FR3048884A1 - Composition pour l'administration par voie orale d'au moins un principe actif a un sujet - Google Patents
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Abstract
L'invention concerne une composition pour l'administration par voie orale d'au moins un principe actif à un sujet. Cette composition comprend des particules d'hydrogel, avantageusement sous forme humide ou sèche, comprenant : - ledit au moins un principe actif, - au moins un polysaccharide gélifiant, - au moins un agent de charge, et - au moins un agent protecteur, choisi parmi les protéines et/ou les résines alimentaires, aptes à conférer une protection dudit au moins un principe actif dans un milieu dont le pH est inférieur à 5,5, lesquelles particules sont aptes à libérer au moins une partie dudit au moins un principe actif dans un milieu dont le pH est supérieur à 5,5.
Description
Domaine technique auquel se rapporte l'invention
La présente invention concerne de manière générale le domaine des compositions pour l’administration par voie orale d’au moins un principe actif à un sujet.
Arrière-plan technologique L’administration efficace par voie orale de principes actifs à visée thérapeutique/curative ou préventive (incluant les compléments alimentaires) implique dans la grande majorité des cas une protection desdits principes actifs vis-à-vis du milieu fortement dégradant de l’estomac (pH, enzymes gastriques) combinée à un mécanisme de libération ciblée au niveau d’une zone de l’intestin.
Dans le cas particulier de la vaccination, la voie orale constitue une approche pertinente pour l’immunisation d’animaux élevés en grands nombre (par exemple poissons, crustacés, volailles).
En dépit d’une efficacité généralement moindre comparativement à l’injection, les avantages de cette technique de traitement sont nombreux : simplicité du mode d’administration, réduction substantielle du stress imposé, possibilité d’un traitement (notamment d’une vaccination) rapide d’un grand nombre d’animaux avec des coûts réduits. L'encapsulation, qui regroupe l’ensemble des technologies permettant le piégeage de composés au sein de particules individualisées ayant un diamètre compris entre 1 micron et 10 millimètres, figure parmi les stratégies les plus appropriées pour répondre efficacement aux exigences de stabilité gastrique et de libération intestinale contrôlée évoquées ci-dessus.
Le choix d’une méthode d’encapsulation particulière n’est cependant pas aisé et doit passer par la mise en place d’une procédure complexe, tenant compte notamment : - des propriétés du principe actif à encapsuler et de son mode d’action, et - des contraintes économiques et réglementaires liées au domaine d’application.
Différentes approches ont été proposées afin de permettre l'immobilisation et la stabilisation de principes actifs (notamment d’agents immunisants) dans des particules (notamment des microparticules).
La sélection adéquate des matériaux constitutifs des particules fait notamment partie des facteurs clés.
Ces matériaux doivent à la fois favoriser une bonne stabilité au stockage du ou des principes actifs, une protection vis-à-vis du milieu gastrique, ainsi qu’une libération contrôlée modulable (en termes de stimuli déclencheur et de cinétique) au niveau de l’intestin.
La protection vis-à-vis du milieu gastrique fait référence à la diminution des effets combinés du pH acide et de l’action des enzymes gastriques sur le ou les principes actifs (par exemple gonflement et solubilisation limités à pH acide, diminution de l'accessibilité pour les enzymes gastriques).
De même, les microorganismes probiotiques sont censés exercer un effet bénéfique sur la santé.
Pour se faire, les probiotiques administrés par voie orale doivent être viables lorsqu'ils atteignent l'intestin, c’est-à-dire capables de se multiplier et de coloniser l'intestin.
Cela suppose que les probiotiques, avant d'atteindre l'intestin, soient protégés à l’égard des conditions gastriques lors de leur séjour dans l'estomac, ces conditions étant fortement dégradantes (acidité, enzymes).
La libération du ou des principes actifs par la particule dans une zone ciblée de l’intestin doit pouvoir être contrôlée, et la cinétique de libération modulée en fonction de l’application. Ces paramètres dépendent des propriétés de gonflement et de dissociation des particules en conditions intestinales, ainsi que de leur capacité à adhérer à la paroi intestinale au préalable.
En outre, la bioadhésion des particules à la paroi intestinale doit par ailleurs être à même d'augmenter le temps de séjour du vecteur (c’est-à-dire les particules) et favoriser ainsi les opérations suivantes : passage du ou des principes actifs dans la circulation sanguine, stimulation d’une réponse immunitaire au niveau des cellules spécifiques présentes dans l’intestin ou colonisation de l’intestin dans le cas de microorganismes probiotiques.
En raison de ces nombreuses contraintes, peu de procédés d’encapsulation fiables ont été développés et rares sont ceux ayant conduits à une application commerciale à grande échelle.
Il serait donc intéressant de disposer de nouvelles compositions pour administration par voie orale, qui assureraient une bonne stabilité du ou des principes actifs au stockage, une protection efficace vis-à-vis du milieu gastrique, ainsi qu’une libération contrôlée modulable au niveau de l’intestin.
Objet de l’invention
Ces buts et d’autres sont atteints par la présente invention. En effet, il est démontré que la composition selon l’invention est particulièrement adaptée à une administration orale. Ces résultats démontrent pour la première fois une coopération entre les composés constitutifs de la composition, ouvrant ainsi de nouvelles perspectives de traitement.
Plus particulièrement, on propose selon l’invention une composition pour l’administration par voie orale d’au moins un principe actif à un sujet ; laquelle composition comprend des particules d’hydrogel comprenant : - ledit au moins un principe actif, - au moins un polysaccharide gélifiant, - au moins un agent de charge, et - au moins un agent protecteur, choisi parmi les protéines et/ou les résines alimentaires, aptes à conférer une protection dudit au moins un principe actif dans un milieu dont le pH est inférieur à 5,5 (avantageusement un pH de 1,0 à 5,0, de préférence encore un milieu gastrique caractérisé par un pH acide et la présence d'enzymes), lesquelles particules sont aptes à libérer au moins une partie dudit au moins un principe actif dans un milieu dont le pH est supérieur à 5,5 (de préférence un pH de 6,0 à 8,0, de préférence encore un milieu intestinal caractérisé par un pH de 6,0 à 8,0, la présence d'enzymes et de sels biliaires). D’autres caractéristiques non limitatives et avantageuses de la composition conforme à l’invention, prises individuellement ou selon toutes les combinaisons techniquement possibles, sont les suivantes : - ledit au moins un polysaccharide gélifiant est d'origine végétale ou microbienne, choisi parmi l’agar, l’alginate, l’amidon, le carraghénane, les dérivés cellulosiques, le dextran, la gomme arabique, la gomme de caroube, la gomme de guar, la gomme gellane, la gomme de xanthane et la pectine ; de préférence, les particules comprennent une combinaison d’alginate et de pectine en tant que polysaccharides gélifiants ; dans ce cas, avantageusement la teneur en alginate est inférieure à 600 mg/g de matière sèche des particules, préférentiellement entre 50 mg/g et 200 mg/g, et la teneur en pectine est inférieure à 600 mg/g de matière sèche des particules, préférentiellement entre 50 mg/g et 200 mg/g ; - ledit au moins un agent de charge est sélectionné parmi l’amidon (de préférence l'amidon granulaire), la silice ou l’argile ; - la teneur dudit au moins agent de charge est inférieure à 900 mg/g de matière sèche des particules, préférentiellement entre 200 mg/g et 800 mg/g ; - ladite au moins une protéine est choisi parmi les protéines de lait dont les caséines, les isolats de protéines sériques (béta lactoglobuline, alpha lactalbumine, albumine sérique bovine, immunoglobuline et lactoferrines), les gélatines, les protéines végétales (en particulier issues de céréales ou de légumineuses, par exemple zéines, protéines de pois, de riz, de soja, de lupin), et/ou ladite au moins une résine alimentaire est une gomme de shellac ; - la composition contient au moins un polysaccharide présentant des fonctions acides faibles, ayant un pKa de 2,0 à 5,0, avantageusement un pKa de 3,0 à 4,0 ; - ladite au moins une protéine est sous une forme dénaturée (partiellement ou totalement), sous l'effet de l’un au moins des paramètres suivants : la température, le pH, la présence d'ions en solution ; - la teneur de ladite au moins une protéine est inférieure à 700 mg/g de matière sèche des particules, préférentiellement entre 200 mg/g et 400 mg/g, et/ou la teneur de ladite au moins une résine alimentaire est inférieure à 700 mg/g de matière sèche des particules, préférentiellement entre 200 mg/g et 400 mg/g ; - lesdites particules consistent en des particules dont le diamètre est compris entre 1 pm et 10 mm, préférentiellement des microparticules dont le diamètre est compris entre 10 pm et 500 pm et plus préférentiellement encore entre 50 pm et 200 pm ; - la composition selon l’invention est destinée à être utilisée comme médicament, de préférence destinée à être utilisée pour la vaccination par voie orale dudit sujet humain ou animal ; - les particules sont individualisées ; - les particules sont sous forme humide, présentant avantageusement des teneurs en eau inférieures à 990 mg/g desdites particules, préférentiellement entre 500 mg/g et 950 mg/g, ou sous forme sèche, présentant avantageusement des teneurs en eau inférieures à 200 mg/g desdites particules, préférentiellement entre 5 mg/g et 100 mg/g et plus particulièrement entre 10 mg/g et 50 mg/g.
La présente invention concerne également le produit contenant la composition selon l’invention, choisi parmi - les formes galéniques ou compléments alimentaires (granule, comprimé, pastille, tablette, gélule, film, solution oro-dispersible), et - les denrées alimentaires en particulier sous forme de granulés ou de suspensions buvables.
La présente invention concerne également une utilisation non-thérapeutique d’une composition selon l’invention, pour adresser ledit au moins un principe actif au sein du tractus digestif d’un sujet de manière, d’une part, à protéger ledit au moins un principe actif vis-à-vis d’un milieu dont le pH est inférieur à 5,5 (avantageusement un pH de 1,0 à 5,0, avantageusement encore un milieu gastrique caractérisé par un pH acide et la présence d'enzymes) et, d’autre part, à libérer ledit au moins un principe actif dans un milieu dont le pH est supérieur à 5,5 (avantageusement un milieu intestinal caractérisé par un pH de 6,0 à 8,0, la présence d'enzymes et de sels biliaires), avantageusement par gonflement et dissociation progressive et contrôlée des particules.
La présente invention concerne encore une utilisation non-thérapeutique d’une composition selon l’invention, pour administration orale chez l'homme, chez les animaux domestiques et chez les animaux de rente, en particulier en aquaculture (chez les poissons, crustacés, mollusques), en aviculture (chez les volailles) et en entomoculture (chez les insectes). L’invention propose également un procédé pour la préparation d’une composition selon l’invention, lequel procédé comprend les étapes suivantes : a) une étape de mélange dudit au moins un principe actif, dudit au moins un polysaccharide gélifiant, dudit au moins un agent de charge et dudit au moins un agent protecteur, pour l’obtention d’une solution intermédiaire ; b) une étape de formation de gouttelettes à partir de ladite solution intermédiaire issue de l’étape a) ; c) une étape de gélification des gouttelettes issue de l'étape b), sous l'effet d’au moins un agent gélifiant, pour l’obtention des particules sous forme humide ; d) une étape de collecte et de lavage desdites particules issues de l’étape c).
De préférence, ledit au moins un agent gélifiant, présentant avantageusement une température contrôlée, est soit un gaz, soit un liquide (préférentiellement une solution aqueuse). Dans le cas d’une solution aqueuse, cette dernière contient avantageusement au moins un cation choisi parmi le sodium, le potassium, le calcium, le zinc, le magnésium, l’aluminium, avantageusement à une concentration comprise entre 0,001 mol/L et 1 mol/L, préférentiellement entre 0,03 mol/L et 0,3 mol/L. Plus préférentiellement encore ledit au moins un cation est choisi parmi les cations divalents, avantageusement lorsque les polysaccharides gélifiants comprennent une combinaison d’alginate et de pectine.
Toujours de préférence, suite à l’étape de collecte et de lavage d), ledit procédé comprend une étape de déshydratation au cours de laquelle les particules issues de ladite étape d) sont déshydratées pour l’obtention de particules sous forme sèche. Ladite étape de déshydratation est avantageusement une étape de lyophilisation.
Description détaillée de l’invention
La description qui va suivre fera bien comprendre en quoi consiste l’invention et comment elle peut être réalisée.
Composition L’invention se rapporte donc à une composition pour l’administration par voie orale d’au moins un principe actif à un sujet.
En l’espèce, la composition selon l’invention comprend des particules d’hydrogel comprenant : - ledit au moins un principe actif, - au moins un polysaccharide gélifiant, - au moins un agent de charge, et - au moins un agent protecteur.
Les excipients de cette composition sont avantageusement choisis parmi les excipients physiologiquement acceptable.
Par « excipients physiologiquement acceptable >>, on entend toute substance, autre que les principes actifs, dans une composition pharmaceutique ou nutritionnelle de l’invention, et non toxique pour l’organisme auquel elle est administrée.
De préférence, ces excipients (ledit au moins un polysaccharide gélifiant, ledit au moins un agent de charge et ledit au moins un agent protecteur) sont d’origine naturelle.
De façon générale, les excipients selon l’invention sont adaptés à une administration par voie orale.
Plus généralement, la composition selon l’invention est réalisée au moyen de composés biocompatibles et biodégradables.
La biocompatibilité d’un matériau est sa propriété à agir dans une application spécifique avec une réponse appropriée de l’hôte.
La biodégradabilité est la capacité intrinsèque d’un matériau à se dégrader (par divers procédés) dans des conditions données et en un temps déterminé.
Dans la présente invention, des polymères naturels, d’origine polysaccharidique et protéique, ont été utilisés.
Tel que développé ci-dessous, la combinaison de composés selon l’invention permet, grâce aux propriétés intrinsèques desdits composés, de formuler un ou plusieurs principes actifs et ainsi produire des particules ayant avantageusement des propriétés de libération contrôlée et retardée dans le système gastro-intestinal du sujet.
De préférence, la composition selon l’invention a comme application la protection de principes actifs encapsulés vis-à-vis des conditions gastriques, suivie d’une libération contrôlée au niveau de l’intestin.
Les principes actifs encapsulés sont ainsi protégés lors du transit dans l’estomac du sujet, puis sont libérés dans l’intestin et de préférence encore dans une zone spécifique de l'intestin.
Plus généralement, les particules selon l’invention permettent l’encapsulation dudit au moins un principe actif, c’est-à-dire son immobilisation au sein d’un matériau, sa structuration et sa fonctionnalisation, sa protection et le contrôle de sa libération.
Les différentes substances formant la composition selon l’invention sont décrites ci-dessous.
Particules
La composition selon l’invention comprend une pluralité de particules d’hydrogel qui contiennent ledit au moins un principe actif.
Le terme « particule » concerne avantageusement un élément de matière solide de la composition, dont les dimensions sont caractérisables par une technique d'observation ou de mesure donnée.
Les particules consistent avantageusement en des particules dont le diamètre est compris entre 1 pm et 10 mm, préférentiellement des microparticules dont le diamètre est compris entre 1 pm et 1000 pm, de préférence encore entre 10 pm et 500 pm et plus préférentiellement encore entre 50 pm et 200 pm.
Les dimensions de ces microparticules peuvent être mesurées par granulométrie laser (normes ISO 13320 : 2009 Particle size analysis - Laser diffraction methods ; ISO 21501-2 :2007 Détermination of particle size distribution - Single particles light interaction methods - Part 2 : Light scattering liquid-borne particle counter).
Les particules selon l’invention peuvent être de différents types : - cœur-coquille ou multi cœur-coquille (localisation du ou des principes actifs dans le ou les cœurs), aussi nommées « capsules » ou « vésicule » ; - matriciel (dispersion homogène du ou des principes actifs dans l'ensemble du volume) ; ou - combinaison d’une structure cœur-coquille ou multi cœur-coquille et matricielle.
Les particules de la composition sont avantageusement individualisées, c’est-à-dire que la cohésion ou l’adhésion entre lesdites particules est faible, voire inexistante.
Les particules ne sont ainsi pas, ou sont peu, adhérentes les unes aux autres, que ce soit sous forme humide ou sèche ; avantageusement ces particules forment alors une poudre lorsqu’elles sont sous forme sèche décrite ci-après.
Les particules de la composition selon l’invention sont du type particules d’hydrogel.
Un hydrogel est un réseau polymérique hydrophile qui peut absorber de grande quantité d'eau (voir à ce sujet par exemple Sytze J. Buwalda et al., « Hydrogels in a historical perspective : From simple networks to smart materials », Journal of Controlled Release 190 (2014) 254-273).
Les particules d’hydrogel peuvent également se présenter sous deux formes distinctes (ou deux états distincts) : humide ou sèche (ou déshydratée).
Dans la forme humide, les particules présentent avantageusement des teneurs en eau inférieures à 990 mg/g desdites particules, préférentiellement comprises entre 990 mg/g et de préférence encore entre 500 mg/g et 950 mg/g.
Dans la forme sèche, les particules d’hydrogel sont déshydratées.
Ces particules présentent alors avantageusement des teneurs en eau inférieures à 200 mg/g desdites particules, préférentiellement entre 5 mg/g et 100 mg/g et plus particulièrement encore entre 10 mg/g et 50 mg/g.
Polysaccharide gélifiant
Les particules selon l’invention comprennent un unique polysaccharide gélifiant ou une combinaison d’au moins deux polysaccharides gélifiants.
De manière générale, les polysaccharides (parfois appelés glycanes, polyosides, polyholosides ou glucides complexes) sont des polymères constitués de plusieurs oses liés entre eux par des liaisons osidiques.
Selon l’invention, les polysaccharides dits « gélifiants >> sont des polysaccharides aptes à former la matrice polymère d’un gel macromoléculaire, et avantageusement d’un hydrogel.
Un tel polysaccharide gélifiant est avantageusement d'origine naturelle, par exemple végétale ou microbienne.
De manière générale, ce polymère est choisi parmi les polymères anioniques (acide hyaluronique, alginate, pectine, carraghénane, gomme de gellane, gomme de xanthane), les polymères ou protéines cationiques (chitosan, polylysine, gélatine) et les polymères neutres (dextran, agarose).
De préférence encore, au moins une source de polysaccharides gélifiants est avantageusement choisie de sorte à obtenir des particules d’hydrogel sensibles au pH.
Pour cela, les particules d’hydrogel sont avantageusement constituées d’un réseau polymérique comprenant des groupes pendants ioniques qui peuvent accepter/donner des protons en réponse à un changement du pH : le degré d’ionisation est modifié et le changement de la charge nette des groupes pendants peut causer des transitions de volume brusque en générant des forces électrostatiques répulsives entre ces groupes ionisés. Cela donne lieu à un gonflement du gel.
Les particules peuvent être formées par deux types d’hydrogels sensibles au pH : - les anioniques, dans lesquels les groupes pendants peuvent être des groupes carboxyliques ou des sulfates, ou - les cationiques dans lesquels des groupes pendants peuvent être des amines.
La charge ionique et le pKa du polymère, ainsi que la force ionique de la solution extérieure, sont les principaux facteurs qui influent sur le degré de gonflement des particules d’hydrogel sensibles au pH.
En l’espèce, le polysaccharide gélifiant est avantageusement choisi parmi les polymères gélifiants anioniques.
Ainsi, le polysaccharide gélifiant anionique présente avantageusement des fonctions acides faibles, ayant un pKa de 2,0 à 5,0 et de préférence encore un pKa de 3,0 à 4,0.
Un tel polysaccharide gélifiant anionique est avantageusement choisi parmi la pectine, l’alginate et le carraghénane.
La pectine et/ou l’alginate peuvent être utilisés en combinaison avec au moins un autre polysaccharide gélifiant, par exemple l’agar, l’amidon, le carraghénane, les dérivés cellulosiques, le dextran, la gomme arabique, la gomme de caroube, la gomme de guar, la gomme gellane et la gomme de xanthane.
Selon un mode de réalisation préféré, les particules comprennent une combinaison d’alginate et de pectine, en tant que polysaccharides gélifiants.
Le demandeur a constaté que le couple alginate / pectine, dans la composition selon l’invention, possède un pouvoir gélifiant efficace, des propriétés de gastro-résistance, une capacité à gonfler à pH neutre ou basique et des propriétés de bioadhésion. L’alginate est un polymère issu des algues marines (algues brunes, en particulier de la famille des laminaires), constitué d'un enchaînement de deux groupements : mannuronate ou acide mannuronique (pKa = 3,38), et guluronate ou acide guluronique (pKa = 3,65). Seuls les enchaînements de groupements guluroniques ont la capacité de gélifier en présence de cations, en particulier divalents.
Parmi les alginates, on peut citer l'alginate de sodium (voir Kuen Yong Lee et al, « Alginate: Properties and biomédical applications >>, Progress in Polymer Science 37 (2012) 106- 126).
La pectine, est un polysaccharide présent dans les parois cellulaires de la plupart des plantes et en grande quantité dans celles de certains fruits (pommes, agrumes). Les molécules de pectines sont majoritairement composées d'acide galacturonique (pKa = 3,50) présentant des taux variables de ramification et d'estérification. Les groupements galacturoniques de la pectine, à l'instar des groupements guluroniques de l'alginate, présentent de bonnes propriétés de gélification en particulier en présence de cations divalents (voir F. Munarin et al., « Biomédical applications of pectin gels >>, International Journal of Biological Macromolecules 51 (2012) 681-689).
Selon ce mode de réalisation, de préférence : - la teneur en alginate est inférieure à 600 mg/g de matière sèche des particules, préférentiellement entre 50 mg/g et 200 mg/g, et - la teneur en pectine est inférieure à 600 mg/g de matière sèche des particules, préférentiellement entre 50 mg/g et 200 mg/g.
Agent de charge
Les particules selon l’invention comprennent un unique agent de charge ou une combinaison d’au moins deux agents de charge. L’agent de charge a principalement pour fonction d’augmenter la teneur en matière sèche des particules et d’améliorer ainsi leurs propriétés mécaniques notamment lors de l’étape de séchage (en particulier pour une technique de lyophilisation). L’agent de charge selon l’invention est avantageusement choisi parmi l’amidon préférentiellement granulaire (de maïs, de blé, de pomme de terre, de manioc), la silice amorphe (pyrogénée ou précipitée, sous forme de microparticules ou de nanoparticules) ou l’argile (par exemple la bentonite, la montmorillonite, ou la kaolinite).
La teneur dudit au moins agent de charge est inférieure à 900 mg/g de matière sèche des particules, préférentiellement entre 200 mg/g et 800 mg/g.
Agent protecteur
Les particules selon l’invention comprennent encore un unique agent protecteur ou une combinaison d’au moins deux agents protecteurs.
Par « agent protecteur >>, on entend les composés aptes à conférer une protection aux particules dont le pH est inférieur à 5,5 (avantageusement encore un milieu gastrique), tout en autorisant la libération dudit au moins un principe actif dans le milieu dont le pH est supérieur à 5,5 (avantageusement encore un milieu intestinal).
En pratique, dans un milieu de pH inférieur à 5,5 (avantageusement gastrique), les particules contenant ledit au moins un agent protecteur assurent une protection améliorée dudit au moins un principe actif par rapport aux particules dépourvues dudit au moins un agent protecteur (au moins pendant 1 heure).
Tel que développé dans les Exemples, les particules selon l’invention confèrent un taux de survie accru des microorganismes, en particulier des bactéries probiotiques (à ce sujet, voir en particulier l’exemple 9).
En particulier, la protection vis-à-vis du milieu gastrique fait référence à la diminution des effets combinés du pH acide et de l’action des enzymes gastriques (par exemple gonflement et solubilisation limités, absence de dissolution à pH acide) sur les particules selon l’invention par rapport à des particules dépourvues de l’agent de protection.
Par « milieu acide », on entend un milieu dont le pH est inférieur à 7,0, de préférence entre 1,0 et 7,0.
Par « milieu gastrique », on définit un milieu acide constitué de l'ensemble des composants sécrétés par l’organisme au niveau de l'estomac (acides forts et faibles, enzymes).
Par « milieu gastrique simulé », on entend un milieu simplifié utilisé comme modèle tel que défini dans les Exemples, dont le pH est inférieur à 6,0, de préférence compris entre 1,0 et 5,0 et qui comprend ou non de la pepsine.
Par « protection », on entend que les particules selon l’invention présentent une réduction significative de la dégradation dudit au moins un principe actif par rapport aux particules dépourvues dudit au moins un agent protecteur, à savoir avantageusement de moins de 99 % et de préférence encore de moins de 90 %.
En particulier, dans le cas d’un organisme vivant encapsulé (par exemple un probiotique), la « protection » consiste avantageusement en ce que les particules selon l’invention assurent une survie améliorée dudit organisme vivant encapsulé par rapport aux particules dépourvues dudit au moins un agent protecteur, à savoir avantageusement une perte de moins de 2 log UFC/g et de préférence encore de moins d'1 log UFC/g (UFC/g, unité formant colonie par gramme).
De manière générale, le terme log correspond à un logarithme décimal aussi désigné logi0.
Un tel agent protecteur est choisi parmi les protéines et/ou les résines alimentaires.
La protéine est avantageusement choisie parmi les protéines de lait dont les caséines, les isolats de protéines sériques (béta lactoglobuline, alpha lactalbumine, albumine sérique bovine, immunoglobuline et lactoferrines) ; les gélatines ; les protéines végétales (en particulier issues de céréales ou de légumineuses, à savoir par exemple zéines, protéines de pois, de riz, de soja, de lupin).
Cette protéine est avantageusement sous une forme dénaturée (partiellement ou totalement), sous l'effet de l’un au moins des paramètres suivants : la température, le pH, la présence d'ions en solution (voir Lucie Beaulieu et al., « Elaboration and Characterization of Whey Protein Beads by an Emulsification/Cold Gélation Process: Application for the Protection of Retinol », Biomacromolecules, 2002, 3 (2), pp 239-248; S.B. Doherty et al, « Development and characterisation of whey protein micro-beads as potential matrices for probiotic protection», Food Hydrocolloids 25 (2011) 1604e1617; WO- 2010/119041).
La dénaturation des protéines permet d'en exposer les zones hydrophobes ce qui, d'une part, accroît l'agrégation des protéines entres elles limitant de fait la diffusion et, d'autre part, améliore les propriétés de bioadhésion des particules. Le contrôle du procédé de dénaturation permet de moduler les propriétés des protéines, en particulier de diffusion et de bioadhésion.
La résine alimentaire consiste avantageusement en une gomme de shellac (ou gomme-laque).
La gomme de shellac est raffinée à partir de la résine sécrétée par la femelle d'un insecte (Kerria lacca) parasite de certaines essences tropicales d'Asie du sud-est. La gomme de shellac est soluble dans l'éthanol, en milieu hydro alcoolique et /ou tampon basique (en particulier comportant de l'ammoniaque). Cette dernière forme permet sont incorporation sous forme de solution aux formulations décrites. La gomme de shellac est de plus insoluble à pH acide ce qui la rend particulièrement intéressante pour des applications combinées de protection gastrique et libération intestinale. L’agent protecteur est avantageusement rapporté dans les proportions suivantes : - la teneur de ladite au moins une protéine est inférieure à 700 mg/g de matière sèche des particules, préférentiellement entre 200 mg/g et 400 mg/g, et/ou - la teneur de ladite au moins une résine alimentaire est inférieure à 700 mg/g de matière sèche des particules, préférentiellement entre 200 mg/g et 400 mg/g.
Les agents protecteurs peuvent encore comprendre des polysaccharides, pouvant faire partie ou non des polysaccharides gélifiant.
Le polysaccharide « protecteur >> est avantageusement choisi parmi l’agar, l’alginate, l’amidon, le carraghénane, les dérivés cellulosiques, le dextran, la gomme arabique, la gomme de caroube, la gomme de guar, la gomme gellane, la gomme de xanthane et la pectine.
Libération dudit au moins un principe actif
Les particules d’hydrogel sont aptes à libérer au moins une partie dudit au moins un principe actif dans un milieu dont le pH est supérieur à 5,5, de préférence dont le pH s’étend de 6,0 à 8,0, avantageusement encore un milieu intestinal.
Sans être limité par une quelconque théorie, cette libération est en particulier liée aux polysaccharides gélifiants, avantageusement anioniques présentant des fonctions acides faibles, ayant un pKa de 2,0 à 5,0 et de préférence encore un pKa de 3,0 à 4,0.
Par « libération >>, on entend que les particules selon l’invention libèrent dans un milieu présentant un pH supérieur à 5,5 (avantageusement le milieu intestinal), au moins 10 % de la teneur initiale dudit au moins un principe actif, avantageusement au moins 50 % et préférentiellement 100 %.
Inversement, dans le milieu acide (avantageusement le milieu gastrique), la libération du principe actif est minime par les particules selon l’invention, c’est-à-dire avantageusement inférieure à 10 % de la teneur initiale en principe actif, de préférence inférieure à 5 % et de préférence encore inférieure à 2,5 %, après 1 h et de préférence encore après 7 h.
Par « milieu intestinal », on définit un milieu constitué de l'ensemble des composants sécrétés par l'organisme au niveau de l'intestin (pH compris entre 6,0 et 8,0, enzymes, sels biliaires).
Par « milieu intestinal », on englobe un « milieu intestinal simulé », c’est-à-dire un milieu simplifié utilisé comme modèle tel que défini dans les Exemples, dont le pH est compris entre 6,0 et 8,0, de préférence compris entre 6,5 et 7,5 et qui comprend ou non de la pancréatine.
Un tel milieu intestinal simulé est par exemple décrit dans les documents M. Hamoudi et al., « Beads made of cyclodextrin and oil for the oral delivery of lipophilie drugs : In vitro studies in simulated gastro-intestinal fluids », International Journal of Pharmaceutics 416 (2011) 507- 514, ou Margareth R. C. Marques et al., « Simulated Biological Fluids with Possible, Application in Dissolution Testing », Dissolution Technologies AUGUST 2011.
Principe actif
Les particules selon l’invention sont destinées à contenir un unique principe actif ou une combinaison d’au moins deux principes actifs.
La notion de « principe actif » englobe notamment les ions (et sels correspondants), les petites molécules (masse molaire inférieure à 1000 g/mol), les macromolécules (masse molaire supérieure à 1000 g/mol), les extraits végétaux (solides ou liquides, dont les huiles essentielles), les peptides, les protéines, les vaccins pouvant être vivants, inactivés, entiers ou en fragments : les virus, les cellules ou les microorganismes (bactéries, levures, champignons).
Par « principe actif » (ou « substance active »), on englobe les composés possédant un effet thérapeutique et les composés dépourvus d’un effet thérapeutique.
Par « composés possédant un effet thérapeutique » ou « composés thérapeutiques », on englobe les « immunogènes » ou « agents immunogéniques », c’est-à-dire les substances qui sont aptes à générer une réponse immunitaire chez un être vivant. Un tel agent immunogénique inclut notamment - les peptides immunogéniques et les protéines immunogéniques, y compris les mélanges contenant des tels peptides immunogéniques et/ou protéines immunogéniques : - les microorganismes (vivants, inactivés, entiers ou en fragments) ; - les particules virales intactes ou inactivées ; - les adjuvants immunostimulants (alun, adjuvant de Freund) ; - ou une combinaison des différents agents cités.
Les composés dépourvus d’un effet thérapeutique, dits encore « composés non thérapeutiques >>, ont par exemple un effet nutritionnel ou un effet cosmétique.
La notion de « principe actif >> englobe ainsi les compléments alimentaires, c’est-à-dire les molécules ou combinaison de molécules présentant un bénéfice pour la santé comprenant les fibres, les vitamines, les acides aminés, les acides gras ou mélange d’acides gras, saturés ou insaturés, les composés minéraux, les extraits naturels d'origine végétale, animale ou marine.
La composition est destinée à contenir une quantité efficace dudit au moins un principe actif.
Le terme « quantité efficace >>, ou « quantité thérapeutiquement efficace >>, se réfère à la quantité qui est suffisante pour exercer l’activité nutritionnelle et/ou thérapeutique associée, lorsqu’elle est administrée à un sujet. Une telle quantité dépend du sujet, du trouble ou de la pathologie à traiter et/ou à prévenir et du mode d’administration. Elle peut être déterminée par des opérations de routine par l’homme du métier.
Procédé de préparation d’une composition selon l'invention
La préparation d’une composition selon l’invention s’appuie sur des techniques classiques pour la fabrication de particules d’hydrogel, avantageusement choisies parmi les techniques d’extrusion, de pulvérisation et d’émulsification (voir par exemple Van-Thanh Tran et al., « Why and how to préparé biodégradable, monodispersed, polymeric microparticles in the field of pharmacy ? >>, International Journal of Pharmaceutics 407 (2011) 1-11 ; Christoph Heinzen et al, « Use of vibration technology for jet break - up for Encapsulation of cells, microbes and liquids in Monodisperse microcapsules >>, Fundamentals of Cell Immobilisation Biotechnology Volume 8A of the sériés Focus on Biotechnology pp 257-275; Ulf Prusse et al, « Comparison of different technologies for alginate beads production >>, Chemical Papers 62 (4) 364-374 (2008) ; Denis Poncelet et al, « Production of alginate beads by emulsification/internal gélation. Methodology” Appl Microbiol Biotechnol. 1992 Oct;38(1):39-45; Ji-Yuan Tian et al., “Formation and oral administration of alginate microspheres loaded with pDNA coding for lymphocystis disease virus (LCDV) to Japanese flounder”, Fish & Shellfish Immunology (2008) 24, 592e599) L'intérêt du procédé de fabrication est que les particules humides obtenues peuvent être directement utilisées ou séchées.
De manière générale, les particules peuvent être : - disponibles sous forme humide et être utilisées sous forme humide ; - disponibles sous forme sèche et être utilisées sous forme sèche ; - disponibles sous forme sèche et être utilisées sous forme humide (après réhydratation).
Ce procédé comprend avantageusement les étapes suivantes : a) une étape de mélange dudit au moins un principe actif, dudit au moins un polysaccharide gélifiant, dudit au moins un agent de charge et dudit au moins un agent protecteur, pour l’obtention d’une solution (ou mélange) intermédiaire ; b) une étape de formation de gouttelettes à partir de ladite solution intermédiaire issue de l’étape a) ; c) une étape de gélification des gouttelettes issue de l'étape b), en présence d’au moins un agent gélifiant, pour l’obtention des particules d'hydrogel sous forme humide ; d) une étape de collecte et de lavage desdites particules d’hydrogel issues de l’étape c).
La formation des gouttelettes consiste avantageusement en une technique d’extrusion, de pulvérisation ou d’émulsification.
Dans le cas de l’extrusion, le mélange est pompé au travers un orifice, qui pourra être multiplié afin notamment d'accroître la productivité. L'orifice pouvant être une buse. L'extrusion de la formulation au travers dudit au moins un orifice, conduit à la formation de gouttelettes dans l'air (ou tout autre gaz), sous l'effet de la gravité simple, ou combinée à la pression hydraulique. Ce procédé est particulièrement dédié à la production de particules dont le diamètre moyen est compris entre quelques centaines de microns et quelques millimètres. L'extrusion peut être combinée à une pulvérisation. La formation des gouttelettes peut alors être favorisée par l'utilisation d'un gaz sous pression (buse pneumatique) ou d'un flux d'air, ou sous l'effet d'une vibration appliquée au niveau de la buse, ou sous l'effet d'une différence de tension appliquée entre la buse et le bain. Ces différentes techniques pouvant être combinées. L'extrusion peut également être combinée à un mécanisme de coupure du jet formé, sous l'effet d'un gaz, d'un liquide ou d'un solide (lame, fil), en mouvement. Le mélange peut enfin être distribué sur un disque en rotation, le disque permettant de pulvériser le mélange sous l'effet de la force centrifuge (en l'absence de buse).
Ces procédés d'extrusion combinés à la pulvérisation sont particulièrement dédiés à la production de particules dont le diamètre moyen est compris entre quelques dizaines et quelques centaines de microns.
Concernant l’émulsification, le mélange (phase discontinue) est dispersé dans la phase continue immiscible (ou faiblement miscible) avec la phase discontinue. La dispersion est réalisée par cisaillement du mélange dans la phase continue. Ce cisaillement peut être obtenu par emploi d'une turbine ou hélice, d'un homogénéisateur de type rotor - stator, sous l'effet d'ultrasons (sonde à ultrasons), par l'emploi d'un homogénéisateur haute pression, par l'extrusion au travers une membrane, par l’emploi de systèmes micro-fluidiques. Le cisaillement et plus particulièrement l'énergie dissipée dans l'émulsion permettent de contrôler le diamètre des gouttelettes obtenues. Après formation de l'émulsion, les gouttelettes sont gélifiées sous l'effet d'un agent gélifiant. Les particules obtenues sont éventuellement séparées (par filtration, décantation, centrifugation) et la phase continue est éliminée (lavage, évaporation).
Selon un mode préféré de réalisation, ledit au moins un agent gélifiant, présentant avantageusement une température contrôlée, est soit un gaz, soit un liquide préférentiellement une solution aqueuse. Dans le cas d’une solution aqueuse, cette dernière contient de préférence au moins un cation choisi parmi le sodium, le potassium, le calcium, le zinc, le magnésium, l’aluminium.
La concentration de ce cation est avantageusement comprise entre 0,001 mol/L et 1 mol/L, préférentiellement entre 0,03 mol/L et 0,3 mol/L.
La gélification en présence de cations est un processus qui conduit à la formation d’un hydrogel. Des polymères de charges négatives sont tout à fait indiqués. En présence de cations divalents, il est possible d’établir des liaisons ioniques entre les groupements des chaînes de ces polysaccharides.
Par ailleurs, suite à l’étape de collecte et de lavage d), ledit procédé selon l’invention comprend avantageusement une étape de déshydratation au cours de laquelle les particules d’hydrogel sous forme humide issues de ladite étape d) sont déshydratées pour l’obtention de particules d’hydrogel sous forme sèche.
Cette étape de déshydratation consiste par exemple en une étape de lyophilisation.
Application de la composition selon l’invention
La composition selon l’invention présente des applications notamment dans les domaines de la santé et de la nutrition humaine et animale, en particulier dans le domaine de la vaccination animale par voie orale.
Pour cela, les particules d’hydrogel selon l’invention peuvent réagir à des stimuli extérieurs et subir des modifications relativement importantes de leurs structures et de leurs propriétés telles que le gonflement, la perméabilité ou encore la résistance mécanique.
De manière générale, la composition permet, d’une part, une protection dudit au moins un principe actif vis-à-vis d’un milieu dont le pH est inférieur à 5,5 et, d’autre part, une libération d’au moins une partie dudit au moins un principe actif dans un milieu dont le pH est supérieur à 5,5.
En l’espèce, la composition selon l’invention est intéressante pour adresser ledit au moins un principe actif au sein du tractus digestif d’un sujet de manière, d’une part, à protéger ledit au moins un principe actif vis-à-vis de conditions du milieu gastrique (pH acide, enzymes) et, d’autre part, à libérer ledit au moins un principe actif dans le milieu intestinal (pH compris entre 6,0 et 8,0, enzymes, sels biliaires), par gonflement puis dissociation progressive et contrôlée des particules d’hydrogel.
Pour cela, cette composition peut se présenter sous différentes formes adaptées à une administration par voie orale, à savoir notamment : - les formes galéniques ou compléments alimentaires, en particulier sous forme de granule, comprimé, pastille, tablette, gélule, film, solution oro-dispersible, et - les denrées alimentaires, en particulier sous forme de granulés ou de suspensions buvables.
Selon un premier mode de réalisation, la composition selon l’invention a une vocation thérapeutique, destinée à être utilisée comme médicament.
Par « thérapeutique >>, on englobe notamment le traitement et/ou la prévention d’une maladie, d’une pathologie ou d’un trouble.
Par « traitement d’une maladie, d’une pathologie ou d’un trouble >>, il est entendu l’inhibition (c’est-à-dire l’arrêt du développement), la régression, la disparition des symptômes, des conséquences et/ou encore des causes de ladite pathologie ou maladie ou trouble.
Par « prévention d’une maladie, d’une pathologie ou d’un trouble >>, il est entendu la prévention de l’apparition de ladite pathologie ou maladie ou trouble, chez un sujet pour lequel la maladie, pathologie ou trouble ne s’est pas encore déclarée. A cet égard, la composition selon l’invention est destinée à être utilisée pour la vaccination par voie orale dudit sujet humain ou animal.
Par « vaccination >>, on entend l’action d'administrer un immunogène ou un agent immunogénique (antigène) par ingestion, afin d'induire une réponse active du système immunitaire spécifique à une bactérie, un virus, un parasite ou une toxine produite par un agent infectieux.
Selon un second mode de réalisation, la composition selon l’invention est mise en oeuvre dans une utilisation non-thérapeutique, par exemple en tant que composition nutritionnelle.
Par « composition nutritionnelle >>, on entend selon l’invention, une composition telle que décrite précédemment, et constituant une composition alimentaire ou encore un supplément/complément alimentaire ne possédant pas les caractéristiques d’un médicament.
La composition selon l’invention peut être administrée à une vaste gamme de sujets : l'homme, les animaux domestiques et les animaux de rente, en particulier en aquaculture (chez les poissons, crustacés, mollusques), en aviculture (chez les volailles) et en entomoculture (chez les insectes).
Avantage de la composition selon l'invention
De manière générale, la composition selon l’invention comporte avantageusement différentes propriétés : - bioadhésion aux parois du tractus digestif, en particulier lors de la phase de gonflement et de dissociation, du fait de la présence des polysaccharides et de la source de protéine ; - résistance gastrique, libération intestinale et bioadhésion pouvant être ajustées et contrôlées lors de la formulation des particules ; - le principe actif présente des propriétés préventives ou curatives concernant la santé, le maintien de la santé ou la croissance de l'organisme chez lequel il est employé.
Exemples
Exemple 1 : Préparation de particules (alqinate / pectine / isolat de protéine sérique)
Préparation de la formulation : L'alginate de sodium (30 mg/g) et la pectine (20 mg/g) sont dissous dans une solution saline (9 mg/g de NaCI), sous agitation vigoureuse (agitation mécanique 1000 trs/min) à 40 °C, pendant 60 minutes. D'autre part, l'isolat de protéine sérique (WPI pour Whey Protein Isolate) est solubilisé dans l'eau déminéralisée (100 mg/g) avant dénaturation thermique (80 °C, 30 min).
La formulation proprement dite est obtenue par ajout successif dans un bêcher de 600 mL agité mécaniquement (500 trs/min) d'une solution saline (9 mg/g de chlorure de sodium, 31,9 g), d'amidon (9,0 g), de la solution d'alginate et de pectine décrite précédemment (100,9 g), puis de la solution de WPI dénaturée thermiquement (nommée DWPI, 60,4 g).
Le tableau 1 ci-dessous présente la composition théorique de la formulation obtenue :
Préparation des particules :
La formulation décrite ci-dessus est extrudée et les gouttelettes obtenues sont gélifiées dans un bain sous agitation douce (solution dans l'eau déminéralisée de dichlorure de calcium dihydraté, concentration 100 mmol/L). Après 10 min de réticulation, les particules sont pompées et filtrée sur tamis (maille de 63 pm). Les particules obtenues présentent une teneur en matière sèche de 93,1 +/- 7,2 mg/g.
Les propriétés de granulométrie obtenues par diffraction laser sont présentées dans le tableau 2 ci-dessous.
Le diamètre médian en volume (D(V, XX %)) représente une valeur de diamètre pour laquelle XX % (en volume) de l'échantillon analysé est inférieure à la valeur indiquée. Le span est un indice de polydispersité (il permet d'apprécier l'homogénéité de l'échantillon en termes de diamètres) ; il est défini par (D(V, 90 %) - D(V, 10 %)) / D(V, 50 %). Le D[4,3] représente le diamètre moyen (toujours en volume).
Les particules humides collectées sont dispersées dans 33 % d'eau déminéralisée avant congélation à -20 °C et lyophilisation (72 h).
Exemple 2 : Evolution du diamètre des particules préparées dans l’exemple 1 en milieux simulés : gastrique puis intestinal (en présence d’enzyme)
Préparation d'un milieu gastrique simulé (SGF) :
Dans un flacon de 250 mL, l'eau déminéralisée est pesée (192 g). Le chlorure de sodium (7,156 g) est solubilisé sous agitation magnétique. Le pH est acidifié par ajout de 4 mL d'acide chlorhydrique (concentration 1 mol/L). Après quelques minutes d'homogénéisation la pepsine (1,295 g) est ajoutée et homogénéisée. Le pH final du milieu SGF est de pH = 1,99.
Préparation d'un milieu intestinal simulé (SIF) : L'eau déminéralisée est pesée (93,77 g) dans un flacon de 100 mL. Le chlorure de sodium (3,582 g) ainsi que l’hydrogénocarbonate de sodium (1,695) sont ajoutés et solubilisés sous agitation magnétique. Le pH est ajusté à pH = 8,20 par ajout de 1 mL d'hydroxyde de sodium (concentration 1 mol/L). Après quelques minutes d'homogénéisation, la pancréatine (1,063 g) est ajoutée et homogénéisée. Le pH final du milieu SIF est de pH = 8,18.
Protocole : L'objectif est de suivre l'évolution du diamètre des particules au cours du temps dans deux milieux simulés (gastrique SGF et intestinal SIF).
Le test est réalisé en deux temps : incubation en milieu gastrique (SGF) puis pour certains échantillons, en milieu intestinal (SIF). L'échantillon de particules lyophilisées est pesé (100 mg) dans des tubes de 15 mL.
La solution de fluide gastrique simulé SGF (10 mL) est ajoutée à T = 0 min.
Les tubes sont agités (agitateur rotatif 30 trs/min) à température ambiante. A 60 min les tubes sont centrifugés (2000 G, 1 min) afin d'éliminer le milieu SGF (surnageant), puis 5 mL de milieu SIF sont ajoutés.
Après agitation, une seconde centrifugation est réalisée (2000 G, 1 min), et le surnageant est éliminé.
Les culots sont resuspendus avec du milieu SIF neuf (10 mL) et les tubes sont de nouveaux agités (agitateur rotatif 30 trs/min). A chaque échéance les tubes sont sacrifiés, 1 ml d'acide chlorhydrique à (solution à 1 mol/L) est ajouté afin de dissoudre d'éventuels précipités de carbonate de calcium. L'analyse par granulométrie laser des particules présentes est réalisée immédiatement. L'évolution des diamètres moyens en volume ainsi que du span sont présentés dans le tableau 3 ci-dessous.
Conclusion :
Il apparaît que le diamètre médian des particules (D(V, 50 %)) n'est pas (ou très peu) modifié lors de l'incubation en milieu gastrique simulé (SGF). Lorsque le milieu SGF est remplacé par le milieu intestinal simulé (SIF) un gonflement intervient de manière rapide. Après 5 heures et demie, les diamètres moyens tendent à décroître, signe que les particules commencent à se désagréger.
Cette expérience met en lumière les capacités du système, à savoir : - une hydratation et un gonflement très faibles (voire inexistants) en milieu gastrique simulé puis - en milieu intestinal simulé, une hydratation et un gonflement significatifs préalablement à la dissociation des particules.
Exemple 3 : Préparation des particules (alqinate pectine DWPI amidon) contenant du Blue Dextran
Préparation de la formulation : L'alginate de sodium (36 mg/g) et la pectine (24 mg/g) sont dissous dans une solution saline (9 mg/g de NaCI) tamponnée par du phosphate de sodium dibasique (Na2FIP04, 26 mmol/L), sous agitation vigoureuse (agitation mécanique 1000 trs/min) à 40 °C, pendant 60 minutes. D'autre part l'isolat de protéine sérique (WPI pour Whey Protein Isolate) est solubilisé dans l'eau déminéralisée (100 mg/g) avant dénaturation thermique (80 °C, 30 min).
La formulation proprement dite est obtenue par ajout successif dans un bêcher de 600 mL agité mécaniquement (500 trs/min) d'une solution saline (9 mg/g de chlorure de sodium, 34,7 g), d'amidon (18,2 g), de la solution d'alginate et de pectine décrite précédemment (167,4 g), puis de la solution de WPI dénaturée thermiquement (nommée DWPI, 119,8 g) et enfin de 59,2 g d'une solution saline (9 mg/g) de Blue Dextran (M = 2 000 000 g/mol, 15 mg/g).
Le pH de la formulation est ajusté à une valeur proche de pH = 7,3 par ajout de 3 mL d'une solution d'hydroxyde de sodium (1 mol/L).
Le tableau 4 ci-dessous présente la composition théorique de la formulation obtenue :
La formulation décrite est pulvérisée dans une solution gélifiante de chlorure de calcium (concentration 100 mmol/L) agité par agitation mécanique douce.
Les particules produites sont collectées par filtration sur un tamis (maille de 63 pm).
Les teneurs en matière sèche sont obtenues par thermogravimétrie. La teneur en matière sèche de la formulation est de 104,3 +/- 1,4 mg/g et celle des particules humides de 95,5 +/- 0,7 mg/g. Les particules humides sont, dispersées dans 10 % d'eau déminéralisée, congelées à -20 °C puis lyophilisées (72 h).
Le lyophilisât obtenu présente une teneur en matière sèche de 985,0 +/-5,4 mg/g et une activité de l'eau (Aw) de 0,04 à 26,5 °C. L'analyse granulométrique des particules par diffraction laser est présentée dans le tableau 5 ci-dessous.
Conclusions :
Les particules obtenues sont parfaitement individualisées que ce soit sous forme humide ou que ce soit sous forme sèche, en témoigne l'analyse granulométrique.
La concentration en Blue Dextran mesurée par spectroscopie visible est de 1,75 +/- 0,01 mg/g pour les particules humides et de 20,00 +/- 0,74 mg/g pour les particules lyophilisées.
Exemple 4 : observation microscopique des particules préparées dans l'exemple 3 en milieux simulés : gastrique puis intestinal (en présence d’enzvmes)
Préparation d'un milieu gastrique simulé (SGB : L'eau déminéralisée est pesée (193,2 g) dans un flacon de 250 mL. Le chlorure de sodium est ajouté (0,41 g) et solubilisé sous agitation magnétique. Le pH est acidifié par ajout de 8,04 g d'acide chlorhydrique (concentration 1 mol/L). La solution obtenue est chauffée à 37 °C. La pepsine (1,210 g) est ajoutée et homogénéisée. Le pH final du milieu SGF est de pH = 1,43. La solution est utilisée à 37 °C.
Préparation d'un milieu Intestinal simulé (SIF) : L'eau déminéralisée est pesée (187,00 g) dans un flacon de 250 mL. Le phosphate de sodium dibasique (Na2HP04, 1,99 g), le chlorure de sodium (2,45 g) ainsi que l’hydrogénocarbonate de sodium (1,34) sont ajoutés et solubilisés sous agitation magnétique. Le pH est ajusté par ajout de 7,00 g d'hydroxyde de sodium (concentration 1 mol/L). La solution obtenue est chauffée à 37 °C. La pancréatine (4,00 g) est ajoutée et homogénéisée. Le pH final du milieu SIF est de pH = 9,15. La solution est utilisée à 37 °C.
Protocole : L'objectif est de suivre l'évolution de l'aspect des particules et du pH au cours du temps.
Le test est réalisé en deux temps : incubation à 37 °C en milieu gastrique (SGF) puis en milieu intestinal (SIF).
Les milieux sont préparés de manière à compenser le pH après ajout du milieu SIF directement sur le milieu SGF (mélange à 50/50 en volume). L'échantillon de particules sèches est pesé (60 mg) dans des tubes de 1,5 mL.
La solution de fluide gastrique simulé SGF (37 °C, 600 pL) est ajoutée à T = 0 h. Les tubes sont agités (agitateur rotatif 10 trs/min) dans une étuve à 37 °C. A T = 1 h, l'ensemble des tubes restants (sauf un qui servira de contrôle : 7 h en milieu SGF) sont complétés par le milieu SIF (37 °C, 600 pL). A chaque échéance, les tubes sont sacrifiés. Après centrifugation (5000 G, 2 min), le surnageant est éliminé. Le culot est resuspendu dans du milieu pour observation sous microscope.
En parallèle le même test est réalisé dans un tube de 15 mL (250 mg d'échantillon, 5 mL de SGF à T = 0 h, puis 5 mL de SIF à T = 1 h). Ce tube servira de témoin pour le suivi du pH.
Le suivi du pH au cours de l’incubation des particules lyophilisées est illustré dans le tableau 6 ci-dessous.
Le pH demeure stable que ce soit dans le milieu SGF (de T = 0 h à T = 1 h) ou après ajout du milieu SIF (de T = 1,02 h à T = 7 h). L’évolution de l’aspect des particules lyophilisées est suivie par microscopie optique.
En milieu SGF, les particules ne gonflent pas et restent cohésives (absence de dissociation) jusqu'à 7 h d'agitation à 37 °C. Ce résultat est cohérent avec les mesures de diamètre en granulométrie (exemple 2).
En milieu SIF (après un séjour de 1 h en milieu SGF), un gonflement des particules est observé avant qu'elles ne commencent à se dissocier à 2 h (soit 1 h dans le SIF). Après 4,5 h (soit 3,5 h dans le SIF) elles sont difficilement distinguables et après 7 h (soit 6 h dans le SIF) elles ne sont plus visibles (dissociation complète).
Conclusions :
Les observations confortent le mode d'action revendiqué pour ces formulations sous l'effet combiné du pH et des enzymes (d’une part, pas de gonflement en milieu gastrique simulé et, d’autre part, gonflement, dégradation et libération concomitante du principe actif).
Ce résultat est cohérent avec les mesures de diamètre en granulométrie (exemple 2). En comparaison de l’exemple 2, la présence d'enzyme accélère de manière évidente la vitesse de dissociation des particules hydratées en milieu SIF.
Exemple 5 : Cinétiques de libérations du Blue Dextran des particules préparées dans l’exemple 3 en milieux simulés : gastrique puis intestinal (en l'absence d’enzyme)
Les milieux sont préparés en l'absence d'enzyme car ces dernières créent une turbidité qui complique fortement les mesures en spectroscopie visible.
Préparation d'un milieu gastrique simulé (SGF) : L'eau déminéralisée est pesée (243,2 g) dans un flacon de 250 mL. Le chlorure de sodium est ajouté (0,51 g) et solubilisé sous agitation magnétique. Le pH est acidifié par ajout de 9,25 g d'acide chlorhydrique (concentration 1 mol/L). La solution obtenue est chauffée et utilisée à 37 °C. Le pH final du milieu SGF est de pH = 1,43.
Préparation d'un milieu Intestinal simulé (SIR : L'eau déminéralisée est pesée (243,0 g) dans un flacon de 250 mL. Le phosphate de sodium dibasique (NaaHPCU, 2,48 g), le chlorure de sodium (3,07 g) ainsi que l’hydrogénocarbonate de sodium (1,68) sont ajoutés et solubilisés sous agitation magnétique. Le pH est ajusté par ajout de 7,51 g d'hydroxyde de sodium (concentration 1 mol/L). La solution obtenue est chauffée et utilisée à 37 °C. Le pH final du milieu SIF est de pH = 9,31.
Protocole : L'objectif est de suivre la libération d'un composé (ici le Blue Dextran en spectroscopie) ainsi que l'évolution du pH au cours du temps.
Le test est réalisé en deux temps : incubation à 37^0 en milieu gastrique (SGF) puis en milieu intestinal (SIF). Les milieux sont préparés de manière à compenser le pH après ajout du milieu SIF directement sur le milieu SGF (mélange à 50/50 en volume). L'échantillon de particules est pesé (lyophilisât : 60 mg, particules humides : 500 mg) dans des tubes de 1,5 mL (analyse en triplicata : soit 3 tubes par échéance plus un « blanc » ne contenant que le milieu).
La solution de fluide gastrique simulé SGF (37 °C, lyophilisât : 600 pL, particules humides : 500 pL) est ajoutée à T = 0 h. Les tubes sont agités (agitateur rotatif 10 trs/min) dans l'étuve à 37 °C. A 1 h les tubes sont complétés par le milieu SIF (37 °C, lyophilisât : 600 pL, particules humides : 500 pL). A chaque échéance les tubes sont sacrifiés.
Après centrifugation (5000 G, 2 min), le surnageant est collecté.
Dans le cas de la partie SGF, 250 pL de surnageant sont collectés et 250 pL de milieu SIF ajouté dans une cuvette de spectroscopie UV (jetable) préalablement identifiée.
Dans le cas de la partie SIF, 500 pL de surnageant sont prélevés et réservés dans une cuvette de spectroscopie UV (jetable) préalablement identifiée.
Un volume de 100 pL d'acide chlorhydrique 1 M est ajouté dans chaque cuvette (afin de dissoudre d'éventuels précipités de carbonate de calcium).
En parallèle le même test est réalisé dans des tubes de 15 mL pour un échantillon de 100 mg de lyophilisât et un échantillon de 2 g de particules humides, complétés par 2 ml_ de SGF (à T = 0 h), puis 2 mL de SIF (à T = 1 h). Ces tubes serviront de témoins pour le suivi du pH.
Le suivi du pH est illustré dans le tableau 7 ci-dessous :
Le pH demeure stable pour le milieu SGF (de T = 0 h à T =1 h) ou après ajout du SIF (de T = 1,1 h à T = 24 h)
La libération cumulée de Blue Dextran par les particules humides ou lyophilisées en milieux gastrique simulé puis intestinal simulé (SGF puis SIF), est présentée dans le tableau 8 ci-dessous.
Discussion des résultats :
En milieu gastrique simulé (SGF), une libération minime du Blue Dextran est constatée après 1 h d’incubation ; la conclusion est la même après 7 h d’incubation (inférieur à 2,5 %).
En milieu intestinal simulé (après 1 h dans le SGF), le déclenchement de la libération est concomitant avec la modification du milieu (élévation du pH, présence d’ions complexant le calcium). Dans ces conditions il est à noter que les particules humides libèrent plus rapidement le Blue Dextran (pente plus importante). Ce phénomène peut être expliqué par le fait que les particules lyophilisées doivent au préalable se réhydrater (ce qui n'est pas le cas des particules humides).
Dans les deux cas (particules humides ou lyophilisées), la libération du Blue Dextran est partielle à 24 h (respectivement 34,7 % +/- 3,8 % et 41,5 % +/- 1,0 %). Ce phénomène est explicable par la quantité limitée de complexant du calcium associé à l'absence d'enzyme (il a été démontré dans l'exemple 4 que la présence d'enzyme dans ces mêmes conditions permettait de dissocier totalement les particules).
Conclusions :
Cet exemple démontre la capacité des particules humides ou lyophilisées à : - d’une part, immobiliser une macromolécule (à plus forte raison une cellule ou un microorganisme) à pH acide en conditions gastriques simulées en limitant très fortement sa libération et en limitant potentiellement la dégradation (activité enzymatique combinée au pH), et - d'autre part, à libérer la macromolécule selon une cinétique prédéterminée lors de la modification des conditions environnementales (conditions intestinales simulées, pH neutre). La cinétique de libération pouvant en particulier être modulée par l'utilisation de particules sous forme humide ou lyophilisée.
Exemple 6 : Encapsulation de Lactococcus lactis ssd lactis au sein de particules (alqinate pectine amidon)
Préparation de la formulation : L'alginate de sodium (36 mg/g) et la pectine (24 mg/g) sont dissout dans une solution saline (9 mg/g de NaCI) et tamponnée par du phosphate de sodium dibasique (Na2HP04, 25 mmol/L), sous agitation vigoureuse (agitation mécanique 1000 trs/min) à 40 °C, pendant 60 minutes.
La formulation proprement dite est obtenue par ajout successif dans un bêcher de 250 mL agité mécaniquement (300 trs/min) : d'une solution saline (9 mg/g de chlorure de sodium, 80,96 g), d'amidon (14,95 g), de la solution d'alginate et de pectine décrite précédemment (83,25 g). Le pH de la formulation est ajusté à une valeur de pH = 7,2 par ajout de 0,8 g d'une solution d'hydroxyde de sodium (1 mol/L). Une suspension de la souche bactérienne (Lactococcus lactis ssp lactis, concentration 2,2 x 1010 UFC/g) en solution saline (9 mg/g) est ajoutée (19,97 g). Le pH de la formulation est : pH = 6,9.
Le tableau 9 ci-dessous présente la composition théorique de la formulation obtenue :
*La teneur en Lactococcus lactis ssp lactis est donnée en UFC/g (UFC : unité formant colonie)
La formulation décrite est pulvérisée dans une solution gélifiante de chlorure de calcium (concentration 100 mmol/L) agité par agitation mécanique douce. Les particules produites sont collectées par filtration sur un tamis (maille de 40 pm). L'analyse granulométrique des particules humides est présentée dans le tableau 10 ci-dessous.
Les particules humides sont dispersées dans 11 % d'eau déminéralisée, congelées à -20 °C puis lyophilisées (92 h). Le lyophilisât obtenu présente une teneur en matière sèche de 962,1 +/- 3,3 mg/g et une activité de l'eau (Aw) de 0,04 à 23,1 °C. La concentration bactérienne dans les particules lyophilisées est de 5,0 x 108 UFC/g.
Exemple 7 : Encapsulation de Lactococcus lactis ssp lactis au sein de particules (alainate pectine DWPI amidon)
Préparation de la formulation : L'alginate de sodium (36 mg/g) et la pectine (24 mg/g) sont dissouts dans une solution saline (9 mg/g de NaCI) et tamponnée par du phosphate de sodium dibasique (Na2HPC>4, 25 mmol/L), sous agitation vigoureuse (agitation mécanique 1000 trs/min) à 40 °C, pendant 60 minutes.
La formulation proprement dite est obtenue par ajout successif dans un bêcher de 250 mL agité mécaniquement (300 trs/min) : d'une solution saline (9 mg/g de chlorure de sodium, 26,69 g), d'amidon (8,98 g), de la solution d'alginate et de pectine décrite précédemment (83,51 g), puis de la solution de WPI dénaturée thermiquement (nommée DWPI, 60,22 g).
Une formulation similaire est préparée sans ajout de la solution de DWPI, pour évaluer l’influence de cette dernière sur le taux de survie des bactéries (exemple 6).
Le pH de la formulation est ajusté à une valeur de pH = 7,3 par ajout de 0,8 g d'une solution d'hydroxyde de sodium (1 mol/L).
Une suspension de la souche bactérienne (Lactococcus lactis ssp lactis, concentration 2,2 x 1010 UFC/g) en solution saline (9 mg/g) est ajoutée (20,05 g). Le pH de la formulation est : pH = 6,9.
Le tableau 11 ci-dessous présente la composition théorique de la formulation obtenue :
La teneur en Lactococcus lactis ssp lactis est donnée en UFC/g (UFC : unité formant colonie).
La formulation décrite est pulvérisée dans une solution gélifiante de chlorure de calcium (concentration 100 mmol/L) agité par agitation mécanique douce. Les particules produites sont collectées par filtration sur un tamis (maille de 40 pm). L'analyse granulométrique des particules humides est présentée dans le tableau 12 ci-dessous.
Les particules humides sont dispersées dans 12 % d'eau déminéralisée, congelées à -20 °C puis lyophilisées (92 h). Le lyophilisât obtenu présente une teneur en matière sèche de 961,3 +/- 9,3 mg/g et une activité de l'eau (Aw) de 0,04 à 23,2 °C. La concentration bactérienne dans les particules lyophilisées est de 8,3 x 108 UFC/g.
Exemple 8 : Encapsulation de Lactococcus lactis ssp lactis au sein de particules (alainate pectine shellac amidon)
Préparation de la formulation L'alginate de sodium (36 mg/g) et la pectine (24 mg/g) sont dissouts dans une solution saline (9 mg/g de NaCI) et tamponnée par du phosphate de sodium dibasique (Na2HP04, 25 mmol/L), sous agitation vigoureuse (agitation mécanique 1000 trs/min) à 40 °C, pendant 60 minutes.
La formulation proprement dite est obtenue par ajout successif dans un bêcher de 250 mL agité mécaniquement (300 trs/min) : d'une solution saline (9 mg/g de chlorure de sodium, 63,90 g), d'amidon (8,95 g), de la solution d'alginate et de pectine décrite précédemment (83,15 g), puis de la solution de shellac (23,85 g). Le pH de la formulation est de pH = 6,9. Une suspension de la souche bactérienne (Lactococcus lactis ssp lactis, concentration 2,2 x 1010 UFC/g) en solution saline (9 mg/g) est ajoutée (20,06 g). Le pH de la formulation est : pH = 6,8.
Le tableau 13 ci-dessous présente la composition théorique de la formulation obtenue :
La teneur en Lactococcus lactis ssp lactis est donnée en UFC/g (UFC : unité formant colonie).
La formulation décrite est pulvérisée dans une solution gélifiante de chlorure de calcium (concentration 100 mmol/L) agitée par agitation mécanique douce. Les particules produites sont collectées par filtration sur un tamis (maille de 40 pm). L'analyse granulométrique des particules humides est présentée dans le tableau 14 ci-dessous.
Les particules humides sont dispersées dans 12 % d'eau déminéralisée, congelées à -20 °C puis lyophilisées (92 h). Le lyophilisât obtenu présente une teneur en matière sèche de 966,6 +/- 15,1 mg/g et une activité de l'eau (Aw) de 0,04 à 23,5 °C. La concentration bactérienne dans les particules lyophilisées est de 8,5 x 107 UFC/g.
Exemple 9 : Détermination du taux de survie des bactéries L. lactis ssp lactis encapsulée ou non, en milieu gastrique simulé (en l’absence d’enzyme)
Préparation d'un milieu gastrique simulé (SGF) : L'eau déminéralisée est pesée (195,60 g) dans un flacon de 250 mL placé sous agitation magnétique. Le chlorure de sodium est ajouté (1,84 g). La pepsine est ajoutée à la solution obtenue (0,61 g). Le pH final du milieu SGF est de pH = 3,99. Le pH sera acidifié par ajout d'acide chlorhydrique (concentration 1 mol/L) directement dans chaque tube contenant les échantillons.
Protocole : L'objectif est de mesurer la concentration bactérienne au cours du temps en condition gastrique simulée et d'en déduire le taux de survie des bactéries afin de pouvoir classer les différentes formulations en termes d'efficacité protection, à savoir les compositions alginate-pectine-amidon (exemple 6), alginate-pectine-amidon-DWPI (exemple 7), alginate-pectine-amidon-shellac (exemple 8) et un contrôle (lyophilisât de bactéries non encapsulées). L'échantillon de lyophilisât (qu'il s'agisse des particules ou du contrôle non encapsulé) est pesé (100 mg environ) dans des tubes stériles de 15 mL. La solution de fluide gastrique simulé SGF (37 °C, 10 mL) est ajoutée à T = 0 min.
Les solutions sont acidifiées par ajout d'acide chlorhydrique (concentration 1 mol/L, voir tableau 15 ci-dessous), afin d’ajuster le pH à une valeur proche de pH = 3. Les tubes sont agités (agitateur rotatif 20 trs/min) à 37 °C. A 30 min, puis 60 min ; un volume de 1 mL de suspension est prélevé et ajouté à un tube de 15 mL contenant 9 mL de solution de tri-citrate de sodium (concentration 75 mmol/L) afin de dissocier les particules et libérer les bactéries du réseau de biopolymère (agitateur rotatif 20 trs/min, 30 min, à 30 °C). L'échantillon est par la suite dilué de manière sérielle au 1/10eme dans une solution saline (9 mg/g). L'échantillon (0,1 mL) est prélevé et étalé sur milieu gélosé (agar M17, Biokar). Les boites sont incubées à 30 °C durant 48-72 heures avant dénombrement des colonies bactériennes.
Tableau 15
Le tableau 16 ci-dessous présente les pertes de viabilité en milieu gastrique simulé (SGF), exprimées en log UFC/g (soit log (concentration cellulaire finale) - log (concentration cellulaire initiale)), après 30 min et 60 min en milieu gastrique simulé.
Tableau 16
Conclusions :
Le pH des échantillons est assez homogène et proche de pH = 3,0.
Le tableau 16 met en évidence l'effet de l'encapsulation sur l'amélioration de la survie de la souche en conditions gastriques simulées.
La formulation alginate pectine amidon ne permet pas d'améliorer de façon significative le taux de survie en particulier après 1 h d'incubation (-4,15 log CFU/g comparé à -4,67 log CFU/g).
Les formulations de particules comportant de la DWPI ou du shellac permettent de réduire de manière significative les pertes par rapport au contrôle non encapsulé, jusqu'à plus de 3 log UFC/g après 30 min et plus de 2 log UFC/g après 60 min, pour la formulation alginate-pectine-shellac.
Cet exemple démontre la capacité des particules à améliorer le taux de survie de la souche L. lactis ssp lactis en milieu gastrique simulé (mise en évidence des capacités de protection de l'actif encapsulé vis-à-vis des conditions gastriques simulées) et l'importance de la présence de la DWPI ou du shellac à cette fin.
Claims (13)
- REVENDICATIONS1. Composition pour l’administration par voie orale d’au moins un principe actif à un sujet, caractérisée en ce que ladite composition comprend des particules d’hydrogel comprenant : - ledit au moins un principe actif, - au moins un polysaccharide gélifiant, - au moins un agent de charge, et - au moins un agent protecteur, choisi parmi les protéines et/ou les résines alimentaires, aptes à conférer une protection dudit au moins un principe actif dans un milieu dont le pH est inférieur à 5,5, et en ce que ledit au moins un polysaccharide gélifiant et/ou ledit au moins un agent protecteur sont choisis parmi les polysaccharides gélifiants et/ou agents protecteurs adaptés à une libération, par lesdites particules, d’au moins une partie dudit au moins un principe actif dans un milieu dont le pH est supérieur à 5,5.
- 2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit au moins un polysaccharide gélifiant est d'origine végétale ou microbienne, avantageusement choisi parmi l’agar, l’alginate, l’amidon, le carraghénane, les dérivés cellulosiques, le dextran, la gomme arabique, la gomme de caroube, la gomme de guar, la gomme gellane, la gomme de xanthane et la pectine.
- 3. Composition selon la revendication 2, caractérisée en ce que les particules comprennent une combinaison d’alginate et de pectine en tant que polysaccharides gélifiants.
- 4. Composition selon la revendication 3, caractérisée en ce que la teneur en alginate est inférieure à 600 mg/g de matière sèche des particules, préférentiellement entre 50 mg/g et 200 mg/g, et en ce que la teneur en pectine est inférieure à 600 mg/g de matière sèche des particules, préférentiellement entre 50 mg/g et 200 mg/g.
- 5. Composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que ledit au moins un polysaccharide gélifiant est choisi parmi les polysaccharides présentant des fonctions acides faibles, dont le pKa de 2,0 à 5,0, avantageusement de 3,0 à 4,0.
- 6. Composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que ledit au moins un agent de charge est sélectionné parmi l’amidon, la silice ou l’argile.
- 7. Composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que la teneur dudit au moins agent de charge est inférieure à 900 mg/g de matière sèche des particules, préférentiellement entre 200 mg/g et 800 mg/g.
- 8. Composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que ledit au moins un agent protecteur est choisi parmi : - les protéines de lait, les gélatines, les protéines végétales, et/ou - la gomme de shellac.
- 9. Composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que : - la teneur de ladite au moins une protéine est inférieure à 700 mg/g de matière sèche des particules, préférentiellement entre 200 mg/g et 400 mg/g, et/ou - la teneur de ladite au moins une résine alimentaire est inférieure à 700 mg/g de matière sèche des particules, préférentiellement entre 200 mg/g et 400 mg/g.
- 10. Composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que lesdites particules consistent en des particules dont le diamètre est compris entre 1 pm et 10 mm, préférentiellement entre 10 pm et 500 pm et plus préférentiellement encore entre 50 pm et 200 pm.
- 11. Composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que les particules sont : - sous forme humide, présentant avantageusement des teneurs en eau inférieures à 990 mg/g desdites particules, préférentiellement entre 500 mg/g et 950 mg/g, ou - sous forme sèche, présentant avantageusement des teneurs en eau inférieures à 200 mg/g desdites particules, préférentiellement entre 5 mg/g et 100 mg/g et plus particulièrement entre 10 mg/g et 50 mg/g.
- 12. Composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 11, destinée à être utilisé comme médicament, de préférence destinée à être utilisée pour la vaccination par voie orale dudit sujet humain ou animal.
- 13. Utilisation non-thérapeutique d’une composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 11, pour adresser ledit au moins un principe actif au sein du tractus digestif d’un sujet de manière, d’une part, à protéger ledit au moins un principe actif vis-à-vis d’un milieu dont le pH est inférieur à 5,5 et, d’autre part, à libérer au moins une partie dudit au moins un principe actif dans un milieu dont le pH est supérieur à 5,5.
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