FR2921071A1 - Procede de prelevement et de detection et/ou d'identification de microorganismes presents dans un echantillon - Google Patents
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Abstract
La présente invention se rapporte à un procédé de prélèvement et de détection et/ou d'identification de microorganismes présents dans un échantillon, en particulier au niveau de surfaces, à l'aide d'un gel de prélèvement hypotonique par rapport au cytoplasme desdits microorganismes et capable de déstabiliser et/ou lyser les membranes et/ou les parois desdits microorganismes.
Description
PROCÉDÉ DE PRÉLÈVEMENT ET DE DÉTECTION ET/OU D'IDENTIFICATION DE MICROORGANISMES PRÉSENTS DANS UN ECHANTILLON La présente invention se rapporte au domaine de la détection et de l'identification de microorganismes. Elle concerne tout particulièrement un procédé et un dispositif de prélèvement et de détection de microorganismes présents dans un échantillon.
La mise au point de méthodes simples et rapides permettant la détection et/ou l'identification et/ou la détermination du taux de microorganismes présents dans un échantillon est un enjeu majeur notamment dans les domaines de la santé et de l'agro-alimentaire, en particulier au niveau des surfaces de production et de travail. La technique de référence actuellement utilisée est l'empreinte sur Pétri (Norme ISO/DIS 14698-1 Salles propres et environnements maîtrisés apparentés û Maitrise de la biocontamination û 1999. Arrêté du 18.12.97 modifiant les bonnes pratiques de fabrication Annexe I Fabrication des médicaments stériles B.O. 98/5). Cette technique peu onéreuse donne des résultats peu reproductibles qui ne sont disponibles que deux à sept jours après prélèvements selon les organismes. Ce délai de réponse permet à la contamination de s'étendre ce qui diminue considérablement la pertinence du contrôle des surfaces. L'utilisation de l'ATP-métrie en contrôle des surfaces permet de réduire à quelques secondes le délai d'obtention des résultats. Cependant cette technologie coûteuse ne permet aucune identification des microorganismes présents et est très peu sensible (détection à partir de 105 germes). Elle n'est donc pas utilisable dans le cadre du contrôle microbiologique des environnements stériles.
Il existe de nombreuses méthodes permettant la détection rapide de microorganismes présents dans un échantillon basées sur l'amplification par PCR (Olive, J. Clin. Microbiol., 27 : 261-265, 1989; Starnbach et al., J. Clin. Microbiol., 27 : 1257-1261, 1989).
Toutefois les adaptations de ces méthodes au contrôle des surfaces peuvent être longues, coûteuses et impliquer de nombreuses étapes rendant leurs résultats peu reproductibles. En particulier, les méthodes de prélèvement par chiffonnettes permettant de passer de la surface analysée à un milieu liquide donnent des résultats peu reproductibles, une étape de culture d'enrichissement durant 16 heures est nécessaire avant d'effectuer les détections, et une étape de lyse des microorganismes et/ou de purification de l'ADN intervient de façon distincte de celle de détection ce qui peut impliquer de nombreuses manipulations et entraîner un coût élevé. Il subsiste donc un besoin pour des méthodes simples et rapides permettant la détection et/ou l'identification et/ou la détermination du taux de microorganismes présents dans un échantillon, en particulier au niveau de surfaces. Les inventeurs ont maintenant mis au point un procédé rapide et simple permettant de résoudre en tout ou partie les problèmes évoqués ci-dessus. En particulier, le procédé selon l'invention peut permettre de réaliser en une seule étape le prélèvement et la déstabilisation et/ou la lyse des membranes et/ou des parois de microorganismes présents dans le prélèvement. Le procédé selon l'invention permet en outre de réaliser la détection directement sur le prélèvement sans passer par une étape de culture des microorganismes. Ainsi le procédé selon l'invention permet de fusionner les étapes de lyse et de détection des microorganismes. Selon un premier aspect, l'invention a pour objet un procédé de prélèvement et de détection d'au moins un microorganisme présent dans un échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : (i) la mise en contact d'un échantillon avec un gel de prélèvement dudit, au moins un, microorganisme ; (ii) la détection et/ou l'identification dudit, au moins un, microorganisme présent sur le gel de prélèvement obtenu à l'étape (i) ; ledit gel étant hypotonique par rapport au cytoplasme dudit au moins un microorganisme et capable de déstabiliser et/ou lyser les membranes et/ou les parois dudit, au moins un, microorganisme. On entend par gel de prélèvement au sens de la présente invention, un gel permettant de prélever ledit, au moins un microorganisme, présent dans un échantillon. On entend par ledit gel étant hypotonique par rapport au cytoplasme dudit, au moins un, microorganisme , le fait que le gel de prélèvement selon l'invention présente une pression osmotique plus faible que celle du cytoplasme et/ou du périplasme dudit, au moins un, microorganisme.
On entend par gel capable de déstabiliser les membranes dudit, au moins un, microorganisme le fait que le gel de prélèvement selon l'invention permette l'augmentation de la perméabilité des membranes dudit, au moins un, microorganisme à des molécules de faible poids moléculaire et éventuellement de haut poids moléculaire tels que des acides nucléiques, plasmides et complexes. On entend par gel capable de déstabiliser les parois dudit, au moins un, microorganisme le fait que le gel de prélèvement selon l'invention permette l'augmentation de la perméabilité des parois dudit, au moins un, microorganisme à des molécules de faible poids moléculaire et éventuellement de haut poids moléculaire tels que des acides nucléiques, plasmides et complexes. On entend par gel capable de lyser les membranes dudit, au moins un, microorganisme le fait que le gel de prélèvement selon l'invention présente une concentration en solutés suffisamment faible pour provoquer l'éclatement des membranes dudit au moins un microorganisme par entrée d'eau. On entend par gel capable de lyser les parois dudit, au moins un, microorganisme le fait que le gel de prélèvement selon l'invention présente une concentration en solutés suffisamment faible pour provoquer l'éclatement des parois dudit au moins un microorganisme par entrée d'eau. Avantageusement, ledit gel de prélèvement est suffisamment hypotonique pour permettre de prélever ledit, au moins un microorganisme, présent dans un échantillon et/ou de déstabiliser et/ou lyser les membranes et/ou les parois dudit, au moins un, microorganisme, par choc osmotique.
Ainsi, le gel de prélèvement peut contenir une quantité d'ions suffisamment faible pour provoquer une entrée d'eau dans ledit microorganisme suffisamment importante pour déstabiliser et/ou lyser les membranes et/ou les parois dudit, au moins un, microorganisme.
L'Homme du Métier pourra déterminer à l'aide de ses connaissances générales une pression osmotique du gel de prélèvement permettant de prélever ledit, au moins un microorganisme, présent dans un échantillon et/ou de déstabiliser et/ou lyser les membranes et/ou les parois dudit, au moins un, microorganisme.
En particulier, l'Homme du Métier pourra déterminer à l'aide de ses connaissances générales une pression osmotique du gel de prélèvement permettant de prélever un genre et/ou une famille et/ou un ordre et/ou une classe de microorganisme, présent dans un échantillon et/ou de déstabiliser et/ou lyser les membranes et/ou les parois d'un genre et/ou une famille et/ou un ordre et/ou une classe de microorganisme.
La pression osmotique peut être déterminée par un osmomètre tel q'un osmomètre de Dutrochet, de Pfeffer.
À titre d'exemples, les techniques permettant de déterminer la pression osmotique peuvent être de la calculer en appliquant la loi de Van't Hoff :
1= i* C* R* T* 1000
ou Jr = i * CB * R * T * 1000
ou a=1000-R-T -n en n avec i = coefficient de Van't Hoff
Cou cB ou cn= concentration de l'espèce dissoute (M) F:= constante des gaz parfaits (8.31 J/mol•K) T= température absolue (K) n= pression osmotique en Pascal (Pa) yn est une valeur expérimentale et ne peut être calculé que dans les cas simples. En général, yi < 1 pour les ions chargés et macromolécules. Yi > 1 pour les Le facteur 1000 permet la conversion des litres en 10 m3 pour obtenir la pression en Pascal ; En particulier, ledit gel de prélèvement selon l'invention peut avoir une pression osmotique allant de 0 à 99 % de celle du cytoplasme dudit au moins un microorganisme, de préférence de 0 à 90 %, 15 préférentiellement de 0 à 50 % et encore plus préférentiellement de 0 à 20 % de celle du cytoplasme dudit au moins un microorganisme. En particulier, le gel de prélèvement est choisi dans le groupe comprenant les gélifiants naturels 20 hydratés, les gélifiants de synthèse hydratés et les gélifiants obtenus par hémisynthèse hydratés. On entend par gélifiant une substance permettant d'obtenir la consistance d'un gel, à savoir un état de la matière intermédiaire entre l'état solide 25 (pour l'élasticité) et l'état liquide (pour la diffusion). On entend par gélifiant hydraté , une substance permettant d'obtenir la consistance d'un gel par hydratation. L'obtention d'un gel par hydratation peut 30 être effectuée selon des techniques bien connues de l'Homme du Métier telles que par chauffage ou ébullition d'une solution de gélifiant déshydraté. On entend par gélifiant naturel , un gélifiant qui provient de la nature, en particulier d'eucaryotes ou de procaryotes et qui n'a pas subi de traitements chimiques tels que des procédés d'hydrolyse ou qui n'est pas obtenu par synthèse. À titre d'exemples de gélifiant naturel, on peut citer l'amidon, la caroube, la gomme notamment la gomme d'accacia, les pectines, les alginates, l'agar-agar, les carraghénanes, les xanthanes. On entend par gomme , une matière visqueuse exsudée par certaines plantes, notamment par des arbres. À titre d'exemples de gomme, on peut citer la gomme d'accacia, de caroube et de guar. On entend par gélifiant de synthèse , un gélifiant issu d'un enchaînement de réactions chimiques. À titre d'exemples de gélifiant de synthèse, on peut citer i'acrylamide et la bis-acrylamide. On entend par gélifiant obtenu par hémisynthèse , un gélifiant issu d'une synthèse effectuée à partir d'au moins une substance naturelle. À titre d'exemples de gélifiant obtenu par hémisynthèse, on peut citer les gélatines, les agaroses modifiées telles que les agaroses présentant un point de fusion plus faible que celui de l'agarose, en particulier la Top agar, la Nusieve, les Low Melting Point agaroses (LMP agarose ou agarose à bas point de fusion) et les agaroses à faible température de gélification ( low gelling temperature agaroses ) et les agaroses à très faible température de gélification ( ultra low gelling temperature agaroses ). En particulier, le gélifiant peut être choisi dans le groupe comprenant les gélatines, l'agar-agar, l'amidon, la caroube, la guar, la gomme notamment la gomme d'accacia, les pectines, les alginates, les carraghénanes, les xanthanes, l'a.crylamide, la bisacrylamide et les agaroses notamment les agaroses modifiées, de préférence l'agarose et les agaroses modifiées et tout préférentiellement l'agarose. Le gélifiant peut être présent dans le gel de prélèvement selon l'invention en une quantité allant de 0,2 à 15 % en poids, de préférence de 1 à 5 % en poids, par rapport au poids total dudit gel de prélèvement.
On entend par échantillon , une fraction ou un prélèvement susceptible de comprendre au moins un microorganisme. L'échantillon peut être choisi dans le groupe comprenant un échantillon liquide notamment sanguin, un échantillon gazeux notamment d'air, un échantillon solide, notamment un échantillon présent au niveau d'une surface, de préférence un échantillon présent au niveau d'une surface, et tout préférentiellement un échantillon d'une surface de sol, d'appareil, de meuble, de machine ou d'élément de machine, de peau. Lorsque ledit échantillon est présent au niveau d'une surface, l'étape (i) de mise en contact de l'échantillon avec un gel de prélèvement peut être réalisée avec une pression allant de 2 g/cm2 à 50 kg/cm2 pendant 1 seconde à 60 minutes, de préférence allant de 20 à 50 g/cm2 pendant 5 à 30 secondes.
Lorsque ledit échantillon est liquide, l'étape i) du procédé selon l'invention peut être précédée du dépôt dudit échantillon sur un milieu absorbant tel qu'une gélose sèche. Un tel milieu absorbant peut permettre d'absorber le liquide de l'échantillon, ledit, au moins un, microorganisme présent dans l'échantillon restant en tout ou partie à la surface du milieu absorbant. On entend par microorganisme , un organisme vivant appartenant à l'un des trois règnes suivants, celui des monères, des protistes et des protozoaires. Les microorganismes présentent une structure cellulaire eucaryote ou procaryote, ou acaryote, une taille microscopique ou ultramicroscopique et sont unicellulaires. En particulier, ledit, au moins un, microorganisme peut être choisi dans le .groupe comprenant : - les algues, - les protozoaires, - les mycètes notamment les levures, - les virus et - les bactéries notamment les bactéries du genre Listeria telles que Listeria monocytogenes, les entérobactéries telles que les bactéries du genre Salmonella et le coliforme, les bactéries du genre Clostridium, les bactéries du genre Legionella, en particulier les levures et les bactéries et tout particulièrement les bactéries du genre Listeria et les entérobactéries.
Le gel de prélèvement selon l'invention peut comprendre en outre au moins un so_uté.
On entend par soluté , une substance soluble. En particulier, ledit soluté peut permettre de maintenir au moins une condition physico-chimique nécessaire à la conservation de moLécules dudit micro- organisme, avantageusement de molécules permettant la détection dudit micro-organisme. À titre d'exemples de telles molécules, on peut citer les acides désoxyribonucléiques (ADN), les acides ribonucléiques (ARN), les protéines par exemple les toxines, ou les peptidoglycans et autres glycoconjugés. Ledit soluté peut être présent dans le gel de prélèvement selon l'invention à une concentration allant de 0,1 pM à 2 M, de préférence allant de 5 nM à 200 mM. En particulier le soluté peut être choisi dans le groupe des molécules tampon comprenant le phosphate de potassium notamment le dihydrogénophosphate de potassium, le monohydrogénophosphate potassium et le phosphate de potassium tribasique, l'acétate de sodium, le tris-hydrochloride, le tris-borate, le tris-acétate, en particulier le tris-hydrochloride. On entend par molécules tampon , une substance capable de maintenir le pH à une valeur ne variant pas plus de 20 % au cours du prélèvement et/ou des réactions nécessaires à la détection dudit au moins un organisme. Par exemple, le tris-hydrochloride peut permettre de maintenir le pH du gel de prélèvement selon l'invention à une valeur supérieure à 7.3 et ainsi d'éviter la dégradation des acides ribonucléiques (ARN) par beta-élimination.
On entend par détection d'un microorganisme le fait de déceler la présence d'un microorganisme, notamment dans un échantillon. On entend par identification d'un microorganisme , la détermination de l'espèce et/ou de la souche d'un microorganisme. En particulier, l'étape ii) du procédé selon l'invention peut comprendre au moins une réaction choisie dans le groupe comprenant : - une réaction de polymérisation en chaîne, notamment une réaction de polymérisation en chaîne en temps réel, une réaction de polymérisation en chaîne multiplex, une réaction de polymérisation en chaîne semi-quantitative, une réaction de polymérisation en chaîne quantitative, - une réaction de polymérisation d'acides ribonucléiques par une ARN polymérase ; - une réaction de polymérisation par une transcriptase inverse ; - une réaction immunologique, notamment une réaction antigène-anticorps ; - une réaction enzymatique, notamment une réaction impliquant des enzymes de restriction, - une réaction colorimétrique, notamment une réaction calorimétrique basée sur la mesure de la présence d'acide désoxyribonucléique et d'acide ribonucléique, de substrats. Les techniques de réaction colorimétrique utilisable dans le procédé selon l'invention sont bien connues de l'Homme du Métier.
Une combinaison de ces différentes réactions colorimétriques est possible (Lisle et al., Lett. Appl. Microbiol., 29 : 42-47, 1999). La mesure de la présence d'acide désoxyribonucléique et d'acide ribonucléique par une réaction colorimétrique peut être effectuée en utilisant le syto dyes. La mesure de la présence de substrats par une réaction colorimétrique peut être effectuée en utilisant des méthodes bien connues de l'Homme du métier. À titre d'exemples, des réactifs colorimétriques tels que le O-nitrophenyl-/ -D-thiogalactoside (ONPG) , le 5-bromo-4-chloro-3-indoyl-%3, le D-galactoside (X- gal) , et le rouge (3 chlorophenol, et le D- galactopyranoside (CPRG) peuvent être utilisés pour détecter l'activité de la /3 -galactosidase. Des appareils de PCR en temps réel disponibles en particulier chez Roche Diagnostics sous la dénomination COBAS Taqman , chez Applied Biosystems sous la dénomination 7500 Real-Time PCR System , chez BioRad sous les dénominations Chromo 4 Real-Time PCR detecion system, iQ 5 real-Time PCR detection system , et chez Genesystems sous la dénomination GeneDisc cycler peuvent être utilisés dans le procédé selon l'invention. Des kits de PCR en temps réel avec des couples d'amorces et sondes spécifiques d'un microorganisme disponibles chez Roche avec le Lightcycler SeptiFast kit sous les références 04469046001 ou 04488814001); chez Biotage avec les kits microbial species determination and resistance sous les références 8, 7 et 12; chez BAG (Biologish Analysensystem GMbH) avec les kits Hyplex StaphyloResist sous la référence 3801, Hyplex StaphyloResist plus sous la référence 3809, Hyplex EnteroResist sous la référence 3802 peuvent être utilisés dans le procédé selon l'invention Par exemple, le kit de PCR en temps réel disponible chez Argène avec la référence 69-002 est utilisable pour identifier et déterminer le taux de virus d'Epstein-Barr (EBV) présent dans un échantillon. En particulier, l'étape (ii) du procédé selon l'invention peut comprendre une réaction de polymérisation en chaîne mise en oeuvre directement sur le gel de prélèvement obtenu à l'étape (i), sans étape préalable de mise en suspension du gel de prélèvement obtenu à l'étape (i). La réalisation d'une réaction de polymérisation en chaîne directement sur le gel de prélèvement obtenu à l'étape (i), sans étape préalable de mise en suspension du gel de prélèvement obtenu à l'étape (i), permet notamment de réduire le nombre d'étapes du procédé de détection et ainsi de réduire les coûts et le délai d'obtention des résultats de détection et/ou d'identification de microorganisme.
La réaction de polymérisation en chaîne peut alors être réalisée directement en milieu gélifié. Selon un mode de réalisation particulier du procédé selon l'invention, l'étape (ii) peut comprendre les étapes suivantes : - la mise en contact du gel de prélèvement obtenu à l'étape (i) avec les réactifs nécessaires à la mise en oeuvre d'une réaction de polymérisation en chaîne, lesdits réactifs comprenant au moins quatre nucléotides triphosphates différents, au moins une polymérase, au moins une paire d'amorces capables de s'hybrider à au moins une séquence du génome dudit, au moins un, microorganisme, et au moins un tampon adapté à une réaction de polymérisation en chaîne ; - la mise en oeuvre d'une réaction de polymérisation en chaîne ; - l'analyse des produits d'amplifications obtenus par ladite réaction de polymérisation en chaîne. L'Homme du Métier pourra simplement déterminer les réactifs nécessaires et les conditions de mise en oeuvre d'une réaction de polymérisation en chaîne à l'aide de ses connaissances générales (Saiki et al., Science, 230 :1350-1.354, 1985 ; Saiki et al., Science, 239 :487-491, 1988). En particulier, lesdits réactifs comprendront au moins une paire d'amorces capables de s'hybrider à au moins une séquence du génome dudit microorganisme.
L'analyse des produits d'amplifications obtenus par ladite réaction de polymérisation en chaîne peut être effectuée par des techniques bien connues de l'Homme du Métier. À titre d'exemples de telles techniques d'analyse, on peut citer la migration sur un gel d'électrophorèse des produits d'amplification obtenus par ladite réaction de polymérisation en chaîne, le séquençage desdits produits (Sanger et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 74 : 5463-5467, 1977; Innis et al., Proc. Nat.
Acad. Sci. USA 85 :9786-9440, 1988), la PCR quantitative (Harbarth et Vosberg, DNA 7 : 297-306, 1988 ; Kawasaki et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86 :5698-5702, 1988), la colorimétrie. Selon un mode de réalisation particulier du procédé selon l'invention, l'étape (ii) peut comprendre une réaction de polymérisation d'acides ribonucléiques par une ARN polymérase mise en oeuvre directement sur le gel de prélèvement obtenu à l'étape (i), sans étape préalable de mise en suspension du gel de prélèvement obtenu à l'étape (i).
Selon un mode de réalisation particulier du procédé selon l'invention, l'étape (ii) peut comprendre une réaction de polymérisation par une transcriptase inverse, mise en oeuvre directement sur le gel de prélèvement obtenu à l'étape (i), sans étape préalable de mise en suspension du gel de prélèvement obtenu à l'étape (i), suivie d'une réaction de polymérisation en chaîne (RT-PCR). Selon un mode de réalisation particulier du procédé selon l'invention, l'étape (ii) peut être précédée d'un traitement du gel de prélèvement obtenu à l'étape (i) par des enzymes lytiques, notamment le lysozyme. On entend par enzymes lytiques , toute activité enzymatique permettant la lyse des membranes et/ou parois d'un microorganisme.
L'Homme du Métier pourra déterminer simplement à l'aide de ses connaissances générales, les conditions de traitement du gel de prélèvement obtenu à l'étape (i) par des enzymes lytiques (Maniatis, in Molecular Cloning, 2nc1e édition, A Laboratory Manual, CSHL Press, pp. 1.29-1.30, 1989). Selon un mode de réalisation particulier du procédé selon l'invention, l'étape (ii) peut être précédée d'une étape de chauffage du gel de prélèvement obtenu à l'étape (i) à une température allant de 30°C à 373°C, pendant une durée de 5 secondes à 60 minutes, de préférence à une température allant de 80°C à 120°C, pendant une durée de 1 à 20 minutes, tout préférentiellement de 90 à 100°C pendant une durée de 1 à 5 minutes. Une telle étape de chauffage peut permettre la déstabilisation et/ou la lyse des membranes et/ou parois dudit microorganisme. Le procédé selon l'invention peut en outre comprendre :L'étape suivante : (iii) la détermination du taux de microorganismes présents dans ledit échantillon.
On entend par taux de microorganismes , la quantité de microorganismes présents dans l'échantillon sur lequel le procédé selon l'invention est mise en oeuvre. La détermination du taux de microorganismes présents dans ledit échantillon peut être effectuée par des techniques bien connues de l'Homme du Métier. À titre d'exemple, cette détermination peut s'effectuer en comparant les résultats obtenus à l'étape (ii) de détection des microorganismes avec les résultats obtenus avec des témoins positifs correspondant à des dilutions déterminées desdits microorganismes. Selon un autre de ses aspects, l'invention a également pour objet un dispositif de prélèvement d'au moins un microorganisme, comprenant un gel de prélèvement tel que défini précédemment.
En particulier, le gel de prélèvement selon l'invention est hypotonique par rapport au cytoplasme dudit au moins un microorganisme et capable de déstabiliser et/ou lyser les membranes et/ou les parois du, au moins un, microorganisme. Dans le dispositif selon l'invention, le gel de prélèvement peut être choisi dans le groupe comprenant les gélifiants naturels hydratés, les gélifiants de synthèse hydratés et les gélifiants obtenus par hémisynthèse hydratés. En particulier, le gélifiant peut être choisi dans le groupe comprenant les gélatines, l'agar-agar, l'amidon, la caroube, la guar, la gomme notamment la gomme d'accacia, les pectines, les alginates, les carraghénanes, les xanthanes, l'acrylamide, la bisacrylamide et les agaroses notamment les agaroses modifiées, de préférence l'agarose et les agaroses modifiées et tout préférentiellement l'agarose. Dans le dispositif selon l'invention, ledit gel de prélèvement peut comprendre au moins un soluté choisi dans le groupe des molécules tampon comprenant le phosphate de potassium notamment le dihydrogénophosphate de potassium, le monohydrogénophosphate potassium et le phosphate de potassium tribasique, l'acétate de sodium, le trishydrochloride, le tris-borate, le tris-acétate, en particulier le tris-hydrochloride. Ledit, au moins un, soluté peut être présent dans ledit gel de prélèvement selon l'invention à une concentration allant de 0,1 pM à 2 M, de préférence allant de 5 nM à 200 mM.
En particulier, dans le dispositif selon l'invention, ledit gel de prélèvement selon l'invention peut avoir une pression osmotique allant de 0 à 99 % de celle du cytoplasme dudit au moins un microorganisme, de préférence de 0 à 90 %, préférentiellement de 0 à 50 % et encore plus préférentiellement de 0 à 20 % de celle du cytoplasme dudit au moins un microorganisme. Selon un mode de réalisation particulier, ledit gel de prélèvement selon l'invention peut être fixé à l'extrémité d'un support. On entend par support , tout appareillage permettant de supporter le gel de prélèvement selon l'invention. En particulier, le support facilite l'utilisation du gel de prélèvement selon l'invention notamment lors du prélèvement d'un microorganisme et/ou lors de la détection et/ou l'identification dudit microorganisme. En particulier, le support peut être choisi dans le groupe comprenant une tige, un rouleau, un stylo, un poinçon, un axe, en particulier une tige. On entend par tige un axe dont la longueur est au moins cinq fois supérieure à la largeur. Ledit gel de prélèvement selon l'invention peut être en libre rotation à l'extrémité dudit support.
En particulier, ledit gel de prélèvement peut présenter une forme choisie dans le groupe comprenant une forme conique, cylindrique, discoïde et la forme d'un film, en particulier une forme conique, cylindrique et discoïde et tout particulièrement une forme conique.
Ledit gel de prélèvement selon l'invention peut être recouvert d'un film retirable, en particulier d'un film plastique retirable. Ledit film retirable peut être un film de protection. Ledit film retirable peut permettre la manipulation du gel de prélèvement selon l'invention sans contact direct avec ledit gel. Selon un autre de ses aspects, l'invention a également pour objet un dispositif de prélèvement et de détection d'au moins un microorganisme comprenant : (a) le dispositif de prélèvement selon l'invention; (b) les réactifs nécessaires à la détection et/ou l'identification dudit, au moins un, microorganisme.
Selon un mode de réalisation particulier du dispositif de prélèvement et de détection d'au moins un microorganisme selon l'invention, lesdits réactifs (b) sont nécessaires à au moins une réaction qui peut être choisie dans le groupe comprenant : - une réaction de polymérisation en chaîne, notamment une réaction de polymérisation en chaîne en temps réel, une réaction de polymérisation en chaîne multiplex, une réaction de polymérisation en chaîne semi-quantitative, une réaction de polymérisation en chaîne quantitative, - une réaction de polymérisation d'acides ribonucléiques par une ARN polymérise ; - une réaction de polymérisation par une transcriptase inverse ; - une réaction immunologique, notamment une réaction antigène-anticorps ; - une réaction enzymatique, notamment une réaction impliquant des enzymes de restriction, - une réaction colorimétrique, notamment une réaction colorimétrique basée sur la mesure de la présence d'acide désoxyribonucléique et d'acide ribonucléique, de substrats. Selon un mode de réalisation particulier du dispositif de prélèvement et de détection d'au moins un microorganisme selon l'invention, les réactifs (b) sont nécessaires à la mise en oeuvre d'une réaction de polymérisation en chaîne, lesdits réactifs pouvant comprendre au moins quatre nucléotides triphosphates différents, au moins une polymérase, au moins une paire d'amorces capables de s'hybrider à au moins une séquence du génome dudit, au moins un, microorganisme, et au moins un tampon adapté à une réaction de polymérisation en chaîne. En particulier, le gel de prélèvement du dispositif de prélèvement (a) peut comprendre lesdits réactifs (b). Lesdits réactifs (b) peuvent être présents dans un contenant, notamment un tube. On entend par tube , un contenant de forme cylindrique ou conique fermé au moins à une extrémité.
En particulier, ledit contenant peut être de forme complémentaire audit gel de prélèvement. Dans les dispositifs selon l'invention, ledit, au moins un, microorganisme peut être choisi dans le groupe comprenant : -les algues, - les protozoaires, - les mycètes notamment les levures, - les virus et - les bactéries notamment les bactéries du genre Listeria telles que Listeria monocytogenes, les entérobactéries telles que les bactéries du genre Salmonella et le coliforme, les bactéries du genre Clostridium, les bactéries du genre Legionella, en particulier les levures et les bactéries et tout particulièrement les bactéries du genre Listeria et les entérobactéries. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront au regard des figures et des exemples qui suivent. Les figures et les exemples qui suivent sont donnés à titre illustratif et non limitatif. EXEMPLE 1 : PROCÉDÉ DE DÉTECTION DE CLONES D'INTÉRÊT D'E. COLI EN ABSENCE DE MILIEU SÉLECTIF Protocole 1 Des entérobactéries de la souche K12 d'Escherichia coli ont été transformées (Maniat:is Fresh Competent E. coli prepared using Calcium Chloride , in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2F édition, CSHL Press, 1989, pp. 1.82-1.84) par le plasmide P38 contenant un fragment EcoRI de l'ADNc de la glycogène synthase d'astrocytes de souris (Bernard-Hélary et al., Glia, 37 : 379-382), étalées sur un milieu LB Agar MILLER (Difco), puis mises en culture pendant 16 heures, à une température de 37°C. Huit clones isolés ont été prélevés à l'aide de cônes gélifiés (eau tétra-distillée + agarose de type D5 à 3%) d'un volume PCR de 30 !tL, afin d'identifier des clones d'intérêt par SPPE (Solid Phase Primer Extension). Les prélèvements ont été placés à 95°C durant 5 minutes afin de détruire les structures cellulaires et dénaturer l'ADN. Après l'ajout de 20 cul de tampon réactionnel [concentration finale : (NH4)2SO4 11,6 mM (Aldrich), Tris HC1 (pH 8,8) 50,0 mM (Sigma), MgC12 anhydre 2,5 mM (Sigma), (3- mercaptoéthanol 8,0 mM (Sigma), BSA (sérum d'albumine bovine) 35,0 g/ml (New England Biolabs), dNTP 0,2 mM (Euromedex), oligonucléotides 30,0 pmol suivants : Nom Séquence Position Fragment TH IU 815 SEQ ID NO : 1 815-834 493 pb 55°C 5'-TCATACACATACGATTTAGG-3' - GS12 SEQ ID NO : 2 1307-1288 5'-AATTTCAACGTGGAAACCCT-3' , Red Taq DNA polymerase (Sigma) 1,0 unité] et homogénéisation du milieu, 35 cycles d'amplification par extension d'amorces, consistant chacun en 15 secondes à 95°C, 45 secondes à 55°C, 60 secondes à 72°C, ont été réalisés sur un thermocycleur (Techne). Une électrophorèse en gel d'agarose de type D5 à 2% a été effectuée en tampon TBE (Tris-Borate-EDTA) 0,5X, à 140 volts, durant 30 minutes. Les dépôts ont été effectués à chaud. Les résultats sont présentés sur la figure 1. Légende de la figure 1 : lignes a-h prélèvements de huit clones indépendants ligne M = marqueur de taille (1 kb DNA leader) (GeneRulerTM, Euromedex) Les résultats montrent que deux clones d'intérêt ont été identifiés (lignes e et f), sans recourir à d'autres cribles de sélection que l'amplification par SPPE, et en moins de quatre heures après prélèvement. Protocole 2 Des dépôts de 100 l d'une dilution à 10-5 d'une culture liquide d'un clone d'intérêt précédemment identifié d'Escherichia coli (clone P32), ont été réalisés sur plaque de verre. Après séchage, des prélèvements indépendants ont été effectués à l'aide de cônes gélifiés d'un volume de 30 cul et de composition suivante : agarose de type D5 à 3% (Euromedex), (NH4)2SO4 11,6 mM (Aldrich), Tris HC1 (pH 8,8) 50,0 mM (Sigma), MgCl2 anhydre 2,5 mM (Sigma), (3-mercaptoéthanol 8,0 mM (Sigma), BSA (sérum d'albumine bovine) 35,0 log/ml (New England Biolabs), dNTP 0,2 mM (Euromedex), oligonucléotides 30,0 pmol (SEQ ID NOs : 1 et 2), Red Taq DNA polymerase (Sigma) 1,0 unité, afin d'identifier des clones d'intérêt par SPPE (Solid Phase Primer Extension). Les prélèvements ont été placés directement sur un thermocycleur (Techne) pour amplification. Après un passage à 95°C durant 5 minutes, 35 cycles d'amplification ont été réalisés comme précédemment décrit. Une électrophorèse en minigel d'agarose de type D5 à 2% a été effectuée en tampon TBE (Tris-Borate-EDTA) 0,5X, à 140 volts, durant 20 minutes. Les dépôts ont été effectués à chaud.
Les résultats sont présentés sur la figure 2. Légende de la figure 2 : lignes a-f = prélèvements de six clones indépendants ligne M = marqueur de taille (1 kb DNA leader) (GeneRulerTM, Euromedex) Les résultats montrent que l'utilisation de cônes de prélèvement complets contenant l'ensemble des réactifs, n'empêche pas la réaction. d'amplification par SPPE, dans la mesure où des clones d'intérêt ont pu être identifiés, sans recourir à d'autres cribles de sélection que l'amplification par SPPE, et en moins de quatre heures après prélèvement. Il est à noter que, dans les conditions utilisées (agarose à 3%), les dépôts sur gel d'électrophorèse sont parfois difficiles à réaliser et à reproduire. Aussi certains dépôts peuvent nuire à la lecture des résultats (lignes b et e). En outre, l'utilisation de cônes de prélèvement, contenant l'ensemble des éléments nécessaires à la réaction d'amplification par SPPE, présente l'avantage d'éviter une étape de manipulation d'ajout de tampon et d'homogénéisation du milieu réactionnel. De plus de tels cônes de prélèvement, peuvent être conservés à 4°C sans dommage durant plusieurs semaines. L'inconvénient lié à la difficulté de dépôt peut être résolu par dilution du produit de réaction avant dépôt ou en utilisant la SPPE en temps réel.30 EXEMPLE 2 : PROCÉDÉ DE DÉTECTION DE LEVURES AU NIVEAU D'UNE SURFACE VITRIFIÉE Les résultats d'amplication par PCR et SPPE d'un fragment du gène ymr298W de levure ont été comparés.
Les réactions ont été réalisées à partir de : pour la PCR : 10 l d'une dilution à 10-3 (LB 1,5X, 2% glucose) d'une culture liquide de Saccharomyces cerevisiae (levure de boulanger) réalisée dans du milieu LB Agar MILLER 1,5X, 2% glucose (Difco). Les dilutions ont été effectuées soit dans l'eau tétra- distillée, soit dans NaOH 20 mM ; pour la SPPE : 100 l d'une dilution à 10-4 (LB 1,5X, 2% glucose) d'une culture liquide de Saccharomyces cerevisiae (levure de boulanger) réalisée dans du milieu LB Agar MILLER 1,5X, 2% glucose (Difco), étalés sur plaque de verre, puis prélévés après séchage, à l'aide de cônes gélifiés d'un volume de
25 l (eau tétra-distillée ou solution NaOH 20 MM + gel d'agarose de type D5 à 3%) Les prélèvements ont été traités par la chaleur comme précédemment décrit. Après l'ajout de 25 pil du tampon réactionnel précédemment décrit et l'homogénéisation du milieu, 35 cycles d'amplification par extension d'amorces 298A (5'-CGGAGATCTCATCTCAACCCACTCCCATCATAAC-3', SEQ ID NO : 3) et 298E (5'-CGGTTAATTAATCACATGTGATAAATTGTGG-3', SEQ ID NO : 4) d'un fragment du gène ymr298w ont été réalisés comme précédemment décrit. Une électrophorèse en minigel d'agarose de type D5 à 2% a été effectuée en tampon TBE (Tris-Borate-EDTA) 0,5X, à 140 volts, durant 20 minutes. Les dépôts ont été réalisés à chaud.
Les résultats sont présentés sur la figure 3. Légende de la figure 3 : ligne M = marqueur de taille (1 kb DNA leader) (GeneRulerTM, Euromedex) ligne a = PCR (traitement par eau tétra-distillée) ligne b = PCR (traitement par NaOH 2OmM) lignes c et d = SPPE avec cônes (agarose de type D5 à 3% + NaOH 2OmM) lignes e et f = SPPE avec cônes (agarose de type D5 à 3% + eau tétra-distillée) Les résultats montrent que l'amplification par SPPE présente de meilleurs rendements que celle par PCR, que ce soit avec un traitement par NaOH 2OmM (PCR ligne b vs SPPE, lignes c et d), ou un traitement par eau tétra-distillée (PCR ligne a vs SPPE, lignes e et f). En outre, il est à noter quegle traitement par NaOH 20 mM à 95°C pendant 5 minutes, améliore la destruction des structures membranaires des levures et favorise ainsi la détection subséquente de ces microorganismes aussi bien par PCR (ligne b vs ligne a) que par SPPE (lignes c et d vs lignes e et f). La SPPE, tout comme la PCR, est sensible à l'état de destruction des structures cellulaires. Cependant, quelque soit celui des deux traitements utilisés, la SPPE donne des résultats d'amplification génique nettement supérieurs à ceux de la PCR. Ceci s'explique par le comportement de type nanofluidique de la réaction de SPPE dont le milieu reste gélifié durant l'ensemble de la réaction. Les macromolécules, ADN et protéines, se trouvent alors partiellement prisonnières entre les moléules de gélifiant hydratées. Dans ces conditions, les espaces dans lesquels se trouvent les macromolécules forment des chambres réactionnelles de très faibles dimensions entre lesquelles seules les petites molécules sont librement échangées.
EXEMPLE 3 : INFLUENCE DE L'ETAT ET DE LA COMPOSITION DU MILIEU REACTIONNEL SUR L'EFFICACITE D'AMPLIFICATION PAR SPPE Des dépôts de 100 pl d'une dilution à 10-5 d'une culture liquide d'un clone d'intérêt précédemment identifié d'Escherichia coui (clone P32), ont été réalisés sur plaque de verre. Après séchage, les prélèvements ont été effectués à l'aide de cônes d'agarose low gelling LM-3 (Euromedex) ou de type D5, à 2 ou 3%, d'un volume de 30 pl, afin d'identifier des clones d'intérêt par SPPE (Solid Phase Primer Extension). Les prélèvements ont été placés à 95°C durant 5 minutes afin de détruire les structures cellulaires et dénaturer l'ADN.
Après l'ajout de 20 l de tampon réactionnel A ou B selon la teneur en MgC12 [concentration finale : (NH4)2SO4 11,6 mM (Aldrich), Tris HC1 (pH 8,8) 50,0 mM (Sigma), MgCl2 anhydre 5,0 mM ou 2,5 mM (Sigma), [3-mercaptoéthanol 8,0 mM (Sigma), BSA (sérum d'albumine bovine) 35,0 ig/ml (New England Biolabs), dNTP 0,2 mM (Euromedex), oligonucléotides 30,0 pmol (SEQ ID NOs : 1 et 2), Red Taq DNA polymerase (Sigma) 1,0 unité] et l'homogénéisation du milieu, 35 cycles d'amplification ont été réalisées comme précédemment décrit.
Une électrophorèse en gel d'agarose de type D5 à 2% a été effectuée en tampon TBE (Tris-Borate-EDTA) 0,5X, à 140 volts, durant 30 minutes. Les dépôts ont été effectués à chaud. Les résultats sont présentés sur la figure 4. Les résultats montrent que la détection par SPPE est favorisée par l'utilisation d'une agarose normale (lignes c, d, g, h, k, 1, o, p) qui forme un milieu gélifié insensible à l'élévation de température durant les cycles réactionnels (même après 30 minutes à 95°C le milieu réactionnel reste gélifié).
L'augmentation de la concentration en agarose (lignes e-h et m-p) favorise la réaction d'amplification par SPPE dans les limites testées. Au contraire, l'augmentation de la concentration en Mgz+ (tampon A vs tampon B - lignes a, c, e, g, i, k, m, o) a un effet légèrement inhibant dans les conditions testées. L'amélioration du rendement de la réaction de SPPE dans un milieu restant gélifié durant l'ensemble de la réaction peut également s'expliquer dans ce cas par l'acquisition de propriétés de type nanofluidique de ce milieu. En effet, les macromolécules, ADN et protéines, se trouvent partiellement prisonnières entre les molécules de gélifiant hydratées. Dans ces conditions, les espaces dans lesquels se trouvent les macromolécules forment des chambres réactionnelles de très faibles dimensions entre lesquelles seules les petites molécules sont échangées. En agarose low gelling, le milieu redevient liquide et perd ses propriétés de type nanofluidiques, expliquant la diminution du rendement réactionnel. EXEMPLE 4 : PROCEDE DE DETECTION MULTIPLEX par SPPE Le mélange de deux dilutions à 10"5, l'une d'une culture liquide d'Escherichia coli (clone P32), l'autre d'une culture de Saccharomyces cerevisiae, (levure de boulanger), a été réalisé dans du milieu LB. L'amplification multiplex par SPPE dudit mélange a été réalisée. Les réactions ont été réalisées à partir de 100 l dudit mélange étalés sur plaque de verre, puis prélevés après séchage, à l'aide de cônes gélifiés d'un volume de 30 l (NaOH 20 mM + gel d'agarose de type D5 à 3%) Les prélèvements ont été traités par la chaleur comme précédemment décrit. Après ajout de 20 pl de tampon réactionnel [(NH4)2SO4 11,6 mM (Aldrich), Tris HC1 (pH 8,8) 50,0 mM (Sigma), MgCl2 anhydre 2,5 mM (Sigma), (3-mercaptoéthanol 8,0 mM (Sigma), BSA (sérum d'albumine bovine) 35,0 mg/ml (New England Biolabs), dNTP 0,2 mM (Euromedex), oligonucléotides 30,0 pmol, Red Taq DNA polymerase (Sigma) 1,0 unité] et l'homogénéisation du milieu, 35 cycles d'amplification ont été réalisés comme précédemment décrit.
Deux couples d'oligonucléotides (SEQ ID NOs : 1 et 2 pour E. coli, et SEQ ID NOs : 3 et 4 pour S. cerevisiae) ont été utilisés pour l'amplification multiplex de deux marqueurs différents en SPPE comme précédemment décrit.
Pour les dépôts, 10 pl (un cinquième) du mélange réactionnel ont été dilués à chaud (80°C) dans 40 pl de TE (10-1) puis ramenés lentement à température ambiante. Une électrophorèse en minigel d'agarose 2,5% a été effectuée en tampon TBE 0.5X à 140 volts durant 20 minutes. Les résultats sont présentés sur la figure 5.
Légende de la figure 5 : Lignes a et b = SPPE multiplexe Les résultats montrent que la détection simultanée de différents marqueurs génétiques et/ou de différents organismes par amplification multiplexe est possible en SPPE.
Claims (30)
1) Procédé de prélèvement et de détection d'au moins un microorganisme présent dans un échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : (i) la mise en contact d'un échantillon avec un gel de prélèvement dudit, au moins un, microorganisme ; (ii) la détection et/ou l'identification dudit, au moins un, microorganisme présent sur le gel de prélèvement obtenu à l'étape (i) ; ledit gel étant hypotonique par rapport au cytoplasme dudit au moins un microorganisme et capable de déstabiliser et/ou lyser les membranes et/ou les parois dudit, au moins un, microorganisme.
2) Procédé selon la revendication 1, dans lequel le gel de prélèvement est choisi dans le groupe comprenant les gélifiants naturels hydratés, les gélifiants de synthèse hydratés et les gélifiants obtenus par hémisynthèse hydratés.
3) Procédé selon la revendication 2, dans lequel le gélifiant est choisi dans le groupe comprenant les gélatines, l'agar-agar, l'amidon, la caroube, la guar, la gomme notamment la gomme d'accacia, les pectines, les alginates, les carraghénanes, les xanthanes, l'acrylamide, la bis-acrylamide et les agaroses notamment les agaroses modifiées, de préférence l'agarose et les agaroses modifiées et tout préférentiellement l'agarose.
4) Procédé selon l'une des revendications 2 ou 3, dans lequel le gélifiant est présent dans ledit gel de prélèvement en une quantité allant de 0,2 à 15 % en poids, de préférence de 1 à 5 % en poids, par rapport au poids total dudit gel de prélèvement.
5) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel ledit gel de prélèvement comprend au moins un soluté choisi dans le groupe des molécules tampon comprenant le phosphate de potassium notamment le dihydrogénophosphate de potassium, le monohydrogénophosphate potassium et le phosphate de potassium tribasique, l'acétate de sodium, le tris-hydrochloride, le tris-borate, le tris-acétate, en particulier le tris-hydrochloride.
6) Procédé selon la revendication 5, dans lequel ledit, au moins un, soluté est présent dans ledit gel de prélèvement à une concentration allant de 0,1 pM à 2 M, de préférence allant de 5 nM à 200 mM.
7) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel ledit gel de prélèvement a une pression osmotique allant de 0 à 90 % de celle du cytoplasme dudit au moins un microorganisme, et préférentiellement de 0 à 20 % de celle du cytoplasme dudit au moins un microorganisme.
8) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans lequel l'étape (ii) comprendau moins une réaction choisie dans le groupe comprenant : - une réaction de polymérisation en chaîne, notamment une réaction de polymérisation en chaîne en temps réel, une réaction de polymérisation en chaîne multiplex, une réaction de polymérisation en chaîne semi-quantitative, une réaction de polymérisation en chaîne quantitative, - une réaction de polymérisation d'acides ribonucléiques par une ARN polymérase ; - une réaction de polymérisation par une transcriptase inverse ; - une réaction immunologique, notamment une réaction antigène-anticorps ; - une réaction enzymatique, notamment une réaction impliquant des enzymes de restriction, - une réaction colorimétrique, notamment une réaction colorimétrique basée sur la mesure de la présence d'acide désoxyribonucléique et d'acide ribonucléique, de substrats.
9) Procédé selon la revendication 8, dans lequel l'étape (ii) comprend une réaction de polymérisation en chaîne mise en oeuvre directement sur le gel de prélèvement obtenu à l'étape (i), sans étape préalable de mise en suspension du gel de prélèvement obtenu à l'étape (i).
10) Procédé selon la revendication 9, dans lequel l'étape (ii) comprend les étapes suivantes :- la mise en contact du gel de prélèvement obtenu à l'étape (i) avec les réactifs nécessaires à la mise en oeuvre d'une réaction de polymérisation en chaîne, lesdits réactifs comprenant au moins quatre nucléotides triphosphates différents, au moins une polymérase, au moins une paire d'amorces capables de s'hybrider à au moins une séquence du génome dudit, au moins un, microorganisme, et au moins un tampon adapté à une réaction de polymérisation en chaîne ; - la mise en oeuvre d'une réaction de polymérisation en chaîne ; - l'analyse des produits d'amplifications obtenus par ladite réaction de polymérisation en chaîne.
11) Procédé selon la revendication 8, dans lequel l'étape (ii) comprend une réaction de polymérisation d'acides ribonucléiques par une ARN polymérase mise en oeuvre directement sur le gel de prélèvement obtenu à l'étape (i), sans étape préalable de mise en suspension du gel de prélèvement obtenu à l'étape (i).
12) Procédé selon la revendication 8, dans lequel l'étape (ii) comprend une réaction de polymérisation par une transcriptase inverse, mise en oeuvre directement sur le gel de prélèvement obtenu à l'étape (i), sans étape préalable de mise en suspension du gel de prélèvement obtenu à l'étape (i), suivie d'une réaction de polymérisation en chaîne.
13) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, ledit procédé comprenant en outre l'étape suivante : (iii) la détermination du taux de microorganismes présents dans ledit échantillon.
14) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, dans lequel ledit échantillon est choisi dans le groupe comprenant un échantillon liquide notamment sanguin, un échantillon gazeux notamment d'air, un échantillon solide notamment un échantillon présent au niveau d'une surface, de préférence un échantillon d'une surface, et tout préférentiellement un échantillon d'une surface de sol, d'appareil, de meuble, de machine ou d'élément de machine, de peau.
15) Procédé selon la revendication 14, dans lequel lorsque ledit échantillon est une surface, l'étape (i) de mise en contact d'un échantillon avec un gel de prélèvement est réalisée avec une pression allant de 2 g/cm2 à 50 kg/cm2 pendant 1 seconde à 60 minutes, de préférence allant de 20 à 50 g/cm2 pendant 5 à 30 secondes.
16) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, dans lequel l'étape (ii) est précédée d'un traitement du gel de prélèvement obtenu à l'étape (i) par des enzymes lytiques, notamment le lysozyme.
17) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, dans lequel l'étape (ii) est précédée d'une étape de chauffage du gel de prélèvement obtenu à l'étape (i) à une température allant de 30°C à 373°C, pendant une durée de 5 secondes à 60 minutes, de préférence à une température allant de 80°C à 120°C, pendant une durée de 1 à 20 minutes, tout préférentiellement de 90 à 100°C pendant une durée de 1 à 5 minutes.
18) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 17, dans lequel ledit, au moins un, microorganisme est choisi dans le groupe comprenant : - les algues, - les protozoaires, - les mycètes notamment les levures, -les virus et - les bactéries notamment les bactéries du genre Listeria telles que Listeria monocytogenes, les entérobactéries telles que les bactéries du genre Salmonella et le coliforme, les bactéries du genre Clostridium, les bactéries du genre Legionella, en particulier les levures et les bactéries et tout particulièrement les bactéries du genre Listeria et les entérobactéries.
19) Dispositif de prélèvement d'au moins un microorganisme, caractérisé en ce qu'il comprend un gel de prélèvement tel que défini selon l'une quelconque des revendications 1 à 18.
20) Dispositif selon la revendication 19, dans lequel ledit gel de prélèvement est fixé à l'extrémité d'un support.
21) Dispositif selon la revendication 20, dans lequel ledit support est choisi dans le groupe comprenant une tige, un rouleau, un stylo, un poinçon, un axe, en particulier une tige.
22) Dispositif selon l'une quelconque des revendications 20 ou 21, dans lequel ledit gel de prélèvement est en libre rotation à l'extrémité dudit support. 15
23) Dispositif selon l'une quelconque des revendications 19 à 22, dans lequel ledit gel de prélèvement présente une forme choisie dans le groupe comprenant une forme conique, cylindrique, discoïde et 20 la forme d'un film, en particulier une forme conique, cylindrique et discoïde et tout particulièrement une forme conique.
24) Dispositif selon l'une quelconque des 25 revendications 19 à 23 dans lequel ledit gel de prélèvement est recouvert d'un film retirable, en particulier d'un film plastique retirable. 10
25) Dispositif de prélèvement et de détection d'au moins un microorganisme caractérisé en ce qu'il comprend : (a) le dispositif de prélèvement selon l'une quelconque des revendications 19 à 24 ; (b) les réactifs nécessaires à la détection et/ou l'identification dudit, au moins un, microorganisme.
26) Dispositif selon la revendication 25, dans lequel lesdits réactifs (b) sont nécessaires à au moins une réaction choisie dans le groupe comprenant : - une réaction de polymérisation en chaîne, notamment une réaction de polymérisation en chaîne en temps réel, une réaction de polymérisation en chaîne multiplex, une réaction de polymérisation en chaîne semi-quanti.tative, une réaction de polymérisation en chaîne quantitative, - une réaction de polymérisation d'acides ribonucléiques par une ARN polymérase ; - une réaction de polymérisation par une transcriptase inverse ; une réaction immunologique, notamment une réaction antigène-anticorps ; - une réaction enzymatique, notamment une réaction impliquant des enzymes de restriction, - une réaction colorimétrique, notamment une réaction calorimétrique basée sur la mesure de la présence d'acide désoxyribonucléique et d'acide ribonucléique, de substrats.30
27) Dispositif selon la revendication 26, dans lequel les réactifs (b) sont nécessaires à la mise en oeuvre d'une réaction de polymérisation en chaîne, lesdits réactifs comprenant au moins quatre nucléotides triphosphates différents, au moins une polymérase, au moins une paire d'amorces capables de s'hybrider à au moins une séquence du génome dudit, au moins un, microorganisme, et au moins un tampon adapté à une réaction de polymérisation en chaîne.
28) Dispositif selon l'une quelconque des revendications 25 à 27, dans lequel le gel de prélèvement du dispositif de prélèvement (a) comprend lesdits réactifs (b).
29) Dispositif selon l'une quelconque des revendications 25 à 28, dans lequel lesdits réactifs (b) sont présents dans un contenant, notamment un tube. 20
30) Dispositif selon la revendication 29, dans lequel ledit contenant est de forme complémentaire audit gel de prélèvement.15
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| DE102006016326A1 (de) * | 2006-04-06 | 2007-10-18 | Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. | Vorrichtung und Verfahren zur Schnellmessung eines mikrobiologischen Zustands einer Probe |
-
2007
- 2007-09-14 FR FR0706454A patent/FR2921071A1/fr active Pending
-
2008
- 2008-09-12 WO PCT/FR2008/001282 patent/WO2009090322A1/fr active Application Filing
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1991006323A1 (fr) * | 1989-10-27 | 1991-05-16 | Scott Paper Company | Compositions de gels de cicatrisation de lesions et leurs modes d'emploi |
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Non-Patent Citations (3)
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|---|
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2949477A1 (fr) * | 2009-09-03 | 2011-03-04 | Millipore Corp | Procede et dispositif de prelevement pour l'analyse d'une surface |
| EP2292730A1 (fr) * | 2009-09-03 | 2011-03-09 | Millipore Corporation | Procédé d'échantillonnage et dispositif pour l'analyse d'une surface |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2009090322A1 (fr) | 2009-07-23 |
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