FR3039402A1 - Solution aqueuse de chitosane injectable pour la prevention ou le traitement de la degenerescence du disque intervertebral - Google Patents

Abstract

La présente invention a pour objet une solution aqueuse homogène de chitosane injectable contenant un chitosane ayant un degré d'acétylation inférieur à 20%, avantageusement inférieur à 10%, ladite solution contenant entre 0,1 et 6 %, avantageusement entre 1 et 3,5 %, en poids de chitosane, ladite solution présentant un pH inférieur à 6,2, avantageusement compris entre 5 et 6,2, ladite solution ne contenant pas de chitosane ayant un degré d'acétylation supérieur à 20%, pour la prévention ou le traitement de la dégénérescence du disque intervertébral, et/ou des douleurs associées à la dégénérescence ou à des pathologies du disque intervertébral.

Description

La présente invention a pour objet une solution aqueuse homogène de chitosane injectable pour la prévention ou le traitement de la dégénérescence du disque intervertébral, et/ou des douleurs associées à la dégénérescence ou à des pathologies du disque intervertébral.

Les disques intervertébraux sont les articulations situées entre deux vertèbres consécutives. Ils permettent donc la mobilité du rachis et contribuent, par leurs propriétés viscoélastiques, à l’amortissement des chocs. Ils constituent environ l/5e de la hauteur total du rachis. Chaque disque intervertébral (DIV) est composé d’un anneau de cartilage fibreux (anneau fibreux ou annulus fibrosus) constituant une ceinture externe du disque, renfermant une matrice faiblement cellularisée de haute viscosité (noyau pulpeux ou nucléus pulposus) de texture gélatineuse, constituée d’environ 80% en masse d’eau. Au cours du processus de dégénérescence discale, les propriétés mécaniques du disque intervertébral se dégradent progressivement, conduisant à une perte de mobilité et un certain nombre de pathologies discales : le noyau pulpeux peut en effet se déshydrater jusqu’à modifier l’élasticité du disque qui n’assure plus la mobilité de l’unité vertébrale et l’amortissement des chocs. Cette déshydratation s’accompagne d’un affaissement de la hauteur discale et peut également s’accompagner d’une compression des racines nerveuses environnantes. L’anneau fibreux peut quant à lui subir des lésions susceptibles d’entraîner une extrusion du noyau pulpeux conduisant à une hernie discale qui peut comprimer la moelle épinière ou les racines nerveuses. Ces pathologies induisent donc des douleurs, éventuellement une parésie ou une paralysie. Elles entraînent un coût social important en France car elles représentent 33% des dépenses de santé des actifs. 8% de ces patients développeront des symptômes chroniques, entraînant ainsi plus de 80% des dépenses de santé. Les interventions chirurgicales consistent habituellement à ôter la hernie discale et son interaction avec les racines nerveuses avec éventuellement un curetage ou nucléolyse du disque abîmé. D’autres stratégies consistent à poser un élément d’insertion à la place du disque intervertébral pour préserver la hauteur discale (cage d’interposition).

Chez l’homme, des prothèses intervertébrales articulées destinées au remplacement des disques ont été développées et sont actuellement disponibles sur le marché. De telles prothèses permettent à deux vertèbres de garder une mobilité partielle même après ablation du disque en traitant ainsi la compression nerveuse.

La chirurgie ayant pour objet le remplacement total d'un disque par une prothèse ou une cage d’interposition est une chirurgie lourde et invasive. Les risques associés à une telle chirurgie sont nombreux, parmi lesquels une possible lésion des vaisseaux situés en avant du rachis (vaisseaux iliaques, veine cave inférieure, aorte), des complications post-opératoires telles que des hématomes en avant du rachis ou des complications liées à la mise en place elle-même de la prothèse discale (fractures, impaction ou tassement vertébraux, mauvais positionnement de la prothèse, etc.). Dans un certain nombre de cas, à plus long terme, la pose de la prothèse s’accompagne du développement d’une pathologie discale sus-jacente, c'est-à-dire que le processus dégénératif continue sur les espaces adjacents.

Face à tous ces risques, et considérant le coût particulièrement élevé de ces interventions, la prévention de la dégénérescence du disque intervertébral et son traitement, ainsi que le traitement des douleurs associées à cette dégénérescence par des techniques moins invasives sont de plus en plus recherchés.

Ainsi, des méthodes d’infiltrations intradiscales de substances actives permettant de contrôler l’inflammation ont été parallèlement développées. Les infiltrations épidurales consistent en une injection locale non invasive de corticoïdes entre deux vertèbres dans l’espace épidural. Cette injection peut être prescrite pour des douleurs de dos (lombo-sciatique, lumbago...) afin de diminuer temporairement l’inflammation et soulager ainsi le patient mais elle ne limite pas la progression de la dégénérescence discale et ne permet pas la restauration des fonctions du disque. D’autres techniques connues sous le nom d'IDET (Intradiscal Electrothermal Annuloplasty) consistent à insérer une aiguille creuse à travers l’anneau fibreux et à faire passer à travers cette aiguille un fil chauffant appelé cathéter électrothermique de manière à ce que ce dernier entoure la périphérie extérieure postérieure du noyau. La chauffe du fil induit une dénaturation et une contraction des fibres de collagène de l’annulus fibrosus dans la partie postérieure ainsi qu’une destruction des nocicepteurs.

Des technologies se sont également développées pour le remplacement du noyau pulpeux. Ces procédés utilisent des prothèses injectables de noyau pouvant être introduites au moyen d'une aiguille traversant l'anneau fibreux. Une première prothèse connue est décrite dans le brevet US6533817. Il s'agit d'un implant en polymère hydrogel introduit à l'état déshydraté prisonnier d’une membrane externe qui contrôle sa réhydratation. Une fois l’implant introduit, il est hydraté avec un fluide présent dans l’enveloppe de manière à occuper l'espace intérieur de l’anneau fibreux. Cette technique présente toutefois un certain nombre d'inconvénients. Tout d'abord l'orifice nécessaire à l'introduction du polymère hydrogel est de taille relativement importante, créant ainsi une lésion susceptible d’entraîner une dégénérescence du disque. Ensuite, l’implant n’occupe pas complètement l'intérieur de l’anneau fibreux de sorte qu’il a tendance à bouger et ne remplit pas correctement son rôle d'amortisseur. Π faut donc envisager plusieurs implantations.

Une alternative à ces techniques consiste à introduire, au sein du noyau pulpeux, des solutions de polymères thermo-gélifiables biocompatibles, la gélification s’effectuant in situ. Cette technique permet de limiter la taille de l’orifice nécessaire à l’injection de la solution de polymère. Dans ce type de formulation, il est nécessaire d’ajouter des agents de réticulation aux compositions injectables pour permettre la gélification in situ de la solution de polymères à des températures et pH physiologiquement acceptables. C’est le cas par exemple de la solution technique proposée dans la demande de brevet WO 02/40070 de la société Biosyntech, mettant en œuvre un biopolymère avec un agent de réticulation électrostatique de type sel de phosphate, et notamment le phosphate de glycérol. Le phosphate de glycérol est toutefois connu pour ses propriétés ostéogéniques et favorisant la calcification du cartilage (Zimmermann, B. at al. Calcif. Tiss. Intem. 1992 51 :54-61). De telles propriétés sont susceptibles de modifier la viscoélasticité du disque intervertébral, altérant ainsi ses propriétés mécaniques. Par ailleurs, les agents de réticulation covalents mis en œuvre dans ces solutions injectables peuvent générer des réactions inflammatoires locales, ils sont souvent toxiques à faible dose pour l’organisme et peuvent conduire à une nécrose. En outre, la solution de polymère étant introduite sous forme liquide, il existe un risque de fuite de ce liquide en particulier si l’anneau fibreux est lésé par ailleurs ou si la viscosité de la solution de polymère n’est pas suffisante pour éviter une fuite par l’orifice d'injection.

Il existe donc un besoin pour le développement de solutions de polymères injectables, capables de gélifier in situ suffisamment rapidement pour éviter tout risque de fuite et permettre la formation rapide d’un implant gélifié ne nécessitant pas la présence d’agent de réticulation cytotoxique ou induisant une dégénérescence discale. Il existe en particulier un intérêt pour des techniques peu coûteuses et non invasives de traitement ou de prévention de la dégénérescence du disque intervertébral, ou des douleurs qui en résultent, ne présentant pas les inconvénients précités, et permettant notamment de restaurer les propriétés mécaniques, en particulier viscoélastiques du disque intervertébral tout en présentant une parfaite biocompatibilité (absence de toxicité et limitation de réactions inflammatoires), sans générer de lésion dans l’anneau fibreux susceptible de conduire à une fuite du noyau et à une dégénérescence du disque.

La présente invention a donc pour objet, selon un premier aspect, une solution aqueuse homogène de chitosane injectable contenant un chitosane ayant un degré d'acétylation inférieur à 20%, avantageusement inférieur à 10%, ladite solution contenant entre 0,1 et 6 %, avantageusement entre 1 et 4,5 %, en poids de chitosane, ladite solution présentant un pH inférieur à 6,2, avantageusement compris entre 5 et 6,2, ladite solution ne contenant pas de chitosane ayant un degré d'acétylation supérieur à 20%, pour la prévention ou le traitement de la dégénérescence du disque intervertébral, et/ou des douleurs associées à la dégénérescence ou à des pathologies du disque intervertébral.

Il est en effet du mérite des demandeurs d’avoir mis au point une nouvelle méthode de prévention et de traitement de la dégénérescence du disque intervertébral par injection d’une solution aqueuse spécifique, présentant une viscosité suffisamment faible pour permettre son injection au travers d’une aiguille de faible diamètre, et gélifiant suffisamment rapidement, et sans dépendre de la température du site d’injection, permettant la formation in situ d’un implant parfaitement biocompatible et biorésorbable en quelques mois, conférant au disque des propriétés mécaniques similaires à celles d’un disque sain. L’implant formé reste en place même sous des contraintes de flexion/torsion du rachis, reconstituant ainsi l’environnement et les propriétés du disque sain sans altérer les disques voisins, et ne génère aucune réaction inflammatoire ou nécrose.

Description des figures

La Figure 1 illustre l’évolution à 37°C des modules G’ et G” des solutions de chitosane en fonction du temps de contact avec la solution de gélification à une fréquence de 1 Hz (6,28 rad/s) et une amplitude de déformation de 1%: IA pour une solution présentant une concentration en polymère (Cp) de 1.5%, IB pour une solution présentant une Cp=2%, IC pour une solution présentant une Cp=2.5% et 1D pour une solution présentant une Cp=3%.

La Figure 2 illustre le suivi des caractéristiques morphologiques des disques après injections au temps 0 et 23h (T14-T15 et T15-L1 = Témoin : disque sain non injecté; Ll- L2 et L5- L6 = solution de chitosane présentant une Cp=2% ; L2- L3 et L4- L5 = solution de chitosane présentant une Cp=3% ; L3- L4 = sérum physiologique) : 2A- Hauteur des disques en mm 2B- Largeur des disques en mm 2C- Section du DIV en mm2).

La Figure 3 illustre les coupes sagittales des disques intervertébraux : 3A : disque T14-T15 de porc sain 3B : disque L5-L6 de porc injecté avec du chitosane (Cp=3%) 3C : disque L4-L5 de porc injecté avec du chitosane (Cp = 2%) 3D : disque L3-L4 de porc injecté avec du sérum physiologique)

La Figure 4 illustre l’altération de la structure du disque intervertébral par un abord chirurgical avec un scalpel de l’anneau fibreux jusqu’au noyau pulpeux.

La figure 5 illustre la viscosité globale (MPa.s) déterminée par modélisation de la courbe de relaxation après l’injection de 100 μΐ de solution de chitosane (Cp=3%) dans le noyau pulpeux des modèle de disques altérés par fenestration.

La Figure 6A et 6B illustre la viscosité globale (MPa.s) et le module élastique (MPa) déterminés par modélisation de la courbe de relaxation après l’injection de 100 pl de solution de chitosane (Cp=3%) dans le noyau pulpeux de disque sain (T13-T14, T15-L1, L1-L2) placé à 37°C en atmosphère humide pendant 8h par comparaison avec la viscosité globale et le module élastique d’un disque sain non injecté (T14-T15) placé dans les mêmes conditions expérimentales.

La Figure 7 illustre la formation d’un gel de chitosane après une injection de 100 μΐ de solution de chitosane (Cp=3%) dans le noyau pulpeux d’un disque sain placé à 37°C en condition humide.

La Figure 8 illustre un cliché IRM d’un disque L6-L7 de porc injecté avec une solution de chitosane (Cp=3%)/DOTAREM®.

La Figure 9 illustre l’évolution du module élastique G’ en fonction de la pulsation ω pour différentes concentrations de chitosane et pour le noyau pulpeux.

Chitosane

Les solutions aqueuses selon l’invention comprennent au moins un chitosane.

Le chitosane est un amino-polysaccharide généralement obtenu par N-désacétylation de la chitine, polysaccharide très répandu dans la biomasse. La chitine est notamment présente dans les cuticules des arthropodes, l'endosquelette des céphalopodes, les parois cellulaires ou encore la matrice extracellulaire de champignons, levures ou algues.

Avantageusement selon la présente invention, le chitosane est un produit d’origine naturelle qui provient d'une source animale, par exemple de crustacés du type crabes, crevettes ou calmars, ou d'une source végétale, telle que des champignons ou des algues. Le chitosane et la chitine sont des copolymères linéaires respectivement de 2- acetamido-2-desoxy-D-glucopyranose et de 2-amino-2-desoxy-D-glucopyranose. On parle plus communément d'unités N-acétyl-D-glucosamine (GlcNAc) et D-Glucosamine (GlcN), liées par des liaisons glycosidiques β-(1—>4). Chitine et chitosane se différencient par la fraction molaire (exprimée en %) des unités GlcNAc présentes dans le copolymère, appelée aussi degré d'acétylation (DA).

Les structures chimiques du chitosane et de la chitine sont représentées schématiquement ci-dessous en fonction du degré d'acétylation (DA) :

Le degré d’acétylation moyen (DA) est donc défini comme la fraction de résidus N-acétyl-D-glucosamine. Il est déterminé par RMN du proton par la méthode d’Hirai telle que décrite dans la publication « Détermination of degree of deacetylation of chitosan by 1 H NMR spectroscopy », Asako Hirai, Hisashi Odani, Akio Nakajima Polymer Bulletin July I 1991, Volume 26, Issue 1, pp 87-94.

Avantageusement selon la présente invention, le chitosane a un degré d'acétylation (DA) inférieur à 20%, encore plus avantageusement inférieur ou égal à 15 %, par exemple inférieur à 10%. Typiquement, le chitosane selon l'invention a un degré d'acétylation (DA) compris entre 0,5 et 20 %, typiquement entre 1 et 15 %, par exemple entre 2 et 10%.

Typiquement, le chitosane a une masse moléculaire moyenne en masse (déterminée avant stérilisation par chromatographie d’exclusion stérique selon la méthode décrite dans «Physico-chemical studies of the gélation of chitosan in a hydroalcoholic medium » A. MONTEMBAULT, C. VITON, A. DOMARD Biomaterials, 26(8), 933-943, 2005) comprise entre 100 000 et 1 500 000 g/mol, avantageusement entre 200 000 et 1 000 000 g/mol, plus avantageusement entre 250 000 et 900 000 g/mol, et encore plus avantageusement entre 250 000 et 800 000 g/mol.

Selon une caractéristique particulière, un autre chitosane de plus faible masse moléculaire moyenne, avantageusement inférieure à 10 000 g/mol, plus avantageusement inférieure à 5 000 g/mol, et mieux inférieure à 3 500 g/mol peut-être ajouté au chitosane tel que défini précédemment, sous réserve de ne pas altérer l’homogénéité de la solution ainsi obtenue.

Solution de chitosane.

Le pH de la solution aqueuse selon la présente invention est inférieur à 6,2, et est avantageusement compris entre 5 et 6,2.

Dans le cadre de l'invention, le chitosane est soluble en solution aqueuse dans les gammes de pH mentionnées précédemment. Avantageusement, la solution aqueuse selon l'invention est stable, en particulier stable (conservation de ses caractéristiques rhéologiques, de sa couleur, de sa transparence et/ou de sa limpidité) dans une gamme de températures allant de 4 à 25 °C pendant au moins 1 mois, de préférence au moins 6 mois, et plus préférentiellement au moins 24 mois.

Par « solution », on entend au sens de la présente invention une composition se présentant sous forme liquide, par opposition à une composition gélifiée. Elle se distingue ainsi des compositions sous forme d’hydrogels injectables à base de chitosane solubilisé telles que celles décrites dans la demande de brevet WO 2009/150651.

Des solutions de chitosane convenant à la mise en œuvre de la présente invention sont notamment décrites dans la demande de brevet WO 2013/079646 des demandeurs.

Selon un mode particulier de réalisation, on entend par « solution injectable » au sens de la présente demande une solution présentant une viscosité à haute vitesse de cisaillement (typiquement 104 s'1) comprise entre 0,001 et 15 Pa.s de préférence entre 0,01 et 5 Pa.s, et plus préférentiellement entre 0,05 et 1 Pa.s.

En effet, les solutions selon la présente demande sont des fluides non newtoniens, pour lesquels la viscosité à haute vitesse de cisaillement reflète les propriétés d’injectabilité (ou seringuabilité, c'est-à-dire facilité d'injection du fait d’un écoulement plus ou moins satisfaisant à travers une aiguille dans une seringue).

La mesure de la viscosité à haute vitesse de cisaillement (typiquement 104 s'1) peut par exemple être obtenue par rhéométrie capillaire selon la méthode décrite dans la publication « Chitosan solutions as injectable Systems for dermal filler applications: rheological characterization and biological evidence » par C. HALIMI, A. MONTEMBAULT, A. GUERRY, T. DELAIR, E. VIGUIER, R. FULCHIRON, L. DAVID (pubmed indexes). La force d’éjection est définie comme la force exercée sur une seringue de calibre déterminé pour permettre à la solution de traverser l’aiguille à un débit donné.

On entend par solution « liquide » au sens de la présente invention, une composition fluide, par opposition à un gel, et notamment un hydrogel. La distinction entre les solutions selon l’invention et des formulations sous forme de gels peut notamment être mise en évidence par la mesure des propriétés rhéologiques de ces compositions.

La distinction gel/solution est réalisée lors d’une étude rhéologique avec un rhéomètre DHR2 (TA industrie) et une géométrie plan-plan 40 mm dans une gamme de pulsation de 0,1 à 100 rad.s"1 à déformation de 1% à 37°C afin de déterminer le module de cisaillement complexe G*= G’ +iG”.

En effet, une solution liquide au sens de la présente invention se caractérise notamment par le fait que son module visqueux G” est supérieur à son module élastique G’. Dans le cas d’un gel, au contraire, le module élastique G’ est supérieur au module visqueux G”. Les mesures sont effectuées sur un rhéomètre DHR2 (TA industries) et une géométrie plan-plan 40 mm selon un mode dynamique (fréquence angulaire : 100 à 1 rad/s, déformation 1 %, 37°C).

Par solution « homogène » de chitosane, on entend au sens de la présente invention que tout le polymère chitosane est dissous, la solution ne contenant pas de particules solides en suspension dans la phase liquide. La solution selon l'invention est également typiquement transparente.

Selon une caractéristique particulière de la présente invention, la solution aqueuse homogène de chitosane contient entre 0,1 et 6 %, avantageusement entre 1 et 4,5 %, en particulier entre 2 et 3,5 %, en poids de chitosane, par rapport au poids total de la solution aqueuse.

De manière particulièrement avantageuse, la solution aqueuse selon l'invention est formulée pour être administrée ou est utilisée par injection dans le disque intervertébral (injection intradiscale dans le noyau pulpeux) par voie percutanée. La solution peut être conditionnée dans une seringue.

Dans un mode de réalisation particulier, la solution aqueuse selon l'invention est stérilisée avant injection, par exemple par autoclave.

Après stérilisation, le chitosane a typiquement une masse moléculaire moyenne en masse comprise entre 50 000 et 1 200 000 g/mol, avantageusement comprise entre 100 000 et 1 000 000 g/mol, plus avantageusement entre 150 000 et 800 000 g/mol, et encore plus avantageusement entre 200 000 et 750 000 g/mol.

Après stérilisation, les solutions liquides selon l’invention présentent de préférence une viscosité à haute vitesse de cisaillement comprise entre 0,001 et 15 Pa.s de préférence entre 0,01 et 5 Pa.s, et plus préférentiellement entre 0,05 et 1 Pa.s. La viscosité des solutions après stérilisation est mesurée selon la méthode décrite pour mesurer la viscosité des solutions avant stérilisation.

De manière particulièrement avantageuse, la solution aqueuse selon la présente invention avant injection ne contient pas de chitosane ayant un degré d'acétylation supérieur à 20%. Ainsi, le chitosane selon l'invention n'est pas mélangé avec un chitosane ayant un degré d'acétylation compris entre 30 et 60%, tel que cela est décrit dans les demandes de brevet WO 2008/072230 et WO 2009/150651. En effet, l’introduction d’un chitosane ayant un degré d'acétylation supérieur à 20% dans les solutions selon la présente demande est susceptible de générer une réaction inflammatoire au niveau du disque intervertébral et une dégénérescence discale.

Dans un mode de réalisation, la solution aqueuse peut contenir plusieurs chitosanes, pour autant qu’ils présentent des degrés d'acétylation inférieurs à 20%, avantageusement inférieurs à 10%.

Dans un autre mode de réalisation de la présente invention, la solution aqueuse peut contenir un chitosane tel que défini précédemment en mélange avec un autre chitosane, tel qu'un oligosaccharide de chitosane encore appelé chito-oligosaccharide, ayant un degré d'acétylation inférieur à 20%, avantageusement inférieur à 10%, de manière encore plus avantageuse ayant un degré d'acétylation identique au chitosane tel que défini précédemment, et ayant typiquement une très faible masse moléculaire moyenne en masse, par exemple inférieure à 10 000 g/mol, avantageusement inférieure 5 000 g/mol, et plus avantageusement encore inférieure à 3500 g/mol.

Dans un autre mode de réalisation préféré de la présente invention, la solution aqueuse contient, à titre de polymère, un seul chitosane ayant un degré d'acétylation tel que défini précédemment, ayant avantageusement une masse moléculaire moyenne telle que définie précédemment, avantageusement en une teneur comprise entre 0,1 et 6 %, avantageusement entre 1 et 4,5 %, en particulier entre 2 et 3,5 %, en poids de chitosane, par rapport au poids total de la solution aqueuse.

Agent de réticulation

Dans un mode de réalisation particulier, le chitosane peut être partiellement réticulé par interactions ioniques induites par exemple par l'ajout de sulfate, citrate, anions métalliques ou encore molécules anioniques, en particulier par la formation de complexes polyélectrolytes avec des polysaccharides présentant un groupe carboxylique COO" (alginates, pectine, xanthane, acide hyaluronique), avec des polysaccharides possédant un groupe sulfate, ou avec l'acide polylactique (PLA), ou encore par interaction avec des protéines (le collagène), des acides nucléiques (l'ADN, l'ARN, les Si ARN, les mARN...) ou des polysaccharides oxydés.

Dans un autre mode de réalisation particulier, le chitosane peut être partiellement réticulé à l'aide d'agents de réticulation covalents (ex : génipine).

Dans un mode de réalisation préféré, la solution aqueuse selon l'invention contient de 0,01 à 0,95 % en poids de sel de monophosphate, de sel dibasique de monophosphate ou de sel monocarboxylique de polyol ou de sucre, en particulier de phosphate de glycérol, de préférence de 0,01 à 0,9 % en poids.

Selon un mode encore plus préféré de réalisation, la solution aqueuse selon l'invention ne contient pas de phosphate de glycérol ou β-glycérophosphate.

Dans un mode de réalisation particulier, la solution aqueuse selon l'invention est composée de l'association d'une solution aqueuse de chitosane non réticulé avec une solution aqueuse de chitosane réticulé.

Selon un mode préféré de réalisation, la solution aqueuse selon l'invention contient moins de 1 % d’agent de réticulation, en particulier de sel de phosphate tel que le phosphate de glycérol ou β-glycérophosphate, notamment de 0,2 à 0,9 % en poids, et de préférence, la solution aqueuse ne contient pas d’agent de réticulation.

Procédé de préparation de la solution

Selon une caractéristique particulière, la solution aqueuse selon l'invention est susceptible d'être préparée par les étapes suivantes : - dissolution du chitosane dans l'eau par ajout d'acide tel qu'un acide faible, ledit acide faible étant avantageusement choisi dans le groupe constitué par l'acide acétique, l'acide glycolique, l'acide lactique, l'acide glutamique, et leurs mélanges, - et éventuellement réajustement du pH pour obtenir une solution aqueuse présentant un pH compris entre 5 et 6,2.

Le chitosane est dissous dans l'eau à l'aide d'un acide fort ou d’un acide faible. Toutefois, le chitosane est de préférence dissous dans la solution aqueuse à l'aide d'un acide faible pour éviter sa dégradation par hydrolyse en solution acide (à des pH de l’ordre de 3 ou moins obtenus lors de la solubilisation par acide fort). Les acides forts, bien que permettant effectivement la solubilisation du chitosane dans l’eau, sont plus difficiles à mettre en œuvre et imposent de contrôler très précisément le volume d’acide pour atteindre la stœchiométrie. L’acide fort peut par exemple être l’acide chlorhydrique ou l’acide phosphorique. L’acide faible peut être choisi parmi l'acide acétique, l'acide glycolique, l'acide lactique, l'acide glutamique, et leurs mélanges.

Dans un mode de réalisation particulier selon l'invention, lors de l'étape de dissolution, l'acide est ajouté en une quantité strictement nécessaire à la dissolution du chitosane. On peut utiliser ainsi un excès d'acide pour certains chitosanes, par exemple les chitosane difficiles à solubiliser avec seulement la quantité stoechiométrique d'acide strictement nécessaire à la protonation des sites NH2.

Dans un autre mode de réalisation particulier selon l'invention, lors de l'étape de dissolution, l'acide est ajouté en une quantité strictement nécessaire à la dissolution du chitosane, telle que la quantité stoechiométrique strictement nécessaire à la protonation des sites NH2 de manière à prévenir la dégradation du chitosane en solution acide.

Le contrôle du pH des solutions est très important pour éviter la nécrose acide des tissus après injection, et également pour protéger les solutions de l'hydrolyse et la dégradation du chitosane si l'on met en œuvre une stérilisation (par exemple par autoclave à 121°C pendant 15 minutes).

Dans la cadre de la présente invention, l’ajustement du pH peut se faire de préférence par dialyse.

Pour contrôler le pH, la solution contenue dans le boudin de dialyse est placée sous agitation dans un réacteur hermétique (Verre Equipements, Lyon, France) à 75 rpm pendant 2 minutes. La valeur du pH est avantageusement contrôlée grâce à un pH-mètre de contact (Mettler-Toledo AG, Suisse) pendant la remontée de pH pour atteindre un pH supérieur ou égal à 5,2 et avantageusement compris entre 5,2 et 6,2, de préférence entre 5,3 et 6,2, et plus préférentiellement 5,7 et 6,2.

La dialyse est un procédé de séparation par membrane des molécules ou des ions en solution. Ainsi, dans le cadre de la présente demande, la solution aqueuse de chitosane selon l’invention peut être dialysée contre une solution tampon présentant un pH égal au pH final souhaité pour la solution de chitosane (pH cible), c’est à-dire au moins supérieur à 6,2, avantageusement compris entre 6,3 et 7,5. Lorsque la solution tampon présente un pH supérieur au pH de gélification de la solution (par exemple 7,5), la dialyse devrait alors être interrompue pour éviter la précipitation/gélification de la solution.

La solution tampon peut, de préférence, être une solution saline de tampon phosphate (PBS, TBS, PBS-acide lactique) et de préférence 150 mM NaCl, 10 mM phosphate.

Selon un mode de réalisation particulier de l’invention, la dialyse peut être réalisée de manière statique contre un seul bain contenant une solution tampon telle que décrite précédemment et une concentration en sel pour atteindre l’osmolarité des tissus ([NaCl]=150 mM).

En particulier, la solution tampon peut présenter une osmolarité comprise entre 250 et 350 mOsm/L, de préférence entre 280 et 320 mOsm/L.

Dans ce mode de réalisation, la solution tampon peut présenter un pH supérieur au pH souhaité pour la solution de chitosane, par exemple entre 7,0 et 7,5.

Après injection notamment dans le disque intervertébral, la solution aqueuse homogène selon la présente invention va former avantageusement un système semi- cristallin, en particulier du fait du changement de pH lié à l'influence des milieux tamponnés de l'organisme.

Par « système semi-cristallin », on entend typiquement un système constitué d'une phase cristalline et d'une phase non cristalline (amorphe).

Typiquement, les cristaux de chitosane obtenus correspondent à l'allomorphe hydraté du chitosane et contribuent à la formation du gel car les cristallites sont des nœuds de réticulation physique multifonctionnels.

De manière particulièrement avantageuse selon la présente invention, la solution aqueuse présente une bonne biocompatibilité et est biorésorbable. En particulier, le produit selon l'invention a une durée de biorésorption plus longue que les produits à base d'acide hyaluronique du type acide hyaluronique réticulé, pour un effet prolongé, tel qu'un effet de comblement prolongé dans le nucléus pulposus.

Par « biorésorbable » ou « biodégradable », on entend une dégradation des chaînes polymériques du produit injecté en oligosaccharides de plus petite taille pouvant être totalement ou essentiellement totalement métabolisés ou éliminés par l’organisme.

Selon une caractéristique particulière de la présente invention, la solution de chitosane est fluide avant injection, gélifie rapidement, notamment en quelques minutes à quelques heures in situ, et présente un temps de résorption long une fois injectée, typiquement de quelques semaines à plusieurs mois, par exemple de l'ordre de 3 ou 4 semaines jusqu'à 18 à 24 mois. Le produit ou biomatériau constitué de ou contenant la solution aqueuse selon l'invention bénéficie du caractère bactério et fongistatique du chitosane, bien connu dans le monde de l'industrie agro-alimentaire et des pansements cicatrisants. Ces propriétés facilitent la conservation du produit avant injection et contribuent à limiter les risques d'infection liés à l'injection.

Dans un mode de réalisation particulier, la solution aqueuse de chitosane selon l'invention comprend un sel tel que le chlorure de sodium ou un sel de phosphate, ou tout autre excipent acceptable avantageusement pour ajuster l'osmolarité de la composition. L'ajout d'un sel tel que le chlorure de sodium peut être intéressant pour obtenir une solution isotonique.

Selon une caractéristique particulière de la présente invention, la composition peut comprendre en outre au moins un composé ayant une activité thérapeutique reconnue. On peut citer à titre d'exemple un composé analgésique, un composé anesthésique local comme la lidocaïne, mépivacaïne, bupivacaïne ou ropivacaïne, un composé anti-inflammatoire comme les corticoïdes, une hormone, ou encore un composé actif du type facteur de croissance ou oligosaccharide bioactif, par exemple un oligosaccharide d'acide hyaluronique ou oligosaccharide de chitosane de degré de polymérisation inférieur à 20, ou encore un acide nucléique, une protéine ou un anticancéreux.

En particulier, la solution aqueuse homogène de chitosane selon l’invention consiste en : - 0,1 à 6 %, avantageusement 1 à 4,5 %, et plus avantageusement 1 à 3,5% en poids d’un chitosane ayant un degré d'acétylation inférieur à 20%, avantageusement inférieur à 10%, - 94 à 99,9 % en poids d’eau, - un acide choisi dans le groupe constitué par l'acide acétique, l'acide glycolique, l'acide lactique, l'acide glutamique, et leurs mélanges, en une quantité stœchiométrique par rapport aux fonctions amines du chitosane, par exemple de 0,01 à 2 % en poids dudit acide, - 0,01 à 2 % en poids d’un sel tel que le chlorure de sodium - 0 à 2 % en poids d’un composé ayant une activité thérapeutique, par exemple un composé analgésique, un composé anesthésique local comme la lidocaïne, mépivacaïne, bupivacaïne ou ropivacaïne, un composé anti-inflammatoire comme les corticoïdes, une hormone, ou encore un composé actif du type facteur de croissance ou oligosaccharide bioactif, par exemple un oligosaccharide d'acide hyaluronique ou oligosaccharide de chitosane de degré de polymérisation inférieur à 20, ou encore un acide nucléique, une protéine ou un anticancéreux, ladite solution présentant un pH inférieur à 6,2, avantageusement compris entre 5 et 6,2, ladite solution ne contenant pas de chitosane ayant un degré d'acétylation supérieur à 20%.

La solution selon la présente invention est de préférence formulée pour être administrée par injection dans le disque intervertébral (injection intradiscale dans le noyau pulpeux) par voie percutanée.

Prévention ou traitement de la dégénérescence du disque intervertébral

Dans le cadre de la présente invention, les solutions aqueuses de chitosane sont mises en œuvre pour la prévention ou le traitement de la dégénérescence du disque intervertébral, et/ou des douleurs associées à la dégénérescence du disque intervertébral.

Il est à noter qu’un disque d’apparence sain peut être à l’origine de douleurs par compression des racines nerveuses avant de présenter des signes de dégénérescences visibles. Π est donc intéressant de renforcer les propriétés mécaniques de disques a priori sains pour prévenir ou traiter les douleurs associées à la dégénérescence du disque.

En particulier, la prévention ou le traitement de la dégénérescence du disque intervertébral, et/ou des douleurs associées à la dégénérescence du disque intervertébral se fait par injection des solutions aqueuses de chitosane précédemment décrites dans le disque intervertébral, de préférence dans le noyau pulpeux du disque intervertébral.

Les exemples suivants sont destinés à illustrer l'invention sans aucunement en limiter la portée.

Exemple 1 : Préparation de solutions aqueuses de chitosane

Le chitosane utilisé dans les présents exemples a été obtenu par modification de la chitine de plume de calamar. Le poids moléculaire moyen du chitosane stérilisé est Mw = 320 000 g/mol, son degré d’acétylation est inférieur à 5%. 4 solutions aqueuses sous forme d’acétate de chitosane ont été préparées avec une concentration en polymère de 1.5% à 3% (w/w). L’acide acétique (99.7%, Sigma-Aldrich, Saint Louis, USA) a été ajouté en quantité stoechiométrique par rapport aux fonctions amines du chitosane. Les solutions de chitosane ont été complètement solubilisées par agitation dans un réacteur hermétique à 75 tours/min toute la nuit à température ambiante. Le pH de la solution de chitosane a été mesuré proche de 5.4.

Afin de limiter l’injection de solutions acides dans le disque intervertébral et ainsi éviter des réactions locales de type nécrose/inflammation, le pH des solutions a été réajusté. Les solutions d’acétate de chitosane ont ainsi été dialysées avec des membranes de dialyse (Spectra por 4, 12 000-14000 Da) dans un tampon phosphate 10 mM (99 %, Sigma-Aldrich, Saint Louis, USA) additionné avec du NaCl à 150 mM (99.5%, Sigma-Aldrich, Saint Louis, USA) à température ambiante.

Le pH des solutions de chitosane après la dialyse est proche de 6,15.

Les solutions dialysées ont ensuite été stérilisées selon un cycle standard 121°C, 15min avec un autoclave industriel.

La stabilité des solutions ainsi préparées a été évaluée à température ambiante et à 4°C : les échantillons ne présentaient pas d’évolution en termes d’homogénéité, de couleur, de transparence et de propriétés rhéologiques, sur une période de 6 mois.

Exemple 2 : Evaluation ex vivo de l’injectabilité des solutions

Essai 1 :

Deux solutions de chitosane présentant une concentration en polymère de 2% et 3% ont été préparées selon la méthode de l’exemple 1 avec un chitosane, présentant un DA inférieur à 5% et un poids moléculaire moyen Mw compris entre 600 000 et 700 000 g/mol avant stérilisation.

Les solutions ont été dialysées en tampon phosphate 10 mM, 150 mM NaCl pH 7. Le pH des solutions de chitosane après la dialyse est proche de 6,15.

Les échantillons ont ensuite été stérilisés à 15 min 121°C. A ce pH, avec cette méthode de remontée de pH et ces conditions de stérilisation, le chitosane reste soluble, et la solution reste stable à 4°C pendant 6 mois.

Les solutions de chitosane ont été colorées avec de l’éosine pour permettre d’observer facilement d’éventuelles fuites de la solution après injection intradiscale.

Les solutions ont été conditionnées dans des seringues à insuline en plastique de 1 ml 25 G (0.5 mm pour le diamètre externe) et injectées dans les disques intervertébraux sains d’un rachis de porc de 30 kg disséqué. Un volume de 50 pl de solution était facilement injectable dans le DIV et un volume de 75 pl était également injectable mais avec une pression plus élevée.

Après injection, l’injectât ne ressort pas et reste localisé dans le DIV. Aucune fuite n’a été observée. Par ailleurs, la dissection des DIV injectés montre que la solution injectée adhère à la substance du noyau pulpeux.

La viscosité à haute vitesse de cisaillement (104 s"1) a été mesurée par rhéométrie capillaire selon la méthode décrite dans la publication « Chitosan solutions as injectable Systems for dermal filler applications: rheological characterization and biological evidence » par C. HALIMI, A. MONTEMBAULT, A. GUERRY, T. DELAIR, E. VIGUIER, R. FULCHIRON, L. DAVID (pubmed indexes).

Les solutions mises en œuvre dans le cadre de l’invention présentent une viscosité à haute vitesse de cisaillement comprise entre 0,05 et 1 Pa.s et sont donc compatibles avec des injections dans l’espace intradiscal.

Les mêmes tests d’injectabilité ont également été réalisés chez des lapins. Des essais d’injection ont été réalisés dans 4 disques intervertébraux sains d’un lapin de 5 kg avec une aiguille de diamètre 25 G* 16 mm. Compte tenu de la plus petite taille des DIV du lapin par rapport à ceux du porc précédemment injectés, des volumes de 10 à 20 pl de la solution de chitosane colorée à l’éosine ont été injectés dans les disques des lapins. Aucun produit n’est ressorti après l’injection dans les 4 disques traités. Après section des DIV, le chitosane gélifié apparaît mêlé au noyau du DIV.

Les solutions selon l’invention peuvent ainsi être injectées au travers d’une aiguille de faible diamètre et ne génèrent pas de fuite consécutivement à l’injection.

Essai 2 :

On a préparé les formulations suivantes : deux solutions de chitosane (Cp = 1,5% à 3%) préparées avec le même chitosane et selon la même méthode que l’essai 1 précédemment décrit, une solution de chitosane préparée selon l’enseignement de la demande de brevet WO 2008/072230 : un chitosane de Cp = 0,5 %, de DA = 20 % et Mw = 100000 g/mol a été mélangé à un chitosane de Cp = 5,5%, de DA = 50% et Mw = 200000 g/mol. La solution a été solubilisée par l’ajout d’acide acétique en quantité stœchiométrique par rapport aux fonctions amines des chitosanes utilisés par agitation magnétique pendant 24h. La solution de chitosane résultante a été ajustée en pH par l’ajout d’une quantité de soude IM strictement nécessaire pour obtenir un pH de 6.8, une solution d’acide hyaluronique (Cp = 2%, Macrolane™) de l’eau.

Les formulations ont été colorées avec du bleu de méthylène (Blue Marker AGUETTANT ND, concentration finale = 1 mg/ml) et injectées dans le noyau pulpeux de rachis de porc afin de vérifier leur injectabilité et de comparer la répartition de l’injectât au sein du disque intervertébral dans les mêmes conditions d’injection (seringue manuelle et Spinocan® 0,70*75 mm / 22G*75 mm, B BRAUN). Les solutions ont été injectées jusqu’à arrêt du piston (augmentation de la pression interne du DIV).

Les paramètres d’injection suivants ont été imposés: - l’utilisation d’une aiguille spinale (Spinocan® 0,70*75 mm /22G*75 mm, B BRAUN) de petit diamètre (70mm/22G) de façon à limiter le caractère invasif de l’injection tout en permettant une injection manuelle (sans pistolet) avec une seringue (seringue en verre avec luer lock, BD), - une injection réalisée par pression manuelle sur le piston de la seringue (en principe, pour une vitesse de l’ordre de 20 mm/min, la pression manuelle est inférieure à 50N, par exemple de l’ordre de 20 N). L’injection a été très facile (faible résistance) pour la préparation d’acide hyaluronique et pour l’eau. Le volume injecté était supérieur à 200 μί. L’injection a été possible pour les préparations de chitosane selon la présente demande (la résistance à l’injection augmentant légèrement lorsque la concentration en chitosane augmente). Le volume injecté était de l’ordre de 200 μί. L’injection a, en revanche, été très difficile et très lente, nécessitant une très forte pression manuelle (résistance à l’injection très forte) pour la préparation de chitosane selon la demande WO 2008/072230. La quantité injectée était inférieure à 100 μL.

Les dissections des DIV ont montré la présence d’un injectât coloré bien présent au sein du noyau pulpeux pour les solutions colorées d’eau, d’acide hyaluronique, et les solutions de chitosane selon la présente demande (Cp=l,5 % à 3%) en cohérence avec les volumes injectés. La solution de chitosane selon la demande WO 2008/072230 est, en revanche, répartie autour du site d’injection, sans parvenir jusqu’au noyau pulpeux, ce qui semble cohérent avec le faible volume injecté.

Contrairement aux formulations de l’art antérieur telles que celles décrites dans la demande WO 2008/072230, les solutions selon la présente demande sont plus facilement injectables et permettent la formation d’un implant au sein du noyau pulpeux.

Exemple 3 : Suivi de la gélification des solutions

On a suivi la gélification de 4 solutions de chitosane présentant une concentration en polymère de 1,5%, 2%, 2,5% et 3% respectivement, préparées selon la méthode décrite à l’exemple 2 par le biais de l’évolution de leur module élastique G’ et module visqueux G” à différents temps à une fréquence donnée.

Les solutions ont été dialysées en tampon phosphate 10 mM, 150 mM Nacl pH 7. Les échantillons ont ensuite été stérilisés à 121°C en autoclave industrielle pendant 15 min

Pour les conditions de gélification, 2,5 ml de chaque échantillon ont été déposés dans des coupelles, les coupelles ont été placées à 37°C dans du milieu de culture DMEM selon un ratio 1/3 v/v (ratio volumique solution de chitosane / milieu DMEM) pendant 24h. La méthode en rhéologie était d’appliquer une gamme de pulsation de 100 à 1 rad/s à une déformation de 1 % à 37°C.

Le chitosane est celui mis en œuvre dans les solutions illustrées à l’exemple 2. Résultats : A une fréquence de 6,28 rad/s, le tracé de G’ et G” a été réalisé en fonction du temps sur une période de 24h (Figure 1). Π a également été étudié l’influence de la concentration en polymère sur la cinétique de gélification du chitosane (Figure 1A-D). Il apparaît que la concentration en polymère impacte très peu la cinétique de gélification du chitosane. En effet la formation d’un gel se réalise en une quinzaine de minutes, et ce quelle que soit la concentration en polymère dans la solution, dans la gamme de concentration de l’étude.

Exemple 4 : Impact biologique de l’injection des solutions in vivo chez le porc

On a évalué l’impact biologique (biocompatibilité, toxicité, réponse inflammatoire, intégration/résorption du chitosane dans le DIV) de l’injection de solution de chitosane fabriquée dans l’exemple 2 dans l’espace intradiscal de disques sains d’un porcelet de 30 kg, mâle de 3 mois.

Les seringues utilisées pour ces injections sont des seringues en plastique 1 ml des laboratoires B. BRAUN avec des aiguilles 20 G de longueur 90 mm des laboratoires VYGON.

Entre 150 et 200 pl de solutions de chitosane ont été injectés dans les disques.

Les injections ont été réalisées sous échographie après anesthésie du cochon selon le schéma suivant :

L’injection de sérum physiologique s’est déroulée en deux injections successives de manière à ce que le geste de l’injection soit intrusif et induise en conséquence une dégénérescence du disque de manière à en suivre l’évolution.

Le suivi de l’impact de l’injection de solutions de chitosane sur les DIV a été assuré par IRM pour évaluer l’inflammation du début de l’expérimentation jusqu’au sacrifice de l’animal (J+l, J+15 J+95). L’IRM est une technique permettant de détecter des changements primaires dans le disque en phase de dégénérescence et en particulier la déshydratation du noyau pulpeux dont la forme dégénérative sera une structure fibrocartilagineuse peu distincte de l’anneau fibreux ou encore une structure calcifiée. L’analyse des clichés IRM pourra permettre l’évaluation des paramètres morphologiques tels que la perte de hauteur, les changements de composition du noyau pulpeux (déshydratation)... Ainsi selon la classification de Gibson, le disque normal sera caractérisé par un signal intense en pondération T2 tandis que la forme de dégénérescence la plus sévère sera caractérisée par une perte totale de signal.

Par ailleurs la mobilité de la colonne vertébrale et l’aisance du déplacement du cochon ont également été suivies tout au long du déroulement de l’expérimentation. L’acquisition des clichés IRM a été réalisée avec une IRM à 0.2 T avec une antenne de surface. Le cochon, intubé sous anesthésie gazeuse (débit Oxygène 1 à 1,5 L et débit isoflurane 1%), était placé en décubitus latéral gauche.

Le protocole utilisé suivait le schéma suivant : - Réalisation du scout view ou topogramme pour le repérage d’ensemble - Repérage sagittal avec une SE (TR/TE/Nb acquisition =350/18/1) FOV 200x200 Matrice 256*192 - 9 coupes sagittales de la droite vers la gauche d’épaisseur 4mm -durée 1 ’ 10 - Repérage dorsal avec une SE (TR/TE/Nb acquisition =350/18/1) FOV 200x200 Matrice 256*192 - 9 coupes dorsales d’épaisseur 4mm - durée Γ10 - Vues sagittales avec une TSE en pondération T2 (TR/TE/Nb acq.=4620/120/l) FOV 200x200 Matrice=192*192 - 15 coupes sagittales d’épaisseur 4 mm - durée 8’51

Ce protocole comprenant 3 séquences (2 de repérage de 1’ 10 + 1 acquisition de 8’51) dure 15 mn. Il a été répété 2 fois de façon à couvrir la zone d’intérêt du rachis thoraco lombaire, à savoir de T15 à S, du cochon. Le disque est situé à 6 cm de profondeur sous la peau (déterminée par tomodensitométrie). Le cochon possède de 13 à 18 vertèbres thoraciques, dans le cas de notre individu il y avait 15 thoraciques et 6 vertèbres lombaires.

Le suivi de l’inflammation par IRM a été réalisé 15 jours après injection puis 95 jours après injection (jour de l’autopsie).

Le signal IRM du disque injecté avec le sérum physiologique (L3-L4) 15 jours après l’injection est éteint ce qui atteste d’une dégénérescence discale sévère marquée par une déshydratation du noyau pulpeux. Les signaux IRM des disques injectés avec les solutions de chitosane sont, quant à eux, en tous points comparables aux signaux IRM des disques sains avant l’injection. L’injection des solutions de chitosane n’a donc pas entraîné sur les moyens et long termes (respectivement 15 jours et 3 mois) de dégénérescence détectable en IRM.

La mobilité du cochon a également été évaluée tout au long du déroulement de l’expérimentation. Π n’a été détecté aucune perte de la mobilité de l’unité vertébrale in vivo et par examen au cours de l’autopsie.

Par ailleurs, l’autopsie du cochon après trois mois d’expérimentation n’a mis en évidence aucun problème clinique dans les disques injectés avec les solutions de chitosane.

Le témoin de disque dégénéré (injection avec du sérum physiologique) était, quant à lui, calcifié et rigide : la mobilité de l’unité discale était très fortement réduite.

Le suivi des caractéristiques morphologiques des disques a été réalisé après les injections au temps 0 et 23h et est illustré à la Figure 2 (A- Hauteur des disques intervertébraux en mm B-Largeur des disques intervertébraux en mm C- Section du DIV en mm2)

Au temps 0 après les injections, le disque injecté avec du sérum physiologique (L3-L4) dont la viscosité est de 1 mPa.s n’a présentait aucun gain ou perte de la hauteur et de la largeur du disque ainsi que de la section en sagittale (Figure 2 A-C). Pour les disques injectés avec la solution de chitosane avec une Cp = 2% (L1-L2, L5-L6), un gain en hauteur moyen a été calculé de 12,7 %, un gain en largeur moyen de a été calculé de 12,6 % et une augmentation moyenne de la section a été calculée de 17.8 %. Pour les disques injectés avec la solution de chitosane avec une Cp = 3% (L2-L3, L4-L5), un gain en hauteur moyen a été calculé de 20,3%, un gain en largeur moyen a été calculé de 12,4 % et une augmentation moyenne de la section a été calculée de 25,8% (Figure 2 A-C).

Au temps 23 h après l’injection, le disque injecté avec du sérum physiologique (L3-L4) ne présentait pas de gain ni de perte de la hauteur et largeur de l’espace intradiscal ni de la section sagittale (Figure 2 A-C). Pour les disques injectés avec la solution de chitosane Cp = 2% (L1-L2, L5-L6), la valeur de la hauteur moyenne déterminée en section sagittale observé au temps 0 a été conservée. De manière similaire, les disques injectés avec la solution de chitosane Cp = 3% (L2-L3, L4-L5) présentent des largeurs, sections et hauteurs du disque intervertébral supérieures aux disques non injectés.

Ainsi, les solutions de chitosane selon l’invention ont permis de rehausser l’espace intradiscal. Aucun gain en hauteur de l’espace intradiscal n’a été observé pour l’injection avec le sérum physiologique. De plus les propriétés de gélification in situ des solutions de chitosane permettent à l’injectât de rester dans le disque intervertébral après injection, sans générer de fuite même après remise en charge du rachis. Les solutions de chitosane selon l’invention devraient donc permettre de redonner au noyau pulpeux sa fonction d’interposant viscoélastique ceinturé par la barrière fibreuse de l’anneau et soulager d’éventuels conflits radiculaires et permettre la restauration des propriétés fonctionnelles du noyau dégénératif.

Les injections des solutions de chitosane ou de sérum physiologique n’ont pas entraîné d’augmentation de la température (fièvre) des animaux. Sur le plan éthologique, le comportement de l’animal était normal tel qu’évalué par un chirurgien vétérinaire : pas de perte d’appétit, pas de perte de mobilité ni de comportement d’isolement ni d’agressivité. Les injections n’ont pas entraîné de perte de poids chez l’animal, la croissance de l’animal est restée normale. L’analyse histologique des disques injectés a ensuite permis d’évaluer qualitativement la toxicité, la dégénérescence discale, l’inflammation et la dégradation/résorption de l’implant. Pour cela, on a réalisé des observations histologiques à partir des différents DIV injectés.

La Figure 3 illustre les coupes sagittales des disques intervertébraux (A : T14-T15 de porc sain ; B : L5-L6 de porc injecté avec du chitosane (Cp=3%) ; C : L4-L5 de porc injecté avec du chitosane (Cp = 2%) et D - L3-L4 de porc injecté avec du sérum physiologique).

Aucune altération histologique de la structure du DIV n’a été observée après une période de 3 mois après injection des solutions de chitosane. En effet, l’architecture histologique du DIV injecté avec du chitosane est semblable à la structure du DIV sain non injecté et ne présente aucun signe de dégénérescence tissulaire par comparaison avec le témoin non injecté (Figure 3 : A, B et C).

Le disque intervertébral L3-L4 témoin injecté avec une solution saline de type sérum physiologique (200 pl) montre une dégénérescence discale très claire : l’ensemble du disque intervertébral est calcifié avec formation d’un tissu osseux à la place du DIV, on remarque un reste d’anneau fibreux, mais on constate la disparition totale du noyau pulpeux (Figure 3D).

Ces résultats de caractérisation histologiques ont par ailleurs été complétés par les mesures des caractéristiques morphologiques 3 mois après l’injection des disques lombaires et thoraciques comme le montrent les résultats présentés dans le tableau suivant :

NP = noyau pulpeux AF= anneau fibreux

Ces mesures ont été réalisées grâce au logiciel ImageJ sur des coupes sagittales des disques intervertébraux non injectés, injectés avec des solutions de chitosane ou du sérum physiologique prélevés le jour de l’autopsie du porc.

Aucune différence significative des caractéristiques morphologiques n’a été observée entre les disques sains (T14-T15, T15-L1) et injectés avec une solution de chitosane selon l’invention (L1-L2, L2-L3, L4-L5, L5-L6).

Le disque L3-L4 injecté avec du sérum physiologique et disque témoin d’une dégénérescence discale a perdu la hauteur de l’espace intradiscal et a donc un espace entre les deux plaques de croissance réduit par rapport au témoin du fait de la fusion osseuse résultant de la dégénérescence discale.

Exemple 5 : Etude ex vivo des propriétés biomécaniques (viscoélasticité) des disques altérés

Une solution de chitosane 3 % a été préparée selon le protocole décrit dans l’exemple 2 pour l’étude de la biomécanique des DIV. L’analyse a été réalisée sur des unités intervertébrales prélevées chez un porc différent de celui de l’exemple 4 (plateau supérieur + DIV + plateau inférieur) : T10-T11, T11-T12, L1-L2, L2-L3, L3-L4. Après analyse d’image de radiographie pour obtenir la surface et la hauteur du DIV, chaque échantillon a été caractérisé dans les conditions suivantes : - Analyse des propriétés mécaniques du disque sain, - Création du modèle altéré par fenestration avec un scalpel et analyse du disque altéré. L’altération de la structure du disque intervertébral a été réalisée par un abord chirurgical avec un scalpel de l’anneau fibreux jusqu’au noyau pulpeux (Figure 4 A-B), résection d’un parallélépipède des sections rectangulaires 1 mm* 10 mm jusqu’au noyau pulpeux - Injection de la solution de chitosane sur le modèle altéré et analyse des propriétés mécaniques du disque altéré injecté. Détermination du domaine de comportement linéaire :

Un disque sain a été placé sur une machine de compression SHIMADZU AG équipé d’un capteur de force de 10000 N. Une gamme de force de compression a été appliquée de 0 à 5000 N à une vitesse imposée de 10 mm/min afin de déterminer la zone de chargement linéaire (lorsque la force est reliée au déplacement par une loi linéaire). Dans cette zone, la force optimale pour les essais a été évaluée à environ 400 N.

La détermination d’un domaine linéaire permet de travailler dans des gammes de force n’entrainant pas de dommages irréversibles de la structure du DIV.

Caractérisation biomécanique : les essais se sont déroulés selon le protocole suivant : - Cycle de 5 chargements en compressions successifs (séparés par des décharges jusqu’à ON) à une vitesse de déplacement de traverse constante de 1 mm/min avec un chargement de 0 à 400 N en compression. - Expérience de relaxation de la force à partir d’une force maximale de 400 N appliquée au moyen d’une compression à une vitesse de 20 mm/min. La relaxation est obtenue après immobilisation de la traverse pendant 10 minutes. Après les 10 min e relaxation, une décharge à 0 N est effectuée à la vitesse de 20 mm/min. L’expérience de relaxation nous permet de déterminer le module d’élasticité à temps de relaxation infini Eo (MPa) et la viscosité globale r|o (MPa.s) en analysant la courbe de relaxation expérimentale avec une loi modélisée (Equation 1), la fonction de relaxation r(t) s’exprime de la manière suivante:

Eq. 1 Où τι et T2 sont les deux temps caractéristiques du phénomène de relaxation exprimés en s, Ei et E2 sont les amplitudes de relaxation correspondantes exprimés en Pa.s. La viscosité globale r|o exprimée en Pa.s peut alors être calculée de la façon suivante :

La figure 5 représente la viscosité globale (MPa.s) déterminée par modélisation pour les disques sains, fenêtrés et injectés. L’altération de la structure du DIV par fenestration a entraîné une perte des propriétés viscoélastiques en particulier une diminution de la viscosité globale pour les disques altérés. Les injections de chitosane ont permis une restauration des propriétés viscoélastiques en particulier un gain de la viscosité globale. De plus, l’injection de la solution de chitosane dans les modèles de disques altérés par fenestration a permis un gain moyen de 1 mm de la hauteur de l’espace intradiscal.

Ces résultats montrent que les solutions de chitosane peuvent être utilisées dans le cas du disque dégénératif pour permettre la restauration de la hauteur du DIV et de ses propriétés viscoélastiques perdues au cours du processus dégénératif. Le retour de cette propriété viscoélastique améliore l’amortissement effectué par le disque intervertébral.

Par ailleurs, les disques altérés par fenestration et injectés avec la solution de chitosane avaient été placés à 37°C en atmosphère humide afin de mimer le plus fidèlement possible l’environnement biologique permettant la gélification. Ainsi la dissection des DIV 12h après l’injection de la solution de chitosane a permis de confirmer la formation d’un gel de chitosane au cœur du noyau pulpeux. Le gel formé reste individualisé et semble adhérent avec les constituants du noyau pulpeux.

Exemple 6 : Etude ex vivo des propriétés biomécaniques (viscoélasticité) des disques sains

Une solution de chitosane 3 % a été préparée selon le protocole décrit dans l’exemple 2 pour l’étude de la biomécanique des disques sains. Un disque d’apparence sain peut en effet être à l’origine de douleurs par compression des racines nerveuses avant de présenter des signes de dégénérescences visibles. Il est donc intéressant de renforcer les propriétés mécaniques des disques a priori sains pour prévenir ou traiter les douleurs associées à la dégénérescence du disque. L’analyse a été réalisée sur des unités intervertébrales prélevées chez un porc différent des exemples 4 et 5 (plateau supérieur + DIV + plateau inférieur) : T13-T14, T14-T15 (témoin non injecté), T15-L1, L1-L2. Après analyse d’image de radiographie pour obtenir la surface et la hauteur du disque, chaque échantillon a été caractérisé dans les conditions suivantes : - Analyse des propriétés mécaniques du disque sain, - Injection de 100 pl de solution de chitosane dans le disque sain et analyse des propriétés mécaniques du disque sain injecté placé à 37°C en atmosphère humide pendant 8h. L’analyse en biomécanique a été réalisée comme décrit dans l’exemple 5. L’injection de la solution de chitosane a permis un gain en hauteur moyen de l’espace intradiscal de 1.2 mm. Une telle rehausse de l’espace intradiscal peut permettre in vivo de diminuer les compressions des racines nerveuses et donc de soulager des douleurs liées à la dégénérescence du disque.

De plus, une analyse mécanique en compression a montré que la solution de chitosane n’a pas entraîné une augmentation de la rigidité du disque. Cette conservation des propriétés de rigidité du disque montre que l’injection d’une solution de chitosane n’entraine pas de perte de mobilité de l’unité vertébrale. L’analyse de la relaxation de contrainte réalisée selon le protocole décrit dans l’exemple 5 a permis de déterminer les paramètres viscoélastiques suite aux injections de la solution de chitosane. Ainsi, 8h après les injections dans le DIV sain, un gain de la viscosité globale r|o et du module élastique Eo ont été observés pour l’ensemble des disques sains injectés avec la solution de chitosane, ce gain en viscoélasticité n’a pas été observé chez le témoin sain non injecté comme l’illustre la figure 6A et 6B.

La dissection des DIV 8h après les injections a permis la mise en évidence d’un gel de chitosane individualisé et adhérent aux constituants du NP comme l’illustre la figure 7. L’ensemble des résultats obtenus montre que l’utilisation des solutions de chitosane dans le cadre de la prévention des maladies associées au rachis pourra immédiatement après l’injection restaurer les propriétés mécaniques du DIV (gain en hauteur, gain viscoélastique).

Exemple 7 : étude ex vivo de la répartition des solutions après injection et du positionnement de l’implant

Une solution de chitosane 3 % a été préparée selon le protocole décrit dans l’exemple 2 et additionnée de 0,4 mM de produit de contraste (acide gadotérique, DOTAREM ®). Cet agent de contraste est couramment utilisé en IRM et permet d’obtenir un signal plus intense et de marquer le produit d’intérêt afin de le différencier des tissus biologiques. Π a été préalablement vérifié que l’ajout de DOTAREM® n’altérait pas les propriétés physicochimiques de la solution de chitosane, en particulier ses propriétés de gélification. 100 pl de solution ont été injectés dans le DIV lombaire L6-L7.

Le suivi par IRM nous a permis de visualiser le produit avec du DOTAREM 0,4 mM dans le DIV (Figure 8). Après quelques minutes, le produit reste toujours dans le DIV (temps entre le début de la manip et l’acquisition des données). 1 h après l’injection de la solution de chitosane/DOTAREM®, une mobilisation maximale du rachis en sollicitation de type flexion, torsion et extension) a été réalisée de façon manuelle en mimant ainsi la remise en charge du rachis de l’animal. L’observation directe n’a pas montré la sortie du produit par le site d’injection. Les clichés IRM ont montré que le produit était toujours présent et n’avait pas diffusé (observation de la section sagittale).

Ainsi, l’injection des solutions de chitosane selon la présente demande permettent la formation dans le disque d’un implant homogène qui reste en place après injection avec un dispositif d’injection manuel même après sollicitation du rachis en flexion, torsion et extension.

Exemple 8 : comparaison du comportement rhéologique du noyau pulpeux d’un disque de cochon avec celui d’un implant obtenu après injection d’une solution de chitosane

Le noyau pulpeux de trois segments intervertébraux de cochon a été extrait après euthanasie d’un cochon de 3 mois. Le module élastique G’ du noyau pulpeux a été étudié par analyse viscoélastique dynamique sur la même gamme de fréquence angulaire que celle utilisée pour les solutions de chitosane testées à l’exemple 3.

Les modules élastiques G’ des 4 implants obtenus à partir des 4 solutions de chitosane préparées à l’exemple 3 ont également été mesurés et comparés avec le module élastique du noyau pulpeux (Figure 9).

On remarque que les propriétés élastiques des hydrogels de chitosane sont supérieures à celles du noyau pulpeux, ce qui signifie que les implants obtenus après injection des solutions de chitosane selon l’invention présentent un comportement de gel plus cohésif avec une composante plus élastique que le noyau pulpeux. Les implants étant moins liquides que le noyau pulpeux, ils seront plus difficilement extrudés du disque en cas de lésion de l’anneau fibreux. Il en résulte que les implants introduits dans le noyau pulpeux du disque permettront de restaurer les propriétés viscoélastiques des disques sans risquer d’en être expulsés.

Claims (10)

1. REVENDICATIONS

   1. Solution aqueuse homogène de chitosane injectable contenant un chitosane ayant un degré d'acétylation inférieur à 20%, avantageusement inférieur à 10%, ladite solution contenant entre 0,1 et 6 %, avantageusement entre 1 et 4,5 %, en poids de chitosane, ladite solution présentant un pH inférieur à 6,2, avantageusement compris entre 5 et 6,2, ladite solution ne contenant pas de chitosane ayant un degré d'acétylation supérieur à 20%, pour la prévention ou le traitement de la dégénérescence du disque intervertébral, et/ou des douleurs associées à la dégénérescence ou à des pathologies du disque intervertébral.
2. 2. Solution aqueuse selon la revendication 1, caractérisée en ce qu’elle présente un pH supérieur ou égal à 5,2 et avantageusement compris entre 5,2 et 6,2, de préférence entre 5,3 et 6,2, et plus préférentiellement 5,7 et 6,2.
3. 3. Solution aqueuse selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le chitosane a une masse moléculaire moyenne en masse comprise entre 100 000 et 1 500 000 g/mol, avantageusement entre 200 000 et 1 000 000 g/mol, plus avantageusement entre 250 000 et 900 000 g/mol, et encore plus avantageusement entre 250 000 et 800 000 g/mol.
4. 4. Solution aqueuse selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle présente une viscosité à haute vitesse de cisaillement (typiquement 104 s’1) comprise entre 0,001 et 15 Pa.s de préférence entre 0,01 et 5 Pa.s, et plus préférentiellement entre 0,05 et 1 Pa.s.
5. 5. Solution aqueuse selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle est susceptible d'être préparée par les étapes suivantes : - dissolution du chitosane en solution aqueuse par ajout d'acide tel qu'un acide faible, ledit acide faible étant avantageusement choisi dans le groupe constitué par l'acide acétique, l'acide glycolique, l'acide lactique, l'acide glutamique, et leurs mélanges, - et éventuellement réajustement du pH pour obtenir une solution aqueuse présentant un pH compris entre 5 et 6,2.
6. 6. Solution aqueuse selon la revendication précédente, caractérisée en ce que le réajustement du pH est réalisé par dialyse contre une solution tampon présentant un pH supérieur à 6,2, avantageusement compris entre 6,3 et 7,5.
7. 7. Solution aqueuse selon l’une des revendications 4 ou 5, caractérisée en ce que la solution tampon est une solution saline de tampon phosphate.
8. 8. Solution aqueuse selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu’elle comprend en outre au moins un composé actif tel qu'un composé analgésique, anesthésique local, tel que la lidocaïne, mépivacaïne, bupivacaïne ou ropivacaïne, une hormone, ou encore un composé actif du type facteur de croissance ou oligosaccharide bioactif, par exemple un oligosaccharide d'acide hyaluronique ou oligosaccharide de chitosane de degré de polymérisation inférieur à 20, ou encore un acide nucléique, une protéine ou un anticancéreux.
9. 9. Solution aqueuse selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu’elle contient de 0,01 à 0,95 % en poids de sel de monophosphate, de sel dibasique de monophosphate ou de sel monocarboxylique de polyol ou de sucre, en particulier de phosphate de glycérol, de préférence de 0,01 à 0,9 % en poids. Solution aqueuse selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu’elle consiste en - 0,1 à 6 %, avantageusement 1 à 4,5 %, et plus avantageusement 1 à 3,5% en poids d’un chitosane ayant un degré d'acétylation inférieur à 20%, avantageusement inférieur à 10%, - 94 à 99,9 % en poids d’eau, - un acide choisi dans le groupe constitué par l'acide acétique, l'acide glycolique, l'acide lactique, l'acide glutamique, et leurs mélanges, en une quantité stoechiométrique par rapport aux fonctions amines du chitosane, par exemple de 0,01 à 2 % en poids dudit acide, - 0,01 à 2 % en poids d’un sel tel que le chlorure de sodium - 0 à 2 % en poids d’un composé ayant une activité thérapeutique, par exemple un composé analgésique, un composé anesthésique local comme la lidocaïne, mépivacaïne, bupivacaïne ou ropivacaïne, un composé anti-inflammatoire comme les corticoïdes, une hormone, ou encore un composé actif du type facteur de croissance ou oligosaccharide bioactif, par exemple un oligosaccharide d'acide hyaluronique ou oligosaccharide de chitosane de degré de polymérisation inférieur à 20, ou encore un acide nucléique, une protéine ou un anticancéreux, ladite solution présentant un pH inférieur à 6,2, avantageusement compris entre 5 et 6,2, ladite solution ne contenant pas de chitosane ayant un degré d'acétylation supérieur à 20%.
10. 10. Solution selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle est formulée pour être administrée par injection intradiscale par voie percutanée.