FR2965278A1 - Procede d'obtention in vitro ou ex vivo de chondrocytes et leurs utilisations - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne un procédé d'obtention de chondrocytes in vitro ou ex vivo et l'utilisation de ces chondrocytes pour le traitement des pertes de substance chondrale liée ou non à un choc traumatique, des maladies ostéo-articulaires , et en particulier les maladies qui sont caractérisées par une destruction ou une dégénérescence du cartilage, comme l'arthrose.
Description
La présente invention concerne le domaine de l'ingénierie cellulaire et tissulaire du cartilage, et en particulier la culture de chondrocytes ou de chondrocytes obtenus à partir de cellules souches mésenchymateuses in vitro ou ex vivo, notamment en vue d'une thérapie cellulaire.
Plus précisément, l'invention concerne un procédé d'obtention de chondrocytes in vitro ou ex vivo et l'utilisation de ces chondrocytes pour le traitement des pertes de substance chondrale liée ou non à un choc traumatique et des maladies ostéo-articulaires, en particulier les maladies qui sont caractérisées par une destruction ou une dégénérescence du cartilage, comme l'arthrose.
L'incidence importante des pathologies caractérisées par une destruction ou une dégénérescence du cartilage est au moins en partie due au fait que ce tissu a un potentiel de réparation spontané très limité. Actuellement, les traitements médicamenteux des dégénérescences du cartilage ne sont que palliatifs et n'empêchent pas l'évolution de la destruction. Dans les stades ultimes, la mise en place de prothèse est incontournable. La transplantation de chondrocytes autologues (TCA), initiée par Brittberg en 1994 pour le traitement de lésions du cartilage articulaire du genou, consiste à isoler par extraction enzymatique les chondrocytes à partir d'un prélèvement de petite taille et de faible morbidité. Cette approche thérapeutique, mondialement utilisée, implique une amplification cellulaire en culture sur plastique. Cette technique est actuellement indiquée pour le traitement de lésions limitées de cartilage. Pour combler des lésions plus importantes et en vue d'appliquer la technique aux lésions arthrosiques débutantes, la technologie s'oriente vers la combinaison de chondrocytes autologues avec des biomatériaux pour la transplantation, comme des gels de collagène. Cependant, l'amplification des chondrocytes en culture monocouche en vue d'une greffe directe ou après combinaison avec un biomatériau s'accompagne d'une dédifférenciation cellulaire, ce qui se traduit, in vivo, par la formation d'un fibrocartilage non-fonctionnel. L'implantation de chondrocytes autologues est donc une technique qui reste perfectible au niveau du contrôle de l'expression du phénotype des chondrocytes, soit lors de leur amplification en culture, soit au sein d'un biomatériau. Elle ne permet pas de reproduire un cartilage hyalin fonctionnel, riche en collagène de type II. Le tissu synthétisé est un fibrocartilage, riche en collagène de type I, ne possédant pas les mêmes propriétés biomécaniques que peut conférer un cartilage sain riche en collagène de type II, ce qui oblige à renouveler l'intervention à terme car ce fibrocartilage de substitution sera dégradé à son tour. Ainsi, les besoins thérapeutiques pour le traitement de ces affections ne sont pas satisfaits, notamment parce qu'il n'existe à l'heure actuelle aucun traitement permettant de restaurer le phénotype chondrocytaire. C'est dans ce contexte que la présente invention se propose de fournir un procédé d'obtention de chondrocytes différenciés in vitro ou ex-vivo capables de synthétiser du cartilage de type hyalin fonctionnel et ainsi conférer les propriétés biomécaniques améliorées de ce type de cartilage par rapport au fibrocartilage.
La présente invention a donc pour objet un procédé d'obtention in vitro ou ex vivo de chondrocytes caractérisé en ce qu'il comprend, voire consiste en, les étapes suivantes: - mettre en culture des chondrocytes dédifférenciés ou différenciés ou des cellules souches mésenchymateuses, à l'exception de cellules souches 15 embryonnaires et de cellules germinales humaines - cultiver ces cellules dans des conditions de faible tension en oxygène, en présence de BMP-2 (« Bone Morphogenetic Protein-2 ») et d'inhibiteur(s) spécifique(s) du collagène de type I. Dans le cadre de l'invention, les inventeurs ont démontré que les conditions 20 de culture mises en oeuvre dans le procédé tel que décrit ci-dessus permettent de promouvoir un phénotype chondrocytaire stable et le plus différencié possible, et notamment caractérisé par un index de différenciation accru. En particulier, la combinaison des conditions de culture en faible tension d'oxygène, en présence de BMP-2 et d'inhibiteur du collagène de type I favorise l'augmentation des marqueurs 25 spécifiques du cartilage (collagène de type II et agrécanne notamment). Les conditions de mise en oeuvre du procédé selon l'invention permettent de limiter le phénomène de dédifférenciation cellulaire inhérent à la culture cellulaire des chondrocytes in vitro ou ex vivo, et de maintenir et/ou d'induire un phénotype chondrocytaire stable. Le procédé selon l'invention permet donc d'obtenir in vitra 30 des chondrocytes matures différenciés qui présentent les caractéristiques de cellules issues d'un cartilage de type hyalin sain et fonctionnel. Dans le cadre de ce procédé, on peut utiliser des chondrocytes différenciés ou dédifférenciés ou des cellules souches mésenchymateuses qui sont par définition indifférenciées. De préférence, les cellules qui sont mises en culture dans le procédé 35 selon l'invention sont des chondrocytes différenciés ou dédifférenciés. Les chondrocytes ou les cellules souches mésenchymateuses peuvent être obtenus par toute méthode connue de l'homme du métier permettant de récupérer ces cellules à partir de tout échantillon biologique susceptible de les contenir. Les cellules souches mésenchymateuses utilisées peuvent provenir de sources variées, comme par exemple de moelle osseuse, de tissu adipeux, de sang de cordon ombilical, d'origine musculaire, de lignée germinale non-humaine embryonnaires, à l'exception des cellules souches embryonnaires humaines, etc. Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, les cellules utilisées sont choisies parmi les cellules souches de moelle osseuse, les cellules souches pluripotentes induites (iPS) et les progéniteurs non-hématopoïétiques du sang de cordon. Les cellules qui sont mises én culture, c'est-à-dire les chondrocytes différenciés ou dédifférenciés ou les cellules souches mésenchymateuses, peuvent être d'origine animale, et de préférence humaine ou équine.
Les chondrocytes différenciés utilisés dans le cadre du procédé de l'invention sont de préférence issus de sujets sains, mais il est également possible d'utiliser des chondrocytes dédifférenciés, et notamment issus de malades, en particulier de malades souffrant de maladie ostéo-articulaire, en particulier caractérisée par une destruction ou une dégénérescence du cartilage. Selon un mode de réalisation particulier, les chondrocytes dédifférenciés utilisés sont issus du patient destiné à recevoir les chondrocytes qui seront obtenus par la mise en oeuvre du procédé de l'invention (greffe autologue). Il est également possible de pratiquer une greffe autologue en utilisation des cellules souches mésenchymateuses pour obtenir des chondrocytes selon l'invention qui seront implantés chez un patient malade, et en particulier souffrant de pertes de substance chondrale liée ou non à un choc traumatique ou atteint de maladie ostéo-articulaire, en particulier caractérisée par une destruction ou une dégénérescence du cartilage, comme l'arthrose. Dans le cadre du procédé selon l'invention, il est également possible 30 d'utiliser des co-cultures de chondrocytes différenciés et/ou dédifférenciés et/ou de cellules souches mésenchymateuses. Selon la présente invention, les chondrocytes différenciés ou dédifférenciés ou les cellules souches mésenchymateuses sont cultivés dans des conditions de faible tension en oxygène, c'est-à-dire en condition d'hypoxie. De préférence, on utilise des conditions de culture inférieures ou égales à Io% d'Oz, de préférence comprise dans une gamme allant de 1 à 10 %, et en particulier de 1 à 5 % d'Oz. Les cellules utilisées dans le procédé de l'invention sont cultivées dans un milieu de culture classique, par exemple DMEM, adapté au type cellulaire choisi, à savoir chondrocytes différenciés ou dédifférenciés ou cellules souches mésenchymateuses. Les chondrocytes différenciés ou dédifférenciés ou les cellules souches mésenchymateuses utilisées dans le procédé de l'invention peuvent être cultivés sous forme de culture monocouche ou bien de préférence au sein d'un biomatériau.
Par « biomatériau », on entend toute structure tridimensionnelle colonisable par des cellules, en particulier par des chondrocytes, et de préférence susceptible de pouvoir être implantée in vivo. Ainsi, le biomatériau utilisé dans le cadre de (invention est biologiquement inactif et de préférence biodégradable. Parmi les exemples de biomatériau qui peuvent être utilisés, on peut notamment mentionner des gels de collagènes, des éponges de collagène de type I ou de type II, des gels d'alginate, des polyéthylèneimines, etc. Selon la présente invention, la culture des chondrocytes différenciés ou dédifférenciés ou des cellules souches mésenchymateuses est réalisée en présence de BMP-2. Pour ce faire, il est possible d'ajouter directement de la BMP-2 dans le milieu de culture ou bien d'utiliser des moyens permettant de maintenir sa présence dans le milieu de culture, par exemple en stimulant sa production ou en empêchant sa dégradation. Par conséquent, on peut ajouter directement dans le milieu de culture une BMP-2 recombinante, et de préférence de la même espèce que les cellules utilisées, c'est-à-dire une BMP-2 humaine dans des cellules humaines, une BMP-2 équine dans des cellules équines, etc. Selon un mode de réalisation de l'invention particulièrement préféré, on utilise tout moyen permettant de maintenir la présence de BMP-2 dans le milieu de culture, directement ou indirectement, et notamment en stimulant sa production ou en empêchant sa dégradation. Par exemple, la présence de BMP-2 peut être obtenue par tout moyen permettant d'empêcher la présence ou d'inactiver l'action de toute molécule capable de dégrader ou d'inactiver la BMP-2, telle que des protéases et en particulier la protéase HTRA1 (High Temperature Requirement Protein 1) ou les membres de la famille HTRA1. En particulier, la présence de BMP-2 peut être maintenue en utilisant un siRNA HTRA1 afin d'empêcher la dégradation de BMP-2.
Lorsque la présence de BMP-2 est obtenue par ajout direct de cette protéine dans le milieu de culture, celles-ci est ajoutée en une concentration finale comprise dans une gamme allant de 10 à 200 ng/mi, et de préférence de l'ordre de 50 ng/ml.
La portée de la présente invention n'est pas limitée à la BMP-2 en particulier. L'effet de la présence de BMP-2 lors de la culture des chondrocytes ou des cellules souches mésenchymateuses selon l'invention peut également être obtenu par la présence de toute autre molécule, ou cytokine en particulier, susceptible d'avoir les mêmes effets ou des effets similaires à ceux induits par BMP- 2 sur la différenciation chondrocytaire. En particulier, la présence de BPM-2 dans le cadre de l'invention peut être obtenue par tout autre membre de la famille BMP capables d'induire les mêmes effets ou des effets similaires à ceux induits par BMP-2 sur la différenciation chondrocytaire. D'autres cytokines peuvent éventuellement être ajoutées au milieu de culture, seules ou en mélange. Par exemple, le milieu de culture peut également contenir du TGFI31 par exemple à une concentration finale comprise dans une gamme allant de 1 à 50 ng/ml, et de préférence de l'ordre de 10 ng/ml, du TGF03 par exemple à une concentration finale comprise dans une gamme allant de 1 à 50 ng/ml, et de préférence de l'ordre de 10 ng/ml, de MF-1 par exemple à une concentration finale comprise dans une gamme allant de 1 à 50 ng/ml, et de préférence de l'ordre de 10 ng/ml, de l'estradiol par exemple à une concentration finale comprise dans une gamme allant de 0,5 à 5 nM, et de préférence de l'ordre de 1 nM. Différentes combinaisons de ces cytokines peuvent ainsi être utilisées lorsque le procédé de l'invention est mis en oeuvre à partir de chondrocytes différenciés et/ou dédifférenciés et/ou de cellules souches mésenchymateuses. Selon la présente invention, la culture des chondrocytes différenciés ou dédifférenciés ou des cellules souches mésenchymateuses est également réalisée en présence d'inhibiteur(s) spécifique(s) du collagène de type I.
Par « inhibiteur(s) spécifique(s) du collagène de type I », on entend toute(s) molécule(s) capable(s) d'empêcher la présence ou d'inhiber l'activité, directement ou indirectement, du collagène de type I de manière spécifique. En particulier, une telle molécule n'affectera pas de manière significative la présence et/ou l'activité d'autres facteurs et notamment des facteurs indispensables à la différenciation chondrocytaire, tels que le collagène de type Il notamment. Cette inhibition spécifique du collagène de type I peut être réalisée à tous les niveaux : gène, messager, protéine etc. S'agissant d'inhibiteurs du collagène de type I au niveau du messager, on peut utiliser des agents d'interférence par l'ARN tels que des siRNA, et ceci constitue un mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention. Il est également possible d'utiliser des inhibiteurs qui ciblent des facteurs de transcription qui modulent l'expression des gènes codant le collagène de type I, et éventuellement qui modulent à la fois l'expression des gènes codant le collagène de type I et II. En particulier, des inhibiteurs modulant de manière différentielle l'expression de ces gènes peuvent être utilisés, comme par exemple les facteurs c- Krox « collagen-Krox» et Sp3 « Specr c prote/n-3» qui sont des activateurs de l'expression du gène codant le collagène de type I et des inhibiteurs de l'expression du gène codant le collagène de type II. Il est également possible de cibler la sous-unité p65 du facteur NF-kappaB « Nuclear Factor-kappe» qui inhibe la transcription du gène du collagène de type II.
La présence de BMP-2 et l'inhibition du collagène de type I peuvent être obtenues à l'aide de toute technique connue de l'homme du métier. En particulier, toute méthode permettant l'introduction active ou passive de molécule(s) capable(s) de produire ces effets. Pour une action au niveau intracellulaire, toute méthode d'introduction des molécules nécessaires à l'obtention de ces effets peut être utilisée. De préférence, on utilise une méthode d'introduction active de ces molécules, notamment par transfection dans les cellules. Pour cela, on peut utiliser tout agent transfectant, et notamment des liposomes, des polyéthylèneimines, des cations polymériques, etc. Il est également possible d'utiliser une méthode d'introduction passive de ces molécules, notamment par diffusion ou par endocytose naturelle des molécules permettant de conduire les effets désirés cités ci-dessus. Selon un mode de réalisation particulièrement préféré de l'invention, on utilise une stratégie d'interférence par l'ARN, et en particulier des siRNA, pour obtenir à la fois la présence de BMP-2 et l'inhibition du collagène de type I dans le milieu de culture pour obtenir des chondrocytes selon l'invention.
De préférence, et en particulier dans le cas d'utilisation médicale ultérieure des chondrocytes obtenus selon le procédé de l'invention, les moyens utilisés pour maintenir la présence de BMP-2 dans le milieu de culture et pour inhiber le collagène de type I sont choisis de façon à induire ces effets de manière transitoire, en particulier sans impliquer la transformation stable du génome des chondrocytes, afin de pouvoir éliminer toute trace de ces moyens utilisés lors de la culture in vitro ou ex vivo avant l'implantation des chondrocytes au sein de l'organisme receveur, et notamment de l'articulation pathologique. De préférence, les différentes étapes du procédé selon l'invention sont réalisées dans l'ordre suivant : taux d'oxygène, présence de BMP-2 puis inhibition du collagène de type I. Dans le cas où les cellules sont cultivées au sein d'un biomatériau, la colonisation dudit biomatériau est de préférence réalisée en premier lieu, avant la réalisation des trois étapes mentionnées ci-dessus. Cependant, l'ordre de réalisation des étapes du procédé de l'invention peut être quelconque et n'est pas limitant.
Selon un autre de ses aspects, l'invention a également pour objet des chondrocytes susceptibles d'être obtenus par la mise en oeuvre du procédé selon l'invention qui est décrit ci-dessus et qui présentent un index de différenciation, c'est-à-dire un rapport protéique collagène de type II / collagène de type I au moins supérieur à 1.
Ces chondrocytes peuvent être présents au sein d'un biomatériau et l'ensemble biomatériau/chondrocytes constitue également un autre objet de la présente invention. De préférence, les chondrocytes susceptibles d'être obtenus selon l'invention sont caractérisés par le fait qu'ils ne présentent pas ou peu d'expression du collagène de type I et/ou ne le produisent pas ou peu au niveau protéique mais expriment et synthétisent de manière significative préférentiellement le collagène de type Il et l'agrécanne. Selon un autre de ses aspects, l'invention a également pour objet les chondrocytes susceptibles d'être obtenus selon le procédé de l'invention décrit ci- dessus pour leur utilisation en tant que médicament. Selon encore un autre de ses aspects, l'invention a aussi pour objet les chondrocytes susceptibles d'être obtenus selon le procédé de l'invention décrit ci-dessus pour leur utilisation dans le traitement des pertes de substance chondrale liée ou non à un choc traumatique, des maladies ostéo-articulaires, et en particulier les maladies qui sont caractérisées par une destruction ou une dégénérescence du cartilage, comme l'arthrose. Cet aspect de l'invention peut également être défini comme l'utilisation des chondrocytes susceptibles d'être obtenus selon le procédé de l'invention, pour la préparation d'un médicament destiné à traiter les pertes de substance chondrale liée ou non à un choc traumatique, les maladies ostéo-articulaires, et en particulier les maladies qui présentent une destruction ou une dégénérescence du cartilage, telles que l'arthrose par exemple. Dans le cadre de l'invention, les chondrocytes susceptibles d'être obtenus selon le procédé de l'invention peuvent être utiles pour ou bien utilisés pour la préparation d'un médicament destiné à traiter et/ou prévenir et/ou ralentir les pertes de substance chondrale liée ou non à un choc traumatique, ainsi que la destruction ou la dégénérescence du cartilage associée(s) aux maladies ostéoarticulaires, telles que l'arthrose par exemple et. Dans le cadre de ces applications médicales, l'administration des chondrocytes obtenus selon le procédé de l'invention peuvent être administrés directement au sein des lésions lorsqu'ils ont été obtenus par culture monocouche. Les chondrocytes qui sont obtenus au sein d'un biomatériau par le procédé selon Invention peuvent être implantés au niveau des lésions à traiter. Selon un mode de réalisation préféré, les chondrocytes implantés se présentent sous la forme d'un substitut biologique constitué de chondrocytes matures différenciés au sein d'un biomatériau selon le procédé de l'invention. Celui-ci pourra être positionné au niveau de la lésion et éventuellement maintenu en place in situ, par exemple à l'aide de colle biologique, notamment de toile à base de fibrine. D'une manière générale, tous les modes de réalisation préférés qui sont mentionnés pour le procédé d'obtention des chondrocytes s'appliquent mutatis mutandis pour les chondmcytes susceptibles d'être obtenus par ce procédé et pour toute composition ou médicament les contenants et leurs utilisations. D'autres aspects et avantages de l'invention seront mieux compris au vu des exemples ci-après qui permettent d'illustrer l'invention, mais n'ont aucun caractère limitatif. Ces exemples se réfèrent aux figures annexées : La figure 1 représente l'effet des siRNA COLLAI sur la quantité des messagers du collagène de type I ou COL1A1 (A), du collagène de type II ou COL2A1 (B) et sur le rapport des messagers des gènes COL2AI/COLIAI (C), mesurée par RT-PCR quantitative.
La figure 2 représente l'effet des siRNA COLLAI sur les taux protéiques du collagène de type I et de type II mesurés par « Western Blot ». La figure 3 représente (A) la quantification des taux protéiques du collagène de type I par ELISA (n=4), (B) la quantification des taux protéiques du collagène de type II par ELISA (n=4 à 24h et n=3 à 48h) et (C) le ratio protéique du collagène de type II/ type I par ELISA (n=4 à 24h et n=3 à 48h).
EXEMPLES MÉTHODOLOGIE : SiRNAs : siRNA COLLAI (collagène de type I, alpha 1)(brins sens et antisens), 5 Hs COL1A1_6 HP Validated SiRNA (SIO2757363), Qiagen. Sens : 51- CAAUCACCUGCGUACAGAA - 3' (SEQ ID NO : 1) Anti-sens : 5'- UUCUGUACGCAGGUGAUUG - (SEQ ID NO : 2) Séquence cible : ACC AAT CAC CTG CGT ACA GAA siRNA contrôle ou « Contrôle négatif » (siRNA double brin), Qiagen (n° 10 1022076) Sens : 5'- UUCUCCGAACGUGUCACGU - 3' (SEQ ID NO : 3) Anti-sens : 51- ACGUGACACGUUCGGAGAA - 3' (SEQ ID NO : 4) Séquence cible : 5'-AAT TCT CCG AAC GTG TCA CGT-3' rhBMP-2 : "recombinant human Bone Morphogenetic Protein-2" 15 L'ADNc codant la BMP-2 humaine (R&D Systems) est exprimé dans des cellules CHO (« Chinese Hamster Ovary cells »). Après clivage protéolytique du peptide signal et du propeptide, la BMP-2 recombinante mâture forme un homodimère, chaque monomère étant chacun constitué de 114 acides aminés. La BMP-2 a été ajoutée au milieu de culture à une concentration finale de 50 ng/ml. 20 Éponges de collagènes de type 1 (SYMATESE Biomatériaux, Chaponost, France): Elles sont caractérisées par un diamètre de 5 mm et une épaisseur de 2 mm. Elles présentent une structure tridimensionnelle adéquate à la culture 3D. Les réseaux de fibres de collagène I forment des pores dont le diamètre moyen est de 150 pm. Ce biomatériau est d'origine bovine, et avec ses fibres de collagène I réticulées, il est 25 biologiquement inactif et biodégradable. Culture cellulaire : Les chondrocytes articulaires humains (CAH) ont été prélevés sur des têtes fémorales lors de la mise en place d'une prothèse chez de patients atteints d'arthrose. Le cartilage a été disséqué en copeaux, puis ces derniers ont été digérés par deux enzymes, la pronase (Sigma-Aldrich, 2 mg/ml, 45 minutes) et la 30 collagénase (Sigma-Aldrich, 2 mg/mi, 15 heures). Le lendemain, les copeaux de cartilage non digérés ont été éliminés par passage de la suspension cellulaire sur filtre nylon de 70 pm. Après centrifugation, le culot cellulaire a été repris dans du DMEM (« Dulbecco% modified Eagle Medium, Fisher Bioblock Scientific »). Le nombre de cellules a été déterminé par comptage sur une cellule de Malassez. Les CAH ont ensuite été ensemencés dans des boîtes de culture à raison de 4.104 cellules / cm2 et cultivés à 37°C, dans un environnement à 5% de CO2. Les chondrocytes ont ainsi été amplifiés en culture monocouche. Nucléofection: Les siRNA (siRNA contrôle ou siRNA COL1A1) ont été incorporés dans les chondrocytes en employant la technique de nucléofection (Nucleofector' II, Lonza). Tout d'abord, les cellules ont été amplifiées en culture monocouche et n'ont subi qu'un seul passage afin de limiter leur dédifférenciation. Une fois à confluence, celles-ci ont été décollées par un mélange trypsine-EDTA (0,25% trypsine/1 mM EDTA, Fisher Bioblock Scientific). La transfection a été réalisée à partir de 2 millions de cellules à l'aide d'une solution de nucléofection contenant un microgramme de siRNA. Une fois transfectés, les chondrocytes sont restés une heure à 37°C dans du milieu DMEM («Dulbecco's modified Eagle Medium», Fisher Bioblock Scientific) supplémenté par 20% de SVF, (Fisher Bioblock Scientific). Après centrifugation, ils ont été ensemencés à raison de 500 000 cellules par éponge de collagène et mis à sécher pendant une heure pour permettre l'adhérence à l'éponge de collagène. Pour finir, les chondrocytes ont été placés en hypoxie, en présence ou non de 50 ng/ml de rhBMP-2 pendant une période de 24 à 48h. L'inhibition de la synthèse du collagène de type I a été suivie au niveau des ARN messagers et au niveau protéique à l'aide d'expériences de « Western-blot », d'ELISA (« Enzyme-linked immunosorbent assay ») ainsi que de RT-PCR (« Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction ») en temps réel. « Western-blot » : Les cellules ensemencées dans les éponges de collagène de type I ont été rincées au PBS 1X (« Phosphate Buffered Saline », Fisher Bioblock Scientific) et lysées à raison de 100 pl de tampon RIPA (« Radioimmunoprecipitation assay buffer ») par éponge, puis ont ensuite été agitées (vortex) toutes les 10 minutes pendant une heure. L'extraction protéique s'est poursuivie en retirant chaque éponge et en les pressant une à une afin de récupérer le maximum de protéines. Le surnageant contenant les extraits cytoplasmiques a enfin été prélevé après une centrifugation de 30 minutes à 14000 g. La concentration en protéines de nos échantillons a été déterminée par la méthode de Bradford. 20 pg de chaque échantillon a été mis en contact avec un tampon de dénaturation (2,5 ml de glycérol 100%; 2 ml de SDS 10%; 1 ml de bleu de bromophénol 1%; 600 pl de Tris-HCI IM pH 6,8; 0,5 ml de 8-mercaptoéthanol) et chauffés à 950C pendant 5 minutes. 2965278 il Une électrophorèse sur gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes (SDSPAGE) a été effectuée. Les protéines du gel ont ensuite été transférées sur une membrane PVDF (Poly Vinylidéne DiFluoride, Millipore) par un électro-transfert de 1 h 30. La membrane ayant été au préalable activée par trois bains successifs : 5 méthanol 100% (1 min), eau distillée (deux fois 1 min) et tampon de transfert 1X (15 min). A la fin du transfert, la membrane a été lavée par du « Tris Buffered Saline-Tween » (TBS-T). Le blocage des sites non spécifiques de la membrane a été réalisé par une incubation dans du TBS-T contenant 100/o de lait écrémé pendant 1 h à température 10 ambiante et sous agitation. La membrane a ensuite été lavée par du TBS-T puis incubée pendant 15 h à 4°C en présence de l'anticorps primaire (Ac Ia're) dirigé contre la protéine d'intérêt (Collagène de type II, 1/2000è', Novotec, Collagène de type I, 1/3000ème, Novotec, GAPDH (Glyceraldéhyde 3 Phosphate Déshydrogénase), 1/2000è', Santa Cruz Biotechnology). Le lendemain, une série de rinçages de la 15 membrane a été effectuée avec du TBS-T, puis celle-ci a été incubée en présence de l'anticorps secondaire (Ac le', anti-lapin, 1/6000è', Tebu-Bio) 1 h à température ambiante. Les protéines ont enfin été révélées à l'aide d'un kit de détection (« Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrate », PIERCE) ELISA (« Enzyme-linked immunosorbant assav », TECOmedical SARL): 20 Les expériences ELISA ont été réalisées à partir des surnageants de culture selon les instructions du kit. Les niveaux protéiques du C-propeptide du Procollagène de type II ont été évalués selon la méthode dite de « compétition » alors que ceux de la partie C-terminale du collagène de type I ont été appréciés via la méthode dite « sandwich ». 25 RT-PCR temps réel : Les cellules ont été lysées avec du TRIzoI Reagent® , Invitrogen. 1 pg d'ARN total a été traité par 1 pl de désoxyribonucléase I (DNase I, Invitrogen) pendant 15 min à 25°C. La réaction a été arrêtée par l'ajout de 1 pl d'EDTA 0,5 mM, puis suivie par une incubation de 10 min à 65°C. Les échantillons digérés par la DNase ont ensuite 30 été rétro-transcrits en ADNc. La réaction a été réalisée en présence d'un mélange composé de 5 pl du tampon de la transcriptase inverse 10X, de 1 pl de la transcriptase inverse « Moloney Murine Leukemia virus » à 200 unités/pl (MMLV, Fisher Bioblock Scientific), de 1 pl d'oligodT, de 2 pl d'un mélange des quatre désoxyribonucléotides (dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 20 pM au final, Fisher Bioblock Scientific) et de 1 pl de RNAse-out (40 U/pl, Invitrogen). Le volume a été complété à 15 pl avec de l'eau traitée par le DEPC (di-éthyl-pyro-carbonate). La réaction de transcription inverse s'est faite pendant une période de 1 h à 37°C, précédée d'un cycle de chauffage de 10 min à 25°C. Après la transcription inverse, les échantillons d'ADNc obtenus ont été dilués au 1/10oème puis utilisés dans des expériences de PCR en temps réel. Pour ce faire, l'amplification du gène étudié a été réalisée en triplicate dans des plaques de 96 puits, selon les instructions de l'appareil « ABI Prism 7000 SDS » (Applied Biosystems). Les échantillons ont été amplifiés à l'aide d'un mélange SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems). Les taux d'ARNm du gène COL1A1 et COL2A1 ont été estimés après normalisation vis-à-vis du gène de référence RPL13. Analyses statistiques : Pour les RT-PCR et les ELISA, les résultats sont représentés sous forme de « Box-plot » ou boîte à moustache, représentant n expériences réalisées de façon indépendante. Cette méthode permet de représenter sur le graphique les valeurs minimales et maximales, le premier quartile, le deuxième quartile ou la médiane, le troisième quartile, ainsi que la moyenne des expériences. Le test U de Mann-Whitney a été utilisé pour déterminer les différences significatives entres les groupes contrôles et traités. Les valeurs de P<0,05 sont considérées significatives.
RESLILTATS : Effet des siRNA COLIAI sur les messagers du collagène de type 1. Des chondrocytes articulaires humains ont été cultivés dans des éponges de collagène de type I à raison de 500 000 cellules / éponge après avoir été transfectés par des siRNA ciblant le collagène de type I, puis cultivés dans des conditions hypoxiques (50/o 02). Les taux d'ARNm du gène MUAI ont été estimés par RT-PCR en temps réel après normalisation vis-à-vis du gène de référence RPL13 (UA: Unité Arbitraire). Les résultats sont représentés sur la figure 1A sous forme de "box plots " correspondants à 4 expériences indépendantes réalisées en triplicate. Pour chaque temps d'incubation, les différences significatives entre le contrôle et les cas traités, et entre les différents cas ont été déterminées par le test U de Mann-Whitney: *=p<0,05, ns=non significatif. Ces résultats montrent que le siRNA COL1A1 diminue fortement les taux moyens d'ARNm du collagène de type I lorsque des chondrocytes sont cultivés dans des éponges de collagène, en hypoxie, en présence de BMP-2 (« BMP-2 ») ou sans BMP-2 (« Contrôle ») et pendant 24 et 48 h. De plus, le siRNA possède une efficacité d'inhibition relative de 80 à 90%, et est capable de bloquer la légère augmentation de ces taux moyens induite par la BMP-2. Effet des siRNA COLIAI sur les messagers du collagène de type II Les taux d'ARNm du gène COLLAI ont été estimés par RT-PCR en temps réel comme décrit ci-dessus. Les résultats sont représentés sur la figure 1B. Ces résultats montrent que les taux moyens des messagers du collagène de type II ne sont pas affectés par la présence du siRNA contrôle et du siRNA COL1A1 à 24h de culture, tout comme à 48h. Rapport des messagers des gènes COL2AI/COLIAI Les taux d'ARNm des gènes COL2,41 et COLLAI ont été estimés comme décrit ci-dessus et le ratio taux d'ARNm de COL2A1 sur taux d'ARNm de COL1A1 a été calculé dans les différentes conditions expérimentales. Ce rapport permet de définir l'index de différenciation des cultures de chondrocytes. Les résultats sont représentés sur la figure 1C et montrent une augmentation de ce ratio suite à la transfection des chondrocytes avec le siRNA COL1A1 et cultivés pendant 24 et 48 h. En conclusion, l'utilisation du siRNA COL1A1 associé à un traitement par la BMP-2 induit et accroit la stabilité du phénotype chondrocytaire. Effet des siRNA COLLAI sur les taux protéiques du collagène de type I et 20 de type II Des chondrocytes articulaires humains ont été cultivés dans des éponges de collagène de type I à raison de 500 000 cellules / éponge après avoir été transfectés par des siRNA ciblant le collagène de type I ou des siRNA contrôle, puis cultivés dans des conditions hypoxiques (5% 02). Des extraits cytoplasmiques ont 25 été soumis à une électrophorèse SM-PAGE en vue d'une analyse par « Western-Blot n avec des anticorps anti-collagène II, I, et anti-GAPDH. Les résultats correspondant à un Western-Biot représentatif sont regroupés sur la figure 2. Ils montrent une importante diminution du taux protéique du collagène de type I en présence du siRNA COL1A1 alors que les taux protéiques du 30 collagène de type II ne semblent pas être modifiés de manière significative. Quantification des taux protéique du collagène de type I par ELISA Des chondrocytes articulaires humains ont été cultivés comme décrit ci-dessus. La quantification du C-propeptide du collagène de type I a été réalisée par ELISA sur les surnageants de culture, puis rapportée à la quantité totale de 35 protéines de l'échantillon. Les résultats sont représentés sous forme de "box plots" correspondant à 4 expériences indépendantes. Pour chaque temps d'incubation, les différences significatives entre le contrôle et les cas traités, et entre les différents cas ont été déterminées par le test U de Mann-Whitney : *= p<0,05, ns= non significatif.
Les résultats sont regroupés sur la figure 3A et montrent une nette diminution des taux protéiques du collagène de type I, surtout après 48 h de culture des cellules. Ainsi, la concentration du collagène de type I passe en moyenne de 0,8 mg de CICP/g de protéines totales en présence du contrôle négatif, à 0,4 mg de CICP/g de protéines totales en présence de siRNA COL1A1.
Quantification des taux protéique du collagène de type Il par ELISA Des chondrocytes articulaires humains ont été cultivés comme décrit ci-dessus. La quantification du C-propeptide du collagène de type II a été réalisée par ELISA comme décrit ci-dessus. Les résultats sont regroupés sur la figure 3B. Les analyses de quantification par ELISA des taux protéiques du collagène de type II rejoignent les résultats observés précédemment en « Western-blot ». En effet, le siRNA COL1A1 ne semble pas avoir d'effet significatif sur les taux protéiques du collagène de type II, à 24 h comme à 48 h de culture en éponge de collagène, en hypoxie, avec BMP-2 (« BMP-2 ») ou sans BMP-2 (« Contrôle »).
Quantification du ratio protéique du collagène de type II/ type I par ELISA. La quantification du C-propeptide du collagène de type I et II a été réalisée par ELISA comme décrit ci-dessus et le ratio protéique du collagène de type II/ type I a été calculé.
Les résultats sont regroupés sur la figure 3C et montrent une augmentation du ratio protéique collagène de type II sur collagène de type I à 24 h de culture en présence de siRNA COL1A1. Cet effet est également observé à 48 h dincubation et la BMP-2 a un effet additif avec le siRNA COL1A1. L'ensemble des résultats obtenus témoigne d'une importante diminution du collagène de type I, tant au niveau de ses taux moyens d'ARNm qu'au niveau protéique. Linterférence à l'ARNm se révèle alors être une approche efficace pour diminuer la production de cet isotype collagénique atypique du cartilage articulaire sain est induit lorsque le cartilage articulaire devient arthrosique. Nos résultats montrent également une augmentation du ratio collagène de type II/type I, reflétant une amélioration de l'état de différenciation des chondrocytes.
Le procédé selon l'invention est donc capable de provoquer l'augmentation des marqueurs spécifiques du cartilage et la diminution des marqueurs non spécifiques, ce qui conduit à une forte augmentation de l'index de différenciation des chondrocytes cultivés in vitro.5
Claims (15)
- REVENDICATIONS1. Procédé d'obtention in vitro ou ex vivo de chondrocytes caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - mettre en culture des chondrocytes dédifférenciés ou différenciés ou des cellules souches mésenchymateuses, à l'exception de cellules souches embryonnaires et de cellules germinales humaines, - cultiver ces cellules dans des conditions de faible tension en oxygène, en présence de BMP-2 (« Bone Morphogenetic Protein 2 ») et d inhibiteurs) spécifique(s) du collagène de type I.
- 2. Procédé d'obtention selon la revendication 1, caractérisé en ce que les cellules qui sont mises en culture sont des chondrocytes dédifférenciés ou différenciés.
- 3. Procédé d'obtention selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les chondrocytes différenciés ou dédifférenciés ou les cellules souches mésenchymateuses qui sont mises en culture sont d'origine humaine ou équine.
- 4. Procédé d'obtention selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les chondrocytes différenciés ou dédifférenciés ou les cellules souches mésenchymateuses sont cultivés dans des conditions de culture inférieures ou égales à 10% d'02.
- 5. Procédé d'obtention selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les chondrocytes différenciés ou dédifférenciés ou les cellules souches mésenchymateuses sont cultivés au sein d'un biomatériau.
- 6. Procédé d'obtention selon la revendication précédente, caractérisé en ce que les chondrocytes différenciés ou dédifférenciés ou les cellules souches mésenchymateuses sont cultivés au sein d'éponges de collagène de type I.
- 7. Procédé d'obtention selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la présence de BMP-2 est obtenue par tout moyen permettant d'empêcher la présence ou d'inactiver l'action de toute molécule capable de dégrader ou & inactiver la BMP-2.
- 8. Procédé d'obtention selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les inhibiteurs du collagène de type I sont des siRNA.
- 9. Procédé d'obtention selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la présence de BMP-2 et l'inhibition du collagène de type I sont obtenues par l'introduction active ou passive de molécule(s) capable(s) de produire ces effets.
- 10. Procédé d'obtention selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'on utilise des siRNA pour obtenir à la fois la présence de BMP-2 et l'inhibition du collagène de type I.
- 11. Chondrocytes caractérisés en ce qu'ils sont susceptibles d'être obtenus par la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 et qui présentent un rapport protéique collagène de type II / collagène de type I au moins supérieur à 1.
- 12. Chondrocytes selon la revendication 11, caractérisés en ce qu'ils ne présentent pas ou peu d'expression et/ou ne produisent pas ou peu de collagène de type I au niveau protéique mais expriment et synthétisent de manière significative préférentiellement le collagène de type II et l'agrécanne.
- 13. Chondrocytes selon l'une des revendications 11 ou 12 pour leur utilisation en tant que médicament.
- 14. Chondrocytes selon l'une quelconque des revendications 11 à 13 pour leur utilisation dans le traitement des pertes de substance chondrale liée ou non à un choc traumatique, des maladies ostéo-articulaires, et en particulier les maladies qui sont caractérisées par une destruction ou une dégénérescence du cartilage.
- 15. Chondrocytes selon la revendication 14 pour leur utilisation dans le traitement de l'arthrose.
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