WO2007077316A1 - Methode pour prevenir et/ou traiter des articles ou milieux contamines par des bacteries du genre legionella - Google Patents

Methode pour prevenir et/ou traiter des articles ou milieux contamines par des bacteries du genre legionella Download PDF

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WO2007077316A1
WO2007077316A1 PCT/FR2006/002786 FR2006002786W WO2007077316A1 WO 2007077316 A1 WO2007077316 A1 WO 2007077316A1 FR 2006002786 W FR2006002786 W FR 2006002786W WO 2007077316 A1 WO2007077316 A1 WO 2007077316A1
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WO
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legionella
peptides
seq
peptide
bacteria
Prior art date
Application number
PCT/FR2006/002786
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Inventor
Yann Hechard
Jean-Marc Berjeaud
Original Assignee
Centre National De La Recherche Scientifique (C.N.R.S.)
Universite De Poitiers
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/305—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F)
    • C07K14/31—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to a method for preventing and / or treating articles, materials or surfaces, or media contaminated with Legionella bacteria. It also relates to the compositions used and the peptides active against these bacteria, hereinafter referred to as "anti-Legionella peptides". Bacteria of the genus Legionella belong to the family Legionellaceae. The genus Legionella is divided into 48 species with 70 distinct serogroups. The species Legionella pneumophila (L. pneumophila) is the bacterium responsible for legionellosis, a fatal pneumonia in about 15% of cases. This bacterium is mainly found in fresh and warm water.
  • Biofilms are microbial communities adhering to a surface and frequently included in a matrix of extracellular polymers. Biofilms are present not only in nature but also in the human environment (pipes, medical devices ). Legionella can also be found in the free state or associated with amoebae, within which they develop. Amoebae are unicellular eukaryotes that belong to the family of protozoa. They play a crucial role in amplifying Legionella populations in aquatic systems, and protect them from adverse environmental conditions. They also provide them with a special environment that will promote their virulence vis-à-vis human cells.
  • Thermal disinfection > 70 ° C
  • the most common treatments are chemical treatments (chlorine and derivatives, oxidative treatments, metal ions ...) (Kim et al (2002), Water Res 36, 4433 - 4444).
  • these treatments are not specifically targeted against Legioneila, which has the effect of disrupting the ecological balance of all microorganisms in the environment.
  • the Legionella grow again, showing the limited effectiveness of the process.
  • the chemicals used are an important source of pollution for the environment.
  • Bacteriocins are anti-bacterial proteins or peptides produced by bacteria. They are produced by both Gram-negative and Gram-positive bacteria. They were first described in E. coli and called colicins. In Gram-positive bacteria, it is the bacteriocins produced by lactic acid bacteria that have been studied the most, given their potential use in agri-food and, more rarely, hygiene or health.
  • US Patent 5,817,362 discloses a bacteriocin produced by Lactococcus lactis, which inhibits the development of a large number of bacteria such as Staphylococcus, Pediococcus, Lactococcus, Lactobacillus ... and which is used in the food field.
  • US Patent 5,445,835 describes a method for producing a yoghurt comprising the bacteriocin PA-1.
  • EP 927023 relates to a composition for treating acne, comprising a bacteriocin produced by Propionibacterium.
  • EP 851751 relates to a chewing gum comprising as an antibacterial agent a bacteriocin.
  • Application WO01 / 92533 relates to a Class IIa bacteriocin produced from a specific strain of Lactobacillus sakei, which proves particularly effective for inhibiting the growth of Listeria, and which can therefore be used industrially as an active agent against pathogenic or undesirable flora in the preparation of food products.
  • the object of the invention is therefore the use of such peptides as anti-Legionella compounds.
  • It also aims to provide a specifically targeted method of decontamination against Legionella bacteria, taking advantage of the properties of peptides isolated from compounds secreted by Staphylococcus and more particularly S. warneri.
  • the invention also aims to provide a decontamination treatment method of Legionella without disturbing the ecological balance of the environment.
  • the invention is further directed to the use of isolated active peptides for making drugs for the treatment of Legionella.
  • the invention provides a method of treating a patient infected with Legionella with the help of said peptides.
  • the invention therefore aims at the use of at least one peptide with an anti-legionella effect, for example in the test reported in the examples, the peptide or peptides being isolated and purified from the compounds secreted by Staphylococcus. , and more especially by S. warneri.
  • anti-Legionella peptides are advantageously chosen from the group comprising amino acid sequence peptides SEQ ID No. 1:
  • delta hemolysin 1 and delta hemolysin 2 isolated by purification from compounds secreted by S. warneri and responding, respectively, to the sequences SEQ ID No. 2 and SEQ ID NO: 3:
  • SEQ ID NO: 2 MAADIISTIGDLVKLIINTVKKFQK
  • SEQ ID NO: 3 MTADIISTIGDFVKWILDTVKKFTK.
  • peptides may also be substituted and comprise, for example, a formyl substitution, it being understood that their substitution does not significantly affect the anti-Legionella activity as evaluated in the examples.
  • the invention also relates to a method of preventing surfaces or materials likely to be in contact with bacteria of the genus Legionella and / or. decontamination of surfaces or materials infected with Legionella, this method comprising contacting the surface or the material to be treated with a composition containing an effective amount of at least one peptide as defined above.
  • compositions used in the above applications are advantageously in the form of solutions or suspensions and optionally contain adjuvants facilitating the application and / or enhancing the activity of the peptides.
  • the peptides used according to the invention exhibit activity against all bacteria of the genus Legionella. Conversely, they are not active against other non-Legionella bacteria.
  • peptides are especially active against the bacteria of the genus Legionella selected from the group consisting of Legionella pneumophila, Legionella bozemanii, Legionella dumofii, Legionella longbeachae, Legionella micdadei, Legionella feeleii, Legionella hackeliae, Legionella sainthelensi, Legionella spietensis, Legionella erythra and Legionella species. quinlivanii.
  • the subject of the present invention is also the use of a peptide (or peptides) as defined above for the preparation of a medicament intended to combat against legionellosis.
  • the drug contains an amount of active ingredient to obtain the effect desired by the treatment and is in the appropriate forms of administration for example for treatment orally, parenterally, or by inhalation.
  • tablets, tablets or capsules are used.
  • Forms suitable for parenteral administration include sterile or sterilizable solutions or suspensions of said peptides.
  • aerosols are advantageously used.
  • the peptides of sequence SEQ ID No. 1 are new products and as such fall within the scope of the invention. They comprise the peptide SEQ ID No. 1 and substituted peptides as indicated above. Pharmaceutical compositions comprising a therapeutically effective amount of this peptide of sequence SEQ ID No. 1 or new anti-Legionella peptides as defined above in association with a pharmaceutically inert carrier are also covered by the invention.
  • the invention is further directed to the transfer or expression vectors, in particular of the plasmid type, characterized in that they comprise at least one DNA fragment as defined above.
  • FIGS. 1 to 4 represent, respectively:
  • FIG. 1 the chromatogram obtained during HPLC of the seven fractions T15 to T21 obtained by solid phase extraction with an acetonitrile-TFA elution gradient starting at 20% of acetonitrile,
  • FIG. 2 the mass spectrum of the active fraction T17
  • FIG. 3 the results of the activity test in wells obtained with the fraction purified by HPLC.
  • EXAMPLE 1 Isolation and Characterization of Legionella-active Peptides from the Staphylococcus Warneri Strain
  • the bacterial strain Staphylococcus warneri named "RK” is isolated as indicated in the article by Inventors Héchard et al. (2005, FEMS Microbiol Lett., 252, 19-23).
  • Peptide anW-Legionella SEQ ID No. 1 was purified by a method which differs from that described in the article of the inventors since it was not possible in the protocol described in Héchard et al. (2005, FEMS Microbiol Lett., 252, 19-23) to obtain a pure peptide and that only a mixture was obtained. This article therefore did not make it possible to provide that the peptide of the invention obtained by purification existed and that it was then possible to obtain a product of high efficiency exploitable industrially since pure.
  • the strain of Staphylococcus warneri RK is cultured for 24 h in Brain Heart Infusion (BHI) medium (200 ml in a 1 L Erlenmeyer flask with stirring at 37 ° C). The culture is centrifuged (6000 g, 15 min, 4 ° C). The supernatant is stored and heated for 15 min at 70 ° C. This sample constitutes the crude extract.
  • BHI Brain Heart Infusion
  • the pH of the crude extract is brought to 5 with HCI hydrochloric acid solution.
  • the solution (100 ml) is then passed through a cation exchange chromatographic column (Hiprep TM 16/10 Carboxy-Methyl FF, Amersham Biosciences), washed successively with 100 ml of sodium acetate buffer (20 mM, pH 5) at room temperature. 0, 0.1 and 1 M NaCl.
  • the growth of L pneumophila is inhibited by the fraction eluted with 1 M sodium acetate NaCl.
  • This fraction ( ⁇ 100 ml) is then loaded on a solid phase extraction cartridge (Sep-pak C18, Waters) previously washed and equilibrated (10 ml of ethanol, 5 ml of acetonitrile and 10 ml of water MiIIi -Q). The elution is carried out sequentially with 5 ml of increasingly concentrated solution of acetonitrile (0, 20, 40, 80 and 100%) and containing 0.05% of trifluoroacetic acid (TFA). The various fractions harvested are then concentrated and lyophilized to be finally suspended in 1 ml of sterile water, then tested against L pneumophila activity.
  • a solid phase extraction cartridge Sep-pak C18, Waters
  • Pneumophila is inhibited with the fraction containing 80% acetonitrile.
  • the peptide is totally isolated. It has a high efficiency, exploitable industrially since pure.
  • the elution is made from a linear gradient H 2 ⁇ -acetonitrile-TFA (0.05%) ranging from 20% to 100% acetonitrile and this in 45 min with the last 10 minutes at 100% of acetonitrile-TFA (flow rate: 0.8 ml.min -1 )
  • Detection is carried out at 220 nm After evaporation of the acetonitrile and lyophilization, each of the fractions, T15 to T21, is suspended in 1 ml of water sterile, then tested in activity.
  • a suspension of L ⁇ gionella pneumophila Lens is performed in 1 ml of sterile milli-Q water.
  • the optical density (OD) at 600 nm with 1/10 th of the suspension is measured.
  • Extract for spreading (which is done with a spreader).
  • composition of the BCYE medium is as follows:
  • Wells are made in BCYE agar using a cookie cutter. 100 ⁇ l of the test solution (T15 to T21) is deposited in a well. The dish is then incubated at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 for 72 hours.
  • Electrospray ionization mass spectrometry analysis of the active fraction T17 made it possible to determine the mass of the corresponding peptide: 2561.04 Da (see FIG. 2).
  • the antagonistic effect is responsible for a zone of inhibition of Legionella around the wells, the radius of which is proportional to the concentration of the bacteriocin.
  • Figure 3 illustrates the test for anti-Le ⁇ // one // a well activity of purified T17 fraction in HPLC.
  • T18 and T19 fractions showed that they were respectively delta hemolysins 1 and 2.
  • the peptide of SEQ ID No. 1 sequence was also obtained by peptide synthesis (Eurogentec).
  • the synthetic peptide has the same properties as the peptide from the bacterial strain: same retention time in HPLC, same mass spectrum and identical activity.
  • EXAMPLE 2 Isolation and Characterization of Delta Hemolysins 1 and 2 from the S. warneri strain

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Abstract

La présente invention a pour objet des peptides actifs contre les bactéries du genre Legionella, caractérisés en ce qu'ils correspondent à la séquence en acides aminés répondant à SEQ ID N°1 : MQFITDLIKKAVDFFKGLFGNK, ou à toutes autres séquences analogues. L'invention concerne également l'utilisation de tels peptides pour prévenir la contamination de surfaces ou de matériaux par les bactéries du genre Legionella ou pour la décontamination de surfaces ou de matériaux infectés par Legionella.

Description

METHODE POUR PREVENIR ET/OU TRAITER DES ARTICLES OU MILIEUX CONTAMINES PAR DES BACTERIES DU GENRE LEGIONELLA
La présente invention concerne une méthode pour prévenir et/ou traiter des articles, matériaux ou surfaces, ou des milieux contaminés par des bactéries du genre Legionella. Elle a également pour objet les compositions mises en œuvre ainsi que les peptides actifs contre ces bactéries, dénommés ci-après « peptides anti- Legionella ». Les bactéries du genre Legionella appartiennent à la famille des Legionellaceae. Le genre Legionella est divisé en 48 espèces regroupant 70 sérogroupes distincts. L'espèce Legionella pneumophila (L. pneumophila) est la bactérie responsable de la légionellose, une pneumonie mortelle dans environ 15 % des cas. Cette bactérie est principalement présente dans les eaux douces et tièdes.
Dans les canalisations d'eau, Legionella est présente dans les biofilms où elle est capable de survivre. Les biofilms sont des communautés microbiennes adhérant à une surface et fréquemment incluses dans une matrice de polymères extracellulaires. Les biofilms sont présents non seulement dans la nature mais également dans l'environnement humain (canalisations, appareils médicaux ...). On peut également trouver Legionella à l'état libre ou associée à des amibes, au sein desquelles elles se développent. Les amibes sont des eucaryotes unicellulaires qui appartiennent à la famille des protozoaires. Elles jouent un rôle crucial au niveau de l'amplification des populations de Legionella dans les systèmes aquatiques, et elles les protègent des conditions extérieures défavorables. Elles leur fournissent également un environnement particulier qui va favoriser leur virulence vis-à-vis des cellules humaines.
L'infection de l'homme par Legionella s'effectue exclusivement par l'inhalation de gouttelettes d'eau contaminées ou d'aérosols contaminés induits par différentes sources comme les systèmes de refroidissement par voie humide (tours aéroréfrigérantes, réseaux de climatisation ...), les douches ... . L. pneumophila se multiplie dans l'eau du robinet à des températures comprises entre 25 et 450C, avec une température optimale de croissance de l'ordre de 350C. En outre L. pneumophila se développe dans une gamme de pH comprise entre 5,5 et 9,2 avec un pH optimum de croissance égal à 6,9. Différents traitements peuvent être utilisés pour limiter le développement de Legionella dans l'eau. La désinfection thermique (> 70°C) peut être utilisée, mais les traitements les plus courants sont les traitements chimiques (chlore et dérivés, traitements oxydants, ions métalliques ...) (Kim et al (2002), Water Res 36, 4433- 4444). Cependant, ces traitements ne sont pas spécifiquement ciblés contre Legioneila, ce qui a notamment pour effet de perturber l'équilibre écologique de l'ensemble des microorganismes dans l'environnement. En outre, dès la fin du traitement, les Legionella se développent à nouveau, montrant l'efficacité limitée du procédé. Enfin, les produits chimiques utilisés sont une source importante de pollution pour l'environnement.
La publication Héchard et al. (2005, FEMS Microbiol. Lett, 252,19-23) divulgue que la souche Staphylococcus warneri (S. warneri) inhibe le développement de Legionella, grâce à une molécule sécrétée par S. warneri qui semble être une bactériocine.
Les bactériocines sont des protéines ou des peptides anti-bactériens produits par des bactéries. Elles sont produites aussi bien par des bactéries à Gram-négatif que par des bactéries à Gram-positif. Elles ont été décrites tout d'abord chez E. coli et nommées colicines. Chez les bactéries à Gram positif, ce sont les bactériocines produites par les bactéries lactiques qui ont été le plus étudiées, compte tenu de leur utilisation potentielle en agroalimentaire et plus rarement en hygiène ou santé.
Le brevet US 5 817 362 décrit une bactériocine produite par Lactococcus lactis, qui inhibe le développement d'un grand nombre de bactéries telles que Staphylococcus, Pediococcus, Lactococcus, Lactobacillus ... et qui est utilisable dans le domaine alimentaire. Le brevet US 5 445 835 décrit une méthode de production d'un yaourt comprenant la bactériocine PA-1. Le brevet EP 927023 concerne une composition pour traiter l'acné, comprenant une bactériocine produite par Propionibacterium. Le brevet EP 851751 concerne un chewing-gum comprenant à titre d'agent antibactérien une bactériocine. La demande WO01/92533 concerne une bactériocine de classe lia produite à partir d'une souche spécifique de Lactobacillus sakei, qui s'avère particulièrement efficace pour inhiber la croissance de Listeria, et qui peut donc être utilisée industriellement comme agent actif contre des flores pathogènes ou indésirables dans la préparation de produits alimentaires.
Excepté la publication susmentionnée (Héchard et al., 2005, FEMS Microbiol. Lett, 252,19-23), aucun document de l'art antérieur ne décrit une bactériocine présentant une activité contre Legionella. Dans la publication Héchard et al. la bactériocine est cependant décrite de façon imprécise, incomplète et en outre erronée car les auteurs n'ont pas réussi à purifier, isoler et identifier la molécule responsable de l'activité contre Legionella. En effet, l'analyse par spectrométrie de masse de la fraction active anti-Leg/one//a révèle deux masses moléculaires de 2613,8 Da et 2449,4 Da respectivement. La poursuite par les inventeurs de leurs travaux de purification sur les peptides sécrétés par les Staphylococcus et plus spécialement par S. warneri leur a permis de caractériser des peptides de grand intérêt. Leur étude a en effet montré une activité élevée de ces peptides contre Legionella et plus spécifiquement contre Legionella pneumophila.
L'invention a donc pour but l'utilisation de tels peptides comme composés anti- Legionella.
Elle a aussi pour but de fournir une méthode de décontamination spécifiquement ciblée contre les bactéries du genre Legionella, mettant à profit les propriétés des peptides isolés à partir des composés sécrétés par Staphylococcus et plus spécialement de S. warneri.
L'invention vise également à fournir une méthode de traitement de décontamination de Legionella sans perturber l'équilibre écologique de l'environnement.
L'invention vise en outre l'utilisation des peptides actifs isolés pour fabriquer des médicaments pour le traitement de Legionella.
Selon encore un autre aspect, l'invention vise une méthode de traitement d'un patient infecté par des légionelles, à l'aide desdits peptides. L'invention vise donc l'utilisation d'au moins un peptide à effet anti-légionelle par exemple dans le test rapporté dans les exemples, le ou les peptides étant isolé(s) et purifié(s) à partir des composés sécrétés par Staphylococcus, et plus spécialement par S. warneri.
Ces peptides ant\-Legionella sont avantageusement choisis dans le groupe comprenant des peptides de séquence en acides aminés SEQ ID N°1 :
MQFITDLIKKAVDFFKGLFGNK,
et des peptides de la famille des delta hémolysines synthétisées à partir de TARN III, en particulier les delta hémolysine 1 et delta hémolysine 2 isolées par purification à partir des composés sécrétés par S. warneri et répondant, respectivement, aux séquences SEQ ID N°2 et SEQ ID N°3 suivantes :
SEQ ID N°2 : MAADIISTIGDLVKLIINTVKKFQK, SEQ ID N°3 : MTADIISTIGDFVKWILDTVKKFTK.
Ces peptides peuvent être également substitués et comportent par exemple une substitution formyle, étant entendu que leur susbtitution n'affecte pas de manière significative l'activité ant\-Legionella telle qu'évaluée dans les exemples.
L'invention vise également une méthode de prévention de surfaces ou de matériaux susceptibles d'être en contact avec des bactéries du genre Legionella et/ou de. décontamination de surfaces ou de matériaux infectés par Legionella, cette méthode comprenant la mise en contact de la surface ou du matériau à traiter avec une composition renfermant une quantité efficace d'au moins un peptide tel que défini ci- dessus.
Les compositions mises en œuvre dans les applications ci-dessus sont avantageusement sous forme de solutions ou de suspensions et contiennent le cas échéant des adjuvants facilitant l'application et/ou renforçant l'activité des peptides.
En variante, il s'agit de compositions pulvérulentes à utiliser telles quelles ou à diluer au moment de leur emploi. i La méthode correspondante de traitement qui comprend l'addition sous une forme appropriée desdits peptides dans l'air ou l'eau est également visée par l'invention.
De façon avantageuse les peptides utilisés selon l'invention présentent une activité contre toutes les bactéries du genre Legionella. A l'inverse ils ne sont pas actifs contre les autres bactéries non-Legionella.
Ces peptides sont notamment actifs contre les bactéries du genre Legionella choisies dans le groupe constitué par les espèces Legionella pneumophila, Legionella bozemanii, Legionella dumofii, Legionella longbeachae, Legionella micdadei, Legionella feeleii, Legionella hackeliae, Legionella sainthelensi, Legionella spiήtensis, Legionella erythra et Legionella quinlivanii.
Selon encore un autre aspect, la présente invention a également pour objet l'utilisation d'un (ou des) peptide(s) tel(s) que défini(s) ci-dessus, pour la préparation d'un médicament destiné à lutter contre la légionellose.
Dans cette utilisation, le médicament renferme une quantité de principe actif permettant d'obtenir l'effet recherché par le traitement et se présente sous les formes d'administration appropriées par exemple pour un traitement par voie orale, parentérale, ou par inhalation.
Pour l'administration par voie orale, on a recours par exemple à des comprimés, tablettes ou gélules.
Des formes convenant pour une administration par voie parentérale comprennent des solutions ou suspensions stériles ou stérilisables desdits peptides.
Pour l'inhalation, on a avantageusement recours à des aérosols.
Les peptides de séquence SEQ ID N°1 sont des produits nouveaux et à ce titre entrent dans le champ de protection de l'invention. Ils comprennent le peptide SEQ ID N°1 et des peptides substitués comme indiqué plus haut. Les compositions pharmaceutiques renfermant une quantité thérapeutiquement efficace de ce peptide de séquence SEQ ID N°1 ou de nouveaux peptides anti- Legionella tels que définis ci-dessus en association avec un véhicule pharmaceutiquement inerte sont également couverts par l'invention.
L'invention vise en outre les vecteurs de transfert ou d'expression, notamment de type plasmide, caractérisés en ce qu'ils comportent au moins un fragment d'ADN tel que défini ci-dessus.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention seront donnés dans les exemples qui suivent, dans lesquels il est fait référence aux figures 1 à 4, qui représentent, respectivement :
- la figure 1 , le chromatogramme obtenu lors de HPLC des sept fractions T15 à T21 obtenues par extraction en phase solide avec un gradient d'élution d'acétonitrile-TFA commençant à 20% d'acétonitrile,
- la figure 2, le spectre de masse de la fraction active T17,
- la figure 3, les résultats du test d'activité en puits obtenus avec la fraction purifiée en HPLC.
EXEMPLE 1 : isolement et caractérisation de peptides actifs vis-à-vis de Legionnella à partir de la souche de Staphylococcus warneri
La souche bactérienne Staphylococcus warneri, nommée « RK » est isolée comme indiqué dans l'article des Inventeurs Héchard et al. (2005, FEMS Microbiol. Lett., 252,19-23).
1) Purification de la souche bactérienne
Le peptide anW-Legionella SEQ ID N°1 a été purifié par une méthode qui diffère de celle décrite dans l'article des Inventeurs puisqu'il n'a pas été possible dans le protocole décrit dans Héchard et al. (2005, FEMS Microbiol. Lett., 252,19-23) d'obtenir un peptide pur et que seul un mélange a été obtenu. Cet article ne permettait donc pas de prévoir que le peptide de l'invention obtenu par purification existait et qu'il était alors possible d'obtenir un produit d'une grande efficacité exploitable industriellement puisque pur.
Parmi les nombreuses possibilités de changement du protocole de purification envisageables par l'homme de l'art, les modifications concernent (a) le pourcentage d'acide trifluoroacétique utilisé dans les éluants qui a été abaissé à 0,05% et (b) la solubilisation de l'échantillon avant injection en HPLC qui a été réalisée avec de l'eau acidifié à pH 5 avec HCI au lieu d'un mélange d'eau et d'acétonitrile.
La souche de Staphylococcus warneri RK est cultivée 24 h dans un milieu BHI (Brain Heart Infusion) (200 ml dans un erlen d'1 L sous agitation à 37°C). La culture est centrifugée (6000 g, 15 min, 4°C). Le surnageant est conservé et chauffé 15 min à 700C. Cet échantillon constitue l'extrait brut.
Le pH de l'extrait brut est amené à 5 avec une solution d'acide chlorhydrique HCI. La solution (100ml) est ensuite passée sur une colonne chromatographique échangeuse de cation (Hiprep™ 16/10 Carboxy-Methyl FF, Amersham Biosciences), lavée successivement avec 100 ml de tampon d'acétate de sodium (20 mM, pH 5) à 0, 0,1 et 1 M NaCI. La croissance de L pneumophila est inhibée par la fraction éluée avec de l'acétate de sodium à 1 M NaCI.
Cette fraction (~100 ml) est ensuite chargée sur une cartouche d'extraction en phase solide (Sep-pak C18, Waters) préalablement lavée et équilibrée (10 ml d'éthanol, 5 ml d'acétonitrile et 10 ml d'eau MiIIi-Q). L'élution est réalisée séquentiellement avec 5 ml de solution de plus en plus concentrée en acétonitrile (0, 20, 40, 80 et 100%) et contenant 0,05% d'acide trifluoroacétique (TFA). Les différentes fractions récoltées sont ensuite concentrées et lyophilisées pour être à la fin suspendues dans 1 ml d'eau stérile, puis testées en activité contre L pneumophila.
L pneumophila est inhibée avec la fraction contenant 80 % d'acétonitrile.
Cette fraction est injectée sur une colonne analytique C8 Kromasil (250 x 4 mm) et analysée en HPLC (Perkin Elmer). Le chromatogramme obtenu est représenté en figure 1. Ce chromatogramme est significativement différent de celui publié, dans Héchard et ai. (2005, FEMS Microbiol. Lett, 252,19-23). En effet, dans la publication Héchard et al., le peptide actif est élue en mélange avec d'autres peptides qui seuls sont détectés en spectrométrie de masse.
Dans la présente invention, le peptide est totalement isolé. Il présente une grande efficacité, exploitable industriellement puisque pur.
L'élution se fait à partir d'un gradient linéaire H2θ-acétonitrile-TFA (0,05%) allant de 20% à 100% d'acétonitrile et cela en 45 min avec les 10 dernières minutes à 100% d'acétonitrile-TFA (débit :0,8 ml. min"1). La détection s'effectue à 220 nm. Après évaporation de l'acétonitrile et lyophilisation, chacune des fractions, T15 à T21, est suspendue dans 1 ml d'eau stérile, puis est testée en activité.
Test d'activité en puits ant\-Leçjionella :
Une suspension de Lβgionella pneumophila Lens est réalisée dans 1 ml d'eau milli-Q stérile. La densité optique (DO) à 600 nm avec 1/10e de la suspension est mesurée.
Aux 900 μl de suspension restante, un volume d'eau nécessaire est ajouté afin d'avoir au final une solution de DO égale à 1.
100 μl de cette solution est déposée sur une boîte BCYE (Buffered Charcoal yeast
Extract) pour l'étalement (qui est effectué à l'aide d'un étaleur).
La composition du milieu BCYE est la suivante :
- Tampon ACES 5g
- Extrait de levure 10g
- Charbon actif 2g
- Agar 15g
- L-cystéine 0,4g
- Pyrophosphate ferrique 0,25g
- Eau qsp 11
Les puits sont pratiqués dans la gélose BCYE à l'aide d'un emporte-pièce. 100 μl de la solution à tester (T15 à T21) est déposée dans un puits. La boîte est ensuite incubée à 370C en présence de 5% CO2 pendant 72h.
Les fractions T17, T18 et T19 sont actives contre Legionella.
L'analyse en spectrométrie de masse par ionisation Electrospray de la fraction active T17 a permis de déterminer la masse du peptide correspondant : 2561 ,04 Da (voir figure 2).
L'effet antagoniste est responsable d'une zone d'inhibition de Legionella autour des puits, dont le rayon est proportionnel à la concentration de la bactériocine.
La figure 3 illustre le test d'activité en puits anti-Leα//one//a de la fraction T17 purifiée en HPLC.
La caractérisation des fractions T18 et T19 a montré qu'il s'agissait respectivement des delta hémolysines 1 et 2. Le microséquençage des peptides isolés et purifiés a conduit aux séquences SEQ ID N°2 et SEQ ID N°3. Leur masse moléculaire respective est de 2 760,00 Da (delta lysine 1) et de 2 871 ,00 Da (delta lysine 2).
2) Séquençage du peptide antl-Legionella
Le microséquençage du peptide purifié SEQ ID N°1 de l'invention a été réalisé au Centre Commun de Séquençage de l'IBCP à Lyon.
Le calcul théorique de la masse de la séquence complète SEQ ID N°1 conduit à 2561 ,08 Da.
De façon avantageuse, le peptide de séquence SEQ ID N°1 a également été obtenu par voie de synthèse peptidique (Eurogentec). Le peptide synthétique présente les mêmes propriétés que le peptide provenant de la souche bactérienne : même temps de rétention en HPLC, même spectre de masse et activité identique. EXEMPLE 2 : isolement et caractérisation des delta hémolysines 1 et 2 à partir de la souche de S. warneri
On opère comme indiqué ci-dessus, mais en appliquant un gradient d'acétonitrile commençant à 50%.

Claims

REVENDICATIONS
1. Méthode de prévention et/ou de traitement d'articles, tels que matériaux et surfaces, ou de milieux tels que l'eau ou l'air, contre une contamination par Legionella, caractérisée en ce qu'elle comprend la mise en contact de la surface ou du matériau à traiter avec une composition renfermant une quantité efficace d'au moins un peptide à effet anti-légionelle isolé et purifié à partir des composés sécrétés par Staphylococcus, et plus spécialement par S. warneri.
2. Méthode selon la revendication 1 , caractérisée en ce que les peptides sont choisis dans le groupe comprenant des peptides de séquence en acides aminés SEQ ID N0I :
MQFITDLiKKAVDFFKGLFGNK,
ou des peptides de la famille des delta hémolysines synthétisés à partir de TARN III.
3. Méthode selon la revendication 2, caractérisée en ce que les peptides hémolytiques sont constitués par la delta hémolysine 1 et la delta hémolysine 2 et répondent, respectivement, aux séquences SEQ ID N°2 et SEQ ID N°3 suivantes : SEQ ID N°2 : MAADIISTIGDLVKLIINTVKKFQK,
SEQ ID N°3 : MTADl ISTIGDFVKWILDTVKKFTK.
4. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en que les compositions mises en œuvre sont sous forme de solutions ou de suspensions et contiennent le cas échéant des adjuvants facilitant l'application et/ou renforçant l'activité des peptides.
5. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en que les compositions mises en œuvre sont sous forme pulvérulente et sont utilisées telles quelles ou diluées au moment de leur emploi.
6. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce qu'elle est mise en œuvre pour lutter contre les bactéries du genre Legionella choisies dans le groupe constitué par les espèces Legionella pneumophila, 0/2
Legionella bozemanii, Legionella dumofii, Legionella longbeachae, Legionella micdadei, Legionella feeleii, Legionella hackeliae, Legionella sainthelensi, Legionella spiritensis, Legionella erythra et Legionella quinlivanii.
7. Peptide actif contre les bactéries du genre Legionella, caractérisé en ce qu'il correspond à la séquence en acides aminés SEQ ID N°1 :
MQFiTDLIKKAVDFFKGLFGNK,
et peptides substitué correspondant.
8. Utilisation d'au moins un peptide tel que mis en œuvre dans la méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, pour la préparation d'un médicament destiné à lutter contre la légionellose.
9. Compositions pharmaceutiques caractérisées en ce qu'elles renferment une quantité thérapeutiquement efficace d'un peptide de séquence SEQ ID N°1 en association avec un véhicule pharmaceutiquement inerte.
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