FR2952373A1

FR2952373A1 - Controle de la fertilite humaine via dpy19l2

Info

Publication number: FR2952373A1
Application number: FR0957963A
Authority: FR
Inventors: Pierre Ray; Christophe Arnoult
Original assignee: Universite Joseph Fourier Grenoble 1
Current assignee: Universite Joseph Fourier Grenoble 1
Priority date: 2009-11-12
Filing date: 2009-11-12
Publication date: 2011-05-13
Anticipated expiration: 2029-11-12
Also published as: EP2499497A1; US20120283126A1; FR2952373B1; WO2011058280A1

Abstract

La présente demande de brevet concerne un procédé de diagnostic ou de pronostic d'une infertilité liée à la protéine DPY19L2, chez un sujet de sexe masculin, ainsi qu'un procédé de traitement d'un tel sujet visant à rétablir la fertilité. La présente invention concerne également l'utilisation de molécules inhibant l'action du polypeptide DPY19L2 chez un sujet de sexe masculin de type sauvage, par exemple de type acides nucléiques interférants anti-DPY19L2 inhibant sélectivement l'expression du polypeptide DPY19L2.

Description

Actuellement, les seuls contraceptifs oraux disponibles sont les contraceptifs féminins hormonaux de type oestro-progestatifs. La spermatogénèse est une fonction hautement spécialisée qui représente une bonne cible pour le développement de méthodes contraceptives alternatives. Très peu de gènes ont jusqu'à présent pu être mis en rapport avec des troubles de la spermatogénèse. Il a été démontré dans les années 1970 que des microdélétions du chromosome Y entraînaient une oligozoospermie (réduction du nombre de spermatozoïdes) ou une azoospermie (absence de spermatozoïdes). La complexité de la région qui est constituée de séquences répétées n'a pas permis d'établir un rôle clair pour les gènes localisés dans cette région. Depuis cette découverte et jusqu'en 2003, aucun gène humain n'a pu être formellement associé à un défaut de la spermatogénèse chez l'homme. En 2003, Xu Min et collaborateurs ont identifié un nouveau gène impliqué dans la spermatogénèse : SPATA16/NYD-SP12 (Xu Min et al., 2003). Ce gène, lorsqu'il est muté, donne un phénotype rare d'infertilité : la globozoospermie (Dam et al. 2007 ; WO2009/013405). Par ailleurs, en 2007, Dieterich et collaborateurs ont démontré que l'absence de protéine fonctionnelle Aurora Kinase C (AURKC) par la mutation c.144delC entraînait une infertilité primaire par production de spermatozoïdes macrocéphales (Dieterich et al., 2007).

Les inventeurs de la présente invention ont mis en évidence un nouveau gène impliqué dans la spermatogénèse : DPY19L2. Une délétion

homozygote complète du gène conduit à un phénotype de globozoospermie, phénotype totalement incompatible avec une reproduction naturelle. Le gène DPY-19 a été décrit comme étant impliqué dans la polarité des neuroblastes et leur migration selon l'axe antéro-postérieur chez la levure C. elegans (Honigberg et al., 2000). Néanmoins jusqu'à ce jour, DPY19L2 n'a jamais été décrit comme étant impliqué dans la spermatogénèse et l'infertilité humaine. Les inventeurs ont démontré que la protéine DPY19L2 est nécessaire à la formation de l'acrosome et à l'élongation de la tête des spermatozoïdes. En effet, en l'absence de protéine DPY19L2, les spermatozoïdes sont dépourvus d'acrosome et ne peuvent pas pénétrer dans l'ovule en vue de la fécondation. Ainsi le sujet porteur de la mutation, conduisant à une absence totale de protéine DPY19L2 ou à une protéine DPY19L2 mutante, présente une infertilité liée à l'absence du gène DPY19L2.

En outre, les patients qui présentent un tel phénotype ne présentent pas de problèmes de santé autre que leur infertilité, ce qui fait de DPY19L2 une cible de choix dans le cadre de la mise au point d'un contraceptif masculin.

Description de l'invention La présente invention concerne un polypeptide DPY19L2 caractérisé en ce qu'il comprend un polypeptide choisi parmi : - le polypeptide de la séquence SEQ ID No. 1 ; - un polypeptide comportant une fonction dans la formation de 25 l'acrosome du spermatozoïde et une séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID No. 1. La présente invention concerne aussi un polynucléotide codant le polypeptide DPY19L2 selon l'invention. Selon un mode de réalisation, ce polynucléotide est caractérisé en ce qu'il a la séquence SEQ ID No. 2 ou la 30 séquence complémentaire de SEQ ID No. 2. L'invention concerne également un polypeptide codé par la séquence nucléotidique se trouvant sur le chromosome 12 humain entre le

nucléotide 63,952,693 et le nucléotide 64,062,354 du numéro d'accession NCBI : NC_000012.11, entre les gènes AVPRIA et TMEM5 (Figure 3). Selon un mode de réalisation de l'invention, le polypeptide est utilisé chez un sujet humain de sexe masculin en vue de restaurer une spermatogénèse fonctionnelle. L'invention concerne aussi un anticorps spécifique du polypeptide DPY19L2 selon l'invention. L'invention concerne également un procédé de diagnostic ou de pronostic d'une infertilité de type globozoospermie liée à DPY19L2 chez un sujet humain du sexe masculin, le gène DPY19L2 étant situé en 12q14.2, ledit procédé comprenant une étape consistant à détecter, dans un échantillon biologique dudit sujet la présence ou l'absence d'un polynucléotide se trouvant sur le chromosome 12 entre le nucléotide 63,952,693 et le nucléotide 64,062,354 du numéro d'accession NCBI : NC 000012.11.

L'invention concerne aussi : une cassette d'expression comprenant un promoteur fonctionnel, un polynucléotide selon l'invention et une séquence terminatrice ; et un vecteur comprenant le polynucléotide selon l'invention et/ou une cassette d'expression selon l'invention, par exemple pour son utilisation pour traiter un sujet de sexe masculin présentant une infertilité lié à DPY19L2. L'invention concerne aussi une molécule inhibant l'expression ou l'action du polypeptide DPY19L2 selon l'invention, chez un sujet de sexe masculin de type sauvage. Selon un mode de réalisation de la présente invention, il s'agit d'un acide nucléique interférant de type ADN ou ARN, anti- DPY19L2 inhibant sélectivement l'expression du polypeptide DPY19L2 chez un sujet de sexe masculin de type sauvage. Selon un mode de réalisation, cette molécule est utilisée en tant que moyen contraceptif chez un sujet de sexe masculin de type sauvage. Enfin, l'invention concerne un support solide de type puce, sur lequel se trouve fixé le polypeptide selon l'invention ou le polynucléotide selon l'invention.

Description des fiqures

Figure 1 : images de microscopie confocale (A, D, G), microscopie électronique (B, E, H) et scan de microscopie (C, F, I) de spermatozoïdes contrôles (A, B, C), spermatozoïdes globozoocéphales sans acrosome (D, E, F) et spermatozoïdes globozoocéphales présentant un acrosome atrophié ou mal placé (G, H, I).

Figure 2 : amplification PCR de 7 loci du gène DPY19L2 (bandes a) à g)) de 10 patients présentant une globozoospermie (P1-P9 et P6f) et de 4 patients fertiles (T1-T4) ; les loci situés dans le gène (c, d et e) ne sont pas amplifiés, ainsi que les loci b et f ; la délétion est délimitée par les loci a et g qui donnent une amplification similaire entre les patients et les contrôles.

Figure 3 : représentation schématique du gène DPY19L2 ; les loci a) et b) sont localisés approximativement à 9 et 25 kb de l'extrémité 3' de DPY19L2 ; les loci c), d) et e) montrent respectivement la position des exons 22, 11 et 1 du gène DPY19L2 ; les régions 1 et 2 représentent des séquences dupliquées de 28kb avec 98% d'homologie localisées de part et d'autre du gène DPY19L2 et suggèrent que les délétions résultent d'un phénomène de recombinaison homologue. Le schéma en bas de page montre la délétion présente chez les patients mutés. Les amorces h permettent d'amplifier uniquement chez les patients délétés un fragment de 1450 nt qui comprend les points de cassures de la délétion.

Figure 4 : amplification PCR en utilisant les amorces h de 8 patients (P1, P2, P4, P5, P6, P7, P8 et P9) et 7 témoins (Ti à T7).

Figure 5 : Analyse par CGH (comparative genomic hybridation) du patient P1 430 Description des séquences

SEQ ID No. 1 : Séquence peptidique de DPY19L2 (numéro d'accession NCBI : NC 000012.11) SEQ ID No. 2 : Séquence ADNc de DPY19L2 (numéro d'accession NCBI : NC 000012.11) SEQ ID Nos. 3-18 : Amorces pour clonage

Polypeptides L'invention a pour objet des polypeptides DPY19L2 présentant une fonction dans la formation de l'acrosome du spermatozoïde, ainsi que dans l'élongation de la tête du spermatozoïde. Comme expliqué plus haut, les inventeurs ont démontré que la protéine DPY19L2 est nécessaire à la formation de l'acrosome et à l'élongation de la tête des spermatozoïdes. En effet, en l'absence de protéine DPY19L2, les spermatozoïdes sont dépourvus d'acrosome et ne peuvent pas pénétrer dans l'ovule en vue de la fécondation. Ainsi le sujet porteur de la mutation, conduisant à une absence totale de protéine DPY19L2 ou à une protéine DPY19L2 mutante, présente une infertilité liée à l'absence du gène DPY19L2. Des expériences d'immunohistochimie ont permis de confirmer que l'acrosome chez les patients présentant une délétion pour DPY19L2 était soit complètement absent, soit atrophié et mal placé sur le spermatozoïde.

Les inventeurs ont, en outre, démontré que la globozoospermie de certains patients est liée à l'absence de protéine DPY19L2 sur le chromosome 12 (en 12g14.2 ; plus précisément sur le chromosome 12 entre le nucléotide 63,952,693 et le nucléotide 64,062,354 du numéro d'accession NCBI : NC 000012.11) entre les gènes AVPRIA et TMEM5 (Figure 3).

Le polypeptide DPY19L2 de l'invention est représenté à la séquence SEQ ID No. 1 dans le listage de séquences. 5

L'invention a également pour objet des polypeptides comportant une fonction dans la formation de l'acrosome du spermatozoïde et présentant au moins 80 % d'identité avec le polypeptide de la SEQ ID No. 1. L'invention a aussi pour objet des polypeptides présentant au moins 90%, 95%, 98% et préférentiellement au moins 99% d'acides aminés identiques avec le polypeptide de la SEQ ID No. 1. Par « acides aminés identiques », on entend des acides aminés invariants entre deux séquences. Ces polypeptides peuvent présenter une délétion, une addition ou une substitution d'au moins un acide aminé par rapport au polypeptide de la SEQ ID No. 1. L'invention a également pour objet des polypeptides présentant au moins 80 %, 90%, 95%, 98% et préférentiellement au moins 99% de similarité avec le polypeptide de la SEQ ID No. 1. Par « similarité », on entend la mesure de la ressemblance entre séquences protéiques ou nucléiques. Ces polypeptides peuvent présenter une délétion, une addition ou une substitution d'au moins un acide aminé par rapport au polypeptide de la SEQ ID No. 1. Le degré de similarité entre deux séquences, quantifié par un score, est basé sur le pourcentage d'identités et/ou de substitution conservatrices des séquences. Les méthodes de mesure et d'identification du degré d'identité et du degré de similarité entre polypeptides sont connues de l'homme du métier. On peut employer par exemple Vector NTi 9.1.0, programme d'alignement A I i g n X (Clustal W algorithm) (Invitrogen INFORMAX, http://www.invitrogen.com). De préférence, on utilise les paramètres par défaut.

L'invention concerne également un polypeptide codé par la séquence nucléotidique se trouvant sur le chromosome 12 humain entre le nucléotide 63,952,693 et le nucléotide 64,062,354 du numéro d'accession NCBI : NC_000012.11 entre les gènes AVPRIA et TMEM5 (Figure 3). L'invention concerne aussi un polypeptide DPY19L2 selon l'invention pour son utilisation chez un sujet humain de sexe masculin en vue de restaurer une spermatogénèse fonctionnelle.

Polynucléotides L'invention concerne aussi des polynucléotides codant pour le polypeptide DPY19L2 selon l'invention. De préférence, ces polynucléotides codent le polypeptide de la séquence SEQ ID No. 1.

Selon la présente invention, on entend par « polynucléotide » une chaîne nucléotidique simple brin ou son complémentaire pouvant être de type ADN ou ARN ou une chaîne nucléotidique double brin (ADN). De préférence, les polynucléotides de l'invention sont de type ADN, notamment d'ADN double brin. Le terme « polynucléotide » désigne également les polynucléotides modifiés. L'invention se rapporte de manière générale aux polynucléotides codant pour les polypeptides selon l'invention. En raison de la dégénerescence du code génétique, différents polynucléotides peuvent coder pour un même polypeptide. Les polynucléotides de la présente invention sont isolés, amplifiés ou purifiés de leur environnement naturel. De préférence, les polynucléotides de la présente invention peuvent être préparés par les techniques classiques de biologie moléculaire telles que décrites par Sambrook et al. (T. Maniatis, E.F. Fritsch, J. Sambrook, Molecular Cloning: A laboratory Handbook, 1982) ou par synthèse chimique.

Dans un mode de réalisation de la présente invention, le polynucléotide codant pour le polypeptide DPY19L2 comporte la séquence SEQ ID No. 2 ou la séquence complémentaire de SEQ ID No. 2. L'invention concerne également la séquence nucléotidique se trouvant sur le chromosome 12 humain entre le nucléotide 63,952,693 et le nucléotide 64,062,354 du numéro d'accession NCBI : NC_000012.11.Cette séquence nucléotidique se situe entre les gènes AVPRIA et TMEM5 (Figure 3).

Diaqnostic et pronostic La présente invention concerne également un procédé de diagnostic ou de pronostic d'une infertilité de type globozoospermie liée à DPY19L2 chez un sujet de sexe masculin. Ce procédé comprend une étape

qui consiste à détecter la présence ou l'absence d'un polynucléotide se trouvant sur le chromosome 12 entre le nucléotide 63,952,693 et le nucléotide 64,062,354 du numéro d'accession NCBI : NC_000012.11. Ce polynucléotide se situe entre les gènes AVPRIA et TMEM5 (Figure 3).

En d'autres mots, le procédé de l'invention comprend une étape qui consiste à détecter la présence du polynucléotide codant le polypeptide DPY19L2 selon l'invention, ou d'un fragment de celui-ci, dans un échantillon biologique dudit sujet. Alternativement, le procédé comprend une étape qui consiste à détecter l'absence du polynucléotide codant le polypeptide DPY19L2 selon l'invention. Selon une autre alternative, le procédé comprend une étape qui consiste à détecter la présence d'un polynucléotide DPY19L2 muté. Le procédé comprend des étapes et des moyens pour déterminer si le gène DPY19L2 d'un sujet de sexe masculin présente une délétion complète du gène DPY19L2 ou une séquence mutante du gène par rapport à la séquence du gène DPY19L2 humain sauvage. Le porteur du gène DPY19L2 sauvage présente un phénotype fertile, compatible avec une reproduction naturelle. Le procédé de l'invention permet donc de détecter la présence du gène DPY19L2 humain sauvage, du gène DPY19L2 humain muté ou l'absence du gène DPY19L2 humain, dans un échantillon biologique d'un sujet de sexe masculin. Si le sujet présente une délétion complète du gène DPY19L2 ou une séquence mutée du gène par rapport à la séquence du gène DPY19L2 humain sauvage, le diagnostic/pronostic d'infertilité ou de fertilité insuffisante en vue d'une reproduction naturelle peut être prononcé et les solutions visant à remédier à la situation peuvent être mises en place ou anticipées. Si le sujet présente un gène DPY19L2 humain sauvage, le diagnostic d'une infertilité est négatif, ce qui signifie que le sujet ne présente pas une infertilité de type globozoospermie liée à DPY19L2. Dans ce cas, le practicien cherchera éventuellement la présence ou l'absence d'autres marqueurs diagnostics.

Par « gène DPY19L2 muté » o u « polynucléotide DPY19L2 muté », on entend une séquence nucléotidique qui dérive du gène DPY19L2 humain sauvage par une délétion, addition ou substitution d'au moins un nucléotide de manière à coder pour une protéine DPY19L2 mutée. Cette au moins une délétion, addition ou substitution (ou ces délétions, additions et/ou substitutions) aura généralement lieu dans au moins une des séquences du gène. Par exemple elle peut avoir lieu dans une ou plusieurs des séquences codantes (CDS) du gène. Alternativement, elle peut avoir lieu dans les séquences non codantes du gène (en particulier, les séquences agissant sur l'epissage ou la régulation de l'expression du gène ou les séquences qui bornent les introns-exons). Le gène DPY19L2 comprend 22 exons. Un exemple de gène muté selon l'invention est un fragment du gène DPY19L2 humain sauvage, comprenant une partie mais pas la totalité du polynucléotide DPY19L2 humain sauvage dont il dérive, par exemple auquel il manque un exon par rapport à la séquence sauvage. Par « protéine DPY19L2 mutée » o u « polypeptide DPY19L2 muté », on entend une séquence aminoacide qui dérive de la protéine DPY19L2 humaine sauvage par une délétion, addition ou substitution d'au moins un aminoacide et qui, de ce fait a perdu sa fonction dans la formation de l'acrosome du spermatozoïde. Le diagnostic/pronostic se fait à partir d'un échantillon biologique d'un sujet de sexe masculin. La détection se fait en utilisant les techniques classiques de biologie moléculaire, connues de l'homme du métier, telles que décrites par Sambrook et al. (T. Maniatis, E.F. Fritsch, J. Sambrook, Molecular Cloning: A laboratory Handbook, 1982). Il est généralement nécessaire d'utiliser des sondes d'acides nucléiques, telles que décrites dans les exemples ci-dessous, plus particulièrement au Tableau 1. Les séquences de ces sondes SEQ ID Nos. 3-12 se trouvent dans le listage de séquences. Ainsi, selon un mode de réalisation de la présente invention, le procédé de l'invention comprend une étape consistant à détecter, dans un échantillon biologique d'un sujet la présence du polynucléotide codant le polypeptide DPY19L2 selon l'invention, la présence d'un fragment du

polynucléotide codant le polypeptide DPY19L2 selon l'invention, la présence d'un polynucléotide muté présentant au moins une mutation, par exemple une addition, une délétion ou une substitution d'au moins un nucléotide par rapport au polynucléotide codant le polypeptide DPY19L2 selon l'invention, et/ou l'absence du polynucléotide codant le polypeptide DPY19L2 selon l'invention, en utilisant une paire de sondes d'acides nucléiques spécifiques. Les sondes peuvent être spécifiques du polynucléotide codant le polypeptide DPY19L2 selon l'invention, d'un fragment de celui-ci ou du polynucléotide muté présentant au moins une mutation, par exemple une addition, une délétion ou une substitution d'au moins un nucléotide par rapport au polynucléotide codant le polypeptide DPY19L2 selon l'invention. La présente invention a, en outre, pour objet un réactif de diagnostic, caractérisé en ce qu'il est sélectionné dans le groupe constitué par les polynucléotides, les polypeptides et les anticorps selon l'invention.

La présente invention a également pour objet un procédé de diagnostic ou de pronostic d'une infertilité de type globozoospermie liée à DPY19L2 chez un sujet de sexe masculin, caracterisé en ce qu'il comprend la mise en contact d'un échantillon biologique dudit sujet, avec un réactif de diagnostic tel que défini ci-dessus, par exemple un anticorps, et la détection de la formation d'un complexe anticorps et polypeptide présent dans l'échantillon biologique.

Sondes La présente invention concerne également une paire de sondes ou amorces spécifiques du polynucléotide DPY19L2 humain sauvage selon l'invention, notamment celui représenté à la séquence SEQ ID No. 1 et permettant son amplification sélective dans des conditions de stringence suffisantes. On entend par « amorce » ou par « sonde », une courte séquence d'oligonucléotides qui, hybridée avec une matrice d'acides nucléiques, permet à une polymérase d'entamer la synthèse d'un nouveau brin de l'ADN. Le brin produit à partir de l'amorce est complémentaire au brin utilisé comme matrice.

La répétition de la synthèse par le processus de Polymerase Chain Reaction (PCR) permet d'obtenir des millions de copies de la séquence d'intérêt.

Cassettes d'expression et vecteurs Selon un mode de réalisation de l'invention, un polynucléotide codant pour un polypeptide selon l'invention est inséré dans une cassette d'expression en utilisant des techniques de clonage bien connues de l'homme du métier. Cette cassette d'expression comprend les éléments nécessaires à la transcription et à la traduction des séquences codant pour les polypeptides selon l'invention. Avantageusement, cette cassette d'expression comprend à la fois des éléments permettant de faire produire un polypeptide par une cellule hôte et des éléments nécessaires à la régulation de cette expression. Ces cassettes d'expression comprennent dans le sens de la transcription: - un promoteur fonctionnel; - un polynucléotide selon l'invention; et - une séquence terminatrice. Tout type de séquence promotrice peut être utilisée dans les cassettes d'expression selon l'invention. Le choix du promoteur dépendra notamment de l'organisme hôte choisi pour l'expression du gène d'intérêt. Certains promoteurs permettent une expression constitutive alors que d'autres promoteurs sont au contraire inductibles. La présente invention concerne également des vecteurs de réplication ou d'expression comprenant au moins un polynucléotide ou une cassette d'expression selon la présente invention. Ce vecteur peut notamment être constitué par un plasmide, un cosmide, un bactériophage ou un virus dans lequel est inséré un polynucléotide ou une cassette d'expression selon l'invention. Les techniques de construction de ces vecteurs et d'insertion d'un polynucléotide de l'invention dans ces vecteurs sont bien connues de l'homme du métier.

Les techniques de construction de vecteurs, de transformation d'organismes hôtes et d'expression de protéines hétérologues dans ces organismes sont décrites dans la littérature (Ausubel F.M. et al., "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes 1 et 2, Greene Publishing Associates et Wiley -Interscience, 1989; T.Maniatis, E.F.Fritsch, J.Sambrook, Molecular Cloning: A laboratory Handbook, 1982).

Molécules inhibiteurs La présente invention concerne également une molécule inhibant l'expression ou l'action du polypeptide DPY19L2 selon l'invention chez un sujet de sexe masculin de type sauvage. Cette molécule représente un moyen de contraception du sujet de sexe masculin. En effet, les spermatozoides sont dépourvus d'acosome ou présentent un acrosome non fonctionnel sous l'effet du traitement par la molécule inhibitrice. Cela résulte de l'action directe de la molécule sur le gène DPY19L2, l'ARNm issu de la transcription du gène DPY19L2 ou la protéine DPY19L2. La molécule selon l'invention peut en effet agir pour bloquer la transcription ou la traduction du gène DPY19L2. Elle peut alternativement bloquer l'action de la protéine conduisant ainsi soit à un acrosome complètement absent, soit un acrosome atrophié et mal placé sur le spermatozoïde. Dans un mode de réalisation de la présente invention, il s'agit d'une acide nucléique interférant de type ADN ou ARN, anti-DPY19L2 inhibant sélectivement l'expression du polypeptide DPY19L2 chez un sujet de sexe masculin de type sauvage. Il peut notamment s'agir de siARN ou de shARN.

L'invention concerne également une molécule selon l'invention pour son utilisation en tant que moyen contraceptif chez un sujet de sexe masculin de type sauvage. Enfin, l'invention concerne l'utilisation de la molécule selon l'invention dans la préparation d'un médicament contraceptif chez un sujet de sexe masculin de type sauvage.

Support solide

Les polynucléotides et les polypeptides de la présente invention peuvent être immobilisés sur un support solide. On connaît les supports solides adaptés à l'immobilisation de polynucléotides notamment pour la fabrication des puces à ADN. Il existe de nombreuses variétés de puces à ADN, qui se distinguent par le type de support utilisé, la nature, la densité et le mode de fixation ou de synthèse des séquences nucléotidiques sur le support, et les conditions de lecture. Ces techniques sont connues de l'homme du métier. On entend également par support solide des supports de type microsphères.

Anticorps La présente invention a également pour objet des anticorps, caracterisés en ce qu'ils sont dirigés contre l'un ou plusieurs des polypeptides DPY19L2 de la présente invention. Selon un mode de réalisation de l'invention, lesdits anticorps sont sélectionnés parmi les anticorps monoclonaux et les anticorps polyclonaux.

Exemples

La globozoospermie est un phénotype rare d'infertilité masculine primaire totale caractérisée par la production de spermatozoïdes dépourvus 5 d'acrosome (OMIM #102530). Les inventeurs ont récemment démontré que la stratégie de cartographie des homozygoties en utilisant un criblage sur l'étendue du génome appliqués à des patients infertiles issus du même milieu ethnico-géographique conduisait à la localisation et à l'identification de gènes impliqués dans la 10 spermatogénèse. Cette stratégie génétique a été appliquée à une cohorte de patients tunisiens présentant une globozoospermie totale. Les inventeurs ont démontré que 8 des 10 patients analysés présentaient une délétion homozygote pour DPY19L2.

15 Patients, matériel et méthode Patients Tous les sujets présentent des spermatozoïdes globozoospermiques (Figure 1). Toutes les analyses de sperme ont été réalisées au moins deux fois en accord avec les recommandations du World Health Organisation. Tous les 20 sujets comportent un caryotype somatique normal. Les patients P1 à P6, P8 et P9 (Figure 2 et Figure 4) sont tunisiens traités à Tunis pour infertilité, nés de la même famille, par exemple cousins germains. Le patient P7 est d'origine turque et résident en France. Il ne présente pas de consanguinité familiale. 25 Les patients P6 et P6f sont frères.

Analyses moléculaires L'ADN génomique est extrait des leucocytes du sang périphérique en utilisant une procédure d'extraction sur chlorure de guanidium ou à partir de salive en 30 utilisant le kit Oragene DNA Self-Collection (DNAgenotech, Ottawa Canada). Les sondes utilisées et les températures d'hybridation sont indiquées dans le tableau 1 ci-dessous : 14 Locus amplifié Séquences ADN 5' - 3' des sondes (F) et (R) Taille (nt) Température Hybridation (°C) a) 3'DPY19L2 F: CCCTCAAGCAATTCTCTTTG 288 60 b) 3'DPY19L2 (SEQ ID No 3) 444 60 R: GATTTGATTTGGGGCCTAA (SEQ ID No 4) F: GATTAAAGTTCTGGGGTGAG c) exon 22 (SEQ ID No 5) 313 57 R: GCAGCCTATTACTTCCGATA (SEQ ID No 6) F: GTGTCTGTTATTAAAGCTTGTG cl) exon 11 (SEQ ID No 7) 516 57 R: ATTGTCTCTAGACAGCAATACAT (SEQ ID No 8) F: AACCTCCTCAAGTGACTTAG e) exon 1 (SEQ ID No 9) 504 65 R : TTGGCCAAGAGTCATT (SEQ ID No 10) F: GGCCAACTTCTTTCTACTCGGAC f) 5'DPY19L2 (SEQ ID No 11) 610 58 R: GACCCAGCTCCACCATACTCCTT (SEQ ID No 12) F : CTACTATTGTCTCAACCAAATATGT g) 5'DPY19L2 (SEQ ID No 13) 750 65 R: GGAATTCAAGACTAGCCTAGAA (SEQ ID No 14) F : GGCATGGAAGTTACCACAAGAA h) DPY19L2 (SEQ ID No 15) 1450 60 R : GTTACACCACTGGCCGTCTC (SEQ ID No 16) F : AAATCTAGACACAGTCACAGCATCATC point de (SEQ ID No 17) cassure R: AGAGGCTTAATAGGTGAAAGAAAGAGA (SEQ ID No 18)

35 cycles d'amplification PCR ont été réalisés en utilisant la Taq polymérise (Qiagène, Courtaboeuf, France). Le séquençage est réalisé en utilisant BigDye Terminator v3.1 (Applied Biosystems). Les électrophorèses sont réalisées sur ABI 3130XL (Applied Biosystems).

Analyses de microarray Les microarrays 250K Styl SNP (Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA) ont été appliqués sur les patients P1-P9 selon les recommandations du fabricant. Les analyses ont été réalisées à l'IGBMC (Strasbourg).

Microscopie électronique Les spermatozoïdes ont été fixés avec du glutaraldéhyde à 2.5% dans 0.1M de tampon cacodylate pH 7.4 pendant 2 heures à température ambiante. Les cellules ont ensuite été lavées avec du tampon, et post-fixées avec du tétroxyde d'osmium à 1% dans le même tampon pendant 1 heure à 4°C. Après un lavage extensive avec de l'eau, les cellules ont été fixées avec de l'acétate d'uranile à 0,5% pH 4 pendant la nuit à 4°C. Les cellules sont ensuite déshydratées en utilisant un gradient d'alcool (30%-60%-90%-100%- 100%-100%) et infiltrées avec un mélange 1/1 epon/alcool 100% pendant une heure avant plusieurs lavages d'epon frais (Flukka) pendant 3 heures. Enfin, les cellules sont centrifugées et immergées dans de l'epon frais et polymérisées pendant 3 jours à 60°C. Des sections ultrafines des cellules sont réalisées en utilisant un ultra microtome (Leica). Les sections sont post-fixées avec de l'acétate d'uranile à 4% and du citrate de plomb à 1% avant d'être observées au microscope électronique à 80 kV (JEOL 1200EX).

Résultats Analyses phénotypiques détaillées Les 10 patients décrits ici présentent une globozoospermie totale avec 100% de spermatozoïdes à tête ronde et un taux de défauts flagellaires augmenté

(40%). Tous les patients présentaient un volume de sperme normal (4.6m1). La concentration du sperme était normale chez 7 patients (52-126 Million/ml) et les patients P5, P7 and P8 avaient de sévères oligozoospermie comprises entre 0.02-1.5 M/ml. La mobilité moyenne et morbidité des 7 premiers patients étaient de 27.5%, valeur supérieure à la moyenne. Le MAI, ou « Multiple anomalies index », était élevé avec une moyenne de 2.5. Des analyses additionnelles ont été réalisées sur le patient P1. Un double marquage du noyau et de l'acrosome avec TOPRO-3 and des lectines de Pisum savitum respectivement, montrent des noyaux parfaitement ronds (Figure 1 D, G), sans acrosome (marquage réalisé à la PSA-FITC, non montré - Figure 1 D) ou des foyers d'acrosome mal placés, à la périphérie du noyau (marquage réalisé à la PSA-FITC, non montré - Figure 1G). La microscopie électronique à transmission a confirmé la présence de noyaux ronds (Figure 1 E, H). Les photographies montrent que le contour des spermatozoïdes ronds n'est pas lisse (Figure 1 F, I). La surface du sperme apparaît ridée par ce qui pourrait être une membrane plasmique trop peu tendue ou une membrane d'acrosome pratiquement vide. L'irrégularité de cette membrane externe peut être vue sur la photographie 1H.

Localisation du qène candidat Un criblage sur l'étendue du génome de 9 patients atteints a été réalisé en utilisant des puces à SNP Affimetrix (250K Styl SNP arrays). Des régions d'homozygotie communes ont été recherchées. 7 patients partageaient une région homozygote comprise entre 0.4 et 54 millions de nucléotides (MB) centrée en 12q14.2. 4 gènes candidats étaient présents dans la région d'homozygotie. L'étude in silico du profil d'expression de ces 4 gènes candidats a mis en évidence le fait que DPY19L2 est exprimé de façon prédominante dans les testicules.

Identification de la mutation Les amorces c, d et e permettent de détecter la présence de la délétion homozygote du gène DPY19L2. La PCR chez les patients délétés est

négative avec ces amorces. Les amorces a, f permettent de borner la délétion et servent de contrôle positif d'amplification chez les patients. Les amorces h permettent d'amplifier la délétion récurente retrouvée chez les patients globozoocéphales. Cette PCR est donc positive chez les hommes atteints et négative chez les hommes sains. Par ailleurs, elles permettent de dépister les individus porteurs d'une délétion présente à l'état hétérozygote : PCR c,d,e positive et PCR h positive.

L'amplification PCR des exons DPY19L2 montrait que le gène était déléte chez tous les patients sauf P7 et P8, le patient P7 étant le patient d'origine turque. La plus petite région d' homozygotie utilisée pour localiser (et identifier) le gène candidat était celle du patient P7. De façon logique, le patient P6f, recruté à un stade ultérieur, présentait également une délétion homozygote du gène DPY19L2. Des amplifications subséquentes de chaque côté du gène ont permis to déterminer deux points de ruptures de 15 KB localisés de chaque côté de DPY19L2 (Figure 3). La délétion inclut approximativement une région de 200KB abritant seulement le gène DPY19L2. La PCR avec les amorces f permet d'amplifier la région délétée chez les patients et donc de réaliser le diagnostique d'hétérozygotie et d'homozygotie. L'amplification PCR de deux exons (1 and 11) a été réalisée sur 100 patients contrôles fertiles Nord africains. Aucun n'était homozygote délété pour DPY19L2. Par ailleurs, les données épidémiologiques présentées dans le T a b l e a u 2 c i-dessous (données publiques obtenues à partir de http://cnv.chop.edu/) montrent que la délétion décrite est présente à l'état hétérozygote dans les trois population étudiées. La fréquence de la délétion pourrait être particulièrement élevée chez les asiatiques.30

Tableau 2 récapitulatif des amplifications au locus DPY19L2 en fonction du génotype des patients (voir Figures 2 et 4) : Gène DPY19L2 PCR a b c d e f g h Individu non-délété + + + + + + + - Individu hétérozygote + + + + + + + + Homme infertile + - - - - - + + globozoocéphale délétion homozygote DPY19L2 Analyse par CGH (comparative qenomic hybridation) Une CGH sur Agilent 4x1 80K a été réalisée sur le patient P1. L'analyse confirme la présence d'une délétion homozygote de DPY19L2 mais l'analyse ne permet pas de délimiter l'étendue de la délétion du à la rareté de sondes dans cette région particulière du microarray Agilent (Figure 5). Discussion Les données épidémiologiques sont présentées dans le Tableau 2 ci-dessous (données publiques obtenues à partir de http://cnv.chop.edu/) : Nombre de Nombre Fréquence Fréquence sujets d'hétérozygotes d'hétérozygotes attendee d'homozygotes Africains 693 2 1/ 347 1/ 481 636 Européens 1321 13 1/ 102 1/ 41 616 Asiatiques 12 1 1/ 12 1/ 576 TOTAL 2026 16 1/ 127 1/ 64 516

La prévalence attendue chez les européens est de 1/41 616.

Aucune information n'est disponible sur la fonction de DPY19L2. Chez l'être humain, les seules données disponibles proviennent d'analyse de bibliothèques cDNA qui indiquent que le transcrit DPY19L2 est principalement dans les testicules (données publiques obtenues à partir de http://www.cgl.ucsf.edu/P.esearch/genentech/genehubmgegis/genehubmgegism search.html .showinq).

D'après sa séquence on prédit que DPY19L2 est une protéine membranaire car elle contient 11 domaines transmembranaires.

Références

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Dam, A.H., Koscinski, I., Kremer, J.A., Moutou, C., Jaeger, A.S., Oudakker, A.R., Tournaye, H., Charlet, N., Lagier-Tourenne, C., van Bokhoven, H. and Viville, S. (2007) Homozygous mutation in SPATA16 is associated with male infertility in human globozoospermia. Am J Hum Genet, 81, 813-820.

Dieterich, K., Soto Rifo, R., Faure, A.K., Hennebicq, S., Ben Amar, B., Zahi, M., Perrin, J., Martinez, D., Sele, B., Jouk, P.S., Ohlmann, T., Rousseaux, S., Lunardi, J. and Ray, P.F. (2007) Homozygous mutation of AURKC yields large-headed polyploid spermatozoa and causes male infertility. Nat Genet, 39, 661-665.

Honigberg L., Kenyon C. Establishment of left/right asymmetry in neuroblast migration by UNC-401DCC, UNC-73/Trio and DPY-19 proteins in C. elegans.

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Carson A.R., Cheung J., Scherer S.W. Duplication and relocation of the functional DPY19L2 gene within low copy repeats. BMC Genomics 2006;7:45. 21

Claims

REVENDICATIONS1. Polypeptide DPY19L2 caractérisé en ce qu'il comprend un polypeptide choisi parmi : - le polypeptide de la séquence SEQ ID No. 1 ; - un polypeptide comportant une fonction dans la formation de l'acrosome du spermatozoïde et une séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID No. 1.
2. Polynucléotide codant le polypeptide DPY19L2 selon la revendication 1.
3. Polynucléotide selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il a la séquence SEQ ID No. 2 ou la séquence complémentaire de SEQ ID No. 2.
4. Polypeptide codé par la séquence nucléotidique se trouvant sur le chromosome 12 humain entre le nucléotide 63,952,693 et le nucléotide 64,062,354 du numéro d'accession NCBI : NC 000012.11. 20
5. Procédé de diagnostic ou de pronostic d'une infertilité de type globozoospermie liée à DPY19L2 chez un sujet humain du sexe masculin, le gène DPY19L2 étant situé en 12q14.2, ledit procédé comprenant une étape consistant à détecter, dans un échantillon biologique dudit sujet la présence ou l'absence d'un polynucléotide se trouvant sur le chromosome 12 entre le 25 nucléotide 63,952,693 et le nucléotide 64,062,354 du numéro d'accession NCBI : NC 000012.11.
6. Cassette d'expression caractérisée en ce qu'elle comprend dans le sens de la transcription: 30 - un promoteur fonctionnel; - un polynucléotide selon la revendication 2 ou 3; et - une séquence terminatrice.15
7. Vecteur comprenant un polynucléotide selon la revendication 2 ou 3 et/ou une cassette d'expression selon la revendication 5.
8. Vecteur selon la revendication 6, pour son utilisation pour traiter un sujet de sexe masculin présentant une infertilité lié à DPY19L2.
9. Molécule inhibant l'expression ou l'action du polypeptide DPY19L2 selon la revendication 1, chez un sujet de sexe masculin de type sauvage, consistant 10 en un acide nucléique interférant de type ADN ou ARN, anti-DPY19L2.
10. Molécule selon la revendication 9, pour son utilisation en tant que moyen contraceptif chez un sujet de sexe masculin de type sauvage. 15
11. Support solide de type puce, sur lequel se trouve fixé le polypeptide de la revendication 1 ou le polynucléotide de la revendication 2.
12. Anticorps spécifique du polypeptide DPY19L2 selon la revendication
13. Polypeptide selon la revendication 1, pour son utilisation chez un sujet humain de sexe masculin en vue de restaurer une spermatogénèse fonctionnelle. 1. 20 25