FR2967780A1 - Procede de quantification par spectrometrie de masse - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne un procédé de quantification par spectrométrie de masse d'au moins une espèce chimique et/ou biologique d'intérêt en solution, dans lequel on produit au moins un ion moléculaire précurseur de l'espèce d'intérêt à quantifier, et on fragmente l'ion moléculaire pour obtenir au moins un ion fragment caractéristique de l'espèce à quantifier. On détecte ensuite au moins un ion fragment et on quantifie l'espèce d'intérêt à doser à partir du signal de détection obtenu. Selon l'invention, la fragmentation de l'ion moléculaire à l'étape b) est obtenue par application d'au moins une onde électromagnétique sub millimétrique à l'ion moléculaire.

Description

La présente invention concerne le domaine technique de la quantification d'espèces chimiques et/ou biologiques par spectrométrie de masse. Le dosage de substances chimiques ou biologiques présentes à l'état de traces au sein d'un échantillon complexe est un enjeu analytique majeur. Ce dosage peut avoir pour but de mesurer, par exemple, la concentration d'une substance chimique présentant un risque toxicologique vis à vis des organismes dans l'environnement ou du consommateur dans l'alimentation. Dans le domaine de la santé humaine, les phénomènes d'absorption et de métabolisation d'un médicament en phase de développement sont suivis en dosant les molécules d'intérêt dans les fluides biologiques (sang, urines) tandis que de nombreuses pathologies pourront, à terme, être précocement dépistées par le biais d'un dosage de substances dites biomarqueurs (protéines, métabolites, fragments d'acides nucléiques) dans ces mêmes fluides. Lorsque le dosage doit cibler une classe de substances ou une substance en particulier, les techniques de détection doivent présenter une spécificité telle qu'elle garantit l'absence d'interférences susceptibles de biaiser la quantification. On peut citer parmi les techniques de détection les plus spécifiques : - l'absorption des ondes lumineuses par des fonctions chimiques singulières de la substance à doser, la spécificité de détection pouvant être accrue lorsque les absorptions de plusieurs longueurs d'onde sont simultanément mesurées (à l'aide d'un détecteur à barrette de diodes par exemple), - la reconnaissance de motifs structuraux par la réaction antigène anticorps constituant le principe de base des dosages immunologiques tel que la technique ELISA, - la spectrométrie de masse qui repose sur la singularité de la masse 30 moléculaire de la substance à doser et de ses voies de fragmentations.

Classiquement, le dosage par spectrométrie de masse repose sur la sélection dans un premier dispositif dit analyseur d'un ou plusieurs ions moléculaires de la substance à doser à l'issue d'une séparation chromatographique. Cette sélection peut être conduite de manière successive ou simultanée. Ces ions, caractérisés par leurs rapports m/z respectifs peuvent être de polarité positive ou négative. Les ions moléculaires sélectionnés, dits ions précurseurs, sont alors fragmentés par le biais de collision énergétique contre un gaz inerte (azote, hélium, argon, xénon) dans un dispositif appelé cellule de collision pour former des ions fragments. Un deuxième analyseur permet la sélection et la transmission jusqu'au détecteur d'un ou plusieurs fragments émanant de la fragmentation de chaque ion précurseur. Ce type d'analyse est appelé spectrométrie de masse en tandem ou MS-MS ou MS2 en mode SRM (Selected Reaction Monitoring) ou MRM (Multiple Reaction Monitoring). L'événement consistant à détecter après sélection un ion fragment émanant de la fragmentation d'un ion précurseur lui-même sélectionné est appelé transition. Plusieurs transitions peuvent être enregistrées pour un même ion précurseur. Alternativement, plusieurs étapes de fragmentation (MSn) peuvent être appliquées dans un processus de quantification (Fortin et al. Anal. Chem. 2009, 81, 9343-9352). De même, l'ensemble des étapes de sélection des ions précurseurs, collision énergétique et sélection des ions fragments peut être conduit dans un unique dispositif permettant le piégeage des ions. Dans ce schéma de fonctionnement, c'est le signal induit par le ou les ions fragments qui arrivent sur le détecteur, signal proportionnel à la quantité initiale du ou des ions précurseurs de la substance à doser, elle même proportionnelle à la concentration initiale de la substance dans l'échantillon de départ, qui permet de doser la molécule. Le plus souvent, cette méthode d'analyse basée sur l'enregistrement du signal associé à une transition est associée à une séparation préalable des molécules de l'échantillon par un système de chromatographie directement en amont du spectromètre de masse. C'est l'intégration du pic chromatographique de la substance à doser qui permet alors d'établir la concentration de la substance par le biais de l'application d'une méthode d'étalonnage (droite d'étalonnage, étalonnage interne avec une substance autre, méthode de l'ajout dosé, étalonnage à l'aide d'un isotopomère). Par rapport aux méthodes de dosage optique, le dosage par spectrométrie de masse est plus spécifique et sensible du fait notamment des étapes successives de sélection des ions précurseurs puis de sélection des ions fragments après application d'au moins une étape de fragmentation. Par rapport aux dosages basés sur la réaction antigène anticorps, le développement d'un dosage par spectrométrie de masse est plus rapide et moins couteux du fait du non recours à un anticorps. Le dosage par spectrométrie de masse est également davantage compatible avec le dosage de substances présentant des caractéristiques proches de celles de la matrice et pour lesquelles il est difficile de produire un anticorps spécifique (cas des isoformes génétiques chez les protéines). Enfin, la vitesse d'acquisition des spectromètres actuels fait qu'il est possible de doser plusieurs dizaines, voire quelques centaines de composés, simultanément lors d'une étape de séparation chromatographique (J. Wang J, D.Leung, J. Agric. Food Chem., 2009,57, 2162-2173). La spectrométrie de masse est devenue ainsi un outil incontournable pour la mise en évidence des pratiques de dopages (Politi et al. J. Anal. Toxicol., 2005, 29, 1-14) pour le dosage des perturbateurs endocriniens dans l'environnement (Gallart-Ayala et al. Mass Spectrom. Rev., 2010, 29, 776-805) ou pour les études de pharmaco cinétique (Mass Spectrometry in Drug Metabolism and Pharmacokinetics. Edited by Ragu Ramanathan John Wiley & Sons, Inc.: Hoboken, NJ. 2009).

Cependant, dans le cas de matrices très complexes, ou de mélanges de substances aux propriétés physico-chimiques proches, il est courant que la transition de la substance à doser soit polluée par des composés dits interférents qui se caractérisent pas des ions moléculaires de valeurs m/z identiques ou proches de celles des ions moléculaires de la substance d'intérêt, et que ces ions moléculaires en se fragmentant conduisent à des ions fragments de valeurs m/z également identiques ou proches de celles des ions fragments issu de la fragmentation des ions moléculaires de la substance d'intérêt. Le dosage est alors biaisé du fait de ce manque de spécificité. Cette configuration est particulièrement rencontrée par exemple dans le cas du dosage des protéines par spectrométrie de masse (Fortin et al. Mol. Cell. Proteomics, 2009, 6, 1239-47).

Ce phénomène tire son origine de l'absence de spécificité du mode d'excitation et fragmentation par collision contre un gaz inerte des ions précurseurs. En effet, tous les ions précurseurs présents simultanément dans la région du spectromètre de masse où est effectué le processus de fragmentation par collision seront fragmentés.

Le défi principal du développement de la spectrométrie de masse aux analyses quantitatives réside aujourd'hui dans l'amélioration de la spécificité de dosage et dans l'abaissement de seuil de détection d'espèces en solution, notamment pour des applications médicales ou environnementales. Un premier objectif de la présente invention est de proposer une technique d'analyse quantitative par spectrométrie de masse qui permette d'améliorer la spécificité de l'étape de fragmentation de l'ion moléculaire sélectionné dans le cadre d'une stratégie de quantification par spectrométrie de masse en tandem (de type MS2). Un autre objectif de la présente invention consiste par cette technique à améliorer les seuils de détection et de quantification de certaines classes de molécules présentes à de très faibles niveaux de concentrations dans des matrices biologiques ou environnementales. Ces objectifs sont atteints, conformément à l'invention, par la mise en oeuvre d'un procédé de quantification par spectrométrie de masse d'au moins une espèce chimique et/ou biologique d'intérêt en solution, dans lequel : a) on produit au moins un ion moléculaire précurseur de l'espèce d'intérêt à quantifier, et b) on fragmente l'ion moléculaire pour obtenir au moins un ion fragment caractéristique de l'espèce à quantifier, c) on détecte au moins un ion fragment et on quantifie l'espèce d'intérêt à doser à partir du signal de détection obtenu.

De façon nouvelle et inventive selon le procédé proposé, la fragmentation de l'ion moléculaire à l'étape b) est obtenue par application d'au moins une onde électromagnétique sub millimétrique sur l'ion moléculaire. Ainsi, l'absorption de l'onde électromagnétique sub millimétrique par l'ion moléculaire conduit à une excitation de cet ion. Le procédé de l'invention propose ainsi d'exciter un ion moléculaire afin d'augmenter son énergie interne par application d'une irradiation électromagnétique sub millimétrique en vue de le fragmenter. Ce procédé permet d'accroître de manière très importante la spécificité de l'étape d'excitation et de fragmentation et est par conséquent beaucoup plus sélectif qu'une dissociation activée par collision à l'aide d'un gaz. En effet, dans ce cas, seules la ou les molécules absorbant à la longueur d'onde électromagnétique sub millimétrique appliquée sont excitées ; par opposition dans le cas d'une excitation collisionnelle, tous les ions sont excités.

L'absorption de l'onde électromagnétique produite peut résulter des propriétés intrinsèques (groupe aromatique, insaturations conjuguées...) de la molécule à doser ou encore de propriétés extrinsèques conférée à cette molécule par des manipulations appropriées telles qu'une dérivation chimique.

Selon une première caractéristique préférée du procédé de l'invention, on choisit au moins une longueur d'onde électromagnétique sub millimétrique de fragmentation en fonction de l'espèce à quantifier. Cette longueur d'onde peut notamment être la longueur d'onde d'absorption maximale ou une longueur d'onde spécifique de la substance à doser.

Selon une autre caractéristique du procédé de l'invention, on modifie les propriétés optiques d'absorption de l'espèce à quantifier par greffage ou complexation non covalente d'un chromophore absorbant à la longueur d'onde de l'onde électromagnétique. On confère ainsi à la molécule à doser des propriétés extrinsèques qui vont favoriser la sélectivité de l'étape de fragmentation par l'onde électromagnétique appliquée. Dans ce mode de réalisation préféré, le chromophore greffé est un avantageusement un chromophore photoclivable.

Toujours de façon préférée selon l'invention, l'onde électromagnétique sub millimétrique de fragmentation est une onde d'excitation dont la longueur d'onde est située dans le domaine infrarouge, visible, ou ultra-violet.

Dans un mode de réalisation préféré, on peut également choisir d'appliquer plusieurs ondes d'excitation de longueurs d'ondes différentes pour fragmenter au moins un dit ion moléculaire d'au moins une espèce à quantifier. De façon avantageuse encore dans ce mode de réalisation, plusieurs chromophores de masse et/ou de longueur d'onde d'absorption différentes peuvent être greffés ou compléxés sur au moins une dite espèce à quantifier dans un même échantillon ou dans plusieurs échantillons simultanément. Le procédé de l'invention a été conçu pour être mis en oeuvre dans un spectromètre de masse permettant une analyse en mode MSn, notamment en mode SRM avec une source de fragmentation optique. Dans un mode de réalisation alternatif, le procédé de l'invention peut également comporter une étape b') de fragmentation par activation collisionnelle classique. De façon préféré mais non exclusive, il est mis en oeuvre dans un spectromètre de masse de type triple quadrupôle ou possédant au moins un piège ionique, la fragmentation du ou des ion(s) moléculaire(s) étant produite dans un des quadrupôle ou ledit piège ionique. Diverses autres caractéristiques ressortent de la description faite ci-dessous en référence aux dessins annexés qui montrent, à titre d'exemples non limitatifs, des formes de réalisation de l'objet de l'invention. - la figure 1 représente schématiquement la mise en oeuvre du procédé de l'invention dans un spectromètre de masse de type triple quadripôle ; - la figure 2 représente schématiquement la mise en oeuvre du procédé de l'invention dans un spectromètre de masse de type piège à ions ; - la figure 3 représente schématiquement la mise en oeuvre du procédé de l'invention dans un spectromètre de masse de type triple quadrupôle à trappe ionique associé à un laser en continu ; - la figure 4 représente la structure chimique d'une molécule utilisée dans un exemple de validation du procédé de l'invention - la figure 5 représente la structure chimique d'un ion fragment obtenu après fragmentation de la molécule de la figure 4; - les figures 6A et 6B représentent les chromatogrammes obtenus lors d'analyses d'un plasma hydrolisé seul par analyse SRM (transition 745/583) en fragmentation induite par collision (CID) et fragmentation induite par laser à À = 532 nm (LID) conformément à l'invention respectivement; - les figures 7A et 7B représentent les chromatogrammes obtenus pour une analyse SRM (transition 745/583) avec fragmentation induite par collision (CID) et fragmentation induite par laser à À = 532 nm (LID) conformément au procédé de l'invention respectivement sur une solution avec une concentration C = 7 500 ng.mL-1 d'une espèce recherchée connue dans du plasma hydrolysé; - les figures 8A et 8B représentent les chromatogrammes obtenus pour une analyse SRM (transition 745/583) avec fragmentation induite par collision (CID) et fragmentation induite par laser à À = 532 nm (LID) conformément au procédé de l'invention respectivement sur une solution avec une concentration C = 500 ng.mL-1 d'une espèce recherchée connue dans du plasma hydrolysé; - les figures 9A et 9B représentent respectivement une droite de calibration de la molécule d'intérêt dans un plasma de rat digéré par analyse SRM (transition 745/583) avec une fragmentation induite par collision (CID) et avec fragmentation induite par laser à À = 532 nm (LID) conformément au procédé de l'invention.

La présente invention a pour objet un procédé de quantification par spectrométrie de masse dédié à tout dispositif d'analyse de masse muni d'une entrée pour l'injection des molécules sous forme ionisée et d'une sortie pour l'éjection des ions à détecter. Comme il sera décrit par la suite, le procédé de l'invention a notamment été pensé pour être mise en oeuvre sur des analyseurs de masse de type triple quadrupôle linéaire ou en forme de U, pièges à ions linéaires ou quadripolaires. De plus, toutes les autres formes de spectrométrie de masse en tandem hybride peuvent également être adaptées à cette technique notamment des architectures de type triple quadrupôle à trappe ionique sans pour cela que le procédé de l'invention ne soit limité à ce type d'appareillage. La source d'ionisation associée à l'analyseur de masse pourra être de tout type communément employé en spectrométrie de masse et notamment de type Electrospray basé sur l'application d'un champ électrique à une solution, de type MALDI (acronyme de l'anglais "Matrice Assisted Laser Desorption Ionization") basé sur l'application d'une irradiation lumineuse, à ionisation chimique ou électronique, APCI (acronyme de l'anglais "Atmospheric Pressure Chemical Ionization") ou toute autre source d'ionisation utilisées en spectrométrie de masse. De la même façon, le dispositif de détection en sortie d'analyseur de masse peut être de tout type communément employé en spectrométrie de masse et notamment multiplicateurs d'électrons, photomultiplicateurs, à galettes de microcanaux. Le procédé de quantification de la présente invention consiste essentiellement à doser au moins une espèce chimique et/ou biologique d'intérêt dans au moins une solution en mettant en oeuvre les étapes suivantes : a) on produit au moins un ion moléculaire précurseur de l'espèce d'intérêt à quantifier, b) on fragmente l'ion moléculaire pour obtenir au moins un ion fragment caractéristique de l'espèce à quantifier, et c) on détecte l'ion fragment obtenu et on quantifie l'espèce d'intérêt à doser à partir du signal de détection obtenu. Alors que dans les procédés de quantification par spectrométrie de masse connus à ce jour l'étape b) de fragmentation de l'ion moléculaire est obtenue par collision à l'aide d'un gaz neutre, le procédé dé l'invention prévoit lui que cette étape de fragmentation de l'ion moléculaire soit réalisée par application d'au moins une onde électromagnétique sub millimétrique sur ledit ion moléculaire. Il convient de noter ici que l'on entend par fragmentation de l'ion moléculaire toute étape menant à un changement de rapport masse sur charge m/z de l'ion précurseur de l'espèce d'intérêt ciblée pour le dosage, que ce soit par changement de masse ou changement de charge électronique. De même, on entend dans le cadre de l'invention par onde électromagnétique sub millimétrique toute onde électromagnétique de longueur d'onde inférieure au millimètre. Toutefois, l'emploi d'ondes d'excitation dans le domaine de l'ultraviolet, du visible ou de l'infra rouge est privilégié dans le cadre de l'invention, notamment pour la simplicité d'emploi et d'intégration de ces sources dans le dispositif de fragmentation, en particulier de sources laser, en couplage avec des analyseurs de masse.

Les figures 1 et 2 représentent différentes configurations possibles et préférées de mise en oeuvre du procédé de l'invention. La figure 1 représente une première configuration de mise en oeuvre du procédé de quantification de l'invention dans un spectromètre de masse 1 de type triple quadrupôle linéaire. Le spectromètre de masse 1 comporte trois quadrupôle Q1, q2, Q3 alignés dans cette ordre, et complétés en amont du quadrupôle Q1 d'une source d'ionisation 2, de type Electrospray par exemple, alimentée en solution à doser, par une chromatographie en phase liquide par exemple et, en aval du quadrupôle Q3, d'un dispositif de détection 3. Le spectromètre de masse 1 est également couplé à une source d'excitation électromagnétique 4, par exemple un faisceau laser Ultraviolet, visible ou Infra-rouge ou toute autre source photonique de préférence. Dans l'exemple de réalisation présenté et exploité dans le cadre de l'expérimentation pratique de l'invention une source d'excitation électromagnétique 4 de type laser Hélium-Néon émettant à 543 nm a été employée. Cette source d'excitation électromagnétique 4 est destinée à assurer la fragmentation dans le quadrupôle q2 d'ions moléculaires 5 spécifiques par leur rapport masse sur charge m/z d'une espèce E chimique ou biologique à doser, ces ions moléculaires 5 ayant été produits dans le dispositif d'ionisation 2 et sélectionnés dans le quadrupôle Q1. Afin de permettre l'excitation et la fragmentation des ions moléculaires 5, une ouverture 6 est aménagée par exemple dans le quadrupôle q2 comme représenté sur la figure 1. Cette ouverture 6 est distincte de l'ouverture d'injection des ions moléculaires 5 à détecter et est obturée de façon étanche par un hublot laissant passer uniquement le faisceau laser de fragmentation émis par la source laser 4. Seuls les ions absorbant à la longueur d'onde du laser 4 sont alors fragmentés. Les ions moléculaires 5 fragmentés en ions fragments 7 caractéristiques de la molécule d'intérêt E à doser sont ensuite sélectionnés en fonction de leur rapport m/z et conservés dans le quadrupôle Q3 puis éjectés vers le dispositif de détection 3 pour déterminer le spectre de masse de la solution dosée et la quantité de l'espèce recherchée dans cette solution à partir de la quantité d'ions fragments présents dans le quadripôle Q3. Dans l'exemple de la figure 1, la source d'excitation laser 4 est représentée telle que le fasceau laser d'excitation est introduit dans le quadrupôle q2 avec une incidence normale. Toutefois, cette configuration n'est donnée qu'à titre purement représentatif et le procédé de l'invention peut être mis en oeuvre de facement totalement analogue avec un faisceau laser introduit dans le quadrupôle q2 selon une incidence nulle ou quelconque par rapport à l'axe du quadrupôle, que ce soit à partir d'une source laser 4 externe au spectromètre de masse 1 ou encore une source interne à celui-ci, notamment une source laser intégrée dans le quadrupôle q2 par exemple. Une seconde configuration de mise en oeuvre du procédé de l'invention est représentée à la figure 2. Dans cette seconde configuration, le spectromètre de masse 10 de type piège à ions quadripolaire est utilisé en combinaison avec une source d'ionisation 20 de type Electrospray par exemple et un dispositif de détection 30 analogue à ceux utilisés dans la configuration de la figure 1. Le piège à ions 10 remplace à lui seul les trois quadrupôles Q1, q2, Q3 du spectromètre de masse 1 de la figure 1 et toutes les étapes sont réalisées au sein du même piège à ions 10. Ainsi, dans un premier temps, une solution contenant des molécules d'une espèce E à doser sont injectées dans la source d'ionisation 20 par infusion grâce à une seringue et une boucle d'injection. Les molécules sont ionisées par la source d'ionisation 20 puis transférées dans le piège à ions 10. Une première sélection par masse sera réalisée en fonction des rapports masse sur charge des ions introduits dans le piège. Une valeur de m/z correspondant aux ions parents à doser est alors fixée afin d'expulser les autres ions présents en phase gazeuse dans le piège hors de celui-ci. Les ions sélectionnés sont ensuite soumis à une excitation électromagnétique afin d'être fragmentés. Une fois encore, l'excitation électromagnétique peut être une onde lumineuse laser émise par une source laser 40, par exemple de type hélium-néon, avec une longueur d'onde d'excitation de 543 nm.

Seuls les ions absorbant à cette longueur d'onde sont alors photo-fragmentés. Suite à la fragmentation, une nouvelle sélection par masse sera effectuée en fonction des rapports masse sur charge des ions fils obtenus dans le piège à ions 20. Seuls les ions fils de rapport m/z désirés resteront au sein du piège afin d'être expulser en fin d'analyse jusqu'au dispositif de détection 30. Dans les exemples décrits précédemment, mention unique d'un laser Hélium-Néon émettant à 543 nm a été faite. Toutefois, dans le procédé de l'invention n'est bien entendu pas limité à 'emploi d'une telle source d'excitation électromagnétique. Au contraire, dans le cadre de l'invention, il est avantageux de choisir la longueur d'onde d'excitation de l'onde électromagnétique, par exemple un faisceau laser, employée en fonction de la nature des espèces chimiques et/ou biologiques à quantifier. Egalement dans le cadre de l'invention, il est aussi avantageux d'utiliser simultanément plusieurs ondes électromagnétiques, par exemple plusieurs ondes laser, de longueur d'ondes différentes pour doser simultanément plusieurs molécules dans une même solution, voir diverses solutions injectées simultanément dans le spectromètre de masse 1, 10.

Par ailleurs, suivant une caractéristique particulièrement originale, le procédé de quantification de l'invention prévoit l'emploi, en combinaison avec les molécules à doser, de chromophores absorbant aux longueurs d'ondes de la ou des sources laser utilisées pour fragmenter les ions moléculaires des molécules à doser. Ces chromophores sont avantageusement greffés sur les molécules à doser. Le greffage peut être réalisé en ligne ou avant l'analyse des molécules. De façon avantageuse encore, les chromophores utilisés sont alors de préférence des chromophores photoclivables, c'est-à-dire des chromophores favorisant une fragmentation privilégiée de la molécule sur laquelle ils sont greffés, donnant lieu à un spectre de fragmentation simple et donc dont le signal est particulièrement concentré sur un faible nombre de pics. De façon avantageuse encore, ces chromophores peuvent être selectionnés pour intensifier le signal des ions moléculaires en augmentant leur rendement d'ionisation.

Ainsi, on procure une augmentation importante de la sensibilité de détection et de quantification du procédé de l'invention. L'utilisation éventuelle de tels chromophores greffés sur les molécules à doser selon le procédé de l'invention ne modifie aucunement les étapes de déroulement de celui-ci. En effet en considérant une analyse réalisée sur un spectromètre de masse de type triple quadrupôle (figure 1), comme précédemment indiqué, les molécules dérivées à doser sont injectées soit par le biais d'une chromatographie liquide soit par infusion dans la source d'ionisation 2. Une fois dans la source d'ionisation 2, les molécules sont ionisées et injectées dans le premier analyseur Q1 du spectromètre de masse 1. Une sélection des ions est réalisée en fonction de leur rapport masse-surcharge (m/z) au moyen d'un champ électrique généré par un système d'électrodes. Les ions sélectionnés seront transférés dans la cellule q2 suivante afin d'être fragmentés par photo-excitation grâce à la ou les sources laser 4 utilisées de longueur d'onde À déterminée en fonction des chromophores utilisés.

En suite de la fragmentation, les ions fils obtenus après fragmentation en q2 sont sélectionnés dans le dernier analyseur Q3 en fonction de leur rapport m/z puis détectés en sorti de spectromètre de masse 1. Lors de l'utilisation d'un seul piège à ion comme représenté à la figure 2, toutes ces étapes seront réalisées au sein même du piège à ions. Bien entendu, plusieurs sources de photons peuvent aussi être utilisés afin de fragmenter sélectivement des molécules absorbant à des longueurs d'ondes diverses. Le procédé de quantification de l'invention apparait comme étant tout particulièrement avantageux par rapport aux modes de quantification par spectrométrie de masse de type SRM réalisés avec une fragmentation des ions moléculaires d'intérêt provenant d'une dissociation induite par collision. Une différence majeure entre l'invention et les méthodes classiques SRM utilisant une fragmentation par collision est que seules les transitions provenant d'une dissociation induite par photo-excitation, et plus généralement par l'excitation électromagnétique sub millimétrique induite selon le procédé de l'invention sont détectées. Pour qu'il y ait une transition, les molécules doivent absorber à la ou les longueurs d'ondes des sources d'excitation électromagnétiques sub millimétriques utilisées, qui sont préférentiellement des sources laser. Ces transitions sont ainsi spécifiques aux molécules d'intérêts. Ces molécules absorbent de manières natives ou consécutivement à leur dérivation sélective avec des chromophores absorbant aux longueurs d'ondes souhaitées. Les molécules peuvent notamment être dérivées avec un seul ou plusieurs chromophores. Ainsi, dans le procédé de l'invention, la spécificité de l'excitation électromagnétique sub millimétrique choisie peut également être couplée à la sélectivité de la spectrométrie de masse. Cet apport engendre de grands avantages. Tout d'abord, très peu de bruit de fond est engendré par la fragmentation suite à l'excitation électromagnétique. En effet, les molécules présentent dans des matrices physiologiques telles que les plasmas, sérums ou des matrices environnementales telles que les eaux de rivières ou eaux potables n'absorbent par exemple que peu les longueurs d'ondes du visible. Ainsi, la quasi-absence de bruit de fond dans le procédé de quantification de l'invention permet de doser et quantifier les molécules d'intérêts dans de telles matrices à très basses concentrations.

Au delà de la quantification, ce procédé permet aussi de détecter des molécules présentent en infime quantité dans un milieu complexe. Ce procédé a enfin pour autre avantage d'être extrêmement souple et polyvalent ; il permet en effet l'utilisation d'un large panel de source électromagnétique sub millimétrique, notamment laser. Toute longueur d'onde susceptible d'être absorbée par une molécule cible dérivée ou non peut être adaptée à la mise en oeuvre de la présente invention. Un exemple concret de mise en oeuvre du procédé de quantification de l'invention va maintenant être décrit au regard des figures 3 à 9B pour la quantification d'une molécule de masse 722 Da synthétisée et mise en solution dans une matrice complexe telle que le plasma de rat hydrolysé par l'enzyme trypsine. L'analyse quantitative comparative de cette molécule en solution est menée en parallèle par spectrométrie de masse en tandem avec fragmentation par collision (CID) et avec une fragmentation par onde électromagnétique laser (LID) selon le procédé de l'invention. Cette expérience montre que la fragmentation par photo-excitation (LID) est une amélioration de la fragmentation par collision (CID). La configuration expérimentale est représentée à la figure 3. Le système d'analyse comporte ainsi un spectromètre de masse 100 de type triple quadrupôle 101, 102, 103, une source d'ionisation 200 de type electrospray, un dispositif de détection non représenté, et un laser 400 pour fragmenter les ions moléculaires d'intérêt. L'expérience a été réalisée sur un spectromètre de masse 100 commercial (Triple quadrupôle, AB Sciex, API 300, Toronto, Canada). Le spectromètre 100 est équipé d'une source laser 400 à diodes de longueur d'onde À = 532 nm de puissance 300 mW. Les ions issus de la source electrospray 200 sont guidés dans le quadrupôle 101 puis dans le second quadrupôle 102 où ils sont excités par le laser 400. T est défini comme le temps d'excitation des ions par le laser 400. De plus, un hublot d'entrée 500 du faisceau laser est formé par une fenêtre de quartz logée dans une ouverture placée axialement à l'arrière du quadrupôle 3 du spectromètre de masse 100. Ce dispositif est couplé à une chromatographie liquide (PerkinElmer Series 200) et une colonne apolaire (2,1 x 100 mm Waters Symmetry C18 3,5 pm) non représentées sur les figures et situées en amont du spectromètre de masse 100.

Une gamme de solutions a été réalisée. La molécule choisie pour l'expérience est représentée à la figure 4. Cette molécule a été synthétisée par l'Ecole Normale Supérieure de Lyon. Cette molécule possède une masse de 722 Da. Cette molécule sera introduite à différentes concentrations dans un plasma de rat hydrolysé. Son ion fragment majoritaire, avec adduit de sodium, et de masse m/z= 583 Da est quant à lui représenté à la figure 5. Une solution mère de concentration 750 000 ng.mL-1 en molécule d'intérêt dans une solution d'eau pure avec 0.5% d'acide formique. Une solution fille diluée cinquante fois dans du plasma de rat hydrolisé est réalisée (S50, CS50 = 15 000 ng.mL-1). Cette solution est diluée par deux dans du plasma hydrolysé afin d'obtenir une solution S100. Le schéma est répété jusqu'à obtenir une gamme de solutions avec les concentrations suivantes : S50, S100, S500, S1000, S2000 et S5000. Une solution SO est réalisée avec seulement du plasma de rat hydrolysé, cette solution sera le blanc.

La molécule d'intérêt possède une masse de 722 Da. Lors de son ionisation, un ion majoritaire de valeur m/z = 745 [M+Na]+ est observé en mode positif. Lors de la fragmentation de cette molécule un ion majoritaire à m/z = 583 [M+Na]+ représenté sur la figure 5, est obtenu. Ainsi, le couple ion parent 745/ion fils 583 forme la transition SRM 30 suivie lors des analyses comparatives menées. Les différentes solutions préparées sont analysées grâce au dispositif expérimental présenté figure 3. Les éluants utilisés sont A (H2O + 0,5% Acide formique) et B (Acétonitrile + 0,5 % Acide formique). Le débit d'injection est de 300 pL.min-l. La quantité injectée de solution est de 50 pL, cela correspond à 2,6 pL de plasma de rat initial. Le gradient de la phase mobile commence par un plateau de 2 minutes à 95% de A suivi d'un gradient linéaire de 95% à 60% de A durant 2 minutes (2 à 4 min). Ce gradient est suivi d'un lavage à 0% de A, 100% de B durant 7 minutes (4 à 11 minutes). Enfin, la colonne est rééquilibrée durant 4 minutes à 95% de A et 5% de B. Le spectromètre de masse 100 est utilisé en mode SRM en ionisation positive afin de suivre la transition 745/583 avec un temps de balayage (dwell time) de 300 ms par transition. La résolution du premier quadripole 101 a été ouverte afin de laisser passer tous les ions précurseurs ayant des valeurs m/z égales à 745±3 au travers du premier quadripole 101. Il convient de noter que le spectromètre de masse 100 de la Figure 3 a été utilisé pour réaliser les analyses comparatives présentées ci-après aussi bien selon la technique connue mettant en oeuvre une fragmentation par collision dite CID que la technique de spectrométrie de l'invention, avec une fragmentation par onde électromagnétique laser dite LID. Ainsi, l'énergie de collision pour les analyses avec fragmentation par CID sera de 35 eV. Pour les analyses avec fragmentation LID conformément au procédé de l'invention, la longueur d'onde appliquée est a,=532 nm et la puissance laser mesurée en entrée du spectromètre de masse est de 274 mW. Sept solutions de concentrations différentes (0, 150, 375, 750, 1 500, 7 500 et 15 000 ng.mL-1) ont été analysées afin de comparer les deux méthodes de fragmentations. Seuls les chromatogrammes des solutions CS100=7500 ng.ml-1, CS500 = 1 500 ng.mL-1 et CSO = 0 ng.mL-1 qui permettent une bonne comparaison des deux techniques de fragmentation employées dans l'expérience menée sont présentés ci-après et sur les figures 6A à 8B. Les figures 6A et 6B représentent le chromatogramme obtenu lors de l'analyse du blanc (concentration CSO) dans une configuration de spectromètre de masse 100 avec fragmentation par collision CID (figure 6A) et dans une configuration de spectromètre de masse 100 avec fragmentation électromagnétique par laser LID (figure 6B). On constate sur la figure 6A que dans l'analyse avec fragmentation CID, on obtient sur le chromatogramme de nombreux pics interférents, correspondant à des molécules endogènes du plasma, à un temps de rétention proche de part et d'autres de l'abscisse 5 min alors que sur la figure 6B de l'analyse avec fragmentation LID conforme à la présente invention on n'obtient aucun pic. On peut donc en conclure de façon directe que l'analyse avec fragmentation électromagnétique LID selon l'invention est plus spécifique que l'analyse avec fragmentation par collision CID connue. En effet, lorsque l'on analyse une solution de concentration nulle en molécule à doser on obtient des ions fragments de molécules présentes dans la solution qui sont détectés et identifiés par leur pics sur le chromatogramme obtenu (figure 6A). Ces ions fragments obtenus par la fragmentation CID confèrent du bruit à la mesure quantitative, bruit représenté par les pics du chromatogramme à la figure 6A, et absent de la figure 6B. La fragmentation par onde laser LID de longueur spécifique choisie comme étant la longueur d'onde d'absorption de la transition SRM recherchée ne produit aucun fragment détecté lors de l'analyse de la solution de concentration nulle en espèce recherchée. Cette première constatation est confortée par l'analyse SRM de la transition 745/583 étudiée suivant le même protocole de la solution de concentration CS100=7500 ng.ml-1 avec fragmentation CID et LID. Les chromatogrammes obtenus pour ces deux analyses sont représentés aux figures 7A et 7B respectivement. On constate alors que l'analyse menée avec une fragmentation CID par collision donne lieu à un chromatogramme identique à celui de la figure 6A auquel s'ajoute un pic, identifié sur la figure par une flèche au temps de rétention attendu pour la molécule recherchée (Tr=6,47 min). On a donc le pic correspondant à la molécule recherchée plus du bruit lié aux fragments d'autres molécules.

Sur le chromatogramme de la figure 7B correspondant à l'analyse de la même transition SRM 745/583 avec fragmentation par LID conformément au procédé de l'invention, on obtient un seul pic correspondant à l'espèce recherchée à Tr=6,47 min et pas de bruit. Par ailleurs, on peut noter que l'intensité des pics selon les deux techniques d'analyses est sensiblement identique et donc que l'analyse avec fragmentation LID est non seulement plus spécifique que l'analyse avec fragmentation CID mais également au moins aussi sensible. De plus, le dosage de la molécule recherchée, qui se fait par intégration de la surface du pic correspondant sur le chromatogramme est nécessairement plus précis par l'analyse avec fragmentation LID que par l'analyse avec fragmentation CID dans la mesure où l'absence de bruit permet d'intégrer exactement la surface du pic correspondant à l'espèce recherchée sans perturbation liée au bruit. Les figures 8A et 8B représentent les chromatogrammes obtenus lors de l'analyse de la transition SRM 745/583 de la molécule recherchée par spectrométrie de masse avec fragmentation CID d'une part et avec fragmentation LID selon l'invention d'autre part pour la solution CS500=1500ng.ml-1. Ces chromatogrammes mettent en exergue un autre avantage du procédé de l'invention qui est, outre sa meilleure spécificité, sa meilleure sensibilité par rapport aux techniques de dosage avec fragmentation par collision. En effet, la spectrométrie de masse avec fragmentation par onde électromagnétique sub millimétrique proposée par l'invention permet d'abaisser les seuils de détection et de quantification. Ainsi sur la figure 8A correspondant à l'analyse menée avec fragmentation CID par collision, on peut constater que le pic correspondant à la molécule d'intérêt recherchée, identifié par une flèche, est noyé dans le bruit de fond de la mesure induit par les interférences et est d'une intensité inférieure à la limite de détection classiquement définie par un rapport signal sur bruit au moins égal à 3.

Par opposition, sur la figure 8B correspondant à l'analyse avec fragmentation induite par laser LID conforme à l'invention, on obtient bien un seul pic identifiable correspondant à la molécule recherché, élué au temps de retention Tr=6,47 min attendu. Ce pic est seul sur le chromatogramme et présente une intensité correspondant à la limite de quantification, soit un rapport signal sur bruit au moins égal à 10. On peut donc doser effectivement la molécule recherché à partir de cette analyse avec fragmentation LID par laser, ce qui est impossible par l'analyse avec fragmentation CID par collision. Le procédé de quantification par spectrométrie de masse selon l'invention, qui prévoit une fragmentation par onde électromagnétique sub millimétrique, permet donc d'abaisser les seuils de détection et de quantification par rapports aux techniques de spectrométrie de masse mettant en oeuvre une fragmentation par collision. Une fois toutes les solutions analysées, une droite d'étalonnage a été réalisée suite à l'intégration du chromatogramme sur la période 6.42-6.52 min.

La figure 9A présente la droite d'étalonnage obtenue suite à la fragmentation par CID lors du suivie de la transition 745/583. Le coefficient directeur obtenu pour la droite passant par les quatre points correspondant au domaine linéaire (15 000, 7 500, 1 500 et 750 ng.mL-1) est égal à 0.999. La figure 9B présente la droite d'étalonnage obtenue suite à la fragmentation par LID conforme au procédé de l'invention lors du suivi de la transition 745/583. Le coefficient directeur obtenu pour la droite passant par les tous les points de la gamme est égal à 0.999. Toutefois, si l'on observe les zooms de ces deux courbes sur les faibles concentrations, on constate une bien meilleure linéarité des points pour la droite correspondant à la fragmentation LID que pour la droite correspondant à la fragmentation CID. Cette meilleure linéarité aux faibles concentrations met en évidence la possibilité de doser à plus faible concentration un composé dans une matrice complexe par le procédé de quantification proposé par l'invention que par les procédés classiques mettant en oeuvre une fragmentation par collision CID.

En effet, en analyse par fragmentation CID, il y a des interférents au même temps de rétention que la molécule d'intérêt. La limite de quantification et de détection sera alors plus élevée que pour l'analyse par fragmentation LID où, n'ayant que très peu de bruit de fond, aura des limites de quantification et détection bien plus faibles. Les points pour les faibles concentrations (375, 150 ng.mL-1) sur la courbe de la figure 9A ne font plus parti du domaine linéaire contrairement aux mêmes points sur la courbe de la figure 9B. Il est ainsi démontré que le procédé de la présente invention permet une meilleure sensibilité de détection que les procédés connus de quantification par spectrométrie de masse, et permet donc une quantification d'espèces même à très faibles concentrations.

Claims (10)

1. REVENDICATIONS1. Procédé de quantification par spectrométrie de masse d'au moins une espèce chimique et/ou biologique d'intérêt en solution, dans lequel : a) on produit au moins un ion moléculaire précurseur de l'espèce d'intérêt à quantifier, et b) on fragmente l'ion moléculaire pour obtenir au moins un ion fragment caractéristique de l'espèce à quantifier, c) on détecte au moins un ion fragment et on quantifie l'espèce d'intérêt à doser à partir du signal de détection obtenu, caractérisé en ce que la fragmentation de l'ion moléculaire à l'étape b) est obtenue par application d'au moins une onde électromagnétique sub millimétrique à l'ion moléculaire.
2. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on choisit au moins une longueur d'onde électromagnétique sub millimétrique en fonction de l'espèce à quantifier.
3. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'on modifie les propriétés optiques d'absorption de l'espèce à quantifier par greffage ou complexation non covalente d'un chromophore absorbant à la longueur d'onde de l'onde électromagnétique sub millimétrique.
4. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le chromophore greffé est un chromophore photoclivable.
5. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'onde électromagnétique sub millimétrique de fragmentation est une onde d'excitation choisie parmi les gammes d'ondes infrarouge, visible, ou ultra- violet.
6. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'on applique plusieurs ondes lumineuses de longueurs d'ondes différentes pour fragmenter au moins un dit ion moléculaire d'au moins une espèce à quantifier.
7. 7. Procédé selon l'une des revendications 3 à 6, caractérisé en ce que plusieurs chromophores de masse et/ou de longueur d'onde d'absorption différentes sont greffés ou compléxés sur au moins une dite espèce à quantifier dans un même échantillon ou dans plusieurs échantillons simultanément.
8. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il est mis en oeuvre dans un spectromètre de masse permettant une analyse de type SRM avec une source de fragmentation optique.
9. 9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il 10 comporte une étape alternative b') de fragmentation par activation collisionnelle.
10. 10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'il est mis en oeuvre dans un spectromètre de masse de type triple quadrupôle ou possédant au moins un piège ionique, la fragmentation d'au moins un ion 15 moléculaire étant produite dans un des quadrupôles ou ledit piège ionique.