FR3026917A1 - Biosurfactants de pseudomonas pour lutter contre les legionelles - Google Patents

Abstract

La présente invention a pour objet un procédé d'inhibition de la croissance des bactéries du genre Legionella, comprenant l'utilisation d'au moins un lipopeptide et/ou un rhamnolipide produit par des bactéries du genre Pseudomonas. La présente demande fournit aussi des procédés de traitement des eaux.

Description

1 Introduction La présente invention a pour objet un nouveau procédé de traitement des légionelles de l'espèce Legionella pneumophila dans tous les milieux potentiellement contaminés par cette bactérie.

Les légionelles sont des bactéries aquatiques que l'on rencontre dans les eaux naturelles (lacs, rivières et marais) et qui se développent particulièrement dans les eaux tièdes (entre 25 et 45°C). Ces bactéries sont responsables chez l'homme d'infections respiratoires aigües, les légionelloses (maladie du légionnaire, fièvre de Pontiac) ainsi que d'anomalies biologiques extra-pulmonaires non spécifiques. La maladie du légionnaire est considérée comme une infection opportuniste. En France, les données issues de la déclaration obligatoire font état de 1527 cas de légionellose déclarés en 2005, représentant une incidence de 2 cas pour 100000 habitants contre une estimation de 8000 à 18000 cas de légionellose chaque année aux États-Unis. A ce jour, environ 50 espèces de Legionella ont été identifiées. L'espèce L. pneumophila est la plus répandue et la plus virulente pour l'homme. Parmi les 15 sérogroupes de L. pneumophila (représentant 90 à 95% des cas cliniques), le sérogroupe (SG) 1 est responsable de 84 % des infections humaines. Les légionelles colonisent naturellement les réseaux d'eau d'alimentation. Elles sont présentes dans les eaux réchauffées des systèmes de conditionnement d'air, des tours aéroréfrigérantes (TAR), dans les réseaux d'eau chaude sanitaire (cumulus) où elles se multiplient de façon optimale entre 30° et 40°C. Elles peuvent contaminer des établissements comme les piscines, les équipements de stations thermales, les fontaines et, dans les hôpitaux, les humidificateurs, les respirateurs ou les nébulisateurs.

La lutte contre les légionelles, en particulier dans les réseaux d'eau, est difficile. En effet, la bactérie se trouve rarement sous forme planctonique, mais est généralement associée à deux types d'interactions, à savoir avec les biofilms (Declerck et al., 2007) et avec des protozoaires dont, notamment, des amibes (Rowbotham, 1980). Dans les biofilms, les microorganismes sont associés de façon irréversible avec une surface et englobés d'une matrice extracellulaire constituée de polymères complexes (Hall-Stoodley et al. 2004). Ce mode de vie confère aux bactéries une résistance accrue aux conditions environnementales délétères et aux 3026917 2 biocides (Borella et al. 2005; Kim et al. 2002). Les légionelles sont aussi associées à des protozoaires (amibes), qui, en les ingérant, permettent leur croissance intracellulaire et leur réplication. Cette multiplication intracellulaire procure aux légionelles un environnement protecteur contre les agressions du milieu. Biofilms 5 comme amibes infectées permettent donc aux légionelles d'échapper aux traitements. Les bactéries peuvent ensuite reprendre leur croissance et recoloniser les systèmes de traitement d'eau. En conséquence, à l'heure actuelle, bien que les traitements utilisés contre Legionella soient nombreux, ils ne sont pas pleinement efficaces. La résistance aux traitements conférée par les biofilms et les amibes 10 circulantes pose ainsi un grave problème de santé publique. Il est donc crucial d'identifier et d'isoler de nouveaux agents antibactériens actifs contre Legionella et ce, même dans les biofilms et les amibes. Description Les inventeurs ont maintenant identifié de nouveaux agents capables de lutter contre 15 les légionelles et ce, même quand ces bactéries participent à des biofilms ou sont incluses dans des amibes. Les présents inventeurs ont en effet montré que des lipopeptides et/ou des rhamnolipides produits par des bactéries du genre Pseudomonas sont capables d'inhiber la croissance des bactéries Legionella en milieu solide et en milieu liquide.

20 Cette inhibition est due à une activité bactéricide, ce qui est particulièrement avantageux dans le domaine du traitement des eaux. En outre les lipopeptides et/ou rhamnolipides de l'invention peuvent tuer les légionelles même quand celles-ci sont sous forme de biofilm, ce qu'aucun agent anti-légionelle de l'art antérieur n'est capable de faire.

25 La présente invention a donc pour objet un procédé d'inhibition de la croissance des bactéries du genre Legionella comprenant l'utilisation d'au moins un lipopeptide et/ou un rhamnolipide produit par des bactéries du genre Pseudomonas. Toutefois, les procédés d'inhibition de la croissance des légionelles selon l'invention ne comprennent pas les méthodes de traitement du corps humain ou animal.

30 Par - lipopeptide », on entend ici des peptides généralement cycliques produits par des bactéries telles que les Bacillus et les Pseudomonas. Ils sont principalement constitués d'une partie peptidique hydrophile, contenant préférentiellement de 7 à 3026917 3 25 acides aminés, reliés à une partie lipidique hydrophobe, le plus souvent un acide gras. Les lipopeptides sont bien connus de l'homme du métier, en raison de leurs propriétés biologiques. Par exemple, un grand nombre d'entre eux ont des propriétés de tensioactifs ou ont des activités antibactériennes ou antifongiques qui leur ont 5 attiré l'intérêt des industriels. Toutefois, c'est ici la première fois qu'une activité de ces molécules contre des légionelles est mise en évidence. Chez les bactéries du genre Pseudomonas, les lipopeptides produits peuvent être groupés en quatre grandes familles, chacune d'elle représentant des molécules structurellement apparentées : la famille de l'amphisine, la famille de la viscosine, 10 la famille de la tolaasine et la famille de la syringomycine. La famille de l'amphisine regroupe des lipopeptides ayant une chaine peptidique composée de 11 acides aminés, tandis que celle des membres de la famille de la viscosine comprend 9 acides aminés. Dans les deux cas, la partie lipidique est constituée par un acide 3 hydroxydécanoïque. Les lipopeptides de la famille de la tolaasine présentent les plus 15 grandes variations dans la longueur de la chaine peptidique (entre 19 et 25 acides aminés). On y note la présence d'acides aminés inhabituels comme l'homosérine ou l'acide 2,3-dehydro-2-aminobutyrique. Par ailleurs, la chaine lipidique de ces lipopeptides peut être un acide 3 hydroxydécanoïque ou un acide 3 hydroxyoctanoïque. Enfin, les membres de la famille de la syringomycine 20 comprennent une chaine peptidique de 9 acides aminés, dont certains sont peu habituels comme l'acide 2,4-diaminobutyrique et un résidu thréonine chloré en C-terminal. La partie lipidique peut être un acide 3 hydroxyle avec 10, 12 ou 14 carbones. En outre, plusieurs nouveaux lipopeptides ont récemment été identifiés chez Pseudomonas, dont l'arthrofactine de la souche MIS38 de Pseudomonas sp. 25 (Roongsawang et al., 2003), les putisolvines I et II de Pseudomonas putida (Kuiper et al., 2004; Kruijt et al., 2009), l'orfamide de la souche Pf-5 de Pseudomonas fluorescens (Paulsen et al., 2005; Gross et al., 2007), les pseudodesmines A et B d'une souche de Pseudomonas isolée à partir de la peau de salamandre (Sinnaeve et al., 2009).

30 Dans un mode de réalisation préféré, le lipopeptide de l'invention appartient à la famille de la viscosine. En particulier, la famille de la viscosine comprend des lipopeptides, les massétolides, qui sont produits par différentes souches de Pseudomonas sp. et qui sont structurellement très proches de la viscosine (Gerard et al., 1997 ; de Bruijn, 2008). Outre ces composés, la famille de la viscosine comprend 3026917 4 aussi le composé WLIP (« White Line Inducing Principle » ; Coraiola et al., 2006), un lipopeptide produit par P. reactans qui ne diffère de la viscosine que par la chiralité d'un acide aminé. En particulier, les lipopeptides au sens de l'invention représentent une famille de 5 lipopeptides comprenant un depsipeptide cyclique. Par « depsipeptide », on entend un peptide dans lequel une ou plusieurs des liaisons amide (-CONH-) sont remplacées par des liaisons ester (-000-). Plus particulièrement, les lipopeptides de l'invention sont des lipopeptides cycliques formé d'un depsipeptide de 9 acides aminés, contenant trois résidus L-leucine (L-Leu), un acide D-glutamique (D-Glu), un résidu D- 10 alto thréonine (Da-Thr), un résidu D-allo isoleucine (Dalle) ou un résidu D-valine (D- Val), deux résidus D-sérine (D-Ser), et un résidu L-isoleucine (L-Ile) ou L-Leucine (L-leu) ou L-valine (L-Val), lié à un acide gras beta-hydroxylé linéaire contenant de 10 à 12 atomes de carbone. Préférablement, un lipopeptide selon l'invention est un composé de formule (I) : R-L-Leu-D-Glu-Da-Thr-X1-Lleu-D-Ser-L-Leu-D-Ser-X2 15 (I) dans lequel : R est un acide gras beta-hydroxylé linéaire contenant n atomes de carbone, où n est un nombre entier compris entre 10 et 12 ; 20 X1 = D-Ile ou D-Val ; et X2= L-Ile ou L-Leu ou L-Val. Préférablement, le lipopeptide selon l'invention est choisi parmi la viscosine et les massétolides A, B, C, D, E, F, G et H. Selon un mode de réalisation préféré, la viscosine est un composé de formule (I) dans 25 lequel n= 10, X1 = D-Val et X2= Lite. Selon un autre mode de réalisation préféré, le massétolide A est un composé de formule (I) dans lequel n= 10, X1 = Dalle et X2= L-Ile.

3026917 5 Selon un autre mode de réalisation préféré, le massétolide B est un composé de formule (I) dans lequel n= 11, X1 = Dalle et X2= L-Ile. Selon un autre mode de réalisation préféré, le massétolide C est un composé de formule (I) dans lequel n= 12, X1 = Dalle et X2= L-Ile.

5 Selon un autre mode de réalisation préféré, le massétolide D est un composé de formule (I) dans lequel n= 10, X1 = Dalle et X2= L-Leu. Selon un autre mode de réalisation préféré, le massétolide E est un composé de formule (I) dans lequel n= 10, X1 = D-Val et X2= L-Val. Selon un autre mode de réalisation préféré, le massétolide F est un composé de 10 formule (I) dans lequel n= 10, X1 = D-Val et X2= L-Leu. Selon un autre mode de réalisation préféré, le massétolide G est un composé de formule (I) dans lequel n= 11, X1 = D-Val et X2= L-Ile. Par - rhamnolipide », on entend au sens de l'invention des structures glycolipidiques amphiphiles constituées d'une partie osidique reliée par une liaison osidique à une 15 partie lipidique hydrophobe. On connait ainsi environ 60 rhamnolipides différents, dont la plupart est produite par des bactéries du genre Pseudomonas (AbdelMawgoud et al., 2010 ; Abdel-Mawgoud et al., 2011). Toutefois, ils ont surtout été étudiés pour leur activité facilitatrice de l'action des phospholipases de Pseudomonas, grâce à leur pouvoir détergent sur les phospholipides membranaires 20 qui facilite l'accessibilité de ceux-ci aux phospholipases (voir par exemple WO 2012/010406). Ils ont aussi été étudiés pour leur activité régulatrice des biofilms comprenant des Pseudomonas (Davey et al., 2003 ; Botes et al., 2005). En revanche, les présents inventeurs sont les premiers à avoir montré que les rhamnolipides produits par Pseudomonas sont capables de tuer les légionelles.

25 Préférablement, la partie osidique des rhamnolipides de l'invention est un monomère ou un multimère du rhamnose, notamment un dimère. La partie hydrophobe des rhamnolipides comprend le plus souvent un ou plusieurs acides gras hydroxyles reliés entre eux par une liaison ester. Avantageusement, lesdits acides gras comprennent entre 8 et 16 carbones. En outre, lesdits acides gras peuvent être des acides gras 30 saturés ou insaturés ; dans ce dernier cas, ils comprendront avantageusement une ou deux doubles liaisons (Abdel-Mawgoud et al., 2010 ; Abdel-Mawgoud et al., 2011).

3026917 6 Selon un mode de réalisation avantageux, les rhannnolipides de l'invention comprennent un (mono-rhamno-) ou deux (di-rhamno-) rhamnoses. Selon un autre mode de réalisation avantageux, les rhannnolipides de l'invention comprennent un (mono-lipide) ou deux (di-lipide) acides gras hydroxylés. Les rhannnolipides de 5 l'invention sont plus particulièrement choisis parmi les mono-rhamno-mono-lipides, les mono-rhamno-di-lipides, les di-rhamno-mono-lipides et les di-rhamno-di-lipides. On peut citer, par exemple, Rha-C8, Rha-Rha-C10, Rha-Rha-C10-C8, Rha-c8:1, R Rha-C10-C8, Rha-Rha-C12:1-C8, Rha-Cio-Cio:i, Rha-C10-C10, Rha-Rha-Cio-C12:2, Rha-RhaCm-C12:1, Rha-C12-C10:1, Rha-C12 et Rha-C12-C10.

10 Préférentiellement, les rhannnolipides de l'invention sont choisis dans les mono- rhamno-mono-lipide. Plus préférentiellement, les mono-rhamno-mono-lipides de l'invention comprennent une chaine d'acide gras comprenant de 8 à 14 carbones (Rha-C8 à Rha-C14), ladite chaine d'acides gras pouvant comprendre de 0 à 2 insaturations. De façon encore plus préféré, la chaine d'acides gras des 15 rhannnolipides de l'invention comprend 8 carbones. Selon le mode de réalisation le plus préféré, le rhamnolipide de l'invention correspond au Rha-C8 (Abdel-Mawgoud et al., 2010 ; Abdel-Mawgoud et al., 2011). Par - légionelle », on entend une bactérie du genre Legionella. Ce genre regroupe une cinquantaine d'espèces, dont notamment les espèces Legionella pneumophila, L. 20 jordanis, L. oakridgensis, L. dumofii, L. bozemanii, L. drozanskii, L. fallonii, L. rowbothamii, L. feeleii, L. micdadei, L. lytica et L. longbeachae. En particulier, L. pneumophila est la bactérie la plus importante en pathologie humaine. On connaît à l'heure actuelle 15 sérogroupes pour cette bactérie. Elle est l'agent responsable d'environ 90% des cas de légionelloses diagnostiqués en France. Le sérogroupe 1 est 25 le plus fréquent (70 à 90% des cas) puis le sérogroupe 6. De préférence, une légionelle au sens de l'invention est une bactérie de l'espèce L. pneumophila. Encore plus préférablement, la légionelle au sens de l'invention est une bactérie de de l'espèce L. pneumophila et du sérogroupe 1 ou 6. Les légionelles selon l'invention peuvent se trouver sous forme planctonique, c'est-à- 30 dire sous la forme libre et circulante de la cellule bactérienne. Cependant, il est aussi connu que des légionelles telles que L. pneumophila peuvent aussi se trouver sous forme de biofilm. Par - biofilm », on entend ici un type d'organisation de microorganismes dans laquelle les cellules adhèrent à une surface.

3026917 7 Le plus souvent, les biofilms sont caractérisés par la sécrétion d'une matrice adhésive et protectrice d'exopolynnères. Dans un biofilm, les microorganismes et, en particulier, les bactéries, dont notamment les légionelles, sont sous forme sessile », c'est-à-dire attachés à la surface et vivant en communauté.

5 De nombreux microorganismes, dont les légionelles, forment des biofilms. Il est d'ailleurs considéré qu'il s'agit là du mode de vie naturel des microorganismes et, en particulier, des légionelles. La structure et la physiologie du biofilm donneraient aux microorganismes qui le constituent des conditions d'organisation sociale proches de celles qu'établissent entre elles les cellules eucaryotes au sein des tissus. Ainsi, les 10 biofilms constituent des réservoirs pour plusieurs espèces de microorganismes dont les légionelles, et leur fournissent une protection vis-à-vis des agressions extérieures, telles que les agents désinfectants, les antibiotiques, les antiseptiques, via la matrice extracellulaire. Par exemple, les légionelles ainsi protégées peuvent survivre à l'action d'un désinfectant puis reformer un biofilm ou être décrochées de celui-ci 15 et se retrouver dans l'eau circulante ou sous forme d'aérosol. Un biofilm selon l'invention peut comprendre une ou plusieurs espèces de microorganismes. Préférentiellement, le biofilm selon l'invention comprend des cellules d'au moins une espèce de légionelle. Plus préférentiellement, le biofilm selon l'invention ne comprend que des cellules de légionelle. Plus préférentiellement 20 encore, le biofilm selon l'invention est constitué des cellules d'une seule espèce de légionelle. En outre, ces bactéries sont capables de se multiplier à l'intérieur de cellules de protozoaires telles que les amibes libres. Par - amibe », on entend ici un organisme unicellulaire du groupe des Rhizopodes capable d'émettre des pseudopodes. Les 25 - amibes libres » selon l'invention sont des amibes qui mènent une existence autonome dans l'environnement et sont totalement indépendantes de l'homme. Ce sont pour la plupart des espèces vivant dans les eaux, les sols humides et les mousses. Les légionelles sont capables de pénétrer dans des amibes libres, comme par exemple, Acanthamoeba sp., Didasculus sp., Echinamoeba sp., Hartmanella sp., 30 Mayorella sp., Naegleria sp., Schizopyrenus sp., Vahlkampfia sp., et de se multiplier dans des vacuoles. Après 36 à 48 heures d'infection, la vacuole de phagocytose emplit la quasi-totalité de la cellule hôte et contient un nombre important de bactéries. Celles-ci sont ensuite libérées dans l'environnement et vont ainsi pouvoir 3026917 8 de nouveau coloniser des biofilms, infecter d'autres amibes ou contaminer des personnes. Les amibes constituent une protection pour les légionelles et leur permettent de survivre pendant de longues périodes lorsque les conditions sont défavorables. Il est 5 en particulier bien connu que les amibes permettent aux légionelles d'échapper aux traitements visant à les éradiquer. Or les lipopeptides et/ou rhamnolipides de l'invention sont capables de lyser les cellules de légionelles quand celles-ci sont non seulement sous forme libre, mais aussi sous forme de biofilm ou incluses dans des amibes. Il s'agit là d'un avantage très important de l'invention, puisque ces deux 10 dernières formes constituent les voies habituellement empruntées par les légionelles pour échapper aux traitements. Dans un mode de réalisation particulier, l'invention a donc pour objet un procédé d'inhibition de la croissance des bactéries du genre Legionella comme décrit ci-dessus, dans lequel les bactéries sont sous forme planctonique. Dans un autre mode 15 de réalisation particulier, l'invention a pour objet un procédé d'inhibition de la croissance des bactéries du genre Legionella comme décrit ci-dessus, dans lequel les bactéries sont sous forme de biofilm. Dans encore un autre mode de réalisation particulier, l'invention a pour objet un procédé d'inhibition de la croissance des bactéries du genre Legionella comme décrit ci-dessus, dans lequel les bactéries sont 20 sous forme intracellulaire dans des protozoaires, notamment des amibes. Les légionelles colonisent les milieux aqueux naturels et artificiels. Dans ces derniers, elles peuvent aussi être transportées par aérosols. Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux du procédé de l'invention, celui-ci comprend le traitement d'un flux gazeux ou liquide avec les lipopeptides de l'invention.

25 L'inhibition de la croissance de bactéries du genre Legionella est très importante afin d'éviter des infections par les légionelles telles que la pneumonie et la fièvre de Pontiac, qui sont provoquées par l'inhalation d'un aérosol contenant des bactéries du genre Legionella. Les lipopeptides et/ou rhamnolipides de l'invention permettent d'empêcher la survie et à la prolifération des légionelles dans l'eau, et de limiter 30 leur diffusion sous forme d'aérosols. Ils sont ainsi particulièrement utiles pour prévenir les infections par les légionelles par le traitement des milieux aqueux artificiels, tels que les réseaux de distribution d'eaux sanitaires ou d'eaux 3026917 9 industrielles, les circuits de refroidissements et les tours aéroréfrigérantes des installations industrielles, les réseaux de climatisations, etc... Les lipopeptides et/ou rhamnolipides de l'invention peuvent être appliqués à un site où l'on s'attend à la croissance de bactéries du genre Legionella, sans aucune 5 limitation particulière. Comme expliqué plus haut, les légionelles selon l'invention sont présentes dans les réservoirs naturels ou artificiels d'eau douce tels que les réseaux de distribution d'eau chaude sanitaire (ballons de réserve d'eau, douches, robinets), les systèmes de climatisation les tours aéroréfrigérantes, les eaux thermales ou encore les fontaines décoratives où elles prolifèrent dans l'eau 10 stagnante et lorsque la température de l'eau est comprise entre 25 et 43°C. Le procédé d'inhibition de la croissance des légionelles selon l'invention trouve donc une application, en particulier, dans la désinfection des réseaux de distribution d'eaux sanitaires ou d'eaux industrielles, des circuits de refroidissement des installations industrielles, ou des réseaux de climatisation.

15 Selon cet aspect particulier, l'invention a pour objet un procédé de désinfection des milieux aqueux artificiels, comprenant l'utilisation des lipopeptides et/ou rhamnolipides décrits ci-dessus. Préférentiellement, ces milieux aqueux artificiels sont des réseaux de distribution d'eaux sanitaires (notamment en milieu hospitalier) ou d'eaux industrielles, des stations d'épuration, des circuits de refroidissements et 20 des tours aéroréfrigérantes, des circuits de géothermie, notamment des pompes à chaleurs, des installations industrielles, ou des réseaux de climatisations. Le procédé de désinfection de l'invention est particulièrement avantageux car il permet de lutter contre les légionelles sous toutes les formes. En particulier, selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, le procédé de l'invention est mis en oeuvre 25 pour lutter contre la prolifération de légionelles au sein des biofilms dans les canalisations d'eaux. Le plus souvent, un flux gazeux ou liquide est traité avec les lipopeptides de l'invention. Les lipopeptides et/ou rhamnolipides de l'invention peuvent ainsi être directement ajoutés aux eaux ou aux liquides circulant dans les canalisations ou dans 30 les réseaux à traiter. Il est également possible de les pulvériser, par exemple sous la forme d'une solution aqueuse en aérosol, dans les réseaux, les cheminées, les installations et les surfaces industrielles à désinfecter.

3026917 10 Selon un autre aspect, l'invention a pour objet un agent désinfectant contenant au moins un des lipopeptides et/ou au moins un des rhamnolipides de l'invention. Préférablement, l'agent désinfectant de l'invention comprend au moins un rhamnolipide et/ou au moins un massétolide. De façon avantageuse, l'agent 5 désinfectant selon l'invention se présente sous la forme d'une solution ou d'une suspension aqueuse, par exemple dans de l'eau distillée. L'agent désinfectant peut aussi se présenter sous une forme pulvérisable, par exemple en aérosol. L'activité inhibitrice de ces lipopeptides et/ou rhamnolipides produits par les bactéries du genre Pseudomonas, et en particulier des massétolides, vis-à-vis des 10 légionelles a été mise en évidence par les inventeurs non seulement sur la forme planctonique de la bactérie, mais aussi sur la forme de biofilm et sur la forme à l'intérieur des amibes libres. Etant donné le rôle essentiel joué par les amibes libres et les biofilms dans la prolifération et le maintien des légionelles dans le milieu extérieur, éléments qui conditionnent l'épidémiologie de la légionellose puisqu'il 15 n'existe pas de transmission interhumaine, le procédé et l'agent désinfectant envisagé selon l'invention présentent de nombreux avantages, en termes de coût, d'efficacité et de respect de l'environnement. Outre les dispositions qui précèdent, la présente invention comprend également d'autres caractéristiques et avantages qui ressortiront des exemples et figures qui 20 suivent, et qui doivent être considérés comme illustrant l'invention sans en limiter la portée. Légendes des Figures Figure 1 : Quantité de biofilm de Legionella restant à la surface des cônes après 2 heures de contact avec les extraits lipopeptides des souches P. otidis 4014 et P. 25 fluorescens PfA7b. La souche DSS73 est un contrôle négatif.Les résultats sont présentés comme la moyenne de 3 expériences indépendantes avec l'écart type comme incertitude. Significativité des résultats : *** P < 0.0001 Figure 2: Imagerie ApoTtome de biofilms âgés de 6 jours formés par des L. pneumophila marqués au DsRed. Les biofilms ont été traités 2 heures soit avec de 30 l'éthanol comme témoin(A), des extraits lipopeptides dilués au 1/40 de la souche P. otidis 4014 (B) ou de P. fluorescens PfA7b. Chaque image est représentative des résultats obtenus dans au moins deux expériences indépendantes.

3026917 11 Figure 3 : Perméabilisation de A. castellanii par les "extraits TA". Des trophozoïtes de A. castellanii ont été traités 2h avec les "extraits TA" purs à 30°C. Les résultats sont présentés comme la moyenne du pourcentage de perméabilisation des cellules, déterminé par la méthode au Sytox green, issu de deux expériences indépendantes.

5 Significativité des résultats : *** : p < 0,001 ; ** : p < 0,01, ns: non significatif (logiciel GraphPad Instat). Figure 4 : Trophozoïtes d'A. castellanii traités 2 h avec les "extraits TA" purs. Un tapis de trophozoïtes d'A. castellanii a été traité 2h avec du tampon amibe (A, contrôle), ou les extraits non dilués de Pfa7b (B), 4014©. 1, forme trophozoïte; 2, 10 amibe lysée; 3, amibe décrochée commençant à s'enkyster; 4, cellules en cours d'enkystement. Figure 5 : Chromatogramme obtenu par HPLC avec un gradient acétonitrile 2%-100% de "l'extrait TA" PfA7b. Quatre fractions correspondant aux pics majoritaires ont été collectés et nommées B, C, D et E. La fraction C a été analysée en 15 spectrophotométrie de masse. Figure 6 : Analyse ESI-MS de - l'extrait TA » de P. fluoresccens PfA7b. (a) Spectre de masse de la fraction active C de « l'extrait TA » PfA7b. Figure 7 : Profil d'élution LC-MS de - l'extrait ACN » de P. fluoresccens PfA7b. Deux masses ont été détectées (1111 et 1125 Da).

20 Figure 8 : Analyse en LC-MS des composés de masse 1111 Da (A) et 1125 Da (B) de l'extrait ACN » de P. fluoresccens PfA7b. Exemples Matériel et méthodes Souches, conditions de culture et réactifs 25 La souche Legionella pneumophila Lens CIP 108286 (Sérogroupe 1) a été obtenue auprès de la CIP (Collection Institut Pasteur, Institut Pasteur, Rue du Docteur Roux, 75015 Paris, France). Les autre souches bactériennes de référence ont été obtenues auprès de plusieurs collections : LMG (Library of Microbiology Universiteit Gent, Belgique), ATCC (American Type Culture collection), CIP (Collection Institut Pasteur) 30 ou proviennent de la collection de souches du laboratoire.

3026917 12 Les souches de Legionella ont été cultivées à 37°C soit sur milieu BCYE (buffered charcoa( yeast extract) gélosé pendant 96 h ou en milieu BYE (buffered yeast extract) liquide sous agitation (150 rpm) pendant 30 h. La souche L. pneumophila Lens (CIP 108286) (Cazalet et al. 2008) a été utilisée comme modèle pour la 5 formation de biofilm. Cette souche a été cultivée en milieu liquide SBB (supp(emented biofilm broth), comme décrit par Pecastaings et al. (Pecastaings et al. 2010). Les souches de Pseudomonas ont été cultivées pendant 24 à 48h en milieu BHI (Brain Heart Infusion) liquide ou gélosé, à 30°C ou 37°C selon la nature de la souche testée.

10 La production de biosurfactants a été obtenue en cultivant les souches 4014 de Pseudomonas otidis et PfA7b de Pseudomonas fluorescens en milieu MSM (minera( medium) soit additionné de glucose comme seule source de carbone (Janek et al. 2010) pour favoriser la production de lipopeptides, soit additionné de mannitol comme seule source de carbone (Déziel et al. 1999) pour favoriser la sécrétion de 15 rhamnolipides. Un volume de 200 ml de milieu a été inoculé à D0600 = 0.01 à partir d'une préculture ayant poussé sur la nuit, avant d'être incubé pendant 96 heures à 17°C pour la production de lipopeptides et 30°C pour la production de rhamnolipides, sous agitation. La croissance de chaque souche a été suivie par mesure de l'absorbance de la culture à 600 nm.

20 La souche Acanthamoeba castellanii ATCC 30234 a été obtenue de l'ATCC (American Type Culture Collection). Les cultures axéniques de Acanthamoebae ont été cultivées en milieu PYG (peptone yeast glucose) (Schuster 2002) et incubées à 30°C. Tous les autres réactifs ont été obtenus chez Sigma-Aldrich (Saint-Louis, MO, USA) sauf mention contraire.

25 Extraction et caractérisation des biosurfactants Les souches 4014 de Pseudomonas otidis et PfA7b de Pseudomonas fluorescens ont été cultivées en milieu MSM pendant 96 h à 17°C. Pour chaque culture, les bactéries ont été éliminées par centrifugation (10,000 x g, 30 min, 4°C) et le surnageant stérilisé par filtration à travers un filtre de seringue de 0.22 pm (Millipore, 30 Germany). Les bactéries du genre Pseudomonas sont capables de produire deux catégories au moins de surfactants, à savoir des lipopeptides et des rhamnolipides. Les 3026917 13 lipopeptides sont obtenus par trois extractions successives du surnageant de culture préalablement complémenté avec du glucose 20 g/L avec de l'acétate d'éthyle (1:1, v/v) suivi de l'élimination du solvant par évaporation sous vide et de la resuspension des lipopeptides dans un solvant adéquat. Les lipopeptides sont constitués d'une 5 partie lipidique et d'une partie peptidique. Afin de détecter la présence de ces molécules dans le résidu, des tests à la ninhydrine et à la primuline sur plaque de silice ont été réalisés. La ninhydrine permet de détecter la présence d'acides aminés. 10pl de l'échantillon ont été déposé sur la plaque de silice. La plaque de silice a été immergée dans une solution de ninhydrine (0,25% acétone) puis chauffée 10 à 105°C afin de révéler la présence (spot violet) d'acides aminés. La primuline permet de détecter la présence d'une partie lipidique. La plaque a été immergée dans une solution de primuline (5 mg/100 ml acétone/eau 80 :20) afin de révéler la présence (spot) sous UV de lipides. Les extraits obtenus sont dénommés - extraits lipopeptides ».

15 Les rhamnolipides ont été extraits en suivant la méthode décrite dans Déziel et al. (Déziel et al., 1999).Le surnageant de culture a été acidifié à pH = 3 pendant une nuit avant d'être extrait trois fois à l'acétate d'éthyle. Après évaporation du solvant, les rhamnolipides ont été resuspendus dans un mélange ACN/eau 2:3 (v/v). Les rhamnolipides sont constitués d'une partie lipidique et d'un ou plusieurs rhamnoses.

20 Afin de détecter la présence de ces molécules dans le résidu, des tests à l'anthrone et à la primuline sur plaque de silice (Silica gel 60) ont été réalisés : - L'anthrone permet de détecter la présence de glucide. 10pl de l'échantillon a été déposé sur la plaque de silice. La plaque a été immergée dans une solution d'anthrone (150 mg/100 ml acide sulfurique/eau milli-Q 75 :25) puis 25 chauffé à 80°C afin de révéler la présence (spot bleu ou rouge) de glucide. - La primuline permet de détecter la présence d'une partie lipidique d'une molécule. Le spot sera immergé dans une solution de primuline (5 mg/100 ml acétone/eau 80 :20) afin de révéler la présence (spot) sous UV de lipides. Les extraits ainsi obtenus ont été dénommés« extraits rhamnolipides ».

30 Dans une deuxième série d'expérience, afin d'optimiser la production de biosurfactants, les bactéries du genre Pseudomonas ont été cultivées dans 200 mL de milieu MSM pendant 4 jours de culture à 17°C sous agitation (180 rpm). Les bactéries 3026917 14 ont ensuite été éliminées par centrifugation (8000 rpm, 20 min, 18°C) puis le surnageant stérilisé par filtration à travers un filtre à seringue de 0,22 [Inn (Millipore, Allemagne). Les biosurfactants présents dans les différents surnageants de culture ont ensuite été extraits successivement trois fois avec de l'acétate d'éthyle (1:1, v / 5 v) avant l'évaporation du solvant sous vide. Les extraits ont été repris dans 5 ml d'un mélange H20/Acétonitrile (ACN) (3:2, v/v) ou, le cas échéant, dans 5 mL de Tampon Amibe (TA : citrate de sodium 1 g/L, MgSO4 4 mM, CaCl2 0,5 mM, Fe(NH)2(SO4)2 0,05 mM, Na2HPO4 2,5 mM, KH2PO4 2,5 mM). Les extraits ont alors été dénommés extraits ACN » ou - extraits TA », respectivement.

10 Purification des biosurfactants Les extraits lipopeptidiques et rhamnolipidiques de chacune des souches 4014 et PfA7b étant susceptibles de contenir plusieurs molécules, leur séparation a été entreprise par chromatographie liquide à haute performance. Les molécules ont été séparées sur une colonne Chromolith SpeedROD RP-18e HPLC en phase inverse (4,6 x 15 50 mm) (Merck Millipore, Billerica, MA, USA) avec une pompe HPLC Dionex P680, équipé d'un détecteur Dionex Ultime 3000. L'élution a été suivie à 205 nm et 214 nm. La séparation a été réalisée dans un système de solvant H20 /ACN/ 0.2% acide formique (v/v). Après un lavage initial de 2 min en ACN 60%, l'élution a été obtenue en 23 min à un débit de 0,8 ml / min avec un gradient linéaire de 6% à 100% ACN, 20 suivi d'un lavage de 5 min en ACN 100%. Toutes les fractions collectées ont été lyophilisées et conservées à -20°C en vue des analyses ultérieures. Analyses en spectrométrie de masse Les masses moléculaires des biosurfactants ont été déterminées par spectrométrie de 25 masse en électrospray (ESI-MS) à l'aide d'un spectromètre de masse de type Xevo Q- TOF (Waters, Milford, MA, USA). Les échantillons ont été suspendus dans 50% ACN/0,2% acide formique (v/v) et analysés, en mode positif pour les lipopeptides et négatif pour les rhamnolipides, par infusion à un débit de 0,5 ml/min. La tension d'ionisation a été réglée à 3,0 kV, la température de la source à 120 °C et la 30 température de désolvatation à 250°C. Les spectres LC MS/MS ont été obtenus en mode MSE (Waters, Milford, MA, USA En bref, en mode MSE, les balayages en masse alternent pendant toute l'expérience entre des énergies de fragmentation faibles (10 3026917 15 V) et fortes (montant de 30 à 60V), ce qui génère pour la même séparation LC (quel que soit le gradient) deux chromatogrammes correspondant aux analyses MS et MS/MS respectivement. Les spectres ont été mesurés entre 150 et 1500 Da. L'analyse des données a été réalisée à l'aide du programme MassLynx comprenant l'outil 5 BioLynx (Waters). Tests antibactériens in vitro Tests en goutte La souche indicatrice, L. pneumophila Lens, a été étalée (100 pl d'une suspension à 108 CFU/ml) sur milieu BCYE gélosé. On a ensuite déposé une goutte de 10 pl d'une 10 culture ayant poussé sur la nuit de la souche 4014 ou PfA7b sur la surface de ce milieu gélosé avant de l'incuber pendant 96 h à 37°C pour la souche 4014 ou 28°C pour la souche PfA7b. Détermination de la concentration minimale inhibitrice La concentration minimale inhibitrice (CMI) des extraits a été déterminée selon la 15 méthode de Verdon et al. (Verdon et al. 2008), à laquelle n'ont été apportées que quelques modifications mineures. Des dilutions séquentielles de facteur deux des extraits testés ont été ajoutées à des suspensions bactériennes (106 CFU/ml) en démarrant à la concentration de 265 pg/ml. Les microplaques contenant ces cultures bactériennes ont été incubées pendant 24 à 96 h à 30°C ou 37°C, selon la souche 20 testée. La CMI a été définie comme la plus petite concentration de l'extrait qui inhibe totalement la croissance visible d'une souche donnée après qu'elle a été incubée durant la période déterminée. Détermination de l'effet bactéricide L'effet bactéricide des extraits ACN sur des cultures L. pneumophila Lens en phase 25 exponentielle a été déterminé comme décrit ci-après. Les cellules de L. pneumophila ont été cultivées jusqu'à ce que la D0600 atteigne une valeur comprise entre 0,4 et 0,8. Les bactéries ont été diluées à 106 CFU/ml environ en BYE, puis ont été incubées pendant 1 h à 37°C en présence de plusieurs dilutions d'extrait. Les bactéries ont ensuite été lavées par centrifugation (10.000 x g, 5 min). Le nombre d'UFC a été 30 déterminé en étalant des dilutions séquentielles de facteur dix des suspensions 3026917 16 bactériennes sur des boites BCYE. Les boites ont été incubées pendant 72 h à 37 °C avant de compter les colonies. Viabilité des amibes en présence d'extraits TA Les effets des extraits TA sur l'intégrité membranaire des trophozoïtes a été estimée 5 en mesurant la fluorescence d'un agent intercalant dans l'ADN, le SYTOX Green (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) dans les cellules traitées. A. castellanii ATCC 30234, a été cultivé de manière axénique en microplaque 96 puits dans du milieu PYG (peptone yeast glucose), puis dilué de façon à obtenir un titre de 2 x 104 trophozoïtes par puit. Des concentrations sérielles d'extraits TA ont 10 été réalisées dans le tampon PAS (Page's modified Neff's amoeba saline) à pH = 6,5 contenant 2 pM de Sytox green. L'éthanol a été utilisé comme témoin négatif. A. castellanii ATCC 30234 a été traité dans un volume total de 100 pL. Un témoin de la lyse spontanée des amibes a été réalisé en incubant les amibes avec du tampon ne contenant pas de Sytox green (valeur 0 %), tandis qu'un témoin de la 15 perméabilisation totale des cellules a été réalisé en ajoutant du Triton à 0,1 % (valeur 100 %). Après 2 heures d'incubation à 30°C, la fluorescence des échantillons a été mesurée à 535 nm après excitation à 488 nm avec l'appareil TriStar2 LB 942 Multidetection Microplate Reader et le logiciel ICE (Berthold technologies, France). L'activité de perméabilisation des membranes des extraits TA a été exprimée en 20 pourcentage des amibes perméabilisées. La manipulation a été réalisée en duplicats internes et externes et les données sont exprimées comme la moyenne ± l'écart-type. Les résultats ont été analysés à l'aide de la méthode d'analyse de la variance (ANOVA) et un test de Bonferroni en utilisant la version 5.04 de GraphPad Prism pour Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).

25 Production de biofilm Un biofilm monoespèce de L. pneumophila Lens a été cultivé sur des microplaques Calgary (Calgary Biofilm Device, CBD; MBEC AssayTM PEtG, Innovotech, Edmonton, AB, Canada). La microplaque est pourvue d'un couvercle couvert de cônes en polystyrène sur lesquels, lorsqu'ils sont mis en contact d'un milieu inoculé sous 30 agitation douce, un biofilm se forme. Les cônes sont préalablement recouverts une nuit avec 200 pl / puits de milieu SBB (étape de - coating »), avant d'être inoculés avec 150 pl/puits d'une suspension 3026917 17 bactérienne de L. pneumophila Lens à 106 UFC/ml. Les microplaques ont été scellées avec du parafilm afin d'éviter l'évaporation et incubées 6 jours à 37°C sous agitation douce (110 rpm). Le milieu a été renouvelé au bout de 3 jours. Les expériences ont été réalisées en triplicats externe (duplicat ou triplicat internes).

5 Effet des extraits TA sur les biofilms préformés Un biofilm préformé de 6 jours de L. pneumophila a été mis en présence de dilutions sérielles d'extraits TA. Après avoir été rincés pendant 1 minute en tampon salin, les couvercles de la microplaque de 96 puits, avec les biofilms attachés aux cônes, ont été déposés sur une microplaque de 96 puits contenant 200 pl par puit de milieu SBB 10 additionné de diverses concentrations d'extraits. Cette microplaque a été incubée pendant 2 h à 37°C sous agitation (110 rpm). Ensuite, le couvercle a été déposé sur une microplaque de 96 puits contenant 200 pl par puits de milieu BYE. La plaque a été soumise à une sonication durant 5 min dans un bain de sonication à une puissance des ultrasons de 100 % (Bioblock Scientific 86480, Fisher, Illkirch, France). Les 15 cellules ont été quantifiées en comptant les UFC sur des boites de BCYE. Les expériences ont été réalisées au moins en duplicats internes et en triplicats externes. Les résultats ont été analysés à l'aide de la méthode d'analyse de la variance (ANOVA) et un test de Bonferroni en utilisant la version 5.04 de GraphPad Prism pour Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).

20 Résultats Identification des souches 4014 de Pseudomonas otidis et PfA7b de Pseudomonas fluorescens. Afin de mettre en évidence une activité anti-Legionella chez des bactéries environnementales du genre Pseudomonas, une collection de différentes souches a 25 été criblée à l'aide d'un test en goutte. Les activités anti-Legionella ont été visualisées par la présence d'un halo d'inhibition autour de la souche de Pseudomonas testée. Deux souches de Pseudomonas actives contre les légionelles ont ainsi été isolées. Il s'agit d'une souche de Pseudomonas otidis, dénommée 4014, et d'une souche de 30 Pseudomonas fluorescens, appelée PfA7b. Purification et caractérisation des biosurfactants de la souche 4014 de P. otidis.

3026917 18 Les Pseudomonas sont capables de produire des biosurfactants, dont notamment des rhamnolipides et des lipopeptides. Afin d'identifier la ou les molécules responsables de l'activité anti-légionelle, les biosurfactants de la souche 4014 de P. otidis ont été isolés en suivant une méthode en deux étapes. Tout d'abord, les biosurfactants, 5 lipopeptides ou rhamnolipides, ont été partiellement purifiés du surnageant de la culture par extraction à l'acétate d'éthyle et ont été passés en HPLC en phase inverse sur une colonne C18. Dans un deuxième temps, les biosurfactants présents dans les extraits ont été caractérisées plus avant par LC-MS/MS. Les rhamnolipides ont été extraits selon le protocole de Déziel et al. (Déziel et al., 10 1999) dans lequel le surnageant de la culture est acidifié à pH = 3 avant l'extraction avec l'acétate d'éthyle et le passage en HPLC. L'activité anti-légionelle a été testée dans cet extrait - rhamnolipide », ce qui a permis de confirmer que les composés présents dans l'extrait sont bien capables de lyser les légionelles. Afin de confirmer la nature de ces composés, des analyses ont 15 été réalisées à l'anthrone et à la primuline pour détecter la présence de lipide et de sucre. L'extrait de P. otidis 4014 est positif à chacun de ces deux tests. Il en est conclu que ces 2 souches sécrètent une ou plusieurs molécules glycolipidiques, certainement des rhamnolipides. Les résultats sont présentés dans le Tableau 1. Tableau 1 : Caractérisation des extraits - rhamnolipides » des P. fluorescens PfA7b et 20 P. otidis 4014. souches Activité Activité du surnageant concentré X15 Extraction Identification des rhamnolipide anti--- rhamnolipide (Lipide :pimuline/sucre :anthrone) Legionella (activité de l'extrait) P. otidis + + +++ LipideD* OUI 4014 SucreD* OUI peptideD* NON Pour confirmer la présence de rhamnolipides, les échantillons ont été analysés en mode négatif en LC/MS. Ces analyses ont montré la présence de rhamnolipides pour les extraits de la souche P. otidis 4014. Plusieurs espèces de rhamnolipides ont été 25 identifiées dans ces extraits en comparant les masses molaires de ces espèces avec 3026917 19 les données de la littérature (Abdel-Mawgoud et al., 2010 ; Abdel-Mawgoud et al., 2011). Le Tableau 2 représente les masses (m/z) des différents ions observés en spectrométrie de masse dans l'extrait de P. otidis 4014.

5 Tableau 2 : Espèces de rhamnolipides détectées dans l'extrait « rhamnolipides » de P. otidis 4014. Pics d'élution : P.otidis 4014 Temps d'élution temps d'élution m/z espèces de (min) initial (min) final rhamnolipides 3.8 4.

35 478 Rha-Rha-C10 16.77 18.69 478 Rha-Rha-C10 22.96 30.85 478 Rha-Rha-C10 16.6 19.27 620 Rha-Rha-C10-C8 (621) 18.29 19.76 302.55 Rha-c8:1 21.7 28.97 304.58 Rha-c8 21.1 23.62 474.28 Rha-C10-C8 (475) 22.7 25.86 647.93 Rha-Rha-C12:1-C8 24.65 35 500.2 Rha-C10-C10:1 (501) 25.5 30.53 502.21 Rha-C10-C10 (503) 25.76 28.22 673.83 Rha-Rha-C10-C12:2 26.22 30.58 675.4 Rha-Rha-C10-C12:1 28.44 31.52 528.16 Rha-C12-C10:1 (529) 528. 28.13 35 360.54 Rha-C12 28.24 35 530.22 Rha-C12-C10 Pour P. otidis 4014, 15 rhamnolipides ont été détectés dans l'extrait. On retrouve parmi ceux-ci des di-rhamnoses et mono-rhamnoses avec un ou deux acides gras 10 saturés ou non comprenant entre 8 et 12 carbones. Ces rhamnolipides sont les suivants : Rha-Rha-C10, Rha-Rha-C10-C8, Rha-c8:1, Rha-C8, Rha-C10-C8, Rha-Rha-C12: - 2:ia-C C812, Rha-C10-C10, Rha-Rha-Cio-C12:2, Rha-Rha-Cio-C12:1, R et Rha-C12-C10. Par ailleurs, des extraits « lipopeptides » de la souche 4014 ont été préparés selon la 15 méthode décrite plus haut. Ces extraits sont actifs contre les légionelles et ce, même à de fortes dilutions (1/32), ce qui n'est pas le cas avec des extraits provenant d'autres souches (non montré). Ils sont actuellement en cours d'analyse.

3026917 20 Détermination de la CMI des extraits « lipopeptides » et « rhamnolipides » de P. fluorescens PfA7b et P. otidis 4014 Les deux extraits de biosurfactants ont montré une activité inhibitrice sur L. pneumophila lens pour chaque souche. La concentration minimale inhibitrice (CMI) a 5 été évaluée par la méthode de microdilution : une suspension bactérienne de 1x106 bactéries/ml a été incubée en milieu BYE supplémenté en Fer et cystéine en présence d'une gamme de dilution des extraits bruts de biosurfactants. Le test a ainsi été réalisé pour chaque extrait (« extrait lipopeptide » et - extrait rhamnolipide » de chaque souche). La CMI correspond à la dilution la plus grande permettant d'inhiber 10 la croissance des bactéries. Le test a permis de montrer qu'une dilution de 1/160 de l'extrait - lipopeptide » brut empêche la croissance des légionelles, représentant la CMI et ce, pour chacune des souches. De façon intéressante, la même dilution (dilution au 1/160) de l'extrait - rhamnolipide » de P. otidis 4014 inhibe la croissance de L. pneumonie lens. En revanche, une dilution au 1/20 de l'extrait 15 correspondant de P. fluorescens PfA7b ne semble pas avoir beaucoup d'effet sur la bactérie. Activité des extraits « lipopeptides » de P. fluorescens PfA7b et P. otidis 4014 sur un biofilm préformé de L. pneumophila Lens Des biofilrns de L. pneumophila Lens ont été cultivés sur des microplaques Calgary 20 (Calgary Biofilm Device, CBD; MBEC AssayTM PEtG, Innovotech, Edmonton, AB, Canada). Quand ils ont atteint l'âge de 6 jours, ils ont été traités 2 heures par les extraits - lipopeptides » de 4014 et PfA7b et extrait - rhamnolipides » de 4014, ainsi que l'extrait - lipopeptide » d'une souche de Pseudomonas ne présentant aucune activité anti-légionelle (contrôle non actif) à des dilutions finales de 1/20 et 1/80. Le 25 biofilm restant après traitement a été décroché par sonication puis quantifié par numération des colonies sur gélose BCYE. Les expériences ont été réalisées en triplicats externe (duplicat ou triplicat internes). Les résultats pour les extraits lipopeptides, reproductibles, sont présentés en Figure 1. Les extraits issus des souches P. otidis 4014 et P. fluorescens Pfa7b présentent une 30 diminution de la quantité de biofilm par rapport au contrôle (diluant du résidu, acétonitrile). En effet, une dilution de 1/20 de l'extrait brut entraine une diminution de 90% par rapport au contrôle.

3026917 21 Observation microscopique de l'activité anti-biofilm des extraits « lipopeptides » de P. fluorescens PfA7b et P. otidis 4014 Des biofilms de Legionella pneumophila Lens exprimant la dsRed ont été cultivés sur des microplaques 24 puits à fond en verre. Des biofilms âgés de 6 jours ont été 5 traités 2 heures avec les différents extraits à la dilution finale de 1/40. L'activité des extraits sur le biofilm a été évaluée par microscopie confocale. Les extraits entraînent un décrochement du biofilm de Legionella pneumophila de manière très importante. Ceci est cohérent avec les résultats obtenus par comptage dans l'expérience précédente (Figure 2).

10 Purification des biosurfactants de la souche PfA7b de P. flurorescens Les présents inventeurs ont observé que les souches P. flusorescens PfA7b et P. otidis 4014 ont toutes deux non seulement une activité anti-légionelle, mais aussi une activité inhibitrice des amibes. Pour purifier les biosurfactants produits par les souches P. fluorescens PfA7b et P. otidis 4014 responsables de ces activités, les 15 souches ont été cultivées dans 200 mL de milieu MSM additionné de glucose. Après 4 jours de culture à 17°C sous agitation (180 rpm), les bactéries ont été éliminées par centrifugation (8000 rpm, 20 min, 18 ° C) puis le surnageant stérilisé par filtration à travers un filtre à seringue de 0,22 [Inn (Millipore, Allemagne). Les biosurfactants présents dans les différents surnageants de culture ont ensuite été extraits 20 successivement trois fois avec de l'acétate d'éthyle (1:1, v / v) avant l'évaporation du solvant sous vide. Les extraits destinés à être testés sur les bactéries ont été repris dans 5 ml d'acétonitrile comme précédemment (nommés "extraits lipopeptides ACN"). Avant de reprendre les résidus dans de l'ACN, ces derniers ont été pesés afin de déterminer la 25 concentration massique des extraits : - 4014: 8.8 mg/ml - Pfa7b : 14.73 mg/ml Les extraits destinés à être testés sur les amibes ont été repris dans 5 ml de tampon amibe puis stérilisés par filtration sur filtre 0,22 [Inn (nommés "extraits TA"). Il est à 30 noter qu'il n'est pas possible d'utiliser le même tampon ACN pour suivre l'effet des biosurfactants de Pseudomonas sur les amibes. En effet, l'acétonitrile, même en 3026917 22 faible concentration, affecte la viabilité des amibes. Avant de reprendre les résidus dans du tampon amibe, ces derniers ont été pesés afin de déterminer la concentration massique des extraits : - 4014 : 21 mg/ml 5 - Pfa7b : 18,4 mg/ml Spectre antibactérien des extraits ACN de P. fluorescens PfA7b et P. otidis 4014 Les extraits ACN des deux souches ont une activité inhibitrice sur L. pneumophila lens. La concentration minimale inhibitrice (CMI) a été évaluée par la méthode de microdilution : une suspension bactérienne de 1x106 bactéries/ml a été incubée en 10 milieu BYE supplémenté en Fer et cystéine en présence d'une gamme de dilution des extraits ACN de chaque souche. La CMI correspond à la dilution la plus grande permettant d'inhiber la croissance des bactéries. Pour l'une comme pour l'autre souche, la croissance des légionelles est inhibée par une dilution 1/160 de l'extrait ACN.

15 Afin de déterminer la sensibilité potentielle de différentes souches bactériennes aux extraits ACN préparés, un test d'activité antibactérienne a été réalisé et la concentration minimale inhibitrice (CMI) déterminée pour chacune des souches testées. Les résultats sont donnés dans le Tableau 3. Alors que les extraits ACN sont actifs contre L. pneumophila lens, toutes les autres souches bactériennes testées 20 étaient résistantes à ces extraits, même à des dilutions de l'ordre du 1/40. Tableau 3. CMI des extraits lipopeptides ACN sur un panel de bactéries. CMI* Souche bactérienne PfA7b 4014 Klebsiella pneumoniae 0502083 >1/40 >1/40 Enterococcus faecalis V583 >1/40 >1/40 Salmonella enterica Typhimurium >1/40 >1/40 Escherichia coli LMG 2092 >1/40 >1/40 3026917 23 Pseudomonas aeruginosa LMG 1242 ND >1/40 Listeria monocytogenes EGDe ATCC ND >1/40 BAA-679 Staphylocoque aureus ATCC 29213 ND >1/40 Proteus mirabilis ATCC 35659 ND >1/40 *, exprimé en dilution finale de l'extrait brut. ND, non déterminé Ces résultats indiquent donc que les extraits lipopeptides ACN possèdent une activité spécifique contre la légionnelle. Viabilité des amibes Acanthamoeba castellanii en présence d'extraits TA de P. 5 fluorescens PfA7b et P. otidis 4014 La sensibilité de Acanthamoeba castellanii a été évaluée en présence de plusieurs dilutions d'extraits TA. Un colorant à haute affinité de l'ADN qui pénètre facilement les cellules dont l'intégrité membranaire est altérée, le SYTOX Green, a été utilisé pour déterminer la perméabilité de A. castellanii. Après une brève incubation des 10 cellules avec le Sytox green, les acides nucléiques des cellules perméabilisées fluorescent dans le vert lorsque qu'ils sont excités à une longueur d'onde entre 450 et 490 nm. Les résultats présentés en Figure 3, exprimés en pourcentage de perméabilisation des amibes, indiquent que les extraits ont un effet cytotoxique significatif sur les 15 trophozoïtes d'A. castellanii. En effet, le SYTOX Green a pénétré les cellules traitées avec les extraits TA de P. flusorescens PfA7b et P. otidis 4014, suggérant une perméabilisation de la membrane (Fig. 3).L'extrait le moins actif, 4014 entraîne une activité de perméabilisation des amibes d'environ 39%. Mais, surtout, de manière tout à fait remarquable, l'extrait PfA7b, quant à lui, induit une mortalité de 100 %.

20 Afin de vérifier de manière qualitative les résultats obtenus par le test au Sytox green, des trophozoïtes adhérés traités avec les "extraits TA" purs ont été observés en microscopie confocale. Les images (Figure 4) ont confirmé les résultats du test de cytotoxicité au Sytox green concernant l'activité des extraits PfA7b et 4014. L'effet est particulièrement clair pour l'extrait PfA7b, de nombreuses cellules étant lysées 25 par rapport au contrôle.

3026917 24 Identification des molécules à activité anti-amibienne de "l'extrait TA" PfA7b Considérant l'activité lytique de "l'extrait TA" PfA7b, issu de la souche P. fluorescens PfA7b, sur les amibes les tests se sont concentrés sur cet extrait. L'extrait PfA7b étant susceptible de contenir plusieurs molécules, leur séparation a 5 été effectuée par HPLC sur colonne C18. Le chromatogramme obtenu par HPLC suite à l'injection de 1 ml d'extrait est présenté en Figure 5. Quatre fractions ont été collectées (B, C, D et E), la fraction entre 0 et 3 min étant le pic d'injection. L'activité anti-amibe des différentes molécules composant l'extrait a été testée en suivant au microscope à épifluorescence la lyse des amibes en présence de chaque 10 fraction. Les fractions B, D, E provoquent un effet sur les amibes que l'on ne retrouve pas dans l'image témoin (début d'enkystement) mais aucun phénomène de lyse n'est observé. La fraction C, en revanche, provoque un effet clair de lyse totale des amibes. Ces résultats indiquent que la fraction C contient une molécule active sur A. castellanii avec un mode d'action par lyse rapide de l'amibe.

15 La fraction C a ensuite été analysée par spectrométrie de masse en electrospray (ESI- MS) à l'aide d'un spectromètre de masse de type Xevo Q-TOF (Waters, Milford, MA, USA). La fraction HPLC C a été diluée au demi dans de l'acétonitrile 50% + 0.2% d'acide formique ACN (v / v) puis analysée, en mode positif, par infusion à un débit de 0,5 ml / min. La tension d'ionisation a été réglée à 3,0 kV, la température de la 20 source à 120° C et la température de désolvatation à 250° C. L'analyse des données a été réalisée avec le logiciel MassLynx avec l'outil BioLynx (Waters). Le spectre de la fraction C montre la présence d'une molécule à 305.08 Da (Figure 6). D'après la littérature, cette molécule correspondrait à un mono rhamnolipide Rha-C8 (Arutchelvi J., 2010; Déziel et al., 1999). L'observation de l'activité de ce 25 rhamnolipide sur un protozoaire n'avait jamais été démontrée auparavant. Dans la littérature, seule l'activité de l'extrait brut de rhamnolipides (dont Rha-C8 représentait une abondance d'environ 6%) sur des champignons et bactéries avait été déterminée. Identification des molécules à activité anti-légionelle présentes dans les extraits 30 lipopeptides ACN de la souche P. fluorescens PfA7b Les extraits lipopeptidiques ACN possèdent une activité anti-légionelle. Les molécules qu'ils comprennent ont été séparées par HPLC en phase inverse sur une 3026917 25 colonne C18. Pour chacun des extraits, les fractions ont été collectées et testées en vue de déterminer leur activité sur Legionella pneumophila Lens. L'ensemble des fractions étaient actives contre les légionelles dans un test d'inhibition en milieu liquide.

5 Toutes ces fractions ont ensuite été analysées par spectrométrie de masse MS. Comme le montrent les spectres présentés en Figure 7, deux masses majoritaires ont été identifiées, l'une à 1111 Da (Figure 7A) et l'autre à 1125 Da (Figure 7B). D'après la littératures, ces masses pourraient correspondre au massétolide E pour la première et à la viscosine et/ou au massétolide F pour la seconde (Gerard et al., 1997). Ce 10 résultat a été confirmé par fragmentation MS/MS (Figures 8A et 8B). Chaque molécule a ensuite été collectée séparément et testée contre L. pneumophila Lens. La molécule la plus active de l'extrait s'est avérée être celle d'un poids moléculaire de 1125 Da (viscosine et/ou massétolide F). La CMI de la visosine a été évaluée par la méthode de microdilution en milieu BYE sur 15 L. pneumophila Lens. Une suspension bactérienne de 1x106 bactéries/ml a été incubée en milieu BYE supplémenté en Fer et cystéine en présence d'une gamme de concentrations de viscosine. La CMI correspond à la concentration la plus petite permettant d'inhiber la croissance des légionelles. Il a ainsi été déterminé que la CMI de la viscosine est de 100 pg/ml.

20 Références Abdel-Mawgoud AM, Lépine F, Déziel E. (2010) Rhamnolipids: diversity of structures, microbial origins and roles. Applied Microbiology and Biotechnology 86(5):1323-36. doi: 10.1007/s00253-010-2498-2. Epub 2010 Mar 25. Abdel-Mawgoud, A.M., Hausmann, R., Lépine, F., Müller, M.M., and Déziel, E.

25 Rhamnolipids: Detection, analysis, biosynthesis, genetic regulation Et bioengineering of production. in: G. Sober6n-Chavez, A. Steinbüchel (Eds.) Biosurfactants: From Genes to Applications (Microbiology Monographs. Springer, Münster, Germany; 2011: 280 Borella P, Guerrieri E, Marchesi I, Bondi M, Messi P (2005) Water ecology of Legionella and protozoan: environmental and public health perspectives.

30 Biotechnology annual review 11:355-80 doi:10.1016/51387-2656(05)11011-4.

3026917 26 Arutchelvi J, Doble M. (2010) Characterization of glycolipid biosurfactant from Pseudomonas aeruginosa CPCL isolated from petroleum-contaminated soif. Letters in Applied Microbiology 51(1):75-82. doi: 10.1111/j.1472-765X.2010.02858.x. Botes BR, Thoendel M, Singh PK. (2005) Rhamnolipids mediate detachment of 5 Pseudomonas aeruginosa from biofilnns. Molecular Microbiology 57(5):1210-23. Cazalet C, Jarraud S, Ghavi-Helm Y, Kunst F, Glaser P, Etienne J, Buchrieser C (2008) Multigenome analysis identifies a worldwide distributed epidemic Legionella pneumophila clone that emerged within a highly diverse species. Genome research 18(3 ):431 -41 doi :10.1101 /gr.7229808 10 Coraiola M1, Lo Cantore P, Lazzaroni S, Evidente A, lacobellis NS, Dalla Serra M. (2006) WLIP and tolaasin I, lipodepsipeptides from Pseudomonas reactans and Pseudomonas tolaasii, permeabilise model membranes. Biochemical and Biophysical Actae 1758(11):1713-22. Epub 2006 Jul 14. Davey ME, Caiazza NC, O'Toole GA. (2003) Rhamnolipid surfactant production affects 15 biofilm architecture in Pseudomonas aeruginosa PA01. Journal of Bacteriology 185(3):1027-36. De Bruijn I, de Kock MJ, deWaard P, van Beek TA Et Raaijmakers JM (2008) Massetolide A biosynthesis in Pseudomonas fluorescens. Journal of Bacteriology 190: 2777-2789.

20 Declerck P, Behets J, van Hoef V, 011evier F. (2007) Replication of Legionella pneumophila in floating biofilms Current Microbiology, 55(5): 435-440. Déziel E, Lépine F, Dennie D, Boismenu D, Marner OA, Villemur R. (1999) Liquid chromatography/mass spectrometry analysis of mixtures of rhamnolipids produced by Pseudomonas aeruginosa strain 57RP grown on mannitol or naphthalene. Biochemical 25 and Biophysical Actae 1440(2-3):244-52. Gerard J, Lloyd R, Barsby T, Haden P, Kelly MT, Andersen RJ. (1997) Massetolides AH, antinnycobacterial cyclic depsipeptides produced by two pseudomonads isolated from marine habitats. Journal of Natural Products 60(3):223-9.

3026917 27 Gross H, Stockwell VO, Henkels MD, Nowak-Thompson B, Loper JE Et Gerwick WH (2007) The genomisotopic approach: a systematic method to isolate products of orphan biosynthetic gene clusters. Chemistry Et Biology 14: 53-63. Hall-Stoodley L, Costerton JW, Stoodley P (2004) Bacterial biofilms: from the natural 5 environnent to infectious diseases. Nature reviews Microbiology 2(2):95-108 doi:10.1038/nrnnicro821. Janek T, Lukaszewicz M, Rezanka T, Krasowska A. (2010) Isolation and characterization of two new lipopeptide biosurfactants produced by Pseudomonas fluorescens BD5 isolated from water from the Arctic Archipelago of Svalbard.

10 Bioresource Technology 101(15):6118-23. doi: 10.1016/j.biortech.2010.02.109. Epub 2010 Mar 19. Kim BR, Anderson JE, Mueller SA, Gaines WA, Kendall AM (2002) Literature review-- efficacy of various disinfectants against Legionella in water systems. Water research 36(18):4433 -44.

15 Kruijt M, Tran H Et Raaijmakers JM (2009) Functional, genetic and chemical characterization of biosurfactants produced by plant growth-promoting Pseudomonas putida 267. Journal of Applied Microbiology 107: 546-556. Kuiper I, Lagendijk EL, Pickford R et al. (2004) Characterization of two Pseudomonas putida lipopeptide biosurfactants, putisolvin I and II, which inhibit biofilm formation 20 and break down existing biofilms. Molecular Microbioly 51: 97-113. Paulsen IT, Press CM, Ravel J et al. (2005) Complete genome sequence of the plant commensal Pseudomonas fluorescens Pf- 5. Nature Biotechnology 23: 873-878. Pecastaings S, Berge M, Dubourg KM, Roques C (2010) Sessile Legionella pneumophila is able to grow on surfaces and generate structured monospecies biofilms. Biofouling 25 26(7):809-19 doi:10.1080/08927014.2010.520159 Roongsawang N, Hase K, Haruki M, Imanaka T, Morikawa M Et Kanaya S (2003) Cloning and characterization of the gene cluster encoding arthrofactin synthetase from Pseudomonas sp. MIS38. Chemical Biology 10: 869-880.

3026917 28 Rowbotham TJ. (1980) Preliminary report on the pathogenicity of Legionella pneumophila for freshwater and soif amoebae. Journal of Clinicat Pathology 33(12):1179-1183. Schuster FL (2002) Cultivation of pathogenic and opportunistic free-living amebas.

5 Clinicat microbiology reviews 15(3):342-54 Sinnaeve D, Michaux C, Van Hemel J et al. (2009) Structure and X-ray conformation of pseudodesnnins A and B, two new cyclic lipodepsipeptides from Pseudomonas bacteria. Tetrahedron 65: 4173-4181. Verdon J, Berjeaud JM, Laconnbe C, Hechard Y (2008) Characterization of anti- 10 Legionella activity of warnericin RK and delta-lysin I from Staphylococcus warneri. Peptides 29(6):978-84 doi:10.1016/j.peptides.2008.01.017

Claims (24)

1. REVENDICATIONS1. Procédé d'inhibition de la croissance des bactéries du genre Legionella, comprenant l'utilisation d'au moins un lipopeptide et/ou un rhamnolipide produit par des bactéries du genre Pseudomonas.
2. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit lipopeptide est choisi parmi les lipopeptides appartenant à la famille de l'amphisine, les lipopeptides appartenant à la famille de la viscosine, les lipopeptides appartenant à la famille de la tolaasine et les lipopeptides appartenant à la famille de la syringomycine.
3. 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que un lipopeptide selon l'invention est un composé de formule (I) : R-L-Leu-D-Glu-Da-Thr-X1-Lleu-D-Ser-L-Leu-D-Ser-X2 (I) dans lequel : - R est un acide gras beta-hydroxylé linéaire contenant n atomes de carbone, où n est un nombre entier compris entre 10 et 12 ; - X1 = D-Ile ou D-Val ; et - X2= L-Ile ou L-Leu ou L-Val.
4. 4. Procédé selon la revendication 3 caractérisé en ce que ledit lipopeptide est un composé de formule (I) dans lequel n= 10, X1 = D-Val et X2= Lite.
5. 5. Procédé selon la revendication 3 caractérisé en ce que ledit lipopeptide est un composé de formule (I) dans lequel n= 10, X1 = Dalle et X2= Lite.
6. 6. Procédé selon la revendication 3 caractérisé en ce que ledit lipopeptide est un composé de formule (I) dans lequel n= 11, X1 = Dalle et X2= Lite.
7. 7. Procédé selon la revendication 3 caractérisé en ce que ledit lipopeptide est un composé de formule (I) dans lequel n= 12, X1 = Dalle et X2= Lite.
8. 8. Procédé selon la revendication 3 caractérisé en ce que ledit lipopeptide est un composé de formule (I) dans lequel n= 10, X1 = Dalle et X2= L-Leu. 3026917
9. 9. Procédé selon la revendication 3 caractérisé en ce que ledit lipopeptide est un composé de formule (I) dans lequel n= 10, X1 = D-Val et X2= L-Val.
10. 10. Procédé selon la revendication 3 caractérisé en ce que ledit lipopeptide est un composé de formule (I) dans lequel n= 10, X1 = D-Val et X2= L-Leu. 5
11. 11. Procédé selon la revendication 3 caractérisé en ce que ledit lipopeptide est un composé de formule (I) dans lequel n= 11, X1 = D-Val et X2= Lite.
12. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que ledit rhamnolipide est choisi parmi choisis parmi les mono-rhamnomon-lipides, les mono-rhamno-di-lipides, les di-rhamno-mono-lipides et les di- 10 rhamno-di-lipides.
13. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que ledit rhamnolipide est choisi parmi Rha-C8, Rha-Rha-C10, Rha-RhaC10-C8, Rha-c8:1, Rha-C8, Rha-C10-C8, Rha-Rha-C12:1-C8, Rha C10 C1o.1, Rha-C10-C10, Rha-Rha-Cio-C12:2, Rha-Rha-Cio-C12:1, Rha-C12 et Rha-C12-C1o. 15
14. 14. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que ledit rhamnolipide est Rha-C8.
15. 15. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que les bactéries du genre Legionella sont des bactéries de l'espèce Legionella pneumophila. 20
16. 16. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que lesdites bactéries appartiennent au sérogroupe 1 ou au sérogroupe 6 de l'espèce L. pneumophila.
17. 17. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que les bactéries du genre Legionella sont sous forme planctonique, 25 sous forme de biofilm ou sous forme intracellulaire dans des amibes.
18. 18. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce qu'il comprend le traitement d'un flux liquide ou gazeux avec ledit lipopeptide.
19. 19. Procédé de désinfection des réseaux de distribution d'eaux sanitaires, 30 notamment en milieu hospitalier, ou d'eaux industrielles, des réseaux de distribution d'eau domestique, des stations d'épuration, des circuits de refroidissements et des tours aéroréfrigérantes des installations industrielles, des circuits de géothermie, notamment des pompes à chaleurs, ou des réseaux de climatisations, comprenant l'utilisation lipopeptide et/ou un rhamnolipide selon l'une quelconque des revendications 1 à 14. 3026917 31
20. 20. Procédé selon la revendication 10 caractérisé en ce qu'il est mis en oeuvre pour lutter contre la prolifération de Legionella pneumophila au sein des biofilms dans les canalisations d'eaux.
21. 21. Agent de désinfection contenant au moins un lipopeptide et/ou au moins un 5 rhamnolipide produit par des bactéries du genre Pseudomonas.
22. 22. Agent de désinfection selon la revendication 21, caractérisé en ce que ledit lipopeptide est un lipopeptide selon l'une quelconque des revendications 2 à 11.
23. 23. Agent de désinfection selon l'une quelconque des revendications 21 ou 22, 10 caractérisé en ce que ledit rhamnolipide est un rhamnolipide selon l'une quelconque des revendications 12 à 14.
24. 24. Agent de désinfection selon l'une quelconque des revendications 21 ou 22, caractérisé en ce qu'il se présente sous la forme d'une solution ou d'une suspension aqueuse, ou sous une forme pulvérisable. 15