FR2955429A1 - Modifications enzymatiques d'un carbone monolithique alveolaire et applications - Google Patents

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Abstract

La présente invention est relative à une électrode électrochimique poreuse constituée d'un matériau solide alvéolaire se présentant sous la forme d'un monolithe de carbone semi-graphitisé comportant un réseau poreux hiérarchisé exempt de mésopore et comprenant des macropores ayant une dimension moyenne dA de 1 µm à 100 µm, et des micropores ayant une dimension moyenne dI de 0,7 à 1,5 nm, lesdits macropores et micropores étant interconnectés. Dans cette électrode, les macropores renferment au moins une espèce électroactive en contact direct avec le carbone semi-graphitisé constituant la surface des macropores. L'invention est également relative à un procédé de préparation d'une telle électrode ainsi qu'à son utilisation à titre de biocapteur ou pour l'élaboration d'une biopile.

Description

B10011FR 1 La présente invention est relative à une électrode électrochimique poreuse constituée d'un monolithe de carbone semi-graphitisé comportant un réseau poreux hiérarchisé comprenant des macropores et des micropores interconnectés et dont les macropores renferment une espèce électroactive, à un procédé de préparation d'une telle électrode, à l'utilisation d'une telle électrode à titre de biocapteur pour la détection d'analytes en milieu liquide ou pour l'élaboration d'une biopile. Un biocapteur est un outil ou un système analytique constitué d'une espèce biologique immobilisée, appelée « ligand », reliée à un transducteur qui transforme le signal biochimique en un signal physique quantifiable. Selon l'Union internationale de la chimie pure et appliquée (IUPAC), un biocapteur doit être petit et compact, avoir un signal réversible, donner des déterminations précises (réactions « onoff») et établir une connexion réelle entre le matériel biologique et le transducteur. Les biocapteurs électrochimiques constituent une catégorie particulière de biocapteurs dans lesquels le ligand est immobilisé sur une électrode. Dans ce cas, la réponse biochimique à l'addition d'un substrat (analyte) est transformée en un signal électrique amplifié et quantifiable. Les biocapteurs électrochimiques peuvent être ampérométriques, potentiométriques, coulométriques ou conductimétriques. Les biocapteurs ampérométriques mesurent le courant généré à un potentiel constant par une réaction d'oxydoréduction. Les biocapteurs potentiométriques mesurent la différence de potentiel entre une électrode active et une électrode de référence. Les ligands sont des composés biologiques qui permettent d'apporter au biocapteur une grande spécificité. Les ligands les plus souvent utilisés sont les enzymes et les anticorps. Mais les cellules entières, les organites cellulaires, les acides nucléiques (ADN, ARN, oligonucléotides), les antigènes ou encore les récepteurs peuvent aussi être utilisés. Une biopile est un système constitué d'une cathode et d'une anode sur lesquelles sont fixées des bioélectrocatalyseurs de nature différente (ligand), le plus souvent des enzymes électroactives et dont les réactions avec les substances présentes dans le milieu dans lequel elles sont implantées génèrent un courant électrique permettant d'alimenter des appareils à faible puissance dans des domaines variés tels que l'environnement ou la santé. A titre d'exemple de biopile, on peut notamment mentionner les biopiles utilisant l'énergie chimique du couple oxygène-glucose naturellement présent dans les fluides physiologiques pour alimenter des dispositifs médicaux implantés destinés par exemple à suivre la glycémie chez les diabétiques. Dans cette biopile, une glucose oxydase est fixée sur B10011FR 2 l'anode par l'intermédiaire d'un polymère conducteur I et une bilirubine oxydase (BOD) est fixée sur la cathode par l'intermédiaire d'un polymère conducteur II. En fonctionnement, à l'anode, les électrons sont transférés du glucose présent dans le fluide physiologique vers la glucose oxydase (GOx), puis de la GOx au polymère conducteur I et du polymère conducteur I vers l'anode. A la cathode, les électrons sont transférés de la cathode vers le polymère conducteur II, puis vers la BOD et de la BOD à l'oxygène présent dans le fluide physiologique. Quelle que soit l'application envisagée (biocapteur électrochimique ou biopile), le ligand peut être immobilisé sur l'électrode par différentes méthodes telles que l'adsorption, le couplage covalent, l'encapsulation, etc... l'objectif de toute méthode d'immobilisation est de retenir l'activité maximale du ligand biologique sur la surface ou dans la porosité de l'électrode. La sélection d'une méthode d'immobilisation appropriée dépend de la nature du ligand biologique, du type d'électrode utilisée, des propriétés physico-chimiques de l'analyte à détecter et des conditions opératoires du système électrochimique. Les deux méthodes les plus couramment utilisées sont l'adsorption et le couplage covalent. L'adsorption physique d'un ligand basée sur les forces attractives de Van der Waals est la plus ancienne et la plus simple méthode d'immobilisation. Elle ne nécessite pas de modification chimique du ligand et permet la régénération du biocapteur ou de la biopile. L'avantage majeur de cette méthode est sa simplicité. Cependant, la perte de ligand adsorbé est possible si des changements de pH, de force ionique ou de température interviennent au cours des mesures effectuées avec le biocapteur ou du fonctionnement de la biopile. Le couplage covalent peut être utilisé pour permettre l'immobilisation sur une matrice ou directement à la surface d'une électrode. Ces méthodes sont basées sur la réaction entre un groupement fonctionnel du ligand et des groupements réactifs de la surface de l'électrode, le plus souvent par l'intermédiaire d'un médiateur rédox. En effet, dans la plupart des biocapteurs et des biopiles, les centres rédox des enzymes sont trop éloignés de la surface de l'électrode pour assurer une bonne conductivité des électrons et doivent être connectés aux électrodes par l'intermédiaire de médiateurs rédox. Ces derniers jouent le rôle de navette d'électrons entre la biomolécule et l'électrode. Les médiateurs rédox peuvent par exemple être constitués d'un bras de liaison conducteur de l'électricité. A titre d'exemple, on peut notamment citer le brevet US 5,089,112 qui décrit un biocapteur constitué d'un collecteur de courant (électrode de carbone) connecté à une enzyme rédox par l'intermédiaire d'un siloxane flexible comportant un groupe ferrocène.
B10011FR 3 Une des difficultés rencontrées lors de l'élaboration de tels biocapteurs réside donc dans la mise au point de ces médiateurs rédox. Un des enjeux majeurs dans ce domaine de recherche consiste donc à arriver à connecter directement les biomolécules à la surface des électrodes pour s'affranchir du médiateur rédox.
Pour pouvoir se passer de médiateur rédox, le matériau d'électrode doit combiner plusieurs critères obligatoires : - être un matériau conducteur de grande surface spécifique, supérieure notamment à celle des fibres de carbone traditionnelles, - présenter une porosité modulable afin de permettre la fixation de io l'enzyme par imprégnation et la diffusion des substrats de l'enzyme, - être bio-spécifique pour des réactions électrochimiques dans des gammes de potentiels raisonnables en milieu biologique et vis-à vis de biomolécules ou d'espèces dissoutes dans des milieux biologiques, - être biocompatible. 15 Le carbone est un matériau de choix pour la réalisation d'électrodes. Son inertie chimique permet en effet d'explorer des grandes gammes de potentiels en électrochimie. C'est pourquoi le carbone est très largement utilisé sous diverses formes pour la réalisation de dispositifs électrochimiques : capteurs, actionneurs, piles et batteries de stockage. De plus, le carbone a la particularité d'être un
20 matériau sur lequel s'adsorbent efficacement les molécules et polymères organiques. Il est donc possible d'y adsorber des médiateurs rédox, des enzymes ou encore des polymères conducteurs pour la réalisation de dispositifs électrochimiques évolués, performants et sélectifs. Le carbone est de plus un matériau biocompatible qui se prête de façon idéale à la réalisation de dispositifs
25 pour des applications biologiques. Le carbone présente d'autres propriétés avantageuses qui sont la tenue mécanique, la stabilité thermique et une aptitude à être mis en forme aux grandes échelles (disques, films, monolithes de formes variées). Les électrodes de carbone se présentent généralement sous la forme de 30 matériaux mésoporeux. Cependant, les performances des matériaux actuels sont encore limitées par des courants d'intensité trop faible, des adsorptions peu stables ou pas assez efficaces et par des limitations cinétiques dues à un faible transport de masse lorsque les matériaux sont strictement mésoporeux. Par exemple, dans le cas des biopiles, les puissances générées sont insuffisantes pour des dispositifs 35 biomédicaux tels que l'alimentation électrique de biocapteur implantés notamment.
B10011FR 4 L'augmentation de la densité de courant d'un biocapteur ou d'une biopile est une étape impérative pour pouvoir atteindre respectivement des limites de détection suffisantes ou des puissances supérieures à 2 µW. Pour ce faire, il est nécessaire d'augmenter la surface spécifique des électrodes tout en maintenant un transport de masse suffisant. La demande de brevet US 2007/0062821 décrit un matériau carboné poreux conducteur de l'électricité et dont les pores sont fonctionnalisés par une enzyme rédox. Le matériau utilisé dans ce cas est constitué par une ossature poreuse métallique dite « mousse métallique » (métaux et alliages de métaux choisis parmi Ni, Cu, Ag, Au, Ni/Cr par exemple) dont la surface est au moins en partie recouverte par un matériau carboné tel qu'une poudre de carbone (Ketjenblack notamment), des nanotubes de carbone ou un fullerène. Dans ce type de support, l'immobilisation des enzymes peut être réalisée sans utiliser de médiateur rédox, cependant les métaux utilisés pour réaliser l'ossature de ce dispositif et les nanotubes de carbone la recouvrant ne sont pas biocompatibles. Le rendement d'un tel dispositif n'est par ailleurs que de 4 mA/cm2, ce qui n'est pas toujours satisfaisant. Les matériaux se présentant sous la forme de monolithes de carbone poreux constituent des matériaux de choix pour de nombreuses applications telles que la purification de l'eau et de l'air, l'adsorption, la catalyse en phase hétérogène, la fabrication d'électrodes utilisables à titre de biocapteur ou de biopiles et le stockage de l'énergie en raison de leur grande surface spécifique, de leur grand volume de pores, de leur insensibilité aux réactions chimiques environnantes, de leurs excellentes propriétés mécaniques et enfin de leur biocompatibilité.
Ces matériaux comprennent une surface spécifique élevée et une structure hiérarchisée, c'est-à-dire une structure alvéolaire présentant généralement une double porosité. Ils présentent notamment une structure mésoporeuse dans laquelle le diamètre moyen des pores varie de l'ordre de 2 à 10 nm. Ils peuvent être préparés selon deux grandes familles de procédés.
La première grande famille de procédés utilise des empreintes molles et correspond aux méthodes dites de « soft templating » en anglais, i.e. aux méthodes mettant en oeuvre des interactions organiques-organiques entre un polymère thermopolymérisable (précurseur de carbone généralement) et certains copolymères blocs de type polymères non ioniques tels que les produits vendus sous les dénominations commerciales Pluronic® P123 ou F127 par la société BASF qui B10011FR sont utilisés à titre d'agent modelant pour obtenir directement un matériau carboné poreux après carbonisation sous atmosphère inerte à 350°C et pyrolyse (Meng Y. et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2005, 44, 2). La deuxième grande famille de procédés utilise des empreintes rigides et
5 correspond aux méthodes dites de «hard templating » ou « exotemplating » en anglais, i.e. aux méthodes dans lesquelles une empreinte solide mésoporeuse est imprégnée par une solution d'un précurseur du matériau final que l'on souhaite obtenir (précurseur de carbone par exemple) avant d'être carbonisée sous atmosphère non-oxydante. io L'invention qui va être décrite ci-après met en oeuvre des matériaux préparés selon un procédé appartenant à la famille des méthodes dites de « hard templating ». Les inventeurs ont maintenant découvert que l'utilisation, à titre d'électrode, d'un monolithe de carbone alvéolaire comportant un réseau poreux exempt de
15 mésoporosité tout en ayant une grande surface spécifique permet de s'affranchir de l'utilisation d'un médiateur rédox, rendant ainsi possible l'élaboration de biocapteurs et de biopiles performants, notamment en termes de densité de courant, sans qu'il ne soit nécessaire d'utiliser un médiateur rédox pour assurer le passage des électrons entre l'espèce électroactive et l'électrode. Ainsi que cela est démontré
20 dans les exemples illustrant la présente demande, les électrodes électrochimiques obtenues à partir des monolithes de carbone utilisables selon la présente invention sont même plus performantes lorsque l'espèce électroactive est en contact direct avec le carbone semi-graphitisé constitutif du monolithe que lorsqu'un médiateur rédox est utilisé pour faire la jonction entre l'espèce électroactive et le carbone
25 semi-graphitisé constitutif du monolithe. La présente invention a donc pour objet une électrode électrochimique poreuse caractérisée en ce qu'elle est constituée d'un matériau solide alvéolaire se présentant sous la forme d'un monolithe de carbone semi-graphitisé comportant un réseau poreux hiérarchisé exempt de mésopore et comprenant des macropores
30 ayant une dimension moyenne dA de 1 µm à 100 µm, et des micropores ayant une dimension moyenne di de 0,7 à 1,5 nm, lesdits macropores et micropores étant interconnectés, et en ce que les macropores renferment au moins une espèce électroactive en contact direct avec le carbone semi-graphitisé constituant la surface des macropores.
B10011FR 6 On entend par « monolithe », un objet solide ayant une dimension moyenne d'au moins 1 mm. On entend par mésopore, tout pore dont le diamètre moyen varie de 2 à 50 nm environ.
On entend par espèce électroactive, toute molécule dans laquelle il peut se produire un échange d'électrons, c'est-à-dire toute molécule qui peut donner ou accepter un ou plusieurs électrons. Grâce à l'utilisation d'un tel monolithe de carbone à titre de matériau d'électrode, l'électrode électrochimique conforme à l'invention présente les io avantages suivants : - elle a une grande surface spécifique, supérieure notamment à celle des fibres de carbone traditionnelle ; - il est possible de moduler le diamètre des pores en fonction de la nature de l'espèce électroactive que l'on souhaite immobiliser et de l'analyte correspondant ; 15 - elle est biospécifique vis-à-vis de biomolécules ou d'espèces dissoutes dans un milieu liquide, par exemple dans un fluide physiologique ; - il est possible d'immobiliser l'espèce électroactive sans utiliser de médiateur rédox. - les espèces électroactives immobilisées dans les macropores du monolithe 20 conservent l'intégralité de leur activité biologique. - les macropores permettent une imbibition rapide des électrolytes au sein de l'électrode, les cinétiques d'imbibition associées ne sont pas limitées par la diffusion de Fick, - de bonnes propriétés mécaniques. 25 Selon une forme de réalisation préférée de l'invention, les parois des macropores du monolithe de carbone semi-graphitisé ont une épaisseur de 0,5 à 40 µm et de préférence de 2 à 25 µm. Les macropores ont de préférence un diamètre de 4 à 70 µm environ. Selon l'invention, les micropores sont présents dans l'épaisseur des parois 30 des macropores, les rendant alors microporeuses. Les micropores ont de préférence un diamètre de 5 à 20 Angstrôms environ.
B10011FR 7 La surface spécifique du monolithe de carbone semi-graphitisé utilisable conformément à l'invention est généralement de 400 à 900 m2/g environ, préférentiellement de 500 à 700 m2/g environ. Les monolithes de carbone semi-graphitisé poreux utilisables selon la 5 présente invention peuvent être préparés selon un procédé comprenant au moins les étapes suivantes : 1) une étape de préparation d'une empreinte de silice solide sous la forme d'un monolithe alvéolaire constitué d'une matrice de silice ou de silice organiquement modifiée, ledit monolithe comprenant des macropores
io ayant une dimension moyenne dA de 1 µm à 100 µm ; des mésopores ayant une dimension moyenne dE de 2 à 50 nm et des micropores ayant une dimension moyenne di de 0,7 à 1,5 nm, lesdits pores étant interconnectés ; 2) une étape d'imprégnation, sous vide, de l'empreinte de silice solide par 15 une solution d'au moins un précurseur de carbone ; 3) une étape de polymérisation et/ou de réticulation dudit précurseur au sein de l'empreinte de silice solide ; 4) une étape de carbonisation de l'empreinte de silice solide renfermant ledit
précurseur polymérisé et/ou réticulé, ladite étape étant réalisée à une 20 température supérieure ou égale à 700°C afin de conduire à la semi-
graphitisation du carbone ; 5) l'obtention dudit monolithe de carbone semi-graphitisé par élimination de l'empreinte de silice solide par traitement avec un acide ou une base, ledit traitement étant effectué indifféremment avant ou après ladite étape de
25 carbonisation. Au sens de la présente invention, on entend par réseau mésoporeux, un réseau comportant des mésopores, c'est-à-dire des pores dont la taille varie de 2 à 50 nm. La préparation de l'empreinte de silice, lors de la première étape, est de
30 préférence réalisée selon les procédés tels que décrits dans les demandes de brevet FR-A1-2 852 947 et FR-A1-2 912 400. Ces procédés consistent, de façon générale, à: - préparer une émulsion en introduisant une phase huileuse dans une solution aqueuse de tensioactif, B10011FR 8 - à ajouter une solution aqueuse d'au moins un précurseur d'oxyde de silice et/ou d'au moins un précurseur d'oxyde de silice organiquement modifié à la solution de tensioactif, avant ou après la préparation de l'émulsion, - à laisser le mélange réactionnel au repos jusqu'à la condensation dudit précurseur, puis - à sécher le mélange pour obtenir l'empreinte de silice solide attendue. Dans ce cas, le ou les précurseur(s) d'oxyde de silice ou d'oxyde de silice organiquement modifié peuvent être choisis parmi les tetralcoxydes de silice de formule (I) suivante : R'ä(OR)4_äSi (1) dans laquelle : - R représente un radical alkyle ayant de 1 à 5 atomes de carbone ou un groupement organique de formule (II) suivante : -(CH2)m Ri (II) dans laquelle 0<_m<_5, et R1 est choisi parmi un groupe thiol, un groupe pyrrole, un groupe amino qui porte éventuellement un ou plusieurs substituants alkyle, alkylamino ou aryle éventuellement substitué, un groupe alkyle (ayant de préférence de 1 à 5 atomes de carbone), ou un groupe phényle qui porte éventuellement un substituant R2 de type alkyle, notamment un groupe méthyle, - R' représente un radical alkyle ayant de 1 à 5 atomes de carbone ou un radical aryle qui portent éventuellement un ou plusieurs groupes fonctionnels, et - 0 n < m ; m étant la valence de l'atome de silicium.
En particulier, le groupement organique de formule (II) peut être :
- un groupement 3-mercaptopropyle ;
- un groupement 3-aminopropyle ;
- un groupement N-(3-propyl) pyrrole ;
- un groupement N-(2-aminoéthyl)-3-aminopropyle ; - un groupement 3-(2,4 dinitrophénylamino) propyle ;
- un groupement phényle ou benzyle ; ou
- un groupement méthyle.
B10011FR 9 Le ou les précurseur(s) de formule (I) sont de préférence choisis parmi le tetraméthoxysilane, le tetraéthoxyorthosilane (TEOS), le (3-mercaptopropyl)triméthoxysilane, le (3-aminopropyl)triéthoxysilane, le N-(3-triméthoxy-silylpropyl)pyrrole, le 3-(2,4 dinitrophénylamino)propyltriéthoxysilane, le N-(2-aminoéthyl)-3-aminopropyltriméthoxysilane, le phényltriéthoxysilane et le méthyltriéthoxysilane. L'utilisation d'un précurseur de formule (I) comportant au moins un groupement de formule (I), permet d'obtenir une empreinte de silice dans laquelle le mouillage par la solution de précurseurs de carbone est amélioré. Cela permet
io également d'optimiser l'imprégnation de la porosité avec des monomères polymérisables ou des macromonomères qui donneront naissance au carbone. La concentration en précurseur(s) d'oxyde de silice et/ou en précurseurs d'oxyde de silice organiquement modifié au sein de la solution aqueuse est, de préférence, supérieure à 10 % en masse par rapport à la masse de la phase aqueuse.
15 Cette concentration varie plus préférentiellement de 17 à 35 % en masse par rapport à la masse de la phase aqueuse. La phase huileuse est de préférence constituée par un ou plusieurs composés choisis parmi les alcanes linéaires ou ramifiés ayant au moins 12 atomes de carbone. A titre d'exemple, on peut citer le dodécane et l'hexadécane. La phase
20 huileuse peut en outre être constituée par une huile de silicone de faible viscosité, c'est-à-dire inférieure à 400 centipoise. La quantité de phase huileuse présente au sein de l'émulsion peut être ajustée en fonction du diamètre des macropores que l'on souhaite obtenir pour l'empreinte de silice, étant entendu que plus la fraction volumique huile/eau sera
25 élevée, plus le diamètre des gouttelettes d'huile au sein de l'émulsion sera faible et plus le diamètre des macropores sera faible également. De manière générale, la phase huileuse représente de 60 à 90 % en volume par rapport au volume total de l'émulsion. Cette quantité d'huile permet d'obtenir une empreinte de silice dans laquelle le diamètre moyen des macropores varie de
30 1 à 100 µm environ. Le composé tensioactif peut être un tensioactif cationique choisi notamment parmi le bromure de tetradécyltriméthylammonium (TTAB), le bromure de dodécyltriméthylammonium ou le bromure de cétyl-triméthylammonium. Lorsque le composé tensioactif est cationique, le milieu réactionnel est porté à un pH B10011FR 10 inférieur à 3, de préférence inférieur à 1. Le bromure de tetradécyltriméthylammonium est particulièrement préféré. Le composé tensioactif peut en outre être un tensioactif anionique choisi parmi le dodécylsulfate de sodium, le dodécylsulfonate de sodium et le dioctylsulfosuccinate de sodium (AOT). Lorsque le composé tensioactif est anionique, le milieu réactionnel est porté à un pH supérieur à 10. Le composé tensioactif peut enfin être un tensioactif non ionique choisi parmi les tensioactifs à tête éthoxylée, et les nonylphénols. Parmi de tels tensioactifs, on peut en particulier citer les copolymères blocs d'éthylèneglycol et
io de propylèneglycol vendus par exemple sous les dénominations commerciales Pluronic® P123 et Pluronic® F127 par la société BASF. Lorsque le composé tensioactif est non ionique, le milieu réactionnel est porté à un pH supérieur à 10 ou inférieur à 3, de préférence inférieur à 1 et contient en outre, de préférence, du fluorure de sodium afin d'améliorer la condensation des précurseurs de l'oxyde de
15 silice. La quantité totale de tensioactif présente au sein de l'émulsion peut également être ajustée en fonction du diamètre des macropores que l'on souhaite obtenir dans l'empreinte de silice. Cette quantité est également variable en fonction la nature du tensioactif utilisé. 20 De manière générale, la quantité de tensioactif varie de 1 à 10 % en masse, de préférence de 3 à 6 % en masse, par rapport à la masse totale de l'émulsion. L'étape de condensation du ou des précurseur(s) d'oxyde de silice et/ou du ou des précurseur(s) d'oxyde de silice organiquement modifié est effectuée avantageusement à une température proche de la température ambiante. La durée
25 de cette étape peut varier de quelques heures (2 à 3 heures) à quelques semaines (2 à 3 semaines) en fonction du pH du milieu réactionnel. L'empreinte de silice obtenue à la fin de la première étape est de préférence lavée à l'aide d'un solvant organique (tel que par exemple le tetrahydrofurane, l'acétone et leurs mélanges), puis séchée (par exemple à l'air en étuve ou par
30 lyophilisation) avant de subir l'étape d'imprégnation par la solution de précurseur de carbone ou de précurseur de céramique. Le ou les précurseur(s) de carbone sont de préférence choisis parmi les résines phénoliques, les résorcinols, le styrène, le divinylbenzène, les polysaccharides tels que par exemple le saccharose et ses dérivés, l'amidon de
35 pomme de terre, la lignine, les mélanges lignine-cellulose et les brais de pétrole.
B10011FR 11 Les précurseurs de carbone peuvent se présenter sous la forme de monomères, d'oligomères, de macromonomères préformés ou de polymères que l'on polymérise et/ou réticule lors de l'étape 3). Lorsqu'un brai de pétrole est utilisé à titre de précurseur de carbone, l'étape 3) n'est pas nécessairement réalisée.
Le précurseur de la solution d'imprégnation est de préférence un précurseur de carbone, et encore plus préférentiellement une résine phénolique, en particulier une résine formophénolique. Le solvant de la solution de précurseur de carbone est de préférence un solvant organique choisi parmi les alcools inférieurs tels que l'éthanol, le tetrahydrofurane (THF), le toluène, et leurs mélanges. Lorsque le précurseur de carbone est choisi parmi les résines phénoliques, le solvant peut également être choisi parmi l'eau et les mélanges d'eau avec au moins un solvant organique choisi parmi les solvants cités ci-dessus, en présence d'une base. La quantité de précurseur de carbone dans la solution utilisée pour l'étape d'imprégnation peut être ajustée en fonction du diamètre des macropores que l'on souhaite obtenir dans les monolithes de carbone à l'issue du procédé, étant entendu que plus cette quantité est faible, plus le diamètre des macropores est grand et plus les jonctions internes (parois des macropores) sont fines. De manière générale, la quantité de précurseur de carbone au sein de la solution d'imprégnation varie de 5 à 90 % en masse, et encore plus préférentiellement de 20 à 70 % en masse, par rapport à la masse totale de ladite solution. L'étape 3) de polymérisation et/ou de réticulation du ou des précurseur(s) de carbone peut être réalisée par toutes les méthodes connues de l'homme du métier. Lorsque le précurseur est un précurseur de carbone, tel que par exemple une 25 résine phénolique, on procède à une réticulation thermique. Lorsque le précurseur est un précurseur de carbone tel que par exemple le styrène ou le divinylbenzène, on procède à une réticulation induite par un agent réticulant choisi notamment parmi l'azo(bis)isobutyronitrile (AIBN), le peroxodisulfate de potassium et le peroxodisulfate de sodium. 30 L'étape de carbonisation de l'empreinte de silice imprégnée de précurseur de carbone permet l'obtention de carbone semi-graphitisé et est généralement effectuée en atmosphère réductrice, à une température variant de 700 à 1200°C environ pendant une durée de 3 à 12 heures environ.
B10011FR 12 Comme indiqué précédemment, l'étape d'élimination de l'empreinte de silice peut être réalisée indifféremment avant ou après l'étape de carbonisation, l'ordre de réalisation de ces deux étapes n'ayant en effet aucune incidence sur la structure du réseau poreux du monolithe résultant.
Cette étape d'élimination de l'empreinte de silice est de préférence réalisée par immersion de l'empreinte de silice imprégnée de précurseur polymérisé et/ou réticulé, ou du monolithe de carbone résultant de la carbonisation, dans une solution d'un acide, telle que par exemple une solution d'acide fluorhydrique ou dans une solution basique ayant un pH supérieur à 9, telle que par exemple dans
io une solution de soude ou de potasse. La durée de ce traitement n'est pas critique à partir du moment où il conduit à l'élimination totale de l'empreinte de silice. Cette durée varie généralement de 12 à 24 heures. Les espèces électroactives pouvant être immobilisées dans les macropores du monolithe de carbone semi-graphitisé utilisable selon l'invention peuvent être
15 choisies parmi toutes les molécules dans lesquelles un échange d'électrons est possible. Parmi de telles molécules, on peut citer les enzymes comportant un centre rédox, les acides nucléiques tels que l'ADN, l'ARN et les oligonucléotides, les anticorps et les antigènes, ainsi que les polymères conducteurs tels que les polypyrroles, les polyanilines et les polymères rédox. 20 Au sens de la présente invention, on entend par enzyme comportant un centre rédox, toute enzyme capable de catalyser une réaction d'oxydation ou de réduction. Selon une forme de réalisation préférée de l'invention, l'espèce électroactive est une enzyme comportant un centre rédox et est choisie parmi les 25 oxydoréductases (E.C. 1) comprenant notamment : i) les oxydases telles que les glucose oxydases, les glucose-6-phosphate déshydrogénases, les isocitrate déshydrogénases, les lactate déshydrogénases, les xanthine oxydases, les lactate oxydases, les pyruvate oxydases, la bilirubine oxydase, les laccases, les cholestérol oxydases, les glutamates oxydases, les
30 pyruvate oxydases et les peroxydases telles que la peroxydase de raifort ; ii) les réductases telles que les 5-alpha réductases, les cytochrome b5 réductases, les folate et dihydrofolate réductases, la HMG-CoA réductase (ou 3-hydroxy-3-méthyl-glutaryl-CoA réductase ou HMGR), la glutathion réductase, la méthémoglobine réductase, la ribonucléotide réductase, B10011FR 13 iii) les oxygénases comprenant les monoxygénases telles que la lipoxygénase et les dioxygénases telles que la cinnamate 4-hydroxylase, la phénylalanine hydroxylase, la tyrosine hydroxylase, la tyrosinase, la cyclooxygénase, la hème-oxydase et le cytochrome P450 ; iv) les hydrogénases et déshydrogénases telles que par exemple les glucose déshydrogénases, les glutamate déshydrogénases, et les luciférases. Pour fonctionner, ces enzymes oxydoréductases sont associées à des cofacteurs choisis parmi les coenzymes d'oxydoréduction tels que par exemple le nicotinamide adénine dinucléotide (NAD), le nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADP), la flavine adénine dinucléotide (FAD), la flavine mononucléotide (FMN), l'hème, et la pyrroloquinoline quinone (PQQ), ou bien à des cations métalliques. Ainsi, lorsque l'espèce électroactive est une oxydoréductase, alors les macropores du monolithe de carbone renferment au moins un cofacteur choisi parmi les coenzymes d'oxydoréduction (celui-ci pouvant faire partie intégrante de l'enzyme oxydoréductase, c'est-à-dire être une portion de la protéine enzymatique elle-même ou bien être présent sous forme séparée) et les cations métalliques. Selon une forme de réalisation préférée de l'invention, la quantité d'espèce électroactive immobilisée varie de 0,01 à 7 % massique environ et plus préférentiellement de 0,04 à 3 % massique environ par rapport à la masse totale de l'électrode électrochimique. Les espèces électroactives sont immobilisées au sein des macropores du monolithe de carbone semi-graphitisé constitutif de l'électrode électrochimique conforme à l'invention, par l'intermédiaire d'interactions électrostatiques avec le carbone semi-graphitisé (adsorption), ainsi que par des contraintes stériques liées à la taille des macropores. La très forte interaction du carbone semi-graphitisé avec la ou les espèces électroactives assure une stabilité d'adsorption accrue. Cette stabilité est critique pour la stabilité des biocapteurs et des biopiles correspondants. En effet, cette stabilité accrue garantie une durée de fonctionnement bien supérieure à celle accessible par des matériaux carbonés traditionnels. La présente invention a également pour objet un procédé de préparation d'une électrode électrochimique conforme à l'invention et telle que définie ci- dessus, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comporte une étape d'imprégnation, d'un monolithe de carbone semi-graphitisé comportant un réseau B10011FR 14 poreux hiérarchisé exempt de mésopore et comprenant des macropores ayant une dimension moyenne dA de 1 µm à 100 µm, et des micropores ayant une dimension moyenne di de 0,7 à 1,5 nm, lesdits macropores et micropores étant interconnectés, par une solution aqueuse ou une dispersion aqueuse d'au moins une espèce électroactive, étant entendu que ledit procédé ne comporte pas d'étape de fonctionnalisation de la surface des macropores par un médiateur rédox. L'étape d'imprégnation du monolithe est de préférence réalisée sous vide. Selon une forme de réalisation particulièrement préférée, l'étape d'imprégnation est réalisée sous vide, à température ambiante pendant une durée io d'environ 72 heures. Lorsque l'espèce électroactive est une enzyme oxydoréductase, et que le cofacteur est un coenzyme d'oxydoréduction ne faisant pas partie intégrante de l'enzyme ou des cations métalliques, alors la solution aqueuse ou la dispersion aqueuse utilisée pour imprégner le monolithe de carbone semi-graphitisé comprend
15 en outre au moins un coenzyme d'oxydoréduction ou des cations métalliques. Le lavage du monolithe à la fin de l'étape d'imprégnation est de préférence réalisé avec de l'eau distillée. L'invention a également pour objet l'utilisation d'une électrode électrochimique telle que définie précédemment, à titre de biocapteur pour la 20 détection d'analytes en milieu liquide ou pour la fabrication d'une biopile. Lorsque l'électrode conforme à l'invention est utilisée à titre de biocapteur, la nature des analytes qui pourront être détectés variera bien entendu en fonction de la nature de l'espèce électroactive immobilisée dans la macroporosité du monolithe de carbone semi-graphitisé. 25 A titre d'exemple, lorsque l'espèce immobilisée est une glucose oxydase, l'électrode électrochimique pourra alors être utilisée comme biocapteur pour la détection du taux de glucose dans un milieu liquide et en particulier dans un fluide biologique tel que le sang. Lorsque l'espèce immobilisée est une molécule d'acide nucléique ou une
30 protéine, l'électrode électrochimique pourra alors être utilisée comme biocapteur d'affinité dont le fonctionnement est basé sur la reconnaissance biologique oligonucléotide-ADN et/ou antigène-anticorps. Ce type de biocapteur est utilisable comme outil comme par exemple dans le diagnostic médical (marqueurs de cancer).
B10011FR 15 Les biopiles sont des piles à combustibles qui reposent sur des réactions biocatalytiques aux électrodes pour convertir les combustibles chimiques présents dans les milieux biologiques d'êtres vivants en puissance électrique. Une biopile peut par exemple servir de source d'énergie pour alimenter des appareils médicaux implantés dans le corps humain, par exemple un implant destiné à mesurer et transmettre le taux de sucre du sang. Lorsque l'électrode conforme à l'invention est utilisée pour la fabrication d'une biopile, ladite biopile peut par exemple être constituée d'une première électrode conforme à l'invention (anode) dans laquelle l'espèce immobilisée est
io une glucose oxydase et d'une seconde électrode conforme à l'invention (cathode) dans laquelle l'espèce immobilisée est la bilirubine oxydase, les deux électrodes étant reliées entre elles par un circuit électrique passant par un dispositif à alimenter en énergie électrique. L'immobilisation des enzymes dans les matériaux cités permet d'éviter la 15 présence d'une membrane pour séparer les deux compartiments de la biopile, permettant ainsi de simplifier le dispositif et rendant possible sa miniaturisation. Un autre objet de l'invention est un biocapteur caractérisé en ce qu'il comprend au moins une électrode électrochimique conforme à l'invention et telle que décrite précédemment. 20 Enfin, l'invention a pour objet une biopile comprenant une électrode positive et une électrode négative reliées entre elles par un circuit électrique, ladite biopile étant caractérisée en ce qu'au moins une des deux électrodes est une électrode électrochimique conforme à l'invention et telle que décrite précédemment. La présente invention est illustrée par les exemples de réalisation suivants, 25 auxquels elle n'est cependant pas limitée. EXEMPLES Les matières premières utilisées dans les exemples qui suivent sont listées ci-après :
- Bromure de tetradécyltriméthylammonium à 98 % (TTAB) : société Alfa 30 Aesar ;
- Tetraéthoxyorthosilane à 98 % (TEOS) : société Aldrich ;
- Acétone et Dodécane à 99 % : société Rectapur ;
- Tetrahydrofurane (THF) ; acide fluorhydrique à 48 % et acide chlorhydrique à 37 % : société Analar Normapur ; B10011FR 16 - Résine formophénolique vendue sous forme d'une solution hydroalcoolique de prépolymères, sous la dénomination Ablaphene RS 101 par la société Rhodia ;
- Bilirubine oxydase (BOD) vendue par la société AMANO (Japon) ; - Polymère rédox : copolymère de polyacrylamide et de poly(N-vinylimidazole) complexé avec [Os (4,4'-dichloro-2,2'-bipyridine)2C1]+i2+ (PAA-PVI-bipy). Le copolymère PAA-PVI peut être préparé comme suit : 4,4'-Dinitro-2,2'-bipyridine N,N'-dioxide a été préparé comme décrit par Anderson, S. et al., J. J. Chem. Soc., Dalton Trans. 1985, 2247-2250, et Kenausis, G. et al., A. J. Chem. Soc., Faraday Trans. 1996, 92, 4131-4135. La 4,4'-dichloro-2,2'-bipyridine (dcl-bpy) a ensuite été synthétisée à partir de la 4,4'-dinitro-2,2'-bipyridine N,N'-dioxide selon la méthode modifiée de Maerker G. et al. (voir Anderson, S. et al., supra et Maerker, G. et al., J. Am. Chem. Soc. 1958, 80, 2475-2477.). Os(dcl-bpy)2C12 a été préparé comme suit : (NH4)2OsC16 et "dcl-bpy ont été dissous dans de l'éthylène glycol dans un rapport molaire 1:2 et portés au reflux sous argon pendant 1 heure (rendement 85%). Os(dcl-bpy)2C12 a ensuite été complexé avec le copolymère 1:7 polyacrylamide-poly(N-vinylimidazole) (PAA-PVI) et purifié comme décrit par Zakeeruddin, S. M. et al., J. Electroanal. Chem. 1992, 337, 253-256 pour conduire au polymère rédox PAA-PVI-bipy ;
- Polyéthylèneglycol diglycidyléther vendu sous la dénomination (PEGDGE)-400 par la société Polysciences. Les matières premières commerciales ont été utilisées telles que reçues des fabricants, sans purification supplémentaire.
Les différents monolithes obtenus dans les exemples ont été caractérisés sur différentes échelles de tailles. La mésoporosité a été caractérisée de manière qualitative par une technique de microscopie électronique à transmission (MET) à l'aide d'un microscope Jeol 2000 F ayant une tension d'accélération de 200 kV. Les échantillons ont été préparés en déposant des squelettes de silice en poudre sur une grille en cuivre revêtue d'une membrane Formvar commat en carbone. La macroporosité a été caractérisée de manière qualitative par une technique
de microscopie électronique à balayage (MEB) à l'aide d'un microscope à balayage
Jeol JSM- 840A qui fonctionne à 10 kV. Les échantillons ont été revêtus d'or ou de 35 carbone avant leur caractérisation.
B10011FR 17 Les mesures de surface spécifique ont été faites par des techniques d'adsorption-désorption d'azote à l'aide d'un appareil commercialisé sous la dénomination Micromeritics ASAP 2010 ; le dépouillement étant fait par les méthodes de calcul B.E.T ou B.J.H..
La macroporosité a été quantifiée par des mesures d'intrusion de mercure, à l'aide d'un appareil commercialisé sous la dénomination Micromeritics Autopore IV, pour atteindre les caractéristiques des cellules minérales macroscopiques composant le squelette inorganique. Les échantillons ont été soumis à une analyse par diffraction des rayons ( RD) ou par diffraction des rayons aux petits angles (SA s), à l'aide d'une source de R à anode tournante de 18 kW (Rigaku-200) utilisant un cristal (111) de Ge comme monochromateur. La radiation diffusée a été collectée sur un collecteur à deux dimensions (Imaging Plate system, commercialisé par Mar Research, Hamburg). La distance du détecteur à l'échantillon était de 500 mm.
Des analyses thermogravimétriques ont été réalisées sous flux d'oxygène (5 cm3.min-1) à l'aide d'un analyseur thermogravimétrique commercialisé sous la dénomination Stearam TAG-1750. Des analyses en spectroscopie infrarouge à transformée de Fournier (ou FTIR : « Fournier Transformation Infrared Spectroscopy ») ont été effectuées sur 20 un spectromètre commercialisé sous la dénomination Nicolet 750. Des tests de compression mécanique des matériaux ont été réalisés à l'aide d'un appareil commercialisé sous la dénomination Instron 4466. Les échantillons ont été compressés entre deux plaques rigides et les déformations mécaniques observées à différentes pressions ont été enregistrées. La vitesse de compression
25 était de 0,5 mm/s. Exemple 1 Préparation de monolithes de carbone macro- et microporeux Dans cet exemple on illustre la préparation de différents monolithes de carbone présentant une double porosité macro/micro à partir d'un monolithe de 30 silice micro/méso/macroporeux. 1) Première étape : Synthèse d'un monolithe de silice micro/méso/macroporeux (MSi).
B10011FR 18 g de TEOS ont été ajoutés à 16 g d'une solution aqueuse de TTAB à 35 % précédemment acidifiée par 7 g d'HCI. On a laissé l'hydrolyse se dérouler jusqu'à obtention d'un milieu hydrophile monophasique (phase aqueuse de l'émulsion). On a ensuite ajouté à cette phase aqueuse, 35 g de dodécane (phase huileuse de
5 l'émulsion) au goutte à goutte et sous agitation. On a ensuite laissé l'émulsion se condenser sous forme d'un monolithe de silice pendant une semaine à température ambiante. Le monolithe de silice ainsi synthétisé a ensuite été lavé par un mélange THF/acétone (50/50 : v/v) pour en extraire la phase huileuse. Le monolithe de silice a alors été mis à sécher pendant une semaine à température ambiante puis il a été
io soumis à traitement thermique à 650°C pendant 6 heures en appliquant une vitesse de montée en température de 2°C/min., avec un plateau à 200°C pendant 2 heures. On a obtenu un monolithe de silice que l'on a désigné MSi. 2) Deuxième étape : Imprégnation du monolithe de silice par la résine phénolique 15 Le monolithe de silice MSi obtenu ci-dessus a été découpé en 5 morceaux identiques de 0,5 g chacun à l'aide d'une scie à main. Par ailleurs, on a préparé les quatre solutions de résine phénolique Ablaphene® RS 110 suivantes :
- Solution S25 : Ablaphene ® RS 110 à 25 % en poids dans le THF,
20 - Solution S60 : Ablaphene ® RS 110 à 60 % en poids dans le THF,
- Solution S80 : Ablaphene ® RS 110 à 80 % en poids dans le THF,
- Solution S90 : Ablaphene ® RS 110 à 90 % en poids dans le THF. Un morceau de 0,5 g de monolithe de silice a ensuite été immergé dans chacune des solutions S25 à S90 dans un bécher. Les béchers ont été placés sous
25 vide jusqu'à disparition de l'effervescence afin de s'assurer d'une bonne imprégnation des matrices de silice par les solutions de résine phénolique. Après 24 heures d'agitation à température ambiante, chacune des solutions a été filtrée. Les monolithes de silice ainsi imprégnés des solutions S25 à S90, respectivement MSiS25, MSiS60, MSiS80 et MSiS90, ont alors été lavés 30 rapidement au THF puis séchés dans un four à une température de 80°C pendant 24 heures afin de faciliter l'évaporation du solvant et initier thermiquement la réticulation des monomères de la résine phénolique. Chacun des monolithes MSiS25 à MSiS90 a ensuite subi un deuxième traitement thermique dans une étuve à air chaud, à 155°C pendant 5 heures, avec une vitesse d'élévation de la 35 température de 2°C/min., en effectuant un premier plateau à 80°C pendant B10011FR 19 12 heures puis un second plateau à 110°C pendant 3 heures. On a ensuite laissé les monolithes revenir à température ambiante par simple arrêt de l'étuve. On a ainsi obtenu des monolithes de silice imprégnés par une résine phénolique réticulée (monolithes hybrides de type MSiSréti). Ces monolithes sont respectivement désignés MSiS25réti, MSiS60réti, MSiS80réti et MSiS90réti. Le monolithe MSiS80réti a été préparé en double. 3) Troisième étape : Synthèse des monolithes de carbone Deux voies de synthèse ont été mises en oeuvre. Selon la première voie de synthèse, chacun des monolithes MSiS25réti, MSiS60réti, MSiS80réti et MSiS90réti tels qu'obtenus ci-dessus à l'issue de la deuxième étape a été immergé dans trois bains successifs d'acide fluorhydrique à 10 %, puis lavé de façon abondante avec de l'eau désionisée. Ce traitement à l'acide fluorhydrique a entra né l'élimination de l'empreinte de silice. Les monolithes résultant de ce traitement ont ensuite été séchés dans une étuve à air chaud pendant une nuit à 80°C. Après séchage, les monolithes ont été soumis à une pyrolyse à une température de 900°C pendant 1 heure sous flux d'azote en respectant une vitesse de montée en température de 4°C/min. Les monolithes de carbone graphitisés ainsi obtenus sont respectivement désignés MS25carb, MS60carb, MS80carb et MS90carb.
La seconde voie de synthèse a été appliquée à l'autre monolithe MSiS80réti. Selon cette seconde voie, l'ordre de réalisation du traitement à l'acide fluorhydrique et de la pyrolyse a simplement été inversé, chacune de ces deux étapes étant néanmoins réalisée de façon identique au mode opératoire utilisé pour aboutir aux monolithes MScarb. Le monolithe de carbone graphitisé ainsi obtenu a été dénommé MS80HF. 4) Caractérisations La figure 1 annexée montre des vues macroscopiques des monolithes obtenus à l'issue de chacune des trois étapes du procédé : la figure la) correspond à un monolithe de type MSi ; la figure lb) correspond à un monolithe de type MSiSréti et la figure lc) correspond à un monolithe de carbone de type MS80HF. On constate que la forme générale du monolithe de silice utilisé à titre d'empreinte est reproduite à l'identique par le monolithe de carbone via le monolithe hybride de type MSiSréti. On observe également une perte de volume d'environ 45 % entre le monolithe de silice et le monolithe de carbone B10011FR 20 correspondant ; cette perte de volume est due à une sorte de tassement du matériau engendrée par l'élimination de l'empreinte de silice lors de la pyrolyse. La figure 1 annexée montre également une vue microscopique en MEB du réseau poreaux macroscopique d'un monolithe de type MSi (fig. 1d) et du monolithe de carbone de type MS80HF. Sur ces figures, les flèches blanches indiquent les jonctions externes des pores et les flèches noires sur fond blanc indiquent les jonctions internes des pores. On observe que la structure du réseau macroporeux du monolithe de silice est conservée dans le monolithe de carbone correspondant indiquant que celui-ci est
io bien la réplique sensiblement exacte de l'empreinte de silice utilisée et non son négatif. Les résultats des mesures d'intrusion au mercure effectuées sur chacun des monolithes de carbone synthétisés dans cet exemple sont reportés sur la figure 2 annexée, et sont regroupés dans le tableau 1 ci-après. 15 Sur la figure 2, les courbes 2a) à 2e) représentent le volume d'intrusion différentiel (en mL/g/nm) en fonction du diamètre de pores (en nm) pour chacun des monolithes de carbone (fig. 2a) : MS25carb ; fig. 2b) : MS60carb ; fig. 2c) MS80carb ; fig. 2d) : MS90carb et fig. 2e) MS80HF). Tableau 1 Monolithes MS25carb MS60carb MS80carb MS80HF MS90carb Volume d'intrusion 1,4 1,0 0,6 0,7 0,5 (cm .g ) Porosité (%) 71 58 51 48 42 Densité apparente 0,5 0,6 0,8 0,7 0,9 Densitég du squelette 1,7 1,5 1,6 1,4 1,5 20 Ces résultats montrent que le volume du réseau macroporeux est inversement proportionnel à la concentration de la solution de résine formophénolique utilisée pour imprégner le monolithe MSi (diminution du volume d'intrusion et du pourcentage de porosité lorsque l'on va de MS25carb vers MS90carb). Le diamètre des macropores est poly dispersé et varie de 10 à 10 000 25 nm (Figure 2).
B10011FR 21 NB : Les mesures d'imprégnation au mercure ne sont valides que dans la gamme des macropores. Les quelques points apparaissant dans la zone de diamètres comprise entre 2 et 50 nm sur les figures 2 c et 2d notamment sont des artéfacts de mesures ou des défauts ponctuels des matériaux mais ne correspondent en aucun cas à la présence d'un réseau mésoporeux. L'absence de réseau mésoporeux a par ailleurs été confirmée par les mesures d'adsorption-désorption d'azote (voir Tableau 2 et conclusion du tableau 2 ci-après). La densité finale du squelette de carbone de chacun des monolithes est par contre sensiblement identique dans chacun des cas, du fait que le squelette est 10 exclusivement constitué de carbone partiellement graphitisé. Les résultats obtenus avec MS80carb et MS80HF ne sont pas significativement différents, ce qui démontre que les deux voies de synthèse utilisées lors de l'étape 3) de carbonisation sont équivalentes. Il a également été vérifié, par spectroscopie Infrarouge à transformée de
15 Fournier, que le traitement à l'acide fluorhydrique effectué lors de la troisième étape permet d'éliminer l'empreinte de silice. La figure 3 annexée représente les spectres FITR obtenus avec l'empreinte de silice Msi (Figure 3a)), une matrice de silice après imprégnation et réticulation d'une solution de résine formophénolique : MSiSréti (figure 3b)), une matrice de silice de type MSiSréti ayant subi un
20 traitement à l'acide fluorhydrique mais pas de carbonisation (Figure 3c)), une matrice de résine formophénolique réticulée obtenue par simple réticulation par traitement thermique de 1 ml de résine formophénolique Ablaphene® RS 101 dans un pilulier en verre (Figure 3d)) et un monolithe de carbone MScarb (Figure 3e)). Sur cette figure 3, la transmittance exprimée en unités arbitraires est fonction de la
25 longueur d'onde exprimée en cm-1. La flèche noire indique le pic caractéristique de Si-O à 1076 cm-1. Les spectres 3a) et 3b) des monolithes Msi et MSiSréti présentent tous les deux une forte absorption centrée à 1076 cm-' significative de la présence de silice. Sur le spectre 3d) correspondant à la matrice de résine formophénolique pure, ce pic est bien s r absent comme cela est le cas également
30 sur les spectres 3c) et 3e). Ces résultats démontrent que l'empreinte de silice a été complètement éliminée par le traitement à l'acide fluorhydrique. Le spectre du monolithe de carbone MScarb est assez plat ; les pics correspondants aux orbitales Sp2 et Spa des cycles aromatiques se situant respectivement vers 1650 cm-1 et 1100cm-1. 35 Les mesures de surface spécifique de chacun des monolithes de carbone obtenus sont regroupées dans le tableau 2 ci-après : B10011FR 22 Tableau 2 Monolithes MS25carb MS60carb MS80carb MS80HF MS90carb Surface spécifique 550 700 460 400 450 par B.E.T. (mz g i) Surface spécifique _ 12 11 2 5 par B.J.H. (m2 g i) a Volume total des 0,25 0,24 0,23 0,20 0,22 pores (cm .g ) a : la méthode B.J.H. a été appliquée uniquement aux pores dont le diamètre était supérieur à 17 et pour la courbe de désorption. A partir de ces résultats, on peut conclure que les monolithes ont un 5 caractère microporeux (taille des pores comprise entre 7 et 12 ), et ne présentent pas de mésoporosité. L'étude de la porosité à l'échelle mésoscopique évaluée par SA S est reportée sur la figure 4a) annexée. Les profils de diffusion ont été établis pour chacun des monolithes de carbone synthétisés (MSi : ^, MSiS80réti : , io MS80carb : A et MS80HF : ). Sur cette figure, l'intensité exprimée en unités arbitraires est fonction du vecteur d'onde (q) exprimé en -1. On constate que les matrices de silice pure MSi et de silice imprégnée de résine réticulée MSiSréti possèdent une mésoporosité non ordonnée avec une distance entre deux pores de 32 (vecteur d'onde q 0,195 -1). On constate par 15 ailleurs une absence de mésoporosité dans les autres monolithes. Lorsque l'on considère la figure 4b) qui représente le spectre de diffraction RD d'un monolithe de carbone de type MS80HF (intensité en unités arbitraires en fonction de l'angle de diffraction en degrés), on observe deux pics principaux (2Q 22° et 2Q 45°) qui correspondent respectivement aux pics caractéristiques 20 des composés carbonés graphitisés (d(002) 0,4 nm et d(100)/d(101)). Les monolithes de carbone de type MScarb et MS80HF ainsi graphitisés présentaient une conductivité de l'ordre de 10 S.cm 1. Les résultats des tests de compression mécanique effectués sur le monolithe de carbone MS80HF sont donnés par la figure 5 annexée sur laquelle la contrainte 25 (en MPa) est fonction de la déformation (en %). La courbe en dents de scies révèle des chutes abruptes de la contrainte qui sont dues à une rupture partielle de la structure macroporeuse du monolithe (rupture de la paroi des macropores). Sur B10011FR 23 cette figure, les lignes obliques en pointillés mettent en évidence que chaque créneau commence avec la même pente quelle que soit la valeur de la contrainte appliquée. Ce résultat est significatif d'un comportement en régime élastique. Les Modules de Young moyens calculés à partir de ces résultats sont de l'ordre de 0,2 GPa et reflètent la très grande résistance des matériaux obtenus autorisant leur utilisation pour la fabrication d'électrodes modifiées par des espèces électroactives pour des biocapteurs ou des biopiles. Exemple 2 Préparation d'un capteur enzymatique io Dans cet exemple on illustre la préparation d'un capteur enzymatique (CE) pour la détection de l'oxygène (02) à partir d'un monolithe de carbone et de bilirubine oxydase (BOD). Le monolithe de carbone utilisé dans cet exemple a été préparé exactement comme décrit ci-dessus à l'exemple 1 sauf que l'on a utilisé pour l'étape
15 d'imprégnation de l'empreinte de silice telle qu'obtenue à l'étape 1) de l'exemple 1, une solution de résine phénolique à 40 %, soit une Solution S40 : Ablaphene RS 110 à 40 % en poids dans le THF. On a obtenu un monolithe de silice imprégné de la solution S40 soit un monolithe MSiS40. 20 La synthèse du monolithe de carbone a alors été effectuée selon la première voie de synthèse décrite ci-dessus à l'étape 3) de l'exemple 1. On a obtenu un monolithe de carbone MS40carb dont les caractéristiques de porosité étaient les suivantes : Mésoporosité (adsorption-désorption d'azote) : 25 Surface des micropores : 523 m2.g-i
Volume microporeux : 0,27 cm3 g 1 Macroporosité (porosimétrie mercure) : Volume d'intrusion : 1,73 cm3 g 1 Porosité : 74 % 30 Densité apparente : 0,43 g.cm3 Densité du squelette : 1,64 g.cm3 B10011FR 24 La fonctionnalisation du monolithe de carbone MS40carb par le bioélectrocatalyseur a ensuite été effectuée selon les procédés suivants : Le monolithe de carbone a été collé sur une électrode en carbone vitreux de 5 mm de diamètre (GC electrode, Pine, USA), au moyen d'une peinture conductrice en carbone puis soumis à un plasma d'oxygène 1 Torr pendant 15 minutes. L'électrode modifiée par le monolithe de carbone a été trempée dans une solution de 1,7 mg/ml de BOD dans un tampon 20 mM phosphate de pH 7,2, pendant une heure trente minutes. io On a ainsi obtenu un capteur enzymatique BOD-MS40carb conforme à l'invention. A titre d'exemple comparatif n°1, on a préparé une électrode en carbone vitreux (CV) de 5 mm de diamètre (Pine Research Instrumentation, Raleigh, North Carolina, USA) que l'on a imprégnée par 5 µl de solution aqueuse de BOD à
15 20 mg/mL. On a obtenu un capteur enzymatique non conforme à l'invention, dénommé BOD-CV. A titre d'exemple comparatif n°2, on a préparé un autre biocapteur non conforme à l'invention à partir du monolithe MS40carb, comprenant la bilirubine
20 oxydase et un médiateur rédox, à savoir un copolymère de poly(N-vinylimidazole) et de poly(acrylamide) complexé à [Os (4,4'-dichloro-2,2'-bipyridine)2Cl]+iz+ (PAA-PVI-bipy). Dans ce cas, la bilirubine oxydase n'est pas directement adsorbée à la surface interne des macropores du monolithe, mais fixée à la surface des macropores, par l'intermédiaire du médiateur rédox. Dans ce cas, le monolithe de
25 carbone MS40carb a été imprégné par 66,6 µg d'un mélange constitué de 51,6 µg de PAA-PVI-bipy , de 10,0 µg de BOD et de 5,0 µg PEGDGE (400) On a ainsi obtenu un capteur enzymatique ne faisant pas partie de l'invention, dénommé BOD-Médiateur-MS40carb. Ces trois capteurs ont ensuite été testés pour la détection de 02 en milieu 30 liquide. Les mesures ont été réalisées avec un bipotentiostat (CH-Instrument, Détecteur électrochimique modèle CHI832) relié à un ordinateur. La température du milieu liquide, constitué par une solution tampon 20 mM phosphate, a été régulée à 37,5°C à l'aide d'un bain thermostaté (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Les capteurs enzymatiques BOD-MS40carb, BOD-Médiateur-MS40carb ou B10011FR 25 BOD-CV ont été maintenus en mouvement dans le tampon à l'aide d'un agitateur Pine Instrument® (Austin T , USA). Les mesures ont été effectuées dans une cellule électrochimique à bain d'eau. Les mesures des potentiels ont été faites avec une électrode de référence 5 commerciale Ag/AgCI (3 M KCl) (société BAS) et en utilisant une électrode de platine (société BAS) comme contre électrode. Les résultats obtenus avec les capteurs enzymatiques BOD-MS40carb, BOD-Médiateur-MS40carb et BOD-CV sont reportés sur la figure 6 annexée sur laquelle la densité du courant (en µA) est fonction du potentiel électrique (en volt). 10 Sur cette figure, la courbe en trait épais continu représente l'électroréduction de 02 en H2O obtenue avec le capteur BOD-MS40Carb conforme à l'invention, la courbe en trait discontinu représente l'électroréduction de 02 en H2O obtenue avec le capteur BOD-Médiateur-MS40Carb ne faisant pas partie de l'invention et la courbe en trait fin continu correspond à l'enregistrement effectué avec le biocapteur
15 BOD-CV ne faisant pas non plus partie de l'invention. On constate que le capteur BOD-MS40Carb conforme à l'invention, c est à dire dans lequel l'enzyme est en contact direct avec le graphite semi-graphitisé de la paroi des macropores, permet d'obtenir de meilleurs résultats que le capteur BOD-Médiateur-MS40Carb ne faisant pas partie de l'invention et dans lequel l'enzyme est fixée à la paroi des
20 macropores par l'intermédiaire d'un médiateur rédox. On constate par ailleurs que le courant est négligeable lorsque le capteur BOD-CV est utilisé.

Claims (14)

  1. REVENDICATIONS1. Electrode électrochimique poreuse, caractérisée en ce qu'elle est constituée d'un matériau solide alvéolaire se présentant sous la forme d'un monolithe de carbone semi-graphitisé comportant un réseau poreux hiérarchisé exempt de mésopore et comprenant des macropores ayant une dimension moyenne dA de 1 gm à 100 µm, et des micropores ayant une dimension moyenne di de 0,7 à 1,5 nm, lesdits macropores et macropores étant interconnectés, et en ce que les macropores renferment au moins une espèce électroactive en contact direct avec le carbone semi-graphitisé constituant la surface des macropores.
  2. 2. Electrode selon la revendication 1, caractérisée en ce que les parois des macropores du monolithe de carbone semi-graphitisé ont une épaisseur de 0,5 à 40 µm.
  3. 3. Electrode selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que les macropores ont un diamètre de 4 à 70 µm.
  4. 4. Electrode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la surface spécifique du monolithe de carbone semigraphitisé est de 400 à 900 m2/g.
  5. 5. Electrode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que les espèces électroactives sont choisies parmi les enzymes comportant un centre rédox, les acides nucléiques, les anticorps, les antigènes, et les polymères conducteurs.
  6. 6. Electrode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que l'espèce électroactive est une enzyme comportant un centre rédox et est choisie parmi les oxydoréductases.
  7. 7. Electrode selon la revendication 7, caractérisée en ce que les macropores du monolithe de carbone renferment au moins un cofacteur choisi parmi les coenzymes d'oxydoréduction et les cations métalliques.
  8. 8. Electrode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la quantité d'espèce électroactive immobilisée varie de 0,01 à 7 % massique par rapport à la masse totale de l'électrode électrochimique.
  9. 9. Procédé de préparation d'une électrode électrochimique telle que définie à l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comporte une étape d'imprégnation d'un monolithe de carbone semi-graphitisé comportant un réseau poreux hiérarchisé exempt de mésopore et comprenant desB10011FR 2 7 macropores ayant une dimension moyenne dA de 1µm à 100 µm, et des micropores ayant une dimension moyenne di de 0,7 à 1,5 nm, lesdits macropores et micropores étant interconnectés, par une solution aqueuse ou une dispersion aqueuse d'au moins une espèce électroactive, étant entendu que ledit procédé ne comporte pas d'étape de fonctionnalisation de la surface des macropores par un médiateur rédox.
  10. 10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'étape d'imprégnation est réalisée sous vide.
  11. 11. Procédé selon la revendication 9 ou 10, caractérisé en ce que l'espèce électroactive est une enzyme oxydoréductase, et que le cofacteur est un co-enzyme d'oxydoréduction ne faisant pas partie intégrante de l'enzyme ou des cations métalliques, alors la solution aqueuse ou la dispersion aqueuse utilisée pour imprégner le monolithe de carbone semi-graphitisé comprend en outre au moins un coenzyme d'oxydoréduction ou des cations métalliques
  12. 12. Utilisation d'une électrode électrochimique telle que définie à l'une quelconque des revendications 1 à 8, à titre de biocapteur pour la détection d'analytes en milieu liquide ou pour la fabrication d'une biopile.
  13. 13. Biocapteur, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une électrode électrochimique telle que définie à l'une quelconque des revendications 1 à 8.
  14. 14. Biopile comprenant une électrode positive et une électrode négative reliées entre elles par un circuit électrique, ladite biopile étant caractérisée en ce qu'au moins une des deux électrodes est une électrode électrochimique telle que définie à l'une quelconque des revendications 1 à 8.
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