FR2923610A1 - Methode non-invasive de recueil de donnees biologiques pour l'etablissement d'un diagnostic d'une pathologie cutanee. - Google Patents

Abstract

L'invention se rapporte à une méthode non-invasive de recueil de données biologiques utiles pour l'établissement d'un diagnostic ou d'un pronostic d'une pathologie cutanée particulière chez un patient, caractérisée en ce que:a) on prélève un échantillon cutané contenant du matériel biologique, par application sur la peau dudit patient d'une couche d'adhésif, puis par retrait dudit adhésif,b) on détecte par spectrométrie de masse dans ledit échantillon au moins une protéine dont la présence, l'absence, ou la variation de quantité ou de concentration par rapport à une valeur standard est associée à la présence, à l'évolution ou à l'absence d'une pathologie cutanée particulière.Une telle méthode est particulièrement adaptée pour l'établissement d'un diagnostic ou d'un pronostic du psoriasis.

Description

L'invention a trait à l'utilisation de la spectrométrie de masse à partir d'un prélèvement cutané non invasif pour l'aide au diagnostic, au pronostic ou au suivi-thérapeutique des pathologies cutanées, telle que le psoriasis. L'invention concerne plus particulièrement une méthode d'analyse d'un échantillon des couches supérieures de l'épiderme.

Les diagnostics des pathologies cutanées sont généralement pratiqués par biopsie ou par un examen local des symptômes cutanés, un tel examen impliquant l'évaluation visuelle des zones montrant une inflammation. Bien évidemment une méthode non-invasive, telle que l'examen visuel, est plus avantageuse que des biopsies en termes de coûts, de temps ainsi que de confort pour le patient. Cependant dans certains cas il est difficile de distinguer effectivement par simple examen visuel entre certaines pathologies de la peau, particulièrement certains désordres cutanés s'accompagnant d'une hyper kératinisation (présence de squames abondants). Ainsi, des erreurs de diagnostic peuvent avoir lieu en particulier lorsque les pathologies en question ne présentent que des symptômes préliminaires ou peu développés. En cas d'erreur de diagnostic, le patient peut devoir faire face à une succession de traitements inefficaces, ce qui est bien sûr à éviter. Par ailleurs une succession de traitements inefficaces peut également avoir pour résultat l'abandon de tout traitement par le patient.

De plus, en matière de pathologie cutanée et en particulier de psoriasis, différents patients peuvent répondre de manière différente à un même traitement même si le diagnostic est correct. Généralement pour des pathologies cutanées, et en particulier le psoriasis, une période minimale d'environ deux semaines est nécessaire pour observer si le traitement montre des effets positifs. Ainsi il existe un besoin pour une méthode efficace, rapide et non-invasive permettant de déterminer la réponse d'un patient à un traitement particulier.

Une telle méthode serait également d'un intérêt particulier lors d'études cliniques en permettant d'identifier rapidement la présence d'une réponse à un traitement donné et donc de réduire les coûts ainsi que de réduire l'implication de patients dans des traitements inefficaces.

Les méthodes utilisées à ce jour permettent d'identifier la présence, l'absence ou la variation de certains marqueurs sanguins ou cutanés mais ces méthodes se sont révélées à l'usage, peu efficaces ou difficiles à mettre en pratique. Ainsi la demande de brevet publiée sous le No. US2005/0221334A décrit une méthode utilisant des prélèvements cutanés effectués par l'utilisation d'un adhésif appliqué sur la peau. Cette méthode décrit ensuite le diagnostic de pathologies cutanées telles que l'eczéma ou le psoriasis par identification de l'ARN messager de certains marqueurs sur les échantillons prélevés. L'identification de l'ARN messager est effectuée par RT-PCR et micro-array (jeu ordonné d'échantillons). Cette procédure est longue et délicate à mettre en pratique particulièrement pour permettre l'identification de marqueurs. De plus, la présence ou l'absence de protéines (marqueurs) n'est pas nécessairement liée à la présence d'ARN messager codant pour ces protéines mais peut résulter de modifications post- traductionnelles (glycosylation ou déglycosylation, glycation, oxydation, phosphorylation...) ou être liée au devenir de ces protéines tel que par exemple l'hydrolyse enzymatique. Cette hydrolyse par l'action de protéases endogènes peut conduire à l'apparition de formes matures ou à la disparition de certains marqueurs. Ces évènements sont particulièrement importants dans les couches épidermiques. Ces modifications biochimiques peuvent signer un état épidermique (désordre) qui ne peut être observé que par la détection et l'identification des protéines par notamment l'analyse protéomique.

La demande de brevet W02007/96846 décrit une méthode d'évaluation de la peau par mesure des métabolites d'échantillons de peau. Cette méthode permet de suivre les métabolites de la surface cutanée, qui sont les conséquences et non pas les acteurs des réactions biochimiques survenues au niveau de la peau. Les techniques développées dans cette demande sont spécifiques à l'analyse du métabolome et ne sont pas adaptée à l'analyse du protéome. L'homme du métier ne peut extrapoler cette méthode d'évaluation du métabolome à l'identification de marqueurs protéiques. L'identification du contenu protéique et son analyse protéomique permet de suivre des marqueurs spécifiques d'une pathologie cutanée et d'orienter le diagnostic. De plus, la plupart des cibles thérapeutiques sont de nature protéique, ce qui renforce l'intérêt de découvrir, d'identifier et de suivre les protéines à la surface de la peau grâce à une méthode spécifique à celles-ci. L'identification de protéines en amont du métabolome est donc fondamentale pour la caractérisation de la réponse tissulaire.

Il existe donc un besoin d'une méthode permettant de déterminer de manière rapide, non- invasive et peu coûteuse la présence, l'absence ou la variation de certains marqueurs protéomiques, indétectables par des technologies comme la RT-PCR, indiquant la présence de pathologies cutanées particulières.

Si diverses méthodes pour identifier des marqueurs de pathologies cutanées existent dans l'art antérieur, ces méthodes sont soit longues et coûteuses soit d'une sensibilité insuffisante ou encore requièrent d'effectuer une opération d'ordre invasive telle qu'un prélèvement sanguin ce qui est souvent douloureux et traumatique pour le patient.

La présente invention se propose de résoudre les inconvénients de l'état de la technique en présentant une nouvelle méthode fiable, rapide et non-invasive de recueil de données biologiques utiles pour l'établissement d'un diagnostic ou d'un pronostic d'une pathologie cutanée telle que le psoriasis.

Un aspect de l'invention concerne donc une méthode non-invasive de recueil de données biologiques utiles pour l'établissement d'un diagnostic ou d'un pronostic d'une pathologie cutanée particulière chez un patient, caractérisée en ce que a) on prélève un échantillon cutané contenant du matériel biologique, par application sur la peau dudit patient d'une couche d'adhésif, puis par retrait dudit adhésif, b) on détecte par spectrométrie de masse dans l'échantillon cutané obtenu en a) au moins une protéine dont la présence, l'absence, ou la variation de quantité ou de concentration par rapport à une valeur standard est associée à la présence, à l'évolution ou à l'absence d'une pathologie cutanée particulière.

La spectrométrie de masse (MS pour Mass Spectrography ) est déjà utilisée dans l'identification de mélanges complexes de composés chimiques et de molécules d'origine biologique. Contrairement aux outils classiquement utilisés comme les puces ou la technique ELISA, cet outil permet de visualiser de nouveaux marqueurs, de nouvelles protéines non encore identifiées et ceci par une méthode ayant une meilleure sensibilité.

Brièvement, le principe de base de l'analyse par spectrométrie de masse est la mesure du rapport masse/charge électrique d'espèces ioniques qui ont été créées par ionisation de l'échantillon à analyser et sur lesquelles sont appliqués des champs électriques et magnétiques. Une des méthodes d'ionisation le plus fréquemment utilisées dans le cas d'échantillons d'origine biologique est l'électro- nébulisation, connue sous le nom d < ElectroSpray (ES), qui génère des ions multichargés et permet l'utilisation d'analyseurs conventionnels peu onéreux comme les quadripôles. La source d'ionisation pour l'electrospray peut être multiple, et en particulier permet d'offrir une bonne sensibilité pour un faible débit. Une autre méthode d'ionisation fréquemment utilisée est la désorption-ionisation par impact laser assistée par matrice, connue sous le nom de MALDI-TOF qui est une méthode d'ionisation bien adaptée aux analyseurs par temps de vol (MALDI pour Matrix Assisted Laser Désorption and Ionisation et TOF pour Time of Flight ).

Le rapport masse/charge électrique se mesure de différentes manières, comme par exemple par la mesure de la déviation standard des espèces ionisées ( Sector MS ) ou la mesure du temps de vol ( TOF MS ). Aujourd'hui les méthodes d'analyse sont variées et comprennent par exemple des analyseurs de masse quadripolaire ou quadripôle (QMS), des analyseurs de masse quadripolaire à piège ionique (QIT), des analyseurs par spectrométrie infrarouge à transformée de Fourier (FTICR). De tels analyseurs ainsi que leurs méthodes d'utilisation sont bien connues.

La méthode appelée spectrométrie de masse en tandem (MS/MS) est l'association de plusieurs analyseurs qui permet la sélection d'un ion particulier puis l'identification de ses fragments en intercalant successivement des étapes de séparation de masses avec des étapes de fragmentation. Ainsi un analyseur en tandem peut isoler un peptide résultant de l'hydrolyse par la trypsine, des fragments de protéines ou une protéine d'un mélange complexe, puis le stabiliser pour permettre sa fragmentation (par exemple au moyen d'un gaz ou d'une autre méthode connue) et cataloguer les fragments ainsi produits. L'utilisation de banques de données permet alors l'identification des protéines présentes dans l'échantillon.

De façon préférentielle, la méthode selon l'invention utilise la technique de spectrométrie 25 de masse en tandem (MS/MS).

Si l'on désire procéder à l'identification d'un mélange complexe de protéines, il est avantageux de procéder tout d'abord à une étape de fractionnement. Une première méthode de fractionnement permet de séparer des protéines entre elles par électrophorèse 30 bidimensionnelle en gel de polyacrylamide. Une deuxième méthode consiste à utiliser la chromatographie en phase liquide (LC pour Liquid Chromatography ), pour séparer les protéines avant de leur faire subir une hydrolyse enzymatique (en général par la trypsine). Les peptides (hydrolysât) sont ensuite introduits dans le spectromètre de masse. Ces deux techniques peuvent avantageusement être combinées. La chromatographie en phase 35 liquide utilisée en combinaison avec un spectromètre de masse diffère de la chromatographie en Phase Liquide à Haute Performance (HPLC pour High Performance Liquid Chromatography ), plus généralement utilisée, principalement par les dimensions des colonnes utilisées et donc par leurs débits. Ainsi le diamètre des colonnes utilisées est le plus souvent de lmm (en contraste avec des diamètres moyens de 4.6mm pour des colonnes HPLC). Plus récemment des diamètres de 300 m et même des colonnes de type capillaires de diamètres de 75 m sont devenus prépondérantes. Dans le cas de ces colonnes, les débits sont proches de 100nL/min. Ces colonnes sont généralement utilisées avec des sources d'ionisation nanospray qui offre une meilleure sensibilité. Une source particulièrement utilisée selon l'invention est une source nanospray telle que celle commercialisée sous le nom de NanosprayTM par la société Applied Biosystems, utilisant des aiguilles Picotip emitterTM, SilicaTip, et couplée à un spectromètre de masse de type LC/MS/MS tel que celui commercialisé sous la marque de Qstar XLTM T par la société Applied Biosystems.

En particulier, l'analyse par spectrométrie de masse utilisée selon l'invention comprend une étape de séparation par chromatographie en phase liquide associée à de la spectrométrie de masse en tandem (MS/MS).

Les taches obtenues par électrophorèse bidimensionnelle correspondent généralement à une seule protéine. Pour identifier celle-ci le gel contenant la tache est excisé et soumis à une protéolyse enzymatique. L'enzyme la plus fréquemment utilisée est la trypsine.

Pour procéder à l'identification des protéines isolées, on utilise la technique de cartographie peptidique ( peptide mass fingerprinting ) par laquelle on compare les masses des peptides obtenus à une liste de référence sur banques de données qui contient la liste des masses des peptides résultant de la digestion de protéines connues. Si les données expérimentales correspondent à une liste donnée, il existe une grande probabilité que la protéine soit présente dans l'échantillon de départ.

L'analyse en mode MS/MS (tandem) est particulièrement recommandée afin d'obtenir une information sur la séquence peptidique et ainsi évaluer la pertinence de l'identification préalable de la protéine (validation). L'analyse en tandem consiste à isoler puis fragmenter les ions peptidiques dans une chambre de collision. Dans cette méthode, le lieu de fragmentation est particulièrement localisé aux liaisons peptidiques. Après fragmentation, les spectres de masse résultants sont comparés par des logiciels à des informations de référence contenues dans des banques de données pour identification des protéines.

Alternativement et préférentiellement, il est également possible d'effectuer directement la protéolyse enzymatique du mélange de protéines puis de séparer les peptides obtenus par digestion enzymatique ou les peptides endogènes par nanochromatograhie avant l'analyse par spectrométrie de masse en tandem (MS/MS).

Ainsi à titre d'exemple les peptides peuvent être préalablement concentrés sur une pré- colonne en milieu acide (C18, pepMap 100, 5 m, 100 A, 300 m i.d.x 5mm), montée sur une chaîne nano chromatographie LC packing (société Dionex). Les peptides sont ensuite chromatographiés sur une colonne de C18, 3 m, 75x150mm, AtlantisTM (société Waters), l'élution progressive des peptides étant réalisée à l'aide d'un gradient (acétonitrile/eau) couplé directement à la source du spectromètre de masse. L'analyse en mode SM/SM est particulièrement recommandée pour l'identification de protéines à partir de mélanges complexes.

Au sens de la présente invention le terme marqueur biologique désigne une molécule biologique associée à la présence ou à l'absence d'un état pathologique particulier, il s'agit plus particulièrement d'une protéine. Par valeur standard , on entend la quantité ou la concentration moyenne de marqueur biologique présente chez les individus sains.

La méthode selon l'invention peut avoir diverses applications. Non seulement elle peut être utile pour l'établissement d'un diagnostic ou d'un pronostic mais elle peut également être utile pour l'étude ou l'observation de l'évolution de pathologies cutanées ou de l'effet de traitements particuliers ainsi que pour permettre de réaliser un pronostic sur l'efficacité de tel ou tel traitement.

Selon un aspect préférentiel de la méthode selon l'invention, cette méthode est utilisée pour déterminer l'existence d'une réponse positive à l'administration d'un traitement particulier en identifiant une variation significative de la présence d'un marqueur particulier. Une telle utilisation permet de déterminer plus rapidement l'efficacité d'un traitement particulier qu'en attendant d'observer visuellement une évolution des symptômes. Elle permet également de réduire ainsi les coûts associés à des études thérapeutiques de nouveaux médicaments.

La maladie de la peau, ou pathologie cutanée, concernée par la méthode de l'invention peut être toute pathologie cutanée. Celle-ci est de préférence une maladie de type inflammatoire et/ou auto immune ou allergique.

Selon un aspect particulièrement préféré de l'invention la pathologie cutanée est le psoriasis et le marqueur à identifier est avantageusement un marqueur des lésions psoriasiques cutanées.

Le psoriasis est une maladie de la peau d'origine mal connue, en partie génétique qui touche 2% de la population. L'épiderme se renouvelle trop rapidement, en seulement quatre à six jours, au lieu des trois semaines habituelles ce qui génère des inflammations localisées. Les cellules épidermiques s'accumulent à la surface de la peau et forment une couche de pellicules blanches appelées squames. Parfaitement inoffensives, celles-ci ont pourtant le désavantage d'être inesthétiques.

Dans sa forme bénigne, le psoriasis se limite au cuir chevelu, aux ongles, aux genoux, aux coudes, aux pieds, aux mains et, parfois, aux organes génitaux. Dans les cas graves, il s'étend et peut gagner la totalité du corps. Le psoriasis comprend diverses formes symptomatiques telles que le psoriasis en plaque, la guttate psoriasis, le psoriasis pustulaire, le psoriasis inverse, le psoriasis érythrodermique et l'arthrite psoriatique. Il est toutefois possible de maîtriser le psoriasis, de diminuer l'étendue des lésions et d'améliorer la vie des patients par certains traitements.

De préférence selon l'invention, le marqueur de psoriasis qui est détecté ou mesuré est choisi dans le groupe constitué par des protéines ayant des fonctions biologiques liées à la prolifération et la différentiation cellulaires. On peut notamment citer la stratifine, la protéine apparentée a la calmoduline spécifique de l'épiderme 5 (CLSP), la protéine liant les acide gras associée au psoriasis, la desmoplakine ; la psoriasine (S 100 A7) et l'alpha enolase, l'antigène 1 et 2 de cellule de carcinome (SCCA1, SCCA2).

Selon un autre mode préféré de l'invention, le marqueur de psoriasis qui est détecté ou mesuré est choisi à titre d'exemple dans le groupe constitué par des marqueurs ayant des fonctions biologiques liées à la réponse au stress et à la réponse immune et inflammatoire. On peut notamment citer les protéines de choc thermique 27 (beta 1), 70.1, et 90, la Calgranuline A et B.

Selon la méthode de l'invention, l'étape de détection d'une protéine comme marqueur biologique, comprend l'identification ou la détermination de la présence ou de l'absence d'au moins une proteine. Cette étape peut éventuellement également comprendre la détermination de la quantité ou de la concentration, relative ou non, dudit marqueur, et/ou de la variation de ces valeurs par rapport à une valeur donnée ou standard ainsi que l'évolution dans le temps de ces valeurs. Bien qu'il soit présentement considéré plus avantageux pour des raisons de simplicité de mise en pratique de simplement déterminer la présence d'un marqueur particulier, l'invention s' étend également à la détermination de quantités, relatives ou non, de marqueurs particuliers ainsi qu'à l'étude de l'évolution de la concentration de plusieurs marqueurs.

Selon la méthode de l'invention, au moins un échantillon de peau, par exemple un seul échantillon, en particulier de la couche supérieure de l'épiderme (le stratum corneum) est prélevé sur un patient. De préférence l'échantillon est prélevé à un endroit montrant des signes cliniques d'une pathologie cutanée, telle qu'une inflammation. Cependant il peut être avantageux de prélever également un échantillon sur de la peau apparemment non atteinte, particulièrement pour des études comparatives et/ou pour confirmer les résultats de l'analyse. Lorsque l'échantillon cutané est prélevé sur une partie inflammée, il est préféré que le prélèvement ait lieu au centre de la plaque de manière à optimiser le prélèvement. Cependant, différentes zones de la lésion peuvent être prélevées afin de déterminer certaines caractéristiques (zone évolutive, zone fortement squameuse, zone présentant un fort érythème, zone traitée ou non traitée).

Avantageusement le prélèvement est effectué par l'apposition d'un adhésif sur la peau de patient puis par le retrait dudit adhésif auquel un échantillon de stratum corneum adhère.

Cet adhésif est choisi de manière qu'un échantillon de peau suffisant soit prélevé. Cet adhésif peut être avantageusement constitué d'une bande de plastique souple translucide ou non. L'adhésif est préférablement disposé sur un support, tel qu'un support souple et de préférence pliable de manière à pouvoir s'adapter au mieux aux contours et à l'élasticité de la partie du corps sur laquelle il est appliqué ce qui favorise l'obtention d'un échantillon de peau, et plus particulièrement de stratum corneum, aussi complet que possible. Un tel support peut être constitué par exemple d'un film de plastique. Par exemple cet adhésif peut être des pastilles de type D-squamesTM (Monaderm), Sebutape (CuDerm Corporation, Dallas, Tex.), BlendermTM ou ScotchTape Tm (3M Company, St. Paul, Minn.), ou bien des hydrogels comme ceux de type Hypan TM (Hymedix International, Inc., Dayton, N.J.), ou tout autre types de matériaux ayant des propriétés adhésives comme les colles les gommes et les résines.

Selon un aspect préféré de la méthode, l'adhésif est appliqué d'une manière répétée sur la peau jusqu'à perte de son adhésivité. Alternativement il est également envisagé de n'utiliser qu'une seule application de l'adhésif ou d'utiliser plus d'un adhésif pour constituer l'échantillon à analyser. Selon un aspect particulièrement avantageux de l'invention, il est cependant possible de ne procéder qu'à une seule application et de n'utiliser qu'un seul adhésif pour obtenir des résultats directement exploitables, c'est à dire contenant suffisamment de matériel biologique.

Il est préférable de procéder sur l'échantillon cutané obtenu à l'étape a) à une étape a') d'extraction de matériel biologique. Cette étape d'extraction peut être réalisée par tout protocole d'extraction, notamment d'extraction de protéines, qui sont bien connues de l'homme du métier.

L'invention concerne donc notamment une méthode non-invasive de recueil de données biologiques utiles pour l'établissement d'un diagnostic ou d'un pronostic d'une pathologie cutanée particulière chez un patient, telle que précédemment décrite, dans laquelle l'échantillon obtenu à l'étape de prélèvement a) est soumis à une étape d'extraction de matériel biologique a'), puis l'étape de détection b) est effectuée sur l'extrait ainsi obtenu.

Alternativement ou de façon additionnelle, l'échantillon de peau peut avantageusement être soumis à une étape a") de digestion enzymatique préalablement à l'analyse par spectrométrie de masse. Cette étape de digestion peut être avantageusement effectuée par l'utilisation de trypsine. De plus cette étape de digestion peut être avantageusement effectuée in situ directement sur le support de l'adhésif ce qui permet d'augmenter la vitesse d'analyse et de réduire la quantité d'échantillon nécessaire et ainsi de permettre de réduire la zone de prélèvement et/ou d'effectuer des prélèvements plus précis. L'invention concerne donc notamment une méthode non-invasive de recueil de données biologiques utiles pour l'établissement d'un diagnostic ou d'un pronostic d'une pathologie cutanée particulière chez un patient telle que précédemment décrite, dans laquelle le matériel biologique contenu dans l'échantillon cutané prélevé à l'étape a) ou obtenu à l'étape a') est soumis à une étape de digestion enzymatique a") préalablement à l'analyse par spectrométrie de masse (étape b)).

Pour effectuer l'analyse et déterminer la présence de marqueur(s) biologique(s), les méthodes d'analyses par spectrométrie de masses décrites ci-dessus peuvent être utilisées, en particulier l'analyse spectrométrique en tandem MS/MS ou la spectrométrie MALDITOF. Selon un aspect particulier de l'invention il est préféré d'utiliser une étape de chromatographie en phase liquide, et plus particulièrement la nano-chromatographie, associée à de la spectrométrie de masse en tandem (MS/MS) car cette méthode, qui permet une première séparation des mélanges complexes, est particulièrement efficace, rapide et sensible.

De préférence, les échantillons sont placés dans un tube (de type Eppendorf) de 2m1 en présence d'une solution tampon (de préférence du bicarbonate d'ammonium pH 8.3) contenant un réducteur (de préférence du dithiothréitol) et un détergent compatible avec l'analyse en spectrométrie de masse (de préférence RapigestTM , (société Waters)) permettant de solubiliser les protéines puis un agent alkylant (de préférence de l'iodoacétamide) est ajouté (étape a')). La digestion par la trypsine des protéines est de préférence directement effectuée dans le tube contenant l'échantillon, à 37°C, sous agitation (étape a")). Le digeste est ensuite filtré sur 0.22 m puis 30 kDa afin de supprimer les débris cellulaires et les protéines non digérées. Après acidification, les peptides sont directement chargés sur une colonne de pré-concentration (C18) LC Packing couplée au spectromètre de masse (étape b)). L'élution de la colonne de pré-concentration est préférentiellement réalisée par un gradient continu de mélange eau:acétonitrile, les peptides sont séparés dans une colonne (AtlantisTM) puis ionisés en sortie de colonne dans la source nanospray pour analyse dans le spectromètre de masse.

L'analyse des spectres de masse obtenus est effectuée par un logiciel permettant l'interprétation des spectres de masse. De tels logiciels sont par exemple les logiciels MASCOT (société Matrix Science) Spectrum Mill (société Agilent), Phenyx (société Genebio), ProID (société Applied Biosystems). Ces logiciels peuvent être couplés à des banques de données comme UNIPROT, SWISSPROT ou alternativement TrEMBL.

Il peut être préférable d'ajouter une étape c) de séparation des peptides avant la séparation par nano chromatographie (étape b)) afin de mieux séparer les peptides issus de la digestion enzymatique. Cette étape est particulièrement recommandée pour des mélanges complexes et pour la recherche de protéines présentes en faible quantité. Cette étape préliminaire peut être avantageusement constituée d'une étape de chromatographie en phase liquide (échangeuse d'ion). Les peptides provenant d'une digestion enzymatique par la trypsine sont ainsi absorbés à pH acide sur une colonne échangeuse d'ion (anionique) puis élués par un gradient continu de sel de concentration croissante ou par une succession de solutions contenant des quantités croissantes de sel ( step ). Les peptides ainsi élués sont directement (en ligne) absorbés sur la colonne de pré concentration (C 18) puis chromatographiés comme décrit précédemment.

Alternativement l'étape de séparation préliminaire c) peut avantageusement comprendre une étape d'iso-focalisation (ou iso-électro-focalisation) des peptides sur un gel comprenant un gradient d'immobiline immobilisée sur le support (gel). Cette étape est similaire à la première étape de séparation des protéines réalisée pour l'analyse bidimensionnelle des protéines. L'application d'un courant électrique permet de séparer les peptides de charges différentes. Les peptides après extraction du gel sont ensuite directement chromatographiés comme indiqué précédemment (nano chromatographie).

Dans le cas de ces deux alternatives (échangeuse d'ion ou iso-focalisation), l'analyse de l'ensemble des spectres de masse doit être effectuée en une seule étape afin d'identifier les différents peptides présents dans les différentes fractions chromatographiées et pouvant appartenir à une même protéine.

D'autres caractéristiques et avantages de l'invention ressortiront mieux des exemples qui suivent, donnés à titre illustratif et non limitatifs.

Exemple 1 : Analyse protéomique d'un échantillon de Stratum Corneum obtenu par application d'un ruban adhésif.

a) Obtention d'un échantillon L'analyse protéomique est effectuée à partir d'un échantillon prélevé sur la peau en appliquant un adhésif de type D-SquamesTM (société Monaderm). Ce produit comprend un support translucide souple en polymère et un adhésif. L'application est répétée sur la peau du patient, préférentiellement jusqu'à perte de l'adhésion. L'échantillon obtenu ne porte que sur le contenu des couches les plus externes de l'épiderme (c'est à dire le Stratum Corneum). Les échantillons ainsi obtenus sont stockés à -30°C ou à -80°C si un stockage pour une période plus longue est désiré.

a') et a") Analyse protéomique: digestion a') Extraction du matériel biologique : L'échantillon obtenu est incubé pendant 60min dans un tube Eppendorf de 2m1 sous agitation constante (à 1400rpm) à 60°C dans 200111 d'une solution tampon de bicarbonate d'ammonium de pH 8.5 contenant 0.1% de détergent RapiGestTM (lmg dans 1000111) et 5 M de DTT (dithiothréitol). Puis on ajoute 15mM d'iodoacetamine (IAA) (6111 d'une solution à 0,5M) et on laisse incuber 1h30min à température ambiante dans le noir.

a") Digestion enzymatique : Puis l'échantillon est incubé sous agitation (400 rpm) 18h à 37°C avec 1111 d'une solution de trypsine d'origine porcine (lmg/ml), puis est acidifié avec de l'acide formique à 2% (4111 d'une solution à 10%). Le produit de digestion est filtré par utilisation de filtres de 0,224tm et 30kDa sous centrifugation (12000rpm). Le filtrat est utilisé directement pour analyse par chromatographie en phase liquide couplé à de la spectrométrie de masse Qstar-XL mode d'analyse (LC/MS/MS). b) Analyse protéomique : LC/MS/MS

Il est préféré d'utiliser la méthode de chromatographie en phase liquide, et plus particulièrement la nano chromatographie, associée à de la spectrométrie de masse en mode tandem (MS/MS). L'analyse des spectres de masse obtenus est effectuée par le programme MASCOT pour l'identification des peptides et des protéines avec les spécifications suivantes : Recherche en mode MS/MS, Type d'instrument : ESI-QUAD-TOF, Digestion trypsine, Modification des protéines apportées : carbamidomethyl (sur les cystéines), Monoisotope, Pas de tolérance sur la masse de la protéine, Tolérance sur la masse peptidique de +/- 0.15Da, Tolérance sur la masse des ions fils (fragmentation): +/- 0.lDa, Absence de clivage toléré de 1, Recherche sur SwissProt, banque de donnée : humaine (Homo Sapiens). Ce programme est un moteur de recherche notamment disponible sur le site Internet www.matrixscience.com.

Exemple 2 : Détermination de la présence de marqueurs de psoriasis pouvant être identifiés par prélèvement non invasif de Stratum Corneum. (identification par LC/MS/MS) Par comparaison entre les protéines identifiées présentes seulement dans les squames psoriasiques (ou fortement présentes par rapport aux squames de sujets sains) et les marqueurs biologiques connues de lésions psoriasiques, il apparaît que la présence de marqueurs suivants a été identifiée : Numéro Nom complet d'entrée SWISSPROT P31946 protéine 14-3-3 (beta/alpha) P31947 protéine 14-3-3 protein (sigma) (stratifine) Q9NZT1 calmoduline spécfique de l'épiderme 5 (CLSP) P62158 Calmoduline P 15924 Desmoplakine Q02413 Desmogléine 1 P68104 Facteur d'élongation alpha 1 P06733 Alpha enolase Q01469 Protéine liant les acides gras épidermiques associés au psoriasis (PA- FABP) P06396 Gelsoline P08107 Protéine de choc thermique 70.1 (HSP71) Numéro Nom complet d'entrée SWISSPROT P08238 Protéine de choc thermique 90 PO4792 Protéine de choc thermique 27 (Oeta-1) P07476 Involucrine P02533 Kératine 14 P08779 Kératine 16 Q04695 Kératine 17 P02538 Kératine, type II cytoskeletal 6A PO4259 Kératine, type II cytoskeletal 6B P47929 Galectine 7 P29034 Protéine S100 A2 P31151 Psoriasine (S 100 A7) P05109 calgranuline A, (S 100A8) P06702 calgranulin B, (S 100A9) P29508 Antigène 1 de cellule de carcinome (SCCA1) P48594 Antigène 2 de cellule de carcinome (SCCA2) Q08188 Transglutaminase 3 (Tgase E) P10599 Thiorédoxine P36952 Maspine P19971 Thymidine phosphorylase De tels marqueurs peuvent être avantageusement utilisés dans une méthode selon l'invention.

Claims (12)

Revendications

1) Méthode non-invasive de recueil de données biologiques utiles pour l'établissement d'un diagnostic ou d'un pronostic d'une pathologie cutanée particulière chez un patient, caractérisée en ce que: a) on prélève un échantillon cutané contenant du matériel biologique, par application sur la peau dudit patient d'une couche d'adhésif, puis par retrait dudit adhésif, b) on détecte par spectrométrie de masse dans l'échantillon cutané obtenu en a) au moins une protéine dont la présence, l'absence, ou la variation de quantité ou de concentration par rapport à une valeur standard est associée à la présence, à l'évolution ou à l'absence d'une pathologie cutanée particulière.

2) Méthode selon la revendication 1 dans laquelle la pathologie cutanée est le psoriasis.

3) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2 dans laquelle l'échantillon cutané obtenu en a) est soumis à une étape a') d'extraction de matériel biologique, puis l'étape de détection b) est effectuée sur l'extrait ainsi obtenu.

4) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 dans laquelle le matériel biologique contenu dans l'échantillon cutané prélevé à l'étape a) ou extrait à l'étape a') est soumis à une étape a") de digestion enzymatique préalablement à l'étape b). 25

5) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 dans laquelle la technique de spectrométrie de masse utilisée est la spectrométrie de masse en tandem (MS/MS).

6) Méthode selon la revendication 5 dans laquelle l'analyse par spectrométrie de masse comprend une étape de séparation par chromatographie en phase liquide, associée à de la 30 spectrométrie de masse en tandem (MS/MS).

7) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 dans laquelle la protéine est un marqueur des lésions psoriasiques cutanées.20

8) Méthode selon la revendication 7 dans laquelle le marqueur est choisi dans le groupe constitué par des protéines ayant des fonctions biologiques liées à la prolifération et la différentiation cellulaires.

9) Méthode selon la revendication 8 dans laquelle le marqueur est choisi dans le groupe constitué par la stratifine, la protéine apparentée à la calmoduline spécifique de l'épiderme 5, la protéine liant les acide gras associée au psoriasis, la desmoplakine, la psoriasine, l'alpha enolase, et l'antigène 1 et 2 de cellule de carcinome.

10) Méthode selon la revendication 7 dans laquelle ledit marqueur est choisi dans le groupe constitué par des protéines ayant des fonctions biologiques liées à la réponse au stress et à la réponse immune et inflammatoire.

11) Méthode selon la revendication 10 dans laquelle le marqueur est choisi dans le groupe constitué par les protéines de choc thermique 27 (beta 1), 70.1, et 90, et la Calgranuline A et B.

12) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 dans laquelle un seul échantillon est prélevé.20