après que l'agent biologique ait été
immobilisé par l'aptamère.
Avantageusement, toujours selon cette deuxième variante, la liaison entre la molécule colorante et l'aptamère peut ne pas comprendre de liaison labile ni d'espaceur.
Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, la molécule colorante appartient à la famille des antibiotiques.
Le principe de détection de cette invention repose sur un changement de couleur résultant d'une réaction inductible en chaîne. En effet, dans le cas d'une application santé
pour la détection de maladies nosocomiales et si l'échantillon biologique à
tester contient la ou les bactérie(s) cible(s), l'aptamère reconnait l'agent biologique et l'immobilise.
La bactérie est alors mise en contact avec la molécule antibiotique liée à
.. l'extrémité 3' de l'aptamère. Suite à ce contact et si la bactérie est résistante à l'antibiotique utilisé (famille des céphalosporines, pénicillines par exemple), celle-ci produit des enzymes par exemple 13-lactamases qui sont aptes à attaquer l'antibiotique.
A titre de motifs pouvant appartenir à ces antibiotiques et susceptibles d'être attaqués par les 13-lactamases, on peut citer les noyaux 13-lactames.
Tous les antibiotiques 13-lactames, à savoir contenant un noyau 13-lactame conviennent à la mise en oeuvre de l'invention. A ce titre, on peut notamment citer les dérivés de pénicilline (pénames), les dérivés de céphalosporine (céphèmes), les oxapénèmes, les monobactames et les carbapénèmes.
Selon la nature/famille de l'antibiotique et selon le mode de détection, une réaction colorimétrique a lieu.
6 PCT/EP2017/067636 Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, la réaction colorimétrique peut notamment engendrer de la luminescence, par exemple de la fluorescence.
La présente invention concerne ainsi selon un mode de réalisation particulier un biocapteur pour détecter la présence et/ou mesurer la concentration d'au moins un agent biologique, comprenant un support sur lequel est disposé un code à barres dont au moins une zone est fonctionnalisée par au moins un aptamère apte à immobiliser sélectivement ledit agent biologique, ledit aptamère étant lui-même lié, directement ou non, à une molécule colorante via une liaison chimique labile qui est apte à se rompre suite à
l'immobilisation de l'agent biologique par ledit aptamère, et ladite molécule colorante étant non luminescente sous sa forme liée à l'aptamère et luminescente, de préférence fluorescente, sous sa forme non liée à l'aptamère.
Elle concerne également, selon un autre mode de réalisation particulier un biocapteur tel que défini précédemment, dans lequel la molécule colorante est liée de manière covalente à l'aptamère via un second espaceur, ledit second espaceur étant lié à la molécule colorante par une liaison chimique labile qui est apte à se rompre suite à
l'immobilisation de l'agent biologique par l'aptamère, par exemple une liaison chimique labile apte à se rompre en présence d'une 13-lactamase.
Elle concerne aussi, selon un autre mode de réalisation particulier, un biocapteur tel que défini précédemment, dans lequel la molécule colorante est un antibiotique lié de manière covalente à l'aptamère, ladite molécule colorante étant apte à
produire une couleur ou changer de couleur suite à l'immobilisation de l'agent biologique par l'aptamère, par exemple ladite molécule chimique comprenant un antibiotique chromogène.
Aptamère/agent biologique Dans le cadre de la présente invention, on entend par aptamère un oligonucléotide synthétique capable de fixer sélectivement un ligand contenu dans l'agent biologique ciblé (typiquement présent à la surface de l'agent biologique ciblé) ou encore sécrété ou excrété par ledit agent, c'est-à-dire l'agent biologique que l'on souhaite détecter à l'aide du bio capteur de l'invention.
7 PCT/EP2017/067636 Les aptamères sont en général des composés synthétiques, isolés in vitro à
partir de banques combinatoires d'un grand nombre de composés de séquence aléatoire par une méthode de sélection itérative appelée SELEX.
Un des avantages du dispositif de l'invention est qu'il permet de détecter tout agent biologique, du moment qu'il existe un aptamère spécifique audit agent biologique.
Il suffit en effet de faire varier l'aptamère pour cibler un agent biologique particulier. Autrement dit, le dispositif se fonde sur une spécificité au niveau du couple agent bio logique/aptamère.
L'agent biologique est typiquement choisi dans le groupe constitué par les bactéries, les prions, les virus, les mycotoxines et les peptides.
Selon un mode de réalisation préféré, l'agent biologique est une bactérie et l'aptamère est apte à fixer sélectivement au moins une protéine membranaire de ladite bactérie, choisie par exemple parmi les lipopolysaccharides (LPS) et les peptidoglycanes (PPG).
Le dispositif de l'invention est particulièrement adapté à la détection d'infections nosocomiales dans le milieu hospitalier, ou encore à la détection de contaminations bactériennes dans le milieu agroalimentaire, détection d'agent pathogène dans l'eau dans les réseaux de distribution d'eau potable, les rivières, les lacs ou encore les piscines.
De préférence, l'agent biologique est une bactérie choisie dans le groupe constitué par Escherichia cou, Pseudomonas aeroginosa, Acinetobacter baumannii, Staphylococcus aureus, Clostridium difficile, Clostridium botulinum, Streptococcus pneumoniae, Treponema pallidum, Salmonella gastroenteretis, Listeria monocytogenes et Legionella spp.
Lorsque l'agent biologique est une bactérie, et comme indiqué précédemment, la présente invention peut avantageusement tirer profit de la présence d'une molécule antibiotique dans le dispositif, engendrant la sécrétion d'enzymes par la bactérie, la sécrétion desdites enzymes permettant, directement ou indirectement la génération d'une couleur ou un changement de couleur via la molécule colorante.
Conformément à la première variante décrite précédemment, la molécule .. antibiotique est comprise dans un espaceur entre l'aptamère et la molécule colorante ou second espaceur dans le cadre de la présente invention.
8 PCT/EP2017/067636 Toujours selon cette première variante, une liaison chimique labile est comprise entre 1' espaceur et la molécule colorante. Autrement dit, l'attaque de l'enzyme secrétée de la liaison chimique entre l'aptamère et la molécule colorante, provoque la libération de la molécule colorante, générant une couleur ou provoquant un changement de couleur.
Conformément à la deuxième variante décrite précédemment, la molécule colorante comprend ou consiste en une molécule antibiotique apte à changer de couleur, ou antibiotique chromogène, suite à l'attaque des enzymes issues de la bactérie cible capturée par le biocapteur selon l'invention.
Les aptamères mis en oeuvre dans le dispositif de l'invention peuvent être de toute nature, du moment qu'ils sont aptes à immobiliser de façon sélective l'agent biologique que l'on souhaite détecter, qu'ils peuvent être fixés sur le support du dispositif, par exemple via un premier espaceur, et qu'ils peuvent être liés à une molécule colorante, par exemple via un second espaceur.
Comme exposé précédemment, une liaison labile peut être comprise entre la molécule colorante et l'aptamère, en particulier entre le second espaceur, lui-même comprenant une molécule antibiotique, et la molécule colorante.
Alternativement, une telle liaison labile peut ne pas être comprise entre la molécule colorante et l'aptamère dans le cas où la molécule colorante appartient à la famille des antibiotiques et est apte à générer de la couleur ou provoquer un changement de couleur ou antibiotique chromogène. Dans ce dernier cas, la molécule colorante peut être directement liée à l'aptamère, sans nécessiter la présence d'un un second espaceur Partant des aptamères décrits dans la littérature et dans les bases de données, l'homme du métier sera capable de les modifier pour permettre leur fixation sur le support du dispositif et leur liaison avec une molécule colorante, ce grâce à des techniques classiques de fonctionnalisation de surface et de couplage covalent, et notamment via un second espaceur.
De préférence, l'aptamère est un brin d'ARN ou d'ADN. Il peut également être un peptide.
Selon un mode de réalisation particulier, l'aptamère est modifié sur son extrémité 3', en particulier pour porter une fonction ¨COOH.
9 PCT/EP2017/067636 Selon un autre mode de réalisation particulier, l'aptamère est modifié sur son extrémité 5', en particulier pour porter une fonction -NH2.
Cette modification permet de fixer l'aptamère sur le support du dispositif de manière aisée, c'est-à-dire avec des techniques usuelles de greffage sur un support.
L'aptamère peut ainsi être lié de manière covalente à la zone du code à barres via un premier espaceur.
Selon un mode de réalisation particulier, ledit premier espaceur peut avoir la formule ¨S-(CH2).-C(0)- où n est un entier compris de 2 à 6 et dans lequel l'atome de soufre est lié de manière covalente au support et l'atome de carbone du groupe C(0) est lié de manière covalente à un atome d'azote de l'aptamère.
Selon d'autres modes de réalisation particuliers, la liaison aptamère-support peut être effectuée par silane (OH-Silane-NH2) par exemple le TPM, par un linker hétérobifonctionnel (SH-Hétero bifonctionnel-NH2) par exemple le SMCC ou encore par UV. A ce titre, une réalisation de film de silane sur un support avec liaisons OH a été décrite dans M.Zain et al Effect of surface treatments on the durability of green polyurethane adhesive bonded aluminium alloy International Journal of Adhesion &
Adhesives 55 (2014) 43-55 pouvant être mise à profit dans le cadre la présente invention.
On cite également l'article Y.Guo et al Potent antigen-specific immune response induced by infusion of spleen cells coupled with succinimidy1-4-(N-maleimidomethyl cyclohexane)-1-carboxylate (SMCC) conjugated antigens International Immunopharmacology 31(2016) 158-168 qui divulgue un exemple illustrant la liaison d'une cellule via un SH
et une protéine via un NH2.
L'utilisation de molécules appartenant à la famille des silanes repose sur l'autoassemblage spontané de ces molécules sur des surfaces par adsorption s'organisant ainsi en monocouches moléculaires ordonnées. Cet assemblage de molécules crée une organisation moléculaire stable et résistante. Dans le cadre de la présente invention, la ou les molécules choisie(s) doit (doivent) contenir un head group ( groupe de tête ), possédant une forte affinité avec l'extrémité hydroxyle du substrat permettant ainsi l'ancrage de la molécule à sa surface, et un end group ( groupe terminal ) qui interagit avec l'extrémité
5' NH2 de l'aptamère.
Il existe différentes familles de molécules dont les propriétés correspondent à
celles précédemment citées telles que les organosilanes, les thiols, les phosphonates. A titre
10 PCT/EP2017/067636 d'exemple d'organosilane on cite le 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate (TPM) (PubChem ID : 17318).
Le head group du TPM RO-Si réagit, alors, avec l'extrémité hydroxyle (OH) du substrat. Cette réaction dite d'hétéro-condensation aboutit à la formation d'une liaison covalente de type O-Si-R' où R' représente le end group qui, in fine, interagit avec l'extrémité 5' NH2 de l'aptamère.
Un autre type d'agents sont de types linkers hétéro-bifonctionnels. Ce sont des réactifs de conjugaison de protéines les plus remarquables et les plus utiles car ils ont deux groupes réactifs distincts. Ils ont la particularité de posséder des groupes réactifs différents aux extrémités.
Par exemple, le N-Succinimidyl 3[2-pyridyldithio]-propionate (SPDP) ou le Succinimidy1-4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane- 1 -carboxylate (SMCC) (PubChem ID:
125175). Le SMCC réagit par l'intermédiaire de son groupe maléimide qui est un groupe sulfhydryle (thiol; -SH) réactif et par son extrémité NHS qui est réactif à
l'amine (NH2) formant ainsi des liaisons covalentes stables.
D'autres molécules appartenant à cette famille de linkers peuvent être utilisées à condition de posséder les mêmes groupements aux extrémités, selon des techniques bien connues de l'homme de l'art.
Ce type de greffage peut être réalisé en utilisant des techniques connues de l'homme du métier, telles que décrites dans les exemples détaillés ci-après.
Ainsi le dispositif de l'invention peut en particulier mettre en oeuvre les couples aptamère/agent biologique selon des banques de données bien connues de l'homme de l'art.
A titre illustratif et non limitatif, on peut citer les couples particuliers suivants, récapitulés dans le tableau ci-après :
Souche de bactérie Aptamère Escherichia cou i 5'CGC GTC CCC CGC CGG GCG CGC GCC AGG ATC GAC 3' ATCC 8739 (SEQ ID NO: 1)
11 PCT/EP2017/067636 5'CTT CTG CCC GCC TCC TTC CTA GCC GGA TCG CGC TGG CCA
Escherichia colt GAT GAT ATA AAG GGG TCA GCC CCC CAG GAG ACG AGA TAG

GCG GAC ACT 3' (SEQ ID NO :2) Staphylococcus 5'TCC CTA CGG CGC TAA CGC CAC CGT GCT ACA ACT CGG ATT
aureus 3' (SEQ ID NO : 3) Escherichia colt 5' GTC TGC GAG CGG GGC GCG GGC CCG GCG GGG GAT GCG 3' 0157H7 (SEQ ID NO 4) Molécule colorante Dans le dispositif de l'invention, la molécule colorante signale la détection de l'agent biologique ciblé, par exemple par la libération de ladite molécule colorante, comme exposé précédemment en lien avec l'un des modes de réalisation particuliers de l'invention.
Dans la cadre de la présente invention, on entend par molécule colorante toute molécule capable soit de produire une couleur, soit de provoquer un changement de couleur suite à un stimulus dans son environnement. Ledit stimulus est avantageusement représenté dans le cadre de la présente invention par l'immobilisation de l'agent biologique par l'aptamère. Toutefois, la génération de couleur ou le changement de couleur peut être indirectement provoqué par cette immobilisation comme exposé ci-dessus.
Autrement dit, la présente invention comprend également les cas où des réactions en chaîne se produisent à
partir de cette immobilisation, dont au moins l'une d'entre elles provoque cette génération de couleur ou changement de couleur via la molécule colorante. La nature de la molécule colorante est détaillée ci-après.
Par génération de couleur , on entend dans le cadre de la présente invention l'apparition d'une couleur par rapport à la couleur présente dans la même zone, avant mise en contact de l'agent biologique avec le biocapteur selon l'invention, déterminée par rapport à un système colorimétrique donné.
Par changement de couleur , on entend dans la cadre de la présente invention un changement de couleur par rapport à la couleur présente dans la même zone, avant mise en contact de l'agent biologique avec le biocapteur selon l'invention, déterminée par rapport à un système colorimétrique donné. Ce changement de couleur inclut également un changement de contraste. Dès lors, la molécule colorante devra être choisie de sorte que ledit changement après l'immobilisation de l'agent biologique sur les aptamères provoque un
12 PCT/EP2017/067636 déplacement colorimétrique ou shift colorimétrique minimum pour qu'il soit détectable par un moyen de lecture approprié.
La terminologie changement de couleur comprend la production de luminescence, comme il sera exposé ci-après.
Au titre de système colorimétrique pouvant être utilisé dans le cadre de la présente invention, on peut notamment citer le modèle RGB. Le modèle RVB
repose sur trois couleurs primaires qui par leurs mélanges vont restituer toutes les autres (256 niveaux sur chaque canal). On peut également citer le modèle TSL (acronyme de Teinte, Saturation, Luminosité) ou encore TSV (teinte, saturation, valeur) qui et un dérivé de RVB. Ces deux derniers permettent une meilleure appréhension ou contrôle de la luminosité.
Tout type d'appareil conçu pour détecter ces générations de couleur et/ou changement de couleur peut être utilisé, selon des techniques bien connues de l'homme du métier.
Il est par ailleurs à noter que dans le cadre de la présente invention, on entend par système colorimétrique, pas seulement les espaces trichromatiques car l'invention concerne aussi la détection par changement de teinte monochromatique ou bichromatique, y compris dans les nuances du blanc au noir. Ce mode de réalisation peut en particulier correspondre à une application dans laquelle le code à barres est un code à
barres 1D ou 2D.
La description suivante illustre l' activation par flash telle qu'utilisée dans le cadre de la présente invention selon le mode de réalisation où la molécule colorante est luminescente, et plus particulièrement fluorescente. Cette étape intervient au moment de la lecture du résultat.
Selon ce mode de réalisation, un second espaceur est lié en 3'de l'aptamère et est également lié à un colorant luminescent, plus particulièrement photo-activable. Ce colorant permet, après son excitation selon une longueur d'onde spécifique, de lire le résultat de détection. En effet, dans le cas d'une application santé pour la détection de maladies nosocomiales et si l'échantillon biologique à tester contient la ou les bactérie(s) cible(s), l'aptamère reconnaît l'agent biologique qu'il immobilise. La bactérie est mise en contact avec la molécule antibiotique liée à l'extrémité 3' de l'aptamère.
Suite à ce contact et si la bactérie est résistante à l'antibiotique utilisé
par exemple famille des céphalosporines ou pénicillines, celle-ci produit des enzymes par exemple 13-lactamases qui attaquent l'antibiotique par exemple le noyau 13-lactame. Cela
13 PCT/EP2017/067636 induit la coupure de la liaison labile entre l'extrémité de l'antibiotique et celle du colorant provoquant ainsi la libération du colorant. Ce colorant est excité à une longueur d'onde spécifique par un flash de téléphone portable permettant ainsi l'apparition de la luminescence du colorant initialement incolore. Dans ce mode de réalisation, on préfère l'utilisation d'un antibiotique non chromogène.
Selon un mode de réalisation particulier, la molécule colorante est une molécule chimique et n'est pas un anticorps.
A titre de molécule colorante non luminescente on peut notamment citer les antibiotiques chromogènes de la famille des céphalosporines, par exemple la nitrocéfine, et des pénicillines.
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, la molécule colorante est non luminescente sous sa forme liée à l'aptamère et luminescente, de préférence fluorescente, sous sa forme non liée à l'aptamère.
A titre de molécule colorante luminescente, et en particulier fluorescente, on peut notamment citer le 5-FAM, le 6-FAM, les colorants de type ATTO, notamment l'ATTO 532 ou l'ATTO 550, l'ATTO 647, le DY-510XL, le DY-530, le HEX, le CAL Fluor Orange 560, et en particulier l'ATTO, tel que mis en oeuvre dans les exemples.
Toujours selon ce mode de réalisation particulier pour lequel la molécule colorante est luminescente et encore plus particulièrement fluorescente, la molécule colorante n'est pas luminescente lorsqu'elle est encore liée à l'aptamère, ce qui signifie que la zone du dispositif qui est fonctionnalisée avec l'aptamère ne génère aucun phénomène colorimétrique si elle n'est pas en présence de l'agent biologique ciblé.
En revanche, lorsqu'elle est activée suite à l'immobilisation de l'agent biologique, ou plus particulièrement libérée suite à l'immobilisation de l'agent biologique, elle devient luminescente et génère un phénomène colorimétrique que l'on peut visualiser par un moyen de lecture approprié.
Ce fonctionnement assure la détection directe et instantanée de l'agent biologique ciblé.
De préférence, une telle molécule colorante luminescente possède une bande d'absorption luminescente comprise de 600 nm à 700 nm, de préférence de 640 nm à 670
14 PCT/EP2017/067636 nm, et une bande d'émission luminescente comprise de 600 nm à 700 nm, de préférence de 665 nm à 675 nm ou un shift colorimétrique minimal pour une détection.
A titre de moyen de lecture on peut en particulier citer une caméra ou un appareil photo ou encore un capteur photosensible de type CCD ou CMOS. Ce dernier type de capteur combine les trois couleurs primaire RGB pour créer par synthèse additive une image couleur.
La molécule colorante telle que décrite précédemment peut être liée à
l'aptamère par différents types d' espaceurs comme exposé précédemment ou encore lié
directement à
.. l'aptamère lorsque la molécule colorante comprend l'antibiotique.
Ainsi, la molécule colorante peut être reliée à l'aptamère par l'intermédiaire d'un second espaceur.
Par ailleurs, comme cela a également été indiqué précédemment, ce second espaceur peut comprendre au moins une liaison labile de sorte à pouvoir libérer la molécule colorante qui peut ainsi occasionner une génération de couleur ou un changement de couleur une fois libre.
La libération de la molécule colorante peut être déclenchée selon divers mécanismes.
Selon le mode de réalisation dans lequel l'agent biologique est une bactérie produisant une enzyme de type f3-lactamase et que la molécule colorante comprend un noyau sensible à la production de cette enzyme, comme décrit précédemment, la liaison labile se situe entre la molécule colorante et l'antibiotique.
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, lorsque l'agent biologique est une bactérie, le second espaceur, est relié à la molécule colorante par une liaison labile. Il est avantageusement formé au moins en partie par une molécule antibiotique provoquant la formation d'une enzyme précisément susceptible d'attaquer ladite molécule antibiotique, et notamment le noyau 13-lactame. C'est ce mode de réalisation particulier qui est illustré dans les exemples, par mise en oeuvre d'un second espaceur comprenant de la céphalosporine. Ainsi, un complexe aptamère4céphalosporineHATTO] est formé, pouvant être greffé sur un support pour donner le biocapeur recherché, permettant la détection de bactéries spécifiques.
15 PCT/EP2017/067636 A titre d'illustration d'un tel complexe aptamère4céphalosporineHATTO], on représente ci-après dans le schéma 1 un enchaînement aptamère-céphalosporine-ATT0647.
noyau beta-lactame liaison labile _.._.(N st....../0I(NH ¨/03C -N-0 H
H i N--03C--N-O--Ç_)--N---N
õ---....õ..õ..õ..N H
\
¨N=-N
0 .

ilb I
Aptamère Céphalosporine ATTO 647 Schéma 1 Au sens de la présente invention, la liaison labile est avantageusement comprise entre la molécule colorante et le second espaceur. Elle se définit dans le cadre de la présente invention comme étant une liaison susceptible d'être rompue suite à l'attaque du bras espaceur par l'enzyme secrétée par l'agent biologique et notamment la bactérie, et plus particulièrement du noyau 13-lactame compris dans la molécule antibiotique comprise dans le second bras espaceur.
Comme décrit précédemment, dans le cadre de ce mode de réalisation particulier, lors de l'immobilisation de ladite bactérie sur les aptamères, l'agent biologique, et par exemple la bactérie ciblée, est mis en contact avec le second espaceur assurant la liaison avec la molécule colorante, par exemple lié en 3' ou en 5'à l'aptamère.
Suite à ce contact, si la bactérie est résistante à la molécule antibiotique utilisée, celle-ci produit des enzymes susceptibles d'attaquer au moins une liaison entre l'aptamère et la molécule colorante. Lorsque comme dans l'exemples, il s'agit d'une bactérie produisant des 13-lactamases par réaction à une action antibiotique, celle-ci vient attaquer le motif 13-.. lactame présent dans la céphalosporine comprise dans le second espaceur.
Selon la nature de l'antibiotique, le changement détectable pourra se manifester par une génération de couleur ou un changement de couleur. Cette manifestation peut être due à la rupture de la liaison labile. La molécule colorante, ainsi libéré, permet la lecture du résultat.
16 PCT/EP2017/067636 Quelle que soit la nature du colorant ou de l'antibiotique, la réaction en chaîne se solde par des changements de couleur, qui peuvent se retranscrire par exemple sur un code-barres dynamique.
Ainsi, dans le cas de la détection de bactéries responsables d'infections nosocomiales, un mode de libération préféré de l'invention se base sur la résistance aux antibiotiques des bactéries, en particulier sur la résistance aux antibiotiques de type 13-lactame.
Les bactéries résistantes aux antibiotiques de type 13-lactame ont la capacité
de libérer des 13-lactamase lorsqu'elles sont en présence desdits antibiotiques, ce qui altère la .. structure de ces antibiotiques et les rend inopérants.
De préférence, le second espaceur est un radical divalent comprenant un motif 13-lactame, par exemple un motif céphalosporine.
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, l'immobilisation de l'agent biologique, et notamment d'une bactérie, sur les aptamères entraîne suite à une réaction en chaîne, la rupture d'une liaison labile qui relie l'aptamère à une molécule colorante. C'est la libération de cette molécule colorante, qui n'était pas luminescente sous sa forme liée à l'aptamère mais devient luminescente, de préférence fluorescente, lorsqu'elle est libérée, qui provoque le phénomène colorimétrique, qui apparaît uniquement dans une zone correspondant à la zone fonctionnalisée par l'aptamère.
L'apparition de cette luminescence modifie donc l'information codée par le code à barres et la lecture du code à barres ainsi modifié à l'aide d'un moyen de lecture approprié
permet alors de lire l'information modifiée par rapport à l'information codée par le code à
barres initial, traduisant la détection de l'agent biologique.
Détection/Application Tout type de détection peut être envisagé.
Comme type d'application, on peut citer l'identification des bactéries, la localisation des foyers infectieux, l'antibiogramme correspondant à chaque type de bactéries ou encore l'estimation de la quantité présente (supérieure ou inférieure à la dose infectieuse).
Selon un mode de réalisation, il est en outre possible de mesurer à l'aide d'un moyen de lecture approprié l'intensité de la génération de couleur ou du changement de couleur, par exemple de la luminescence, générée par la molécule colorante, et par
17 PCT/EP2017/067636 comparaison avec une valeur de référence prédéterminée, on peut déterminer si la concentration d'agent biologique dans l'échantillon contrôlé est supérieure à
une quantité
correspondant à une dose infectieuse spécifique.
Un autre avantage de la présente invention est que la même méthode de lecture peut être conservée entre la pré-immobilisation et la post-immobilisation de l'agent biologique sur le biocapteur.
Le dispositif ou biocapteur de la présente invention permet donc de détecter la présence et/ou mesurer la concentration d'au moins un agent biologique en temps réel, c'est-à-dire sans incubation préalable de l'échantillon à contrôler et sans traitement préalable, comme par exemple une lyse dans le cas de bactéries.
Avec un dispositif de détection rapide, les agents biologiques tels que les bactéries peuvent être identifiés avant qu'ils n'incubent et/ou prolifèrent et peuvent être traités avec les traitements appropriés.
En outre, le dispositif ou biocapteur de la présente invention présente l'avantage de ne pas nécessiter de stockage spécifique en matière de température. En d'autres termes, le dispositif de la présente invention est stable thermiquement à une température comprise entre -20 C à 80 C de préférence entre 0 C et 40 C.
Support Le dispositif de l'invention présente l'avantage de pouvoir être mis en oeuvre sur une grande variété de supports, qu'ils soient rigides ou souples.
Le support peut être un support souple ou rigide, sur lequel est disposé le code à
barres.
Selon un mode de réalisation, le support est un support souple, de préférence un support de type papier ou plastique revêtu d'alumine, du papier ou du plastique.
A titre de matériau plastique on peut notamment citer le polypropylène ou le polyéthylène microporeux tel que vendu sous le nom Teslin par la société PPG
industries.
De tels supports en Teslin peuvent notamment présenter une épaisseur comprise entre 150itm et 450 ,m.
Le polypropylène peut être dur ou semi-rigide.
Selon un autre mode de réalisation, le support est un support rigide, par exemple en verre.
18 PCT/EP2017/067636 De préférence, le support est revêtu d'une couche d'alumine sur laquelle est disposé le code à barres.
Le dépôt d'une couche d'alumine peut être réalisé par toute technique connue de l'homme du métier, telle que celle décrite dans les exemples ci-après.
L'épaisseur de la couche d'alumine varie typiquement de 500 nm à 10 ium et est par exemple de 1 ium.
L'utilisation de la couche d'alumine présente plusieurs avantages :
- Tout d'abord une augmentation de la surface d'échange, grâce à
l'adaptation de la taille des pores selon le type d'application, - mais aussi une meilleure adhérence de la fonctionnalisation chimique pour la fixation des ligands (Aptamères). Cela est dû à la présence de liaisons hydroxydes libres (-OH) au niveau de cette surface, qui va faciliter l'immobilisation des aptamères. Ainsi, le taux de liaison hydroxydes disponible peut atteindre environ 80% pour le biocapteur.
L'utilisation de la couche d'alumine présente encore les avantages suivants :
- La couche d'alumine a une stabilité thermique, de sorte qu'elle ne nécessite aucun stockage spécifique après sa fabrication, - elle est biocompatible, c'est-à-dire qu'elle ne dégrade pas le matériel biologique avec lequel on l'utilise, et enfin, - le coût de fabrication de la couche d'alumine est relativement faible.
Code à barres Le dispositif de l'invention présente l'avantage de pouvoir être mis en oeuvre avec une grande variété de code à barres, qu'ils soient à 1 ou 2 dimensions.
En outre, une ou plusieurs zones du code à barres peuvent être fonctionnalisées avec un seul ou plusieurs aptamères différents, afin de pouvoir détecter un seul ou plusieurs agents biologiques différents.
Les figures 3 et 4 illustrent l'utilisation telle que décrite dans l'exemple 4 de code à barres 1D et 2D, dans le cas d'une molécule colorante de type antibiotique chromogène, la nitrocéfine, qui passe du jaune en absence de 13-lactamase au rouge en présence de 13-lactamase. Comme illustré dans cet exemple c'est la présence de contrastes entre les bandes ou les pixels qui permet de porter le message porté par le code barre et conclue à la présence ou l'absence de la bactérie cible.
19 PCT/EP2017/067636 Selon un mode de réalisation, le code à barres est un code à barres à 1 dimension, composé d'un assemblage de bandes noires et de bandes blanches parallèles, dans lesquelles au moins une zone d'au moins une bande blanche ou d'une bande noire est fonctionnalisée par au moins un aptamère.
De préférence, la totalité d'au moins une bande blanche est fonctionnalisée par au moins un aptamère.
Selon des variantes de ce mode de réalisation, deux, trois, quatre, voire cinq bandes blanches ou plus peuvent être fonctionnalisées avec des aptamères différents, de manière à détecter deux, trois, quatre, voire cinq agents biologiques différents ou plus.
Selon un autre mode de réalisation, le code à barres est un code à barres à 2 dimensions, composé d'un assemblage de pixels noirs et de pixels blancs, dans lesquels au moins un pixel blanc ou au moins un pixel noir est fonctionnalisé par au moins un aptamère.
Ce type de code à barres présente l'avantage de contenir davantage d'informations, tel que l'identification des bactéries, la localisation des foyers infectieux, l'antibiogramme correspondant à chaque type de bactéries et l'estimation de la quantité
présente (supérieure ou inférieure à la dose infectieuse).
Selon des variantes de ce mode de réalisation, deux, trois, quatre, voire cinq pixels blancs ou plus peuvent être fonctionnalisés avec des aptamères différents, de manière à détecter deux, trois, quatre, voire cinq agents biologiques différents, ou plus.
Procédé de fabrication du biocapteur Le dispositif de la présente invention peut être fabriqué par des techniques engendrant de faibles coûts de production.
Le dispositif de la présente invention peut être aisément miniaturisé et il peut être réalisé de manière à être à usage unique et donc détruit après utilisation.
Un procédé de fonctionnalisation de support adapté à la fabrication d'un biocapteur selon l'invention est décrit dans les exemples détaillés ci-après.
Ce procédé comprend les étapes suivantes : préparation du support, par exemple comprenant le revêtement par une couche d'alumine, suivie de l'éventuelle activation de la couche d'alumine pour permettre le greffage des aptamères, puis greffage du complexe aptamère-molécule colorante sur le support, tel que l'alumine activée ou bien greffage de
20 PCT/EP2017/067636 l'aptamère sur le support tel que l'alumine activée suivi du greffage de la molécule colorante sur l'aptamère ainsi greffé.
Ces étapes de modification de surface (revêtement, activation, fonctionnalisation, greffage, couplage, etc.) utilisent des techniques connues de l'homme du métier.
Ce procédé peut être mis en oeuvre pour fonctionnaliser une zone prédéterminée d'un code à barres, tel qu'illustré dans les exemples détaillés ci-après, afin de préparer un biocapteur selon l'invention.
Procédé pour analyser une contamination Selon un autre objet, la présente invention concerne un procédé pour analyser la contamination par au moins un agent biologique dans un environnement, comprenant au moins les étapes consistant à :
- disposer d'un biocapteur selon l'invention, - mettre en présence le biocapteur avec l'environnement à analyser, dans des conditions propices à l'immobilisation du ou des agents biologiques éventuellement présents dans ledit environnement par les aptamères du biocapteur, - lire le biocapteur ainsi revêtu, par exemple dans des conditions d'illumination propices à la luminescence de la molécule colorante sous sa forme non liée à
l'aptamère, de manière à acquérir l'information codée par le code à barres du biocapteur ainsi revêtu, et - générer à partir de l'information acquise une information concernant la présence éventuelle d'au moins un agent biologique dans l'environnement.
Par environnement à analyser , on entend le milieu dans lequel on souhaite détecter la présence de l'agent biologique ciblé.
Dans le cas de la détection d'une contamination bactérienne chez un patient, le dispositif de l'invention est typiquement mis en oeuvre à partir de fluides corporels tels que prioritairement la sueur, l'urine, la salive ou encore le sang. Le dispositif de l'invention n'est donc pas nécessairement invasif puisqu'il peut être mis en oeuvre sur un échantillon autre que du sang.
21 PCT/EP2017/067636 L'environnement à analyser peut donc être un échantillon de fluides corporels d'un patient tels que le sang, la sueur, l'urine, ou la salive.
Dans le cas de la détection d'une contamination bactérienne dans un produit agroalimentaire, il peut s'agir de l'atmosphère gazeuse contenue dans un emballage alimentaire ou bien d'un échantillon prélevé sur ou dans le produit alimentaire, tel que le vin ou la bière.
Lors de la mise en présence du biocapteur avec l'environnement à analyser, on s'assure que les conditions sont propices à l'immobilisation du ou des agents biologiques éventuellement présents dans ledit environnement par les aptamères du biocapteur.
L'utilisation du biocapteur peut être réalisée à température ambiante. Les réponses sont typiquement obtenues en moins de 15 à 20 minutes.
Lors de la mise en présence du biocapteur et de l'environnement à analyser, si celui-ci contient des agents biologiques ciblés par ledit biocapteur, ceux-ci sont immobilisés sur les aptamères spécifiques à ces agents biologiques, ce qui provoque une génération de couleur ou un changement de couleur, par exemple du fait de réactions en chaînes qui se soldent par la libération de molécules colorantes, dans les zones correspondant aux zones de fonctionnalisation par les aptamères.
L'étape suivante consiste donc à acquérir l'information codée par le code à
barres soit directement en lisant le code à barre après réaction dans le cas d'une réaction colorimétrique soit en excitant la molécule colorante à une longueur d'onde adaptée pour une molécule luminescente.
Ainsi, dans le cas particulier d'une molécule colorante luminescente l'étape suivante consiste donc à lire le biocapteur ainsi revêtu, dans des conditions d'illumination propices à la luminescence de la molécule colorante sous sa forme non liée à
l'aptamère, de manière à acquérir l'information codée par le code à barres du biocapteur ainsi revêtu.
L'homme du métier sera capable d'adapter les conditions d'illumination pour activer la luminescence de la molécule colorante.
Selon un mode de réalisation préféré, la luminescence de la molécule colorante n'est décelable que sous une illumination plus importante que la lumière du jour ou l'éclairage artificiel d'intérieur.
22 PCT/EP2017/067636 Selon ce mode, la luminescence de la molécule colorante est typiquement activée au moyen d'un flash, typiquement un flash d'appareil photo ou de téléphone portable.
L'homme du métier sera capable d'adapter la molécule colorante en fonction de la longueur d'onde du flash pour tirer profit de sa luminescence.
Outre les conditions de luminescence, il est également nécessaire de recueillir l'image du code à barres, typiquement au moyen d'une caméra ou d'un appareil photo, typiquement de l'appareil photo d'un téléphone portable (smartphone).
Le dispositif de la présente invention est donc facilement mis en oeuvre, c'est-à-dire qu'il ne requiert aucune technique d'analyse particulière : un simple contrôle à l'aide d'un flash et d'une caméra ou d'un appareil photo est suffisant pour analyser la réponse du biocapteur.
Le mode de lecture du biocapteur de l'invention, utilisant la luminescence et de préférence la fluorescence, présente l'avantage d'être discret et confidentiel puisque seul l'utilisateur muni d'une source lumineuse et d'un moyen de lecture adaptés, typiquement un smartphone équipé d'un flash et de l'application dédiée, est apte à décrypter l'information codée dans le code à barres du biocapteur.
Dans le domaine médical, par exemple dans le cas de la détection d'une contamination bactérienne chez un patient, ce mode de lecture permet au personnel médical de ne pas alarmer le patient en cas d'infection.
Comme déjà décrit plus haut, l'analyse de l'image du code à barres permet d'accéder à diverses informations, telles que la présence ou non d'un agent biologique ciblé
et l'atteinte ou non d'une dose infectieuse en fonction de l'intensité de la luminescence mesurée, ainsi que toute autre information intégrée dans le code à barres telles que la localisation de l'infection détectée, l'identification des agents pathogènes, l'estimation de la quantité des agents pathogènes pour déterminer si la dose infectieuse est dépassée ou non ou la programmation d'un antibiogramme en fonction du type de bactéries identifiées.
Ainsi, plusieurs modes de lecture du code à barres peuvent être envisagés, selon les modes de réalisation de l'invention :
- étape de lecture où le code à barres modifié code lui-même pour une information renseignant sur la présence d'un agent biologique ciblé,
23 PCT/EP2017/067636 - étape de lecture suivie d'une comparaison avec le code à barres initial pour identifier les zones du code à barres qui apparaissent modifiées, permettant de conclure sur la présence ou non d'agents biologiques ciblés, ou - étape de lecture suivie d'une étape de mesure du contraste des zones du code à barres qui apparaissent modifiées et comparaison avec des valeurs d'étalonnage, permettant de conclure sur la concentration en agents biologiques ciblés.
Selon un autre objet, la présente invention concerne l'utilisation d'un biocapteur selon l'invention pour analyser la contamination par au moins un agent biologique dans un environnement.
Le biocapteur de l'invention est adapté pour détecter la contamination par au moins un agent biologique chez un patient dans un milieu hospitalier, dans une denrée alimentaire, dans le domaine agricole ou horticole, ou dans le domaine du traitement de l'eau.
Le biocapteur de l'invention est particulièrement adapté à la détection de la contamination bactérienne chez un patient, par analyse de ses fluides corporels tels que son sang, sa sueur, son urine, ou sa salive.
Le biocapteur de l'invention est en outre particulièrement adapté à la détermination du dépassement d'une dose infectieuse.
Selon un autre objet, la présente invention concerne un dispositif pour analyser la contamination par au moins un agent biologique dans un environnement, comprenant au moins un biocapteur selon l'invention.
La présente invention est en outre illustrée, sans y être limitée, par les exemples ci-après.
24 PCT/EP2017/067636 EXEMPLES
Exemple 1 ¨ Protocole général de fixation des aptamères et du colorant Matériel - Agitateur et plaque (Vortex) - Balance de précision - Plaque chauffante - Machine de traitement de surface Corona Réactifs' - acide 3-mercaptopropionique (MPA), Sigma Aldrich - N-hydroxysuccinimide (NHS), Sigma Aldrich - 1-éthy1-3-(3-diméthylaminopropyl) carbodiimide (EDC), Sigma Aldrich - eau déionisée et eau distillée, IES
- [céphalosporine]-[ATTO], Sigma Aldrich (référence : C0682000 ¨ 97875) Etape 1 - Préparation du support = Evaporation thermique d'aluminium sous vide Un creuset rempli d'aluminium métallique a été chauffé jusqu'à évaporation de l'aluminium. En regard du creuset, un substrat de papier a été placé de manière à condenser les vapeurs d'aluminium sur ledit substrat.
Une couche d'aluminium d'épaisseur d'environ 1 ium a été obtenue.
= Anodisation Dans une cuve remplie d'acide phosphorique 15%, à une température de 0 C - 5 C, le substrat revêtu d'une couche d'aluminium obtenu à l'étape précédente a été
placé à l'anode d'un générateur de courant continu, la cathode du système étant en platine (inerte au milieu).
Une tension comprise entre 80V ¨ 120V a été appliquée et le substrat a été
immergé
pendant une durée comprise de 600 s à 900 s pour former une couche d'alumine en surface du dépôt d'aluminium. Pour 600 s : épaisseur = 425 nm ¨450 nm et taille des pores = 81 nm ¨ 96 nm. Pour 900 s : épaisseur = 800 nm ¨ 950 nm et taille des pores = 81 nm ¨ 96nm.
25 PCT/EP2017/067636 = Nettoyage du support Le support a ensuite été nettoyé en le plongeant dans de l'eau déionisée à 70 C
pendant 1 minute, puis dans de l'eau déionisée à 20 C pendant 1 minute.
= Traitement de surface (effet Corona) La surface d'alumine du support nettoyé a ensuite été traitée par effet Corona pendant 30 secondes. Ce traitement permet d'améliorer la mouillabilité et la tension de surface (adhérence) de la surface d'alumine et permet en outre de la protéger contre la corrosion.
Etape 2 : Activation de la surface du support Il est nécessaire d'activer la surface externe de la couche d'alumine du support pour préparer le greffage des aptamères.
Une méthode classique d'auto-assemblage moléculaire (self-assembly monolayer), notamment décrite dans Wu et al. (PLOS ONE 2012, 7(11), 1-9) ou dans Braiek et al. (Biosensors 2012, 2, 417-426) a été utilisée pour revêtir la surface externe de la couche d'alumine du support de groupements labiles ¨0-succinimide.
Pour cela, du MPA (30 iil d'une solution à 100mM) a d'abord été déposé sur la surface d'alumine, puis le support ainsi revêtu a été laissé en agitation (agitateur plaque vortex) pendant 1 heure à température ambiante.
La couche d'alumine, initialement greffée de groupements -OH, se retrouve ainsi greffée de groupements ¨S-CH2CH2-C(0)-OH.
Après lavage à l'eau distillée de la surface ainsi fonctionnalisée, 30 iil d'un mélange de EDC/NHS (solution à 100mM en EDC et à 50mM en NHS, préalablement préparée et agitée pendant 1 heure) a été déposé sur la surface, puis le support ainsi revêtu a été laissé en agitation (agitateur plaque vortex) pendant 1 heure à
température ambiante.
La couche d'alumine se retrouve ainsi greffée de groupements -S-CH2CH2-C(0)-0-succinimide, la chaîne -S-CH2CH2-C(0)-correspondant à un premier espaceur.
26 PCT/EP2017/067636 Etape 3 Première variante : Fixation successive des aptamères et du colorant Selon une première variante, dite linéaire , on fixe dans un premier temps les aptamères sur le support, puis le colorant est greffé aux aptamères.
Des solutions aqueuses d'aptamères (concentration de 1 nmol/m1 en aptamère) ont été préparées.
En fonction du type de bactérie que l'on souhaite détecter, on utilise un aptamère associé.
Le tableau ci-après indique un aptamère (monobrin d'ADN) associé :
Souche de bactérie Aptamère Escherichia colt 5'CGC GTC CCC CGC CGG GCG CGC GCC AGG ATC GAC 3' ATCC 8739 (SEQ ID NO: 1) 5'CTT CTG CCC GCC TCC TTC CTA GCC GGA TCG CGC TGG CCA
Escherichia colt GAT GAT ATA AAG GGG TCA GCC CCC CAG GAG ACG AGA TAG

GCG GAC ACT 3' (SEQ ID NO :2) Staphylococcus 5'TCC CTA CGG CGC TAA CGC CAC CGT GCT ACA ACT CGG ATT
aureus 3' (SEQ ID NO : 3) Escherichia colt 5' GTC TGC GAG CGG GGC GCG GGC CCG GCG GGG GAT GCG 3' 0157H7 (SEQ ID NO 4) Les extrémités 3' des aptamères mis en oeuvre sont de préférence préalablement modifiées en groupements ¨COOH, par une technique connue de l'homme du métier.
Alternativement les extrémités 5' des aptamères mis en oeuvre peuvent être modifiés en groupement NH2par une technique bien connue de l'homme du métier.
Pour fonctionnaliser une zone spécifique de la surface du support, on peut utiliser un masque adapté aux dimensions du support et présentant au moins une ouverture qui coïncide à la zone du support que l'on souhaite fonctionnaliser lorsque le masque est superposé sur le support. Ce masque peut présenter plusieurs ouvertures qui correspondent aux différentes zones à fonctionnaliser, par un même aptamère ou de préférence par des aptamères différents de manière à pouvoir immobiliser différents agents infectieux.
27 PCT/EP2017/067636 Ainsi, lorsque l'on souhaite fonctionnaliser une ou plusieurs zones avec un ou plusieurs aptamères, on superpose un masque adapté aux dimensions du support et présentant autant d'ouvertures que de zones à fonctionnaliser, puis on dépose par tout moyen connu de l'homme du métier la ou les solutions d'aptamères dans la ou les ouvertures correspondantes, et ce lors d'une même étape.
Alternativement à l'utilisation d'un masque, d'autres techniques connues de l'homme du métier peuvent également être utilisées, comme l'impression jet d'encre. On fournit pour cela des solutions d'aptamères comme encres de l'imprimante à jet d'encre et on imprime successivement les zones du support à fonctionnaliser.
Quelle que soit la technique employée, après le dépôt d'un ou plusieurs aptamères, le support ainsi revêtu est ensuite laissé en agitation (agitateur plaque vortex) pendant 30 minutes à température ambiante, puis l'agitation est arrêtée et le support est placé
sous une hotte aspirante pendant 30 minutes.
Une molécule d' aptamère (monobrin d'ADN) se fixe ainsi par un groupement ¨
NH2 porté par une de ses bases (adénine, guanine ou cytosine) à un groupement -S-CH2CH2-C(0)-0-succinimide. Il y a formation d'une liaison amide -C(0)-NH- et départ d'une molécule de N-hydroxysuccinimide.
Le dépôt des solutions d' aptamères peut être répété encore 1 à 2 fois de manière à optimiser le taux de greffage, puis le support est laissé toute une nuit à
température ambiante et est enfin rincé à l'eau distillée.
Après la fixation des aptamères sur le support, le colorant est ensuite greffé
aux aptamères.
Le colorant est de préférence fourni sous la forme d'un précurseur, contenant un premier motif correspondant au colorant et un second motif correspondant à un deuxième espaceur, ces deux motifs étant liés de manière covalente.
A titre de précurseur de colorant, on utilise de préférence le composé
[céphalosporine]-[ATTO] (Sigma Aldrich), dans lequel le motif [céphalosporine]
désigne le deuxième espaceur et comporte un groupement ¨NH2 libre, et le motif [ATTO]
désigne le colorant.
La fixation du composé [céphalosporine]-[ATTO] est réalisée en déposant d'abord, sur une zone spécifique du support préalablement fonctionnalisée en aptamères, de l'agent de couplage EDC (10 L) qui permet d'activer le groupement ¨COOH libre de
28 PCT/EP2017/067636 l'extrémité 3' des aptamères. Le support est mis en agitation faible sur plaque vortex pendant environ 30 minutes et 20 iLt1 de complexe [céphalosporine]-[ATTO] sont déposés sur ladite zone.
Le colorant est ainsi fixé sur l'aptamère par création d'une liaison peptidique entre le groupement ¨NH2 libre du motif [céphalosporine] et le groupement -COOH libre de l'extrémité 3' des aptamères.
Deuxième variante : Fixation en une étape de l'aptamère et du colorant Selon une deuxième variante, dite convergente , on greffe d'abord le colorant sur l'aptamère, puis ce complexe est ensuite fixé sur le support.
Cette variante peut être adaptée de la première variante, en réalisant d'abord, hors du support, le couplage de l'aptamère et du colorant.
A titre d'aptamère, on utilise de préférence les aptamères décrits ci-dessus, dont les extrémités 3' sont préférentiellement préalablement modifiées en groupements -COOH, par une technique connue de l'homme du métier.
A titre de colorant, on utilise de préférence le composé [céphalosporine]-[ATTO] décrit ci-dessus.
Le couplage entre un aptamère et le colorant [céphalosporine]-[ATTO] peut être réalisé par couplage peptidique selon une méthode connue de l'homme du métier.
Le complexe aptamère4céphalosporineHATTO] peut ensuite être greffée sur la surface du support, préalablement fonctionnalisée en groupements -S-CH2CH2-C(0)-0-succinimide par une méthode similaire à celle employée dans la première variante.
Exemple 2 ¨ Réalisation d'un biocapteur code-barres 2D
Un biocapteur code-barres 2D a été réalisé en utilisant le protocole de l'Exemple 1.
En premier lieu, les supports d'alumine sont réalisés.
Puis, les pixels du code-barres sont imprimés, en laissant vierges les zones destinées à être fonctionnalisées par les aptamères et le colorant.
Enfin, les aptamères ont été greffés sur les zones spécifiques prédéterminées.
Un biocapteur capable de détecter à la fois Escherichia cou i ATCC 8739 et Staphylococcus aureus a notamment été préparé en utilisant les aptamères décrits ci-dessus et le colorant [céphalosporine] - [ATTO].
29 PCT/EP2017/067636 Exemple 3 ¨ Mise en oeuvre d'un biocapteur code-barres 2D
Quatre biocapteurs code-barres 2D identiques, fabriqués à l'Exemple 2 et capables de détecter Escherichia cou i ATCC 8739 et Staphylococcus aureus, ont été testés en appliquant sur chacun des codes-barres 2D:
- un échantillon témoin comprenant uniquement du sérum physiologique, - un échantillon n 1 comprenant Escherichia cou i ATCC 8739 selon une concentration de 106 cfu dans du sérum physiologique, - un échantillon n 2 comprenant Staphylococcus aureus selon une concentration de 104 cfu dans du sérum physiologique, ou - un échantillon n 3 comprenant Escherichia cou i ATCC 8739 selon une concentration de 106 cfu et la Staphylococcus aureus selon une concentration de 104 cfu du sérum physiologique.
Après application des échantillons, à l'oeil nu, aucune différence de code n'était décelable.
Les codes-barres 2D des trois biocapteurs ont été pris en photo avec un smartphone équipé d'un flash (longueur d'ondes de 640 nm à 670 nm).
Sur la photo du code-barres de l'échantillon témoin, aucune différence n'a été
identifiée avec le code initial.
En revanche, sur la photo du code-barres de l'échantillon n 1, le code est apparu modifié par rapport au code initial, la zone fonctionnalisée par l'aptamère spécifique à
Escherichia cou i ATCC 8739 est apparue colorée.
De même, sur la photo du code-barres de l'échantillon n 2, le code est apparu modifié par rapport au code initial, la zone fonctionnalisée par l'aptamère spécifique à
Staphylococcus aureus est apparue colorée.
Quant à la photo du code-barres de l'échantillon n 3, le code est également apparu modifié par rapport au code initial, les zones fonctionnalisées par l'aptamère spécifique à Escherichia cou i ATCC 8739 et par l'aptamère spécifique à
Staphylococcus aureus ont toutes les deux apparues colorées.
30 PCT/EP2017/067636 La comparaison du code pris en photo par le smartphone avec un code de référence, de préférence enregistré dans le smartphone, a donc permis de déterminer la présence ou non d'une bactérie dans l'échantillon, ainsi que le type de bactérie.
La mesure du contraste de la couleur qui apparait sur la photo du code, comparée à des valeurs d'étalonnage préalablement enregistrées, a en outre permis de déterminer la concentration de bactéries dans chacun des échantillons n 1, n 2 et n 3.
Example 4 - Exemple de réalisation avec code à barre 1D et 2D par utilisation d'un antibiotique chromogène à titre de molécule colorante Dans cet exemple, c'est le biocapteur tel que réalisé dans l'exemple 5 ci-après, qui est utilisé.
4.1. Réalisation d'un code à barres 2D
La figure 3 illustre l'évolution visuelle d'un code à barres 2D par changement de teinte de couleur avant et après révélation d'une bactérie cible par un biocapteur selon l'invention.
On fait les observations suivantes :
- en (a), la matrice base du Code barre 2D. Elle est formée de petits carrés.
- en (b), Code barre 2D renferme une information par exemple dans le cas présent neg (pour négatif). Ceci est rendu possible car il y a un contraste entre les petits carrés jaunes (foncés) et les blancs (clairs).
Certains petits carrés (blancs ou jaunes) ont été fonctionnalisés par le processus décrit plus haut. Mise en contact avec un échantillon biologique liquide tel que la salive, l'usine, le sang, la transpiration ou toutes préparations utilisant de tels échantillons.
- en (c), le Code barre 2D est fonctionnalisé pour détecter une ou plusieurs bactéries cibles et est utilisé comme décrit précédemment. Dans le cas présent, ce code barre 2D détecte l'absence de bactéries cibles.
- en (d), un Code barre 2D fonctionnalisé pour détecter une ou plusieurs bactéries cibles est utilisé comme décrit précédemment. Dans le cas présent le Code barre 2D détecte la présence de bactéries cibles. A savoir les petits carrés fonctionnalisés changent de teintes (les foncés peuvent devenir clairs ou vice versa).
31 PCT/EP2017/067636 Dans le cas présent, les petits carrés jaunes ou blancs deviennent rouges. De ce fait, les petits carrés jaunes et blancs deviennent les Clairs et les petits carrés rouges deviennent les Foncés . Par conséquent, le message porté par le code barre 2D a évolué.
Le contraste ainsi produit permet de lire pos pour positif.
4.2. Réalisation d'un code à barres 1D
La figure 4 illustre l'évolution visuelle d'un code à barres 1D par changement de teinte de couleur avant et après révélation d'une bactérie cible par un biocapteur selon l'invention.
On fait les observations suivantes :
- en (a), à savoir avant mise en contact de la bactérie avec le biocapteur, la matrice base du Code barre 1D est formée de rectangles foncés ou clairs.
- en (b), le Code barre 1D renferme une information par exemple dans le cas présent neg (pour négatif). Ceci est rendu possible car il y a un contraste entre les rectangles jaunes (foncés) et les blancs (clairs).
Certains rectangles (blancs ou jaunes) ont été fonctionnalisés par le processus décrit précédemment.
- en (c) le biocapteur est fonctionnalisé pour détecter une ou plusieurs bactéries cibles est utilisé comme décrit précédemment. Dans le cas présent, ce code barre 1D détecte juste la présence d'une bactérie cible. Les rectangles restent jaunes. Ainsi, ce code barre 1D
détecte l'absence de bactéries cibles.
- en (d) le biocapteur fonctionnalisé et utilisé et réagit positivement. A
savoir les rectangles fonctionnalisés ont changé de teintes (les foncés peuvent devenir clairs et vice versa).
Dans le cas présent, les rectangles jaunes ou blancs deviennent rouges. De ce fait, les rectangles jaunes et blancs deviennent les Clairs et les rectangles rouges deviennent les Foncés . Par conséquent, le message porté par le code barre 1D a évolué.
Le contraste ainsi produit permet de lire pos pour positif.
Exemple 5 - Mise en oeuvre d'un biocapteur plastique souple Le biocapteur décrit dans cet exemple illustre la variante de l'invention dans laquelle une molécule colorante comprend un antibiotique chromogène, dans le présent
32 PCT/EP2017/067636 exemple de la classe des céphalosporines : la nitrocéfine, cette variante ne nécessitant pas la présence d'un second espaceur. Aucune rupture de liaison labile n'est produite suite à
l'attaque de la 13-lactamase sur le noyau lactame de l'antibiotique.
Matériel - Agitateur et plaque (Vortex) - Balance de précision - Plaque chauffante - Machine de traitement de surface Corona Réactifs' - le 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate (TPM)), Sigma Aldrich - Hydroxyde de soude (Na0H), Sigma Aldrich - eau déionisée et eau distillée, IES
- Nitrocéphine, Sigma Aldrich - Aptamère E coli 0157 :H7 modifié à son extrémité 5' par NH2 - Diméthyl sulfoxide (DMSO), Sigma Aldrich - Lactamator : Solution de Beta lactamases, CPC Biotech Etape 1 : préparation du support Dans un exemple, le support fonctionnalisé est un support plastique souple, le Teslin, un substrat hydrophobe et synthétique qui possède l'avantage d'être très résistant, tout en étant très fin.
Comme précédemment (exemple 1), un pré-traitement corona est réalisé pendant 5 minutes.
Des groupements OH sont ensuite ajoutés à la surface du substrat grâce à un bain de soude à basse concentration (<20%) avant d'être rincé à l'eau distillée.
Etape 2 : Greffage de l'aptamère à l'aide d'un linker Cette technique d'immobilisation repose, comme précédemment (exemple 1) sur le principe des Self-Assembled Monolayers, constituées ici d'un organosilane, le TPM.
Cette étape nécessite plusieurs heures d'incubation (lh à 6h) et a été testé
pour des concentrations comprises entre 10 et 50 mM. L'incubation est réalisée sous hotte
33 PCT/EP2017/067636 aspirante, sous agitation et à température ambiante. Afin d'éliminer les molécules n'ayant pas été greffées, un rinçage à l'eau distillée est effectué.
S'ensuit la fixation de l'aptamère sur le TPM. L'extrémité 5' de l'aptamère a été
.. modifiée avec un groupement amine (NH2) par une technique connue de l'homme du métier.
Les aptamères sont ensuite ajoutés à l'échantillon conformément au protocole suivi dans l'exemple 1.
L'échantillon est ensuite rincé à l'eau distillée afin d'éliminer les aptamères n'ayant pas lié le TPM de façon spécifique.
Etape 3 : Fixation du colorant L'aptamère testé (SEQ ID NO 4) se termine par une base guanine, possédant naturellement à son extrémité un groupement NH2 libre (car l'aptamère étant simple brin, le groupement NH2 n'est pas engagé avec une cytosine dans une liaison hydrogène, comme c'est le cas en configuration double brin).
Ce groupement NH2 est utilisé pour la fixation de la molécule colorante. Dans cet exemple, la molécule colorante désigne un antibiotique chromogène de la classe des céphalosporines : la nitrocéfine. L'utilisation d'un antibiotique chromogène est la variante testée ici, car elle permet de s'affranchir d'une étape supplémentaire et simplifie la détection .. de couleur (visible à l'oeil nu).
Différentes concentrations de nitrocéfine ont été testées à ce jour (5 à 30 mM).
Après une incubation (30 minutes à 3heures), l'échantillon est rincé avec du DMSO. A l'issue de cette étape, une coloration jaune apparaît sur le support.
Etape 4 : Test colorimétrique et spécificité
Un premier test est réalisé afin de s'assurer de la présence de nitrocéfine à
la surface du substrat fonctionnalisé : quelques dizaines de microlitres de solution 13-lactamase sont déposés. Une coloration rouge est alors observée à la surface du substrat, suggérant qu'il y a bel et bien eu liaison de la nitrocéfine à la construction moléculaire greffée sur le substrat.
Un second test est réalisé afin de vérifier qu'en l'absence de la construction moléculaire décrite ci-dessus la nitrocéfine est éliminée lors du rinçage au DMSO. Le test
34 PCT/EP2017/067636 est réalisé après deux étapes différentes (étape 1 et étape 2). Dans les deux cas, l'ajout de 13-lactamase ne provoque pas de réaction colorimétrique.

Claims (21)

REVENDICATIONS
1. Biocapteur pour détecter la présence et/ou mesurer la concentration d'au moins un agent biologique, comprenant un support sur lequel est disposé un code à barres dont au moins une zone est fonctionnalisée par au moins un aptamère apte à
immobiliser sélectivement ledit agent biologique, ledit aptamère étant lui-même lié, directement ou non, à une molécule colorante apte soit à produire de la couleur, soit à changer de couleur suite à
l'immobilisation de l'agent biologique par ledit aptamère.
2. Biocapteur selon la revendication précédente, dans lequel la molécule colorante est liée directement ou non via une liaison labile.
3. Biocapteur selon la revendication l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le support est un support souple ou rigide, sur lequel est disposé le code à barres.
4. Biocapteur selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le support est en verre, en papier ou en plastique, par exemple du polypropylène ou du polyéthylène microporeux.
5. Biocapteur selon la revendication précédente, dans lequel une couche d'alumine est disposée sur le support.
6. Biocapteur selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le code à barres est un code à barres à 1 dimension, composé d'un assemblage de bandes noires et de bandes blanches parallèles, dans lesquelles au moins une zone d'au moins une bande blanche ou d'une bande noire est fonctionnalisée par au moins un aptamère.
7. Biocapteur selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le code à barres est un code à barres à 2 dimensions, composé d'un assemblage de pixels noirs et de pixels blancs, dans lesquels au moins un pixel blanc ou au moins un pixel noir est fonctionnalisé par au moins un aptamère.
8. Biocapteur selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'aptamère apte à immobiliser sélectivement ledit agent biologique est un brin d'ARN, un brin d'ADN ou un peptide, et en particulier un brin d'ARN ou d'ADN, dont l'extrémité
3' est modifiée pour porter une fonction -COOH ou encore dont l'extrémité 5' est modifiée pour porter une fonction -NH2.
9. Biocapteur selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'aptamère est lié de manière covalente à la zone du code à barres via un premier espaceur, de préférence un espaceur de formule ¨S-(CH2)n-C(O)- où n est un entier compris de 2 à 6 et dans lequel l'atome de soufre est lié de manière covalente au support et l'atome de carbone du groupe C(O) est lié de manière covalente à un atome d'azote de l'aptamère ou est lié par une liaison silane (OH-Silane-NH2), par exemple le TPM, par un linker hétérobifonctionnel (SH-linker hétérbifonctionnel -NH2) par exemple le SMCC ou encore par UV.
10. Biocapteur selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'agent biologique est choisi dans le groupe constitué par les bactéries, les prions et les virus, les mycotoxines et les peptides.
11. Biocapteur selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'agent biologique est une bactérie et l'aptamère est apte à fixer sélectivement au moins une protéine membranaire de ladite bactérie, choisis par exemple parmi les lipopolysaccharides (LPS) et les peptidoglycanes (PPG).
12. Biocapteur selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'agent biologique est une bactérie choisie dans le groupe constitué
par Escherichia coli, Pseudomonas aeroginosa, Acinetobacter baumannii, Staphylococcus aureus, Clostridium difficile, Clostridium botulinum, Streptococcus pneumoniae, Treponema pallidum, Salmonella gastroenteretis, Listeria monocytogenes et Legionella spp.
13. Biocapteur selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle ladite molécule colorante est non luminescente et peut être choisie parmi un antibiotique chromogène tel que les céphalosporines ou les pénicillines ou est luminescente et en particulier fluorescente, et peut être choisie parmi le 5-FAM, le 6-FAM, les colorants de type ATTO, notamment l'ATTO 532 ou l'ATTO 550, l'ATTO 647, le DY-510XL, le DY-530, le HEX, le CAL Fluor Orange 560, et est en particulier l'ATTO.
14. Biocapteur selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, dans lequel ladite molécule colorante est non luminescente sous sa forme liée à l'aptamère et luminescente, de préférence fluorescente, sous sa forme non liée à l'aptamère.
15. Biocapteur selon la revendication précédente, dans lequel la molécule colorante possède une bande d'absorption luminescente comprise de 600 nm à 700 nm, de préférence de 640 nm à 670 nm, et une bande d'émission luminescente comprise de 600 nm à 700 nm, de préférence de 665 nm à 675 nm ou un shift colorimétrique minimal pour une détection.
16. Biocapteur selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la molécule colorante est liée de manière covalente à l'aptamère via un second espaceur, ledit second espaceur étant lié à la molécule colorante par une liaison chimique labile qui est apte à se rompre suite à l'immobilisation de l'agent biologique par l'aptamère, par exemple une liaison chimique labile apte à se rompre en présence d'une 13-1actamase.
17. Biocapteur selon la revendication précédente, dans lequel le second espaceur est un radical divalent comprenant un motif13-lactame, par exemple un motif céphalosporine.
18. Biocapteur selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la molécule colorante est un antibiotique lié de manière covalente à
l'aptamère, ladite molécule colorante étant apte à produire une couleur ou changer de couleur suite à
l'immobilisation de l'agent biologique par l'aptamère, par exemple ladite molécule chimique comprenant un antibiotique chromogène.
19. Procédé pour analyser la contamination par au moins un agent biologique dans un environnement, comprenant au moins les étapes consistant à :
- disposer d'un biocapteur selon l'une quelconque des revendications 1 à
18, - mettre en présence le biocapteur avec l'environnement à analyser, dans des conditions propices à l'immobilisation du ou des agents biologiques éventuellement présents dans ledit environnement par les aptamères du biocapteur, - lire le biocapteur ainsi revêtu, par exemple dans des conditions d'illumination propices à la luminescence de la molécule colorante sous sa forme non liée à
l'aptamère, de manière à acquérir l'information codée par le code à barres du biocapteur ainsi revêtu, et - générer à partir de l'information acquise une information concernant la présence éventuelle d'au moins un agent biologique dans l'environnement.
20. Utilisation d'un biocapteur selon l'une quelconque des revendications 1 à

pour analyser la contamination par au moins un agent biologique dans un environnement.
21. Dispositif pour analyser la contamination par au moins un agent biologique dans un environnement, comprenant au moins un biocapteur selon l'une quelconque des revendications 1 à 18.
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