FR2975994A1 - Sucroses octasulfates de calcium, leur preparation et leurs applications pharmaceutiques et cosmetiques - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne un sucrose octasulfate de calcium de formule générale I, son procédé de préparation et son utilisation dans le domaine pharmaceutique et/ou cosmétique Formule générale I dans laquelle : 0 ≤ n ≤ 4 n est un nombre entier Y représente OH, Cl, Br, I, NO , C H O , CH CO , CF CO ou -OCH .

Description

SUCROSES OCTASULFATES DE CALCIUM, LEUR PREPARATION ET LEURS APPLICATIONS PHARMACEUTIQUES ET COSMETIQUES

La présente invention concerne des sucroses octasulfates de calcium, leur procédé de préparation et leur utilisation dans le domaine pharmaceutique et/ou cosmétique. Les oligosaccharides sont des glucides dont l'hydrolyse produit uniquement des sucres simples (oses). Ils sont constitués par l'union d'au moins deux molécules de sucres simples. Parmi les oligosaccharides, on trouve le sucrose formé par la condensation de deux oses : une molécule de glucose et une molécule de fructose.

Les oligosaccharides sulfatés sont connus dans la littérature et possèdent de multiples activités biologiques, cosmétiques et/ou thérapeutiques. Par exemple, la demande WO2006/017752 décrit une méthode de traitement des inflammations des voies aériennes utilisant des oligosaccharides sulfatés comme substances actives. Parmi ceux ci se trouve, en particulier, un oligosaccharide issu de la condensation du glucose et du fructose et totalement sulfaté. US5767104 décrit des oligosaccharides sulfatés, principalement le sucrose octasulfate d'aluminium, dans le traitement de l'alopécie. Par ailleurs, le sucrose octasulfate est utilisé comme principe actif dans le traitement des ulcères gastriques pour ses propriétés réparatrices/cicatrisantes.

FR 2 646 604 décrit des formulations de sucrose octasulfate d'aluminium, ou sucralfate, aux propriétés anti-inflammatoires et cicatrisantes, destinées au traitement de plaies ou autres inflammations ulcéreuses. WO1994/00476 décrit une méthode de traitement des lésions et/ou inflammations de l'appareil digestif par administration d'un sel de sucrose sulfaté, plus particulièrement le sucrose octasulfate de potassium ou de sodium. FR 1390007 décrit l'utilisation par voie topique de formulations contenant du sucralfate en association avec du sulfate de cuivre et de zinc comme régénérants tissulaires, cicatrisants et apaisants. Enfin, EP0230023 décrit l'utilisation d'oligosaccharides polysulfatés, plus 30 particulièrement du sucrose octasulfate de potassium, comme agent guérissant les blessures.

Les problèmes de cicatrisation se retrouvent dans un grand nombre de pathologies, d'accidents ou font suite aux opérations chirurgicales. Il existe donc en permanence un besoin de compositions alternatives permettant d'améliorer la cicatrisation et/ou de l'accélérer.

Dans la présente invention, les inventeurs ont obtenu de nouveaux composés ayant des propriétés réparatrices, antimicrobiennes et anti-radicalaires surprenantes. En effet, il a été montré que ces composés induisent la migration des kératinocytes, la synthèse d'acide hyaluronique, la différenciation des kératinocytes et la synthèse de peptides antimicrobiens. Ainsi, ces composés permettent la réparation de la peau, la guérison de blessures et favorisent la cicatrisation, et ce, d'une manière très efficace. Par ailleurs, les inventeurs ont montré que ces composés pouvaient aussi être utilisés en cosmétique pour maintenir le confort et la beauté de la peau La Figure 1 représente l'induction de la synthèse d'acide hyaluronique (en ng/ml) par de l'acide rétinoïque 0,1 µM (Témoin), du sucrose octasulfate de Ca à 10 µM (SOS-Ca), du sucrose octasulfate de Na à 10 µM (SOS-NA), du sucrose octasulfate de K à 10 µM (SOS-K). Les pourcentages indiquent l'induction de la synthèse par rapport au témoin non traité. * p<0.05 par rapport au témoin non traité La présente invention porte en particulier sur des composés de formule générale I suivante, -03S0 O S O OS O3SO ° 0-PS03 O3S0 [ n Cal+ + (8 - 2n) (CaY)+] -03SO Formule I dans laquelle : 0<n<4 n est un nombre entier Y représente OH, Cl, Br, I, NO3, BF4, C6HSO7, CH3CO2, CF3CO2 ou -OCH3.

Dans un mode de réalisation de l'invention, le composé de formule I selon l'invention est tel que n=4. Ce composé est représenté par la formule II suivante. 03S0 OS03 03s0 0s03- os03 03SO 0 -03S 0 0s03- [4 Cal+] Formule II Dans un autre mode de réalisation de l'invention, le composé de formule I selon l'invention est tel que n=3. Ce composé est représenté par la formule III suivante. 0s03-'\ 03S00 ~0~1 03s0 03s0 OS03 03S0 0S03- OS03 [3 Cal+ + 2 (CaY)+] Formule III Dans un autre mode de réalisation de l'invention, le composé de formule I selon l'invention est tel que n=2. Ce composé est représenté par la formule IV suivante. 03S0 OS03- OS03- [2 Cal+ + 4 (CaY)+] Formule IV Dans un autre mode de réalisation de l'invention, le composé de formule I selon 15 l'invention est tel que n=l. Ce composé est représenté par la formule V suivante. -03SO OSO3- S03- aOi -O3SO 0 -03SO -03S0 OS03- [Ca2+ + 6 (CaY)+] OS03- Formule V Dans un autre mode de réalisation de l'invention, le composé de formule I selon l'invention est tel que n=0. Ce composé est représenté par la formule VI suivante. OS03 03SO 0 O_I 03S0 03S0 03S0 OS03 [8 (CaY)+] OS03 OS03 Formule VI Dans ce mode de réalisation de l'invention, le composé de formule VI correspond à un composé de formule I dans lequel n est égal à 0. Dans toutes les formules III à VI ci-dessus, Y représente OH, Cl, Fr, I, NO3, C6HSO7, CH3CO2 ? CF3CO2 ou -OCH3. Préférentiellement, le composé de formule I selon l'invention est tel que n=4.

Dans un mode de réalisation, le composé selon l'invention est sous forme hydratée. La présente invention porte en outre sur un procédé de préparation des composés selon l'invention. En particulier, l'invention porte sur un procédé de préparation des composés de formule I selon l'invention caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a. mise en contact de la forme acide du sucrose octasulfate en solution, préférentiellement en solution aqueuse telle que l'eau, avec un sel de calcium pour former du sucrose octasulfate de calcium, et b. récupération du sucrose octasulfate de calcium ainsi formé.

Le procédé selon l'invention comprend donc une première étape a. dans laquelle la forme acide du sucrose octasulfate en solution est mise en contact avec un sel de calcium. Par sucrose octasulfate sous forme acide on comprend du sucrose octasulfate de formule VII suivante : Formule VII HO3SO OSO3H HO3SO HO3SO HO3SO25 Par « mise en contact » selon l'invention, on entend la mise en présence du sucrose octasulfate sous forme acide et d'un sel de calcium dans des conditions permettant leur complexation. Préférentiellement, le sel de calcium est dissout dans la solution de sucrose octasulfate sous forme acide. Les quantités relatives de sucrose octasulfate sous forme acide et du sel de calcium dans la solution sont choisies de manières à obtenir le composé de formule I souhaité. Le temps de contact entre le sucrose octasulfate sous forme acide et le sel de calcium pourra être déterminé par des tests de routine et dépendra notamment de la nature du sel de calcium utilisé. Lorsque le sel utilisé est l'hydroxyde de calcium, le temps de contact sera préférentiellement compris entre 8 et 15 heures. La mise en contact sera préférentiellement réalisée sous agitation par exemple à l'aide d'un agitateur magnétique. Le « sel de calcium » selon l'invention est préférentiellement choisi parmi les sels minéraux de calcium tels que, par exemple, Ca(OH)2, CaO, CaC12, CaBr2, CaCl2, Ca(NO3)2 ou Ca(BF4)2 ou les sels organiques de calcium tels que, par exemple, Ca(CH3CO2)2, Ca(CF3CO2)2, Ca3(C6H5O7)2 ou Ca(CH3O)2. Préférentiellement le sel de calcium selon l'invention est l'hydroxyde de calcium Ca(OH)2. Le mélange obtenu après l'étape a. pourra éventuellement être filtré, notamment pour supprimer d'éventuels sels de calcium restants.

Le procédé selon l'invention comprend une seconde étape b. dans laquelle le sucrose octasulfate de calcium obtenu à l'étape a. est récupéré. Par récupération selon l'invention, on entend préférentiellement l'obtention d'un solide de sucrose octasulfate de calcium, éventuellement un cristal. Les méthodes permettant de récupérer un tel solide sont bien connue de l'homme du métier par exemple la récupération selon l'invention pourra être réalisée par extraction/précipitation par ajout d'un solvant au mélange obtenu à l'étape a. Alternativement, il est possible de récupérer le solide directement par lyophilisation d'une solution aqueuse obtenue à l'étape a. Dans un mode de réalisation préféré, le solvant est ajouté à la solution aqueuse obtenue à l'étape a. et est mélangé à celle ci.

L'ensemble est ensuite décanté. La phase la moins dense contenant le cristal est ensuite récupérée. Cette phase sera préférentiellement lavée à l'eau puis sera être lyophilisée afin d'obtenir le sucrose octasulfate de calcium sous forme solide. Dans un mode de réalisation, le pH de la solution obtenue à l'étape a. est ajusté à pH basique, par exemple pH 9. Afin d'augmenter le rendement de la précipitation et la pureté du composé obtenu, la phase dense obtenue après décantation pourra être dissoute dans de l'eau puis à nouveau précipitée dans le solvant. Cette mise en solution et réextraction dans le solvant pourra être réalisée autant de fois que nécessaire pour obtenir la pureté et le rendement désiré en sucrose octasulfate de calcium. Un tel procédé de récupération du sucrose octasulfate de calcium est notamment décrit dans les exemples. Le solvant sera préférentiellement un solvant organique ou un mélange de solvants organiques tels que par exemple l'acétone, l'éthanol, l'acétate d'éthyle, la méthylisobutylcétone ou la méthyléthylcétone, préférentiellement l'acétone ou l'éthanol. Les étapes a. et b. sont préférentiellement réalisées à l'obscurité. La forme acide du sucrose octasulfate en solution utilisée dans l'étape a. du procédé selon l'invention pourra être obtenue de toutes les façons connues de l'homme du métier. Préférentiellement, le sucrose octasulfate sous forme acide sera obtenu à partir d'un sel de sucrose octasulfate. Dans un mode de réalisation préféré, le sucrose octasulfate sous forme acide est obtenu à partir d'un sel de sucrose octasulfate par les étapes suivantes : al. dissolution dans une solution, préférentiellement une solution aqueuse telle que l'eau, d'un sel de sucrose octasulfate, a2. désalification de la solution de sel de sucrose octasulfate ainsi obtenue pour former la forme acide du sucrose octasulfate en solution. Le « sel de sucrose octasulfate » selon l'invention peut être choisi parmi tous les sels de sucrose octasulfate existants tel que par exemple les sels de métaux alcalins (tel que par exemple le potassium, le sodium, le lithium, etc.). Préférentiellement, le sel de sucrose octasulfate est le sucrose octasulfate de potassium ou le sucrose octasulfate de sodium. L'étape al. permet l'obtention d'une solution de sel de sucrose octasulfate.

Par « dissolution » du sel de sucrose octasulfate on entend la mise en solution dudit composé. L'homme du métier peut facilement estimer le volume de solution, telle que l'eau, à ajouter pour solubiliser totalement la quantité de sel de sucrose octasulfate souhaitée et pour obtenir une solution à la concentration requise (par exemple entre 0,01M et 1M). La dissolution est préférentiellement réalisée par agitation du sel dans une solution, telle que l'eau, par exemple grâce à un agitateur magnétique. Le procédé selon l'invention peut également comprendre une étape a.2 dans laquelle la solution de sel dissous obtenu à l'étape al. est désalifiée. Par «désalification » on entend la dissociation dans le sel de sucrose octasulfate de la forme acide du sucrose octasulfate et du cation. Cette étape de désalification est suivie de la récupération de la forme acide du sucrose octasulfate. Cette étape peut être réalisée par toutes les techniques connues de l'homme du métier notamment par passage sur une colonne échangeuse d'ions. Le passage sur une colonne échangeuse d'ions de la solution contenant le sucrose octasulfate acide peut être effectué plusieurs fois afin d'éliminer l'ensemble des cations qui lui sont originellement associés. La colonne échangeuse d'ions contient préférentiellement une résine échangeuse de cations. Dans un mode de réalisation de l'invention, la résine échangeuse de cations est une résine de type acide sulfonique (par exemple l'AmberliteTM) Dans un mode de réalisation préféré, le procédé selon l'invention comprendra ou consistera en les étapes suivantes : al. dissolution dans une solution, préférentiellement une solution aqueuse telle que 20 l'eau, d'un sel de sucrose octasulfate, a2. désalification de la solution de sel de sucrose octasulfate ainsi obtenue pour former la forme acide du sucrose octasulfate en solution. a. mise en contact de la forme acide du sucrose octasulfate en solution avec un sel de calcium pour former du sucrose octasulfate de calcium, et 25 b. précipitation du sucrose octasulfate de calcium ainsi formé. Dans un autre mode de réalisation, le sucrose octasulfate de calcium est obtenu directement à partir du sucralfate. Le sucralfate est tout d'abord sulfaté, par exemple dans la pyridine puis mis en présence d'une base forte, telle le (Ca(OH)2) par exemple. La présente invention porte, en outre, sur des compositions comprenant un ou 30 plusieurs composés selon l'invention et au moins un excipient pharmaceutiquement ou cosmétologiquement acceptable.

L'invention a également pour objet un dispositif médical comprenant un ou plusieurs composés selon l'invention et un excipient pharmaceutiquement ou cosmétologiquement acceptable. Préférentiellement, la composition selon l'invention ou le dispositif médical selon 5 l'invention ne contiendront qu'un seul type de composés de formule I, préférentiellement le composé de formule II. « L'excipient » selon l'invention pourra, par exemple, être seuls ou en association un ou plusieurs tensioactifs, un ou plusieurs solvants, un ou plusieurs polymères hydrosolubles, un ou plusieurs épaississants ou gélifiants, un ou plusieurs 10 conservateurs, un ou plusieurs antibactériens, un ou plusieurs antiseptiques, un ou plusieurs agents cicatrisants, un ou plusieurs agents antioxydants, un ou plusieurs agents émollients et/ou hydratants, un ou plusieurs pigments, un ou plusieurs parfums et/ou un ou plusieurs colorants, des agents d'ajustement du pH tels que les sels, des acides, des bases. 15 Par « pharmaceutiquement et/ou cosmétologiquement acceptable » selon l'invention on se réfère à des entités moléculaires et des compositions qui ne produisent aucun effet adverse, allergique ou autre réaction indésirable quand elles sont administrées à un animal ou un humain. La composition exacte et la forme de la composition selon l'invention pourra être 20 déterminée par l'homme du métier en fonction de l'utilisation et la voie d'administration envisagées pour la composition. La composition selon l'invention sera préférentiellement formulée de manière à pouvoir être administrée par voie topique ou orale. Par « administration par voie topique » selon l'invention on comprend notamment 25 les applications cutanées, les applications buccales (muqueuse buccale), les applications génitales (muqueuse anale, vaginale). Par « administration par voie orale » selon l'invention on comprend notamment les administrations par ingestion (dont gastriques). Lorsque la composition est formulée de manière à pouvoir être administrée par 30 voie topique, elle sera préférentiellement sous une forme permettant une application facilité telle que une poudre, un lait, une crème, un baume, une huile, une lotion, un gel, une mousse, un gel moussant, une pommade, d'un spray, une pâte, un patch, etc.

Alternativement, lorsque les voies d'administration anale ou vaginale sont envisagées, la composition selon l'invention pourra être sous forme de suppositoire, ovule ou capsule. Lorsque la composition est formulée de manière à pouvoir être administrée sous forme orale elle sera préférentiellement sous forme d'une gomme, d'une pastille, d'un comprimé, d'un sucre cuit, d'un gel à boire, d'une poudre à dissoudre, d'un pansement gastrique, etc. Les dosages des composés selon l'invention dans les compositions seront notamment déterminés en fonction de la quantité de substance active nécessaire pour obtenir la réponse thérapeutique et/ou cosmétique désirée, en fonction du mode d'administration envisagé et de la durée du traitement désiré. Dans un mode de réalisation, la composition selon l'invention présente une teneur en sucrose octasulfate de calcium selon la formule générale I comprise entre 0,1 et 30 % en poids. Préférentiellement la composition selon l'invention, par exemple pour une application topique, comprendra entre 0,5 et 7%, encore préférentiellement entre 0,5 et 5% en poids de sucrose octasulfate de calcium. La composition selon l'invention pourra en outre comprendre au moins un autre principe actif, préférentiellement un autre cicatrisant, un antidouleur, un agent anti radicalaire, un antiseptique et/ou un anti-inflammatoire.

La présente invention porte, en outre, sur des composés selon l'invention ou des compositions selon l'invention pour leur utilisation en tant que médicaments. La présente invention porte, en outre, sur l'utilisation d'un composé ou d'une composition selon l'invention pour la fabrication d'un médicament. La présente invention porte, en outre, sur une méthode de traitement comprenant 25 l'administration à un patient en ayant besoin, d'une dose efficace de composés ou compositions selon l'invention Préférentiellement, les composés ou compositions selon l'invention sont utilisés pour le traitement de la peau, des muqueuses ou des organes, encore préférentiellement pour favoriser la cicatrisation de la peau, des muqueuses ou des organes et/ou pour les 30 protéger des infections microbiennes et/ou pour lutter contre des infections microbiennes et/ou pour lutter contre l'inflammation.

Par « cicatrisation » selon l'invention, on entend notamment les phénomènes de régénération et de consolidation des tissus ou des organes afin de combler une lésion. Par « favorisation de la cicatrisation » on entend notamment que la cicatrisation se fait de façon plus rapide et/ou plus efficace (absence ou diminution des cicatrices...) en présence du composé ou d'une composition selon l'invention. Préférentiellement, l'utilisation selon l'invention concernera la cicatrisation des plaies aigües ou chroniques et des brûlures. L'expression «plaie aiguë ou chronique » selon l'invention comprend notamment les écorchures, les éraflures, les égratignures, les coupures, les aphtes, les diverses plaies de la sphère buccale, l'acné cicatriciel, les ampoules, les chéilites, l'eczéma, les érythèmes fessiers, les dermatoporoses, les ulcères par exemple gastrique ou de la jambe, les escarres, les plaies du diabétique (en particulier des pieds), les irritations diverses, les dermites ou les cicatrices post chirurgie ou post acte de dermatologie esthétique (laser, épilation, peeling, injection).

Le terme « brulure » selon l'invention comprend les brûlures de toute origine dont les brulures thermiques, mécaniques, chimiques ou dues aux rayonnements. Les brulures selon l'invention peuvent notamment être les brulures dues à la chaleur ou à un coup de soleil, les radiodermites, les cicatrices de cryothérapie, les cicatrices post chirurgie ou post acte de dermatologie esthétique (laser, épilation, peeling).

Par « infection microbienne » on entend toutes les infections cutanées ou des muqueuses qu'elles soient dues à des bactéries, des levures, des champignons ou des virus. Les compositions selon l'invention peuvent être utilisées dans un but préventif pour éviter l'apparition d'une infection microbienne ou à but thérapeutique pour lutter contre une infection microbienne déjà existante.

Par « inflammation » on entend une réaction de défense immunitaire du corps à une agression caractérisée notamment par une rougeur, un gonflement, une sensation de chaleur et de douleur. La présente invention concerne particulièrement le traitement des états inflammatoires de la peau. La quantité de sucralfate à administrer à un patient dépendra de la pathologie à traiter et du mode d'administration. Par exemple, lorsqu'une application gastrique est envisagée, le sucrose octasulfate de calcium pourra être administré à une dose de 1 à 10 g/jour, préférentiellement de 2 à 6 g/jour.

La présente invention porte, en outre, sur l'utilisation d'un composé ou d'une composition cosmétique selon l'invention pour améliorer l'aspect de la peau. Par « améliorer l'aspect de la peau» selon l'invention on entend l'amélioration esthétique ou de confort d'un état de la peau et/ou des muqueuses.

La dégradation esthétique de l'état de la peau ou de son confort peut être due par exemple à l'âge, aux conditions extérieures ou aux variations de poids. Par exemple, la composition cosmétique selon l'invention pourra permettre de restaurer la fonction barrière de la peau, l'hydratation de la peau, l'augmentation de son élasticité et/ou de sa tonicité et aussi la réduction des vergetures, de la cellulite ou des rides ainsi que la disparition des taches cutanées. Alternativement le composé ou la composition selon l'invention pourra être utilisé afin de prévenir le vieillissement cutané. Les exemples suivants sont donnés à titre illustratif et ne limitent pas la portée de l'invention.

EXEMPLES Exemple 1 : Préparation et caractérisation du composé de Formule II 1.1 Méthode de préparation du composé de formule II. 0s03 o3so0 1 -03S0

03s0 0350 OS03 [4 Cal+] 0s03- 0s03- Une solution de sucrose octasulfate de potassium (1,50 g ; 1,16 mmol, 1,00 equiv, 99%) dans l'eau (50 ml) est placée dans un ballon de 100 ml. La solution est passée à travers une colonne ((D 40x500 mm) contenant 250 g de résine échangeuse d'ions 0 d'Amberlite IR 120 H à un débit de 1 ml/min à 0 C. La fraction acide (120 ml ; pH < 1,5) est collectée et neutralisée immédiatement par ajout d'une suspension d'hydroxyde de calcium jusqu'à pH = 8,15. Le mélange résultant, est laissé sous agitation pendant une nuit à température ambiante et à pH = 8,05.

Le mélange est ensuite filtré et 500 ml d'acétone sont ajoutés au filtrat. Le mélange résultant est laissé au repos pour la nuit. Le surnageant est décanté et le sirop restant est dissous dans 15 ml d'eau déminéralisée, et 200 ml d'acétone sont ajoutés à la solution. Le mélange résultant est laissé au repos pendant 3 heures et le surnageant est décanté. Une telle opération est répétée 3 fois. Puis le sirop est dissous dans 30 ml d'eau et le mélange est lyophilisé. Un solide blanc de sucrose octasulfate de calcium est obtenu (0,50 g ; 38%). Toutes ces étapes ont été réalisées à l'abri de la lumière en enveloppant le milieu réactionnel avec du papier d'aluminium. 1.2 Caractérisation du composé de formule II obtenu Le spectre RMN du composé de formule II obtenu est le suivant: RMN H (D2O, 300 MHz, ppm): 8: 4,14-4,44 (m, 9 H); 4,50 (m, 1 H); 4,67 (m, 2 H); 5,04 (d, J= 8,1 Hz, 1 H); 5,73 (d, J= 3,6 Hz, 1 H). Par ailleurs un dosage du sucrose octasulfate et du calcium contenu dans le composé II obtenu (SOS-Ca) est effectué. Le même dosage est réalisé dans des échantillons témoins ayant une concentration en Ca ou en sucrose octasulfate connue : le CaC12 et le sucrose octasulfate de potassium (SOS-K). Le dosage est réalisé de la manière suivante : - Solution standard et préparation des échantillons : 7,6 mg de CaC12 (pureté : 96%) pesés avec précision dans une fiole jaugée de 10 ml et dissous complètement dans une solution aqueuse à 0.05% en TFA, la concentration finale étant de 0,76 mg/ml. 12,1 mg de SOS-K (teneur en eau : 8.82%) pesés avec précision dans une fiole jaugée de 10 ml et dissous complètement dans une solution aqueuse à 0.05% en TFA, la concentration finale étant de 1,21 mg/ml. 16,0 mg de SOS-Ca pesés avec précision dans une fiole jaugée de 10 ml et dissous complètement dans une solution aqueuse à 0.05% en TFA, la concentration finale étant de 1,60 mg/ml. Un échantillon de 7,0 ml est dilué avec une solution aqueuse à 0,05% en TFA dans une fiole jaugée de 10 ml, pour l'analyse du sucrose octasulfate dans SOS-Ca. - Analyse par HPLC : Les échantillons SOS-Ca, SOS-K et Cac12 ainsi obtenus sont caractérisés par HPLC grâce au matériel et conditions suivants : Colonne : Atlantis T3 (4,6*100 mm; 3,0 µm), température de la colonne : 30°C, débit : 0,6 ml/min, volume d'injection : 5µl pour l'analyse de Ca dans SOS-Ca, 20 µl pour l'analyse de SOS dans SOS-Ca, Détection : ELSD (température «tube de transfert » = 50°C ; débit gazeux = 2,0 1/min, phase mobile A : 0,05 % TFA/Eau, phase mobile B : 0,05 %/ Acétonitrile (gradient : TO A :100%, T2 A :100%, T5 A :5%, B :95%).

Les résultats obtenus quant à la teneur en calcium et en sucrose octasulfate sont représentés dans les tableaux 1 et 2 suivant : Concentration Concentration en Aire du pic/teneur en Ca Ca (mg/ml) (mg/ml) CaC12 0,76 0,2629 1123298 SOS-Ca 1,60 - 888944 Tableau 1 : Estimation de la concentration en Ca des échantillons SOS-Ca en fonction d'un standard CaC12.

Le calcul de la concentration en Ca dans l'échantillon de SOS-Ca permet d'obtenir une valeur de 3,2443 mmol/g. Concentration en SOS Aire du pic/teneur en SOS (mg/ml) SOS-K 0,8353 5322294 SOS-Ca - 5725367 Tableau 2 : Estimation de la concentration en sucrose octasulfate des l'échantillon SOS-Ca en fonction d'un standard SOS-K.

Le calcul de la concentration en SOS dans l'échantillon de SOS-Ca permet d'obtenir une valeur de 0,8237 mmol/g.

Comme on peut le constater, le ratio calcium / sucrose octasulfate dans le composé de formule II SOS-Ca obtenu est de 3,2443/0,8237, soit de 3,94 ce qui correspond bien au ratio attendu.

Exemple 2 : Effet du sucrose octasulfate de Ca sur la migration des cellules La migration des cellules épithéliales est une étape importante du développement et des processus de réparation tissulaire, tels que l'embryogenèse et la cicatrisation. Lors de la cicatrisation cutanée et dans les affections inflammatoires chroniques dermatologiques, les kératinocytes sont "activés" pour entreprendre le processus de migration. Les cellules voient alors leur phénotype influencé par les interactions avec la matrice extracellulaire d'une part et par les interactions cellules-cellules, d'autre part. Les kératinocytes de l'assise basale des berges d'une plaie, migrent sur la plaie et la recouvrent. Afin d'évaluer l'impact du sucrose octasulfate de calcium sur la migration cellulaire de lignées de kératinocytes HaCAT, des études ont été réalisées à l'aide du Kit de migration cellulaire Oris Cell Migration Assay (Platypus Technologies). Cette étude a été menée en parallèle avec le sucrose octasulfate de potassium, et le sucrose octasulfate de sodium pour comparaison. Matériels et méthodes -Matériel biologique La lignée de kératinocytes utilisée est la lignée de kératinocytes humains HaCaT, spontanément immortalisée. Cette lignée est fréquemment citée comme modèle de référence dans la littérature. - Protocole de migration cellulaire Le protocole utilisé pour l'étude de la migration cellulaire repose sur l'utilisation d'un kit 96 puits, Oris Cell Migration Assay (Platypus Technologies - TEBU), permettant la miniaturisation et la quantification de ce processus cellulaire. Le principe de ce test consiste à étudier la migration cellulaire vers le centre du puits de la plaque de 96 puits. Il consiste à placer un stoppeur dans des puits, afin de créer une zone de détection de 2 mm de diamètre. Puis de retirer les stoppeurs une fois que les cellules ont bien adhéré à la surface autour de ceux-ci, et ainsi, de permettre aux cellules de migrer vers la zone de détection. Les plaques sans les stoppeurs et avec les actifs sont mises à incuber à 37°C pendant 24 heures dans du DMEM 0% SVF. On analyse ensuite la quantité de cellules situées dans la zone où il y avait le stoppeur, afin d'évaluer la migration des cellules. Un cache permet de visualiser et de comptabiliser uniquement les cellules situées dans cette zone. Pour chaque condition, la moyenne de 6 à 8 puits est réalisée. Les produits testés dans cette étude sont le SOS-Ca obtenu dans l'exemple 1 à 10µM, du SOS-K à 10µM (Sucrose octasulfate de potassium), du SOS-Na à 10µM (Sucrose octasulfate de sodium) et de l'EGF en tant que témoin positif. Un témoin négatif est réalisé dans lequel aucun composé n'est ajouté au milieu de culture.

Résultats L'effet des 3 sucroses a été testé sur la migration des cellules HaCat. Les résultats sont quantifiés grâce à la formule suivante : IF trâlté: F a r ~.n tom' X 100 - en IF (Intensité de Fluorescence, proportionnelle à la quantité des cellules ayant 15 migrées). - en pourcentage d'activité par rapport au témoin 0% SVF : Les résultats obtenus sont résumés dans le tableau 3. Témoin EGF SOS-Ca SOS-Na SOS-K 0% SVF 33ng 10pM 10pM 10pM 2011 ± 847 8489 ± 301 4144 ± 1077 1145 ± 290 1853 ± 667 100 422*** 206*** 57 92 20 Tableau 3 : E f f e t des 3 sucroses sur la migration des kératinocytes. ' ' < p<0.001 par rapport au témoin 0%SVF. De ce tableau on peut déduire que : - L'EGF à 33 ng/ml, contrôle positif de nos expériences, induit la migration (et la prolifération) des kératinocytes de façon importante et significative. 25 - A 10 µM, le sucrose octasulfate de potassium (SOS-K) et le sucrose octasulfate de sodium (SOS-Na) n'induisent pas la migration des kératinocytes. - A 10 µM, le sucrose octasulfate de calcium (SOS-Ca) induit de façon statistiquement significative la migration des kératinocytes. Comme on peut le constater, le SOS-Ca permet d'induire significativement la 30 migration des kératinocytes contrairement au SOS-K et SOS-Na. MOY IF % activité / témoin Exemple 3 : Effet du sucrose octasulfate de Ca sur la différenciation des cellules L'épiderme joue un rôle protecteur majeur en procurant une barrière chimique et mécanique pour le corps. Elle assure le maintien de l'étanchéité, à savoir la fonction barrière cutanée. Les cornéocytes, kératinocytes de la couche cornée, associés à une matrice lipidique, assurent en grande partie cette fonction. Néanmoins les couches plus profondes interviennent dans la mise en place des acteurs de cette fonction. La capacité de différenciation des kératinocytes de l'épiderme va garantir la mise en place d'une barrière de type perméabilité sélective fonctionnelle. Le programme de différenciation des kératinocytes est régulé de manière spatiotemporelle, évoluant des couches les plus profondes de l'épiderme, couche basale la moins différenciée, vers la couche cornée, stade ultime de différenciation des kératinocytes en cornéocytes. D'un point de vue protéique, la différenciation épidermique est majoritairement axée sur l'évolution de protéines de structure que sont les kératines et qui contribuent à l'intégrité architecturale de l'épiderme. Leur expression varie en fonction du degré de maturation des kératinocytes. La kératine 1 basique et la kératine 10 acide, sont des marqueurs précoces de la différenciation kératinocytaire, présents dès la couche basale de l'épiderme. L'expression d'autres marqueurs de ce processus biologique, plus tardifs, peut être suivie telle que celle des protéines de l'enveloppe cornée, comme la cornéodesmosine (CDSN), les small prolin rich protein 1 (SPRRIA et SPRR1B), l'involucrine (IVL), ainsi que certaines enzymes majeures à l'origine du pontage des protéines de structure entre elles et avec des lipides kératinocytaires, les transglutaminases, telles que la transglutaminase 1 (TGMl) ou 3. La formation de la matrice fibreuse présente dans les cornéocytes est initiée au niveau de la transition entre kératinocytes granuleux et les cornéocytes. La loricrine (LOR) est une protéine de structure contenant des résidus glutamine et lysine permettant la fixation avec d'autres protéines de l'enveloppe cornée. Les molécules basiques de filaggrine (FLG) produites à partir de son précurseur la profilaggrine (stockée dans les granules de kératohyaline) s'associent aux filaments de cytokératine, permettant ainsi leur agrégation. La filaggrine peut être ensuite déiminée par les enzymes Peptidyl Arginine Deiminase (PAD) et notamment PAD1 et PAD3. La filaggrine déiminée, acide, se détache alors des filaments intermédiaires avant d'être complètement dégradée, engendrant les acides aminés qui constituent le facteur naturel d'hydratation (FNH). Parallèlement, la synthèse et le transport de lipides kératinocytaires sont à l'origine du ciment lipidique intercornéocytaire indispensable à la barrière cutanée, dont la formation représente la phase ultime de la différenciation épidermique terminale. Cette matrice lipidique extracellulaire fournit la principale barrière aux mouvements transcutanés d'eau et d' électrolytes. Ainsi un certain nombre d'enzymes et de transporteurs lipidiques voient leur expression kératinocytaire augmentée avec la différenciation. Ce ciment résulte d'un équilibre entre trois espèces lipidiques, le cholestérol, les acides gras libres et les céramides. Ces lipides dérivent de glucosylcéramides, sphingomyeline, cholestérol et de phospholipides synthétisés dans les couches épineuses et granuleuses. Ils sont transportés via les corps lamellaires, petites vésicules sécrétoires qui fusionnent dans la couche granuleuse et déversent leur contenu à la jonction stratum granulosum/stratum corneum. En plus de ces précurseurs lipidiques, les corps lamellaires contiennent de nombreuses enzymes incluant des hydrolases lipidiques comme la Sphyngomyélinase acide (aSmase), la betaglucocerebrosidase (GBA) ou les plospholipases A2 (sPLA2) ainsi que des lipases acides et neutres. Co-délivrés avec les précurseurs lipidiques dans les espaces extracellulaires, ces enzymes convertissent respectivement, la sphingomyeline en céramide, la beta-glucocérébroside en céramide et les phospholipides en acides gras libres et glycérol. ELOVL4 (elongation of vert' long chain fatty acids-4) et la Sphingolipid C4-hydroxylase/delta-4 desaturase (DESG2) interviennent aussi dans la synthèse des céramides et donc sur la fonction barrière de la peau. SULT2B1 (cholestérol sulfotransferase) permet la sulfonatation du cholestérol dans les couches supérieures de l'épiderme. Finalement FABP5 (fatty acid binding protein) participe au transport et au métabolisme des acides gras. La fonction barrière de la peau inclut aussi une défense contre les micro- organismes. L'épithélium joue un rôle actif dans les défenses innées de l'hôte. Les systèmes antimicrobiens cutanés reposent entre autres sur la présence de certains lipides de surface (acides oléique et palmitoléique du sébum et de certaines protéines constitutives qui sont de plus en plus exprimées en fonction de l'état de différenciation des kératinocytes (RNAse 7, proteinase inhibiteur 3). La RNase 7 et la protéinase inhibiteur 3 (PI3 ou elafin) possèdent des activités antimicrobiennes. Rnase 7 est un membre de la famille des Rnase A et possède une activité antimicrobienne à large spectre. Elle est ainsi capable d'agir contre des bactéries Gram + ou Gram -. De plus, l'acidification de la surface épidermique joue un rôle important dans la défense antimicrobienne cutanée. La peau agit ainsi non seulement comme une barrière physique, mais aussi comme une barrière chimique. Il existe également une composante adaptative de l'immunité innée reposant sur la sécrétion inductible de peptides antimicrobiens. Ils possèdent des activités antimicrobiennes directes contre des bactéries variées, des virus et des champignons avec la capacité d'inhiber leur croissance. En plus, de par leur action chimiotactique, ces peptides antimicrobiens font le lien entre réponse immunitaire innée et adaptative. Ils jouent un rôle important comme médiateurs de l'inflammation en ayant des effets sur les cellules épithéliales et inflammatoires, en influençant la prolifération cellulaire, la cicatrisation, la production de cytokines, chimiokines et la chimiotaxie. Les peptides antimicrobiens sont généralement synthétisés dans les couches supérieures de la couche épineuse et la couche granuleuse, mais ils sont actifs dans la couche cornée où ils sont libérés. Leur mode d'action consiste à rompre la membrane plasmique des microbes infectieux ou à pénétrer dans le microorganisme afin d'interférer avec le métabolisme intracellulaire. Les peptides antimicrobiens les plus étudiés dans la peau sont les (3-défensines et les cathélicidines. Les 13-défensines humaines constituent la classe majeure des peptides antimicrobiens retrouvés dans les épithéliums humains et quatre d' entres elles ont été identifiées dans la peau, hBD 1-4. Bien qu'elles appartiennent à la même famille, elles sont régulées par des voix différentes.

La 13-défensine 2 humaine (hBD-2 ou DEFB4), un peptide de 4 kDa se liant à l'héparine est l'un des principaux peptides antimicrobiens cutanés. Seulement bactériostatique face à S. aureus, hBD-2 possède une activité antimicrobienne essentiellement dirigée contre les bactéries à Gram négative. La 13-défensine 3 (hBD-3), un peptide antimicrobien de 5 kDa présente une 30 activité antimicrobienne à large spectre incluant Staphylococcus aureus.

La psoriasine (Si OOA7), appartient à la famille des protéines S100, tient son nom du fait qu'elle fut découverte à partir d'extraits de squames de psoriasis. Ce peptide de 1l kDa est notamment produit dans les zones cutanées où la colonisation bactérienne est abondante ainsi que dans les zones inflammatoires. Elle est principalement dirigée contre Escherichia coli. L'effet du sucrose octasulfate de calcium et des sucroses octasulfates de potassium et de sodium sur la régulation de cibles moléculaires impliquées dans les processus de différenciation kératinocytaire a été évalué. Pour cela des kératinocytes normaux humains (NHK) ont été mis en présence des différents produits à tester et l'expression de différentes protéines impliquées dans la mise en place des structures protéiques de l'enveloppe cornée, mais aussi dans la synthèse lipidique ou les activités antimicrobiennes, a été estimée. - Matériel biologique La lignée de kératinocytes utilisée est la lignée de kératinocytes humains 15 primaires ou NHKs préparée à partir de lambeaux cutanés issus de déchets opératoires de chirurgie esthétique (diminution mammaire). - Protocole expérimental Les produits à tester sont incubés avec les kératinocytes pendant 72 heures. Les cellules sont ensuite récupérées et une analyse de l'expression de gènes cibles 20 impliqués dans la différenciation épidermique par PCR en temps réel est réalisée. Les produits testés sont le SOS-Ca à 10 µM ou 30 µM, le SOS-Na à 10 µM ou 30 µM, le SOS-K à 10 µM ou 30 µM, du CaC12 à 1,5mM en tant que témoin positif. Un témoin négatif est réalisé dans lequel aucun produit n'est ajouté au milieu de culture.

25 30 Résultats : Les résultats obtenus sont résumés dans le tableau 4. Marqueurs de différenciation des 10 µM 30µM 1,5 mM kératinocytes SOS-K SOS-Ha SOS-Ca SOS-K SOS-Ha SOS-Ca Calcium Calmodulin-like5 CALML5 88 56 211 196 184 266 220 Filaggrin FLG 156 135 225 204 241 562 230 Involcurin IVL 205 158 283 366 367 761 478 Loricrin LOR 190 79 202 300 218 1117 437 Peptidyl arginine PAD11 133 108 139 105 174 270 243 deiminase, type I Small proline-rich SPRRIA 207 187 277 388 350 754 625 protein lA Small proline-rich SPRRIB 151 170 184 256 264 581 512 protein 1B(cornifin) Corneodesmosin CDSN 127 95 138 152 142 198 174 Transglutaminase 1 TGM1 90 81 82 139 133 204 177 Synthèse des lipids Fatty acid binding FABP5 128 122 134 189 192 379 334 protein 5 Elongation of very ELOVL4 148 117 147 169 147 188 165 long chain fatty acids Degenerativatocyte DEGS2 104 62 96 143 258 283 340 homolog 2, lipid desaturase Sulfotransferase SULT2B1 88 84 102 150 138 256 317 family, cytosolic, 2B, member 1 Desquamation Kallikrein-related KLK7 134 131 159 171 191 256 438 peptidase 7 Peptide anti-microbien, immunité innée Defensin, beta 4 DEFB4 224 207 188 208 235 383 778 Peptidase inhibitor P13 90 133 306 124 182 1989 5825 3, skin-derived 5100 calcium S100A7 49 49 133 50 59 205 884 binding protein A7 Tableau 4 : expression de gènes impliqués dans la différentiation cellulaire dans une lignée de kératynocyte NHKs après incubation avec du SOS-Ca à 10 µM ou 30 µM, du SOS-Na à 10 µM ou 30 µM, du SOS-K à 10 µM ou 30 µM ou du CaC12 à 1,5mM en pourcentage de l'expression des différents ARNm par rapport au témoin négatif. Comme on pouvait s'y attendre le calcium à 1.5 mM, contrôle positif des expériences, a bien induit l'expression des gènes impliqués dans la différenciation des kératinocytes ainsi que dans la synthèse de peptides antimicrobiens. Le SOS-Ca a induit fortement l'expression des marqueurs de différentiation. Au contraire les SOS-K et SOS-Na à 30 µM ont induit la différenciation des kératinocytes de façon modérée. On peut constater que, à 30 µM, le SOS-K et le SOS-Na ont induit respectivement 8 et 11 cibles alors que le SOS-Ca en a induit 17. De plus, l'induction de l'expression de l'ensemble des gènes est plus forte par le SOS-Ca qu'avec les deux autres SOS.

Ainsi le SOS-Ca a induit l'expression des marqueurs protéiques de la différenciation, de protéines impliquées dans la synthèse des lipides (tel que KLK7), impliquées dans la desquamation, et a induit l'expression de peptides antimicrobiens comme hBD2 (DEFB4), PI3 et la psoriasine (S 100A7). En induisant l'expression de la filaggrine et de Padil, le SOS-Ca participe aussi à la synthèse de facteur naturel d'hydratation. Par ailleurs, il est à noter que l'effet du SOS-Ca ne peut pas être imputé à la seule contribution de la partie Ca (équivalente à 120 µM). Cette concentration en calcium, 10 fois inférieure à celle du contrôle positif, n'est pas suffisante pour induire les marqueurs de la différenciation des cellules dans les conditions expérimentales. Par ailleurs, le tableau montre que le SOS-K et le SOS-Na n'induisent pas de façon dose dépendante et significative tous les marqueurs de cette différenciation. En conséquence, cette différenciation est donc bien induite, de façon inattendue, par la synergie du SOS et du Ca présents dans le SOS-Ca. De plus, les résultats montrent que les propriétés du SOS-Ca, notamment sur l'expression des marqueurs de la différenciation des kératinocytes, sont supérieures à celles obtenues avec le contrôle positif Ca à 1.5 mM.

Le SOS-Ca joue donc un rôle très important dans la différenciation des kératinocytes et active la fonction barrière physique protéique, lipidique et antimicrobienne ainsi que l'hydratation cutanée.

Exemple 4 : Effet du sucrose octasulfate de Ca sur la synthèse d'acide hyaluronique L'acide hyaluronique est un composant de la matrice extracellulaire pouvant être synthétisé par les kératinocytes et ayant de nombreuses fonctions. En particulier, l'acide hyaluronique est impliqué dans le maintient de l'hydratation cutanée, dans la prolifération et la stimulation de la motilité cellulaire, pendant la ré-épithélialisation. La quantité d'acide hyaluronique présente au niveau cutané diminue avec l'âge ce qui est en partie responsable du vieillissement cutané. L'effet du sucrose octasulfate de calcium sur la synthèse d'acide hyaluronique a été testé. -Matériel biologique La lignée de kératinocytes utilisée est la lignée est la lignée de kératinocytes humains primaires ou NHKs, préparée à partir de lambeaux cutanés issus de déchets opératoires de chirurgie esthétique (diminution mammaire). -Protocole expérimental Les produits à tester sont incubés avec les kératinocytes pendant 72 heures. Les surnageants de culture sont ensuite récupérés et une analyse de l'expression de l'acide hyaluronique est réalisée par le kit ELISA Duoset Hyaluronan (ReD Systems) selon les instructions du fournisseur. Les produits testés sont le SOS-Ca à 10 µM, le SOS-Na à 10 µM, le SOS-K à 10 µM, et l'acide retinoïque à 0,1 µM en tant que témoin positif.

Un témoin négatif est réalisé dans lequel aucun produit n'est ajouté au milieu de culture. Résultats Les valeurs de la quantité d'acide hyaluronique obtenues sont représentées sur la Figure 1 en pourcentage d'induction par rapport au témoin négatif non traité.

Comme on pouvait s'y attendre, l'acide rétinoïque à 0.1 µM, témoin positif, a induit la synthèse d'acide hyaluronique de 80%.

Les SOS-K et Na n'induisent pas une augmentation de la synthèse d'acide hyaluronique. En revanche le SOS-Ca à 10 µM a bien induit la synthèse d'acide hyaluronique de 38%. Cette induction est statistiquement significative par rapport au témoin non traité.

Le SOS-Ca joue donc un rôle important dans l'induction de la synthèse de l'acide hyaluronique et donc dans l'hydratation et la prévention du vieillissement cutané.

Claims (17)

1. REVENDICATIONS1. Composé de formule générale I 0350 OS03 03S0 03S0 OS03 [ n Cal+ + (8 - 2n) (CaY)+] Formule générale dans laquelle : 0<n<4 10 n est un nombre entier Y représente OH, Cl, Br, I, NO3, BF4, C6HSO7, CH3CO2, CF3CO2 ou -OCH3.
2. 2. Composé selon la revendication 1, caractérisé ce que n = 4. 15
3. 3. Procédé de préparation des composés de formule I selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a. mise en contact de la forme acide du sucrose octasulfate en solution avec un sel de calcium pour former du sucrose octasulfate de calcium, et b. précipitation du sucrose octasulfate de calcium ainsi obtenu. 20
4. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la forme acide du sucrose octasulfate en solution est obtenue par les étapes suivantes, al. dissolution dans une solution d'un sel de sucrose octasulfate, a2. désalification de la solution de sel de sucrose octasulfate ainsi obtenue pour 25 former la forme acide du sucrose octasulfate en solution.
5. 5. Procédé selon la revendication 4, dans lequel le sel de sucrose octasulfate est le sucrose octasulfate de potassium ou le sucrose octasulfate de sodium.
6. 6. Procédé selon la revendication 4 ou 5, dans lequel l'étape de désalification de la solution de sel de sucrose octasulfate en solution est réalisée par passage de ladite solution sur une colonne échangeuse d'ions.
7. 7. Procédé selon l'une des revendications 3 à 6, caractérisé en ce que ledit sel de calcium est un sel minéral de calcium, choisi dans le groupe comprenant le Ca(OH)2, CaC12, CaBr2, Cale, Ca(NO3)2 et Ca(BF4)2, ou un sel organique de calcium, choisi dans le groupe comprenant le Ca(CH3CO2)2, Ca(CF3CO2)2, Ca3(C6H5O7)2 et Ca(CH3O)2.
8. 8. Composé selon l'une des revendications 1 à 2, pour son utilisation en tant que médicament.
9. 9. Composé selon la revendication 8, pour favoriser la cicatrisation.
10. 10. Composé selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il s'agit de la cicatrisation des brûlures et plaies aiguës ou chroniques.
11. 11. Composé selon la revendication 10, caractérisé en ce les brûlures et plaies 20 aiguës ou chroniques sont dues à une brûlure par la chaleur ou un coup de soleil, une radiodermite, une irritation d'origine diverse, une dermite, une écorchure, une éraflure, une égratignure, une coupure, un ulcère par exemple de jambe ou gastrique, un escarre, une plaie du diabétique, un aphte, une plaie de la sphère buccale d'origine diverse, de l'acné cicatriciel, une cicatrice de cryothérapie, une cicatrice post chirurgie ou post acte 25 de dermatologie esthétique, une ampoule, une chéilite, de l'eczéma, un érythème fessier ou une dermatoporose.
12. 12. Composé selon la revendication 8, pour la prévention ou le traitement des infections microbiennes.
13. 13. Utilisation d'un composé selon l'une des revendications 1 à 2, pour la préparation d'une composition cosmétique. 10 15 3010
14. 14. Composition pharmaceutique comprenant au moins un composé selon la revendication 1 ou 2, et un excipient pharmaceutiquement acceptable.
15. 15. Composition pharmaceutique selon la revendication 14, contenant au moins un autre principe actif.
16. 16. Composition cosmétique comprenant au moins un composé selon la revendication 1 ou 2, et un excipient cosmétologiquement acceptable.
17. 17. Utilisation d'une composition selon la revendication 16 pour améliorer l'état de la peau.