CN104911171A - 以海藻酸钠、明胶复合凹土制备益生菌微胶囊的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了以海藻酸钠、明胶复合凹土制备益生菌微胶囊的方法，该方法首先是纯化凹土，其次将凹土与海藻酸钠、明胶混合成复合壁材，接着将已制备好的益生菌菌悬液在一定的条件下与上述复合壁材混合均匀，然后缓慢滴入CaCl2中固化成型，最后真空冷冻法干燥，获得益生菌微胶囊；本发明以海藻酸钠、明胶复合凹土作为壁材，既发挥靶向性和控释性，又提高其机械强度，该胶囊提高益生菌制备过程中的存活率以及经过胃环境到达肠的存活率。
Description
技术领域
本发明涉及益生菌微胶囊制备方法，具体涉及以海藻酸钠、明胶复合凹土制备益生菌微胶囊的方法。
背景技术
益生菌常因高强度的生产加工而大量失活，常规添加手段不能保护益生菌免受喂饲过程的胃酸、胆盐以及消化酶等的作用，导致活菌数大幅下降，因此很难有足够数量的活菌到达肠道并定居于肠黏膜上而发挥其生理功能。包埋是提高益生菌活性的一种有效方法。研究发现微胶囊包埋技术是最好方法之一，并成为目前国内外研究的热点。
微胶囊技术是一种用成膜材料（即壁材）把某种物质（即芯材）包覆并使之形成微小粒子的技术，得到的微小粒子叫做微胶囊，其粒径一般在微米到毫米范围。微胶囊技术最大的特点是芯材可根据需要在恰当的时间和位置以一定的速率进行释放。采用肠溶性壁材后，能防止胃液的破坏，而使尽可能多的菌体到达肠道，真正起到保健和治疗的作用。益生菌微胶囊化常用的方法是挤压法、乳化法、喷雾干燥法、复凝聚法和淀粉粘附法等。
微胶囊包埋存在的问题除了制备方法外，壁材的选用成为关键，目前一般选用如海藻酸钠、明胶等有机高分子材料。凹凸棒石粘土简称凹土，是一种天然非金属粘土矿物，具有较好吸附性、胶体性、粘结性、催化性等。凹土富含生物活性物质，可作为益生菌载体制备益生菌制剂。
发明内容
本发明的目的在于：提供一种以海藻酸钠、明胶复合凹土制备益生菌微胶囊的方法，以海藻酸钠、明胶复合凹土作为壁材，既发挥靶向性和控释性方面的优异性能，又提高其机械强度，该胶囊提高益生菌制备过程中的存活率以及经过胃环境到达肠的存活率。
本发明的技术解决方案是：该方法首先是纯化凹土，其次将凹土与海藻酸钠、明胶混合成复合壁材，接着将已制备好的益生菌菌悬液在一定的条件下与上述复合壁材混合均匀，然后缓慢滴入CaCl2中固化成型，最后真空冷冻法干燥，获得益生菌微胶囊。
本发明的制备方法包括以下具体步骤：
第一步凹土的纯化：将凹土采用电导率低于5μs/cm的去离子水浸泡20~28h，搅拌器以1000~1500rpm转速搅拌20~28h，静置分层，取中间层凹土悬液，以其5~20%的量继续加入上述去离子水，同样操作，重复2~3次，于105~120℃烘干，研磨，过筛，取200目至140目细土备用；
第二步益生菌菌悬液的制备：将枯草芽孢杆菌、双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、粪链球菌、地衣芽孢杆菌或酵母菌培养至对数生长期后期，收集菌体，采用无菌生理盐水洗涤去培养基，将菌体悬浮于pH为2~9的磷酸盐缓冲体系中，并将浓度调节至109~1010CFU/ml备用；
第三步壁材与益生菌混合溶液的制备：将5-50g的海藻酸钠、0-50g的明胶和1-40g的凹土悬浮至10L的菌悬液中，混合均匀；
第四步微胶囊固化成型：将上述壁材与益生菌的混合溶液缓慢滴加入离子强度为0.01-2mol/L、pH5-8磷酸盐缓冲液配制的浓度为1-50g/L的CaCl2中，于20-40℃固化成型10-100分钟，获得粒径大小为100-2000μm的微胶囊粒子；
第五步真空冷冻干燥法获得益生菌微胶囊制剂：真空冷冻干燥法条件为：上述微胶囊粒子于-40~-75℃预冻2~3小时，迅速移入冷冻干燥机冷冻干燥20~28小时，使微囊制剂含水量≤2%，检测活菌剂中活菌数为109~1012CFU/g。
枯草芽孢杆菌培养条件是：培养基为葡萄糖5g、蛋白胨10g、酵母膏5g、氯化钠5g，蒸馏水1000ml，pH7.2；35℃振荡培养18h，摇床转速为180rpm。
双歧杆菌培养条件是：培养基为蛋白胨15g，葡萄糖15g，酵母膏4g，牛肉膏4g，NaCl 5g，Na2HPO4 2.5g，蒸馏水1000ml，pH7；35℃静置培养22小时。
嗜酸乳杆菌培养条件是：培养基为蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，柠檬酸氢二铵2g，葡萄糖20g，吐温-80 1ml，CH3COONa·3H2O 5g，K2HPO4·3H2O 2g，MgSO4·7H2O 0.58g，MnSO4·H2O 0.25g，蒸馏水1000ml，调pH6.2-6.4；37℃静置培养20小时。
嗜热链球菌培养条件是：培养基同嗜酸乳杆菌；40℃静置培养20小时。
保加利亚乳杆菌培养条件是：培养基同嗜酸乳杆菌；37℃静置培养20小时。
鼠李糖乳杆菌培养条件是：培养基同嗜酸乳杆菌；37℃静置培养20小时。
粪链球菌培养条件是：培养基为蛋白胨2g，牛肉膏2g，乳糖2g，蒸馏水1000ml，pH6.8；37℃振荡培养6h，摇床转速为100rpm。
地衣芽孢杆菌培养条件是：培养基为葡萄糖5g，蛋白胨5g，K2HPO4 2g，MgSO4 2g，蒸馏水1000ml，pH 7.0；37℃振荡培养40h，摇床转速为180rpm。
酵母菌培养条件是：培养基为马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL，pH自然；28℃振荡培养18h，摇床转速为150rpm。
本发明的优点是：采用海藻酸钠、明胶复合凹土制备益生菌微胶囊，和单纯凹土制得的活菌制剂在真空冷冻过程中和在人工模拟胃环境中的存活率要高得多，在人工肠环境中能较长时间地维持高活菌水平。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术解决方案，这些实施例不能理解为是对技术方案的限制。
实施例1：依以下步骤制备益生菌微胶囊制剂
第一步凹土的纯化：将凹土采用电导率低于5μs/cm的去离子水浸泡20h，搅拌器以1000rpm转速搅拌20h，静置分层，取中间层凹土悬液，以其5%的量继续加入上述去离子水，同样操作，重复2次，于105℃烘干，研磨，过筛，取200目至140目细土备用；
第二步益生菌菌悬液的制备：将枯草芽孢杆菌培养至对数生长期后期，收集菌体，采用无菌生理盐水洗涤去培养基，将菌体悬浮于pH为2的磷酸盐缓冲体系中，并将浓度调节至109CFU/ml备用；枯草芽孢杆菌培养条件是：培养基为葡萄糖5g、蛋白胨10g、酵母膏5g、氯化钠5g，蒸馏水1000ml，pH7.2；35℃振荡培养18h，摇床转速为180rpm；
第三步壁材与益生菌混合溶液的制备：将5g海藻酸钠和1g的凹土悬浮至10L的菌悬液中，混合均匀；
第四步微胶囊固化成型：将上述壁材与益生菌的混合溶液缓慢滴加入离子强度为0.01mol/L、pH5磷酸盐缓冲液配制的浓度为1g/L的CaCl2中，于20℃固化成型10分钟，获得粒径大小为100μm大小的微胶囊粒子；
第五步真空冷冻干燥法获得益生菌微胶囊制剂：真空冷冻干燥法条件为：上述微胶囊粒子于-40℃预冻3小时，迅速移入冷冻干燥机冷冻干燥20小时，使微囊制剂含水量≤2%，检测活菌剂中活菌数为109CFU/g。
实施例2：依以下步骤制备益生菌微胶囊制剂
第一步凹土的纯化：将凹土采用电导率低于5μs/cm的去离子水浸泡21h，搅拌器以1100rpm转速搅拌21h，静置分层，取中间层凹土悬液，以其10%的量继续加入上述去离子水，同样操作，重复3次，于110℃烘干，研磨，过筛，取200目至140目细土备用；
第二步益生菌菌悬液的制备：将双歧杆菌培养至对数生长期后期，收集菌体，采用无菌生理盐水洗涤去培养基，将菌体悬浮于pH为3的磷酸盐缓冲体系中，并将浓度调节至1010CFU/ml备用；双歧杆菌培养条件是：培养基为蛋白胨15g，葡萄糖15g，酵母膏4g，牛肉膏4g，NaCl 5g，Na2HPO4 2.5g，蒸馏水1000ml，pH7；35℃静置培养22小时；
第三步壁材与益生菌混合溶液的制备：将10g的海藻酸钠、1g的明胶和5g的凹土悬浮至10L的菌悬液中，混合均匀；
第四步微胶囊固化成型：将上述壁材与益生菌的混合溶液缓慢滴加入离子强度为0.05mol/L、pH6磷酸盐缓冲液配制的浓度为5g/L的CaCl2中，于25℃固化成型20分钟，获得粒径大小为500μm大小的微胶囊粒子；
第五步真空冷冻干燥法获得益生菌微胶囊制剂：真空冷冻干燥法条件为：上述微胶囊粒子于-45℃预冻2小时，迅速移入冷冻干燥机冷冻干燥21小时，使微囊制剂含水量≤2%，检测活菌剂中活菌数为1010CFU/g。
实施例3：依以下步骤制备益生菌微胶囊制剂
第一步凹土的纯化：将凹土采用电导率低于5μs/cm的去离子水浸泡22h，搅拌器以1200rpm转速搅拌22h，静置分层，取中间层凹土悬液，以其15%的量继续加入上述去离子水，同样操作，重复2次，于115℃烘干，研磨，过筛，取200目至140目细土备用；
第二步益生菌菌悬液的制备：将嗜酸乳杆菌培养至对数生长期后期，收集菌体，采用无菌生理盐水洗涤去培养基，将菌体悬浮于pH为2~9的磷酸盐缓冲体系中，并将浓度调节至109~1010CFU/ml备用；嗜酸乳杆菌培养条件是：培养基为蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，柠檬酸氢二铵2g，葡萄糖20g，吐温-80 1ml，CH3COONa·3H2O 5g，K2HPO4·3H2O 2g，MgSO4·7H2O 0.58g，MnSO4·H2O 0.25g，蒸馏水1000ml，调pH6.2-6.4；37℃静置培养20小时；
第三步壁材与益生菌混合溶液的制备：将15g的海藻酸钠、5g的明胶和10g的凹土悬浮至10L的菌悬液中，混合均匀；
第四步微胶囊固化成型：将上述壁材与益生菌的混合溶液缓慢滴加入离子强度为0.10 mol/L、pH7磷酸盐缓冲液配制的浓度为10g/L的CaCl2中，于30℃固化成型30分钟，获得粒径大小为1000μm大小的微胶囊粒子；
第五步真空冷冻干燥法获得益生菌微胶囊制剂：真空冷冻干燥法条件为：上述微胶囊粒子于-50℃预冻3小时，迅速移入冷冻干燥机冷冻干燥22小时，使微囊制剂含水量≤2%，检测活菌剂中活菌数为1011CFU/g。
实施例4：依以下步骤制备益生菌微胶囊制剂
第一步凹土的纯化：将凹土采用电导率低于5μs/cm的去离子水浸泡23h，搅拌器以1300rpm转速搅拌23h，静置分层，取中间层凹土悬液，以其20%的量继续加入上述去离子水，同样操作，重复3次，于120℃烘干，研磨，过筛，取200目至140目细土备用；
第二步益生菌菌悬液的制备：将嗜热链球菌培养至对数生长期后期，收集菌体，采用无菌生理盐水洗涤去培养基，将菌体悬浮于pH为5的磷酸盐缓冲体系中，并将浓度调节至1010CFU/ml备用；嗜热链球菌培养条件是：培养基同嗜酸乳杆菌；40℃静置培养20小时；
第三步壁材与益生菌混合溶液的制备：将20g的海藻酸钠、20g的明胶和15g的凹土悬浮至10L的菌悬液中，混合均匀；
第四步微胶囊固化成型：将上述壁材与益生菌的混合溶液缓慢滴加入离子强度为0.5mol/L、pH8磷酸盐缓冲液配制的浓度为15g/L的CaCl2中，于35℃固化成型40分钟，获得粒径大小为1500μm大小的微胶囊粒子；
第五步真空冷冻干燥法获得益生菌微胶囊制剂：真空冷冻干燥法条件为：上述微胶囊粒子于-55℃预冻3小时，迅速移入冷冻干燥机冷冻干燥23小时，使微囊制剂含水量≤2%，检测活菌剂中活菌数为1012CFU/g。
实施例5：依以下步骤制备益生菌微胶囊制剂
第一步凹土的纯化：将凹土采用电导率低于5μs/cm的去离子水浸泡24h，搅拌器以1400rpm转速搅拌24h，静置分层，取中间层凹土悬液，以其5%的量继续加入上述去离子水，同样操作，重复2次，于105℃烘干，研磨，过筛，取200目至140目细土备用；
第二步益生菌菌悬液的制备：将保加利亚乳杆菌培养至对数生长期后期，收集菌体，采用无菌生理盐水洗涤去培养基，将菌体悬浮于pH为6的磷酸盐缓冲体系中，并将浓度调节至109CFU/ml备用；保加利亚乳杆菌培养条件是：培养基同嗜酸乳杆菌；37℃静置培养20小时；
第三步壁材与益生菌混合溶液的制备：将25g的海藻酸钠、20g的明胶和20g的凹土悬浮至10L的菌悬液中，混合均匀；
第四步微胶囊固化成型：将上述壁材与益生菌的混合溶液缓慢滴加入离子强度为1mol/L、pH5磷酸盐缓冲液配制的浓度为20g/L的CaCl2中，于40℃固化成型50分钟，获得粒径大小为2000μm大小的微胶囊粒子；
第五步真空冷冻干燥法获得益生菌微胶囊制剂：真空冷冻干燥法条件为：上述微胶囊粒子于-60℃预冻2小时，迅速移入冷冻干燥机冷冻干燥24小时，使微囊制剂含水量≤2%，检测活菌剂中活菌数为109CFU/g。
实施例6：依以下步骤制备益生菌微胶囊制剂
第一步凹土的纯化：将凹土采用电导率低于5μs/cm的去离子水浸泡25h，搅拌器以1500rpm转速搅拌25h，静置分层，取中间层凹土悬液，以其10%的量继续加入上述去离子水，同样操作，重复3次，于110℃烘干，研磨，过筛，取200目至140目细土备用；
第二步益生菌菌悬液的制备：将鼠李糖乳杆菌培养至对数生长期后期，收集菌体，采用无菌生理盐水洗涤去培养基，将菌体悬浮于pH为7的磷酸盐缓冲体系中，并将浓度调节至1010CFU/ml备用；鼠李糖乳杆菌培养条件是：培养基同嗜酸乳杆菌；37℃静置培养20小时；
第三步壁材与益生菌混合溶液的制备：将30g的海藻酸钠、25g的明胶和25g的凹土悬浮至10L的菌悬液中，混合均匀；
第四步微胶囊固化成型：将上述壁材与益生菌的混合溶液缓慢滴加入离子强度为1.5mol/L、pH6磷酸盐缓冲液配制的浓度为25g/L的CaCl2中，于20℃固化成型60分钟，获得粒径大小为100μm大小的微胶囊粒子；
第五步真空冷冻干燥法获得益生菌微胶囊制剂：真空冷冻干燥法条件为：上述微胶囊粒子于-65℃预冻3小时，迅速移入冷冻干燥机冷冻干燥25小时，使微囊制剂含水量≤2%，检测活菌剂中活菌数为1010CFU/g。
实施例7：依以下步骤制备益生菌微胶囊制剂
第一步凹土的纯化：将凹土采用电导率低于5μs/cm的去离子水浸泡26h，搅拌器以1000rpm转速搅拌26h，静置分层，取中间层凹土悬液，以其15%的量继续加入上述去离子水，同样操作，重复2次，于115℃烘干，研磨，过筛，取200目至140目细土备用；
第二步益生菌菌悬液的制备：将粪链球菌培养至对数生长期后期，收集菌体，采用无菌生理盐水洗涤去培养基，将菌体悬浮于pH为8的磷酸盐缓冲体系中，并将浓度调节至109CFU/ml备用；粪链球菌培养条件是：培养基为蛋白胨2g，牛肉膏2g，乳糖2g，蒸馏水1000ml，pH6.8；37℃振荡培养6h，摇床转速为100rpm；
第三步壁材与益生菌混合溶液的制备：将40g的海藻酸钠、40g的明胶和30g的凹土悬浮至10L的菌悬液中，混合均匀；
第四步微胶囊固化成型：将上述壁材与益生菌的混合溶液缓慢滴加入离子强度为2mol/L、pH7磷酸盐缓冲液配制的浓度为35g/L的CaCl2中，于30℃固化成型70分钟，获得粒径大小为500μm大小的微胶囊粒子；
第五步真空冷冻干燥法获得益生菌微胶囊制剂：真空冷冻干燥法条件为：上述微胶囊粒子于-70℃预冻2小时，迅速移入冷冻干燥机冷冻干燥26小时，使微囊制剂含水量≤2%，检测活菌剂中活菌数为1011CFU/g。
实施例8：依以下步骤制备益生菌微胶囊制剂
第一步凹土的纯化：将凹土采用电导率低于5μs/cm的去离子水浸泡27h，搅拌器以1250rpm转速搅拌27h，静置分层，取中间层凹土悬液，以其12.5%的量继续加入上述去离子水，同样操作，重复3次，于115℃烘干，研磨，过筛，取200目至140目细土备用；
第二步益生菌菌悬液的制备：将地衣芽孢杆菌培养至对数生长期后期，收集菌体，采用无菌生理盐水洗涤去培养基，将菌体悬浮于pH为2~9的磷酸盐缓冲体系中，并将浓度调节至109~1010CFU/ml备用；地衣芽孢杆菌培养条件是：培养基为葡萄糖5g，蛋白胨5g，K2HPO4 2g，MgSO4 2g，蒸馏水1000ml，pH 7.0；37℃振荡培养40h，摇床转速为180rpm；
第三步壁材与益生菌混合溶液的制备：将45g的海藻酸钠、45g的明胶和35g的凹土悬浮至10L的菌悬液中，混合均匀；
第四步微胶囊固化成型：将上述壁材与益生菌的混合溶液缓慢滴加入离子强度为0.01mol/L、pH8磷酸盐缓冲液配制的浓度为45g/L的CaCl2中，于30℃固化成型85分钟，获得粒径大小为1000μm大小的微胶囊粒子；
第五步真空冷冻干燥法获得益生菌微胶囊制剂：真空冷冻干燥法条件为：上述微胶囊粒子于-75℃预冻3小时，迅速移入冷冻干燥机冷冻干燥27小时，使微囊制剂含水量≤2%，检测活菌剂中活菌数为1012CFU/g。
实施例9：依以下步骤制备益生菌微胶囊制剂
第一步凹土的纯化：将凹土采用电导率低于5μs/cm的去离子水浸泡28h，搅拌器以1500rpm转速搅拌28h，静置分层，取中间层凹土悬液，以其20%的量继续加入上述去离子水，同样操作，重复3次，于120℃烘干，研磨，过筛，取200目至140目细土备用；
第二步益生菌菌悬液的制备：将酵母菌培养至对数生长期后期，收集菌体，采用无菌生理盐水洗涤去培养基，将菌体悬浮于pH为9的磷酸盐缓冲体系中，并将浓度调节至1010CFU/ml备用；酵母菌培养条件是：培养基为马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL，pH自然；28℃振荡培养18h，摇床转速为150rpm；
第三步壁材与益生菌混合溶液的制备：将50g的海藻酸钠、50g的明胶和40g的凹土悬浮至10L的菌悬液中，混合均匀；
第四步微胶囊固化成型：将上述壁材与益生菌的混合溶液缓慢滴加入离子强度为2mol/L、pH8磷酸盐缓冲液配制的浓度为50g/L的CaCl2中，于40℃固化成型100分钟，获得粒径大小为2000μm大小的微胶囊粒子；
第五步真空冷冻干燥法获得益生菌微胶囊制剂：真空冷冻干燥法条件为：上述微胶囊粒子于-75℃预冻2小时，迅速移入冷冻干燥机冷冻干燥28小时，使微囊制剂含水量≤2%，检测活菌剂中活菌数为1011CFU/g。
实施例1-9的数据如表1和表2所示。
表1 益生菌制剂存活率比较
表2 益生菌制剂在人工模拟胃环境(3h)存活率比较
Claims (10)
1.以海藻酸钠、明胶复合凹土制备益生菌微胶囊的方法，该方法首先是纯化凹土，其次将凹土与海藻酸钠、明胶混合成复合壁材，接着将已制备好的益生菌菌悬液在一定的条件下与上述复合壁材混合均匀，然后缓慢滴入CaCl2中固化成型，最后真空冷冻法干燥，获得益生菌微胶囊；其特征是该制备方法包括以下具体步骤：
第一步凹土的纯化：将凹土采用电导率低于5μs/cm的去离子水浸泡20~28h，搅拌器以1000~1500rpm转速搅拌20~28h，静置分层，取中间层凹土悬液，以其5~20%的量继续加入上述去离子水，同样操作，重复2~3次，于105~120℃烘干，研磨，过筛，取200目至140目细土备用；
第二步益生菌菌悬液的制备：将枯草芽孢杆菌、双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、粪链球菌、地衣芽孢杆菌或酵母菌培养至对数生长期后期，收集菌体，采用无菌生理盐水洗涤去培养基，将菌体悬浮于pH为2~9的磷酸盐缓冲体系中，并将浓度调节至109~1010CFU/ml备用；
第三步壁材与益生菌混合溶液的制备：将5-50g的海藻酸钠、0-50g的明胶和1-40g的凹土悬浮至10L的菌悬液中，混合均匀；
第四步微胶囊固化成型：将上述壁材与益生菌的混合溶液缓慢滴加入离子强度为0.01-2mol/L、pH5-8磷酸盐缓冲液配制的浓度为1-50g/L的CaCl2中，于20-40℃固化成型10-100分钟，获得粒径大小为100-2000μm的微胶囊粒子；
第五步真空冷冻干燥法获得益生菌微胶囊制剂：真空冷冻干燥法条件为：上述微胶囊粒子于-40~-75℃预冻2~3小时，迅速移入冷冻干燥机冷冻干燥20~28小时，使微囊制剂含水量≤2%，检测活菌剂中活菌数为109~1012CFU/g。
2.根据权利要求1所述的以海藻酸钠、明胶复合凹土制备益生菌微胶囊的方法，其特征是枯草芽孢杆菌培养条件是：培养基为葡萄糖5g、蛋白胨10g、酵母膏5g、氯化钠5g，蒸馏水1000ml，pH7.2；35℃振荡培养18h，摇床转速为180rpm。
3.根据权利要求1所述的以海藻酸钠、明胶复合凹土制备益生菌微胶囊的方法，其特征是双歧杆菌培养条件是：培养基为蛋白胨15g，葡萄糖15g，酵母膏4g，牛肉膏4g，NaCl 5g，Na2HPO4 2.5g，蒸馏水1000ml，pH7；35℃静置培养22小时。
4.根据权利要求1所述的以海藻酸钠、明胶复合凹土制备益生菌微胶囊的方法，其特征是嗜酸乳杆菌培养条件是：培养基为蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，柠檬酸氢二铵2g，葡萄糖20g，吐温-80 1ml，CH3COONa·3H2O 5g，K2HPO4·3H2O 2g，MgSO4·7H2O 0.58g，MnSO4·H2O 0.25g，蒸馏水1000ml，调pH6.2-6.4；37℃静置培养20小时。
5.根据权利要求1所述的以海藻酸钠、明胶复合凹土制备益生菌微胶囊的方法，其特征是嗜热链球菌培养条件是：培养基同嗜酸乳杆菌；40℃静置培养20小时。
6.根据权利要求1所述的以海藻酸钠、明胶复合凹土制备益生菌微胶囊的方法，其特征是保加利亚乳杆菌培养条件是：培养基同嗜酸乳杆菌；37℃静置培养20小时。
7.根据权利要求1所述的以海藻酸钠、明胶复合凹土制备益生菌微胶囊的方法，其特征是鼠李糖乳杆菌培养条件是：培养基同嗜酸乳杆菌；37℃静置培养20小时。
8.根据权利要求1所述的以海藻酸钠、明胶复合凹土制备益生菌微胶囊的方法，其特征是粪链球菌培养条件是：培养基为蛋白胨2g，牛肉膏2g，乳糖2g，蒸馏水1000ml，pH6.8；37℃振荡培养6h，摇床转速为100rpm。
9.根据权利要求1所述的以海藻酸钠、明胶复合凹土制备益生菌微胶囊的方法，其特征是地衣芽孢杆菌培养条件是：培养基为葡萄糖5g，蛋白胨5g，K2HPO4 2g，MgSO4 2g，蒸馏水1000ml，pH 7.0；37℃振荡培养40h，摇床转速为180rpm。
10.根据权利要求1所述的以海藻酸钠、明胶复合凹土制备益生菌微胶囊的方法，其特征是酵母菌培养条件是：培养基为马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL，pH自然；28℃振荡培养18h，摇床转速为150rpm。
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